Využití biotechnologií v ŽV. Conc. in Pig Sci., 13/2001
Biotechnologie v chovu hospodářských zvířat jsou programové postupy využívající genetických znalostí a mají za cíl zvýšení užitkovosti. Biotechnologie zvířat má interdisciplinární charakter a sestává z elementů z mnoha oborů jako jsou anatomie, endokrinologie a fyziologie, technologie ultrazvuku, biochemie, buněčná biologie, andrologie nebo molekulární biologie. Chov zvířat založený na výzkumu existuje již po dobu 50 let na základě rostoucích znalostí populační genetiky a statistiky. Již od samého počátku zahrnoval tento přístup biotechnologické procedury, z nich je zářným příkladem např. umělá inseminace, s jejichž pomocí se výrazně zvýšil genetický pokrok. Biotechnologické procedury, které za posledních dvacet let procházely vývojem, otevřely celou řadu dalších perspektiv. V současnosti pojem “biotechnologie hospodářských zvířat” sestává z celého arzenálu biologicko-reprodukčních a molekulárně biologických procedur. Reproduktivní biologie například zahrnuje: umělou inseminaci, synchronizaci říjí, transfer embryí, kryokonzervaci gamet a embryí a mnoho dalších. Molekulární genetika zahrnuje analýzu genomu (sekvenování, mapování, polymorfismy), molekulární diagnostiku ( genetické defekty, genetický přenos, genetická diverzita), funkční genomiku (vzory exprese, interakce genů), transgeniku (aditivní genový transfer, knockout), atd. Jednou z nových aplikací je rovněž využívání genetických markerů. V průběhu posledních desetiletí bylo objeveno mnoho genů či genetických markerů spojených s geny, které ovlivňují vlastnosti našeho zájmu u hospodářských zvířat. To umožňuje vytvořit novou a efektivnější selekci a chovatelské programy, které nachází uplatnění v chovech hospodářských zvířat. Šlechtitelské cíle Definování šlechtitelského cíle je první a pravděpodobně nejdůležitější krok v rozhodování. Zlepšování úrovně nevyhovující vlastnosti by mohlo být ekvivalentní nebo horší než nezlepšovat vůbec. Je důležité jasně definovat selekční kritéria. V chovu prasat zahrnují hlavní znaky: - produkce, jako růst, konverzi a jatečnou hodnotu, - reprodukce, jako velikost vrhu, ap.
Sexování spermií Přesné provedení sexování spermií vychází z rozdílů v DNA mezi pohlavími. DNA je součástí chromozomů. Chromozomy se nacházející v buňkách jednoho druhu, například
skotu, jsou vždy podobného počtu a velikosti, rozdíly zde existují pouze mezi samci a samicemi. U savců samčí buňky obsahují chromozomy typu X a Y, samičí buňky obsahují dva chromozomy X. V buňkách vajíček a spermií je sádka chromozomů rozštěpena. Vajíčko vždy obsahuje jeden X chromozom, spermie obsahuje některý ze dvou typů chromozomů (X nebo Y). Oplození vajíčka X-spermií vede ke vzniku samice, zatímco oplozením Y-spermií vzniká samec. Jinými slovy: Buňka spermie ovlivňuje pohlaví. Obvykle se vyskytuje 50 % buněk spermií s chromozomem X a 50 % buněk spermií s chromozomem Y. Na základě třídění spermatu a používání oddělených typů můžeme tedy řídit pohlaví potomstva. Technika Jediná úspěšná metoda na třídění spermatu, fluorescenční metoda, je založena na rozdílech v obsažené DNA. X-chromozomy jsou větší než Y-chromozomy. Vzhledem k tomu je i větší množství DNA v X-spermiích než v Y-spermiích. U skotu se tento rozdíl pohybuje kolem 4 %. Před vlastním tříděním se buňky zbarvují fluorescenčním barvivem, které sváže DNA. Buňky se poté třídí použitím takzvaných flow-cytometrů. Přístrojem může být roztříděno několik tisíc buněk za sekundu s čistotou přes 90 %. Efektivita dalších metod, založených například na odstřeďování nebo na rozdílech v plovoucích rychlostech, zůstává poněkud spornou. Použitelnost žádné z těchto metod ještě nebyla dokázána. Separace spermií pro produkci rodičovských populací je komerčně velmi zajímavý, neboť řeší - produkci žádaného pohlaví u mateřských/otcovských populací, - problém výskytu kančího pachu (Evropa), - zpřesnění, rozdělení a zvýšení selekčního tlaku pro jednotlivé pohlaví, - poměr pohlaví ve vrhu. Imunokastrace - Tato metoda spočívá v potlačení tvorby hormonů, odpovědných za vývoj varlat, prostřednictvím aplikace bílkovin (potlačení vývoje pohlavních orgánů vakcínou) nebo sexování spermií. Jedná se o aktivní imunizaci podobnou klasickému očkování. V Evropě dosud nebyla její aplikace povolena. Výkrm kanců a imunokastrace jsou z hlediska ekonomiky zemědělského podniku výhodnější, protože kanci rychleji rostou a mají lepší konverzi krmiva v porovnání s kastrovanými jedinci.
Embryotransfer Embryotransfer představuje výkon, při němž se embrya přenášejí do dělohy příjemkyně. Je založen na získávání embryí, jejich kultivaci, imunologickou toleranci vejcovodů a dělohy, oplozování ovocytů in vitro, konzervaci embryí, export a import embryí aj. Současně se s metodou odběru embryí rozvíjely metody superovulace dárkyň (např. PMSG) a
synchronizace příjemkyň. U prasat je situace komplikovanější, neboť získávání embryí in vivo je možné jen s vyjmutím dělohy. Není jasné, zda komplikovaný postup produkce embryí bude technologií použitelnou v praxi díky ceně. Postmortální odběr embryí prasat pro experimentální účely je nejčastější; v metodách ET u prasat se nejčastěji uplatňuje chirurgická cesta - Niemann (1995), Oberfranc et al. (1992), Oberfranc (1994) a další. Technika chirurgického odběru je však provozně náročná. Rovněž přenos je nejčastěji prováděn chirurgickou, laparotomickou cestou, případně méně
invazní laparoskopickou
Wallenhorst,
Holtz (1995)
metodou
-
souhrnně
popisuje Oberfranc (1994);
používali transcervikální postup přenosu embryí
bez
velkých úspěchů. Klonování Dnes je slovo ´klonování´ používáno pro označení několika věcí. Ale v zásadě je klonování technika používaná k vytvoření identických organismů. Klony jsou geneticky identičtí potomci nepohlavně odvození z jednoho jedince. Rostliny se klonují již po mnoho let; někdy tak činíme my sami na své zahradě. Nebo k tomu dojde spontánně: výběžky či výhonky se mohou vyvinout v geneticky identické rostliny. Také mikroorganismy se mohou rozmnožovat klonováním. V dnešní době je klonování rozšířeno i na proces používaný k získání identických kopií biologického materiálu jako jsou molekuly DNA, buňky, orgány či tkáně (molekulární klonování). Klonování se proslavilo s vytvořením prvního klonovaného savce, ovce Dolly, která byla získána přenosem jádra somatické buňky do enukleovaného vajíčka. Modifikované vajíčko bylo pak implantováno do dělohy, aby tam rostlo. Tento postup, také nazývaný „reprodukční klonování", se používá k vytvoření duplikátu(ů) existujícího zvířete. Při reprodukčním klonování jde o generaci jedinců s identickou genetickou informací. Jsou známy dva typy reprodukčního klonování. Jedna technika generuje klony z embryí, zatímco druhá spočívá v přenosu buněčného jádra z dospělé buňky. Generace klonů z embryonálních buněk byla úspěšně použita při klonování laboratorních myší, koz, ovcí, dobytka a dalších savců.
Nejznámější prací klonování přenosem jádra bylo vytvoření ovce Dolly v roce 1997. V tomto experimentu bylo odstraněno jádro vaječné buňky (oocytu) a nahrazeno jádrem somatické buňky z dospělé ovce (samice). Vajíčko nyní obsahovalo genetický materiál (DNA) dospělé buňky. Výsledný „oplodněný“ oocyt se vyvinul v embryo, které bylo implantováno do dělohy jiné dospělé ovce. Dělilo se jako normální embryo, a jehně, které se narodilo, bylo klonem, tj. genetickou kopií původní dospělé dárkyně. V současnosti je tato metoda spojena s příliš vysokou pravděpodobností výskytu závažných genetických defektů u klonu, a poměr úspěšných pokusů je u savců obvykle velmi nízký. Cíle živočišného reprodukčního klonování jsou rozmanité, jako například: •
Produkce zemědělských zvířat jako v konvenčním šlechtitelství tak, aby byla zlepšena kvalita zvířat či jejich produktů. Klonování embryonálních buněk zemědělských zvířat a jejich implantace do náhradních samic se dnes již používá u dobytka. Tato technologie šetří čas a spolehlivě udržuje dané vlastnosti klonovaných zvířat.
•
Produkce geneticky modifikovaných laboratorních zvířat. Ty by například mohly nést mutace způsobující určité choroby a být používány pro studium lidských chorob. Animální modely chorob se také používají pro testování nových léků v reprodukovatelných systémech, takže se snižuje celkový počet animálních testů.
•
Produkce geneticky modifikovaných zemědělských zvířat, která budou užitečná pro produkci vysoce hodnotných terapeutických proteinů. Tento přístup je nazýván „pharming“. Pokud se dají klonováním získat velká stáda, mohl by být tento způsob získávání obtížně syntetizovatelných látek (ať už v mikroorganismech nebo buněčných kulturách) velmi zajímavý pro farmaceutický průmysl.
•
Pokusy o záchranu ohrožených či vyhynulých druhů. K tomu jsou potřeba velmi dobře zachovalá DNA a blízce příbuzný druh. Byly učiněny pokusy vyklonovat téměř vyhynulý druh dobytka (Gaur) a mamuta.
•
Zlepšení klonovaných domácích zvířat je již nabízeno v USA. Ve skutečnosti, získané klony nejsou zcela identické, protože požadované vlastnosti (např. barva srsti) často nejsou zakódovány v genech jádra. Klony získané přenosem jádra obsahují jaderný genom dárcovského jádra, ale také mitochondriální genom dárce oocytu.
•
Další aplikace klonování včetně produkce živočichů vhodných pro xenotransplantace.
Klonování prasat
Připomeňme si, že Dolly se narodila ze zárodku, který vznikl spojením buňky dospělé ovce se zralým ovčím vajíčkem zbaveným jeho vlastní dědičné informace. Dolly se narodila jako jediné jehně z 277 naklonovaných ovčích zárodků. Už samotné spojení buňky s vajíčkem provázejí nemalé technické obtíže. Při klonování prasat to ale představovalo jen první krok. Buňky z těla dospělé prasnice (tzv. granulozní buňky zajišťující výživu prasečího vajíčka) byly spojeny s vajíčkem zbaveným vlastní dědičné informace. Vznikl tak jednobuněčný zárodek, jehož dědičná informace je totožná s dědičnou informací použité granulozní buňky. Tento zárodek ale ponechali vědci ponechali v klidu jen 24 hodin. Aby jej proměnili v zárodek co nejpodobnější skutečnému zárodku vzniklému oplozením vajíčka, provedli ještě jeden přenos jádra. Odebrali jádro z klonovaného jednobuněčného zárodku a to spojili s jednobuněčným zárodkem vzniklým oplozením vajíčka a zbaveným jeho vlastní dědičné informace. Ten, kdo si nikdy neodzkoušel přenášení buněčného jádra, si dovede jen těžko představit, jak je toto "dvoustupňové" klonování náročné. Prasnice donosí selata pouze v případě, že se v jejím těle úspěšně vyvíjí alespoň pět plodů. Klonované zárodky ale nemívají vysokou životaschopnost a mnoho jich v průběhu vývoje v těle náhradní matky odumírá. Ve většině případů pak zbyde v těle prasnice příliš málo zdravých zárodků, než aby se mohly vyvinout ve zdravé sele. Vědci z PPL zkoušeli všechno možné, ale nakonec jim nezbylo nic jiného, než přenášet do těla jedné jediné prasnice obrovská množství naklonovaných zárodků v naději, že jednou jich přežije alespoň pětice. Jak už víme, nakonec se jim to podařilo. Pětice klonovaných selátek se narodila po přenosu více než stovky klonovaných embryí náhradní matce. Pro dosažení tohoto úspěchu ale bylo nutné naklonovat tisíce zárodků (srovnejme to s 277 klonovanými zárodky nutnými pro narození Dolly).
Xenotransplantace Termín xenotransplantace (z řeckého slova "xenos" = cizí) obecně označuje transplantaci do jiného druhu, konkrétně zvířecích orgánů, tkání či buněk do lidských pacientů. K této nové metodě se přistoupilo proto, aby byl překonán nedostatek lidských orgánů dostupných pro transplantace. V příštích letech se čeká, že v rozvojových i vyspělých státech tento deficit dále poroste. V současnosti je xenotransplantace stále ještě experimentální metodou, ale má potenciál pro klinické využití. Jednou z hlavních překážek xenotransplantace je odmítnutí zvířecích tkání či orgánů pacientem. Nejnovější pokrok v překonání tohoto problému zahrnuje: •
vývoj nových léků pro potlačení pacientova imunitního systému
•
genetické inženýrství živočichů pro produkci orgánů a tkání, které budou minimalizovat četnost odmítnutí.
•
riziko infekce pacientů identifikovanými a neidentifikovanými živočišnými proteiny, viry nebo bakteriemi vyžaduje další zkoumání.
•
vývoj a aplikace této technologie není výhradně bio-medicínskou otázkou. Jde také o otázku filosofickou, pojímající stránky etické, sociální, kulturní a náboženskou toleranci a akceptování.
Orgánů pro transplantace je zoufalý nedostatek. Mnoho lidí umírá jen proto, že se pro ně včas nenajde vhodný dárce. Řešení nabízejí xenotransplantace - transplantace zvířecích orgánů lidem. Lékaři experimentovali s orgány šimpanzů a paviánů, ale ty jsou malé a nevýkonné, není jich dost a navíc po jejich transplantaci hrozí nákaza nebezpečnými opičími viry. Řešení nabízí použití orgánů prasete. Lidské tělo se však přijetí prasečích buněk ostře brání a prakticky okamžitě je ničí. Z etického hlediska nepředstavuje použití prasečích orgánů zdaleka takový problém jako použití orgánů lidoopů. Organismus prasete se v mnoha směrech podobá lidskému tělu. Prasečí orgány mají například podobné nároky na zásobování krví. Výjimkou je jen lidský mozek, který je na přívod krve podstatně náročnější než mozek prasete (viz tabulka).
Prasečí orgány mají hned několik výhod. Je jich dost a dost. Dokonce i velikostí a výkonností odpovídají potřebám lidského těla. Jen kdyby tu nebyla ta zpropadená imunitní bariéra. Na prasečí buňky reaguje lidský imunitní systém tzv. hyperakutní rejekcí (HAR). Za tímto děsivým slovním spojením se skrývá fakt, že lidský imunitní systém útočí na prasečí buňky, tkáně a orgány přímo zběsile a likviduje je prakticky okamžitě. Prasečí ledvina promytá lidskou krví se doslova před očima mění na beztvarou hmotu. Vědci proto usilovně hledají možnosti, jak získat prase, jehož orgány by byly pro lidský imunitní systém přijatelnější. Nabízejí se dvě řešení. První představuje vnášení lidských genů do dědičné informace prasete. Přenášeny jsou především geny, které zajistí utlumení těch nejrazantnějších obranných mechanismů lidského imunitního systému. Takových genů byla vytypována celá řada. Většina z nich kóduje bílkoviny, které jsou schopny tlumit razantní akci komplementu. Za slibné jsou z tohoto hlediska považovány především geny pro DAF (decay accelerating factor), gen pro MCP (tzv. membrane cofactor protein) a gen pro CD59. Prasečí srdce
nesoucí na povrchu buněk antigen DAF vydrží 4 hodinový průtok lidské krve bez zjevného poškození. Byla získána prasata s různými kombinacemi genů pro DAF, MCP a CD59. Prasata, která nesou tyto lidské geny ve své dědičné informaci, už stojí v experimentálních stájích několika velkých společností. Druhou možnost lepšího přijetí prasečího orgánu člověkem otevírá vyřazení vybraných prasečích genů z jejich funkce. Buňky takového prasete by díky chybějícím genům ztratily některé typické znaky a staly by se pro lidský imunitní systém mnohem "nenápadnější". Reálný se stal tento přístup k řešení problému hyperakutní rejekce provázející xenotransplantace teprve s nástupem klonování hospodářských zvířat. Tím se otevírá možnost získat prasata, která mají tzv. genetickým knokautem vyřazen z funkce gen pro a(1,3) galaktosyltransferázu. Tento enzym je zodpovědný za syntézu disacharidu galokatoso - a(1,3)galaktosy. Enzym a(1,3) galaktosyltransferáza je vlastní všem savcům s výjimkou opic Starého světa, lidoopů a člověka. Vyskytuje se i na povrchu bakterií. Lidský organismus tedy tento dichasacharid nevyrábí, ale jeho imunitní systém na něj reaguje díky „zkušenostem“ s bakteriemi jako na silný antigen. Protože se disacharid vyskytuje i na povrchu buněk prasete a dalších zvířat, je jedním z antigenů, které jsou zodpovědné za spuštění hyperaktutní rejekce. Genovým knokautem genu pro a(1,3) galaktosyltransferázu by vznikla prasata, jejichž buňky neobsahují funkční gen. Neprodukují proto tento enzym a na povrchu jejich buněk díky tomu chybí disacharid galokatoso - a(1,3)galaktosu. Jejichž orgány by byly lidským imunitním systémem více tolerovány. Taková prasata se sice zatím nikomu nepodařilo získat, ale poté, co americká pobočka PPL Therapeutics oznámila úspěšné naklonování pěti prasat a následný úspěch dalších týmů, se zdá, že se blýská na lepší časy. Genové inženýrství nabízí možnost vyblokovat prasatům gen pro alfa-galaktosylázu a zbavit tak jejich orgány „dráždivých“ cukrů. To už se povedlo hned několika vědeckým týmům.
Mapování genomu Po většinu dvacátého století přetrvával ústřední problém v genetice, a to tvorba map celých chromozomů. Tyto mapy byly nezbytné pro porozumění struktury genů, jejich funkce a evoluce. Od doby asi před patnácti lety, byla využita technologie rekombinantní DNA ke generaci molekulárních nebo fyzikálních map, které definujeme jako pořadí rozlišitelných DNA fragmentů v závislosti na jejich rozmístění podél chromozomu. Genomu prasete s důrazem na identifikaci a mapování genů významných pro růst a tvorbu svalové hmoty i ukládání tuku se věnuje Laboratoř genomiky živočichů, která ve spolupráci s Univerzitou v Hohenheimu (Německo) mapuje QTL pro užitkové znaky u prasat. Ty slouží jako základ pro hledání kandidátních genů a jejich využití v chovu a šlechtění zvířat. U genů podílejících se na vývoji a růstu svalů se studuje jejich exprese ve svalech fetů i dospělých zvířat, aby se identifikovaly alely ovlivňující tvorbu svalové hmoty, tzn. masa. Mapování genomu předpokládá objev markerů geneticky vysoce variabilních, dělících se na - minisatelity, - mikrosatelity (jsou stále objevovány ve velkém počtu a jsou náhodně rozmístěny v celém genotypu),
Genotyp se zjišťuje -
užitím PCR (polymerázové řetězové reakce), umožňující analýzu DNA sekvencí,
-
určením variability markerů s ohledem na kvantitativní znaky,
-
nakupení/ rozmístění markerů v genomu, chovající se jako samostatný lokus (v jiných populací se však tak chovat nemusí, je toto závislé na selekci).
Použití markerů v selekčních programech má za následek -
kontinuitní tvorbu vazeb/rekombinací marker – znak,
-
provádění retestů (zjištění mezimarkerových vazeb a rekombinací marker x QTL).
Markery vykazující DNA-polymorfismus možno určovat bez ohledu na čas, pohlaví, čehož se využívá k redukci volby měřitelných užitkových znaků při uplatnění MAS (marker assisted selection), introgresi, tedy k možnému přenosu a hromadění žádoucích genů z jedné linie na další. U prasat je počet takových genů omezen, nicméně existují, jsou přenosné a jsou známy pro plodnost (četnost vrhu, časná puberta, znaky chování, příjem krmiva, apod.). Selekci vlastních sourozenců na užitkové znaky bez testů. Předností MAS je v možnosti provádění selekce uvnitř rodin, snižování inbreedingu (i při nulovém progresu je MAS pozitivní), zkrácení generačního intervalu a zvýšení genetického zisku (v kombinaci jiných biotechnologií jako in vitro získávání/kultivace/oplodnění oocytů bez potřeby testu užitkovosti). **Vědci z Oddělení zoologie Národní tchajwanské univerzity oznámili, že se jim podařilo vytvořit fosforeskující prasata. Zelené jsou jejich oči, zuby, kůže, kopyta, srdce i vnitřní orgány. Tohoto efektu bylo docíleno přidáním DNA z medůzy do prasečích embryí. Například zelená fosforeskující prasata, kterým vědci z Tajwanu implantovali pomocí DNA světelné buňky tzv. fotofory jednoho druhu fluoreskující medúzy.
Transgeneze Cizorodý gen vnesený do organismu se nazývá transgen. Transgenní živočichové jsou, stejně jako transgenní rostliny, organismy s uměle pozměněnou genetickou informací, za účelem zvýšení užitné hodnoty daného organismu. S transgenními organismy se můžeme setkat také pod názvem geneticky modifikované organismy (GMO). Je uskutečňována přímou aplikací DNA do jádra raného embrya, ale pouze 1 % injektovaných embryí produkuje transgenní potomstvo. Rozvoj kmenových buněk embrya u prasat je ovlivněn precisností genové manipulace. Tyto buňky mohou být kultivovány v laboratoři (jsou nediferencovány - mohou dát základ jakémukoli typu tkáně včetně zárodečné) a vkládány zpět do embrya. První transgen byl u prasat proveden v roce 1985, další se týkají konstrukce strukturních genů podporují produkci růstových hormonů (vědomosti o regulaci růstu apod. jsou stále nejasné), regulace exprese přenesených genů (nenapodobuje účinek růstových hormonů), studia, genová regulace fyziologických procesů (není zcela jasná, proto je těžké vybrat gen/geny VJH k přenosu), které geny použít a jak je regulovat pro požadovaný efekt, využití GMO ve šlechtění (vývoj GMO vyžaduje dlouhodobé testy, jejichž časové období vyrovnává nadřazenost nad ΔG získaným normálně v nukleech. Tato nadřazenost však rychle mizí s aplikací užitkového křížení, což možno minimalizovat užitím zpětného křížení GMO v nukleech), možné kombinace transgeneze s klonováním embryí (stačí jedinec pro získání klonů a následné prověření modifikovaných klonů dle poptávky trhu). Využití GM živočichů
GM hospodářská zvířata jsou využívána pro produkci lidských bílkovin významných pro léčbu některých chorob (srážlivý faktor VIII a IX pro léčbu hemofilie, alfa-1-antitrypsin pro léčbu rozedmy plic, antitrombin pro prevenci tvorby nebezpečných krevních sraženin apod. Chov těchto živých bioreaktorů je předmětem činnosti specializovaných firem. V chovu hospodářských zvířat byly první pokusy upřeny k možnostem zvýšení růstových schopností. V posledních letech se výzkum zaměřuje na genetické modifikace, které by mohly přispět k ozdravění živočišných produktů. Příkladem jsou GM prasat, která získala gen fat-1 odpovědný za tvorbu enzymu převádějící málo žádoucí, ale zato hojné omega-6-mastné kyseliny na žádoucí omega-3-MK. A měly by příznivý vliv na kardiovaskulární systém konzumentů.
