DNAlabs
LeerlingenHANDLEIDING Versie Datum Auteur
1.0 6/10/2013 CONCEPT 6 oktober 2013 Bart J. van Zweeden
0
Inhoudsopgave
1. Inleiding 2. Modulen in detail 3. Totaaloverzicht Practica 4. Afsluiting, toetsing, eisen en schriftelijke verwerking Modulen in detail: Module CELLEN Practicum: Cellen van de rode ui Module CELLEN Practicum: Cellen van de tulpenstengel Module CELLEN Practicum: Cellen van gist,mos en alg Module GENCLASSIC1 Practicum: Drosophila Module GENCLASSIC1 Practicum: Bacteriën Module GENCLASSIC1 Practicum: Drosophila2 Module MOLGEN1 Practicum: Isolatie DNA Module MOLGEN2 Practicum: Maken van een gel Module MOLGEN2 Practicum: ICT-opdracht Module SOLANUM1 Practicum: ICT-Opdracht Module DNA1 Practicum: DNAlab1 Updatehistorie X-1 X-2
oktober 2013 Initiële opzet januari 2014 bijstelling
1
2 3 6 7 8 9 10 11 12 15 16 18 20 21 22
1. Inleiding Voor je ligt de leerlingenhandleiding die hoort bij de lessenserie over DNA. In deze practica maak je kennis met de technieken om DNA te onderzoeken en haal je je kennis over zaken als transcriptie en translatie weer op. Mogelijk heb je deze onderwerpen nog niet of niet geheel gehad; in de les volg je de uitleg aan de hand van een powerpointpresentie of verbale uitleg van de docent. Deze serie bestaat uit 7 modulen: 1. Cellen 2. GenClassic 3. MolGen1 4. MolGen2 5. Solanum1 6. DNA1 7. Solanum2 Deze blokken in meer detail staan hierna uitgewerkt. Het doel van deze lessenserie is een kennismaking met moleculaire biologie en een klein stukje onderzoek zoals dat in laboratoria wordt gedaan. Je maakt kennis met het maken van preparaten voor onder de microscoop en kennis met de kleinste cellen: bacteriën. Ook zal je deze bacteriën opkweken op eigen gemaakte kweekbodems en leer je bacterie-groepen te herkennen dmv de Gramkleuring. In het DNA-gerichte deel maak je kennis met PCR, het maken van gels en het isoleren van DNA uit kiwi, banaan en tenslotte aardappel. In de zoektocht naar middelen in de strijd tegen phytophtora, maak je kennis met resistentiegenen en hoe je die kan detecteren in het aardappel genoom. In het practicum voer je zelf de analyse om te kijken of in jouw aardappelras deze twee genen aanwezig zijn. Gezien de omvang van het practicum, wordt e.e.a. bekort. Er zitten nogal lange wachttijden in, waardoor je pas de volgende dag het resultaat kan zien. Het aanlooptraject begint bij de cellen. Het is best mogelijk dat je dit practicum al eens eerder gedaan hebt; Voor het begrip van het DNA practicum is het niet noodzakelijk. Voor het uitvoeren van alleen het DNA-practicum DNA1 (11) is het nodig dat de practica: 7. MOLGEN1 DNAislolatie uit kiwi 8. MOLGEN2 Maken van een gel 9. MOLGEN2 ICT-practicum 10. SOLANUM1 CoCo-les. wel doorlopen zijn. Bart J. van Zweeden Wassenaar/Haarlem oktober 2013.
2
2.
Modulen in detail.
CELLEN In deze module leer je het verschil tussen planten en dierencellen. Ook leer je welke onderdelen (celorganellen) je in de cel kan aantreffen en welke functie zij hebben. Bij deze module gaat het er om dat je een goed beeld krijgt van de algemene opbouw van de cel en van de algemene kenmerken. Ook is het belangrijk een idee te hebben van de verschillen in afmetingen van de cellen. Hierbij is het maken van eigen preparaten erg belangrijk; daardoor krijg je ervaring in het maken van coupes en ontdek je hoe dun die moeten zijn. Door de coupes te kleuren, ontstaat meer contrast in het microscoopbeeld en kun je structuren misschien beter waarnemen. Tijdsduur: 2 lesuur Theorie en 3 lesuren practica.
GENCLASSIC De module GenClassic verwijst naar de klassieke genetica. Hoe is de mens er achter gekomen dat de erfelijkheid in de cellen moet worden gezocht? In vroeger tijden sprak men trouwens van bloedverwanten; een verwijzing die duidelijk maakt hoe men vroeger dacht over dit thema. Door in de theorie de historie hierin na te gaan, komen we mensen tegen als Mendel, Morgan, en het duo Watson en Crick, de ontdekkers van de structuur van het DNA. In het practicum gaat het om het thuisraken in de aanvankelijk eenvoudige verervingsschema's als mono- en dihybride kruising. Later bekijken we lastigere vormen als crossing over en gekoppelde genen. Tijdsduur: 5 lesuren Theorie en 2 lesuren practica.
MOLGEN1 De module MOLGEN1 is de eerste confrontatie met het DNA. In de vorige module zagen we dat tal van mensen bezig zijn geweest met deze chemische stof, maar dat Watson en Crick de structuur bloot legden en daardoor snel begrepen hoe de replicatie tot stand kon komen. In deze module proberen we exact na te gaan hoe de replicatie is geregeld en wat celdeling dus betekent. Nadien bekijken we de transcriptie van het DNA en de translatie van het RNA. Centraal staat dus de functie van het DNA als matrijs voor de producten van de cel. In het practicum isoleren we DNA uit Kiwi en banaan en kijken we dat later aan een analyse zouden kunnen onderwerpen. Tijdsduur: 4 lesuren Theorie en 2 lesuur practicum.
MOLGEN2 In deze module leer je enkele DNA-analyse technieken en hoe men die uitvoert. Het is in deze module van belang een scherp beeld te hebben van de vier mogelijke basen die in DNA voorkomen en dat een korte sequentie van slechts 20 baseparen aal behoorlijk uniek is in een genoom. Centraal staat in deze module de werking van de bekende PCR-methode; een methode om een gekozen stuk genoom duizenden malen te vermenigvuldigen opdat het zichtbaar wordt en nadere analyse mogelijk wordt. 3
In het practicum maak je een minigel waarmee je kennismaakt met een DNAscheidingstechniek die electroforese heet. Ook kijken we kort naar de DNA-sequenties van een aantal bekende organismen. Tijdsduur: 1 lesuren Theorie en 1 lesuur practicum.
SOLANUM1 De module SOLANUM1 introduceert het probleem van een plantenziekte bij aardappelen. Aardappelen zijn in de (Westerse) wereld een belangrijke bron van voedsel en zetmeel en daarmee van groot belang voor de voedselproductie. De ziekte Phytophtora is een schimmel infectie die snel na nattig weer een geheel aardappelveld kan verwoesten en de oogst gehele doet mislukken. In het verleden heeft een dergelijke ramp in Ierland al voor een paar jaar hongersnood gezorgd. Wij zullen zien welke onderzoeken worden gedaan om de ziekte in te dammen en welke technieken daarbij komen kijken. In deze twee lessen doorloop je totaal 11 opdrachten die je doen verplaatsen in de rol van teler van aardappels. Tijdsduur: 4 lesuren Theorie en Zelfwerkzaamheid
DNA1 In deze module zal je de aanwezigheid gaan testen van twee genen in de aardappelplant. We zullen checken of de resistentie-claim van de aardappelteler terecht is door de aanwezigheid van kenmerkende resistentiegenen te controleren. Daartoe onderzoeken we tenminste vijf aardappelrassen en twee of drie rassen uit de winkel. Daarnaast kunnen aan aardappel verwante soorten ook nog onder de loep worden genomen. Tijdsduur: 2 lesuren Theorie, 2 lesuren practica + 1 uur nabespreking van de resultaten. Laatste vrijdag: evaluatie. In het schema hieronder zie je dat de modulen wel in een bepaalde volgorde samenhangen. Niettemin is het denkbaar dat iemand een module mist; Dit is tot op zekere hoogte mogelijk, maar niet wenselijk. Op de volgende pagina zie je de (nu nog) lineaire opzet van deze modulen, waarbij moet worden opgemerkt dat 12-e klassers die stukken gemist hebben, kunnen inspringen bij MOLGEN1.
4
figuur 1.0 Moduleplattegrond Lessenserie DNA
Cellen en Celstructuren: CELLEN
Klassieke Genetica: GENCLASSIC
Mol. Biologie: MOLGEN1
Mol Bio/ Technieken: MOLGEN2
Planten en ziekten: SOLANUM1
PRAKTICUM Solanum: DNALAB1
De modulen zullen worden gegeven SOLANUM2 in periodelessen wel vaklessen. Het is afhankelijk PRAKTICUM: (indan ontwikkeling) van het programma en de leerkracht welke modulen je van deze 6 (7) zal zien. In de pagina's hieronder zie je de practicumvoorschriften die horen bij deze 6 (7) modulen. In de laatste pagina's staan de verwerkingseisen van elk practicum en de mogelijk testvragen die je moet kunnen beantwoorden. Enkele aandachtspunten: Practica doe je in principe met twee mensen. Ieder maakt zijn eigen verslagen (zie overzicht practica P 6 en afsluiting : P 26). Alle spullen die volgens het voorschrift nodig hebt, breng je ook weer terug Zorg dat na afloop de tafels weer schoon zijn Laat geen rommel op de vloer slingeren (zeker geen biologisch materiaal) Denk om de veiligheid van jou en anderen. Soms moet je voor de verwerking van de practica even wachten op anderen: Er is bijvoorbeeld maar één PCR-apparaat en één gel-electroforese kamer. Zorg dat je eerst het practicum goed gelezen hebt. Dat scheelt in de wijze van uitvoer.
5
4.
TOTAALOVERZICHT PRACTICA
Onderstaande practica zitten in de leerlinghandleiding van deze module-reeks. Bekijk de index om ze op te zoeken. Alle practica doe je met twee personen. Foto's maken met je smartphone kan je doen, mits ik die terugzie in je verslagen. Als er wordt gevraagd om een tekening, is een foto geen alternatief. Module CELLEN
Practicum Ui
CELLEN
tulp
CELLEN
mos,alg, schimmel GENCLASSIC1 drosophila-1 GENCLASSIC1 Bacteriën GENCLASSIC1 drosophila-1 MOLGEN1 MOLGEN2
DNA-isolatie Gel
MOLGEN2
ICT
SOLANUM1
ICT
DNA1
DNA
Inhoud maken eigen preparaten van de rokken van (rode) ui. maken van stengelcoupes van de tulp Bekijken van mos,alg en schimmel Bekijken balsempreparaten fruitvlieg Maken van bacterie-kweken , reinstrijk Ontwikkelstadia bekijken vanuit de kweekbuizen. Isolatie DNA uit kiwi Maken van een gel voor electroforese Ict opdracht: Nagaan genoom Ict-opdracht: Genoomanalyse Solanum Gen-detectie met PCR en gel-electroforese
Verslagvorm kort kort kort kort uitgebreid kort kort kort kort uitgebreid: 11 uitgewerkte opdrachten. uitgebreid
Toekomst: In de toekomst (2014- en verder) worden deze practica mogelijk uitgebreid met: SOLANUM2: Verdere analyse van de Phytophtora-resistentie DROS1 : Detectie genen/mutanten van drosophila CSI1: Detectie van daders van een (fictief) delict. RESTRICT1: Werken met restrictieenzymen en PCR.
6
4. Afsluiting, toetsing, eisen en schriftelijke verwerking Verslagen: In deze periode wordt een serie les-theorie-ervarings-practicum verslagen gemaakt. Er zijn twee vormen van verslag hierbij:
KORT
(dit verslag past op 1 A4-tje (excl. tekeningen)) korte omschrijving van het practicum in max 6 zinnen. korte beschrijving wat de resultaten waren (Max 10 zinnen) tekeningen. (Zie URL: tekenregels met namen) Eigen visie getuigend van begrip van het practicum (max 6 zinnen) (Wat gebeurde er, wat was er te zien, waarom, wat ging er mis… etc)
UITGEBREID
(dit verslag eist minimaal 2-3 A4-tjes (excl. tekeningen)) uitvoerigere omschrijving van het practicum in max 20 zinnen betekenis van het practicum: waarom doen we dit, wat moet er uit komen, welke materialen hebben we gebruikt, welke techniek. beschrijving wat de resultaten waren (ca 10-20 zinnen) tekeningen. (Zie URL: tekenregels met namen) Eigen visie getuigend van begrip van het practicum (max 6 zinnen)
TOTAAL bestaat je verslag uit 8 korte en 3 uitgebreide verslagen + de uitgebreide uitwerking van de 11 opdrachten uit de SOLANUM-opdracht. bevat je totaalverslag een kort nawoord waarin je terugblikt op deze periode lever je het geheel DIGITAAL in uiterlijk 23 sept 2014 om 12:00 uur. Elke hele dag te laat levert een punt aftrek op. Niets inleveren levert de score 1.0 op. telt het verslag mee als cijfer in het PTA van biologie/ANW
7
1.
Module CELLEN Practicum: Cellen van de rode ui
Doel Het aantonen van de flexibiliteit van het plasmamembraan binnen de cellen van de rode uit.
Beschrijving
rode uit, is dit (plasmolyse) proces nóg beter te volgen.
In elke plantencel zit aan de binnenzijde van de celwand een plasmamembraan dat de
inhoud van de cel omsluit. Door de cel te leggen in een zoutoplossing die een hogere zoutconcentratie heeft dan in de cel, zal water de cel uitgaan en de celmembraan passeren. Hierdoor zal het plasmamembraan slinken terwijl de celwanden intact blijven. Door gebruik te maken van de cellen van de
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: een stukje rode ui pincet objectglaasjes en afdekglaasjes zout water microscoop+verlichting scherp mesje.
Methoden Bekijk op de site de filmpjes over microscoopgebruik (bronnen)en die over de plasmolyse. Probeer aan de binnenzijde van een rol van een ui een stukje vlies los te maken. Deze is één celllaag dik. Als het goed is, zijn de cellen paarsgekleurd. Probeer een stukje van ca 6-10 mm2 op het objectglas te krijgen en voeg een druppel gewoon water toe. Dek af met een objectglas. Bekijk het resultaat onder de microscoop bij 50x en 200x Haal het preparaat onder de microscoop vandaan, til het dekglas iets op en voeg nu een druppel zoutoplossing toe. Dek toe met het dekglas. Bekijk het resultaat onder de microscoop bij 50x en 200x Neem de tijd om de verandering die zich in minuten voltrekt, te volgen.
Opdrachten Maak een tekening van de cellen van de uienrok en van de geplasmolyseerde cellen.
Verwerking Verwerk de resultaten in een kort verslag van wat je gezien hebt. Maak een tekening van de cellen van de uienrok en van de geplasmolyseerde cellen.
Uitbreiding Lukt het om de cellen weer in de oorspronkelijke toestand terug te brengen? Wat moest er voor gebeuren? 8
2.
Module CELLEN Practicum: Cellen van tulpenstengel
Doel Het leren vervaardigen van een coupe van de stengel van de tulp.
Beschrijving In dit practicum gaat het om het maken van een coupe van de stengel van de tulp. Tulpenstengels zijn groot genoeg om een mooie coupe van te snijden. Ook is de stengel hiervoor stevig genoeg.
Op de foto zie je de doorsnede van een éénzaadlobbige plant.
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: een stukje stengel van de tulp pincet objectglaasjes en afdekglaasjes Eosine-Methyleenkleuring (plastic tube) microscoop+verlichting scherp mesje. (Starmesje)
Methoden Het lastige is om een dwarsdoorsnede van de tulp te maken en zó dun te snijden, dat de coupe 1 á 2 cellen dik is. Vaak lukt het niet, en heb je maar een stukje van de coupe. Die zijn vaak wel beter dan een hele , maar te dikke coupe. Als je een coupe hebt, leg deze op het objectglas en voeg een druppel kleurstof toe. Laat deze 2 min intrekken. Daarna voeg je een paar druppels water toe en leg je het dekglas er voorzichtig op. Pas op voor belletjes. Bekijk het resultaat onder de microscoop bij 50x en 200x
Opdrachten Maak een tekening van de cellen van de tulp en kijk of je verschillende soorten cellen kan aanwijzen.
Verwerking Verwerk de resultaten in een kort verslag van wat je gezien hebt. Maak een tekening van de cellen van de tulpenstengel. Kijk op de site het filmpje na voor de tekenregels (bronnen).
Uitbreiding Kijk of je op deze manier ook coupes kan maken van planten die buiten de school in de tuin staan. 9
3.
Module CELLEN Practicum: Cellen van gist, mos en alg
Doel Het observeren van diverse vormen van eencelligen en cellen van meercellige mossen.
Beschrijving In dit practicum gaat het om het waarnemen van verschillende typen cellen. De groep algen is enorm groot; als je een beetje slootwater neemt, zal je zien dat daar van alles in zwemt en krioelt. Ook gewone bakkergist, toont een ééncellig beeld.
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: Een monster uit de sloot een beetje bakkersgist een blaadje van sterrenmos. pincet objectglaasjes en afdekglaasjes Eosine-Methyleenkleuring (plastic tube) microscoop+verlichting
Methoden Je hebt voor dit korte practicum weinig tijd nodig. Het gaat erom dat je de diversiteit waarneemt van allerlei celtypen van ééncelligen en meercelligen. Neem een druppel water op een objectglas en doe daarop: een mosblaadje, een beetje bakkersgist of wat sloot/bloemenwater. Bekijk het resultaat onder de microscoop bij 50x en 200x
Opdrachten Maak een tekening van de cellen van gist, mos en algen en kijk of je verschillende soorten cellen kan aanwijzen.
Verwerking Verwerk de resultaten in een kort verslag van wat je gezien hebt.
10
4.
Module GENCLASSIC1
Practicum: Drosophila
Doel Het observeren van verschillende onderdelen van de fruitvlieg Drosophila melanogaster.
Beschrijving De fruitvlieg Drosophila is een piepklein vliegje dat zich vaak ophoudt bij de groencontainer. Het diertje leg eitjes in rottend fruit en plant zich om de twee weken voort.. Er zijn op zaal enkele preparaten van de vlieg en enkele mutanten. Levende exemplaren zijn er mogelijk ook op de zaal.
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: Een preparaat van de fruitvlieg microscoop+verlichting
Methoden Je hebt voor dit korte practicum ook weinig tijd nodig. Het gaat erom dat je de diversiteit waarneemt van allerlei aspecten van de fruitvlieg. Bekijk het resultaat onder de microscoop bij 50x.
Opdrachten Neem een foto van wat je ziet. Misschien is de vlieg beter te bekijken bij lage vergrotingen.
Verwerking Verwerk de resultaten in een kort verslag van wat je gezien hebt. Zorg dat je kan zien wat mannetjes zijn en wat de vrouwtjes.
Uitbreiding Bekijk levende exemplaren door deze eerst te verdoven met Ether. Laat de docent/Toa je even helpen.
11
5.
Module GENCLASSIC1
Practicum: Bacteriën
Doel Het maken van een eerste kweek van bacteriën van bodemmonsters + eventuele reinkweek.
Beschrijving Onze bodem zit vól met bacteriën die een nuttige rol spelen bij de afbraak van organisch materiaal. ze zijn dus erg hard nodig voor een gezond bodemleven. In slechts één kubieke cm grond leven naar schatting een miljard bacteriën. Deze gaan wij in dit practicum opkweken.
Materiaal Bekijk eventuele filmpjes over reinstrijken en bacteriekweken. (bronnen) Voor dit practicum heb je nodig: Een bodemmonster van verse grond van rondom de school (tuinstrook naast de school, VW, sportvelden, perkje tegenover de onderbouw etc). drie petrischalen agarpoeder glucose marmite losse afsluitbare buisjes voor het nemen van bodemmonsters rekje met 6 reageerbuizen, zilverpapier. thermostaatbad (80 graden)
Methoden Het practicum kent vijf delen A) Verzamelen bodemmateriaal (kost 30-40 min) B) Agarbodem bereiden C) Extract maken en inzetten kweek op 30 en 80 graden Inoculatie op agarbodem D) Bekijken resultaat onder de microscoop E) Reinstrijk maken voor doorkweek. Deel
A)
Verzamelen bodemmateriaal
Je gaat in tweetallen naar buiten je neemt op één plaats twee monsters van de bodem op ca 5-10 cm diepte. Zorg ervoor dat je geen onnodige vuiligheid van straat verzameld. Bacteriën zitten overal, en daarvoor is het opscheppen van hondenpoep niet nodig. De bodemmonsters verzamel je in een kweekbuis van de vliegenpractica. Deze buizen kunnen met een schroefdop afgesloten worden. Neem de buizen halfvol met materiaal. Tijdsduur 30/40 min. 12
Deel B) Agarbodem bereiden Om straks de bacteriën te kweken, bieden we ze een gelbodem met een koolstofbron in de vorm van glucose. Ook voegen we wat marmite toe om te voorzien in aminozuren en vitamine. Bacteriën hebben niet veel nodig. Uitvoering: 0. Bekijk het filmpje: http://www.youtube.com/watch?v=HcmQN6iMKoA Hier laat een laborant zien hoe je het gieten van de agar in principe moet doen. (stap 9) 1.
10. 11. 12.
Je bereidt materiaal voor 7 agar-schaaltjes. Weeg 1,0 gram agar af op de balans Neem 90 ml water en voeg de agar eraan toe. Weeg 0,5 gram glucose en laat dit op lossen in 10 ml heet water (brander) Voeg de suikeroplossing ook toe aan de 100 ml agaroplossing. Voeg een klein mespuntje marmite toe. Breng de erlenmeyer met 100 ml agar-suiker-marmite mengsel aan de kook en kijk uit dat het NIET overkookt. De kooktemperatuur ligt erg hoog!!! sluit de erlenmeyer af met een stukje zilverfolie Laat na koken afkoelen tot ca 40-50 graden. Maak je tafel schoon met alcohol/spiritus/chloorbleek Stal de 7 petrischaaltjes voor je uit en til met je linkerhand het deksel een beetje op Dan giet je in elk schaaltje ca 2-3 mm hoog agar-oplossing. Als het goed is, kom je redelijk goed uit. (Zie filmpje) Sluit na het gieten de schaaltjes snel. Laat de schaaltjes met agar stollen. Dit duurt ca 30 min. Als ze zijn afgekoeld kan je aan de ONDERKANT je naam schrijven.
Deel
C)
2. 3. 4. 5. 6.
7. 8. 9.
19.
Extract maken en inzetten kweek op 30 en 80 graden Inoculatie op agarbodem Neem de buizen met grondmateriaal en voeg gedestilleerd water toe. Als het goed is, heb je een buis half grond, half water. Schud flink gedurende enkele minuten. Laat de buizen daarna 5 min staan. Van de twee buizen zet je er één in het hete waterbad van 80 graden. Daar staat de buis 30 minuten in. Met de ander buis gebeurt dat niet. Neem nu een gloeidraad en gloei die in een gasvlam uit. Daarna laten afkoelen. Roer hiermee door het grondmonster-met-water (20 graden) ZONDER het bodemmateriaal te raken dat inmiddels is uitgezakt op de bodem. Neem het eerste agarschaaltje en strijk hiermee over het agaroppervlak. Sluit de petrischaal snel. Doe dat ook met schaal 2 en 3. (duplo's) Herhaal de stappen 15 en 16 en 17 met het bodemmonster dat op 80 graden verwarmd is geweest. Dit worden schaaltjes 4, 5 en 6. Je hebt nog drie ongebruikte schaaltjes over. Ze de zes schaaltjes in de kast en kijk na één/twee dagen hoe ver het kweken gaat.
Deel
D)
13.
14. 15.
16. 17. 18.
Bekijken resultaat onder de microscoop 13
1.
Na twee dagen haal je de agarbodems uit de kast en bekijk je het ontstaan van de bodemcultures. Elke losse stip is als het goed is één kolonie, die (daar gaan we vanuit) ontstaan is uit één bacterie.
2.
Neem een objectglaasje en doe daarop een kleine druppel schoon water. a) Neem een uitgegloeide naald van het inoculeren en breng wat bacterieel materiaal over op het object glas. b) Verspreid het materiaal door de druppel en laat de druppel drogen door het glaasje door een net niet blauwe gasvlam te halen. De druppel droogt snel op en de bacteriën worden gedood. c) Voeg 1 druppel kristalviolet toe en laat 1 min inwerken. d) Spoel de druppel eraf met aquadest e) Voeg 1 druppel lugol toe en laat 1 min inwerken f) Spoel opnieuw af, ditmaal met een pipet en 96% alcohol. g) Voeg tenslotte 1 druppel fuchsine toe en laat 30 seconde inwerken. h) spoel die voorzichtig af. i) Bekijk de kolonie onder microscoop zonder dekglas!
Deel
E)
Reinstrijk maken voor doorkweek.
Je eerste kweek is bonte verzameling van allerlei bacteriesoorten. Om slechts één soort op te kweken, zullen we een zogenaamde reinstrijk maken. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Kies van je 6 schalen degene die een bacteriekolonie laat zien als een losse druppel Neem de laatste agarbodem Gloei de naald uit en laat afkoelen Doop je entnaald in die ene kolonie en haal hem over het oppervlak van de verse agarbodem door een paar maal heen en weer te krassen. Gloei de entnaald wéér uit en kras er nogmaals doorheen, maar nu onder 90 graden. Herhaal dit nog 2x. Zet schaaltje 7 weg in de kast Beantwoord de vragen. Bekijk na twee dagen of je reinstrijk gelukt is.
Opdrachten 1. 2. 3. 4. 6.
Wat is het nut geweest van het 80 graden bad? Waren er verschillen tussen de petrischaaltjes 1,2,3 en 4,5, 6? Welke? Wat is het nut van het uitgloeien van de entnaald? Welk type bacterie levert een glimmende kolonie op, en welk type een meer doffe? Met kristalviolet en logol , voer je een zgn. Gramtest uit. Zoek op Internet wat deze Gram-kleuring inhoudt.
Verwerking Verwerk de resultaten in een uitgebreid verslag van wat je gezien hebt.
14
6.
Module GENCLASSIC2
Practicum: Drosophila-2
Doel Het observeren van verschillende levenstadia van de fruitvlieg
Beschrijving Hiernaast zie je ontwikkelingsstadia van de fruitvlieg. We onderscheiden: ei/embryo 1e instar 2nd instar 3rd instar (Pre)puppa puppa (pop) = donker adult
Merk het verschil op tussen man en vrouw. De voorstadia zijn allen beweeglijk in het kweekmedium.
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: Een bodem met kweekmedium waar de larven in voorkomen. Binoculair+verlichting
Methoden Je hebt voor dit korte practicum ook weinig tijd nodig. Het gaat erom dat je de diversiteit waarneemt van allerlei aspecten van de fruitvlieg. Bekijk het resultaat onder de binoculair.
Opdrachten Neem een foto van wat je ziet of teken het. Kijk of je alle stadia kan terugvinden.
Verwerking Verwerk de resultaten in een kort verslag van wat je gezien hebt.
15
7.
Module MOLGEN1
Practicum: Isolatie DNA
Doel Het isoleren van DNA uit de cellen van kiwi of banaan.
Beschrijving In dit practicum gaan we het DNA uit de cellen van de kiwi halen. Deze procedure is betrekkelijk eenvoudig en kan gebeuren met simpele huis- tuin- en keukenmiddelen.
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: Erlenmeyer Bekerglas 100 ml Filter en filterhouder Ijskoude alcohol of spiritus rijpe kiwi of banaan mesje keukenzout halve reageerbuis afwasmiddel mortier en stamper 100 ml water in de erlenmeyer Heet water (waterbad) + rb rekje
METHODE 1.
Schil de kiwi, snijd deze eerst in kleinere stukjes. Vervolgens maal je hem zo fijn mogelijk met de mortier en stamper.
2.
Breng 100 ml water even aan de kook en los hierin 3 gram zout en 10 tot 15 ml afwasmiddel op.
3.
Giet de oplossing die je bij stap 2 hebt gemaakt bij de kiwimoes en roer dit af en toe even door. Door de ontvettende eigenschappen van het afwasmiddel gaan de celmembranen nu open omdat de celmembranen vooral bestaan uit vetachtige moleculen. De inhoud van de cel (die voornamelijk bestaat uit eiwitten en maar voor een klein gedeelte uit DNA) komt nu vrij in de oplossing.
4.
Gooi na een half uur wachten (wel af en toe roeren) de hele oplossing door een koffiefilter en vang de gefiltreerde vloeistof op in een erlenmeyer. 16
5.
Vul de erlenmeyer voor een vijfde deel met de vloeistof en voeg hier een theelepel zout aan toe. Meng dit goed en als alle zoutkristallen zijn opgelost, voeg je nog een lepel toe.
6.
Giet nu heel voorzichtig de ijskoude spiritus bovenop de kiwioplossing zodat er laag van ongeveer 2 cm spiritus op drijft. Omdat de spiritus zich niet mag mengen met de kiwioplossing is het makkelijk als je de erlenmeyer schuin houdt en heel langzaam langs de rand de spiritus bovenop de kiwioplossing giet. Als de spiritus en de kiwioplossing toch mengen, moet je opnieuw beginnen…
7.
Als je wel een goede scheiding hebt, moet je nu 5 - 10 minuten wachten en dan zie kleine witte vlokjes of misschien wel dunne lange draden die vast geklit lijken aan kleine luchtbelletjes en die langzaam door de spiritus heen naar boven drijven. Na ongeveer een half uur tot een uur is dit het beste en het mooiste te zien. Lange dunne spierwitte draden drijven rond in de alcohol omdat DNA niet oplost in spiritus; dit is nou het DNA van een kiwi! Je kan eventueel met een half opengevouwen paperclip proberen om wat vlokjes op te pikken.
Opdrachten Beantwoord deze vragen in je verslag. 1) Waarom voeg je bij stap 2 kokend water toe? 2) Welke celonderdelen maak je kapot tijdens het malen? 3) Welke celonderdelen gaan kapot door de toevoeging van afwasmiddel? 4) Zout verandert de structuur van eiwitten. Wat doet zout met de chromosomen? 5) Het DNA ‘overleeft’ het warme water doordat het een stabiele structuur heeft. Waardoor is de structuur van DNA zo stabiel? 6) De kiwi bevat een eiwitsplitsend enzym; wat is een enzym?
Verwerking Verwerk de resultaten in een uitgebreid verslag van wat je gezien hebt.
17
8.
Module MOLGEN2
Practicum: Maken van een gel
Doel Het maken van een gel en het scheiden van een mengsel van kleurstoffen.
Beschrijving In dit practicum ga je een eerste gel maken met behulp van agar. We zorgen ervoor dat in de gel kuiltjes aanwezig zijn om later de kleurstof in te laten zakken. De gel bestaat uit agar-agar dat ook vaak in de keuken wordt gebruikt als verdikkingsmiddel. De foto hiernaast toont een gel gemaakt van agar. In het midden zijn gaatjes aangebracht waarin de kleurstoffen zijn aangebracht.
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: Erlenmeyer 50 ml water of TBE buffer (1x) 1 gram agarpoeder bunsenbrander en driepoot+gaasje 1 gram zout
METHODE 1.
Doe 50 ml TBE-buffer (1X) in een erlenmeyer. Voeg daarbij de 1 gram agarpoeder.
2.
Verwarm dit zodat de oplossing nét niet kookt. Pas op, want ineens kookt het over... en hete agaroplossing is HEEEEL heet!
3.
Laat de oplossing met opgelost zout en agar staan tot handwarm, maar wel vloeibaar
4.
Leeg de agaroplossing in een plastic petrischaal en zorg dat het niveau van de agar tot minder dan halverwege de hoogte van het petrischaaltje komt. Je zal zo'n 30-40 ml nodig hebben. Spoel de erlenmeyer direct om, anders krijg je de resten er nauwelijks uit.
5.
Laat de agar stollen.
6.
Als de agar gestold is, kan je met een mesje een drietal kuiltjes snijden die niet tot de bodem reiken. Daarna snij je twee half ronde zijkanten uit de agar weg zodat het middensegment met de kuiltjes blijft zitten. Zie figuur 2.0 hieronder.
18
figuur 2.0
7.
Vouw twee zilverpapiertjes op de lege randen van het petrischaaltjes en zet ze vast met een opstaande paperclip. Deze stukjes zilverpapier steken straks in de zoutoplossing (stap 8).
8.
Maak een TBE-oplossing van 50 ml . Giet deze oplossing over de gel heen zodat dit nét onder de rand blijft. De gel moet wel onder de vloeistofspiegel staan (2 mm).
9.
Nu gebruik je de micropipet om 20 uL kleurstof netjes in de kuiltjes te laten zakken. Er zijn drie mengsels A, B en C.
10.
Sluit de 3x 9 V batterij aan op de draadjes die naar de paperclip lopen en wacht af wat er gebeurd.
11.
Kijk na 1 uur wat er met de plaats van de kleurstoffen gebeurd is. Teken de situatie.
Opdrachten Beantwoord deze vragen in je verslag. 1) Welke van de kleurstoffen gaan naar de pluspool? Welke naar de min-pool? 2) Wat is de rol van het zout in zowel agar als wateroplossing? 3) De kleurstoffen zijn de stoffen Eosine, Methyleen en kristalviolet. Is te verklaren waarom zij een bepaalde kant op gaan? 4) DNA is negatief geladen. Als we in plaats van kleurstof DNA zouden laden in de gaatjes, welke kant gaat dat dan op? 5) DNA is helaas niet zichtbaar. Daarom zullen wij in de module de (giftige) stof EthidiumBromide gebruiken. Die maakt DNA zichtbaar onder UV licht. Zou je een neutraal geladen stof ook zo zien verplaatsen?
Verwerking Verwerk de resultaten in een uitgebreid verslag van wat je gezien hebt.
19
9.
Module MOLGEN2
Practicum: ICT-opdracht
Doel Kennismaken met de DNA-databank van organismen.
Beschrijving Van veel organismen is inmiddels de DNAvolgorde geheel bekend. Van veel andere organismen slechts een deel. In dit ICT-practicum ga je een gen opzoeken van de fruitvlieg Drosophila melanogaster.
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: laptop/PC en internet aansluiting (ICTlokaal of thuis)
METHODE 1. Start Google Chrome of een andere browser op 2. Neem de volgende URL over: De volgende sites bevatten (moeilijke en soms lastig te lezen) informatie: 1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=drosophila Gebruik deze laatste link om wat genen te bekijken van de fruitvlieg. a) Klik op Chromosome 3L b) Klik op graphics. Wat je nu ziet zijn de bekende genen op chromosoom 3L . Elk groen stripje stelt een gen voor. Verwacht geen gen voor 'oogkleur'... De genen coderen voor proteïnen welke mogelijk met o.a. oogkleur van doen hebben. c) Probeer in te zoomen op dat stukje totdat je de DNA-sequentie kan zien.
d) e) f) g) h)
Kijk of je de sequenties kan zien op base-niveau (AGCTACG etc) Klopt het dat de sequenties beginnen met AUG (Startcodon) … waarom niet? Kijk of je ca 35 posities voor het startcodon de sequentie TATAA of TATAT kan zien. Probeer de EINDELOZE mogelijkheden van deze website uit: Selectie op proteinen, genen, andere organismen als arabidopsis thaliana. Bij elk gemeld gen staat "FASTA" "genbank" en "Graphics" Ben je erachter wat het betekent?
Verwerking Verwerk de resultaten in een uitgebreid verslag van wat je gevonden hebt. Zorg dat je in je verslag laat zien welke zaken je allemaal gevonden hebt.
20
10. Doel
Module SOLANUM1
Practicum: ICT-opdracht
Kennismaken met de DNA-databank van de aardappelplant.
Beschrijving Van veel organismen is inmiddels de DNAvolgorde geheel bekend. Van veel andere organismen slechts een deel. In dit ICT-practcium ga je een gen opzoeken van de aardappelplant Solanum
Materiaal Voor dit practicum heb je nodig: laptop en internet aansluiting
METHODE 1. Start Google Chrome of een andere browser op 2. Neem de volgende URL over: De volgende sites bevatten (moeilijke en soms lastig te lezen) informatie: 3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=solanum Gebruik deze laatste link om wat genen te bekijken van de fruitvlieg. a) Kijk of je resistentiegenen R3a en R1 kan vinden. b) Probeer in te zoomen op dat stukje totdat je de DNA-sequentie kan zien.
c) d)
Neem in je verslag op de volledige sequentie van R3a. Kan je deze software laten terugvinden waar de primers zitten? Controleer of dit fragment inderdaad 288 bp lang is. (deze kennis is nodig om in het practicum hetzelfde te zien!)
Locus R1-F
repeat R1 locus (WUR)
Primer CAACCCTGGCATGCCACG
Tm* 56.9
Tm
R1-R R3aF
R1 locus (WUR) R3a locus
CACTCGTGACATATCCTCACT TGGAAGTAGTAGTGCCGACAA
52.9 54.6
56
R3aR
R3a locus
GGAGGACCAACTGCCATAGAA
55.3
Control1 Control1
chloroplast DNA chloroplast DNA
AGTTCGAGCCTGATTATCCC GCATGCCGCCAGCGTTCATC
Alleles ??
size
Genbankno
?? 1
288 bp
AY849382.1
56
1
288 bp
AY849382.1
62 62
1 1
297 bp 297 bp
Verwerking Verwerk de resultaten in een kort verslag van wat je gevonden hebt.
21
11. Module DNA1
Practicum: DNAlab1
Doel Het isoleren van DNA uit de aardappelplant.
Beschrijving In dit practicum proberen we iets van het genoom van de aardappel te weten te komen. Je weet door het vorige practicum dat meerdere genen betrokken zijn bij de resistentie tegen phytophtora. Eén van die genen zijn oa. R1 en R3a. Beide worden in de literatuur gemeld. Om te checken of onze 5-7 aardappelrassen deze genen bezitten, gaan we moleculair onderzoek doen.
Voorkennis Om dit praktcum succesvol te doorlopen moet je voldoen aan de volgende eisen: 1. De practica MOLGEN2 en SOLANUM1 gedaan hebben. 2. De powerpointpresentatie(s) over PCR, gel-electroforse en DNAstructuur gevolgd en begrepen hebben, danwel van je docent afdoende informatie ontvangen hebben over deze onderwerpen zodat jij weet wat de termen PCR en gel-electroforse inhouden.
Methode-volgorde Het practicum kent de nodige wachttijden, omdat de moleculaire processen dit nu eenmaal opeisen. In die tussentijd zal de docent alvast wat resultaten laten zien. De gevolgde methode bestaat uit: A) Het isoleren van DNA uit vijf aardappelrassen (elk tweetal neemt één ras) B) Het isoleren van DNA uit een stukje schil van de aardappels Bintje en XXX (wat er bij de winkel maar te koop is) Mogelijk dat de docent nog extra materiaal heeft. Het klaarmaken van PCR-stap van je ras naar keuze (Het gieten van de agarose-gel doe de docent: er zijn te weinig electroforese bakjes.) C) Het overbrengen van de geamplificeerde PCR-producten naar de gel D) Het laten lopen van de gel onder 100 Volt. E) Interpretatie van de resultaten.
22
Materiaal -Methode A)
Het isoleren van DNA uit vijf aardappelrassen (elk tweetal neemt één ras)
Je werkt in tweetallen 1. kies één van aardappelsoorten waarvan we in de vriezer het bladmateriaal hebben. Waarschijnlijk heb je die keus eerder al moeten maken, zodat de docent je een diepgevroren sample geeft. De school heeft geen vriezer, alles zo in de thermodoos. Soort Texla Doré Mozart Mona Lisa Irene aantal 8 8 8 8 8 buizen in stock. (2013) 2.
3. 4. 5. 6. 7. 8.
In je buisje tref je een stukje bevroren bladmateriaal aan dat in de zomer van 2013 van een volkstuin komt. Hier zijn vijf rassen naast elkaar gezet en opgekweekt tot volwassen plant. Daarna zijn na de bloei stukje blad verzameld en in de vriezer bewaard. Naderhand zijn stukjes blad voor onderzoek in kleine (2 ml) epjes gedaan. Die gebruiken wij. Neem ieder een stel schone latex handschoenen en hou die aan! Maak je tafel schoon met bleek of alcohol. Neem een plankje met gaatjes zodat je steeds de epjes kwijt kan. Haal bij de docent/TOA twee kleine epjes van 0.2 ml. 10 pipetpunten van 10-100 uL (5 kleine en 5 grote) bewaar ze in een boterhamzakje. een micropipet schone tissue (groen) boterhammenzakje objectglaasje klein schoon!! mesje Installeer op je groene tissue je plankje en de 2 lege epjes. Je pipetpunten bewaar je in een brandschoon boterhammenzakje. Haal bij de docent/TOA: 2 Epje met lysisbuffer (hierin zit al 20 uL Dilutionbuffer)
23
9. INTERMEZZO: even een vaardigheid leren: de micropipet. Onderstaande methode voorkomt dat we iedereen peperdure pipetten moeten geven. Die zijn er nu nog niet. Bovendien zijn die erg kwetsbaar. Hoe doen we dit wel? We nemen 2 kleine en twee grote pipetpuntjes (oefentips uit de doos) Een setje schone handschoenen. Een leeg petrischaaltje. Een donkere ondergrond. een buisje met methyleenblauw. 1. 2. 3.
4. 5.
Trek je handschoenen aan Leg in het bakje een paar druppels water Door de pipetpunt losjes vast te houden en in de druppel te dopen kan je met je wijsvinger 'druk' zetten op de bovenkant van de pipet. Door de duwen, blaas je er lucht uit, door los te laten, zuig je wat water op. Kijk of het lukt om op deze manier 0.5 ul (kleinste tip) en 1.0 ul (kleine of grote tip) op te zuigen. Om op een schoon deel van petrischaal je druppel te lozen, moet je harder drukken.
Op bovenstaande foto heb je een idee over de minuscule hoeveelheden. In ons practicum hebben we vaak de hoeveelheid 0.5 uL nodig. Die doe je met de kleinste pipetpunt. Vaak al je zien dat door capillaire werking, de vloeistof al vanzelf wordt opgezogen. Als je 0.5 ul in een 0.2 ml epje moet plaatsen, zet dan de pipetpunt tegen de wand. Ook kan je kijken of het lukt om 0.5 uL over te brengen in een 0.2 ml epje.
24
Door eerst 10 uL water in het epje te doen, vervolgens 0.5 uL methyleen blauw en dit even te vortexen, zie je of je overdracht is gelukt. NU VERDER met DNA1 B)
Het isoleren van DNA uit een stukje schil van de aardappels Bintje en XXX (wat er bij de winkel maar te koop is) Mogelijk dat de docent nog extra materiaal heeft. Het klaarmaken van PCR-stap van je ras naar keuze (Het gieten van de agarose-gel doe de docent: er zijn te weinig electroforese bakjes.) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
10. 11. 12.
Neem een schoon objectglaasje Neem een starmesje of iets dergelijks Maak het mesje schoon met alcohol Snijdt 3 mm2 van het bladmateriaal doe dit ZONDER aanraken in je epje met 20 uL Dilutionbuffer. (Epje met D erop) Neem een pipetpunt (schoon) en druk het stukje blad fijn tegen de wand van je ep. (de oplossing wordt iets groeniger) Centrifugeer gedurende 30 seconden. (er passen 4 eps tegelijk in) Neem een schone (tweede) ep van 0.2 uL Voeg toe in deze volgorde: I 10 uL DNA-buffer (hierin zitten nucleotide en extra componenten) II 0.5 ul Primermix R1 (zet de druppel tegen de wand van de ep) II 0.5 uL DNA-polymerase (HEEEEEL DUUR!! (ca 60 euro voor 200 uL)) Zet de druppel tegen de wand van de ep. III 0.5 uL van de eerste ep. Vermijd dat stukjes blad meekomen.. Voeg ten slotte toe: 10 uL xNase-vrij water uit een aparte waterbuis. Hierin zit geen enzym dat DNA afbreekt.. Vortex het epje kort. en centrifugeer 30 seconden. Alles zit gegarandeerd onderin! Lever je epje in bij de docent/Toa of zet hem zelf in de PCR-machine. Onthoudt goed welke van jullie is. (markeer met een stift: groep1: Mozart 1 : M1 of M2 etc groep2: Irene N1, N2 groep3: Texla T1, T2 T3 etc
De TOA/docent start de pcrmachine op programma 20. Deze staat zó ingesteld dat deze het volgende programma doorloopt: 1. 5 min 98 graden 2. 40 keer {10 sec 98 graden, 20 sec 45 graden, 20 sec 72 graden} 3. 5 min 72 graden. Het programma draait gedurende 4 uur!!! Intussen laat de docent enkele gels zien die al eerder gelopen hebben, zodat je weet wat je kan verwachten.
25
Maak nu de bijbehorende opdrachten. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Schrijf een uitvoerig verslag van dit practicum Geef duidelijk aan waar het practicum zou kunnen misgaan en wat verstorende factoren zijn Gebruik de ncbi-database om te kijken of er nog meer genen zijn waarop je onze aardappelplanten zou kunnen testen. Gebruik Google om te zien welke documenten er nog meer over aardappel(veredeling) gaan. Lees het artikel op de site van Bioimpuls Aardappelveredeling (Projecten) Bekijk deze site eens goed! Lees het artikel op de site van de WUR:
http://www.wageningenur.nl/upload_mm/2/b/8/0ee26d65-6a78-411b-88cfcda044be5ab3_KennisOnline%20Magazine%20mei%202012.pdf
DIT DEEL VAN HET PRACTICUM MOET DE DOCENT/TOA doen. C)
Het overbrengen van de geamplificeerde PCR-producten naar de gel De PCR is klaar en de epjes kunnen worden geladen met 5 uL loading dye. Het nut van deze kleurstof is dat je bij daglicht kunt zien hoevér de gel is gelopen, én dat het laden van de epjes makkelijker gaat. Bij het laden wordt 20 uL van jouw epje gemixd met deze loading dye. Aangezien de loadingdye glycerine bevat dat zwaarder is dan water, loopt de gepipetteerde DNA-sample niet meeteen de gel uit. We pipetteren nl 'onder water'!.
D)
Het laten lopen van de gel onder 100 Volt. De gel wordt gerund op 10 minuten 50 en later op 100 Volt. Dit proces duurt bijna 2 uur.
E)
Interpretatie van de resultaten. De volgende morgen is de run klaar en bekijken de leerlingen de gemaakte gel onder UV, of met behulp van een foto.
Vragen: a) Wat zijn de resultaten van de gel? b) Kloppen deze met wat de fabrikant opgeeft voor de resistentie? c) Hoe zou je testen of ook tomaat over het gen R1 of R3a beschikt? Beschrijf kort dat practicum d) Hoe zou je dit practicum kunnen uitbreiden? -> andere genen (database, primers ontwerpen etc) Neem een foto van wat je ziet of teken het. Kijk of je alle stadia kan terugvinden.
Verwerking Zie opdrachten. 26
