0094: Elisabeth C.W. dkk.
KO-20
EFEK ANTIKANKER MAMMAE DARI EKSTRAK CENTELLA ASIATICA DAN ANDROGRAPHIS PANICULATA: SUATU RANGKUMAN STUDI AKTIVITAS SECARA IN VITRO AND IN VIVO Elisabeth Catherina Widjajakusuma1,∗ , Wahyu Dewi Tamayanti2 , Lucia Hendriati2 , Iwan Sahrial Hamid3 , Ferawati3 , Adrianta Surjadhana2 , dan Arijanto Jonosewojo4 1
Pusat Penelitian Obat Tradisional, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya Jl. Dinoyo 42-44, Surabaya 60265 Tel. (031) 72703378 2 Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya 3 Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga Surabaya 4 Poli Obat Tradisional Indonesia, RSU Dr. Soetomo, Surabaya ∗
e-Mail: widjajakusuma
[email protected]
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK Centella asiatica (CA) atau pegagan dan Andrographis paniculata (AP) atau sambiloto telah banyak digunakan untuk pengobatan bermacam-macam penyakit. Tulisan ini berupa rangkuman penelitian yang berfokus pada efek antikanker mammae yang dipelajari baik secara in vitro maupun secara in vivo. Secara in vitro digunakan cell line kanker mammae T47D yang dihitung nilai IC50 . Pengujian juga dilanjutkan dengan mempelajari efek kombinasi kedua ekstrak tersebut. Nilai indeks kombinasi (CI)>3,3 dari kedua ekstrak tersebut menunjukkan efek antagonis yang kuat. Penelitian ini kemudian dilanjutkan ke tahap in vivo dengan menggunakan tikus Sprague Dawley yang diinduksi dengan DMBA 20 mg/kg bb sebanyak 2 kali seminggu selama 5 minggu. Pemberian sampel ekstrak dilakukan pada minggu ke-7 hingga 10 dan hewan coba dikorbankan pada minggu ke-17. Meskipun pengujian secara in vitro menunjukkan efek antagonis yang kuat, pengujian secara in vivo memperlihatkan efek sinergis yang ditandai dengan rerata skor histologi dan jumlah protein GST. Kata Kunci: Centella asiatica, andrographis paniculata, uji sitotoksik, histopatologi, kanker mammae
I.
PENDAHULUAN
Penelitian tentang pengobatan berbasis tanaman mengalami kemajuan pesat di seluruh dunia. Banyak contoh tanaman berkhasiat sebagai antikanker yang telah diuji dengan cell line (Merina et al., 2012; Talib and Mahasneh, 2010; Wing et al., 2007). Centella asiatica (CA) atau pegagan adalah salah satu tanaman tradisional yang digunakan dalam pengobatan berbagai penyakit. Masyarakat Jawa Barat mengenal makanan ini sebagai salah satu tanaman untuk lalapan. Ekstraknya telah terbukti berpotensi untuk memperbaiki memori otak, dan dapat digunakan untuk gangguan kognitif dan berbagai penyakit kulit (Dev et al., 2009; Tiwari et al., 2011). Pengujian efek immunomodulator menunjukkan kemampuan kemopreventif dan antiproliferatif (Punturee et al., 2005), dan pengujian dengan berbagai cell lines kanker memperlihatkan kemampuan ekstrak untuk menginduksi apoptosis yang merupakan kunci aktivitas antitumor sekurang-kurangnya pada
human breast cell lines (Babykutty et al., 2008). Di lain pihak, Andrographis paniculata (AP) atau sambiloto telah banyak dibudidayakan di daerah Asia dan digunakan dalam pengobatan seperti di negara Cina, India, Pakistan dan Thailand (Niranjan et al., 2010; Siriwathananukul, 2010; Su, 2011). Di Indonesia, sambiloto merupakan salah satu komponen jamu yang khasiatnya telah banyak dibuktikan secara ilmiah (Elfahmi, 2006). Jamu sambiloto atau jamu pahitan adalah jamu yang banyak digunakan secara turun temurun (Limyati, 1998). Aktivitas sitotoksik beberapa senyawa diterpenoid dari herba sambiloto telah diuji aktivitas antikankernya (Sukardiman et al., 2007). Tujuh senyawa diterpenoid telah diuji sifat sitotoksiknya pada berbagai human tumor cell lines (Tan, 2005). Artikel ini merangkum penelitian aktivitas antikanker mammae yang dipelajari baik secara in vitro maupun secara in vivo dengan mengkombinasikan pegagan dan sambiloto. Sebagian besar hasil peneliProsiding InSINas 2012
0094: Elisabeth C.W. dkk.
KO-21
tian ini sedang dipersiapkan untuk dipublikasikan dalam jurnal (Tamayanti et al.). Pengujian sitotoksisitas baik tunggal maupun kombinasi dilakukan pada human cell line T47D dengan metode MTT. Pengujian secara in vivo dilakukan dengan menggunakan hewan coba tikus Sprague Dawley yang diinduksi dengan DMBA. Hasilnya memperlihatkan aktivitas antikanker and potensinya untuk digunakan sebagai preventif kanker payudara.
II.
METODOLOGI
Persiapan ekstrak Tanaman segar pegagan dan sambiloto yang diperoleh dari desa Pandaan, Jawa Timur, dicuci, dipotong dan dikeringkan, kemudian diekstraksi dengan air hingga mendapatkan dekoknya (Kaneria et al., 2012). Dekok tersebut kemudian dikeringkan dengan spray drier untuk mendapatkan ekstrak kering. Ekstrak kering pegagan diperoleh dengan penambahan aerosil 10%, sedangkan ekstrak kering sambiloto tidak memerlukan penambahan aerosil. Pengujian viabilitas sel Sel T47D berasal dari Cancer Chemoprevention Research Center Fakultas Farmasi UGM. Sel tersebut dibiarkan tumbuh dalam media Dulbeccofs Modified Eagle Media (DMEM) yang mengandung foetal bovine serum (FBS) 10% (v/v) (FBS qualified, Gibco, InvitrogenTM USA), dan antibiotika penisilinstreptomisin 1% (v/v) (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, 14072, USA). Uji sitotoksitas dilakukan dengan metode MTT (Ehrich and Sharova, 2001). Untuk menentukan IC50 dari pegagan, sambiloto dan pembanding tamoxifen dibuat larutan uji dengan konsentrasi 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL dan 500 µg/mL. Persentasi sel yang bertahan hidup (% viabilitas sel) dihitung dengan P ERS . (3). % viabilitas sel =
At − Ab × 100 Ac − Ab
(1)
Di mana At , Ab , dan Ac masing-masing adalah nilai absorbansi sampel uji, nilai absorbansi blanko, dan nilai absorbansi kontrol. Regresi linear antara logaritma konsentrasi dan % viabilitas sel memberikan persamaan y = bx + a yang digunakan untuk menghitung nilai IC50 yang merupakan konsentrasi yang meng-inhibisi proliferasi sel sebanyak 50%. Pengujian efek kombinasi Untuk uji efek sitotoksik kombinasi pegagansambiloto dibuat seri konsentrasi masing-masing 81 , 14 , 3 1 8 , 2 IC50 dengan cara pengenceran yang menggunakan media kultur DMEM. Efek kombinasi dinyatakan dalam nilai CI (combina-
tion index) berdasarkan P ERS . (4) (Reynolds and Maurer, 2005). CI =
D1 D2 + Dx1 Dx2
(2)
dengan D1 dan D2 adalah konsentrasi dari masingmasing senyawa uji yang digunakan dalam uji kombinasi, sedangkan Dx1 dan Dx2 merupakan konsentrasi senyawa uji tunggal yang diperoleh dari ekstrapolasi persen viabilitas sel yang disebabkan oleh perlakuan kombinasi (x) pada persamaan regresi yang digunakan untuk menentukan IC50 . Pengujian efek antikanker secara in vivo Hewan coba digunakan adalah tikus betina galur Sprague Dawley berusia 50-60 hari dengan berat badan 70-90 g yang diperoleh dari Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta dan dipelihara dalam kandang hewan Lab Hewan Fakultas Farmasi, UKWMS. Universitas Airlangga, Surabaya. Kemudian hewan coba dikelompokkan dalam dalam 6 kelompok yaitu: - Kelompok I: Kelompok normal - Kelompok II: Kelompok negatif (hanya DMBA) - Kelompok III: Kelompok yang diberi DMBA dan tamoxifen - Kelompok IV: Kelompok yang diberi DMBA dan CA - Kelompok V: Kelompok yang diberi DMBA dan AP - Kelompok VI: Kelompok yang diberi DMBA dan CAAP Seluruh kelompok, kecuali kelompok I, diberi DMBA selama 5 minggu. Induksi DMBA dilakukan dengan melarutkan DMBA dalam minyak jagung, dan hewan coba diberi larutan DMBA 20 mg/kg bb 2× seminggu. Setelah itu, pemberian DMBA dihentikan, dan hewan coba tidak diberi perlakuan selama satu minggu. Penimbangan berat badan hewan coba dilakukan setiap minggu, dan dilakukan palpasi mammae untuk mengamati insidensi tumor. Pada minggu ke-7 masing-masing kelompok diberi sampel hingga minggu ke-10. Hewan coba dipelihara hingga dikorbankan pada minggu ke-17 dengan cara dislokasi leher kemudian dikumpulkan organ mammae dan hati. Pengujian ini telah disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Surabaya. Analisis histopatologi dilakukan dengan pengecatan H&E terhadap organ mammae untuk menentukan tingkat keparahan tumor/kanker, sedangkan pada organ hati dilakukan pewarnaan immunohistokimia dengan antibodi glutathione S-transferase (GST). Tingkat keparahan ditentukan dari total skor yang diperoleh Prosiding InSINas 2012
0094: Elisabeth C.W. dkk.
KO-22
TABEL 1: Nilai IC50 Senyawa Uji (Hendriati et al., 2010)
Senyawa uji Pegagan Sambiloto
G AMBAR 1: Efek perlakuan sampel sambiloto (biru), pegagan (merah), dan tamoxifen (hijau) terhadap viabilitas sel T47D
dari menghitung jumlah tubulus, atipia, dan jumlah mitosis berdasarkan Bloom dan Richardson. Baik tingkat keparahan maupun jumlah protein GST dianalisa menggunakan uji statistik variansi satu arah (ANOVA) dan dilanjutkan post-hoc test LSD dengan tingkat kepercayaan 95%.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Viabilitas sel Perlakuan sel T47D dengan sampel uji menghasilkan diagram persen viabilitas sel terhadap konsentrasi yang diperlihatkan oleh G AMBAR 1, sedangkan nilai IC50 ditampilkan dalam TABEL 1. Meskipun IC50 dari CA tertinggi, tetapi lebih rendah dibandingkan IC50 ekstrak air CA terhadap human breast cancer MDA MB-231 yaitu 648 µg/mL (Pittella et al., 2009). Bila dibandingkan dengan zat murni, CA dan AP dapat dianggap tidak menunjukkan potensi sitotoksik. Tetapi karena yang digunakan adalah ekstrak kasar, maka ekstrak ini dapat dianggap berpotensi. Senyawa aktif CA yang telah diteliti berefek sitotoksik adalah asam asiatat dengan IC50 masing-masing terhadap sel MCF-7 dan MDA-MB-231 adalah 5,95 µM dan 8,12 µM (Hsu et al., 2005). Sedangkan untuk ekstrak AP, senyawa aktif yang menunjukkan aktivitas sitotoksik adalah 14-deoxyandrographolide dan 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide, tetapi hanya terbatas terhadap T-47D cell line (harga EC50 masing adalah 2.8 ´ıg/ml dan 1.5 ´ıg/ml), dan yang paling berpotensi adalah senyawa 14-deoxy-11,12didehydroandrographolide dibandingkan senyawa diterpenoid lainnya (Tan, 2005). Efek kombinasi ekstrak CA-SP Hasil perlakuan sel T47D dengan ekstrak kombinasi CA-AP dengan perbandingan 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 2:3, 3:1, 3:2, 3:4, 4:1 dan 4:3 ditunjukkan oleh nilai CI pada TABEL 2 dan diagram pada G AMBAR 2. Nilai CI>3,3 me-
IC50 286 µg/mL 89 µg/mL
nunjukkan kombinasi CA-AP memberikan efek antagonis yang kuat pada semua ratio IC50 . Pengamatan morfologi sel pada perlakuan kombinasi (G AMBAR 2 A-C) tidak menunjukkan perubahan morfologi yang berarti jika dibandingkan dengan masing-masing perlakuan tunggal CA dan AP. Namun demikian, penelitian ini dilanjutkan ke tahap in vivo dengan pertimbangan keterlibatan metabo-lisme tidak tercakup pada uji sitotoksik ini dan senyawa glikosida seperti asiaticoside A, asiaticoside B, madecassoside dan centelloside yang telah diisolasi dari tanaman ini dapat terhidrolisis menghasilkan asam-asam triterpena, asiatic acid, madegascaric acid (madecassic acid) dan centellic acid (Jamil et al., 2007). Semua asam ini terdapat pada CA dalam keadaan bebas kecuali centellic acid. TABEL 2: Nilai CI ekstrak CA-AP pada sel T47D
CA (µg/mL) 37,5 75 110 150
11,25 17,9 22,5 11,7 5,7
AP (µg/mL) 22,5 33,75 12,7 17,4 9,3 8,1 6,8 21,3 5,4 11,8
45 8,3 9,4 10,9 6,0
G AMBAR 2: Efek perlakuan kombinasi pegagan air dan sambiloto air terhadap pertumbuhan sel T47D. Gambar atas menunjukan nilai CI perlakuan kombinasi CA-AP. Bawah: (A) Morfologi sel perlakuan CA150 µg/mL, (B) perlakuan AP 22,5 µg/mL (C), dan (C) kombinasi CA 150 µg/mL-AP22,5 µg/mL. Panah menunjukkan sel yang mengalami perubahan morfologi.
Prosiding InSINas 2012
0094: Elisabeth C.W. dkk.
KO-23
G AMBAR 4: Histopatologi kelenjar mammae dengan pengecatan H&E. (A) Kelompok normal, (B) Kelompok negatif, (C) Kelompok Tamoxifen, (D) Kelompok CA, (E) Kelompok AP), dan (F) Kelompok CA-AP
G AMBAR 3: Tingkat keparahan tumor/kanker berdasarkan total skor dari ke-6 kelompok uji
Pengaruh ekstrak terhadap histologi mammae Uji antikanker mammae dilakukan dengan pengamatan baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Pada pengukuran makroskopis yang dilakukan dengan palpasi tidak menunjukkan adanya nodul tumor. Namun demikian, hasil pengamatan mikroskopis dengan pengecatan H&E memberikan perbedaan yang ditunjukkan oleh tingkat keparahan tumor. Hasil uji efek ekstrak terhadap tingkat keparahan tumor/kanker yang dinyatakan dalam total skor diperlihatkan pada G AM BAR 3 . Kelompok negatif adalah kelompok yang hanya mendapat DMBA dan air memberikan nilai rerata tertinggi seperti yang terlihat pada gambar histologis (G AMBAR 4). Kelompok negatif pada G AMBAR 4-B menunjukkan glandula mammae yang mempunyai lebih dari satu inti dalam satu sel, jumlah mitosis yang meningkat dan terjadi variasi ukuran sel. Sedangkan pada kelompok yang diberi ekstrak post-inisiasi, terlihat bahwa pemberian ekstrak mengurangi tingkat progresitas tumor. Analisis statistik total skor menunjukkan perbedaan bermakna antara kelompok normal, negatif dan kelompok CA. Tetapi total skor kelompok normal tidak berbeda bermakna dengan kelompok AP dan CA-AP. Dalam hal ini, total skor CA-AP yang rendah tidak tidak berbeda bermakna menunjukkan adanya efek aditif/sinergis dari ekstrak CA dan AP. Pengaruh ekstrak terhadap jumlah protein GST Enzim glutation S-transferase mengkatalis konjugasi senyawa metabolit reaktif yang dapat menyebabkan mutasi pada DNA, senyawa ini dapat dikeluarkan dari dalam tubuh pada proses metabolisme fasa II.
G AMBAR 5: Jumlah GST untuk setiap kelompok uji
Pengamatan ekspresi GST dilakukan dengan metode imunohistokimia (G AMBAR 6) secara kuantitatif (G AM BAR 5 ). Jumlah ekspresi GST diperoleh dengan menghitung sel dengan sitoplasma yang berwarna coklat. Analisis statistik menunjukkan tidak terjadi perbedaan bermakna antara kelompok normal, kelompok CA, dan kelompok AP. Pemberian tamoxifen tidak meningkatkan jumlah GST tetapi cenderung menurunkan. Sedang pemberian ekstrak cenderung meningkatkan jumlah GST. Kenaikan tertinggi terjadi pada pemberian ekstrak CA-AP. Hal ini menunjukkan adanya efek sinergi antara ekstrak CA-AP dalam peningkatkan jumlah GST dan potensi ekstrak kombinasi sebagai preventif kanker mammae. Prosiding InSINas 2012
0094: Elisabeth C.W. dkk.
KO-24
[5]
[6] G AMBAR 6: Pengecatan immunohistokimia sel hepar tikus terhadap ekspresi GST menggunakan antibodi GST. (A) Kelompok normal, (B) Kelompok negatif, (C) Kelompok Tamoxifen, (D) Kelompok CA, (E) Kelompok AP), dan (F) Kelompok CA-AP. Inti berwarna coklat menunjukkan ekspresi GST.
IV.
KESIMPULAN
Ekstrak AP memiliki efek sitotoksik terhadap sel T47D yang lebih baik daripada ekstrak CA bila dibandingkan dari harga IC50 . Kombinasi kedua senyawa ini memberikan efek antagonis pada uji in vitro. Di lain pihak, uji in vivo mengkonfirmasi sifat aktivitas antikanker kedua ekstrak tersebut, tetapi menunjukan bahwa kombinasi ekstrak CA-AP tidak bersifat antagonis terhadap aktivitas antikanker bahkan bersifat sinergis pada penghambatan kanker melalui peningkatan jumlah GST. Perbedaan hasil uji in vitro dan in vivo mengindikasikan adanya proses metabolisme yang perlu dipertimbangkan. Penelitian ini menunjukkan bahwa kombinasi ekstrak CA-AP memiliki potensi antikanker dan mempunyai keuntungan yang lebih baik daripada menggunakan ekstrak tunggalnya.
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini dapat terlaksana berkat adanya hibah penelitian dari Kementerian Riset dan Teknologi. Untuk itu, para peneliti yang terlibat dalam penelitian ini mengucapkan banyak terima kasih
[12]
[13]
DAFTAR PUSTAKA [1] Babykutty, S., Padikkala, J., Sathiadevan, P.P., Vijayakurup, V., Azis, T.K., Srinivas, P. and Gopala, S. (2008) Apoptosis induction of Centella asiatica on human breast cancer cells. Afr J Tradit Complement Altern Med 6(1), 9-16. [2] Dev, R.D.O., Mohamed, S., Hambali, Z. and Samah, B.A. (2009) Comparison on cognitive effects of Centella asiatica in healthy middle age female and male volunteers. European Journal of Scientific Research 31, 553-565. [3] Ehrich, M. and Sharova, L. (2001) In-vitro methods for detecting toxicity. Current Protocols in Toxicology. [4] Elfahmi, R.K., Bos R., Kayser O., Woerdenbag H.J.,
[14]
[15]
[16]
Quax, W.J. . (2006) Jamu: The Indonesian traditional herbal medicine, in dissertation: Phytochemical and biosynthetic studies of lignans. 13-34. Hendriati, L., Ferawati, Surjadhana, A., Jonosewojo, A. and Widjajakusuma, E.C. (2010) Cytotoxic effect of ethanol and water extract of Centella asiatica on human breast cancer T47D sel. Proceeding International Conference and Talk Show on Medicinal Plant, 253-257. Hsu, Y., Kuo, P., Lin, L. and Lin, C. (2005) Asiatic acid, a triterpene, induces apoptosis and cell cycle arrest through activation of extracellular signal regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase pathways in human breast cancer cells. J Pharmacol Exp Ther 313, 333-344. Jamil, S.S., Nizami, Q. and Salam, M. (2007) Centella asiatica (Linn.) Urban : A review Natural Product Radiance 6, 158-170. Kaneria, M., Kanani, B. and Chanda, S. (2012) Assessment of effect of hydroalcoholic and decoction methods on extraction of antioxidants from selected Indian medicinal plants. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 195-202. Limyati, D.A., Juniar B.L.L. (1998) Jamu Gendong, a kind of traditional medicine in Indonesia: the microbial contamination of its raw materials and endproduct. J Ethnopharmacol 63, 201-208. Merina, N., Chandra, K.J. and Jibon, K. (2012) Medicinal plants with potential anticancer activities: a review. IRJP 3, 26-30. Niranjan, A., Tewari, S.K. and Lehri, A. (2010) Biological activities of Kalmegh (Andrographis paniculata Nees) and its active principles-A review. Indian Journal of Natural Product and Resources 125-135. Pittella, F., Dutra, R.C., Junior, D.D., Lopes, M.T. and Barbosa, N.R. (2009) Antioxidant and cytotoxic activities of Centella asiatica (L) Urb. Int J Mol Sci 10(9), 3713-21. Punturee, K., Wild, C.P., Kasinrerk, W. and Vinitketkumnuen, U. (2005) Immunomodulatory activities of Centella asiatica and Rhinacanthus nasutus extracts. Asian Pac J Cancer Prev 6(3), 396400. Reynolds, C.P. and Maurer, B.J. (2005) Evaluating response to antineoplastic drug combinations in tissue culture models. Methods in Molecular Medicine 110, 173-183. Siriwathananukul, Y., Watanasit S., Itharat A. (2010) Effect of Thai or Chinese Andrographis paniculata and Psidium guajava leaves on E.coliDiarrhea treatment of suckling pigs. J Sci Technol MSU 29, 389-403. Su, Y.S., Hsieh C.L. (2011) Anti-inflammatory effects of Chinese medicinal herbs on cerebral isProsiding InSINas 2012
0094: Elisabeth C.W. dkk.
KO-25
chemia. Chinese Medicine 6, 1-9. [17] Sukardiman, H., Widyawaruyanti, A., Sismindari and Zaini, N.C. (2007) Apoptosis inducing effect of andrographolide on TD-47 human breast cancer cell line. Afr J Tradit Complement Altern Med 4(3), 345-51. [18] Talib, W.H. and Mahasneh, A.M. (2010) Antiproliferative activity of plant extracts used against cancer in traditional medicine. Sci Pharm 78, 33-45. [19] Tamayanti, W.D., Hamid, I.S., Hendriati, L., Ferawati, Surjadhana, A., Jonosewojo, A. and Widjajakusuma, E.C. Anti-breast cancer activity of the combination of extracts of Centella asiatica and Andrographis paniculata. in print. [20] Tan, M.L., Kuroyanagi M., Sulaiman S.F., Najimudin N., Muhammad T.S.T. (2005) Cytotoxic activities of major diterpenoid constituents of Andrographis paniculata in a panel of human tumor cell lines. Pharmaceutical Biology 43, 501-508. [21] Tiwari, S., Gehlot, S. and Gambhir, I.S. (2011) Centella asiatica: A concise drug review with probable clinical uses. Journal of Stress Physiology & Biochemistry 7, 38-44. [22] Wing, Y.L., Shun, W.C., De, J.G., Peter and Hoi, F.Y. (2007) Correlation between antioxidative power and anticancer activity in herbs from traditional Chinese medicine formulae with anticancer therapeutic effect. Pharmaceutical Biol 45, 541-546.
Prosiding InSINas 2012
