ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra přírodovědných oborů
TÝMOVÝ PROJEKT
2011/2012
Monika Burdová
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra přírodovědných oborů
Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikrobiálních kontaminací Týmový projekt
Vedoucí projektu:
Mgr. Veronika Vymětalová
Student:
Monika Burdová
Rok:
2011/2012
Anotace Předmětem týmového projektu „Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikroorganizmů“, konkrétně mé části „Použití metod světelné mikroskopie k detekci mikrobiálních kontaminací“ je seznámit se s mikroorganismy, speciálně kvasinkami, popsat kvasné procesy, kterých se tyto organismy zúčastňují, zjistit uplatnění těchto procesů v potravinářském průmyslu a v neposlední řadě také popsat kontaminanty těchto procesů. V druhé části projektu jsem se zabývala vlastním experimentem, který spočíval v pozorování kvasinek pomocí světelné mikroskopie v roztoku destilované vody a v roztoku sacharózy.
Annotation The goal of team thesis: “Using of methods of light microscopy to detection of microorganisms“, specifically my part „Using of methods of light microscopy to detection of microbial contamination” is to learn about microorganisms, especially with yeast, to describe the fermentation process, which these organisms take part in, to find their application in food industry and last but not least to describe contaminants of these process. In the second part of my work I dealt with experiment own, which concerned with observation of yeast in the solution of distilled water and solution of sucrose using the light microscopy.
Poděkování Ráda bych tímto poděkovala vedoucí týmového projektu Mgr. Veronice Vymětalové, za její pomoc při vypracovávání našeho projektu, především v experimentální části a dále svému otci Mgr. Pavlu Burdovi za veškeré korekturní práce.
ii
Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem …………………………………………………………………………………………… ……..vypracoval(a) samostatně a použil(a) k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu § 60 Zákona č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).
V ……………. dne ………………
……………………. podpis
iii
OBSAH ÚVOD ........................................................................................................................................ 1 1
KVASINKY ....................................................................................................................... 2 1.1
Zařazení do systému a základní charakteristika .......................................................... 2
1.2
Historie pozorování kvasinek ...................................................................................... 2
1.3
Morfologie ................................................................................................................... 2
1.4
Cytologie ..................................................................................................................... 3
1.5
Kultury kvasinek.......................................................................................................... 5
1.6
Rozmnožování ............................................................................................................. 6
1.6.1
Vegetativní ............................................................................................................... 6
1.6.2
Pohlavní ................................................................................................................... 7
1.7
1.7.1
Askosporogenní .................................................................................................... 8
1.7.2
Bazidiodporogenní ............................................................................................. 16
1.7.3
Rody, u nichž není známa tvorba pohlavních spor ............................................ 18
1.8
Etanolové kvašení .............................................................................................. 23
1.8.2
Výroba piva ........................................................................................................ 24
1.8.3
Pivovarské kvasinky........................................................................................... 25
1.8.4
Kontaminace piva ............................................................................................... 26
1.8.5
Výroba vína ........................................................................................................ 26
1.8.6
Kontaminace vína ............................................................................................... 27
1.8.7
Pekařské droždí .................................................................................................. 28
1.8.8
Kontaminace droždí ........................................................................................... 29
Patogenní kvasinky .................................................................................................... 29
MIKROSKOPOVÁNÍ ..................................................................................................... 31 2.1
Základní světelná mikroskopie .................................................................................. 31
2.2
Fázový kontrast.......................................................................................................... 31
2.2.1 3
Průmyslové využití kvasinek ..................................................................................... 23
1.8.1
1.9 2
Taxonomie kvasinek a jejich zástupci ......................................................................... 7
Princip .................................................................................................................... 32
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................ 34 3.1
Pozorování zástupců kvasinek v běžně dostupném zdroji......................................... 34
ZÁVĚR..................................................................................................................................... 37 Seznam použité literatury ......................................................................................................... 38 Seznam zdrojů obrázků ............................................................................................................ 40
iv
ÚVOD Kvasinky doprovázejí člověka již dlouhá staletí, možná tisíciletí, avšak jejich objev není tak starý. Tyto organismy nám pomáhají, ale i škodí. Setkáváme se s nimi prakticky v každodenním životě. Ať je to již při pití piva či vína nebo při konzumaci chleba, tak jsou obsaženy také v našem organismu. Jsou to jedny z nevíce používaných mikroorganismů na světe a díky nim jsme schopni vyrobit alkohol prakticky z jakéhokoli ovoce, může péct nadýchané pečivo, jsou to ale také organismy vhodné ke zkoumání na poli genetiky. Na druhou stranu mohou způsobit celou škálu onemocnění a chorob jak lidí a živočichů, tak rostlin. Pro všechny tyto vlastnosti a schopnosti je zajímavé a potřebné zkoumat a pozorovat je, stejně tak jako organismy a látky, které kvasným procesům škodí. Cílem této práce tedy je seznámit se s kvasinkami a jejich vlastnostmi, rozdělit je na základě těchto vlastností, obeznámit se také s kvasným procesem a jeho využitím v průmyslu, zjistit nejčastější kontaminanty kvašení, určit nejvhodnější techniku světelné mikroskopie pro pozorování těchto mikroorganismů a v experimentální části si ověřit vědomosti v praxi a zjistit možné způsoby detekce kontaminantů pomocí výše zmíněné světelné mikroskopie.
1
1 KVASINKY Zařazení do systému a základní charakteristika Kvasinky patří mezi eukaryotní organismy, konkrétně mezi houby, oddělení vřeckovýtrusých a třídu hemiaskomycety, pravé vřeckovýtrusné či archiaskomycety, avšak jsou výjimky patřící do oddělení stopkovýtrusných.[1][2] Vzhledem k těmto rozdílným zařazením netvoří kvasinky taxonomickou skupinu a je obtížné je přesně definovat vzhledem k jejich rozdílnosti. Některé druhy žijí jako saprofyté, jiní jako parazité. Rozmnožují se převážně pučením, ale vyskytují se i výjimky, u kterých je možné přehrádečné dělení. U některých druhů bylo prokázáno pohlaví, u některých však stále je neurčeno. Kvasinky jsou organismy tvořící jak pravé mycelium (podhoubí), tak pseudomycelium (soubor nepravých hyf). [3] 1.1 Historie pozorování kvasinek Název kvasinek se vztahuje ke kvasným procesům, které mají velice dlouhou historii. Již ve starém Babylonu v dobách před naším letopočtem se vyráběl ze zkvašeného odvaru z naklíčeného obilí nápoj, který byl podobný dnešnímu pivu, jsou také známy doklady o pití vína a piva ve starém Egyptě. V takovéto formě lidé znali kvašení už od pradávna, avšak s kvasinkami, jako průvodci těchto dějů se seznámili až dlouho poté. [3] V sedmnáctém století pozoroval pravděpodobně jako první Angličan Antonie van Leeuwenhoek malé kuličky v pivě pomocí primitivního mikroskopu, avšak tehdy se kvasinky považovaly za jakýsi vedlejší produkt při čiření tekutiny. Následoval objev v roce 1837, kdy Theodore Swann popsal v kvasícím víně rozmnožující se kvasinky a označil je názvem „cukerná houba“. Rozhodujícím momentem pro přijmutí faktu o podílení se kvasinek na procesu kvašení byla studie Luise Pasteura z roku 1873, ve které dokládal účast mikroorganismů na kvasném procesu a také negativní vliv kyslíku na tento průběh. [3] 1.2 Morfologie Většina kvasinek se rozmnožuje pučením či dělením a s tím souvisí také tvar jejich buněk. Nejčastěji je vejčitý, kulovitý nebo elipsoidní, ale je také možné, aby buňky byly dlouze protáhlé, válcovité, trojúhelníkovité či citronkovité. Tvar závisí také na stáří buněk či kultivačním prostředí, takže většinou nebývá stálý, ale naopak kolísá. Velikost buněk je mezi 3 – 6 μm na šířku a 3 – 15 μm na délku.[4]
2
U některých druhů dochází k pučení pouze na pólech a poté zůstávají buňky spojeny ve dlouhá zaškrcovaná vlákna, tzv. pseudomycelia, které obsahují místa se svazky kratších elipsoidních buněk – blastospory. Jiné odrůdy se dělí příčně, čímž vzniká pravé mycelium, také s blastospory. Tvorba pseudomycelia či mycelia se vyskytuje většinou u rodů se zvýšeným aerobním metabolismem.[4] Pro některé rody je typické pučení na široké základně, což je přechod mezi pučením a dělením. Některé kvasinky mají tenké stopky (sterigmata), na kterých se tvoří exospory (balistospory), které jsou odmršťovány kapalinovým mechanismem.[4]
Obr. č. 1: – Růst kvasinek a) ve svazcích buněk, b) v pseudomyceliu, c) v pravém mycelium [1]
1.3 Cytologie Na okraji buněk kvasinek je buněčná stěna polysacharidové povahy (z 80%) doplněná bílkovinami (6 – 10%), lipidy a fosfolipidy (3-10%) a fosforečnany, vázanými esterovými vazbami na polysacharidy. Tyto fosfátové zbytky spolu s –COOH skupinami bílkovin způsobují negativní náboj, který ovlivňuje adsorpci látek z živného prostředí. Stěna se skládá hlavně z glukanů, u některých druhů jsou zde přítomny ještě mannany či glukosamin a chitin.[4] Na povrchu buněčné stěny jsou jizvy po pučení a jejich počet se pohybuje mezi 9 – 43 (nejčastěji 15 – 24). Jizvy po obarvení primulinem (látka podobná glykosidům) silně fluoreskují, je tedy možné je pozorovat pomocí fluorescenčního mikroskopování. Na jednom z pólů buňky je jizva po dřívějším spojení buňky s mateřskou. Nazývá se jizva zrodu a u některých rodů, kde buňky nepučí nikdy vícekrát na jednom místě, je možné pomocí těchto jizev určit stáří buňky či růstovou fázi.[4]
3
Některé druhy mají na povrchu stěn buněk polysacharidové obaly ve formě pouzder. Stěna kvasinek je rozkládatelná při působení enzymů trávicího traktu hlemýždě Helix pomatia či enzymů některých bakterií.[4] U mladých buněk je cytoplazma průhledná, homogenní hmota, oproti tomu u starších se objevují zrníčka a vakuolizace. Cytoplazma obsahuje systém dvojitých membrán, endoplazmatické retikulum, které mají póry a na povrchu jsou zrníčka polyzomů, agregátů ribozomů, v nichž se vyrábějí bílkoviny. Endoplazmatické retikulum obsahuje také různé enzymy a rezervní látky.[4] Mezi další organely kvasinkových buněk patří mitochondrie, strukturované útvary různorodého tvaru. Jsou dlouhé až 3 μm a široké 0,3 až 1 μm. Každá mitochondrie má dvě membrány, vnější má bradavičnatý povrch a vnitřní tvoří vchlípeniny směrem dovnitř (kristy). Tyto organely jsou složeny především z bílkovin, lipidů a fosfolipidů. Obsahují také RNA (kyselina ribonukleová) a DNA (kyselina deoxyribonukleová). Jsou zde také dýchací enzymy a systém oxidační fosforylace, syntetizují se tu také některé bílkoviny. [4] Vakuola je jednomembránová organela, která se vyskytuje často u mladých buněk ve větším počtu, oproti tomu starší klidové buňky obsahují většinou pouze jednu velkou, která vyplňuje i téměř celý obsah buňky. Vakuola má při pozorování, kvůli roztoku propouštějící světlo, stejnou barvu jako zorné pole. Uvnitř vakuol se nacházejí hydrolytické enzymy (proteinázy, ribonukleáza, esteráza), polyfosfáty a draselné ionty, aminokyseliny a puriny. [4] Další membránový útvar je Golgiho aparát, který má tvar plochého měchýřku či několika těchto měchýřků nebo rovnoběžně uložených cisteren. Jeho pravděpodobnou funkcí je transport prekurzorů (stavební kameny) buněčné stěny z cytoplazmy přes cytoplazmatickou membránu. [4] Uvnitř kvasinkových buněk je také cytoskelet, což je vlastně síť proteinových vláken umožňující pohyb organel. Významné jsou zde mikrotubuly, vycházející z určitého centra, jež jsou nepříliš ohebné trubice z bílkoviny tubulinu a jejichž volné konce se podle potřeby mohou rozkládat a obnovovat. Molekula tubulinu obsahuje guanosintrifosfát, což je látka sloužící jako zdroj energie pro zapojení mikrotubulu. [4] V buňce kvasinek se nacházejí také zřetelná zrníčka rezervních látek, hlavně volutinu a glykogenu, u některých to může být tuk, který může tvořit až 60% sušiny buňky. [4] Jádro má dvojitou membránu, obsahující veliké póry. Leží přibližně ve středu buňky, a pokud ho chceme pozorovat, je nutné speciální barvení. Vzhledem k velmi obtížnému rozlišení chromozomů jsou jejich počty odvozeny z genetických studií. Jádro obsahuje také jadérko, které má srpkovitý tvar, leží těsně pod jadernou membránou a je možné ho také 4
barvit některými barvivy. Můžeme také pozorovat pólové tělísko vřeténka, jež má diskovitý tvar a vycházejí z něj mikrotubuly, jež hrají důležitou roli při dělení jádra v průběhu množení buněk. [4]
Obr. č. 2: Schéma buňky kvasinek: 1 – buněčná stěna, 2 – jizva zrodu, 3 – cytoplazmatická membrána, 4 – jádro, 5 – jaderná membrána, 6 – vakuola, 7 – endoplazmatické retikulum, 8 – mitochondrie, 9 – glykogen, 10 – volutin, 11 – lipidy, 12 – Golgiho aparát [1]
1.4 Kultury kvasinek Pokud jsou kvasinky v kapalném prostředí, začínají se shlukovat a usazovat na dně ve formě sedimentu, což se projevuje jako zákal. Pokud potřebují větší množství kyslíku, po využití všech sacharidů vytvoří na povrchu kultivační tekutiny slizký povlak neboli mázdru. U některých druhů se vytvoří na povrchu média křís, což je křehká blanka. [3] Při použití pevného média vytvoří kvasinky kolonie. Ty jsou buď jednobuněčné či z jedné spory (unicelulární, monosporické) nebo z několika buněk. Abychom mohli posoudit velikost kolonie, sledujeme její povrch, který je buď hladký s vyvýšeným středem či prohlubní uprostřed, nebo drsný různého tvaru. Některé kolonie mohou být také slizovité, což svědčí o výskytu polysacharidových pouzder kolem buněk. [3] Některé rody či druhy lze určit podle tvaru, velikosti, vzhledu či rychlosti růstu kolonie. Tyto vlastnosti závisí na podmínkách kultivace, velikosti a tvaru samotných buněk či také na vzniku mutací, což zapříčiňuje různé rozdílnosti mezi koloniemi. [3]
5
1.5 Rozmnožování Kvasinky mají dva základní druhy rozmnožování. Vegetativní, což je pučení či přehrádečné dělení, a potom pohlavní, kde je to izogamní či heterogamní způsob. U každého druhu či rodu je životní cyklus či způsob rozmnožování rozdílný a závisí také na spoustě okolních faktorů. [3] 1.6.1 Vegetativní Největší část zástupců kvasinek se rozmnožuje pomocí pučení, při kterém se vytvoří na buňce postupně se zvětšující pupen až do stejné velikosti jako je buňka samotná. Během tohoto procesu se fragmentují vakuoly, v místě tvorby pupene se hromadí sekreční měchýřky, prodlužují se mitochondrie a jádro se přesune na hranici mezi mateřskou buňkou a pupenem. Poté se rozdělí a spolu s částí cytoplazmy a dalších organel přejde do pupenu, spojení mezi ním a mateřskou buňkou se postupně uzavře a nová buňka se definitivně oddělí. Na základě místa tvorby pupene, můžeme pučení rozdělit na monopolární, bipolární či multipolární. Je ale možné, že buňky zůstanou spojeny po vypučení na pólech ve vlákna, čímž vzniká pseudomycelium či pravé mycelium s příčnými přepážkami mezi jednotlivými buňkami. Toto se děj většinou u kvasinek s aerobním metabolismem. [3]
Obr. č. 3: Průběh pučeni kvasinek: 1 – jádro, 2 – mitochondrie, 3 – vakuola, 4 – endoplazmatické retikulum, 5 – pólové tělísko vřeténka, 6 – mikrotubuly, 7 – vřeténko [1]
6
Přehrádečné dělení je charakteristické například pro rod Schizosacchatomyces a je možné bez vzniku mycelia i s ním.[3] Na přechodu mezi přehrádečným dělením a pučením je rozmnožování se pomocí pučení na široké základně, kde mateřská buňka a dceřiná jsou spojeny širokým krčkem, který se postupně uzavírá přepážkou. [3] 1.6.2 Pohlavní Po několikerém buněčném dělení dojde u většiny druhů kvasinek ke spájení dvou haploidních buněk a také jejich jader, čímž vznikne diploidní buňka (zygota). Její jádro se může meioticky rozdělit a tím vzniknou 4 haploidní jádra, kolem kterých jsou ve vřecku umístěné spory. Pokud jsou původní buňky přibližně stejně veliké, nazývá se toto spájení izogamní, pokud je jejich velikost rozdílná, jde o spájení heterogamní. K druhému případu dochází pouze u homothalických kmenů kvasinek, což jsou kmeny s pohlavně nediferencovanými buňkami. Druhým případem jsou kmeny heterothalické, kde se vyskytují opačné párovací (kopulační) typy, které se spájejí díky zastavení buněčného cyklu a změnění složení stěn a tvaru jedné z buněk pomocí látek peptidového charakteru vylučovaných druhou buňkou. [3] 1.6 Taxonomie kvasinek a jejich zástupci Tříděním kvasinek (taxonomií) se u nás zabývá například Anna KockováKratochvílová, která založila také jejich sbírku, další významná sbírka je v Delftu v Holandsku. V dnešní
době je asi nejrozsáhlejší českou sbírkou Česká sbírka
mikroorganismů (CCM) při Ústavu experimentální biologie PřF Masarykovy univerzity. [3][5] Každý zdroj a autor však rozdělují kvasinky jinak, což je to způsobeno nejednotností této skupiny. Nejvhodnější je třídit je podle způsobu rozmnožování. První skupinou jsou askosporogenní (telemorfní), které se vyznačují tvorbou vřecek s askosporami a jsou zařazené mezi Ascomycotina do třídy Hemiascomycetes a řádu Endomycetales. Tyto kvasinky se dělí přehrádkami a mají pravé mycelium či jsou jednobuněčné a pučí. Další skupinou jsou bazidiosporogenní (sporobocomycetaceae) z řádu Basidiomycetales, tvořící bazidiospory či sporidie. Poslední skupinou jsou imperfektní kvasinky (anamorfní), u kterých není známa tvorba pohlavních spor, jsou tedy považovány za asporogenní. Jsou zařazeny mezi Deuteromycotina a v dřívějších dobách byly označovány jako „nepravé kvasinky“ či „kvasinkové mikroorganizmy“. [3] [4] [7]
7
1.7.1 Askosporogenní Vegetativní rozmnožování multilaterálním pučením: - r. Saccharomyces Tento rod je pravděpodobně nejdůležitějším a nejznámějším z kvasinek. Druhy patřící k Saccharomyces zkvašují většinou několik cukrů, avšak nevyužívají laktózu jako zdroj uhlíku ani NO3- jako zdroj dusíku. Jejich buňky jsou většinou elipsoidní, vejčité či protáhlé. Spájení u nich je izogamní a jejich askospory mají kulatý až elipsoidní tvar a vyskytují se v asku po 1 až 4. [4] S. cerevisiae je průmyslově a technologicky nejdůležitější kvasinka. Její buňky jsou kulovité až oválné, jejich velikost je 6 – 7 x 7,5 – 8,7 μm. Tyto kvasinky zkvašují glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu a rafinózu. Do tohoto rodu patří i vinařské kmeny, dříve označovány jako samostatná varieta S. cerevisiae var. Elipsoideus, jinak je to spíše pivní, vinná, lihovarnická a pekařská kvasinka. Pro jednotlivá odvětví se využívají speciální kmeny, které vyhovují příslušným podmínkám a mají požadované vlastnosti. Tato kvasinka je také modelovým organismem pro biochemické a genetické práce. [4] Kmeny pro výrobu droždí a pivovarské kmeny musejí mít stálý tvar, velikost buněk a stálé vlastnosti. Byly tedy vyselektovány polyploidní nebo aneuploidní buňky, které mají v důsledku nadbytečných chromozomů přerušený průběh meiózy. [4] Pekařské droždí se připravuje aerobní fermentací okyselených melasových zápar, které jsou přiživené amonnými solemi a fosfátem. Zápary se dále provzdušňují stlačením sterilním vzduchem, který je přiváděn ke dnu tanku, kde probíhá kvasný proces. Díky neustálému přívodu melasové zápary je dosaženo aerobního metabolismu a buňky se díky tomu rozmnožují za nízké koncentrace cukrů v prostředí a i při tomto procesu se produkuje určité množství etanolu. [4] Saccharomyces cerevisiae subsp. cerevisiae jsou především pivovarské kvasinky, které jsou velmi podobné pekařským. U svrchního typu kvašení probíhá tento proces při teplotě nad 15° C. Tyto kvasinky nemají enzym melibiozu, odštěpují fruktózu pomocí invertázy a disacharid melibiosu, který vzniká při tomto procesu, neumějí rozložit. Těchto kvasinek se využívá při výrobě piva anglického typu. [4] Kmen Saccharomyces cerevisiae subsp. uvarum je označován jako spodní pivovarská kvasinka, dříve jako S. Carlsbergensis. U tohoto kvašení je třeba nižší teplota (6 – 10°C) a také delší čas. Při pomnožování je třeba provádět provzdušňování a při kvašení a dokvašování je naopak potřeba vytvořit anaerobní podmínky. Po procesu prokvášení klesají kvasinky na
8
dno kvasících nádob. Takto vyrobená piva mají delší trvanlivost a patří mezi ně například česká. [4] S. exiguus: Tento druh fermentuje glukózu, sacharózu, galaktózu. Vyskytuje se především na ovocných výrobcích, ovoci samotném, v limonádách, fermentovaných nápojích atd. [4]
Obr. č. 4: Saccharomyces cerevisiae - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm [2]
Obr. č. 5: Saccharomyces cerevisiae - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25°C (tzv. obrovská kolonie)[2]
- r. Zygosaccharomyces Kvasinky tohoto rodu jsou osmotolerantní a snesou i 50% glukózy v prostředí, ve kterém se nacházejí. Jejich buňky jsou schopné tvořit pseudomycelium. Je to rod, který se odštěpil od Saccharomyces. Kvasinky Zygosaccharomyces jsou častou příčinou kažení čokolád, medu a dalších cukrovinek. [4] Z. bailii se vyskytuje na některých potravinách s obsahem cukru nad 60%. Dobře snáší vysoké teploty, nízké pH či vysokou koncentraci etanolu a oxidu siřičitého. Způsobuje kontaminace vína – tvorba křísu. Z. rouxii způsobuje kažení čokoládových bonbonů, Z. bisporus je schopná zkvašovat glukózu a také způsobuje kvašení medu či sirupu, kde při tomto procesu vzniká pěna. [3][4] 9
- r. Kluyveromyces Tento rod byl oddělen od Saccharomyces z důvodu nepřítomnosti hexosové represe dýchání a vegetativní fázi, která je v převážné míře haploidní. Jedním z druhů je K. marxianus, který se vyskytuje ve dvou variantách - var. Marxianus (K. marxianus, K. fragilis) a var. Lactis (K. lactis). K. lactis je obsažena v kefírových zrnech, spolu s některými bakteriemi, z kterých se vyrábí kefír a zkvašuje laktózu. K. marxianus var. Lactis se používá také k výrobě krmných kvasnic. [3][4]
Obr. č. 6: Klyveromyces lactis - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm [2]
Obr. č. 7: Klyveromyces lactis - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25°C (tzv. obrovská kolonie)[2]
- r. Pichia Tento rod se vyznačuje nízkou kvasnou schopností a vytvářením křísu na tekutých substrátech. Z cukrů vznikají organické kyseliny, které reagují s alkoholy na estery, jež způsobují pachuť či zápach kontaminovaného produktu. Na základě těchto vlastností jsou nežádoucím kontaminantem piva, ovocných šťáv, vína či kysaného zelí. [3][4][7]
10
Obr. č. 8: Pichia anomala - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
Obr. č. 9: Pichia anomala - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25° C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Hansenula Rod Hansenula se odlišuje od rodu Pichia především schopností využívat dusičnany. Tento rod je také schopen zkvašovat cukry, tvoří kyseliny a estery, způsobují křís ve víně. Jsou velice rozšířené v přírodě a kontaminuji ostatní kvasné procesy v potravinářském průmyslu, kde například způsobují nežádoucí zákal piva či chuťové změny produktů. V některých zdrojích je rod Hansenula a Pichia považován za jeden a tentýž. [3][4][7]
- r. Yarrowia Pučící buňky rody Yarrowia vytvářejí pseudohyfy i pravé hyfy. Y. lipolytica – dříve nazývána Candida lipolytica nebo Saccharomyces lipolytica - není schopna zkvašování, avšak může štěpit tuky. Je využívána pro produkci biomasy růstem na n-alkanech ropy pro krmné účely a biotechnologické čištění ropy. [3][4]
11
Obr. č. 10: Yarrowia lipolytica - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
Obr. č. 11: Yarrowia lipolytica - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25°C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Debaryomyces Kvasinku D. hansenii můžeme najít v mléčných výrobcích, v mase, tabáku a výrobcích studené kuchyně, ale také na pokožce lidí či zvířat. Speciální kmen je složkou tepelně neopracovaných masných výrobků především kvůli jeho výjimečným schopnostem snižovat redoxpotenciál, štěpit tuky či přispívat k tvoření aroma a stabilizaci zbarvení těchto výrobků. [3][4]
Na povrchu kapalného média vytvářejí suchou blanku, některé zástupce můžeme najít v mořské vodě či solených potravinách, mají bradavčité spory a slabé kvasné schopnosti. [3][4]
12
Obr. č. 12: Debaryomyces hansenii - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
Obr. č. 13: Debaryomyces hansenii - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25° C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Lipomyces Lipomyces mají pytlovitá vřecka s mnoha sporami, vytvářejí kolem sebe houbovitá pouzdra a nezkvašují cukry. U tohoto druhu se vyskytuje v asku 8 – 10 elipsoidních askospor a z jedné jediné jejich buňky může vzniknout až 6 asků. Obal buněk je obalen polysacharidem, který je možné barvit modře. [3][4]
- r. Nematospora Vřecka těchto zástupců jsou větší než vegetativní buňky. N. coryli má 8 spor s přívěsky a parazituje na některých rostlinách, jako je například bavlník, kávovník a citrusové plody. V roce 200 byl N. coryli přejmenován na Eremothecium coryli. Tento rod je fytopatogenní (způsobující choroby rostlin) a v asku se u něj vyskytuje 8 vřetenovitých askospor s bičíky. [3][4]
13
- r. Metschnikowia Některé druhy tohoto rodu se nacházejí jako parazité u obratlovců či se vyskytují na rostlinách a ovoci. Uvolňují do svého okolí barvivo pulcherimin, jsou schopny slabě zkvašovat a vyskytují se například na ovoci či v ovocných šťávách. Jeden ze zástupců - M. bicuspidata se vyskytuje v mořských vodách. [3][4] Vegetativní pučení na široké základně: - r. Saccharomycodes Rod Saccharomycodes má silné fermentační účinky, buňky jsou cintronkovitého tvaru a je možné, že některé askospory kopulují přímo v asku. Tento rod nemá vůbec haploidní vegetativní fázi. Vyskytuje se na ovoci, zúčastňuje se spontánního kvašení vína i po zasíření, čímž způsobuje nežádoucí kontaminace. [3][4]
Obr. č. 14: Saccharomycodes ludwigii - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
Obr. č. 15: Saccharomycodes ludwigii - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25°C (tzv. obrovská kolonie). [2]
14
- r. Nadsonia Jediný zástupce rodu Nadsonia, Nadsonia fluorescens využívá ke svému rozmnožování heterogenní spájení.[7]
- r. Wickerhamia W. fluorescens - zástupce kvasinek rodu Wickerhamia se množí v médiu s obsahem glukózy větším než 50%. Pokud se vyskytuje v tuhých živných půdách, může do nich vypouštět riboflavin (vitamin B2). [3][4] Vegetativní rozmnožování dělením - r. Schizosaccharomyces Tento rod se vyznačuje jako jediný tím, že se rozmnožuje pomocí dělení s tvorbou překážky, avšak nevzniká při tom mycelium. Má celkem dobré kvasné schopnosti a nevyskytuje se u něj hexosová represe dýchání. [4] Druh S. pombe je využíván například v Africe k výrobě nápoje z prosa jménem Pombe. Také se používá k odkyselování vín, kde využívá přítomnou kyselinu jablečnou. Je to jeden z modelových organismů v genetice.[4] Druhý z tohoto rodu je S. octosporus, který lze izolovat z ovoce a používá se také při biologickém odkyselování vín. [3][7]
Obr. č. 16: Schizosaccharomyces pombe - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
15
Obr. č. 17: Schizosaccharomyces pombe - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25°C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Endomycopsis Tento rod spolu s Eremotheciumm a Ashbay je na pomezí mezi kvasinkami a plísněmi. Většina z nich má aerobní metabolismus a kvasí pouze slabě nebo vůbec. Rozmnožují se pomocí blastospor.[4]
- r. Eremothecium Tento rod většinou parazituje na rostlinách a díky vysokému obsahu vitaminu B2 v některých kmenech, je možné je využít pro získávání tohoto vitaminu.[4]
- r. Ashbya Stejně jako předcházející rod je Ashbya parazitem, ale lze jej využít pro výrobu vitaminu B2.[4]
- r. Saccharomycopsis S. fibuligera produkuje škrob a amylasy. V myceliu tohoto rodu jsou přepážky, ve kterých se nacházejí plazmodezmata, což jsou vlastně úzké kanálky, které spojují protoplasty mezi buňkami. [4] 1.7.2 Bazidiodporogenní Mezi tuto skupinu patří kvasinky, které tvoří bazidiospory na protáhlých bazidiích, teliospory, z nichž pučí promycelium, které nese sporidie, ale také některé druhy bazidiomycet. Všechny se rozmnožují pučením a sexuální cyklus je zastoupen heterokaryotním myceliem s přezkami (vnější můstky mezi dvěma buňkami zajišťující rovnoměrné rozdělení jádra).[4]
16
Některé jsou červené kvasinkovité a za přístupu světla a kyslíku tvoří karotenoidy nerozpustné ve vodě, některé obsahují karotenoidní pigmenty a tvoří balistokonidie, které jsou na jednoduchých či větvených sterigmatech.[7] čeleď Filobasidiaceae: - r. Filobasidiella Tento rod patří mezi patogenní. Jeho zástupce je například F. neoformans, který má kulovité bazidiospory nebo F. bacillispora, u kterého jsou spory tyčinkovitého tvaru. Tyto kvasinky byly dříve označovány jako Cryptococcus neoformans, často napadají lidskou či zvířecí tkáň a způsobují smrtelná onemocnění. Přenáší se vdechováním ze vzduchu například z holubího trusu. Mají řetízky bazidiospor na 4 místech basidia. [4]
- r. Filobasidium Tento rod má 8 bazidiospor a je perfektním stádiem rodu Cryptococcus.[4] Rody tvořící sporidie: - r. Rhodosporidium Tyto kvasinky hromadí tuk a vytvářejí oranžové až růžové kolonie, což je způsobeno obsahem karotenoidních barviv v nich. Je to perfektní stádium rodu Rhodotorula, které má pouze aerobní metabolismus.[4]
- r. Sporidiobolus Perfektní stadium rodu Sporobolomyces, jehož kolonie jsou žluté, oranžové či růžové barvy. Vytváří balistospory, které jsou odmršťovány pomocí speciálního kapalinového mechanismu.[4] Tento rod spolu s předcházejícím a jejich imperfektními rody se vyskytují ve vzduchu a zastupují také asi 50% kvasinkové populace ve sladké povrchové i slané mořské vodě na Zemi.[4]
17
Obr. č. 18: Sporidiobolus salmonicolor - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm.[2]
Obr. č. 19: Sporidiobolus salmonicolor - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25°C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Leucosporidium Rod Leucosporidium je bez červených pigmentů, je schopen růst při nízké teplotě, vyskytuje se tedy například v Arktidě či chladných oceánech.[4] Kvasinkovité stadia vyšších bazidiomycet - r. Tremellales Tremellales vytváří slizovité plodnice na kmenech a pařezech stromů či plodnicích jiných bazidiomycet.[4] 1.7.3 Rody, u nichž není známa tvorba pohlavních spor - r. Candida Rod Candida je nejrozsáhlejším z kvasinek, zahrnuje něco kolem 200 druhů. Mezi zástupci tohoto druhu jsou jedinci jak se silnými fermentačními účinky, tak i druhy nekvasící. Získávají uhlík a energii z metanolu a oxidací metanu ze zemního plynu nebo bioplynu Některé druhy, zejména C. utilis jsou vhodné k výrobě krmného droždí z melasy či jiných odpadních materiálů. C. kefyr, která se dříve označovala jako C. pseudotropicalis či C. 18
sphaerica, zkvašuje laktózu a je imperfektním druhem Kluyveromyces marxianus. K tomuto druhu patří i dříve samostatný Torulopsis, který se lišil pouze mutací rozhodující o tvorbě mycelia či pseudomycelia. [3][4] Dalším z tohoto rodu je C. albicans, který způsobuje kožní a nehtová onemocnění viz kapitola Patogenní kvasinky. C. utilis se používá k produkci biomasy. Dalšími zástupci jsou například C. ethanolica, C. ethanolitolerans, C. maltosa, C. shehatae, C. boidinii C. hydrofumarica, C. rugosa, C. atmospherica či C. diddensiae [3][4][7]
Obr. č. 20: Candida tropicalis - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
Obr. č. 21: Candida tropicalis - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25° C (tzv. obrovská kolonie). [2]
Obr. č. 22: Candida utilis - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
19
Obr. č. 23: Candida utilis - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25° C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Brettanomyces Kvasinky rodu Brettanomyces kontaminují kvašené nápoje, jako je pivo, víno a další. Při jejich fermentaci se uvolňuje vysoké množství kyseliny octové, čímž vzniká vysoké pH, které je pro ně smrtelné. Jsou také imperfektní formou rodu Dekkera. [3][4]
- r. Kloeckera Příslušníci rodu Kloeckera snášejí velmi dobře kyselé prostředí, proto je můžeme nalézt na vinných hroznech či v půdě vinic, kde se uplatňují v první samovolné fázi. [3][4]
- r. Malassezia Rod Malassezia (jiným názvem Pityrosporum) je velice podobný předešlému druhu. Je mimo jiné patogenní pro člověka i zvířata. U zdravých lidí je běžným kontaminantem na kůži a pro jeho růst jsou potřebné lipidy. Vyznačují se monopolárním pučením na velmi široké základně. [3][4]
- r. Cryptococcus Toto imperfektní stadium rodu Filobasidium (kromě C. neoformans, což je imperfektní stadium rodu Filobasidiella) má buňky obalené slizovitým obalem a některé jeho kolonie jsou žluté barvy kvůli obsahu karotenoidních barviv. Jejich zdrojem uhlíku jsou pentózy a pentozany. Jediný patogen je C. neoformans. [3][4]
- r. Rhodotorula Buňky kvasinek rodu Rhodotorula obsahující karotenoidní barviva nemají žádné fermentační účinky. Kolonie jsou tedy zbarveny oranžově až růžově, čímž se chrání před 20
škodným UV zářením. Je to imperfektní stadium rodu Rhodosporidium a od rodu Phaffia se liší nezkvašováním cukrů a jiným typem pigmentů. [3][4]
Obr. č. 24: Rhodotorula glutinis - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm. [2]
Obr. č. 25: Rhodotorula glutinis - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25° C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Sporobolomyces Rod Sporobolomyce, často nazývaný některými autory Bensingtonia, není stejně jako předešlý rod schopen kvašení a tvoří žluté až růžové kolonie díky karotenoidům. Tyto kolonie jsou zvrásněné, tvoří jakoby poprašek. Ten je způsoben balistosporami, které po vystřelení sporami padají zpět na ně. Můžeme je nalézt na listech stromů a rostlin odkud se jednoduše mohou dostat do vody. Tento rod produkuje karotenoidní barviva.[4]
- r. Trichosporon Mycelium těchto kvasinek se může rozpadat na artrospory či některé druhy mohou tvořit endospory. Některé druhy (asi 15) jsou za určitých podmínek patogenní a způsobují nemoci kůže a nehtů či dokonce infekci vnitřních orgánů a tkání. Tito zástupci mají svými vlastnostmi blíže basidiomycetovým jedincům. Také jsou výjimeční tvorbou ureázy. [3][4]
21
- r. Geotrichum Geotrichum candidum je druh na pomezí mezi plísněmi a kvasinkami, často kontaminuje mléčné výrobky, droždí, zelí či maso.[4]
Obr. č. 26: Geotrichum candidum - Nativní preparát. Úsečka znázorňuje délku 100 µm.[2]
Obr. č. 27: Geotrichum candidum - Kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25° C (tzv. obrovská kolonie). [2]
- r. Bullera Tito jedinci tvoří krémové až světle žluté kolonie a jejich asexuální balistospory jsou vymršťovány pomocí kapky vylučované na spodu spory.[3]
- r. Sterigmatomyces Tyto kvasinky byly izolovány například z mořské vody a podle některých autorů jsou řazeny jako Fellomyces či Sterigmatomyces. [3][7]
22
1.7 Průmyslové využití kvasinek 1.8.1 Etanolové kvašení Fermentace neboli kvašení je oxidační proces, kde organická molekula (sacharid, lipid, protein) předá elektron jiné molekule v průběhu anaerobního procesu.[8] Pro nás je důležité etanolové kvašení, při němž se přeměňují sacharidy na etanol a oxid uhličitý. O tento proces se zajímal Pasteur, který v roce 1860 dokázal, že při kvašení vznikají také další vedlejší produkty jako je glycerin a kyselina jantarová, a že část cukrů spotřebují kvasinky, které díky němu mohou růst. [9] C6H12O6 → 2 CO2 + 2C2H5OH + energie
(1)
Pyruvát je dekarboxylován na acetaldehyd, který je pak pomocí redukovaného kofaktoru NADH a určitého enzymu redukován na etanol. Díky tomu vznikají z jedné molekuly cukru dvě molekuly etanolu a také dvě molekuly oxidu uhličitého za vzniku energie – dvou molekul ATP.[9] Na začátku kvašení při nedostatku acetaldehydu je dehydrogenován kofaktor NADH pomocí redukce meziproduktu glykolýzy, který poskytuje glycerol. Tím se vytvoří asi 3% glycerolu. Toto množství můžeme zvýšit až na 25% odstraňováním vznikajícího acetaldehydu. Touto metodou se ale sníží výtažek etanolu. [9] Při etanolovém kvašení v průmyslu vzniká ještě řada dalších vedlejších produktů. Vyskytují se sice v malých koncentracích, ale jsou technologicky významné. Především jsou to vyšší jednosytné alkoholy (propanoly, butanoly, pentanoly) vzniklé z aminokyselin odumřelých kvasinek a získávané ve formě tzv. přiboudliny, která se využívá například k výrobě laků. Při výrobě piva jsou vznikající estery nežádoucí, avšak ve vinařství jsou součástí tzv. buketu (Vůně vína složená ze směsi těkavých látek, které částečně přecházejí do vína z moštu a částečně se vytváří během jeho vývoje.[10]). Estery jsou vytvářeny při etanolové esterifikaci organických kyselin pocházejících většinou z vinného moštu. Dalším z vedlejších produktů jsou fermentační sloučeniny, které jsou v pivovarnictví také nežádoucí, vzhledem k jejich nepříznivému ovlivňování chuti piva již v malých koncentracích. [9] Etanolové kvašení se využívá v pivovarnictví, kde se využívá především rod Saccharomyces carlsbergensis a probíhá při poměrně nízké teplotě, kolem 12°C. Dále ve vinařství s využitím kvasinek rodu S. cerevisiae či S. ellipsoideus, ale i například při použití
23
pekařského droždí, což jsou lisované S. cerevisiae. Kvasinky jsou potřebné také například při kvašení kefíru, kde se uplatňují S. kefyr.[8] 1.8.2 Výroba piva Jedním z procesů při výrobě piva je také samozřejmě kvašení. Proces fermentace se u některých druhů liší, především použitými kvasinkami, dále pak teplotou či dobou kvašení. Ale jedno je u všech typů piva společné, důvodem kvašení je tvorba alkoholu v nápoji.[11] U piva probíhá tento proces ve dvou fázích: kvašení a následné dokvašování. To hlavní kvašení takzvané mladiny probíhá v kvasných nádobách, které se nacházejí v chlazených místnostech, nazývaných spilky. Nádoby na kvašení mohou být otevřené či uzavřené, většinou se používají stojaté či ležaté tanky, které jsou speciálně vyrobeny, aby jejich materiál neovlivňoval proces kvašení. Jsou tedy, oproti dřívějšímu dřevu, vyrobeny především z oceli s různými ochrannými nátěry či hliníku. Ochlazená mladina, která se vyrobí při varných procesech, stéká do těchto kádí, majících ve stěnách chladící zařízení a zde dochází k zakvašení mladiny kulturou pivovarských kvasinek, které obsahují enzym maltázu, schopný katalyzovat štěpení maltózy na dvě molekuly glukózy, které se dále zkvašují. Používají se kvasinky pomnožené z čisté kultury a lze je několikrát použít.[11][12] Fermentace probíhá za tzv. studené teploty (5 až 9° C) nebo teplé, což je teplota 12 až 16°C. V druhém případě je proces rychlejší, avšak může docházet ke zhoršení pěnivosti či chuti či zvýšené sedimentaci kvasinek. Teplota a doba kvašení se odvíjí podle požadované stupňovitosti piva. Jakost piva a průběh samotného kvašení ovlivňuje jak použitý typ kvasinek a jejich množství, tak složení mladiny, které může podpořit či zastavit růst kvasinek. Musí tedy obsahovat určité množství zkvasitelného extraktu, tvořeného převážně sacharidy, maltózy, dextriny a aminodusíky, její pH musí být mezi 5,2 a 5,7 a při kvašení klesne na 4,3 až 4,7. [11][12] Většina kvasinek sedimentuje na dně kádí a mladina přechází na tzv. mladé pivo. Vzniklý oxid dusičitý je jímán v poklopu armaturou. Dále vznikají také různé vedlejší produkty. Jsou jimi vyšší alkoholy, estery, aldehydy, sirné sloučeniny a další. Během hlavního kvašení se rozlišují 4 fáze – zaprašování, při kterém se tvoří pěna, nízké bílé kroužky – zde se tvoří maximum oxidu uhličitého, vysoké hnědé kroužky – kal z piva se dostává na povrch kroužků, a propadání „deky“ – dochází k sedimentaci buněk, což vytváří tzv. deku, spolu s nimi jsou tam vyloučené tříslobílkovinné komplexy a barviva. Vše se musí včas odebrat a zbytek se může přečerpat na dokvašení.[11]
24
Mladé pivo dozrává v tancích při teplotě 1 až 2° C několik dnů. Záleží na požadovaném stupni – 10°pivo tam zůstává 25 dnů, 11°zraje 35 dnů a 12°pivo 50 dnů. Při tomto procesu získává celkovou chuť a říz, čehož je dosaženo oxidem uhličitým. Teplota během dozrávání pozvolna klesá a také zkvasitelný extrakt v pivě. Zbylé kvasinky sedimentují a snižují obsah vysokomolekulárních látek. Mění se také oxidoredukční potenciál. [11][12]
Pokud stáčíme či pijeme pivo přímo z tanku, jedná se o pivo kvasnicové nebo přesněji nefiltrované. Takové pivo je zakalené, protože obsahuje zbytek kvasnic, voní i chutná po nich a obsahuje vysoké množství vitaminů skupiny B. V druhém případě se pivo filtruje, především pomocí křemelinového svíčkového filtru, aby bylo čiré, zaručila se jeho trvanlivost, biologická a koloidní stabilita. Tímto procesem je pak náchylnější k mikrobiální kontaminaci, takže je potřeba jeho pasterizace. Ta je možná zahřátím piva a prudkým ochlazením, což ale působí nepříznivě na chuť, nebo je možné jej filtrovat přes membránový filtr, který pracuje za studena. Dále se použijí různé stabilizátory, například bentonity, silikagely, tanin či enzymové přípravky. [11][13] Poslední fází je kontrola složení a stáčení do lahví, sudů či jiných nádob a uvedení obsahu alkoholu, koncentrace původní mladiny, pH a další hodnoty. Dále se hodnotí chuť, vůně, říz, hořkost či plnost chuti. [11] 1.8.3 Pivovarské kvasinky Na výrobu piv se používají různé kmeny kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae, které jsou výhradně kulturní, ve volné přírodě je nenajdeme. Tyto kvasinky se dělí na svrchní a spodní. [11] Svrchní pivovarské kvasinky se využívají při výrobě piva infúzním způsobem, kdy se slad pouze v teplé vodě luhuje, ale nevaří. Nazývají se tak protože buňky v průběhu kvašení vystupují na povrch a tam vytvářejí hustou vrstvu. Celý proces probíhá při teplotě mezi 15 a 25°C a nakonec klesá pod 10°C. Tento kmen kvasinek zkvašuje z jedné třetiny rafinózu, dále z ní odštěpují fruktózu bez melibiózy. Při tomto postupu jsou nádoby na kvašení většinou pevně uzavřené a CO2 uniká přes speciální zátku. [11][14] [15] Spodní pivovarské kmeny mají schopnost zkvašovat rafinózu úplně díky melibióze. Celé kvašení probíhá při teplotách do 10°C. Během spodního kvašení je kvasná nádoba. Tyto kvasinky se pak na konci kvašení shlukují do vloček a usazují se na dně nádob. Tyto rozdílné vlastnosti oproti svrchním kvasinkám lze vysvětlit rozdílným elektrickým nábojem na
25
povrchu buněk, kdy svrchní kvasinky mají opačný náboj než oxid uhličitý, jsou jím tedy přitahovány a vynášeny na povrch. Avšak vlastnosti se mohou měnit v důsledku změny okolních podmínek, například teploty kvašení. Tento způsob dodává pivu specifickou chuť, typickou například pro česká piva. [11][15] 1.8.4 Kontaminace piva Během výroby piva, jeho dozrávání či skladování na něj může nepříznivě působit spoustu vlivů či organismů, které pak ovlivní chuť, trvanlivost nebo jiné vlastnosti. [11] Mezi nejčastější kontaminanty patří mléčné bakterie rodu Lactobacillus nebo Pediococcus. První z nich patří mezi grampozitivní bakterie, mají tvar tyčinek, jsou nesporolující, kyselinotvorné, anaerobní a homofermentativně nebo heterofermentativně kvasí sacharidy. Jejich škodlivý účinek spočívá v tvorbě zákalu a kyseliny mléčné. Převážně se jedná o druhy L. casei nebo L. brevis. Z rodu Pediococcus kazí pivo nejčastěji P. cerevisiae, který tvoří kyselinu mléčnou a diacetyl. Tyto bakterie jsou anaerobní, patří mezi grampozitivní koky a kvasí sacharidy homofermentativně. [11] Mezi další bakteriální kontaminanty piva patří rody Pectinatus (gramnegativní tyčinky) a Megasphaera (gramnegativní koky). Dalšími jsou rody Enterobacter, Escherichia či například Citrobacter, které redukují dusičnany na dusitany a vytvářejí vicinální diketony (například diacetyl). Pokud jsou piva svrchně kvašená, je u nich možný výskyt gramnegativních tyčinek druhu Zymomonas anaerobia, které za nepřístupu vzduchu přeměňují glukózu na etanol a oxid uhličitý. Pokud nezamezíme přístupu vzduchu k pivu, mohou se zde objevit také gramnegativní octové bakterie. [11] Pokud se v nápoji objeví či dokonce převládnou krom čistých kmenů kvasinek i jiné, způsobí změnu chuti, zákalu, vůně či například sedimentu. Nejčastěji jsou to zástupci rodu Saccharomyces, dále pak Candida, Pichia či Hansenula. K tomuto jevu nejčastěji dochází nejčastěji, pokud je k pivu dostatečný přístup vzduchu. [11] 1.8.5 Výroba vína Díky přirozené mikroflóře na bobulích vinných hroznů dochází k samovolnému kvašení moštu. Patří mezi ni kvasinky rodu Kloeckera, Hanseniaspora, Saccharomyces (především Saccharomyces cerevisiae) a zástupci mléčných a octových bakterií. Toto složení se mění v průběhu kvašení a závisí také na vinařské oblasti či použitých chemických metodách. [11]
26
Kvašení moštu má tři základní fáze. Na začátku se množí aerobní organismy, jako jsou křísotvorné kvasinky a octové bakterie, dále se množí apikulátní kvasinky (divoké kmeny kvasinek, nejčastěji Kloeckera, Hanseniaspora) dokud úplně nepřevládnou. Začne vznikat v moštu alkohol až pH klesne na určitou hranici, kdy se růst a množení kvasinek zastavuje. V poslední fázi se množí S. cerevisiae, zvyšuje se koncentrace etanolu, snižuje se pH a selektují se ty kmeny kvasinek, které jsou odolnější k etanolu než ostatní. [11] Kvašení moštu může být buď relativně, nebo absolutně čisté. Co se prvního způsobu týče, nežádoucí organismy se odstraní pomocí síření ihned po vylisování a odkalení moštu. Ke kvašení pak dochází pomocí zákvasu či přidáním kvasinek z minulého cyklu. Při absolutně čistém kvašení se přechází k pasterizaci či separaci, čímž se odstraní veškerá mikroflóra a následně se do moštu přidá čistá kultura vyšlechtěných vinných kvasinek. Avšak tento způsob není příliš rozšířen, protože nelze dosáhnout tak vysoké kvality vína bez příspěvku dalších kvasinek, které dávají vínu charakteristickou vůni a chuť. [11] Bílé víno se vyrábí z červených, bílých či modrých hroznů a nepřecházejí do něj látky ze slupek či zrníček, ale pouze ze šťávy. Hlavní kvašení probíhá 7 až 14 dní za teploty 25 až 30°C, dále následuje dokvašování po dobu několika týdnů, kdy se vlivem snížení teploty a výroby oxidu uhličitého víno čistí usazováním kalů. Oproti tomu červené víno se vyrábí pouze z modrých hroznů, postup je podobný, pouze je rozšířen o extrakci barviv ze slupek.[11] 1.8.6 Kontaminace vína Jak
kontaminace
mikrobiálního
původu,
tak
různé
choroby
způsobené
mikroorganismy jsou schopné negativně ovlivnit kvalitu vína. Protože mošt obsahuje vysoké množství cukrů a živin, vytváří vhodné podmínky pro kvasinky, bakterie či plísně. Během kvašení dochází k eliminaci obsahu těchto organismů, ale i přes to mohou na konci procesu být některé druhy kvasinek a bakterií ještě aktivní. Pro člověka jsou tyto choroby nebezpečné, protože lidské patogeny nemohou v nízkém pH, jaké má mošt růst. Dále ovlivňují chuť a aroma vína také samozřejmě pH, čas kvašení, teplota okolí, přístup kyslíku či použité chemické látky. [16] Mezi nežádoucími jevy u vína je například zákal, který způsobují převážně kvasinky druhu Zygosaccharomyces bailii, které kvasí nejdříve fruktózu, až pak glukózu. Často je víno také znehodnoceno kontaminací pocházející z některých výrobních zařízení (sudy, hadice, potrubí, apod.). Bývá to kvasinkami rodu Candida, Pichia, Hansenula, Rhodotorula či
27
například Sporobolomyces. Tyto rody vytvářejí ve víně především kyselinu octovou, etylester kyseliny octové, acetaldehyd a mění aroma vína. [11][16] Je ale také možné, že je kontaminace způsobena Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces oviformis či Zygosaccharomyces bailii. Tyto druhy jsou u kvašení vyžadovány, avšak ve víně se mohou vyskytovat i divoké kmeny či různé varianty, které způsobí vysoké množství kyseliny octové, sirnatých sloučenin, oxidu siřičitého, močoviny či jiných těkavých sloučenin. [11][16] Rody Dekkera či Brettanomyces najdeme v moštu a víně. Jsou to rody často produkující etylfenoly, jejichž vůně je popisována jako koňský hnůj, leukoplast či koňský pot. Druhý z výše zmiňovaných rodů může zapříčinit vysoké škody, protože může napadnout dřevěné sudy i betonové tanky, které je třeba pak speciálně čistit. Můžeme ho ale najít i v lahvích, kde zapříčiní nemožnost konzumace vína. [16] I přes užitek mléčných bakterií rodu Lactobacillus či některých koků (odbourávají kyseliny) se mohou stát kontaminanty, protože při mléčném kvašení vzniká veliké množství vedlejších produktů, jako jsou manitol či kyselina octová, které mohou snížit jakost vína. Stejný účinek mohou mít bakterie Lactobacillu podobné, které způsobují slizovatění vína. Pokud nedodržíme určité hygienické podmínky při výrobě či dovolíme přístup vzduchu, může u některých druhů vín dojít k jejich oxidaci na kyselinu octovou. Tento proces často způsobují bakterie rodu Acetobacter. [11] I některé mikromycety mohou zkazit vůni či chuť vína. Jedním z nich je například rod Aspergillus, který můžeme najít na korkových zátkách. Takzvaná „zelená hniloba“ hroznů (choroba, která napadá zrající hrozny a způsobuje hnilobné projevy na jednotlivých bobulích) je způsobena pak houbami rodu Penicillium napadající sudy. Velice oceňovaná Botrytis cinerea, která napomáhá odparu vody z bobulí a pozitivně upravuje složení moštu, se může stát nežádoucí, pokud napadne ještě nezralé hrozny při chladném počasí. Způsobí tak kyselost bobulí a zapříčiní také menší obsah vody v nich. [11] 1.8.7 Pekařské droždí Pro výrobu droždí je základem lisovaná biomasa vybraných a vyšlechtěných pekařských kmenů kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae. Dříve to bývaly odpadní kvasinky z pivovarů, později byly pro tento účel vybrány takové kmeny, které nejlépe odpovídaly požadavkům. Požaduje se od nich, aby se rychle množily s vysokým výnosem biomasy na jednotku sacharidu, aby bylo omezeno alkoholové kvašení, čímž zbyde více
28
energie na výrobu biomasy. Rovněž aktivita maltázy musí být dostatečně vysoká, aby odpovídala požadované rychlosti kvašení, kvasinky musejí mít také dostatečnou trvanlivost a v neposlední řadě musejí mít požadovanou světlou barvu a svěží aroma. [11] Během procesu výroby droždí dochází k několika množení kvasinek, které se provádí nejdříve v malém množství sladiny, později ve větším množství melasy. Při výrobě se jednotlivé stupně označují jako generace, konečným výrobkem je IV: generace. Na začátku procesu se melasa zředí pitnou vodou, pomocí kyseliny sírové se sníží její pH a pro zvýšení obsahu dusíku se přidá síran amonný a superfosfát. Dále se melasa vaří, abychom ji sterilizovali a vysráželi z ní koloidní látky. Koncentrace melasy závisí na použitém kmeni kvasinek tak, aby zde bylo přítomno určité množství enzymů katalyzujících autolýzu. Kultivace melasy se provádí v chlazených kovových nádobách za přístupu vzduchu o teplotě 27 – 30°C. [11] Produkce etanolu je v různých generacích odlišná, v některých výrobnách je zachycován a dále destilován. Tekutina, jako je kvasničné mléko, se odstřeďuje v průtokových odstředivkách a na bubnových rotačních lisech, čímž dostaneme asi 27 – 29% sušiny. Je také možné zahustit kvasničné mléko pomocí svíčkových filtrů. Dále se přistupuje k sušení sterilním vzduchem, nakonec biomasa jde do formovacích a balících strojů. [11] 1.8.8 Kontaminace droždí Povolenou kontaminaci droždí u nás určuje Nařízení komise (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách. K poškození droždí dochází nejčastěji v důsledku přítomnosti kvasinek rodu Candida utilis, Candida tropicalis nebo Saccharomyces exiguus. Pokud dojde ke kontaminaci někdy na začátku výroby, u první generace, celkové procento kontaminace se zvýší. Na povrchu droždí můžeme také někdy najít Oidium (Oospora) lactis. [11] 1.8 Patogenní kvasinky Kvasinky patří již od pradávna spolu s bakteriemi a viry k původcům různých onemocnění u lidí a živočichů. Jako takové jsou známé pravděpodobně od druhé poloviny minulého století. [11] Většina druhů, převážně rodu Candida, běžně žije v našem těle jako komenzálové, nejčastěji v dutině ústní a trávicím traktu a pro zdravého jedince jsou prakticky neškodné, ale při spojením s některým s dalších faktorů se z nich stávají patogeny. Těmito faktory mohou
29
být například snížená imunita, některé nemoci, například cukrovka, tuberkulóza, rakovina, AIDS, infekční choroby, poruchy žláz s vnitřní sekrecí a další. Negativně ovlivnit vliv kvasinek na naše tělo mohou i léčba antibiotiky, cytostatiky či kortikosteroidy, transplantace či infuze. U některých povolání je také vyšší riziko této infekce. Týká se to pracovníků s dlouhodobější macerací – mytí nádobí, některé továrny apod. Mezi projevy výskytu kvasinek patří léze různých tvarů, onemocnění nehtů, různé pigmentace či naopak depigmentace kůže, záněty močového měchýře nebo moučnivka. Onemocnění způsobené kvasinkami mohou přerůst až v záněty plic, průjmy či endokarditidu. [11] Nejčastější onemocnění způsobené kvasinkami jsou kandidózy dutiny ústní, hltanu, kůže, dýchacích cest, sliznic, gastrointestinálního a urogenitálního traktu a další. Nejčastěji jsou způsobeny zástupci rodu Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. viswanathii, C. pseudotropicalis, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. kefyr, C. inconspicua, C. famata, C. rugosa, C. dubliniensis, C. stellatoidea a další. [11] Candid je v dnešní době kolem 200 druhů a stále jsou objevovány nové. Například C. dubliniensis se vyskytuje u pacientů s AIDS a vyskytuje se většinou v dutině ústní, C. tropicalis je u nás nejrozšířenější kvasinka tohoto druhu, která často způsobuje problémy onkologickým pacientům. [11] Jednou z nebezpečných kvasinek je rod Cryptococus, jehož se u nás vyskytuje asi 17 druhů. Je velice nebezpečná, pokud není včas rozpoznána, způsobuje infekce dýchacího ústrojí, infekce mozku a míchy, v nejhorším stádium i meningitidu, což může být smrtelné onemocnění. U pacientů s AIDS se může vyskytovat i více kmenů tohoto rodu najednou. Přenašečem těchto kvasinek jsou většinou holubi či myší trus. [11] Dalším patogenním rodem jsou kvasinky Malassesia, jejichž 7 druhů způsobuje převážně kožní onemocnění na hlavě či hrudi jako je např. atopický ekzém. Rod Rhodotorula zahrnuje tři patogenní druhy. Jedním z nich je Rh. Mucilaginosa, která degraduje keratin v nehtech. Patogeny jsou i například některé druhy Sporobolomyces, Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, která způsobuje gynekologické záněty či Aureobasidium, která způsobuje obtíže pacientům po transplantacích. [11]
30
2 MIKROSKOPOVÁNÍ K pozorování mikroorganismů nestačí pouhé oko. Potřebujeme vhodné zařízení, které by nám pozorovaný objekt vhodně zvětšilo a metodu, která nám pozorování usnadní. K tomuto účelu slouží světelný mikroskop a jeho různé modifikace, které umožňují pozorování živých organismů, které se pohybují a rozmnožují. V následujících kapitolách se budeme zabývat mikroskopováním a nejvhodnějšími metodami používanými k pozorování kvasinek. 2.1 Základní světelná mikroskopie Světelné mikroskopii je přibližně vyhrazena oblast od 10 µm do 0,2 µm. Využívá hlavně světlo o vlnové délce 400–700 nm. Při základním mikroskopování ve světelném poli prochází světlo z kondenzoru vzorkem a vstupuje dále do objektivu. Objekty vidíme díky tomu, že jsou schopny zeslabovat intenzitu jimi procházejícího záření. Tato metoda je tedy vhodná pro objekty buď zcela nepropustné, nebo alespoň barevné. Důležitým parametrem pozorování je kontrast. Pokud tedy nejsou objekty barevné, je nutné přistoupit k jejich zbarvení. U živých organismů to ovšem znamená jejich usmrcení, což nám brání v dalším dlouhodobějším pozorování jejich života, vývoje, zániku či rozmnožování. Proto byly vynalezeny techniky umožňující zvýšení kontrastu bez nutnosti barvení či usmrcení pozorovaného materiálu. Mezi tyto metody patří použití temného pole, kde se využívá ohybu světelných paprsků v kondenzoru nebo, polarizační mikroskopie, používající polarizační hranol. Kombinují se rovněž různé fyzikální principy, využívá se různých zdrojů vlnových délek či metody fluorescenční mikroskopie a fázového kontrastu, které jsou pro pozorování kvasinek nejvhodnější a budou nás proto nejvíce zajímat. [17] 2.2 Fázový kontrast Fázová mikroskopie patří mezi speciální metody mikroskopování, které se používají k pozorování živých či nebarevných objektů. Díky této technologii je možné zobrazit nebarevné či velice jemné struktury, které při běžném světle není možné pozorovat. Je jedinečnou metodou při studiu organel kvasinkových buněk, jejich růstu a množení. Zásady fázového kontrastu poprvé zformuloval ve třicátých letech dvacátého století holandský vědec a fyzik Frits Zernike. V roce 1941 byl dle jeho návrhu sestaven prototyp fázového mikroskopu ve firmě Zeiss v německé Jeně. Od roku 1945 se toto zařízení vyrábělo sériově a v roce 1953 za jeho objev získal F. Zernike Nobelovu cenu v oblasti fyziky. [18][19]
31
2.2.1 Princip Při kontrastní mikroskopii nevidíme přímo fázový kontrast jako takový, ale pozorujeme rozdílnou intenzitu světla či rozdílnou barvu. Fázový posun vzniká tak, že se oddělují paprsky, které procházejí pozorovaným objektem a mění svou fázi a směr šíření oproti paprskům v okolním prostředí směřujícím přímo. Tyto paprsky pak spolu interferují, což zvyšuje kontrast objektu. Do přední ohniskové roviny kondenzoru je vložena aparatura, která má tvar úzkého mezikruží, která je následnou optickou soustavou zobrazena v zadní rovině kondenzoru. V objektivu se nachází další aparatura, která je tvořena skleněnou podložkou s nanesenou fázovou maskou. Obě aparatury musejí být seřízeny do zákrytu. [18][19] Lidské oko je nejcitlivější přibližně na vlnovou délku 540 nm, proto se používá filtr či kvazichromatické osvětlení, které má žlutozelenou barvu. Dále je nejvhodnější použít fázovou destičku měnící fázi přímých paprsků o jednu čtvrtinu vlnové délky, čímž dosáhneme maximálního kontrastu, a fázový kroužek v objektivu, který redukuje intenzitu světla v pozadí pomocí neutrálního materiálu. Tím je dosaženo vyššího kontrastu a lze pozorovat i ty nejmenší detaily preparátů.[18][19] Kontrastní mikroskopie se používá při pozorování fázových objektů, které oproti amplitudovým, jež mění amplitudu procházejícího vlnění, nejeví vzhledem k okolí změnu absorpce světla a liší se od něho jen malou změnou indexu lomu. Tyto objekty posunují fázi světelné vlny, proto je při použití výše zmíněné techniky vidíme jako tmavé na světlém pozadí a tím tmavší, čím je pozorovaný exemplář silnější. Toto zobrazení se nazývá pozitivní fázový kontrast. Fázovou masku však můžeme pozměnit i tak, že objekty jsou zobrazeny jako světlé na tmavém pozadí, což připomíná metodu pozorování v temném poli. Takovýto způsob se nazývá negativní fázový kontrast. Možné je také osvětlit objekt bílým světlem, kdy ho vidíme jako barevný, což zapříčiňuje vlnová délka. Běžný fázový mikroskop nám umožňuje rozeznávat i fázové rozdíly menší než 10-2, jeho rozlišovací schopnost dosahuje 0,1 μm.[18][19] Kontrastní fázová mikroskopie má však také své nedostatky, mezi něž patří především výskyt halo efektu. Prakticky to znamená ztrátu hranice objektů, kterou zapříčiňuje lom světla na stěnách mikroskopických objektů, zejména objektů z materiálu o vysokém indexu lomu, mezi něž patří například kvasinky ve vodném prostředí. [18][19] Tomuto efektu je možné zabránit použitím například Hoffmanova modulačního kontrastu či Nomarského techniky. Další možností je použití speciálních objektivů, které minimalizují světelný kruh vyskytující se ve fázových objektech, zvyšují kontrast pozorovaného objektu a mají širší tónový rozsah. [18][19]
32
Obr. č. 28:Schéma fázového kontrastu[3]
33
3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Pozorování zástupců kvasinek v běžně dostupném zdroji Potřebné látky a chemikálie: destilovaná voda, sacharóza droždí Vínka - Sušené kultury vinných kvasinek, hlubokoprokvášející, Frutana spol. s. r. o. Složení – strouhaná houska, sladový výtažek, pepton, kultury kvasinek
Obr. č. 29: Sušené kultury vinných kvasinek
Potřebné nádobí: 2 x Petriho miska, kádinka, skleněné tyčinky, laboratorní váhy, centrifuga, mikroskop, podložní a krycí sklíčka, plastová pipeta Přístroje: Laboratorní váhy – Pioneer TM Ohaus, Ohaus Co.
Obr. č. 30: Laboratorní váhy
34
Mikroskop – Olympus CX 21, Olympus
Obr. č. 31: Mikroskop
Laboratorní centrifuga – Eppendorf miniSpin, Eppendorf
Obr. č. 32: Laboratorní centrifuga
Postup Nejdříve jsme si rozmíchali sušené droždí s malým obsahem destilované vody v Petriho misce, až vznikla suspenze, kde byly pozorovatelné pouze částečky strouhanky. Poté jsme směs rozdělili na dvě části. První část jsme vložili do laboratorní centrifugy a odstřeďovali po dobu dvou minut při 10200 otáčkách za minutu. Pro druhou část jsme si připravili 1 molární roztok sacharózy v destilované vodě. Následně jsme smíchali 2 ml suspenze s 2 ml cukerného roztoku a tuto směs nechali přibližně hodinu odstát (kvasit). Po odstředění jsme odebrali část vzorku bez strouhanky, umístili jej na podložní sklíčko, překryli krycím a mikroskopovali. Stejně jsme odebrali vzorek ze směsi droždí a cukerného roztoku a pozorovali pod mikroskopem. Závěr: U obou preparátů jsme mikroskopovali kvasinky. Při druhém pozorování jsme však zjistili, že kvasinky byly ve větších shlucích a některé již pukly.
35
Výpočty: Namíchání 1 molárního roztoku sacharózy: Sacharóza – C12H22O11 Msacharózy = 342 g/mol 1mol : 342 g sacharózy v 1 l rozpouštědla 34,2 g sacharózy ve 100 ml rozpouštědla
36
ZÁVĚR V této práci jsem se zabývala kvasinkami, jejich rozdělením a vlastnostmi, kvasnými procesy využívanými v potravinářském průmyslu, kontaminanty těchto procesů a jejich detekcí. Zjistili jsme, že největším kontaminantem těchto procesů jsou kvasinky samotné, dále některé druhy bakterií či jiných hub. Ujasnili jsme si také, že nejvhodnější metodou pro pozorování kvasinek je fázová kontrastní mikroskopie. V experimentální části jsme se seznámili se základním pozorováním kvasinek. Do budoucna se zaměřím na speciální typy fázové kontrastní mikroskopie, které jsou kombinací s jinými způsoby mikroskopování a umožňují ještě kvalitnější a detailnější pozorování jak kvasinek, tak výše zmíněných kontaminantů v průběhu kvasných procesů. Bude se jednat především o další experimentální části z oblasti mikroskopie. Předpokládá se také spolupráce s některým experimentálním ústavem z mikrobiologickým zaměřením.
37
Seznam použité literatury
[1] KURTZMAN, C a Jack W FELL. The yeasts: a taxonomic study. 4th ed. New York: Elsevier, c2000, 1055 s. ISBN 04-448-1312-8. [2] ROSYPAL, Stanislav. Nový přehled biologie. 1. vyd. Praha: Scientia, 2003, 797 s. ISBN 80-7183268-5. [3] BENDOVÁ, Olga a Blanka JANDEROVÁ. Základy biologie kvasinek: určeno pro posl. fak. přírodověd. 1. [dotisk] 1. vyd. Praha: SPN, 1989, 88 s. ISBN 80-706-6029-5. [4] ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila a Blanka JANDEROVÁ. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology: určeno pro posl. fak. přírodověd. 3. oprav. a dopl. vyd. Praha: ACADEMIA, 2002, 363 s. ISBN 80-200-1024-6. [5] Česká sbírka mikroorganismů (CCM): Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. [online]. [cit. 2012-01-03]. Dostupné z: http://www.sci.muni.cz/ccm
[6]
Kvasinkovité
MICROBIOLOGY.
mikroorganizmy. [online].
MASARYK
18.10.2006
[cit.
UNIVERSITY,DEPARTMENT
OF
Dostupné
z:
2012-01-03].
http://www.sci.muni.cz/mikrob/kvasbiotech/kvasmikro/kvasmikro.html
[7] BARNETT, J, R PAYNE a D YARROW. Yeasts: characteristics and identification. 2nd ed. New York: Cambridge University Press, 1990, 1002 s. ISBN 05-213-5056-5. [8] VOTAVA, Miroslav, R PAYNE a D YARROW. Lékařská mikrobiologie obecná: characteristics and identification. 2., přepr. vyd. Brno: Neptun, 2005, 351 s. ISBN 80-86850-00-5. [9] KRÄTSCHMEROVA, Kateřina. Sledování populace vinných kvasinek během kvašení vinného moštu.
Brno,
2010.
Dostupné
http://www.vutbr.cz/www_base/zav_prace_soubor_verejne.php?file_id=25596.
Diplomová
z: práce.
Vysoké učení technické v Brně. Vedoucí práce Mgr. Dana Vránová, Ph.D. [10] Vinopark: Degustační slovník. Www.vinopark.cz [online]. [cit. 2012-01-03]. Dostupné z: http://www.vinopark.cz/slovnik/slovo/buket-vina/
38
[11] BENDOVÁ, Olga a Blanka JANDEROVÁ. Vybrané kapitoly z biotechnologií: Určeno pro posl. fak. přírodověd. 1. vyd. Praha: SPN, 1990, 94 s. ISBN 80-706-6204-2. [12] Projekty SIPVZ Gymnázia Olomouc - Hejčín: Kde se používá fyzika a chemie. KOVÁŘ, PH.D., RNDr.
Dušan.
[online].
[cit.
2012-01-03].
Dostupné
z:
http://projektysipvz.gytool.cz/ProjektySIPVZ/Default.aspx?uid=10
[13]
Pivovar
Kácov:
Výroba
piva.
[online].
[cit.
2012-01-03].
Dostupné
z:
http://pivovarkacov.cz//pivovar/vyroba-piva/ [14] HLAVÁČEK, František a Alois LHOTSKÝ. Pivovarství: Řada potrav. lit. Praha: SNTL, 1966, 483 s. [15] Vasepivo.cz: Často kladené otázky. [online]. 2012 [cit. 2012-01-03]. Dostupné z: http://www.vasepivo.cz/sekce/casto-kladene-otazky-S102.html [16] EKOVÍN: Mikrobiální kontaminace. Svaz integrované a ekologické produkce hroznů a vín [online].
2012
[cit.
2012-01-03].
Dostupné
z:
http://www.ekovin.cz/sekce-ekologicke-
produkce/mikrobialni-kontaminace [17] Speciální mikroskopické metody. In: Univerzita Palackého v Olomouci: Katedra buněčné biologie
a
genetiky [online].
Dostupné
11.2.009.
z:
http://genetika.upol.cz/files/predmety/kbbmik_06.pdf [18] Fázový kontrast. Oddělení fyziologie a anatomie rostlin: Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita [online].
24.10.2006
[cit.
2012-01-03].
Dostupné
z:
http://www.sci.muni.cz/kfar/html/fazovy_kontrast.pdf [19] JEŘÁBKOVÁ, Ing. Petra. Studium vlastností biologického materiálu pomocí metod obrazové analýzy.
Brno,
2010.
Dostupné
http://www.vutbr.cz/www_base/zav_prace_soubor_verejne.php?file_id=32356.
Doktorská
z: práce.
Vysoké učení technické v Brně. Vedoucí práce prof. Ing. Oldřich Zmeškal, CSc.
39
Seznam zdrojů obrázků [1] ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila a Blanka JANDEROVÁ. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology: určeno pro posl. fak. přírodověd. 3. oprav. a dopl. vyd. Praha: ACADEMIA, 2002, 363 s. ISBN 80-200-1024-6. [2] MINIATLAS MIKROORGANISMŮ. Fakulta potravinářské a biochemické technologie: Vysoká škola
chemicko-technologická [online].
[cit.
2012-01-03].
Dostupné
z:
http://www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/mikr.htm [3] PLÁŠEK, Jaromír. Nové metody optické mikroskopie: Pokroky matematiky, fyziky a astronomie. [online]. 1996, 1-24 [cit. 2012-01-03]. Dostupné z: http://dml.cz/handle/10338.dmlcz/139719
40
