11/8/2007
Topik 9
METODE EVALUASI ANTIOKSIDAN SECARA IN VITRO DAN IN VIVO
Endang Prangdimurti
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR - 2007 PPt e-Learning ENBP
Evaluasi Antioksidan Dr.Ir. Endang Prangdimurti, MSi Staf Pengajar Ilmu dan Teknologi Pangan IPB
Antioksidan adalah senyawa yang dapat menahan terjadinya reaksi oksidasi makromolekul, seperti lipid, protein, karbohidrat dan DNA, pada konsentrasi yang lebih rendah daripada konsentrasi makromolekul target oksidasi tersebut. Antioksidan: ada yang dihasilkan dalam tubuh (endogen) maupun yang berasal dari makanan (eksogen).
1
11/8/2007
Komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan Komponen endogen : • glutation (GSH) dan Se-glutation peroksidase • Fe-katalase • NADPH • ubiquinol-10 (koenzim Q10 tereduksi) • Mn, Cu, Zn-SOD (superoksida dismutase) • asam urat • asam lipoat • hormon-hormon dengan aktivitas antioksidan (contoh: melatonin) • protein pengikat logam, misalnya protein pengikat Fe dan Cu (transferin, seruloplasmin), protein pengikat Fe kompleks (heptoglobin, hemopexin)
Komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan Antioksidan pangan dan antioksidan eksogen : • • • •
tokoferol dan tokotrienol (vitamin E) askorbat (vitamin C) vitamin A dan karotenoid (-karoten, likopen, lutein, dll) Se (dan logam esensial lainnya yang berperan dalam fungsi enzim antioksidan) • senyawa-senyawa fitokimia dengan aktivitas antioksidan • komponen pangan lain (CoQ10, glutation, asam lipoat, dll) • antioksidan pangan (BTP) (BHA, BHT, propil galat, TBHQ, ekstrak rosemary)
Penggolongan antioksidan Berdasarkan cara kerjanya : •
Antioksidan preventif : menekan pembentukan radikal bebas - disebut juga antioksidan sekunder
1.a. Dekomposisi hidroperoksida dan hidrogen peroksida : peroksida didekomposisi menjadi produk nonradikal Katalase:: dekomposisi Katalase dekomposisi hidrogen peroksida Glutation peroksidase (seluler): (seluler): dekomposisi dekomposisi hidrogen peroksida dan hidroperoksida asam lemak bebas Glutation peroksidase (plasma): (plasma): dekomposisi dekomposisi hidrogen peroksida dan fosfolipid hidroperoksida Fosfolipid hidroperoksida glutation peroksidase: peroksidase: dekomposisi dekomposisi fosfolipid hidroperoksida Peroksidase: dekomposisi dekomposisi lipid hidroperoksida Glutation SS-transferase: dekomposisi dekomposisi lipid hidroperoksida
2
11/8/2007
1. b. Pengkelat logam Transferin, laktoferin: laktoferin: mengikat Fe Haptoglobin:: mengikat hemoglobin Haptoglobin Hemopexin:: menstabilkan heme Hemopexin Seruloplasmin, albumin: albumin: mengikat Cu 1.c. Pendeaktifasi (quencher) SOA (species oxygen active) Superoxida dismutase (SOD): disproporsionasi superoksida Karotenoid, vitamin E : mendeaktifasi singlet oksigen
2.
Antioksidan peredam radikal (radical (radical--scavenging antioxidants): bereaksi dengan senyawa radikal untuk memutus rantai propagasi - umumnya antioksidan ini akan berubah menjadi antioksidan radikal setelah bekerja meredam senyawa radikal - disebut juga antioksidan primer - berdasarkan sifat kelarutannya, dibedakan menjadi : a. Golongan hidrofilik : vitamin vitamin C, asam urat, bilirubin, albumin b. Golongan lipofilik : vitamin vitamin E, ubiquinol, karotenoid, flavonoids
Enzim-enzim antioksidan utama (SOD, katalase, glutation peroksidase) saling bekerjasama mengeliminir anion superoksida yang terbentuk secara normal di dalam tubuh
3
11/8/2007
ANTIOKSIDAN DALAM PANGAN Antioksidan : antioksidan gizi dan non gizi
Antioksidan non gizi
vitamin E (tokoferol dan tokotrienol) vitamin C (asam askorbat) vitamin A dan beta karoten (prekursor non gizi) zat gizi esensial untuk berfungsinya sistem antioksidan endogen, seperti mineral Cu, Mn, Zn, Fe (keempatnya kofaktor enzim SOD), Se, dan vitamin riboflavin merupakan kofaktor--kofaktor penting dalam sistem enzim antioksidan. kofaktor
Vitamin E
Vitamin E berada pada membran sel dan dalam LDL yang bersirkulasi merupakan antioksidan non polar (antioksidan utama pada medium non polar) α-tokoferol efektif dalam sistem pangan, sedangkan tokoferol efektif dalam in vivo. Vitamin E bekerja sebagai antioksidan pemutus rantai (mendonorkan atom H pada radikal) serta mendeaktifasi singlet oksigen Vitamin E radikal dapat diregenerasi oleh vitamin C Sumber utama : sayuran, bijibiji-bijian, minyak kacangkacang-kacangan RDA : 15 IU
Vitamin E laboratory and animal studies
Vitamin E the oxidation of LDLLDL-C inhibit smoothsmooth-muscle cell growth inhibit platelet adhesion improves endothelial function reduced the number and severity of atherosclerotic lesions in rabbits fed highhigh-fat diets
Clin Cardiol 1993;16:I16-18
4
11/8/2007
Vitamin C
merupakan antioksidan utama pada medium polar (darah, cairan interstitial dan sitosol) bekerja mendonorkan atom H pada radikal, mendeaktifasi anion superoksida dan singlet oksigen, meregenerasi radikal vitamin E. Namun dapat menjadi prooksidan dalam reduksi Fe3+ menjadi Fe2+ (reaksi Fenton) Sumber : buah dan sayur RDA : 60 mg
Vitamin C
a waterwater-soluble vitamin found in many fruits and vegetables a less potent antioxidant than vit E associated with lower LDLLDL-C, higher HDL HDL--C, and lower BP inhibits platelet aggregation recommended daily allowance 60 mg
Tokoferol mendonorkan atom H-nya kepada radikal lipid peroksida (LOO*). Radikal tokoferol yang terbentuk diregenerasi oleh vitamin C (asam askorbat).
5
11/8/2007
Karotenoid
Berada di dalam darah dan membran Karotenoid dan vitamin A bekerja mendeaktifasi singlet oksigen dan meredam SOA lain. Kemampuan mendeaktifasi singlet oksigen lebih besar dibandingkan asam askorbat maupun tokoferol
Beta--carotene Beta
A plantplant-derived nutrient contained in yellow and orange vegetables and fruits, and leafy green vegetables provides up to half of dietary vit A recommended daily allowance is 5,000 IU
Mineral--mineral Mineral Zn, Cu, Mn kofaktor enzim Superoxide Dismutases (SOD) Zinc/copper superoxide dismutase Mitochondria Superoxide (O2(O2-) to O2 and water Manganese superoxide dismutase Mitochondia and cytosol Superoxide to O2 and water
Se kofaktor Glutathione peroxidase (GPx) Mitochondia Peroxides to water
6
11/8/2007
Antioksidan non gizi Golongan
Contoh senyawa
Karotenoid
Likopen, lutein, astaxantin
Bioflavonoid
Genistein, diadzein, quercetin
Fitosterol
Sitosterol, stigmasterol, oryzanol
Tannin
Katekin dan komponen polifenol lainnya
Klorofil
Klorofil--a dan klorofilin Klorofil
Terpenoid
Limonin dan limonene
Senyawa allylic
Diallyl sulfida dan disulfida
Indoles
Indole--3-carbinol Indole
7
11/8/2007
METODE EVALUASI ANTIOKSIDAN Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan secara bertahap sebagai berikut : Uji in vitro menggunakan reaksi kimia, misalnya metilmetillinoleat, DPPH Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya mengukur viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan dien terkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dan lainlain-lain Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya aktifitas enzim antioksidan, kadar TBARS Uji in vivo pada manusia
Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimia DPPH atau ABTS DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang relatif stabil. DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi oleh suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan intensitas warna ungu (memudar). Semakin besar selisih absorbansi dibandingkan kontrol (tanpa penambahan antioksidan) menunjukkan semakin tingginya aktivitas antioksidan senyawa uji.
Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimia Dien Terkonjugasi Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi. Konfigurasi Konfigurasi--konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer UV langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra absorpsi. Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut diinkubasi bersamabersama-sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga membentuk kurva oksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.
8
11/8/2007
Pengujian in vitro menggunakan materi biologis Teknik kultur sel Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari hewan atau manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel tersebut setelah masa inkubasi tertentu. Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun diberi stres oksidatif menggunakan senyawa oksidator (misalnya H2O2), dan sebagai kontrol adalah model tanpa penambahan senyawa uji. Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berproliferasi, sel harus memiliki membran yang utuh. Adanya oksidasi pada lipid penyusun struktur membran sel mengakibatkan sel tidak dapat merespon sinyal sehingga tingkat proliferasi sel menurun. Dengan kultur sel dapat diukur pula kadar TBARS sebagai indikator peroksidasi lipid.
Pengujian in vitro menggunakan materi biologis LDL teroksidasi Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari hewan atau manusia. Senyawa uji diinkubasi bersamabersama-sama dengan LDL, kemudian dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga membentuk kurva LDL teroksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi. Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun tanpa penambahan senyawa uji.
Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)
Mula-mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian Muladiukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan lainnya) Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H2O2, glutation dan lainnya). Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan model yang diberi stres oksidatif.
9
11/8/2007
Vitamin E (tokoferol) Status vitamin E dapat diperkirakan dengan pengukuran kadar tokoferol dan tokotrienol dalam plasma dan/atau jaringan adipose. Tokoferol utama dalam plasma, yaitu α dan , diukur dengan HPLC. Metode terdahulu yaitu dengan menggunakan GC. Untuk setiap 10 kali lipat peningkatan konsumsi α-tokoferol, menghasilkan peningkatan kadarnya dalam plasma sekitar 2 kali lipat. Level -tokoferol dalam plasma lebih tinggi daripada -tokoferol meskipun asupan -tokoferol lebih tinggi. Hal ini terkait dengan peran protein pengikat -tokoferol. Tokotrienol dan tokoferol lain juga mempunyai fungsi antioksidan yang penting. Oleh karena itu, estimasi status vitamin E dalam tubuh yang hanya berdasarkan kadar -tokoferol saja adalah tindakan yang kurang tepat atau bahkan tidak tepat.
Selenium (Se) Selenium adalah kofaktor enzim antioksidan glutation peroksidase (Se(Se-GSHGSH-Px) yang memiliki bentuk yang beragam. Pengukuran status Se dapat dilakukan dengan mengukur kadar Se plasma menggunakan graphite graphite--furnace atomic absorption. absorption. Enzim SeSe-GSHGSH-Px dapat diukur pada plasma, platelet, dan sel darah merah (eritrosit). Se eritrosit adalah indikator status Se jangka panjang yang baik, namun analisisnya rumit dikarenakan interferensi dari Fe dan Cu dalam hemolisat. Oleh karena itu tahap digesti basah menggunakan asam perklorat dan asam nitrit penting dilakukan dalam analisis Se eritrosit.
Askorbat (vitamin C)
Analisis askorbat dalam plasma dilakukan dengan menggunakan metode HPLC yang telah divalidasi.
Askorbat dalam plasma terdegradasi menjadi produk sekunder walaupun disimpan pada suhu -70oC apabila tidak distabilkan dengan asam metafosforat pada saat kolektif.
Secara in vitro, vitro, askorbat dapat juga berperan sebagai prooksidan, karena askorbat mereduksi ion feri menjadi fero dan mempromosikan terjadinya reaksi Fenton. Secara in vivo, vivo, peran askorbat sebagai prooksidan masih kontroversial.
10
11/8/2007
Karotenoid
Sebagai indikator status karotenoid dalam plasma umumnya berdasarkan kadar likopen dan -karoten dalam plasma. Pengukuran status karotenoid akan lebih baik jika berdasarkan pengukuran beberapa karotenoid dibandingkan hanya satu parameter. Pengukuran kompleks karotenoid dalam jaringan biologis dapat dilakukan dengan menggunakan metode HPLC. Meskipun karotenoid bereaksi dengan cepat dengan singlet oksigen dan juga bekerja efisien menangkap ROS lain secara in vitro, namun perannya secara in vivo sebagai antioksidan belum terbukti secara penuh.
Glutation (GSH)
Salah satu antioksidan larut air yang utama dalam tubuh manusia adalah tripeptida glutation (GSH), yang berperan sebagai kofaktor GSHGSH-Px dan GSHGSH-S-transferase. Biosintesis GSH memerlukan asam amino sistein dan metionin, sehingga kekurangan konsumsi asam amino tersebut berakibat pada defisiensi GSH. GSH dapat diukur dalam plasma, eritrosit, dan limfosit. Pengukuran kadar GSH dapat dilakukan dengan kolorimetri dan HPLC. HPLC dapat mengukur baik GSH maupun GSSG (glutation tereduksi) dalam plasma, sel dan jaringan.
Enzim--enzim Antioksidan Enzim
Analisis dilakukan dengan menggunakan sel darah merah. Setelah dihemolisis, enzim antioksidan yang umumnya diukur adalah aktivitas enzim : - superoksida dismutase (SOD) - katalase - glutation peroksidase (GSH(GSH-Px).
11
11/8/2007
Enzim SOD
Berfungsi mempercepat dismutasi superoksida (*O2-). Untuk analisis enzim ini dibuat sistem yang menghasilkan radikal superoksida yaitu sistem xantin/xantin oksidase. Superoksida mengoksidasi suatu senyawa (misalnya ferisitokrom, NBT) sehingga menghasilkan suatu kromogen, misalnya ferisitokrom teroksidasi yang dapat diukur pada 430 nm atau formazan pada 560 nm.
Enzim Katalase
Enzim katalase memecah H2O2 menjadi H2O dan ½ O2. Perubahan absorbansi H2O2 pada 240 nm diukur pada selang waktu tertentu selama waktu tertentu. Kemiringan (slope) kurva menggambarkan aktifitas katalase. Semakin tinggi aktifitas katalase maka slope semakin rendah.
Enzim Glutation Peroksidase (GSH(GSH-Px)
Enzim Glutation Peroksidase (GSH(GSH-Px) berperan mereduksi hidrogen peroksida (H2O2) maupun lipid peroksida (LOOH) dengan keberadaan GSH menjadi GSSG. Pengukuran dilakukan dengan mengukur kadar GSH tersisa. GSH digenerasi dari sistem lain yang melibatkan glutation reduktase dan NADPH + H+.
12
11/8/2007
Struktur Flavonoids
TERIMA KASIH
13
