Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program
1. Főirány: Életminőség javítása
Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére
1/48/2001
Zárójelentés: 2001. május 15.-2004. december 31.
RP7. A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása….
Dr. Tímár József Országos Onkológiai Intézet
1
RP7. A daganatos progresszió génexpressziós térképének kialakítása és felhasználása a prognózis megítélésére és új innovatív terápiás elvek kialakítására Témavezető: dr. Tímár József, Országos Onkológiai Intézet Résztvevők: dr. Németh Péter PTE Immunológiai Intézet dr. Puskás László MTA SZBK Dr. Hernádi Zsuzsa Pfizer kft. Dr. Sebeszta Miklós Janssen-Cilag kft. 7.1. A daganatok áttétképzésében szerepet játszó adhéziós molekulák és jelátviteli pályáik meghatározása 1.1. Paralell b3 integrin expressziós modell kialakítása emberi melanóma sejtvonalban Miután emberi melanómában azzal lehet számolni, hogy a két b3 integrin együttesen expresszálódik, ezért olyan avb3-integrint expresszáló humán melanóma vonalakat állítottunk elő, amelyekbe aIIb és b3 gént transzfektáltunk. A klónok aIIb expresszióját mRNS és protein szinten kontrolláltuk. Valamennyi klón párhuzamosan expresszálta az av(b3) integrint, így modellezve a humán melanóma tumorok egyik fenotípusos jellegzetességét, a fokozott avb3 expressziót (Trikha et al.IJC2002). 1. táblázat. Sejtfelszini b3 integrin expresszió human melanoma klónokban (flow cytometry) clone 3.1 mock ESL 8F3 19L ESH 19H
aIIb 0.66+0.7 6.7+3.4 8.0 12.3+4.9 22.5+7.7 27.2+3.9
b3 80.0+3.2 64.0+3.0 79.0 67.0+5.6 69.3+2.3 78.0+6.2
avb3 44.0 31.0 nd 10.5 13.0 28.4
Data are in % of positive cells (aIIb and b3: mean+SEM, n=3-6, avb3: average of two samples), nd= not determined
A transzfektánsok in vitro proliferációs képességei változatlanok voltak, ugyanakkor SCID egerekbe oltva a primer tumorok növekedési üteme eltért, a kettős b3 integrint expresszáló klónok szignifikánsan jobban növekedtek in vivo. 1. ábra. aIIbb3 transzfektált humán melanóma proliferáció in vitro és in vivo A/ In vitro növekedési ütem B/In vivo növekedés SCID egérben
absorbance (BRdU+)
2.0
3.1P 19L 19H
1.5
1.0
0.5
0.0 0.0
volume (mean+SEM, mm3)
15
3.1P 19L 19H
10
5
0 2.5
5.0
7.5
10.0
0 1
2
3
4 5
6 7
8
9 10 11 12 13 14
days
cell number (x103)
Ez ellentmondásban látszott állni az in vitro eredményekkel, így megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy emögött nem állhat-e fokozottabb vaszkularizáció és megállapítottuk, hogy
2
a transzfektánsokból képződő tumorok érdenzitása szignifikánsan emelkedett (Döme et al.2004). 2. ábra. Transzfektáns melanóma klónok intratumorális érdenzitása SCID egérben A/ érdenzitás CD31 jelölés alapján
*
20
15
10
5
0
100
% positive cells
MVD/field (mean+SEM)
B/ VEGF és bFGF protein mérés flow cytométerrel
VEGF bFGF
75
50
25
0
3.1P
19L
19H
3.1
19L
19H
Következő lépésként megvizsgáltuk, hogy a két fő melanóma-angiogenetikus faktor expressziója milyen a transzfektánsokban. Immuncytokémiai és flow cytometriai vizsgálataink kimutatták, hogy változatlan és maximális VEGF expresszió mellett az alapklónban minimális a bFGF expresszió, míg az aIIbb3 transzfektált (tehát av- és aIIb-b3 integrint egyaránt expresszáló klónokban csaknem 100%-os lett a bFGF expresszió amit az in vivo növekedő tumorokban is igazoltunk (2b. ábra). A fokozott bFGF expresszió mögött két nagyságrenddel megnövekedett bFGF mRNS szint áll kvantitatív PCR vizsgálataink alapján (Dömet et al.2005). Jelenleg folyó vizsgálataink arra keresik a magyarázatot, hogy humán melanómában milyen genetikai tényezők játszanak szerepet az egyes szervekbe történő áttétképző képességben. Vizsgálataink szerint ugyanis egyazon tumor a különböző szervekben szignifikánsan eltérő extravazációs képességgel rendelkezik (Paku et al. 2001). Valamennyi transzfektáns klón több szervbe is képes áttétet képezni (tüdő, máj, agy, csont) ezek között csak az áttétképzés hatékonyságában van eltérés, mert az aIIbb3 transzfektált klón(ok) fokozott májáttétképző képességgel rendelkeznek. 2. táblázat. Metasztázis incidencia különböző szervekben b3 integrin transzfektált human melanoma klónokban clone 3.1P ESL ESH 19L 19H
Tüdő (i.v.)
Máj (i.s.)
Agy (i.c.)
Csont (i.c.)
100 83 100 86 100
100 100 100 100 80
100 50 75 60 100
83 80 75 40 75
A tumorsejteket (106/animals) i.v. (tüdő), intrasplenikusan (máj) illetve intrakardiálian (agy, csont) injektáltuk SCID egerekbe. 4-6 hét után az állatokat Nembutallal túlaltattuk és az egyes szervekben az áttéteket sztereomikroszkóp alatt számoltuk meg. Minden csoportban min. 5 állat volt. Az adatok az áttétek %-os gyakoriságát jelenti a csoporoton belül.
3
3. ábra. aIIbb3 transzfektált melanóma klónok májáttétképző képessége SCID egérben
májáttétek száma
300
3 .1 P ESL ESH 19L 19H
250 200 150 100 50 0
3.1P
ESL
ESH
19L
19H
a IIb - k ló n o k 1.2.A két b3 (α αIIβ β és av) integrin paralell expressziójának következményei: angiogenetikus fenotípus Vizsgálataink arra utaltak, hogy az αIIbβ3 integrin transzfekciója αvβ3-at expresszáló humán melanóma vonalakba fokozza az apoptosis resistenciát, aminek következtében a sejtek tumorigenicitása növekedett. Ehhez azonban hozzá járult az is, hogy az in vivo növekedő tumorok kifejezettebb érdenzitással rendelkeztek, aminek egyik oka az volt, hogy a vizsgált transzfektáns klónban nagyságrendekkel emelkedett a bFGF expressziója, míg a VEGF szint konstitutíven magas maradt. Annak igazolására, hogy az αIIbβ3 pozitív humán melanóma klónokban emelkedett az bFGF expresszió, szubklónoztuk az eredeti populációt és a kapott mintegy 10 klónt is megvizsgáltuk bFGF expresszióra qPCR módszerrel (Dömet et al.2004). 4. ábra. aIIb és bFGF expresszió kapcsolata transzfektáns humán melanóma klónokban (cytokémia és qPCR)
(% of cells)
α IIb protein expression
20 15 10 5 0
3 .1 P
ESL 8F3 19L ESH ( t r a n s f e c t e d c lo n e s )
.8 .6 .4 .2 .0 .8 .6 .4 .2 .0
(Q-PCR relative unit)
1 1 1 1 1 0 0 0 0 0
25
bFGF mRNA expression
30
19H
Ahogy azt korábban bemutattuk, humán vizsgálataink arra utaltak, hogy a melanóma vastagságával (nagyságával) az αIIbβ3 integrin expressziója nő, míg az αvβ3 expresszió konstitutiven magas marad (Trikha 2002). Ezt a gondolatot emberi melanómás beteganyagon teszteltük, ahol kimutattuk, hogy az eltérő vastagságú és klinikai kimenetelű primer melanómák esetében, bár a peritumorális érdenzitás sokkal nagyobb mint az intratumorális, mégis az utóbbi denzitása függött csak össze az 5 éves túléléssel és a zsigeri áttétek kialakulásával (Döme et al.2002). Ezek a megfigyelések azt erősítették, hogy az intratumorális érdenzitás növekedése felelős a szervi áttétek kialakulásáért a használt melanoma modellekben és felvetették, hogy ezért esetleg a megjelenő aIIb(b3) integrin és következményes bFGF expresszió felelhet.
4
Kérdés volt továbbá, hogy a megnövekedett angiogenetikus képesség ténylegesen milyen érellátási formára való készséget jelent. Irodalmi adatok és saját vizsgálataink arra utalnak, hogy melanómában például elsősorban nem a klasszikus neoangiogenezis zajlik mint fő érellátási forma, hanem ér-kooptáció a domináló (Döme és mtsai 2002), de az un. vaszkuláris mimikri is gyakori jelenség (Hendrix 2003, Tímár és mtsai 2001). Genetikai vizsgálatok szerint a vaszkuláris mimikri hátterében endoteliális gének neoexpressziója állhat. DNS chip vizsgálataink szerint a 19H transzfektáns vonalban, melynek intratumorális erezettsége jelentősen megnő több un. endotél-specifikus gén fokozott expressziója figyelhető meg: CD34, endotelin receptorB, PI2 szintáz, ami felveti annak a lehetőségét is, hogy az aIIb ektópiás expressziója lehet egy olyan genetikai változás melanómában amely az endoteliális genotípus egyes elemeinek megjelenését indukálja. 7. 1.3. A két b3 (α αIIβ β - és av-) integrin paralell expressziójának következményei: jelátvitel Az αIIbβ3-/+ humán melanóma klónokban microarray vizsgálattal teszteltük a génexpressziós változásokat egy 3200K humán cDNS chipen az SZBK DNS-chip laboratóriumával kollaborációban. Első elemzéseink azt mutatták, hogy az αIIbβ3 transzfektáns humán melanóma klónban az integrin-asszociált jelátviteli pálya több eleme is fokozottan expresszált: így a ABL, FYN, NEC2/3, TEC tirozin kinázok, valamint a farneziltranszferáz és a K-ras. (Fokozódás alatt >3x míg csökkenés alatt <50% expressziós változást tekintettünk). A lipid-szignálút vonatkozásában feltűnő volt a PLA2, a PI-3K számos cyclooxygenáz és az általunk már korábban megfigyelt PKCα izoforma fokozott expressziója. (Ugyanakkor csökkent volt a FAK és a MAPK expresszió). 3. táblázat. Metasztatikus szignálútvonal expressziós változásai in vivo metasztatizálás során aIIbb3 transzfektáns melanóma sejtvonalakban klón 3.1 (>3x) 19H (>5x) Tirozin-kaszkád c-abl EphA2 TEC NEK2 NEC3 K-ras Farnezil transzferáz PI3K Szerin/treonin kaszkád PKA PLA2 PKCa PKCa PKCb
Ezen vizsgálatok több ponton is megerősítik korábbi megfigyeléseinket az ektópiás αIIbβ3 melanóma sejtekben zajló jelátviteléről, hogy az ektópiás megakaryocyta integrin (αIIbβ3) jelátvitele FAK-gátlással, illetve fokozott arachidonsav bomlással és fokozott 12-LOX és PKC aktivitással jár (Rásó et al.2001). A kérdés azonban továbbra is fenn maradt, milyen molekuláris mechanizmus vezet az ektópiás aIIb(b3) integrin expresszió esetében a jelentős génexpressziós profilbeli változásokhoz. Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a b3 integrin lánc különleges abban a tekintetben, hogy citoplazmatikus doménje endonexin fehérjével áll kapcsolatban (Shattil,1995). Az endonexin kétféle szerepet tölt be, egyrészt a b3 lánc jelátvitelét szabályozza, mediálja egy közelebbről még nem ismert módon, másrészt transzkripciós faktorként is szerepel, s így ennek révén a b3 integrin aktiválódása direkt transzkripciós változásokat indukálhat. Ismert target génjei a THRA, RXR, NFkB és a cyclinA (Ohtoshi,2000). Ennek ismeretében felmerült, hogy emberi melanómákban a b3 integrin fokozott expressziója endonexinen keresztül jelentős transzkripciós változások kiváltója lehet.
5
4. táblázat. Endonexin expresszió humán melanómában in vitro (QPCR/+ DNSchip)
WM35 (nem metasztatikus) HT199 A-2058 WM983B 3.1P 19H
Q-PCR 1 1.9 1 1 0.3 6.5
Különböző biológiai aktivitású humán melanóma vonalainkban in vitro meglehetősen egyenletes szinten van a b3endonexin expresszió QPCR vizsgálatok szerint. Feltűnő ugyanakkor, hogy az igen alacsony aIIb expressziójú (csak avb3-at kifejező) 3.1P klónunkban milyen alacsony az endonexin expresszió és ehhez képest az aIIbb3 transzfektált 19H vonalban ez a szint több mint 20x magasabb. Ez a jelentősen megemelkedett endonexin expresszió már magyarázatot adhat az észlelt globális génexpressziós változásokra. Továbbmenve azt is megvizsgáltuk, hogy hogyan alakul az b3endonexin expresszió in vivo körülmények között a tényleges áttétképzés során. Olyan modellt használtunk SCID egerekben, amikor spontán áttétképzés csak újszülött egerekben van, felnőttben nincsen és a kétféle primer tumort hasonlítottuk egymáshoz, illetve a primer tumort a belőle keletkezett áttétéhez. A 3.1P vonal esetében a kétféle primer tumor között gyakorlatilag nem volt jelentős endonexin expresszióbeli eltérés csak az áttétekben emelkedett meg a szint ~5x mértékben. A 19H vonal esetében ezzel szemben már a metasztatikus primer tumorban létrejött egy 5x mértékű endonexin expresszió fokozódás amely az áttétekben már nem emelkedett tovább.
5. táblázat. Endonexin expresszió in vivo aIIbb3 transzfektáns klónokban (DNS chip)
3.1P 19H
Metasztatikus primer/ Nem-metasztatikus primer <0.6 >5
Metasztázis/primer >5 <0.9
Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a b3 integrin asszociált transzkripciós faktor endonexin expressziója az emberi melanóma áttétképzése során jelentősen fokozódik. Felmerül annak a lehetősége, hogy endonexin expresszió alapján esetleg prognosztizálni lehet a primer tumor alapján annak későbbi biológiai viselkedését/áttétképzését is. Ehhez azonban a piacon még nem létező monospecifikus antitest előállítására van szükség.
6
7.1.3a. A vaszkuláris adhéziós protein (VAP1) expressziója és szerepe melanómában A daganatok vérellátásának több mechanizmusa lehetséges amelyek egymás mellett is működhetnek: neoangiogenezis, ér-inkorporáció, glomeruloid érfonat-képzés (Döme és mtsai 2003) és vaszkuláris mimikri. A daganatos erek számos ponton eltérhetnek a normális erektől: átmérőjük változékony, permeabilitásuk fokozott és a fal defektív, abnormális bazális mebránnal és pericyta köpennyel. Fenotípusát tekintve a tumoros erekben atradicionális érmarkerek (Cd1, CD34, CD105) hiányozhatnak, de eltünhetnek más adhéziós molekulák is, mint a E-szelektin vagy a VE-cadherin. A VAP1 adhéziós protein egy 90 kD transzmembrán fehérje, amelynek extracelluláris doménje monoaminooxidáz aktivitással rendelkezik és normálisan fehérvérsejtek extravazációjában játszik szerepet. Korábbi vizsgálataink arra hívták fel a figyelmet, hogy a malignus melanomában található intratumorális ereknek jelentős szerepük lehet a daganatok áttétképzésében (Döme és mtsai,2002), azonban ennek módja illetve mechanizmusa még tisztázatlan. Ezért jelen periódusban a korábban még nem vizsgált új endothel-adhéziós molekula a VAP1 expresszióját vizsgáltuk 28 primer bőr melanómában immuncitokémia és immunhisztokémia valamint immunelektronmikroszkópia segítségével és morfometriával kombináltuk. Normál bőrben az epidermis-közeli mikroerek endothelje VAP1 pozitiv volt, míg a mélyebb erekben elsősorban a pericyták mutattak reakciót. 5.ábra. Normál bőr mikroerek VAP1 expressziója
E
P
A/ confokális mikroszkópia VAP1: zöld, mag: kék, BM: piros
b/ immunelektronmikroszkópia VAP1: elektrondenz precipitátum
Melanómák körül a peritumorális érdenzitás igen magas és ezeken a területeken az új erek erős VAP1 pozitivitást mutatnak. Ugyanakkor a daganat belseje felé haladva az intratumorális erek egyre inkább elvesztik VAP1 pozitivitásukat, ami mind az endothel, mind a pericytát érinti. 6. ábra. VAP1 expresszió primer bőr melanomában (immuncitokémia)
PT
IT
Fehér: tumor/stroma határ. PT peritumorális terület, IT intratumorális terület. Zöld: VAP1, piros: laminin
7
Az intratumorális erek csökkent VAP1 expresziója (amit az intratumorális erek VAP pozitivitási %-ban fejeztünk ki) nem függött a daganatok vastagságától, gyakorlatilag amint a tumornak volt dermális komponense, a jelenség egyöntetüen megfigyelhető volt. 7. ábra VAP1+intratumorális/peritumorális erek gyakorisága a melanoma vastagságának függvényében.
% VAP-1+ vessels (mean+SEM)
100
PT IT
75
50
25
0
survival fraction
<1 1-2 2-4 >4 mm Az intratumorális erek melanomában pericytákkal borítottak (Döme és mtsai 2002) így felmerült, hogy a VAP1 expresszió csökkenése/megszűnése esetleg a pericyta boríték elvesztése miatt történik. Kettős jelöléses vizsgálatok szerint azonban a melanoma intratumorális ereinek pericyta borítéka megmarad, csak a VAP1 expresszió vész el. A VAP1 adhéziós molekula mint azt más rendszerekben közölték, a limfociták/leukociták extravazációjában játszik szerepet. Melanóma esetében felmerült hogy az immunreakciót befolyásoló tényező lehet. Az intratumorális antigén prezentáló sejtek vagy CD8 citotoxikus T sejtek denzitása nem tért el jelentősen a magas vagy alacsony VAP1 expressziót mutató melanomákban, ami arra utal hogy az intratumorális erek ezen megváltozott fenotípusa a tumort infiltráló sejtek denzitására hatástalan. Ugyanakkor megfigyeltük, hogy csökkent VAP1 expresszió a primer tumorban (<25%) jelentősen csökkentette a betegek 5 éves túlélését (26.3% illetve 42.6%) (12. ábra), a két csoport vastagsága nem tért el szignifikánsan. 8. ábra. Melanomás betegek 5 éves túlélése az intratumorális erek VAP1 expressziós szintje alapján. VAP>25 (n= 7) VAP<25 (n=19)
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0
12
24
36
48
60
months
Mindezen megfigyeléseink arra utalnak, hogy a melanoma intratumorális ereinek 1./ jelentősége van a daganat progressziójában, 2./megváltozott a fenotípusa (csökkent VAP1 expresszió), amit prognosztikus faktorként is fel lehetne használni (Forster-Horváth Cs és mtsai 2003). 8
7.1.4.Humán fibrosarcoma sejtek mozgása in vitro Kísérleteinkben megállapítottuk, hogy a HT1080 humán fibrosarcoma sejtek in vitro Matrigélen félkör alakot vesznek fel, amely alakot megtartják mozgásuk során (1. ábra). Ez a megfigyelés jelentősen különbözik a korábbi tapasztalatokhoz, amely szerint a fibroblasztok mozgása során a vezető membránjuk kitüremkedését egy farok rész retrakciója követ. A HT1080 sejtek mozgása ezzel szemben a halak keratocitájának mozgásával mutat hasonlóságot, azzal a különbséggel, hogy a tumorsejtek mozgása sokkal lassabb. Megvizsgáltuk a sejtekben az adhéziós helyek, valamint a sejtváz komponenseinek eloszlását a mozgás során. Kimutattuk, hogy a sejtekben az adhéziók csak a sejtek széli részén helyezkednek el félkörben, és a mozgás során a sejtek alatt csak elvétve képződnek. 9. ábra. HT1080 humán fibrosarcoma sejt alakja in vitro migrációja alatt Matrigélen.
10. ábra. Adhéziós plakkok kimutatása in vitro migráló humán fibrosarcoma sejtekben. Vinculin immunfluoreszcencia (a), foszfotirozin-tartalmú proteinek kimutatása (b).
a
b
A citoszkeleton elemek, az α-aktinin (3a ábra) és a miozin (3b ábra), valamint az aktinkötegek (4. ábra) elhelyezkedésének eloszlásából megállapíthattuk, hogy a sejtmozgáshoz szükséges kontrakció közvetlenül a membrán mögött keletkezik a mozgó sejtekben.
9
11. ábra. α-aktinin (a) és miozin (b) molekulák eloszlása in vitro migráló humán fibrosarcoma sejtekben.
a
b
10µ µm
12. ábra. Aktinkötegek elrendeződése in vitro migráló humán fibrosarcoma sejtekben.
Az adhéziós plakkok mozgásának dinamikáját is megvizsgáltuk a mozgó tumorsejtekben. Ehhez a sejteket transzfektáltuk GFP-vinkulin plazmiddal, és a mozgást konfokális mikroszkóppal követtük sorozatfelvételeket készítve. Az eredmények azt mutatják, hogy az adhéziós helyek a sejtek felszínén képződnek, és néhány perc múlva, amikor a sejtek elhaladnak felettük, meg is szűnnek A mozgásuk (természetesen nem egyedi plakk mozgásáról van szó) leírására alkalmas a hal keratociták mozgásánál felfedezett GRE (Graded Radial Extension) modell. Ez a modell azt állítja, hogy a mozgás során a sejtmembrán minden pontja merőlegesen mozdul el a felszínre, mégpedig csökkenő távolsággal (legnagyobb a sejt elején, legkisebb a sejt két oldalsó végén). Ennek megfelelően a sejtfelszín pontjai előre és oldalra irányuló mozgást mutatnak a migráció alatt, a sejt két oldalán természetesen ellenkező irányba. A transzfektált sejteken jól láthatóan kirajzolják az adhéziós plakkok ezt a kétoldali plakk-elmozdulást.
10
13. ábra. Adhéziós plakkok dinamikája in vitro mozgó humán fibrosarcoma tumorsejtben. Kiindulási helyzet (a), 30 perces elmozdulás sorozatfelvételei egymásra vetítve (b).
a
b
10µ µm
A citoszkeleton elemek elhelyezkedése valamint az adhéziós plakkok dinamikájának vizsgálatával felállítottunk egy új modellt a humán fibrosarcoma sejtek migrációjára (6. ábra). Ez a modell a már korábban leírt GRE-modelt használja, és jelentősen különbözik a fibroblasztok mozgását leíró eddigi elképzelésektől. A mozgás során az adhéziós plakkok kizárólag a sejtmembrán frontján keletkeznek, és gyors turnover-ük van. Több adhéziós komponens egyszerre található meg ezeken a helyeken, tehát nincs adhézió érése/öregedése a tumorsejtekben. Az adhéziók dinamikája azt mutatja, hogy az új adhéziós helyek folyamatosan keletkeznek az előzőek előtt egy kicsit oldalra mozdulva. Az aktinkötegek, amelyek az adhéziókat kötik össze íveket formálnak, amelyek konkáv felszínei néznek a mozgás irányára. Ennek megfelelően az aktintól eredő erő merőleges a mozgás irányára. A miozin és az α-aktinin közvetlenül a membrán alatt is megtalálható, és mennyiségük fokozódik a mag felé, amelyből arra következtethetünk, hogy a mozgáshoz szükséges aktin-miozin filament csúszás már a membrán mögött azonnal kialakul. Az aktinkötegeknek folyamatosan kell nőniük a sejt legnagyobb átmérőjéig, ahol az adhéziókkal együtt bekerülnek a sejttestbe és lebomlanak. Látható, hogy ebben a modellben nincs hátsó vége a sejteknek, nincsenek adhéziók a sejttest alatt vagy esetleg a végében, hiszen ezek az adhéziók csak hátráltatnák a sejtmozgást. 14. ábra. Hipotetikus modell in vitro migráló HT1080 humán fibrosarcoma sejtek mozgásának leírására
t4 adhéziók kötegek t3 aktin sejt frontja erők az aktinról és a
t2
szubsztrától
t1
11
t0 start
7.1.5. Motilitással összfüggő gének expressziója humán melanómában metasztatikus és nem metasztatikus körülmények között. A sejtek mozgásának szabályozásában parakrin és autokrin faktorok egyaránt részt vesznek. Korábbi kutatásainkban sikerült kimutatni, hogy az egyik legjobban ismert autokrin szabályozó, az autocrin motilitási faktor (AMF) fontos szerepet játszik egér melanóma sejtek mozgásának szabályozásában. Korábbi vizsgálataink során meghatároztuk az AMF receptoráról (gp78) induló szignálútvonalak egyes komponenseit. Ezek szerint a gp78-hoz kapcsolt G proteinek aktiválódása után a szignál foszfolipáz A2-n (PLA2) keresztül arachidonsav (AA) bontásával folytatódik, amelyet lipoxigenázok (LOX) és ciklooxigenázok (COX) végeznek. Ezek után a szignál jelentős protein kináz C alpha (PKC) aktivitás-fokozódást eredményez, majd több foszfoszerin foszfatáz (PSPP) és protein tirozin kináz aktiválódik (PTK), amelyek már az effektorfunkciókban is szerepet játszanak (pl. citoszkeleton elemek átrendeződése). Azt is kimutattuk korábban, hogy az AMF receptor humán tumorvonalakon és klinikai melanóma mintákban is expresszálódik, és az expressszió mértéke összefüggést mutatott a klinikai stádiummal (Tímár és mtsai 1999,2002). Irodalmi adatok szerint a sejtmozgás effektor funkcióinak szabályozásában kis G-proteinek játszanak kulcsszerepet. A rho/rac/cdc42 kis G-proteinek a sejtmozgás különböző eseményeit irányítják (stressz rostok kialakulása, lamellipodia képződése, filopódia megjelenése), és több molekulát magában foglaló folyamat kiindulópontjai. Jelen vizsgálatainkban arra voltunk kíváncsiak, hogy a már korábban leírt, a motilitás szabályozásában részt vevő szignálkomponensek expressziójában van-e valamilyen különbség metasztatizálást megengedő és gátló környezetben növekedő humán melanóma xenograftokban. Ehhez β3-integrinnel transzfektált humán melanóma sejteket oltottunk felnőtt és újszülött SCID egerekbe subcután. A tumorok újszülött egerekben mindig képeznek tüdőáttétet, míg felnőttben nem tapasztalunk ilyet. Az összehasonlító vizsgálatban metasztatikus és nem metasztatikus körülmények között növekedő primer daganatokból RNS-t izoláltunk, és 3200 gént tartalmazó DNS hibridizációs chipen teszteltük (SZBK DNS chip Labor). Az eredményekből megállapítható, hogy a korábban egér melanómában leírt AMF szignálútvonal több komponensének expressziója jelentősen (több mint ötszörösére) fokozódik a metasztatikus körülmények között növekedő primer daganatban. A legmagasabb expresszió-fokozódást a PKCα esetében tapasztaltuk, amelynek melanoma sejtmozgásban betöltött kulcsszerepét több közleményünkben is leírtuk. Ezen felül azonban fokozott expressziót mutatott több, a lipidszignálban résztvevő elem is (K-Ras, PLA2, PI3K, COX1, TXS), valamint számos tirozin-kináz (Abl, TEK, TEC, NEK, EphA). 15. ábra. Korábban leírt AMF szignálútvonal egyes komponensei expressziójának összehasonlítása metasztatikus és nem metasztatikus körülmények között növő humán primer melanómákban. (lilával azon gének, amelyek expressziója >5x volt az áttétképző tumor szövetében).
KRas 5x< 10x PI3K5x<
13x
TXS 5x<
NEC3, TEC, NEK2 EphA 5x< 12
Ezrin 5X
A motilitás effektor-funkcióit szabályozó molekuláris útvonalak egyes komponenseinek expressziójában is jelentős változást találtunk a metasztatikus körülmények között levő primer melanómában a nem metasztatikushoz képest. A legjelentősebb különbségek a stresszrostok kialakulását szabályozó útvonalban mutatkoztak (Rho, mDia, LIMK), amelyben biztos hogy szerepe van a PKCα-nak is, de más upstream-elemek is fokozott expressziót mutattak, mint pl. az NWASP. 16. ábra. A daganatsejt-mozgás végrehajtásában résztvevő szignálútvonalak egyes komponenseinek expressziója metasztatikus körülmények között növekedő humán melanómában (lilával azon gének, melyek >5x expressziót mutattak).
5x 10x 2x
13x
2x
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a korábban egér melanoma modellben általunk felállított motilitási jelátviteli pálya számos eleme emberi melanomában is kimutatható, még in vivo körülmények között is. Továbbmenve, az a tény, hogy az áttétképző tumorszövetben ezen gének közül számos expressziója jelentősen fokozódik arra utal, hogy ezen motilitási jelátviteli pályának az áttétképzésben is kiemelkedő szerepe van. Harmadrészt, az a tény, hogy ugyanazon génkészlettel rendelkező melanoma sejtek metasztatizálást megengedő környezetben mutatnak ilyen jellegzetes expressziós profilt, arra utal, hogy a szöveti környezet fontos szabályozója a daganatsejtek metasztatikus képességének.
13
7.2. A tumorsejtek ektópiás génexpressziójának felhasználása a differenciáldiagnosztikában és prognosztikában (Tímár et al.2001a) Humán melanóma sejtvonalakban és mintegy 30 emberi melanómában mutattuk ki az αIIb(β3) megakariocita integrin illegitim expresszióját. Vizsgálataink szerint az integrin közeli rokona, az általánosan expresszálódó avβ3 vitronektin receptor konstitutive expresszálódik emberi melanómában, míg az αIIb(β3) megakariociter integrin a tumor vastagságának növekedésével párhuzamosan jelenik meg és a vastag, rossz prognózisú esetekben expressziója hasonló az avb3 integrinéhez (Trikha et al. 2002). 7.táblázat. β3 integrinek expressziója primer bőr melanómában. Immunhisztokémia, konfokális lézer scanning mikroszkópia.
vastagság <1.5 mm 1.5-4.0 >4.0
αIIb (β3)
αv (β3)
7.7+1.8 33.1+10.4 61.5+5.0*
77.9+4.8 88.1+4.1 75.1+9.0
Az adatok a + tumorsejtek %-át jelölik. 7.2.1. Az ektópiás aIIbb3 genetikai szerkezete Vizsgálataink során állandó problémát okozott az annak a ténynek a magyarázata, hogy szemben a trombocitával daganatsejtekben az ektópiás aIIb(b3) integrin minden kisérleti adatunk szerint un. aktív magas affinitású konformációban van jelen (Trikha et al.1997, Tímár et al.1998). Normális körülmények között ez más integrinek esetében csak ligand-kötéskor, trombociták esetében pedig aktiválódáskor jön létre. Felmerült az, hogy ennek a konstitutív aktív konformációnak, aminek funkcionális következménye az állandóan bekapcsolt jelátviteli pálya (FAK tirozin-fiszforiláció) esetleg az aIIb lánc szerkezeti változása állna. Kollaboráló munkacsoportom bemutatta, hogy az aIIb integrin-lánc daganatokban citoplazma-domén hiányos formában is megjelenhet (Trikha 1998). A nyitott kérdés csak az volt, hogy ez új splice variáns-e vagy igazi génkárosodás eredménye. Ezek a megfigyelések fordították figyelmünket az aIIb lánc szerkezetének vizsgálatára, ugyanis az emberi örökletes véralvadási/trombasténiás zavarok jelentős részében az aIIb integrin lánc mutációja mutatható ki, azonban ezen károsodások valamennyien az integrin extracelluláris doménjét érintik. A különféle trombasténiákban vagy maga a ligand kötő régió vagy az un Ca-kötő béta-propeller régiók (amelyből 4 van az aIIb láncban) károsodnak (Mitchell,2003). Ezért olyan primereket terveztünk amelyek aIIb specifikus Ca-kötő domén azonosítására alkalmasak. A probléma azért nehéz, mert ebben a régióban (is) meglehetős homológia van a másik, sokkal gyakoribb integrin az αv vonatkozásában. 17. ábra. aIIb lánc mRNS kimutatása humán melanómában nested PCR és qPCR segítségével. A/ nested PCR: αIIb extracelluláris régió outer primer gradiens és ionkoncentráció kalibráció
14
B/ Real-time PCR kalibráció: 250mM, 65°C – zöld: extracelluláris régió – outer lila: intracelluláris régió - outer
Az aIIb extracelluláris doménjét a 19H aIIbb3 transzfektánsban vizsgáltuk nested PCR segítségével. Meglepetésünkre 2 reakció-terméket kaptunk, melyek szekvenálása során a várt és autentikus (wt) aIIb mellett egy kisebb termék is megjelent a 19H sejtekben. A termék szekvenálása a 1144-1152 nukleotida régióban deléciót jelzett, ami gyakorlatilag 3 aminósav deléciónak felelhet meg (372-373-374). 18.. ábra. aIIb extracelluláris domén nukleinsav és aminósav szekvencia jelölve a 19H melanómában észlelt eddig még pontosan nem jellemzett eltérést. A/ nukleinsav-szekvencia 1081 accgaaaact ggccgaagtg gggcgtgtgt atttgttcctgcagccgcg ggcccccacg 1141 cgctgggtgc ccccagcctc ctgctgactg gcacacagct ctatgggcga ttcggctctg 1201 ccatcgcacc cctgggcgac ctcgaccggg atggctacaa tgacattgca gtggctgccc B/ aminósav sorrend 301 ldsyyqrlhr lraeqmasyf ghsvavtdvn gdgrhdllvg aplymesrad rklaevgrvy 361 lflqprgpha lgapsllltg tqlygrfgsa iaplgdldrd gyndiavaap yggpsgrgqv 421 lvflgqsegl rsrpsqvlds pfptgsafgf slrgavdidd ngypdlivga yganqvavyr A 1144-1152 régió (AA372-374) az aIIb nehézlánc Ca-kötő 2. béta-propeller régiójában helyezkedik el. Irodalmi adatok szerint a 374 pozicióban aminósav-csere megakadályozza az érett aIIb lánc keletkezését, trombasténiát okoz (Michell,2003). Mutagenezis vizsgálatok ebben a régióban azonban azt is kimutatták, hogy a környező aminósavak is befolyásolják a Ca++ kötést és az aIIb lánc érését és a 372-374 régió bizonyos aminósav-cseréi az aIIb lánc fokozott stabilitásához és ami ennél is érdekesebb, az un. aktív, magas affinitású konformáció konstitutív kialakulásához vezethet. Saját funkcionális vizsgálataink a humán melanóma vonalainkon azt mutatják, hogy különböző mértékig de az aIIbb3 komplex magas affinitású konformációban van jelen a sejtfelszinen és igen ritka az aIIbb3 hiánya, különösen nem áll ez a 19H klónra. A megfigyelt Ca-kötő régió-beli aminósav deléció nagy valószínüséggel nemhogy nem akadályozza meg a kóros fehérje felszinre jutását aIIbb3 komplexben, hanem valószínüleg a konstitutív aktiváltság egyik okozója is lehet. Másik okként természetesen az aIIb lánc citoplazmatikus domén-deléciója is állhat (ami a transzfektáns modellünkben természetesen nem állhat fenn). Ezek a vizsgálatok arra irányítják figyelmünket, hogy egy adott adhéziós molekula expressziója malignus daganatban önmagában még nem szolgáltat elegendő magyarázatot az esetleges különös vagy domináns funkciójára, annak hátterében génszerkezeti eltéréseket is érdemes keresni.....
15
7.2.2. Thrombocyta Lipoxygenase Az arachidonsav a jelátviteli rendszerek egyik általános hirvivő-forrása, melynek átalakítását a ciklo- és a lipoxigenáz rendszerek végzik. Elsőként mutattuk ki molekuláris biológiai módszerekkel humán melanóma sejtvonalakban és sebészi anyagban, hogy a melanómában kórosan expresszálódik a thrombocita-típusú 12-lipoxigenáz enzim (Timar es mtsai 2001bc) 19. ábra. p-12-lipoxigenáz sejtvonalakban
enzim
A/ nested-PCR
expressziójának
kimutatása
humán
melanóma
B/ Western blotting
5
6
7
2
1 2 3 4 5 6 7 1=MW, 2=+CTR, 3-6=WM35,WM983B,HT168, HT168M1(humán melanómák),7víz Egyúttal azt is bemutattuk, hogy az enzim expressziója az invazívabb vastag tumorokban fokozódik. Ezek a vizsgálataink megerősítik korábbi megfigyeléseinket, hogy a 12lipoxigenáz enzim a daganatos progresszióban érintett jelátviteli pályákban fontos szerepet játszik. 7.2.3. Heparán szulfát proteoglikán A melanómák sejtfelszini heparánszulfát proteoglikán expressziójának jelentőségét a progresszióban már évekkel ezelőtt megfigyeltük (Tímár et al.2002), ugyanakkor nem volt ismeretes, hogy melyik konkrét proteoglikánról van szó. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a CD44 molekula v3 splice variánsa, mely HSPG funkciót tölt be, a humán melanómák egy részében expresszálódik RNS és fehérje szinten. Mintegy 50 emberi melanóma vizsgálata során azt találtuk, hogy a CD44v3 expresszió az áttétképző daganatokra jellemző (azok mintegy felében van jelen), és ezesetben a betegek 5 éves túlélése szignifikánsan rosszabb mint a negatív daganatos betegeké (Döme et al.2001).
% survival
20. ábra. Malignus melanómás betegek 5 éves túlélése a CD44v3 expresszió függvényében. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
CD44v3 negative (n=24) CD44v3 positive* (n=14) MMP-2CD44v3-=26.63+6.80
MMP-2CD44v3+=69.08+7.24**
0
12
24
36
48
months
16
60
Szintén elsőként igazoltuk emberi melanóma sejrtvonalakban és sebészi anyagban egy kötőszöveti alkotó elem, a TGFβ-t szabályozó decorin gén expresszióját. Vizsgálataink szerint a gén kóros formában van jelen és ennek tulajdonítjuk, hogy a fehérje nem befolyásolja a TGFβ biológiai hatásait melanómák esetében (Ladányi és mtsai 2001, Tímár et al.2002). Eddigi vizsgálataink szerint a decorin nincsen jelen melanocitákban nevusban és dysplastikus melanocita léziókban, ami felcsillantja annak a lehetőségét, hogy ezen kóros génexpresszió a malignus átalakulás indikátora lenne melanómában. Ennek jelentősége az, hogy jelenleg ilyen indikátorral nem rendelkezünk. A melanómák erezettsége és ennek jelentősége a progresszióban már régóta vita tárgya az irodalomban. Munkánk során mintegy 50 emberi melanómában vizsgáltuk az erezettséget és annak összefüggését a betegség kimenetelével. Megállapítottuk, hogy bár a daganatkörüli erezettség jóval magasabb mint a tumoron belül ennek nincs klinikai jelentősége, csakis a daganatszigeteken belüli érdenzitásnak. Ennek valószínű oka az hogy itt történik a daganatsejtek intravazációja, a hematogén áttétképzés első lépése. Megállapítottuk, hogy egy bizonyos intratumorális erezettség alatt (30/mm2) a betegek 5 éves túlélése csaknem 100 % (Döme et al. 2002). 21.. ábra. Malignus melanómás betegek 5 éves túlélése a daganaton belüli érdenzitás függvényében
l a vi vr u s %
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
MVD<30 MVD>30
0
12
24
36
48
60
months
7.2.4. Autokrín motilitási faktor receptor Az áttétképzésben kiemelkedő szerepet játszó sejtmozgást meghatározó autokrín motilitási faktor receptorának (AMFR) kiterjedt expresszióját találtuk humán melanóma sejtvonalakban és sebészi anyagban. Kisérleti körülmények között kimutattuk, hogy a receptor expressziója az áttétképző képességgel fokozódik. A klinikai anyagban bemutattuk, hogy a vastag tumorokban (melyek áttétképző hajlama jelentősen kifejezettebb) az AMFR expresszió is jelentősen megnőtt (Tímár et al.2002). 22.ábra. AMF-receptor expressziója emberi primer bőr melanómában (immunhisztokémia, konfokális lézer scanning mikroszkópia)
A 70
weak heterogenous diffuse/strong
% of cases
60 50 40 30 20 10 0
mm
<1.5 n=24
1.5-3.9 n=16
>4.0 n=14
17
7.2.. Melanoma specifikus génexpressziós profil meghatározása A klinikai és patológiai gyakorlatban használatos melanoma-markerek gyakorlatilag nem azok: valamennyien melanocyta-markerek. Globális génexpressziós vizsgálatok többszörösen igazolták, hogy a melanocyták markerei a tyrosinase, tyrBP1, dopachrom-tautomerase (DCT), S100B és a MART1/MelanA amelyek a nevusokban és melanomákban is különböző gyakorisággal és intenzitással megmaradnak. Emellett kiderült, hogy a melanocytákban több jellegzetes transzkripciós faktor (PAX3, SOX10, SLUGH, MITF) és tirozin kináz (c-met, ckit, c-erbB3) expresszálódik. Miután a mindennapi gyakorlatban nagy szükség lenne malignus-melanoma-specifikus markerre, hiszen egyre gyakoribbak az un. borderline nevussejtes elváltozások célul tűztük ki ilyen gének kutatását. A korábbi vizsgálatok legnagyobb hibájául az róható fel, hogy a melanoma szövet/sejtvonal génexpressziós profilját normál bőr vagy másfajta tumorhoz hasonlították és nem nevushoz (azaz jóindulaú melanocyta daganathoz) ami a mindennapi differenciáldiagnosztika gyakori problémája. Mi 3200 cDNS klonból álló chipen vizsgáltuk 4 különböző genetikai eredetű humán melanoma sejtvonal (WM35, HT199, A2058, HT168) génexpressziós profilját, melyet emberi nevus mRNS expressziós profiljához hasonlítottunk. Konzekvens un. melanoma-specifikus génexpressziót (>1.5x növekedés illetve >50% csökkenés) akkor vélelmeztünk, ha a 4 sejtvonalból legalább 3 esetében volt kimutatható az adott gén expressziójának eltérése. 6. táblázat. Melanoma-specifikus gének expressziója humán melanoma sejtvonalakban (4)
Legalább 3 sejtvonal
Fokozottan expresszált 33/3200 18/3200
csökkent 14/3200 5/3200
A melanómákban csökkenten expresszálódó gének listáját a 6. táblázat, míg a fokozottan expresszálódó génekét a 7. táblázat tartalmazza.
7. táblázat. Melanómában csökkent expressziót mutató gének cDNS Glycerol kinase 2 Fibronectin-1 Homo sapiens cDNA similar to RNA binding protein C. elegans Jagged 1 (HJ1) NADH: ubiquinone oxidoreductase subunit B13 (B13)
WM35 0.085 0.111 0.40
HT199 0.157 0.258 0.358
A2058 0.112 0.128 0.281
HT168 0.055 0.090 0.333
0.441 0.366
0.441 0.526
0.406 0.610
0.625 0.425
Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mRNS-re vonatkoztatva Az érintett gének nem tűnnek különösebben izgalmasnak mivel közöttük 2 metabolikus enzim, egy közönséges matrix fehérje és egy talán a későbbiekben jelentőséggel bíró jelátviteli molekula található.
18
8. táblázat. Melanómában fokozott expressziót mutató gének cDNS WM35 HT199 A2058 Nuclear cup binding 8.693 6.664 protein 80kD Ryanodin receptor2 7.002 4.668 4.738 Peptidyl-prolyl cis- 4.153 2.849 6.229 trans isomerase MP isomerase 2.022 4.128 4.657 Sorcin 3.1746 2.894 MTG8a protein 2.288 2.160 2.788 ATP synthase O 1.890 3.570 3.076 SRNP polypeptide B 1.768 3.341 2.516 SH3p18 4.415 3.800 Glutamate receptor 6 4.484 2.989 Cyclin E 3.476 2.021 2.012 PTPase non-rec1 1.670 2.850 2.353 NADH:ubiquinon 2.208 1.241 2.507 oxidoreductase 15kD Rb-like prot-1 1.886 2.146 1.946 (107kD) IFN-inducible p9-27 2.058 5.816 Biliverdin-IX a- 2.885 1.372 2.245 reductase 60Sribosomal pL41 1.852 3.909 FBR-Mu-SV 1.963 2.372 Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mRNS-re vonatkoztatva
HT168 6.932 4.692 4.137 2.697 2.333 2.250 3.072 5.167 4.415 2.315 1.850 2.389 2.857 2.043 1.750 2.300 3.357 2.000
A melanomában fokozottan expresszálódó gének között sejtciklus-szabályozók (cyclinE, RBlike p107) és jelátviteli alkotók voltak döntő többségben (ryanodin R2, sorcin, SH3p18, PTPnR1). A gének közül 2-nek az expresszióját vizsgáltuk tovább. A cyclinE jelentőségét abban gondoltuk, hogy azt esetleg diagnosztikus markernek fejleszthetjük, mivel jó antitestek állnak rendelkezésre amelyek paraffinos formalin-fixált mintákon is működnek. A ryanodin R2-t pedig abból a szempontból választottuk, hogy ez egy szív-specifikus Ca csatorna, melyet esetlegesen terápiás targetként lehetne fejleszteni. Megkezdtük ennnek megfelelően a cyclinE expresszió melanoma-specificitásának vizsgálatát, első lépésben Q-PCR technikával. Olyan melanomákat választottunk, amelyek nevus talaján alakultak ki. A daganat két részét az általunk hazánkban bevezetett laser-mikrodisszekciós módszerrel választottuk el egymástól és a környező stromától, majd RNSt izoláltunk és BioRad Icyclerrel vizsgáltunk. A mikrodiszekciós mintákban 10.000 sejtből sikerült megfelelő minőségű RNS-t nyerni a tumor fagyasztott metszeteiből. Eredményeink szerint cyclin E mRNS expresszió csak a melanoma szövetben volt kimutatható, sem a nevusban sem a környező stromában nem volt detektálható mennyiségben.
19
23. ábra. Cyclin E expresszió (mRNS) kimutatása Q-PCR és laser mikrodisszekció kombinálásával humán bőr melanoma szövetből.
Temperature, Celsius stroma-----Naevusból izolált melanocyták Melanoma szövetből izolált tumorsejtek Melanoma szövetből izolált stromális komponensek
A továbbiakban a cyclinE fehérje expresszióját kívánjuk vizsgálni nagyszámú nevus/melanoma tumormintákon immunhisztokémia segítségével. A ryanodin R2 a szívizom sarcoplazmás retikulum membránjában lévő Ca csatorna amely azonban T sejtekben, az idegrendszerben myometriumban is kimutatható. Érdekes megfigyelés, hogy a ryanodinR1 a melanocitákban is jelen van. Első lépésben olyan primert terveztünk amely a ryanodin R 1 és 2-t specifikusan el képes különíteni. Ennek segítségével analizáltuk a ryanodin R2 expressziót Q-PCR segítségével a korábban cDNS chippel vizsgált humán melanoma sejtvonalakban. Megállapítottuk, hogy a melanoma vonalakban igazolható a ryanodin R2 expresszió és a sejtvonalak közötti relatív expressziós szint Q-PCR-rel is hasonló mint amit a chip-eredmények mutattak. 24. ábra. Ryanodin R2 mRNS expresszió kimutatása humán melanoma sejtvonalakban QPCR-rel.
A következőkben monospecifikus antitest segítségével vizsgáltuk a ryanodin R2 fehérje expresszióját a humán melanoma sejtvonalakban és 3 bőr melanoma fagyasztott mintájában konfokális mikroszkópiával.
20
A sejtvonalakban a ryanodinR2 egyrészt az ER zónában perinukleárisan helyezkedett el, de jellegzetes membrán-aggregációt is mutatott. A melanoma szövetben a ryanodin R2 egyrészt igen intenzív citoplazmatikus jelölődést mutatott a melanoma sejtekben, ami igen kifejezetten granuláris jellegű volt. 25. ábra. RyR2 HT168 humán melanomában.
26. ábra. RyR2 humán bőr melanomában
Ezek a vizsgálatok azt igazolják, hogy humán melanomákban a Ryanodin R2 gyakori protein szintű expressziójával kell számolni. A Ca csatorna működésének sajátosságai, jelátviteli szerepének tisztázása adhat csak választ arra kérdésre, hogy expressziója szolgálhat-e terápiás célpontként, ami a további periódus kutatási feladata lesz.
7.2.2.Melanóma-specifikus gének expressziójának vizsgálata klinikai anyagban Korábbi globális genomikai vizsgálataink során több olyan gén expressziójára figyeltünk fel, melyek nevushoz képest fokozott expressziót mutattak és ezt qPCR módszerrel is igazolni tudtuk. Ezek között a sejtciklust szabályozó cyclinE, a neurogén sejtek egyik receptora a cannabioid receptor-1 és szívizom Ca-csatornája a ryanodin receptor 2 voltak. Kérdés volt, hogy ezeket a géneket fehérje szinten is ki tudjuk-e mutatni sebészeti mintákban és vajon paraffinos anyag is elegendő erre. 20 –20 nevus és melanóma vizsgálata alapján egyik fenti fehérje sem mutatható ki paraffinos melanóma mintákban a jelenleg hozzáférhető antitestek segítségével. Ugyanakkor valamennyi fehérje megbízhatóan detektálható fagyasztott anyagban, ebből azonban csak 10-10 paralell minta állt rendelkezésre. A cyclin E esetében elsősorban magi reakciós mintázatot kaptunk, bár a melanómák egy részében intenzív cytoplazmatikus reakció is észlelhető volt. A minták között több negatív melanómát is találtunk ugyanakkor a nevusok negatívnak bizonyultak immuncytokémiai vizsgálattal.
21
27. ábra. Cyclin E protein kimutatása nevusban (A) és VGP melanómában (B). A B
A nevusban a laphámsejtek pozitívak, míg a nevus sejtek negatívak. A melanóma sejtek intenzív magi és cytoplazmatikus reakciót mutatnak. Magfestés (piros), cyclin E (zöld). Immunfluoreszcencia. RyR2 fehérje esetében a fentiekhez nagyon hasonló mintázatot kaptunk, bár ez a fehérje egyértelműen cytoplazmatikus lokalizációjú volt az SSM melanómákban. 28. ábra. Ryanodin Receptor-2 kimutatása nevusban (A) és SSM melanómában (B) immunfluoreszcens módszerrel. A B
A nevussejtek negatívak (A: zöld fluoreszcencia), míg a melanóma sejtek (B: zöld fluoreszcencia) erősen pozitívak RyR2-re. A sejtmagok pirosan fluoreszkálnak. A továbbiakban a CB1 cannabioid receptor fehjérjét kiséreltük meg kimutatni emberi melanóma sejtvonalakban amihez igen agresszív biológiai viselkedésű vonalakat használtunk: a HT199 és M1-et melyek genetikailag egymással nem állnak kapcsolatban. Immunfluoreszcens vizsgálattal igazoltuk, hogy humán melanóma sejtvonalakban a CB1 receptor protein kimutatható, mégpedig 2 lokalizációban, a sejtfelszinen illetve cytoplasmában (ez nem csoda), de meglepő módon nagy mennyiségben van jelen a sejtmagban is amire nézve eddig még nem találtunk magyarázatot.
22
29. ábra. CB1 receptor (immunfluoreszcencia) A/ HT199 humán melanóma
kimutatása
sejtek
emberi
melanóma
sejtekben
in
vitro
B/ M1 humán melanóma sejtek
Cytoplazmatikus CB1 reakció A sejtmag pirosan jelölt.
Nnukleáris CB1 reakció (zöld).
Az elmúlt években számos közlemény jelent meg arról, hogy endogén cannabioidok jelentősen képesek különféle daganatféleségek proliferációját illetve apoptosisát befolyásolni, az adatok többsége proliferáció gátlásról és apoptosis indukcióról szól, ami in vitro és in vivo is kiváltható. (Bifulco, Di Matzo, Nat Med 8:547-550,2002). A vizsgálatok kimutatták, hogy a hatásért általában a CB1 receptor expresszió felelős, illetve annak daganatos szignalizációja melynek downstream targetje az EGFR illetve MAPK lehetne… Mindezen adatokról még nem tudva, magunk emberi melanóma sejtvonalak globális génexpressziós mintázatát tanulmányozva észleltük, hogy ezek CB1 mRNS-t tartalmaznak. Természetesen a kérdés az hogy ez a receptor funkcionálisan aktív-e. Ezért megvizsgáltuk 2 CB1 ligand biológiai hatásait több humán melanóma sejtvonalunkon és meglepő módon azt kaptuk, hogy mind a CB1 agonista 2met-F-AEA, mind a CB1 antagonista AM251 jelentősen gátolta a sejtproliferációt: az IC50 mindkét esetben 5 µM körül volt. Azt azért ehhez hozzá kell tenni, hogy a hatás elsősorban az apoptosis-érzékeny szérum-mentes közegben volt ilyen pregnáns, szérum jelenléte az IC50-et csaknem egy nagyságrenddel megemelte! 30. ábra. 2MetF-AEA CB1 agonista és AM251 CB1 antagonista hatása M1 melanóma in vitro proliferációjára (szerum mentes közegben) 0 .8
M et-F -AE A AM 251
0 .7
cell density
0 .6 0 .5 0 .4 0 .3 0 .2 0 .1 0 .0 0
5
10
15
20
µM
A melanóma az egyik legagresszívebb roszindulatú daganat mely egyben igen rezisztens a kemoterápiás szerekre. Ennek hátterében az áll, hogy a melanocyta és a melanóma sejtek is apoptosis rezisztensek. Azt tartja a köztudat, hogy az apoptosis rezisztencia áttörése nélkül nem lehet ezt a daganatot gyógyszeresen kezelni. Ebből a szempontból lenne jelentősége a melanóma CB1 receptorát moduláló farmakológiának….Ehhez azt kell igazolnunk, hogy melanóma esetében apoptosis indukcióról van szó, (más daganatokban is ez történik: emlőrák, prostatarák, vagy glioblasztóma). Pozitív esetben érdekes farmakológiai lehetőséget rejthet a funkcionális CB1 receptor jelenlétének kiaknázása emberi melanómában. 23
7.2.3. WT1 génexpresszió az endothelsejtek és endothelialis tumorok új markere A klasszikus endothelialis markerek angioblaszt-specifikus gének mint a CD31, CD34, VCAM, VE-cadherin, VEGFR2 és a FVIII. Az endothel sejtek angioblasztokból differenciálódnak amelyek csontvelői őssejtekből keletkeznek. A csontvelői őssejtek konstitutiven expresszálják a c-kit-et és a WT1 gént, ugyanakkor angioblasztokban csak a ckit-re vannak adatok ami a kiérett endothel-sejteken már nem expresszálódik. Felmerült a kérdés, vajon a másik ősi csontvelői marker-gén, a WT1 meddig expresszálódik az endothelsejtek diferenciálódása során illetve daganataiban visszatér-e expressziója. Első lépésben in vitro tenyésztett humán endothel sejteken néztük meg a WT1 gén expressziót RT-PCR segítségével. Megállapítottuk, hogy a HUVEC és a Kaposi sarcoma sejtek WT1+ak, míg az agyi mikrovaszkuláris endothel (HBME) WT1 negatív volt. 31. ábra. WT expresszió humán endothel sejtekben in vitro, RT-PCR. KS HBME HBME HBME HBME
HUVEC
a
nyíl: WT1
A KS sejtek SCID egerekben tumorigének és metasztatikusak, melyekből áttéti modellt is kialakítottunk. Ezen xenograft szövetekben mind a primer, mind az áttéti szövetekben WT mRNS és protein expressziót tudtunk kimutatni RT-PCR illetve immunhisztokémia segítségével. A módszer érzékenységét jól mutatta, hogy az egerek keringésében is sikerült RT-PCR módszerrel a keringő KS sejteket kimutatni WT1 expresszió alapján. Azt is megállapítottuk, hogy ezek a KS sejtek a WT több splice variánsát is expresszálják (17AA+/illetve KTS+/-). A következőkben 42 bőrbiopsziás anyagban vizsgáltuk a WT1 protein expressziót panWT1 illetve 17AA-specifikus antitest segítségével. Kontrollként a CD34 reakciót végeztük el. Meglepetésre a bőr mikroereinek endothelje intenzíven jelölődött, de csak a panWT1 antitesttel, azonban a reakció citoplazmatikus volt (18a ábra). Gyulladásos szövetben is megfigyeltük a regenerálódó erekben a WT1 pozitivitást 32.ábra. WT1 protein expresszió emberi bőrben (immunhisztokémia)
A/ normál bőr mikroerek
B/ dermatitis, granulációs szövet
24
A továbbiakban 10 benignus (haemangioma, és 26 malignus érdaganatban (Kaposi sarcoma és angiosarcoma) tanulmányoztuk a WT1 expressziót. Az esetek döntő többségében csak a panWT1 antitest mutatott citoplazmatikus reakciót, a 17AA antitest csak a Kaposi sarcomák egy kis részében adott magi pozititást a daganatsejtekben. 33. ábra WT1 protein expresszió érdaganatokban.
A/ haemangioma
B/ Kaposi sarcoma
C/ angiosarcoma
Valamennyi esetben a tumort körülvevő normál szövetben az erek WT1 pozitivak voltak és az un. peritumorális neoangiogenetikus erek is hasonlóan jelölődtek. Az endothelialis tumorsejtek a haemangiomák és Kaposi sarcomák 30%-ban expresszálták a WT1-et. Ugyanakkor az angiosarcomák egy eset kivételével WT1 pozitívaknak bizonyultak 9.táblázat. WT1 protein expresszió érdaganatokban pTE
nE
TC Normál bőr (n=42)
42/42
gyulladás (n=6)
6/6
Benignus tu. (n=10)
3/10
10/10
10/10
Malignus tu. (n=26)
14/26
26/26
26/26
KS (n=18)
7/18
18/18
18/18
AS (n=8)
7/8
8/8
8/8
NE= normál erek, pTE= peritumorális érhálózat, TC= tumorsejtek
Mindezen vizsgálatok alapján számol fontos következtetésünk van. 1./ A WT1 expresszió (bizonyos megszorításokkal) új endothelialis markernek tekinthető. 2./ Felmerül az is hogy a WT1 expresszió angioblast marker, erre nézve további vizsgálatok kellenek. 3./ A WT1 az angiosarcomák markere. 4./ A Kaposi sarcomák a WT1 expresszió alapján is inkább lymphogen, mint vérér eredetűek.
25
7.2.3.Tumor-infiltráló sejtek prognosztikai jelentősége A melanómát infiltráló T-sejtek aktiváltsági állapota és prognosztikai jelentősége Emberi melanómákat (76 eset) infiltráló T-sejtek aktivációs állapotának meghatározását két T-sejt-aktivációs marker, a CD25 illetve a CD134 (OX40) elleni antitesttel végeztük. A CD25 (IL-2-receptor-α) a tumorokat infiltráló limfocitáknak csak kis részén jelenik meg, és a sejtosztódást szabályozó receptorként a T-sejtek működésében is kiemelten fontos szerepe van. Az OX40 a frissen aktivált CD4+ sejtek - igen specifikus – markere. A két T-sejt-aktivációs markert (CD25, 20. ábra, OX40, 21. ábra) hordozó limfociták mennyisége a peritumorális infiltrátumban szignifikáns különbséget mutatott a nem metasztatikus vagy csak nyirokcsomóáttétet adó tumorok és a szervi áttétet adók között, az előbbiek javára. 34. ábra. Humán melanóma T sejt aktivációs markereinek expressziója és a progresszió CD25+
OX40+
400
140
2
2
cells/mm
200
cells/mm
120
300
100
100 80 60 40 20
0
0
Nonmet+LN-m et
Nonm et+LN-m et
Visceral met
Visceral m et
Ugyanezek a paraméterek a betegek túlélésével is összefüggést mutattak: azok a melanómás betegek, akiknek tumora nagymennyiségű CD25+ (22. ábra) illetve OX40+ (23. ábra) limfocitát tartalmazott, szignifikánsan hosszabb túlélési idővel rendelkeztek, mint azok, akiknél alacsony volt ezen sejtek peritumorális denzitása (CD25: p=0,0028; OX40: p=0.0255). A két marker tehát prognosztikai faktorként használható melanómás betegekben (Ladányi et al. 2003a,b,c). 35/a. ábra. CD25 és melanóma túlélés.
35/b. ábra. OX40 és melanóma túlélés.
+
CD25
OX40+ 1,0
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
Survival ratio
Survival ratio
1,0
0,6 0,5 0,4 0,3
0,6 0,5 0,4 0,3
0,2
CD25+>75 (n=37)
0,2
0,1
CD25+<75 (n=39)
0,1
OX40+>20 (n=28) OX40+<20 (n=48)
0,0
0,0 0
10
20
30
40
50
0
60
months
10
20
30
months
26
40
50
60
Dendritikus sejtek vizsgálata primer malignus melanómákban Különböző progressziós stádiumú primer melanómákban vizsgáltuk a mononukleáris infiltrátum sejtes összetevőit. Ezen belül kvantitatívan értékeltük a legjelentősebbnek tartott antigénprezentáló sejtek, a dendritikus sejtek denzitását (77 tumormintában), a melanóma sejtfészkeket infiltráló intratumorális, illetve a tumorokat körülvevő infiltrátumban megjelenő peritumorális lokalizációban. Mind intra-, mind peritumorálisan a legmagasabb dendritikus sejt-szám az 1,0 mm-nél vékonyabb melanómáknál volt megfigyelhető. Az 1,01-2,0 mm közötti tumorokban már ennél kevesebb dendritikus sejtet találtunk, míg a 2,0-4,0 mm-es és a 4,0 mm-nél vastagabb kategóriában további csökkenés mutatkozott. A tumorvastagsággal való fordított korreláció szignifikáns volt (Kruskall-Wallis teszt, p<0,0001). 36. ábra. Humán melanóma DC sejtek denzitása és a tumorvestagság Intratu. CD1a +
Peritu. CD1a +
140
200
100
cells/mm 2
cells/mm 2
120 80 60 40
150 100 50
20 0
0 <1.0
1.0-2.0
2.0-4.0
<1.0
>4.0 m m
1.0-2.0
2.0-4.0
>4.0 m m
Mind az intratumorális, mind a peritumorális infiltrátumban megfigyelhető volt, hogy az áttétet nem adó daganatok esetén az átlagos dendritikus sejt-szám magasabb volt, mint az akár nyirokcsomó-, akár szervi áttétet adók esetén. Ennek oka nagyrészt az, hogy a legvékonyabb kategóriában találhatók a legmagasabb értékek, s ez a csoport kizárólag nem metasztatikus tumorokból állt ebben a vizsgálatban. Amennyiben az 1,0 mm-nél vékonyabb melanómákat kihagytuk a vizsgálatból, a különbség eltűnt. Azok a melanómás betegek, akiknek primer tumora nagymértékű peritumorális dendritikus sejt-infiltrációt mutatott (>30 sejt/mm2), jobb túlélési eséllyel rendelkeztek (5 éves túlélés: 78% vs. 54%, p=0,0422). Azonban ha a vékony (≤1,0 mm) tumorokat nem vesszük figyelembe, a különbség itt sem szignifikáns. Ez azt jelenti, hogy a vizsgálat szerint ez a paraméter nem alkalmazható prognosztikus faktorként, minthogy hatása a tumorvastagságtól függ, és a középvastag-vastag kategóriákban, ahol ténylegesen kérdéses a betegség kimenetele, nem ad információt erre nézve (Ladányi et al. 2003a,b). Megfigyeléseink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a melanoma vastagságával egyre csökken abban az antigén-prezentáló sejtek denzitása, ami az un. immunterápiák esélyét csökkentő tényező.
27
7. 3./ A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása a tumorok individuális viselkedésének predikciójára 3.1.Progressziós oligo- chipek készítése Az SZBK chip-laboratóriumával kollaborációban megkezdtük vizsgálni emberi melanómák génexpressziós profilját 3200 emberi gént tartalmazó cDNS-chip segítségével. Referenciaként nem-metasztatikus sejtvonal szolgált (WM35) míg áttétképző sejtvonalakból 3 genetikailag egymással kapcsolatba nem álló sejtvonalat választottunk. Bár számos gén expressziójában találtunk eltérést, ezek közül véleményünk szerint azoknak lehet jelentősége amelyek a vizsgált sejtvonalak többségében is megjelentek. Ilyen szigorú kritériumok alapján mintegy 20 gént tartalmazó lista keletkezett, melyek expressziója szignifikánsan eltért az áttétképző illetve a nem-áttétképző sejtvonalakban (Kopper és Tímár 2002). A gének között vannak olyanok, melyeket korábban már kapcsolatba hoztak a melanóma progressziójával (TIMP3, uPAreceptor, RXRγ), azonban döntő többségükről eddig még ilyen adataink nincsenek. A továbbiakban a kapott adatok részletes elemzése illetve egygénes PCR és kvantitatív PCR ellenőrzése folyik 10. táblázat Génexpressziós profil változások áttétképző emberi melanómákban (3.2K cDNS chip, SZBK) fokozódás RXRgamma v-ral GAPSH3 foszfoszerin kináz aminotranszferáz ferritin
csökkenés IL-10 IL-17R IL-1b konvert. enzim teratocc. GF CD73
MLC MBP b3 endonexin LAMP2 metallotionein 3
uPAR TIMP3 lizozim karboxipeptidáz M kalpastatin TRAIL
A program keretében hazánkban elsőként munkába állítottunk egy lézer-mikrodisszekciós készüléket és kialakítottunk egy ilyen laboratóriumot, ahol emberi szövetek metszeteiből néhány sejtet mikroszkópos ellenőrzés mellett eltávolítva mód nyílik arra, hogy a génexpressziót daganatokban szöveti környezetben is sejtekhez lehessen kötni. Kidolgoztuk a DNS és RNS izolálás metodikáját amikoris 103 illetve 104 sejtből lehetséges un. azonosított géenxpressziós profil meghatározása. Ezek a vizsgálatok ahhoz fognak hozzásegíteni, hogy a melanóma progressziójában szerepet játszó gének szöveti környezetben történő expresszióját nyomon követhessük 37. ábra. Primer bőr melanóma tumorszigetének mikrodisszekciója és actin-PCR-je
28
7.3.1. „Progressziós oligo-chip tervezése” Az elmúlt időszakban számos vizsgálat alkalmazta a globális génexpresszió meghatározását arra, hogy egyes daganatféleségek, vagy a metasztatikus daganatok specifikus génjeit meghatározzák. Ezen vizsgálatok érdekes eredményekkel jártak amelyek az áttétképzésről alkotott elképzeléseinket is alapjaiban változtathatják meg. A két érvényes teória szerint az áttétképző képesség az áttétképző primer tumor sejtjeinek döntő részére jellemző, így az prediktálható az általános génexpressziós profil alapján, míg a másik vélemény szerint ezzel a képességgel csak a populáció egy kicsi, sokszor elenyésző része rendelkezik, így azt ilyen vizsgálat nem képes felderíteni, erre az áttétek vizsgálata alkalmasabb, mert abban feldúsulhat ez a populáció. Kisérleti rendszerben vizsgáltuk ezt a kérdést, amikoris humán melanoma sejteket oltottunk semiorthotopikus (subcutan) pozícióba SCID egerekbe olyan körülmények közé, amikor a gazdaszervezet metasztázis permisszív (újszülött) illetve restriktív (felnőtt) volt. A primer és metasztatikus tumorokból RNSt izoláltunk és 3.2 K humán cDNS chippel hasonlítottuk össze az expressziós profilokat. A vizsgálatot 3 tumorvonallal végeztük el, a WM983B un. szülői vonal (heterogén összetételű, metasztatikus), annak negatívan szelektált, gyengén metasztatikus variánsa, 3.1 és ennek integrin aIIbb3 transzfektált erősen metasztatikus klónja, 1919H. 11. táblázat. Génexpressziós eltérések primer és áttéti tumorban, WM983B melanoma. WM983B (parent) NM/Mp P/M 6 7 Represszált Ribosomal protein L35 Pig10 mRNA Brain-derived neurotrophic factor Interferon-inducible protein Acyl-Coenzyme A dehydrogenase long chain Glutathione S-transferase theta2 Gap junction protein beta 1 Glucocorticoid receptor alpha Receptor protein-tyrosine kinase (HEK7) Translation elongation factor 1 delta KIAA0134 Actin related protein, subunit 5 overexpresszált Eukaryotic translation initiation factor 3, TIF3 CDC28 protein kinase Protein phosphatase 2A (beta-type) Small nuclear ribonucleoprotein B and B1 Death associated transcription factor 1, DATF1 Metallothionein 1L Light polypeptide similar to ferritin Utrophin TNF-alpha converting enzyme, TACE, ADAM17 RNA polymerase III subunit EGFR2 Aconitase 2, mithocondrial Mitotic feedback control protein Madp2 hom DNA polymerase alpha-subunit Q13066 GAGE-2 protein UDP-glucuronosyltransferase 2B10 pre. Összesen változó
0.474
0.491 0.436 0.513 0.519 0.540 14 2.414 2.311 2.182 2.163 2.134 2.059 2.057 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000
20
0.407 0.513 0.500 0.500 0.500 0.500 0.375
2
2.051 2.060 9
NM= nem áttétképző primer tumor, Mp= áttétképző primer tumor, P= primer, M= metastasis. Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mRNS-re vonatkoztatva
29
Az alapvonal (WM983B) esetében azt tapasztaltuk, hogy a primer tumorban mintegy 20 gén expressziója változott amikor az áttétképzést hajtott végre, míg a primer tumor és áttéte között csak 9 gén expressziója volt eltérő, ami arra utalt, hogy a primer tumorban jelentős mennyiségű áttétképző sejt volt jelen, melyek klónjai az áttétekben is megtalálhatók (nem volt további szelekció). További érdekesség volt, hogy a primer tumorban elsősorban bizonyos gének expressziójának csökkenése volt az áttétképző tumorban, míg az áttétekben inkább génexpresszió fokozódás volt a jellemző. A gének között általában nem ismert géneket találunk, a tirozin kinázok és foszfatázok, az apoptosist és a proliferációt szabályozó gének közül. A negatívan szelektált gyengén áttétképző 3.1 klón esetében hasonló tendenciák érvényesültek de érdekes módon más és kevesebb gén részvételével, melyek között számos még nem tisztázott fehérjét kódoló szerepelt. 12. táblázat. Génexpressziós változások metasztatikus körülmények között gyengén metasztatikus 3.1 melanomában. 3.1 (negatian szelektált)
NM/Mp
represszált
1
Histidyl-tRNA synthetase Proteosome component C5 HUL 15/19 overexpresszált
P/M 2 0.369 0.379
0.414 7 4.410 3.740 3.129 2.964 2.788 2.38 2.077 8
HUL9/32 HUL19/30 HUL19/13 HUL21/25
0
HUL 21/18 HUL12/63 HUL22/40 2 Összesen változó NM= nem áttétképző primer tumor, Mp= áttétképző primer tumor, P= primer, M= metastasis. Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mRNS-re vonatkoztatva
A 3.1-transzfektált és fokozottan áttétképző hajlamú klónja a 1919H esetében a fentiekkel ellentétes tendenciákat tapasztaltunk. Az áttétképzést megengedő körülmények alig befolyásolták a klónok expressziós profilját (5 gén változott) amelyek között nukleinsav szintézist végző gén illetve transzkripció szabályozó volt. Ugyanakkor igen jelentős génexpressziós profil eltérés keletkezett a primer tumor és áttéte között: az áttétben sok gén expressziója fokozódott, amelyek között a proliferációban a sejt-metabolizmusban, a matrixkölcsönhatásban a túlélésben szerepet játszó gének sora aktiválódott. Ez arra utal, hogy az integrin-transzfekció hatására a tumor populációban jelentős képességű, de kis számú különleges sejt keletkezett amelyek a metasztázisokban mintegy bedúsulhattak. Külön érdekesség, hogy az itt aktiválódott vagy kikapcsolódott gének egyik előző sejtvonalban sem szerepeltek. Ez arra utal, hogy ugyanazt a célt, az áttétképző daganatsejtek igen eltérő molekuláris megoldásokkal (génkészlettel) képesek elérni. Ennek igen nagy klinikai jelentősége lehet, mert ezek szerint nehéz készíteni egyszerű sablonokat, a daganatok individualitása ebből a szempontból is érvényesül.
30
13. táblázat. Génexpressziós profilok változása integrin transzfektált 3.1 melanoma klonban (1919H) Transzfektált 3.1/1919H represszált Interferon inducible protein 9-27 Very low density lipoprotein receptor Nuclear cap binding protein, 80kD Laminin, gamma1 NBPhox Cysteinyl-tRNA synthetase AMY-1 mRNA CUL-2 mRNA ERC-55 mRNA Grancalcin Human TNF-alpha converting enzyme Endothelin receptor type B Krueppel-related zincfinger protein Multidrug resistance protein 1 Death associated transcription factor Glucocorticoid receptor alpha Ribosomal protein, large, P0 Ionotropic ATP receptor P2X5a CHD1 mRNA Ribonuclease, A family overexpresszált Cysteinyl-tRNA synthetase Ribosomal protein S2 Humán interferon-gamma induced protein EGFR3 Putative oral tumor suppressor Chloride intracellular channel 1 Solute carrier family 9 Phosphatidylinositol 4-kinase alpha HUL20/76 Összesen
NM/Mp 3 0.248 0.315 0.456
2 1.988 1.593
5
P/M 17
0.325 0.347 0.401 0.404 0.429 0.429 0.432 0.434 0.434 0.437 0.439 0.459 0.475 0.475 0.497 0.498 0.501 7
1.835 1.863 1.922 2.007 2.010 2.013 3.090 24
NM= nem áttétképző primer tumor, Mp= áttétképző primer tumor, P= primer, M= metastasis Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mRNS-re vonatkoztatva Ezek a vizsgálatok arra is felhívták a figyelmünket, hogy az in vivo észlelhető géenexpressziós profilok alapvetően eltérnek az in vitro tapasztaltaktól (melyekről az 1. sz jelentésben már beszámoltunk). Ez a tény tovább erősíti azt a véleményünket, hogy az áttétképzés mechanizmusát illetve az ebben szereplő géneket nem lehet in vitro megismerni, ehhez releváns állati modellekre és értlemes klinikai vizsgálatokra van szükség. Megdöbbentő volt továbbá az a tény, hogy a 3 melanoma sejtvonal esetében csak 1 olyan gén volt amely 2 sejtvonal esetében is hasonlóan változott az áttétképzés során, ez a glucocorticoid receptor-α volt. Korábban már melanoma sejtvonalakban észleltük ennek a génnek expresszióját az áttétképző sejtvonalakban. Saját korábbi megfigyeléseink melyeket kisérleti melanoma modelleken tettünk, valamint a klinikai adatok mind arra utalnak, hogy steroid receptorok szerepet játszhatnak a melanoma progressziójában, sajnos eddig még nem tisztázott módon. A steroid receptor (család) expressziójának és funkciójának vizsgálata humán melanomában talán közelebb vezethet bennünket a kérdés tisztázásához a kutatási program utolsó évében.
31
•
7.3.1.1.Humán melanóma chip.... Az áttétképzés folyamatának kutatásában a microarray technika jelentős előrehaladással kecsegtet. Alkalmazásának azonban gátat szab, hogy a műtéti anyagokból származó minták lokalizációja, stádiuma valamint a host genetikai és fiziológiai státusza egyaránt rendkívül heterogén mintázatot mutat. Célunk egy olyan kísérletes metasztázis modell kidolgozása volt, amely a lehető legtöbb paraméter szempontjából standardizálható, ismételhető és az azonos típusú, de különböző genetikai eredetű humán tumoroknak, jelen project esetén humán melanómák vizsgálatára egységes platformot biztosít, amely alapján a valóban host vagy tumor eredetű változásokra lehet a kérdéseinket fókuszálni. A vizsgálatok végső célja az, hogy a melanómák un. metasztatikus génexpressziós újjlenyomatát meghatározzuk, miután erre nézve csak igen kezdetleges adatok állnak rendelkezésre, szemben pl. az emlőrákkal. A modell alapja az a tény, hogy veleszületetten vagy mesterségesen immunszupprimált újszülött rágcsálókban számos olyan humán tumor ad megbízható gyakorisággal áttétet, amely kifejlett állatokban soha. Ily módon lehetőségünk van arra, hogy genetikailag gyakorlatilag azonos hostba, azonos időpontban, azonos lokalizációba, azonos tumorsejt-szuszpenziót implantáljunk. A különbség a két host között fiziológiás, ám az áttétképzés szempontjából mégis döntőnek bizonyul. Mivel a tumor stromális komponensei host eredetűek, a host és tumor eredetű változások külön speciesspecifikus DNS-chipen (egér ill. humán), azonos mintából vizsgálhatóak. Az áttétek könnyen hozzáférhetőek, azaz azonos időpontban hasonlíthatjuk össze a primer és az áttéti tumor génexpressziós mintázatát is – és ezt is a stromális komponensek zavaró hatása nélkül.
Veleszületetten immunhiányos újszülött (a születéstől számított 24 órán belül) és kifejlett scid/scid egérbe ugyanazon humán melanóma sejtvonal in vitro tenyészetéből származó egysejtszuszpenzióját implantáltunk azonos szubkután régióba (szemiortotop implantáció). A kiértékelés két időpontban történt, a tumor implantációjától számított 7. és 21. napon. A 7. napon a makroszkóposan színes gombostűfejnyi tumorból és környezetéből totál RNS-t izoláltunk. Ugyancsak RNS-t izoláltunk azonos alomból származó 7 napos állatok megfelelő szöveti régiójából. A 21. napon kizárólag a tokkal körülhatárolt primer tumort távolítottuk el mindkét állatcsoportból, illetve a tüdőáttéteket vágtuk ki egyenként az újszülöttként implantált állatok tüdejéből. Ugyanezen kísérletet három, genetikailag különböző eredetű humán melanóma sejtvonallal (WM983B, HT168M1, HT199) párhuzamosan végeztük el. Az expressziós mintázat változásának kiértékelését a 21. napon 18.000 gén-specifikus probe-ot (OperonSIGMA) hordozó humán oligonucleotide microarray-vel (SZBK, Dr. Puskás László – Biorobotics TAS spotter) végeztük el. Szignálamplifikációt (Genisphere) követően a Cy5-jelölt mintákat Ventana Discoveries automata hibridizációs rendszerrel hibridizáltuk és olvastuk le. Az egyszínű jelölés lehetőséget nyújtott (az Affymetrix rendszeréhez hasonlóan) valamennyi minta összes más mintához történő összehasonlítására. A statisztikai elemzést Lowess normalizáció és T-teszt segítségével végeztük el. Az M és A értékeket alapján határoztuk meg azokat a géneket, amelyek expressziós változása szignifikánsnak volt tekinthető. A 7. napon nyert minták kiértékelésére a tumor eredetű faktorok esetén az Agilent 41,000 génre specifikus (60mer oligo próbákat hordozó) Whole Human Genome Oligo Microarray Kit-jét, a host eredetű faktoroknál az Agilent 20,000 egér eredetű génre specifikus (ugyancsak 60-mer oligo próbákat tartalmazó) Agilent Mouse Oligo Microarray Kit-jét használtuk. A mintákat amplifikálás nélkül Cy3 és Cy5-jelölést követően páronként egymással szemben hibridizáltuk és Agilent Microarray Scanner segítségével olvastuk le és a cég által biztosított Agilent Feature Extraction Software segítségével értékeltük ki.
Az implantációtól számított 21. napon az újszülöttként implantált állatokban minden esetben tüdőáttétet, esetenként agyi és nyirokcsomó áttéteket találtunk. Kifejlett állatokban lényegesen hosszabb túlélés esetén sem tapasztaltunk áttétképzést ebből a lokalizációból egyetlen humán melanóma esetén sem Ez a modell számos előnnyel szolgál az áttétképzésben (potenciálisan) résztvevő gének felderítése szempontjából. Először is lehetőséget kínál annak eldöntésére, hogy az áttétképzésre alkalmas sejtpopuláció szelekcióját host vagy tumor eredetű tényezők befolyásolják. Azaz a host által biztosított környezet szelekciós nyomást gyakorol a kiindulási, in vitro tenyészetből származó sejtpopulációra, és ily módon egy olyan primer tumor alakul ki, amelyben már jelen vannak az áttétképzésre alkalmas sejtek. Ebben az esetben lényeges különbséget kell találnunk a kifejlett és az újszülött állatban kinőtt, azonos
32
korú primer tumor génexpressziós mintázata között. Ez a szelekció, mivel ezen inbred állatok genetikai állománya gyakorlatilag azonos, azonos az implantáció lokalizációja, tehát a szöveti környezet is, mindössze a host fiziológiásnak tekinthető állapotkülönbségével, azaz a újszülött státusszal hozható összefüggésbe. A modell ebben a tekintetben egészen különleges lehetőségeket kínál a xenograft tumorok jól ismert szövettani sajátságai miatt. Ezen tumorokban ugyanis kizárólag a tumor humán eredetű, míg a stromális komponensek (kötőszövet, erek) host, azaz egér eredetűek. Amennyiben tehát a tumor génexpressziós mintázatában mutatkozó különbségeket szeretnénk vizsgálni, humán microarray-el nagy valószínűséggel megtehetjük. Nem szembesülünk azzal a humán műtéti anyagból származó mintákban oly gyakori problémával, hogy a tumorból származó RNS pool a stromális komponenseket is tartalmazza, annak arányától függően jelentősen torzíthatja „hígíthatja” a tumorra jellemző RNS mintát. Mivel a standardizálásra használt géneket a stromális komponensek is ugyanúgy expresszálják, a hígítás mértékét nem lehet kontrollálni. Izgalmas lehetőség, hogy eldöthető, hogy bizonyos, potenciálisan a host és a tumor által egyaránt expresszálható génekről eldönthető, hogy mely komponensből származnak. Ami ennél is lényegesebb, az újszülött és a kifejlett állat által a tumor számára „nyújtott” host eredetű faktorok egér microarray segítségével egyértelműen meghatározhatók és összevethetők. Mivel az eredmények validálása (humán gének esetén az Applied Biosystems TaqMan kártyája segítségével, host eredetű gének esetén kvantitatív PCR-ral, egyedileg tervezett primerekkel) most van folyamatban, végleges génlista még nem közölhető. 38. ábra. Humán 42000 oligochip hibridizálás M1 humán melanóma metasztatikus és nemmetasztatikus primer tumorának RNS-ével. A/ Oligo-chip spot-fluoreszcencia
B/ Génexpresszió változások megoszlása
A 21. napon vett minták alapján levonható következtetések (kizárólag olyan géneket figyelembe véve, amelyek a három tumor közül legalább kettőben több mint 2-szeres különbséget mutattak): Az áttétképző és nem-áttétképző sajátossággal rendelkező primer melanómák (újszülött szubkután vs felnőtt szubkután) 72 eltérő módon expresszálódó gént hordoztak. Ez a szám a szelekciós teóriát támasztja alá, mivel lényegesen több, mit az újszülött primer tumora és tüdőáttéte közötti 42 gén különbség. Különösen ha tekintetbe vesszük, hogy ezen gének egy része nagy valószínűséggel az új mikrokörnyezet (szubkután vs tüdő) hatására váltott expressziós mintázatot. Érdekes módon feltűnően sok mRNS-splicingért felelős gén mutatott szignifikáns eltérés ebben az összehasonlításban. A legnagyobb különbséget (103 gén) az in vitro tenyészet (amiből a szubkután implantációk megtörténtek) és a szubkután növő tumor expressziós mintázatában találtunk, amely a tenyészeteken végzett kísérletek korlátolt értékelhetőségére hívhatja fel a figyelmünket. A 7. napon értékelt minták esetében 846 up és 1175 down-regulált humán gén mutatott 2-szeresnél nagyobb expressziós különbséget egybehangzóan legalább kétféle humán melanóma esetében. Ez a változás arányaiban lényegesen nagyobb, mint a 21. napos változás. Az eltérő platformon kívül a host esetleges változása (az újszülött „felnő”) is
33
magyarázhatja ezt a jelenséget. Az újszülött esetén szelekciós nyomást gyakoroló faktorok eltűntével ugyanis a tumor genetikai instabilitásának köszönhetően az új faktorok által támogatott populációkkal gyarapszik, s ezzel „kihígul” az áttétképzésre jellemző expressziós mintázat. Különös tekintettel figyelünk azon génekre, amelyek megváltozott expressziója a 21. napra még mindig megtartott. Az egér-gének vizsgálatakor (inváziós host) 36 down és 46 upregulált gént észleltünk (p<0.001) ami alaposan leszűkíti a szelekciós nyomásért felelőssé tehető faktorok számát. Ennek kiszűrése és a humán műtéti anyagok stromájából a megfelelő humán gének expressziójának kimutatása teljesen újszerű eredményeket ígér. 7.3.1.2. Fejnyaki laphámrák Régi klinikai megfigyelés, hogy a különböző anatómiai lokalizációjú fejnyaki rákok esetében a klinikai lefolyásban jelentős eltérések vannak, bár a szövettani típus vagy a klinikai stádium igen hasonló. Ennek egyik lehetséges magyarázata lehet az, hogy ugyanazon daganattípus génexpressziós profilja az anatómiai környezet (normál szövet) hatására eltérő lehet. Ennek tisztázására húsz glottikus gégerák esetében az un. metasztázis gének expressziós mintázatát vizsgáltuk egy 96 génből álló Superarray makrochip segítségével. A daganatokat larynngeaális és hypopharyngealisakra osztottuk és eltérő expresszió határának a 2x különbségeket vettük. A vizsgált 96 gén közül 18 esetében találtunk eltérő expressziót a két anatómiai lokalizációban (20%). Vizsgálataink szerint a jobb prognózisú laryngeális daganatokban 3 metasztázis szuppresszor gén: NME4, DCC és E-cadherin1 jelentős expressziót mutat a hypopharyngeális tumorokhoz képest, ami alátámaszthatja ezen tumorok kevésbé aggresszív viselkedését. Ugyanakkor a laryngealis rákokban számos u. metasztázis asszociált gén expressziója mutatható ki (integrin a5/a6, MMP1, CD44, osteopontin) amelyek nincsenek jelen a hypopharyngeális rákokban, igazolva azt, hogy a két daganatféleség progressziós képessége jelentősen eltérhet. 14. táblázat. Glottikus tumorok differenciált metastasis-asszociált génexpressziója (SuperArray macrochip) Description Larynx (n=5) Hypopharynx Gene GeneBank (n=5)
nam e Rac1 NME1 S100A4 Osteopontin CD44 Integrin α5 Integrin α6 Collagenase1 PAI-1 Cystatin C DCC NME4 E-cadherin CD31 MT1-MMP
NM-006908 NM-000269 NM-002961 NM-000582 NM-000610 NM-002205 NM-000210 NM-002421 NM-000602 NM-000099 NM-005215 NM-005009 NM-004360 NM-000442 NM-004995
TMPRSS4 FGF2 c-Fes
NM-019894 NM-002006 NM-002005
Ras-related C3 botulinum toxin substrate Non-metastatic cell-1 protein (NM23A) S100 calcium binding protein A4 Secreted phosphoprotein-1 (osteopotin) CD44 antigen Integrin, alpha 5 (fibronectin receptor alpha) Integrin, alpha 6 Matrix metalloproteinase 1 (interstitial) Plasminogen activator inhibitor type 1 Cystatin C Deleted in colorectal cancer Non-metastatic cell-4, protein Cadherin 1, epithelial Platelet/endothelial adhesion molecule-1 Matrix metalloproteinase 14 (membraneinsert) Transmembrane protease, serine 4 Fibroblast growth factor 2 (basic) Feline sarcoma oncogene homolog
34
Human tumor metasztásis gene-array-t (SuperArray HS 007-N) használtunk 5-5 poolozott laryngeális és hypopharyngeális tumor exőressziós mintázatának megállapítására. A cDNS biotinylated-16-dUTP volt jelölve és chemiluminescens probával. A 4 párhuzamos spot intenzitását Alpha Innotech Chemi Imager 8900 készülékkel mértük. A gének expressziós szintjét GAPDH housekeeping genhez hasonlítottuk. Jelek: nincs= fehér, van=fekete, down-regulált=zöld, over-expresszált=piros, eltérés >2 fold
Hasonló következtetésekre lehetett jutni a génpolimorfizmus vizsgálatokkal: a DNS repair gének XRCC1 és XRCC3 polimorfizmusainak igen eltérő gyakorisága észlelhető a laryngealis illetve hypopharyngealis rákokban (Tímár és mtsai 2005). Ezek a megfigyelések előre vetítették annak a lehetőségét, hogy a kétféle anatómiai lokalizációban a rákok progressziója eltérő genetikai mechanizmusokkal történhet. A progresszióban szerepet játszó genetikai újjlenyomat meghatározására vonatkozó vizsgálatok eredményét az RP5. beszámoló tartalmazza. 7.3.2.Progressziós protein chip tervezése. Témavezető: Németh Péter, PTE Immunológiai és Biotechnológiai Intézete A projekt első szakaszában több, korábbi monoklonális ellenanyagok fejlesztését és jellemzését fejeztük be, valamint az onkodiagnosztikai és onkológiai kutatási célokra történő alkalmazásuk felmérése történt meg, előkísérletek formájában. Ennek kapcsán az alábbi monoklonális ellenanyagok kerültek kiválasztásra: Tumor asszociált antigének hCG beta Insulin Peanut agglutinin antigen binding receptor Hepatitis B vírus X antigén
Növekedési faktorok TGF-alpha TNF-alpha Glukorotikoid receptor
Daganat stróma faktorok Aquaporin 1 Aquaporin 4
Az immunszerológiai és immunhisztokémiai technikák mellett – miként a diagnosztika más területein is – az onkodiagnosztikában és az onkológiai kutatásban előtérbe kerültek a multiparaméteres vizsgálatok és azok komplex bioinformatikai kiértékelése. Ezért indítottunk egy olyan fejlesztési irányt, ami a fluoreszcens mikrogyöngy technikát veszi alapul és a meglevő ellenanyagaink felhasználásával egy gyakorlati kit-fejlesztést tesz lehetővé. A projekt első szakaszának vizsgálati eredményeiből általánosságban azt a következtetést lehetett levonni, hogy diagnosztikus célokra a szolubilis (elsősorban a daganatos állapotokat valószínűsítő, ill. maguk a daganatok által expresszált, főként fehérje és glikoprotein természetű) antigén-mintázatok komplex analízise nemcsak technikailag egyszerűbb, hanem több információt is szolgáltathat, mint a daganatsejtek egyedi vizsgálata. Ugyanakkor, az alkalmazott kutatásban továbbra is kiemelt területet kell, hogy képviseljenek a celluláris szintű vizsgálatok. A jelen szakaszban a PTE-ÁOK Immunológiai és Biotechnológiai Intézete a megelőző beszámolóban bemutatott, monoklonális ellenanyag alapú onko-diagnosztikai célokra felhasználható, nagyrészt korábbi alapkutatási és K+F tevékenységéből származó immunreagensei közül a HBxAg specifikus ellenanyag családot választotta ki továbbfejlesztésre. Mivel rendelkezésre álltak olyan klónok, melyek nem mutattak egymás közt keresztreakciót, lehetőség mutatkozott egy immunszerológiai elven működő diagnosztikai rendszer kifejlesztésére. A választást a fejlesztéshez szükséges mennyiségben
35
folyamatosan rendelkezésre álló monoklonális ellenanyagokon kívül az is indokolta, hogy – szemben a „hagyományos” tumor-markerekkel – a HBxAg-t nem a daganatsejtek termelik, monitorozása a daganatos megbetegedés kialakulásának vizsgálata és így a megelőzés szempontjából is jelentőséggel bír. További előnyt jelentett az a tény, hogy ezeket az ellenanyagokat már immunhisztokémiában korábban kipróbáltuk formol-paraffinos anyagokon, így lehetőség nyílik a jövőben a sejt és szöveti szintű összehasonlító vizsgálatokra és ezzel párhuzamosan egy multifunkciós esszé kialakítására is. Az elvégzendő feladatok két fő irányt jelentettek: először a monoklonális ellenanyagok epitópspecificitásának meghatározása, majd a szerodiagnosztikai rendszer módszertani fejlesztése történt meg. A technikai fejlesztésnél külön igény volt, hogy az alkalmazandó módszertan alkalmas legyen - a hosszú távú célként megjelölt – multiparaméteres mérésekre, azaz az un. mikrogyöngy alapú „fehérje-chip” technikában történő felhasználásra. A beszámolási periódusban egy új technika – a filamentózus fág által kifejezett random peptid könyvtár - felhasználásával sikerült az egyik ellenanyagunk finom specificitását meghatározni. Ez a szekvencia (88-93) a HBxAg molekula pato-biológiai szempontokból kiemelt fontosságú régiójának (XAP2) felel meg. Az X fehérje 13-26 aminósav szekvenciáját tartalmazó szintetikus peptid antigén ellen előállított másik ellenanyag egy ettől távoli régiót jelöl, ami magyarázza, hogy sem keresztreakció, sem térbeni gátlás a két ellenanyag közt nem áll fenn. A szero-diagnosztikumként történő felhasználáshoz először a labordiagnosztikában általánosan elterjedt, un. „szendvics ELISA” rendszert fejlesztettük ki. A mérőmódszer technikai paramétereit optimalizáltuk, majd a tesztmérések után a mikogyöngy alapú technika kialakítását kezdtük meg. A beszámolási periódus végére – kollaborációban - megtörtént az ellenanyagok mikrogyöngyökhöz történő immobilizálása is. 7.3.2.1.Az anti-HBxAg monoklonális ellenanyag család klónjainak jellemzése és kiválasztása immunszerológiai technikához. 7.3.2.1.1. Előzmények A korábbi években kifejlesztett monoklonális anti-HbxAg ellenanyagaink a primér hepatocelluláris carcinona (PHC), a cholangiocelluláris carcinoma, ill. újabban más, nem máj eredetű daganatok kialakulásában is, (transzaktivációs mechanizmusok létrehozásán keresztül) az oki tényezőnek tartott, un. „X antigén” fehérje specifikus felismerésére képesek. Az X antigén (HBxAg) a hepatitis B vírus negyedik “open reading frame”-je által kódolt fehérje. Irodalmi adatokból ismert, hogy a HBxAg fehérjeszerkezetét tekintve jelentősen eltér az élő rendszereket felépítő fehérjéktől A rendkívül konzervatív, 17 kDa-os fehérjére jellemző a nagyfokú hidrofobicitás. A 154 aminosavból 80 (54%) hidrofób jellegű, amely biológiai rendszerekben egyedülálló fiziko-kémiai szerkezetet jelent, ezért vizsgálata mind az alap, mind a gyakorlati pato-biológia számára fontos. Az erősen hidrofób antigénekről általánosságban ismert, hogy „ragadósak”, azaz nem-specifikus molekuláris kölcsönhatásokat hoznak létre, gyakran maszkírozódnak, kevésbé hozzáférhetők az immunrendszer felismerő molekulái és sejtjei számára, az eltakart epitópok immunogenitása nagyfokban változó. Bár a HBxAg pato-biológiai szerepe még nem teljesen tisztázott, számos irodalmi adat utal a sajátos fiziko-kémiai fehérjeszerkezetből adódó hatásokra a hepatitis B vírusfertőzés után. Az X fehérje által kiváltott transzaktiváció protein-protein kölcsönhatások alapján valósul meg. Funkciója a sejtműködésben lokalizációjától függően kettős: a citoplazmában előfordulva a szekunder messenger rendszer szabályozásán, a magban előfordulva pedig a különböző promoterek működésén keresztül hat. Ennek az antigénnek a vizsgálata nemcsak egyedi fiziko-kémiai természete miatt szükséges, hanem számos irodalmi adat szerint a HBV genomot hordozó betegekben expresszálódó HBxAg-nek, illetve a vele szemben kialakult immunreaktivitásnak a betegség távoli prognózisa szempontjából alapvető jelentősége van. A HBxAg vizsgálata azért is rendívül fontos, mert a legújabb statisztikák a világon több mint
36
400 millió hepatitisz B vírussal fertőzöttet tartanak nyilván. A HBV fertőzésben, a krónikus hordozóknál az elsődleges májrák (PHC) kialakulásának a valószínűsége kétszázszorosára nő a fertőzésen át nem esettekhez viszonyítva. A hepatitis B vírusfertőzés minden közegészségügyi erőfeszítés ellenére továbbra is számottevő, elsősorban a harmadik világ országaiban a lakosság nagy hányadát érintő megbetegedés, ami hosszú távú hatásaiban is komoly közegészségügyi problémákat okoz. A migráció fokozódásával a jelenleg kevésbé érintett országokban is prognosztizálható, hogy mind a HBV fertőzések száma, mind a hosszabb távon jelentkező szövődmények, köztük a daganatos jellegű megbetegedések incidenciája növekedni fog. Hazánkban jelenleg nem az akut fertőzések száma és lefolyása jelent elsődlegesen gondot, hanem az idült és hordozóvá vált gyulladásos esetekben kialakuló májcirrhózis és azt követően az elsődleges májrák. Megfelelő diagnosztikus lehetőségek hiányában az sem tisztázott még, hogy a hepatitis B vírusfertőzésen átesettek közt az élet későbbi szakaszában jelentkező, nem máj eredetű daganatos megbetegedésekben kimutathatóe az X antigén jelenléte, és az esetleges kóroktani összefüggése. Ezért a kérdés vizsgálata nemcsak gyakorlati, hanem elméleti jelentőséggel is bír. A HBxAg elleni monoklonális ellenanyag család előállítása során a Szentgyörgyi Albert Orvostudományi Egyetem Mikrobiológiai Intézete (Prof. Molnár János és munkacsoportja) által kifejlesztett rekombináns rendszert használtuk (J.Biotechnology, 1997, 56., 81-88.), melyben a „Proten A” fúziós fehérjével ko-expresszáltatott X antigént alkalmaztuk az immunizásálra és a glutation-S-transzferáz (GST) fúziós fehérjével együtt kifejeződött formát a specifikus ellenanyagokat termelő klónok kiválogatására, ill. a további tesztelésekhez. Már a jelen projekt időtartama alatt előállítottunk egy új hibridóma vonalat is, az X antigén egy relatíve jó immunogenitású, felszíni epitópja ellen. A 13-26 aminósav szekvenciát tartalmazó szintetikus peptidet használtuk (KHL hordozóhoz kötve) az immunizálásra és a natív peptidet a tesztelésre. A két, eltérő epitópspecificitású ellenanyagunk segítségével immunhisztokémiai és immunszerológiai vizsgálatokat végeztünk. Immunhisztokémiával a hagyományosan használt „s” és „c” antigénekre specifikus, kereskedelmi forgalomból származó szérumokkal összehasonlítva a rekombináns antigén ellen előállított monoklonális ellenanyagainkat az X antigén kimutatásra jó gyakorlati alkalmazhatóságot, magas specificitást és szenzitivitást kaptunk (Pathol. Oncol. Res 2001; 7/3: 178-84.). Az immunhisztokémiai vizsgálatokat megismételtük a szintetikus antigén ellen kifejlesztett monoklonális ellenanyaggal elsődleges májrákból származó biopsziás minták metszetein és az előző tanulmányban észlelthez hasonló lokalizációjú jelöléseket kaptunk. Mivel a cél csak az ellenanyag tesztelése volt ebben a fázisban, részletes összehasonlító vizsgálatokat ezzel a monoklonális ellenanyaggal nem végeztünk. Az immunhisztokémiai előtanulmány alapján történt meg az ellenanyag klónok kiválasztása az immunszerológiai technikákban történő felhasználásra. Mivel az ELISA fejlesztésénél a rekombináns HBxAg molekula ellen előállított monoklonális ellenanyagok epitóp specificitása nem volt ismert, térképezést kezdtünk, különböző mikoanalitikai és molekuláris biológiai technikák felhasználásával a felismert struktúra pontos meghatározására. Az immunhisztokémiában legjobb eredményeket mutató klónt választottuk ki a térképezésre. Ez az ellenanyag intenzív pozitivitást mutatott nemcsak a PHC eseteken, hanem az akut és az idült hepatitiszesek mintáin is. 7.3.2.1.2. Epitóp meghatározás Kezdetben az anti-HBxAg monoklonális ellenanyag epitóp meghatározását számítógépes molekulamodellen végzett antigenitás predikció alapján kiválasztott szintetikus peptidekkel, majd limitált proteolízishez kapcsolt tömegspektrometriával kíséreltük meg. A tömegspektrometriai technika lényege, hogy először a rekombináns antigén natív elektroforézise után, gélben történő tripszines emésztést végeztünk, majd a peptid-
37
fragmentumokat a gélből kioldottuk és HPLC-vel szétválasztottuk. A HPLC-n elválasztott frakciókat ELISA rendszerben teszteltük és a pozitív frakciókat tömegspektrometriai módszerrel, nano-electrospray ionizálással (az un. „gold coated capillary” technikával) analizáltuk. Az antigén szerkezete és e módszerek elvi korlátai miatt sem a számítógépes antigén predikció, se a tömegspektrometrás analízis nem vezetett eredményre. A továbbiakban az epitóp meghatározását egy kilenc aminosavas, filamentózus fág felszínen megjelenített random peptid könyvtárral végeztük. A kapott eredmény megerősítésére a HBX protein 77.-142. aminosavig terjedő szakaszából három átfedő GST-fúziós peptidet expresszáltattunk E.coli-ban, melyeket aztán ELISA-val teszteltünk. A random peptid könyvtár screenelése A filamentózus fág pVIII-as köpenyfehérjén megjelenített kilenc aminosavas random peptid könyvtárat Alessandra Luzzago (IRBM, Roma) és munkacsoportja fejlesztette ki. A módszer optimalizálását monoklonális ellenanyagok epitóp specificitásának meghatározására elvégeztük (Czömpöly T. et al., 2003.: Biochemical and Biophysical Research Communications, 307. 791-796.) Először a fágok dúsítását végeztük el: egy petri csészét érzékenyítettünk anti-HBX antitesttel, majd blokkolás és mosás után 1010 fágot adtunk a rendszerhez, inkubáltuk, majd XL1-Blue E.coli-t fertőztünk velük. M13KO7 helper fággal történt felülfertőzés után a fágokkal egy második dúsítási ciklust kezdtünk és az XL1-Blue E.coli telepeket nitrocellulóz membránra emeltük. A membránokat blokkolás után inkubáltuk anti-HBX antitesttel (1 ug/ml), majd alkalikus-foszfatáz konjugált anti-egér IgG másodlagos antitesttel. Az előhívás után negyven pozitív klónt választottunk ki, amelyeket ELISA-val tovább teszteltünk, oly módon, hogy a fágokat kötöttük ki a lemezre. Az ELISA alapján tíz klónból DNS-t izoláltunk amit egy ABI Prism 310-es készüléken megszekvenáltunk. A random peptid könyvtárból kiválasztott klónok szekvenálása és egymással való összevetése alapján a „LPxxLH” konszenzus szekvenciát kaptuk. Ez a szekvencia a HBX protein 88.-93. aminosaváig terjedő szakaszával (LPKVLH) feleltethető meg. A módszer kontrollját a rekombináns HBx mutánsokkal végeztük: a három átfedő rekombináns GST fúziós peptid közül az anti-HBX antitest ELISA rendszerben az 1. terméket felismerte, míg a másik két peptiddel nem adott reakciót. Így az ellenanyag epitópját a HBX protein 77.-95. aminosaváig terjedő szakaszára tudtuk lokalizálni. Az epitópmeghatározást, az NKFP támogatás feltüntetésével nemzetközi folyóiratban közöltük: Pál J., Czömpöly T., Nyárády Z., Marczinovits I., Janáky T., Kele Z., Felici F., Nemeth P. (2003): Molecular Immunology, 40., 214-246. 7.3.2.2. Az anti-HBxAg monoklonális ellenanyag párok felhasználása a metodikai fejlesztésekben 7.3.2.2.1.ELISA alapú diagnosztikus panel A fentiekben ismertetett ellenanyag párokat „szendvics ELISA” kialakításhoz használtuk fel. „Kifogó ellenanyagként” a 88-93 szekvencia specificitású (a rekombináns HBxAg ellen előállíott) monoklonális ellenanyag, a második antitest pedig a 13-26 aminósav szekvenciát tartalmazó szintetikus antigén elleni klón bizonyult alkalmasnak. Ezt az ellenanyagot biotinnal jelöltük és az esszé előhívását streptavidin-peroxidáz komplexszel végeztük. Az optimalizálást normál szérumokhoz adott, különböző koncentrációjú, rekombináns antigén (GST-Xag) felismerésének un. „szendvics ELISA” rendszerben történő mérésével végeztük. Az esszé érzékenységének beállítása is ezzel a módszerrel történt. Az általunk elért optimális érzékenységi határ az 1-4 ng/ml tartományban volt, ami már alkalmas humán szérumok vizsgálatára. Az intézet szérumbankjából, ill. külső intézményekkel végzett kollaborációból származó B és C hepatitises betegek, valamint egészséges, szeronegatív egyének vérmintáinak tesztelését kezdtük meg. Szérumbankunkból random kiválasztott 25
38
(szeronegatív) mintán egyértelmű negatív reakciót kaptunk (a mérések során az OD490 0.01 alatt volt), a 13 akut, 24 krónikus hepatitiszes minta jól értékelhető mérési eredményeket adott, ill. a 12 hepatitisz B vírushordozóból származó minták is egyértelműen értékelhetők voltak. A módszer kvantifikálását a GST-Xag fúziós fehérje ismert mennyiségeire végeztük. A mérési eredményeket a 8. táblázatban tüntettük fel. Mivel a bizonyítottan hepatitisz B vírus fertőzést követen, az idült májgyulladás talaján kialakult PHC hazai előfordulása ritka, a következő periódusban nemzetközi kollaborációt keresünk a HBxAg expressziós kinetikájának tanulmányozására a daganatos megbetegedés folyamatában. 7.3.2.2.2. Mikrogyöngy alapú diagnosztikus panel fejlesztésének előkészítése Mivel az általunk kidolgozott ELISA alkalmas a vérszérumok jól reprodukálható analízisére, célszerűnek tűnt a sok-paraméteres, „fehérje-chip” jellegű, az elmúlt években megjelent, áramlási citometriában felhasználható, un. mikrogyöngy esszé fejlesztésére. Az eljárás lényege az, hogy különböző nagyságú, ill. színű mikrogyöngyökre kötjük az „elfogó ellenanyagot”, amit a vizsgálandó mintába teszünk. Ez az antitest kapcsolatba lép a keresett antigénnel, majd az antigén egy másik epitópjára specifikus, az áramlási citométerben jól analizálható fluoreszkáló festékkel jelölt, második ellenanyaggal tesszük kimutathatóvá az immunkomplexet. Mivel a mikrogyöngyök méretük vagy színük alapján jól elkülöníthetők egymástól, valamint a második ellenanyag fluoreszcenciája is jól mérhető, ugyanabban a mintában, tetszőlegesen nagy számú paraméter párhuzamos mérésére, és, megfelelő bioinformatikai rendszerben mennyiségi kiértékelésére is lehetőségünk van. Ez (a vázlatosan bemutatott) technika nemcsak immunológiai alapú monitorozásra alkalmas, hanem nukleinsav próbákkal kombinálva lehetővé teszi a gén szinten kimutatható eltérések expressziós analízisét is. A mikrogyöngy rendszerben kifejlesztett HBxAg meghatározás ideális modell lehet a bonyolultabb onkogén expressziók vizsgálatának megtervezéséhez. A fejlesztés jelenlegi szakaszában – kollaborációban a Beckton Dickinson (USA) céggel, ill. a Soft Flow Hungary szakembereivel megtörtént az anti-HBxAg monoklonális ellenanyagok mikrogyöngyökhöz történő immobilizációja, ill. az érzékenyített hordozók minőségellenőrzése. Az ELISA vizsgálatokhoz használt antigén standardok, ill. szérum minták felhasználásával a módszertani fejlesztés következő lépcsőjéhez a feltételek adottak. A részfeladat teljesítését összefoglalva elmondhatjuk, hogy az anti-HBxAg monoklonális ellenanyag család gyakorlati, laboratóriumi onko-diagnosztikai felhasználási területei tisztázottak, a kapcsolódó alapkutatási feladatokat elvégeztük, a K+F jellegű munka nagy része a beszámolási időszakra megvalósult, a további munkák a pályázatban megfogalmazott célkitűzésekkel összhangban folynak. A már jelenleg is hasznosítható gyakorlati felhasználás területét a primér hepatocelluláris carcinóma diagnosztikája, ill. laboratóriumi monitorozása jelenti.
39
4./ Preklinikai vizsgálatok új innovatív antimetasztatikus terápiás eljárások kidolgozására • 4.1./ Antiaggregációs terápia Korábbi irodalmi és saját vizsgálataink alapján ismert, hogy emberi melanóma domináló funkcionális integrin molekulája az αvβ3 integrin, bár jelentős szerepe lehet az ektópiás αIIbβ3 integrinnek is. Ugyanakkor a melanómasejt-thrombocyta kölcsönhatásban mindkét integrin jelentős szerepet játszik. Megvizsgáltuk, hogy a melanómasejt-thrombocita kölcsönhatás in vivo történő felfüggesztése befolyásolja-e a tumorsejtek tüdőbe való eljutását, az áttétképzést. Erre a célra a hazánkban is elérhető humanizált anti-humán αvβ3-at és αIIbβ3-at felismerő RheoPro humanizált antitestet használtuk, amellyel SCID egereket kezeltünk. Megállapítottuk, hogy az antitest kezelés szignifikánsan csökkenti a tüdőbe történő áttétképződést az általunk alkalmazott HT168 melanóma vonal esetében.
Median Lung weight
39. ábra. Humán rekombináns anti-aIIbb3/avb3 antitest (RheoPro) hatása humán melanóma áttétképzésére SCID egérben. Kontroll RheoPro
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Control
ReoPro
Kezelés: 2.5 µg/ml hetente (4 alkalom). Az adatok a tüdő súlyát jelölik. A 25 és 250 µg/ml dózisok hasonló hatást mutattak.
Ipari projekt keretében az alacsony mólsúlyú heparin (Fragmin) hatását tanulmányozzuk emberi daganatok áttétképzésére. Megállapítottuk, hogy a Fragmin nem befolyásolja emberi daganatok (melanóma, vastagbélrák, laphámrák) növekedését illetve apoptózisát. Ugyanakkor állatmodellben ismételt kisérletekben a Fragmin jelentősen gátolta emberi melanóma tüdőbe történő áttétképzését, miközben nem észleltünk változást a kisérleti állatok véralvadásában. Jelenleg számos új angiogenezis-gátló és egyben antimetasztatikus hatású vegyület tesztelése folyik világszerte. Munkacsoportunk ezen vegyületek új családját, a bázikus peptideket állította elő és igazolta azok antiangiogentikus és antimetasztatikus hatásait (Fazekas et al.2001,2002). 4.1.1.Thrombocyta αIIbβ β 3 –specifikus antitest terápia lehetősége melanómában Korábbi vizsgálatainkban bemutattuk, hogy b3 integrin-ellenes antitest kezeléssel (RheoPro) emberi melanóma tüdő-áttétképzése gátolható volt. Miután az antitest nem tesz különbséget a thrombocyta és daganatsejt aIIbb3 illetve az aIIbb3 illetve avb3 integrinek között, ezek az adatok csak felvetették annak lehetőségét, hogy a hatásért esetleg a melanóma sejtfelszini aIIbb3 is felelős lehet (Trikha et al.2002). Hogy a kérdést tovább vizsgáljuk B16a melanóma sejteket kezeltünk anti-aktív αIIbβ3 integrin antitesttel (PAC-1) 24-28 órára, ahol kontrollként IgM illetve a fiziológiás ligand, a fibrinogén szolgált. A kísérlet során meghatároztuk a mitózis-, apoptózis rátát és a sejtszámot. 24 órás antitestkezelés (2-20 µg/ml) nem okozott szignifikáns apoptózis szám emelkedést a kezelt sejtekben. Ugyanakkor 48 órára
40
a mitózis-szám szignifikánsan (50%-kal) csökkent és a sejtproliferáció is drámaian lecsökkent. 40. ábra. PAC-1 antitest kezelés hatása B16a melanóma proliferációjára in vitro. A/ Sejtpoliferáció 48 óra B/ Mitózis szám 24 óra FBG PAC-1
2.5
2.0
1.5
1.0
0 0
0.1 0.2
1 2
10 FBG 20 PAC-1
15
number of mitosis/103 cells
cell density
3.0
10
5
0
concentration (µ µg/ml)
CTR
PAC-1
Ez a sejtproliferáció-gátlás lehetséges következménye lenne a jelátviteli kísérletekben PAC-1 hatásra bekövetkező foszfotirozin foszfatáz aktiválódásnak és következményes gátolt tirozinszignál-aktivitásnak. 41. ábra. PAC-1 kezelés hatása a tirozin foszforiláció dinamikájára B16 sejtekben
% positive cells
75
50
25
0 0
5
10
15
20
25
30
m in
B16a sejteket in vitro inkubáltuk PAC1 antitesttel és a jelzett időpontokban mintát vettünk, melyekben a foszforilált tirozin-os fehérjéket immuncitokémiával jelöltük és a + sejtek százalékát flow cytométerben mértük.
Ezek a megfigyelések kisértetiesen hasonlítanak azon jelenségekhez, amit manapság több daganatféleségben leírtak. Az c-erbB2 amplifikált emlőrákokban és c-erbB1-et fokozottan kifejező laphámrákokban ezek a daganatsejtek a két tirozin-kináz un. konstitutív aktivitásával jellemzhetők és a receptor-ellenes un. gátló antitestekkel (extracelluláris doménspecifikusakkal) a daganatsejtek proliferációját lehet gátolni és a daganatszövet növekedését fékezni, miközben a jelátviteli pálya kikapcsolódik. Melanóma-modell rendszerünkben az ektópiás aIIbb3 integrin konstitutívan aktivált állapotban van, amit a FAK konsitutív tirozinfoszforilációja igazol (Rásó 2001). Ezt a folyamatot a PAC-1 antitest fel tudja függeszteni (eddig még nem pontosan ismert módon), ami nem egyszerűen a ligand-kötő domén lefedése lehet, mert a fiziológiás ligand, a fibrinogén kezelés nem képes a sejtproliferációt leállítani a B16 sejtekben. Mindezek a kisérleti eredmények felvetették annak a lehetőségét, hogy antiaIIbb3 integrin elleni antitest-kezeléssel ilyen melanómák progressziója gátolható lenne.
41
7.4.1.2. Antiaggregációs terápia: Heparinok A daganatok haematogen disszeminációja során a keringésbe jutott daganatsejteket különböző mechanikai és immuneffektor hatások érik, de különösen azok a tumorsejtek képesek a túlélésre, amelyek thrombocytákkal aggregálódnak. Másrészt a tumorsejtek által termelt prokoaguláns anyagok hatására fibrin-védőháló képződik a daganat körül, amely védelmet nyújt az NK sejtek támadásával szemben és növeli a szervi áttétképzés esélyét is. Az alacsony molekulasúlyú heparinokat (LMWH) széles körben alkalmazzák thromboprofilaxisra. Világirodalmi adatok szerint a heparinokkal történő antikoaguláns terápiának van egy kedvező „mellékhatása”: késlelteti a daganatos progressziót és megnöveli a daganatos betegek túlélését. Ugyanakkor a K-vitamin antagonistáknak (pl.:warfarin) nincs ehhez hasonló hatása. Célul tűztük ki, hogy a heparinok (különösen az LMWH) - in vivo kísérleti rendszerekben már korábban igazolt – antimetasztatikus hatásának mechanizmusát tisztázzuk és megvizsgáljuk a véralvadási rendszerben játszott szerepét. Kísérleteink során vizes oldatban lévő Fragmint használtunk, amelynek hatását nem frakcionált heparinnal (UFH, Richter Gedeon Rt., Budapest), hirudinnal (Refludan, Hoechst Marion Roussel GmbH, Frankfurt am Main, Germany) és Fibrinopeptid A-val (FPA, Sigma) hasonlítottuk össze. Negatív kontrollként fiziológiás sóoldatot használtunk. Fragmin hatásának dinamikája humán melanoma sejtek tüdőkolonizációs képességére SCID egerekben Az állatokat az oltást megelőző napon és az oltás előtt 10 perccel i.p. kezeltük a humán dózissal ekvivalens (200 IU/tskg) koncentrációjú Fragminnal és UFH-val, kontrollként fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk. Csoportonként 3-3 nőstény SCID egeret oltottunk HT-168 M1 sejtekkel (106/állat i.v.) és a 0., 1., 4. és 6. órában leöltük őket. A tüdőbe került daganatsejteket immunhisztokémiai feldolgozás során melanomaspecifikus HMB45/MART-1 markerekkel jelöltük meg, majd fénymikroszkóp alatt leszámoltuk az 1 cm2-re eső tumorsejtek átlagos számát. A tüdőbe került daganatsejtek száma heparinizálás hatására már a 0. órában szignifikánsan csökken a kontrollhoz képest. A Fragminnak ez a hatása jóval elhúzódóbb, hiszen az UFH-val szemben a Fragmin még a 6. órában is csökkentette az extravazációt. 42. ábra. 43. ábra. 106 µ m2-nyi tüdõterületre jutó melanoma sejtek átlagos száma %-ban
34 32 106 µm2-nyi tüdõterületre jutó melanoma sejtek száma (átlag)
30 28 26 Kontroll UFH LMWH
24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0
1
2
3
4
5
A tumorsejt beadásától eltelt idõ (óra)
6
100
Kontroll UFH
90
Fragmin 80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.0
1.0
4.0
6.0
A tumorsejt beadásától eltelt idõ (óra)
Extravazált melanóma sejtek denzitása (43. ábra) és relatív aránya (44. ábra) a tüdőben heparinok hatására. A tumorsejteket melanoma antigén expresszió alapján mutattuk ki és számoltuk le.
Heparinok és más antikoagulánsok hatásának összehasonlítása humán melanoma sejtek áttétképzésére SCID egerekben Először Fragmint (200 IU/tskg), UFH-t (200 IU/tskg), hirudint (1-3 mg/tskg) és fibrinopeptid A-t (3,8 µg/állat) adtunk i.p., kontrollként fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk. A kísérlet során
42
csoportonként 10-10 nőstény SCID egeret oltottunk HT-168 M1 tumorsejttel (106/állat i.v.) úgy, hogy az oltást megelőző napon, az oltás napján és még további 3 napig kezeltük az állatokat a fenti koncentrációkban. Ezután az állatokat 7 hétig tartottuk el - állapotukat folyamatosan nyomon követve-, majd sztereomikroszkóp alatt meghatároztuk a kialakult tüdőkolóniák számát az egyes csoportokban. A fixált mintákat szövettanilag is feldolgoztuk. Az előző kísérleteinkkel egybehangzóan a humán dózissal ekvivalens Fragmin és UFH kezelések szignifikánsan csökkentették a kialakult tüdőáttétek számát, míg más antikoagulánsok (hirudin és FPA) ezt a hatást nem tudták utánozni. (26. ábra). Még élesebben látszott ez a különbség, ha az áttétes állatok incidenciáját vizsgáltuk, ami a kontroll csoportban 100% volt és Fragmin hatására 56%-ra csökkent, UFH esetében 80% volt, míg hirudin illetve FPA kezelt állatokban 90%-os volt. 44. ábra. 45. ábra 25
metasztázis incidencia (met/állatszám,%)
Tüdõkolóniák száma
100 20 15 10 5 0
Kontroll Frag40 UFH40
Hir3
Hir1
75
50
25
0
FPA100
CTR Fragmin UFH
Hir3
Hir1
FPA
Alvadás-modulátorok hatása humán melanoma tüdő kolonizációjára SCID egerekben.
105 tumorsejtet oltottunk nőstény SCID egerek lépébe (10-10 állat/dózis), majd az oltást követő 8. naptól naponta kezeltük az állatokat i.p. Fragminnal (20-200 IU/tskg), UFH-val (20200 IU/tskg) és hirudinnal (3 mg/tskg) 5-ször egy héten, két nap szünettel 2 héten keresztül (negatív kontroll ebben az esetben is fiziológiás sóoldat volt). Az állatokat az oltást követő 4. hét végén altattuk el és sztereomikroszkóp alatt meghatároztuk a májban kialakult makroszkópos áttéteket. Eredményeinket értékelve megállapítható, hogy (korábbi eredményeikkel egybehangzóan) a Fragmin már a humán dózis 1/10-énél hatékonyan gátolja a májáttétek keletkezését, míg az UFH ezt a hatást csak 10-szeres dózisnál érte el. A hirudin kezelésnek semmiféle áttétszám csökkentő hatása nem volt. 46. ábra. Heparinok hatása a májáttétképzésre SCID egerekben. UFH 30
LMWH
28
Hirudin
26 24
Májáttétek száma (átlag)
22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
0.0
20.0
200.0
IU/tskg
Fragmin antimetasztatikus hatásának lehetséges mechanizmusai 1.Antikoagulánsok hatása különböző alvadási paraméterekre A vérvétel előtt 24 illetve 1 órával csoportonként 3-3- nőstény SCID egeret kezeltünk i.p. Fragminnal (20-200 IU/tskg), UFH-val (20-200 IU/tskg) és hirudinnal (1-3 mg/tskg). Kontrollként fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk. A vért 3.8%-os citrát oldatba vettük le (vér:citrát arány=10:1) és centrifugálás után SYSMEX CA 1500 koagulométerben határoztuk
43
meg az aktivált parciális thromboplasztin időt (APTT), a thrombin időt (TT), prothrombint, INR-t és a fibrinogén szintet. 47. ábra. Heparinok hatása a protrombin %-ra SCID egerekben. 125
100
%
75
50
25
0
kontroll
UFH20
UFH200
LMWH20 LMWH200
Hir1
Hir3
Eredményeinket kiértékelve azt találtuk, hogy a fent említett alvadási paramétereket mindhárom antikoaguláns szer közel azonos módon befolyásolja (illetve az adott koncentrációban nem befolyásolja), tehát a Fragmin in vivo észlelt antimetasztatikus hatása nem a véralvadás/vérzés egyensúlyának felborulása útján valósul meg. 2., Humán melanoma sejtek adhéziós képességének vizsgálata in vitro 96 lyukú plate-ket fibrinogénnel, fibronektinnel, lamininnel, Matrigellel és kollagén I-III-mal vontunk be. 2x104/well HT-168 M1 melanoma sejtet 200 µl Se- RPMI-ben 0.1-1-10 IU/ml Fragminnal és UFH-val illetve 5-15 µg/ml hirudinnal kezeltünk egy órán át 37°C-on. A kitapadt sejteket SRB módszerrel festettük meg, majd a sejtdenzitást ELISA módszerrel határoztuk meg. A kísérlet többszöri megismétlése után sem a Fragmin, sem az UFH, sem a hirudin nem csökkentette a humán melanoma sejtek matrix adhéziós képességét. 48. ábra. Heparinok hatása humán melanoma sejtek fibrinogén adherenciájára in vitro. 150 140 130
UFH LMWH
120 110
Hirudin
kontroll %
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0.0
0.1
1.0
10.0
IU/ml
3., Humán melanoma sejtek migrációjának vizsgálata in vitro 96 lyukú polikarbonát anyagú migrációs membránra (Neuro Probe Inc.,USA) 2x104 HT-168 M1 melanoma sejtet vittünk fel wellenként 20 µl Se- RPMI-ben. A daganatsejteket 1 és 10 IU/ml Fragminnal és UFH-val kezeltük, kontrollként Se- RPMI-t használtunk. Kemoattraktánsként 1%-os FCS-t alkalmaztunk. 20 órán át 37°C-on migráltattuk a sejteket, majd 1%-os toluidinkék festés után fénymikroszkóp alatt határoztuk meg az átmigrált tumorsejtek átlagos számát. A fent alkalmazott koncentrációkban mind a Fragminnak, mind az UFH-nak igen jelentős migráció gátló hatása van. 44
49. ábra. Heparinok hatása humán melanoma sejtek migrációjára in vitro. 60 55
Migrált sejtek száma (átlag)
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
0.0
k
1.0 U FH 1
2.0 U FH 10
3.0 LMW H1
4.0 LMW H 10 IU /ml
Korábban bemutattuk, hogy az LMWH specifikus antimetasztatikus hatással bír. Egyes szerzők heparin ilyen hatásának vizsgálata során az endothel sejtekhez történő daganatsejt kitapadást és annak selectin mediált mechanizmusát tételezték fel. Ennek megfelelően mi is megvizsgáltuk humán melanóma sejtek és endothelsejtek felhasználásával, hogy az LMWH befolyásolja e az adhéziót. 50. ábra. M1 humán melanóma sejtek kitapadása emberi endotélsejt réteghez heparin és LMWH (Fragmin) jelenlétében in vitro (4 óra). 30
Control
number of adherent cells per field (mean ± SEM)
UFH LMWH
25
20
*p<0.05
*
15
*
10
5
0
Control
UFH
LMWH
45
Vizsgálataink szerint a pozitív kontrollként használt heparinhoz hasonlóan a Fragminnak (LMWH) is melanóma-endotél adhéziót gátló hatása volt, tehát ez lehet az egyik lehetséges magyarázat a korábban megfigyelt tüdőkolonizáció gátló hatásnak. További kérdés volt, hogy a keringésbe juttatott melanóma sejtek hová kerülnek LMWH hatása alatt. Korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy a célszervbe (tüdő) sokkal kevesebb daganatsejt jut el, más szervben pedig áttét nem keletkezik. Ezért az LMWH-val kezelt állatok véréből humán melanóma kimutatást végeztünk érzékeny q-PCR módszerrel amikor is a humán WT1 gént használtuk markerként. 12. ábra. Heparin és Fragmin (LMWH) előkezelés hatása a keringésben lévő melanóma sejtek számára SCID egérben 5
Control UHFFH
4
LMWHH
3 2 1 0 5 min
60 min
Az állatokat a daganatsejtek i.v. bejuttaása előtt i.p. kezeltük humán ekvivalens dózis heparinnal illetve Fragminnal (200IU/kg). A bemutatott időpontokban vért vettünk, melynek sejtes elemeiből RNSt izoláltunk. Az adatok β-actinra normalizált relatív mRNS expressziót jelentenek és 3 mérés átlagai. Megállapítottuk, hogy a daganatsejtek keringésbe juttatása után már 5 perccel jelentősen több daganatsejt reked a vérpályában LMWH kezelés alatt, mint anélkül és ez a hatás 60 percig áll fenn. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az LMWH kezelés egyrészt gátolja a melanóma sejtek endotélsejtekhez történő kitapadását a célszervben, emiatt a daganatsejtek tovább maradnak a keringésben és emiatt valószínűleg nagyobb eséllyel pusztulnak el (mivel más szervekben egyáltalán nem és a célszervben is csökkent mértékben képesek áttétet képezni). A célszervbe eljutott kevesebb daganatsejt pedig migrációjuk gátolt volta miatt nagyobb eséllyel pusztul el vagy lesz képtelen invázióra (korábbi kisérletek). Következtetések A Fragminnak és az UFH-nak specifikus áttétképzést gátló hatása van, amely a klinikailag használt dózistartományban jelentkezik. Kísérleteink során vérzéses szövődményünk nem volt. Ezen tény valamint a koagulometriai vizsgálatok eredményei alapján kimondható, hogy az antimetasztatikus hatásban nem véralvadás/vérzés egyensúlyának felborulása játszik szerepet. Ezt az a tény is alátámasztja, hogy sem a hirudin sem az FPA nem váltott ki a heparinokhoz hasonló hatást. Az antimetasztatikus hatás mechanizmusa még nem ismert, de előző kísérleteinkből az már nyilvánvaló, hogy nem antiproliferatív hatásról van szó, hanem valószínüleg specifikus migráció-gátló hatásról, ami a daganatsejtek áttéti szövetbe történő extravazációjakor már jelentkezik. Fenti adataink alapján a Fragmin áttétes melanomás betegben történő klinikai alkalmazásának protokollja kialakítható és tesztelhető, az erre vonatkozó lépéseket megtettük.
46
7.4.2. Az endocrin terápia lehetőségeinek kiterjesztése un. nem-hormonérzékeny daganatokra 2-metoxiösztradiol (2ME) hatása humán melanóma xenograftokra Klinikai és kísérleti megfigyelésekből adódott a feltételezés, hogy a melanóma is az úgynevezett hormondependens tumorok közé tartozhat. Vizsgálataink tárgya a 2metoxiösztradiol (2ME2), az ösztrogén májban keletkező végmetabolitja. Fiziológiás funkciója nem ismert, affinitása az ösztrogénreceptorokhoz nagyon alacsony, hatását nem ezeken keresztül fejti ki. In vitro és in vivo angiogenezis-gátló és tumorszuppresszor hatását más tumorok esetén már leírták.
A2058
60 50
HT168
40
HT168M1 HT199
30 20
50 depol. mitok. membrán (sejtek %-a)
apoptotikus sejtek (%)
Humán melanóma sejtvonalakon végzett 3 napos kezelés 1 ill. 0,5 µM koncentrációjú 2ME2-vel átlagosan 66 ill. 36%-os proliferációgátlást eredményezett, míg a normális humán fibroblasztok nem voltak érzékenyek. 24 órás, 5 ill. 1 µM koncentrációjú 2ME kezelést követően a sejtciklus G2/M fázisában akkumulálódott sejtek aránya átlagosan 12- ill. 3szorosára, az apoptotikus sejtek aránya pedig 15- ill. 7-szeresére nőtt, míg az ösztrogénnek nem volt ilyen hatása. A mitokondriumok melanoma-apoptózisban játszott szerepére membránjuk depolarizációja utalt, mely 24 órás, 5 µM koncentrációjú kezelés után a vizsgált melanómasejtek 40%-ában megfigyelhető volt. 52. ábra. 2ME apoptosis indukciója in vitro 53. ábra. 2ME hatása mitochondriumokra
WM983A
10
WM983B
0 0 0,5 1,0 5,0 2ME2 koncentráció (µM)
40 30
HT168-M1 HT199 WM35
20 10 0 K
1,0 2ME2 koncentráció (µM)
A mikrotubulusokra gyakorolt hatást immuncitokémiai módszerrel, α-tubulin kimutatásával vizsgáltuk. A 2ME2-kezelés hasonló mikrotubulus-aggregációt okozott, mint az ismert tubulus-stabilizáló Taxol. In vivo májmetasztázis-modellben vizsgáltuk a 2ME hatását humán melanóma áttétképző képességére. Hím egerekben 10 napig tartó 7,5 mg/ttkg dózisú 2ME2-kezelés 20%-kal, míg a 75 mg/ttkg dózisú több mint 50%-kal csökkentette az áttétek számát. Ugyanakkor csökkent a primer léptumor tömege is. A 2ME kezelés in vivo körülmények között is jelentős melanoma-apoptosis fokozódást okozott morfometriai vizsgálataink szerint 54. ábra. 2ME antimetasztatikus hatása 55. ábra. 2ME apoptosis-indukciója in vivo apoptotikus sejtek száma/mm2
májáttétek száma
80 60 40 20 0
40 30 20 10 0 K
K
7,5 mg/ttkg 75,0 mg/ttkg 2ME2 2ME2
47
7,5 mg/ttkg 2ME2
75,0 mg/ttkg 2ME2
5,0
Fejnyaki daganatok A kutatási project záró évében tovább folytattuk a fejnyaki daganatok hormonreceptor státuszának vizsgálatát. A hormonreceptor státuszt két alternatív módszerrel határoztuk meg, egyrészt fagyasztott mintában immuncytokémiai módszerrel vizsgáltuk az ösztrogén receptor (ER)a, ERb és a progeszteron receptor (PgR) fehérje tumorban történő jelenlétét fluoreszcens mikroszkópiával, majd a pozitív minták esetében adatainkat RT-PCR módszerrel is ellenőriztük és limitált esetben a kapott terméket meg is szekvenáltuk. Összesen 67 esetet vizsgáltunk ilyen kritériumok szerint, 24 szájüregi rákot és 43 glottikus tumort, az esetek döntő többsége férfi volt és a tumorok valamennyien laphámrákok. A fejnyaki daganatok 58.2%-a expresszált valamilyen sex hormon receptort és ebből a szempontból nem volt különbség a kétféle lokalizáció között. Jellemzően gyakoribb volt a többes hormonreceptor expresszió mint a szoliter és ezek között a leggyakoribb az ERa+PgR genotípus volt a leggyakoribb amit az ERa/b+PgR követett. Klinikai szempontból a funkcionális ER expressziónak lehet jelentősége az esetleges hormonterápia szempontjából, ezért külön is megvizsgáltuk az ER+PgR fenotípusú kombinációt, mert a PgR megjelenése ER mellett indirekt bizonyíték az ER funkcionális expressziójára, mivel a PgR ER transzkripciós kontroll alatt áll. A fejnyaki daganatok 41.8%-ban találtunk un. funkcionális ER expressziót, ami igen magas arány még az emlőrákokhoz képest is. 15. táblázat. Fejnyaki daganatok sex hormon receptor státusa (n=67) ERa
ERb
ERa/b
PgR
ERaPgR
ERb+PgR ERa/b+PgR
Összes 28/67 0/67 (n=67) szájüregi rák 10/24 0/24 (n=24) Glottikus rák 18/43 0/43 (n=43)
1/67
5/67
5/67
15/67
4/67
9/67
0/24
4/24
0/24
6/24
1/24
3/24
1/43
1/43
5/43
9/43
3/43
6/43
neg
A receptor pozitivitást immuncytokémiával és RT-PCR-ral határoztuk meg.
A 67 eset közül 48 esetében már rendelkezésre állt a 3 éves túlélési adat. A 48 daganat között 15 szájüregi rák volt, azonban ezek között nem volt kiegyenlített arányban receptor negatív tumor ezért a szájüregi rákok esetében nem lehetett statisztikai elemzést végezni, csak a glottikus tumorok esetében. A 33 glottikus tumoros beteg 3 éves túlélésének elemzése azt mutatta, hogy az ER negatív daganatos betegek túlélése lényegesen jobb mint a receptor pozitív eseteké (78.9% versus 42.8%). Hasonló eredményt kaptunk, amikor az un. funkcionális ER pozitivitás szempontjából vizsgáltuk a túlélést (ER+PgR+): mert a negatív csoportban 75% volt míg a pozitívban csak 46.2%. 56. ábra. Ösztrogén receptor státusz hatása glottikus rákok túlélésére survival fraction (%)
100
ER+ (n=14) ER- (n=19)
75
50
25
0 0
12
24
month 47
36
Ezek a vizsgálatok elsőként igazolták molekuláris szinten, hogy a fejnyaki rákokban autentikus és funkcionális hormonreceptorok expresszálódnak. Előzetes adataink a vizsgált beteganyag mintegy felén azt mutatják, hogy az ösztrogén receptor expressziónak a túlélés szempontjából komoly prognosztikus ereje van. Ezen két megfigyelésünk alapján azt állítjuk, hogy a fejnyaki daganatok (de legalább is a glottikus tumorok) nagy valószínüséggel hormondependens daganatok és szelektív ösztrogén receptor antagonista gyógyszerekkel valószínüleg kezelni lehetne. A hipotézist klinikai vizsgálatban kellene tesztelni. Humán Melanoma Az irodalomban régóta folyik a vita, hogy humán melanóma hormonérzékeny daganat és hogy expresszálhat ösztrogén receptort. Korábbi vizsgálatainkban azt találtuk, hogy emberi melanóma vonalak kisérleti májáttétképzése jelentősen függött a host nemétől: a nóstány állatokban sokkal kevésbé volt hatékony a folyamat. Ez felvetette azt, hogy a melanómákban ösztrogén receptor lenne és ez volna felelős az eltérésért. Jelen kutatási periódusban az un. glukokortikoid receptor család expresszióját térképeztük fel az általunk használt humán melanóma sejtvonal-panelen. A vizsgálatokat első lépésben RTPCR módszerrel végeztük és az ösztrogén receptorokat (ERa és b), a progeszteron receptort (PgR), az androgén receptort (AR) valamint a glukokortikoid receptort (GCR1) határoztuk meg. 57. ábra. Humán melanóma glukokortikoid receptor expressziós analízise RT-PCR módszerrel (n=15) ERα
1. 2. 3. 4. ERβ
5. 6.
3. 4. 5. 6.
7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
1. PGR
2.
7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
1. AR
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 1.marker, 2.+kontroll, 3. 8F3, 4. 9B4, 5.28/01tumor, 6. M29, 7. 35/01 tumor, 8. 32/01 tumor, 9. A2058, 10. WM983A, 11.6E5, 12. 3.1, 13. WM983B, 14. HT168, 15. M1, 16. WM35, 17. HT199, 18. negativ GCR
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 1. marker, 2. M1, 3. HT168, 4. A2058, 5. HT199, 6. M35, 7. M24, 8. WM983A, 9. WM983B, 10. tumor, 11.1919H, 12.1919L, 13. + kontroll, 14. negativ
48
Eredményeink szerint a vizsgált humán melanóma vonalakban és a néhány tumorszövetben autentikus ER , PgR, AR és GCR expressziót lehet kimutatni. Feltűnő, hogy az ER izoformák a PgR és az AR tekintetében számos un. splice variáns is kimutatható, bár gyakoribb a vad típusú génforma. Amennyiben humán melanóma vonalaink megfelelő sex hormon receptort expresszálnak, felmerül annak lehetősége, hogy ezen hormonok befolyásolnák az áttétképzést. Ebből a célból két sejtvonal esetében un. arteriális kolonizációs tesztet végeztünk SCID egérben. A két sejtvonal elsősorban a májba képezett áttéteket, így vizsgálatainkat ezen modell esetében folytattuk. A kísérleteket a tumorsejtek beoltását megelőzően orchiectomián ill. ovariectomián átesett hím ill. nőstény, valamint kontroll hím és nőstény egereken végeztük, két, korábbi vizsgálatokban erős májpreferenciát mutató melanoma sejtvonalon. Mindkét sejtvonal esetében jelentős különbség mutatkozott a szívbeoltást követően létrejött májáttétek számában a kontroll hím és nőstény állatok között, az előbbiek javára. Emellett az orchiectomián átesett hímekben a májkolóniák száma szignifikáns mértékben csökkent (különösen a HT168-M1 sejtvonal esetében). Ezzel szemben az ovariectomián átesett nőstényekben a kontrollokhoz viszonyítva a HT199 vonal esetén magasabb áttétszámot találtunk, és hasonló tendenciát figyeltünk meg a HT168-M1 vonalnál, bár itt a különbség nem volt szignifikáns. 16. táblázat. Hím, kontroll Hím, orchiect. Nőstény, kontroll Nőstény, ovariect.
Előfordulás 100% 67% 43% 67%
HT168-M1 Áttét (átlag) 130,7 1,7 0,6 2,6
Áttét (SEM) 33,2 0,8 0,8 1,0
Előfordulás 100% 100% 100% 100%
HT199 Áttét (átlag) 101,0 56,0 24,0 61,4
Áttét (SEM) 23,3 8,1 11,0 7,8
Ezen megfigyelésünk alapján egyértelmű, hogy az androgén hormon igen erős májmetasztázist potencírózó hatású humán melanóma esetében, míg az ösztrogénnek kisfokú, de esetenként jelentős májáttétképzést gátló hatása van. Természetesen az in vitro kimutatott receptor expresszió a humán melanóma vonalakban még nem elegendő bizonyíték arra, hogy a látott hatásért receptor-mediált folyamatokat tegyünk felelőssé, ehhez funkcionális receptor moduláns vizsgálatokra van szükség. Vizsgálataink egy másik részében fehérjeszinten is vizsgáltuk a glükokortikoid-receptor mint a szteroidhormon-hatás lehetséges közvetítője - jelenlétét humán melanómákban. Immuncitokémiai és immunhisztokémiai módszerekkel kilenc fagyasztott tumormintában ill. hét humán melanóma sejtvonalon mutattunk ki GCR-t különböző lokalizációkban. Előfordult sejtmagi, diffúz citoplazmás és kevert jelölődés is.
49
58.. ábra. GCR protein kimutatása emberi melanómában. A monoklonális antitest a PTE munkacsoport saját fejlesztése (Németh P). A/ HT199 melanóma sejtek in vitro
B/ 2404 sebészeti melanóma
A sejtmagok piros szinben tűnnek fel, míg a az antiGCR lokalizációját zöld fluoreszcencia jelzi. A sebészi mintát fagyasztva metszettük majd MetOHban fixáltuk hasonlóan a tenyészetekhez. Annak ellenére, hogy a GCR (referenciaszekvencia: nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1; NR3C1) mRNS- és fehérjeszinten is megtalálható volt, dexametazonnal (Dex) in vitro tesztekben nem sikerült jelentős proliferációgátlást elérni. Két napos kezelés még az igen nagy, 80 µM koncentrációjú dexametazonnal (a legmagasabb alkalmazott humán dózis kb.kétszeresének felel meg) is csak egyetlen sejtvonal esetén (WM983A) eredményezett 40%os proliferációgátlást, akár szérum (FCS) jelenlétében (19a. ábra), akár annak hiányában (19b. ábra) végeztük a vizsgálatokat. Huzamosabb kezeléssel (4-5 nap, 40 µM Dex, 5% FCS) két sejtvonal esetében ugyanezt a hatást értük el, és ezt a fenolvörös indikátor (melynek enyhe ösztrogénszerű hatása van) jelenléte vagy hiánya nem befolyásolta. 59. ábra. Dexametazon kezelés hatása humán melanóma sejtek proliferációjára in vitro. A/ Szerum+ B/ Szérum-
50
50 0 M
1
2 H 4 T1 W 9 M 9 9 W 83A M 98 M 3B 35 /0 1
M
M
1
0
100
50
2 H 4 T1 W 9 M 9 9 W 83A M 98 3 M B 35 /0 1
100
150
M
K Dex 80 Dex 40 Dex 20 Dex 10
150
4.3./ Tumorsejtmozgás felfüggesztésének alkalmazása az áttétképzés lelassításá
Kálcium-csatorna gátlás hatása humán melanóma-sejtvonalakra Az emberi melanoma sejtek inváziós szignalizációja nagymértékben függ a PKCa funkciójától korábbi kisérleti eredményeink szerint. Ez a PKC izoforma egyértelemű Cafüggő aktivitást mutat, ezért úgy gondoltuk, hogy a melanoma sejtek Ca-csatornáit moduláló anyagokkal indirect módon befolyásolni lehet a melanoma sejtek proliferációját és/vagy migrációs aktivitását. Elsőként megvizsgáltuk, hogy a korábban bemutatott RyanodinR2 Ca csatorna funkcionálisan aktiv-e melanómában. A vizsgálathoz ryanodint használtunk agonistaként és sejtproliferációs tesztben mértük a következményeket. 60. ábra. RyR2 agonista ryanodin hatása emberi melanoma sejtek proliferációjára in vitro.
% control
250
WM35 A2058 M1 HT199
200
150
100
50
0
1 10 100 Ryanodin koncentráció (µ µM log10) Megfigyeléseink szerint a ryanodin 10-100 µM koncentrációs tartományban eltérő mértékben, de stimulálja emberi melanoma sejtek proliferációját, ami a receptor funkcionális aktivitására utal. Ezen eredmények alapján (is) kívánatosnak tűnt különböző típusú Ca csatorna blokkolók tesztelése emberi melanómákon: vizsgálatainkhoz a RyR2-gátló ruthenium redet, valamint a klasszikus Ca csatornákat gátló Verapamilt és Felodipint használtuk.
Ca-csatorna blokkolás hatása emberi melanoma sejtek proliferációjára in vitro. 2 féle humánmelanóma sejtvonalat (HT168-M1/9 és HT199) 5 ezer sejt / well koncentrációban tettünk ki 96-well multiplate-re 5% FCS–tartalmú médiumban. A sejteket 24 órás inkubáció után kezeltük két kálcium-csatorna gátló különböző koncentrációival (Rutenium Red: 0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 100 µM; Felodipin: 1 µM, 5 µM, 10 µM, 25 µM, 50 µM) a sejteket 2,5% FCS-t tartalmazó, illetve savómentes körülmények között 48 órán keresztül. A proliferáció mértékének kiértékelése MTT-assay-jel történt.
51
61. ábra. Ca csatorna blokkolók hatása humán melanóma sejtek proliferációjára in vitro.
A proliferáció szignifikáns gátlása Ruthenium Rednél az 50 µM-os, míg a Felodipinnél a 25 µM-os dózisnál kezdődött mind a HT168-M1/9, mind pedig a HT199 melanóma sejtvonal esetében. Az 50 µM-os Felodipin-kezelés teljesen elpusztította a sejtjeinket. WM35 esetében a fenti metodikával megegyezően elvégeztük a proliferációs assay-t, de a Felodipinhez a Verapamil hatását hasonlítottuk (1 µM, 10 µM, 100 µM, 500 µM). A Verapamil esetében szignifikáns proliferációcsökkenést még 100 µM-os kezelésnél sem tapasztaltunk, míg 500 µM-ban teljesen elpusztultak a sejtek. Ebben a sejtvonalban már a Felodipin 1 µM-os dózisban hatásosnak bizonyult. 62. ábra. Ca csatorna blokkolók hatása WM35 humán melanóma proliferációjára in vitro. WM35 proliferációjának befolyásolása Verapamil és Felodipin kezeléssel 0,6
Sejtszám
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
50uM Felodipin
25uM Felodipin
10uM Felodipin
DMSO kontrol
Kezelés
1uM Felodipin
500uM Verapamil
10uM Verapamil
100uM Verapamil
Kontrol
1uM Verapamil
-0,1
Mean ±SE ±SD
Fenti vizsgálataink az irodalomban elsőként fedezték fel a Ca csatorna blokkolók mitogén szignalizációt gátló hatásait emberi melanoma sejteken. Korábbi irodalmi adatok azt mutatták, hogy a Ca csatorna blokkolók gátolják melanoma sejtek un. Multidrog rezisztenciáját. Másrészt korábbi vizsgálataink azt is kimutatták, hogy a Ca csatorna blokkolók jelentősen modulálják melanoma sejtek felszini adhéziós receptor expresszióját és a citoszkeletont. Új adataink ezeket a vizsgálatokat jelentősen kiegészítik. Ca csatorna blokkolás hatása human melanoma sejtek migrációjára M1/9 melanóma sejteket 106 sejt / ml koncentrációban, 20 µl térfogatban, 5% fetális borjúsavó tartalmú médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe. A sejtek viabilitását előzetes tripánkék festéssel ellenőriztük. Az alsó részbe savómentes médiumban oldott 100 µg/nl fibronektint helyeztünk, amely kemotaktikus
52
ingerként szolgált. 6 órás inkubációs periódus után (37 C°, 5% CO2) a nem migrált sejteket a a 8 µm pórusú membránról eltávolítottuk, a fibronektin felőli sejteket metanolos fixálás után toluidinkék oldattal festettük, majd megszámoltuk a látóterenkénti sejtszámot. a) A migráció alatti vizsgálatnál a sejtek a migráció teljes fázisa alatt jelen volt a kezelőanyag. Ebben az esetben nem volt szignifáns különbség a kontroll-csoport, valamint a Felodipin 10 µM-os dózisával kezelt sejtek migrációs készsége között. b) Migráció előtti kezelésnél a sejteket kitettük 6-well multiplate-re, 24 órás inkubációs periódus után 5% FCS-t tartalmazó médium mellet történt a Felodipin különböző koncentrációival (0,5 µM, 1 µM, 5 µM, 10 µM) való kezelés, amely 48 órán keresztül tartott. Ezután a sejteket 0,02%-os EDTA segítségével felszedtük, majd minden mintát 106 sejt/ml koncentrációban 5% FCS-t tartalmazó médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe, 100 µg/nl fibronektinnel szemben. Szignifikáns különbség itt sem volt tapasztalható.63. ábra. HT168-M1/9 migrációjának befolyásolása szimultán Felodipin kezeléssel
HT168-M1/9 migrációjának befolyásolása felodipin előkezeléssel
90
95
88 90
86 84
85 80
80
Sejtszám
Sejtszám
82
78 76 74 72
75 70 65
70 60
68 66
55
64 62 Kontroll
Felodipin
10 µM
50
Mean ±SE ±SD
Kontroll
0,5 µM
1 µM
Felodipin
5 µM
10 µM
Mean ±SE ±SD
A fenti kisérleti felállásban alkalmazott Ca csatorna blokkolók a még nem anti-mitotikus dózisban (10 µM) nem rendelkeztek antimigrációs hatással. Jelenlegi kisérleteink azt vizsgálják, hogy az antititotikus dózis egyúttal rendelkezik-e antimigrációs hatással. Korábbi genomikai vizsgálataink emberi melanóma sejtvonalak esetében több Ca szignalizációban részt vevő fehérje fokozott expresszióját mutatta: a ryanodin receptor2 mellett a sorcin, calneurinét is. Ezek az adatok arra utaltak, hogy a malignus transzformáció során a melanóma sejteknek szükségük van a Ca szignálra. Ezért gondoltuk azt, hogy Ca csatorna blokkolókkal esetleg befolyásolni lehet a humán melanóma sejtek biológiai viselkedését. Kisérleti eredményeink egy új melanóma terápiás irányzat alapjait jelentheti, ahol az ismerten terápia rezisztens melanóma sejteken Ca csatorna blokkolók segítségével lehet legalább is antimitotikus hatást elérni. Természetesen a vizsgálatokat folytatni kell és preklinikai modelleken igazolni kell hogy a biológiai hatás szöveti környezetben is fenn áll. EGF receptor moduláció hatása melanóma-sejtvonalakra Korábbi sporadikus eredmények alapján többször felmerült a lehetősége annak, hogy a melanómaák EGFR-t expresszálnának, azonban a kellően mély molekuláris vizsgálatok ezt nem tudták igazolni meggyőzően. Első lépésben tehát megvizsgáltuk a rendelkezésünkre álló 5 féle genetikai hátterű humán melanóma sejtvonalon hogy az EGFR kifejeződik e mRNS és fehérje szinten.
53
EGF-receptor expresszió vizsgálata emberi melanóma sejtvonalakon RT-PCR segítségével próbáltuk meghatározni az EGF-receptor intra- és extracelluláris doménjének jelenlétét humán melanóma sejtvonalainkon. Kontrollként az A431 humán laphám-carcinóma vonalat használtuk, amely amplifikáltan expresszálja a vad típusú EGFreceptort. Az alábbi ábrán látható a PCR-termékek agaróz gélen történő futtatásának etidium-bromiddal előhívott képe. Minden sejtnél az 1. oszlopban látható a kontroll β-globulinnak felel meg, a 2. oszlopban egy extracelluláris, ligandkötő régióban lévő lévő terméket kaptunk (a primerpár a 438-811 közötti bázisokat célozza). A 3. és 4. oszlopok az intracelluláris, tirozinkináz régiót reprezentálják (2650-3060., ill. 2523-2840. bázis). 64. ábra. EGFR expresszió emberi melanóma vonalakban (RT-PCR)
Megállapítható, hogy az a pozitív kontrollhoz (A431) hasonló expressziós mintázatot a 9 vizsgált melanóma vonal közül csak 2 az M24 és a WM983A tartalmaz. Az is látható, hogy 2 vonal negatívnak bizonyult. Ugyanakkor 5 melanóma vonalban az EGFR domének un. alternatív bendeket tartalmaznak. A szekvenálás igazolta az extracelluláris és a cytoplazmatikus termék autentikus voltát az M24 sejtvonalban, azonban a cytoplazmatikus 2.3. primerek esetében megjelenő alacsonyabb mólsúlyú termék természete még nem tisztázott.
Eredményeinket q-PCR módszerrel is megerősítettük. Ha a HT199 EGF-receptor expresszióját vesszük egységnyinek, akkor az expressziós ráták az alábbiak szerint alakulnak az emberi melanóma sejtvonalakban: 17. táblázat. Sejtípus
EGFR szint (RT-PCR analízis)
HT199
1
A431
392926
M24met
30000
HT168
0,133
HT168-M1/9
0,0077
A2058
0
M35
25,9
WM983A
17,6
WM983B
21,5
54
Ennek megfelelően az EGFR cytoplazmatikus doménje alapján jelentős eltérés van az emberi melanóma vonalak között: a wtEGFRt expresszáló M24 négy nagyságrenddel többet expresszál, mint a HT199, erős expresszió jellemzi a WM983 vonalakat és az M35-öt, míg igen gyenge a HT168 családot. Humán melanóma sejtvonalak EGF-receptor expressziójának vizsgálata flow-cytométerrel A felhasznált sejtvonalakban megvizsgáltuk az EGF-receptor expressziójának mértékét flowcytometria segítségével. Az 1%-os paraformaldehid fixálás után 0.2%-os szaponinnal permeabilizált mintákban mértük az expressziót. A felhasznált Transductional Laboratories által gyártott antitest az intracelluláris, míg a BD antitestje az EGF receptor extracelluláris doménjét ismerte fel. Az M24met sejtvonal 95%-ban volt pozitív az extracelluláris doménre, a többi sejtünk negatívnak bizonyult. 65. ábra. Az EGF-receptor TK domén expressziója humán melanóma sejtvonalakon 90% 80%
Expressziós %
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% M1/9
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM83B
M24met
66.abra.Emberi melanóma sejttek proliferációjának befolyásolása EGFR TK gátló ZD1839-el ZD1839 hatása különböző melanóma sejtek proliferációjára (0% FCS)
Proliferációs % (Kontrollhoz képest)
300,00% 0,1 uM 1 uM 10 uM 100 uM
250,00%
200,00%
150,00%
100,00%
50,00% 0%
0%
0,00%
A2058
M1/9
M24 met
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM983B
A 8 féle melanóma sejtvonalat (A-2058, HT168-M1/9, M24met, HT168, HT199, WM35, WM983A, WM983B) 5 ezer sejt / well koncentrációban tettünk ki 96-well multiplate-re 5%
55
FCS–tartalmú médiumban. 24 órás inkubáció után kezeltük ZD1839 különböző koncentrációival (0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 100 µM) a sejteket 2,5% FCS-t tartalmazó, illetve savómentes körülmények között 48 órán keresztül. A proliferáció mértékének kiértékelése MTT-assay-jel történt. 67. ábra. A ZD1839 antititotikus hatása a 10 µM-os koncentrációnál kezdődött, a 100 µM-os dózis már teljesen elpusztította a sejteket. ZD1839 hatása különböző melanóma sejtek proliferációjára (2,5% FCS) 250,00% 0,1 uM 1 uM 10 uM 100 uM
Proliferációs % (kontrollhoz képest)
200,00%
150,00%
100,00%
50,00%
0%
0%
0%
0%
0,00%
A2058
M1/9
M24 met
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM983B
68. ábra. ZD1839 proliferációgátló hatásának összehasonlítása klasszikus EGFR TK gátló PD153035 kezeléssel HT168-M1/9, M24met, HT199, WM983A és B sejtvonalakon a fenti metodika alkalmazásával, savómentes körülmények között összehasonlítottuk az Iressa (ZD1839) hatását egy kísérletes célokra használt specifikus EGF-receptor tirozin-kináz gátlóval, a PD153035-tel. 69. ABCD. Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása M24met melanóma sejtvonalon
Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása HT168-M1/9 melanóma sejtvonalon 0,800
Iressa
0,350
PD153035
PD153035
0,300
Extinkció
0,600
Extinkció
0,400
Iressa
0,700 0,500 0,400 0,300
0,250 0,200 0,150
0,200
0,100
0,100
0,050 0,000
0,000 Kontroll
0,1 uM
1 uM
10 uM
Kontroll
100 uM
0,1 uM
Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása HT199 melanóma sejtvonalon 0,600 0,500
10 uM
100 uM
Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása WM983A melanóma sejtvonalon Iressa
1,200
PD153035
1,000
0,400
Iressa
Extinkció
Extinkció
1 uM
Kezelési dózis
Kezelési dózis
0,300 0,200 0,100
PD153035
0,800 0,600 0,400 0,200
0,000 Kontroll
0,1 uM
1 uM
10 uM
0,000
100 uM
Kontroll
Kezelési dózis
0,1 uM
1 uM
10 uM
100 uM
Kezelési dózis
Vizsgálataink eredményeként megállapítható hogy a ZD1839 (Iressa) valamennyi emberi melanóma sejtvonalunkon minden dózisban hasonlóan hatásosnak bizonyult, mint a
56
PD153035. Ugyanakkor az is megállapítható, hogy a PD EGFR TK gátló is hatásos emberi melanóma sejtvonalakon. EGFR TK gátlása apoptózist okoz emberi melanóma sejtvonalakon A melanóma sejtvonalainkat 24 órás inkubáció után kezeltük az ZD1839 különböző koncentrációival (5 µM, 25 µM, 50 µM) 5% FCS-t tartalmazó médiumban 48 órán keresztül. 0,02%-os EDTA segítségével való felszedést követően a sejteket 70 %-os –20 °C-os alkohollal való inkubáció után kezeltük propidium-jodiddal, valamint RNAse-zal. Ezután flow-cytometria használatával következtettünk a sejtekben található DNS mennyiségére, ebből pedig a sejtciklusra. A sub-G1 fázisban lévő sejteket tekintettük apoptotikusnak.69. ábra.
Az apoptózis aránya különböző dózisú ZD1839 kezelés hatására humán melanóma sejtvonalakon 80% Iressa 5 uM 70%
Iressa 25 uM
Apoptózis mértéke
Iressa 50 uM 60%
50%
40%
30%
20%
10%
0% A2058
M1/9
M24 met
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM983B
Öt %-ot meghaladó apoptózis a legalacsonyabb 5µM-os dózisban 2 sejtvonalban volt tapasztalható (HT168 és WM983A) , míg a magasabb 25 µM-nál 10% feletti apoptosis ráta a HT168 családban (A2058, HT168 és M1) valamint a WM családban volt észlelhető, mely utóbbi bizonyult a legérzékenyebbnek ebből a szempontból. Megjegyzendő, hogy a wtEGFR-t expresszáló M24 melanóma vonal a legrezisztensebb a TK gátló hatásra.
EGFR TK gátlás hatása humán melanóma migrációjára M1/9 melanóma sejteket 106 sejt / ml koncentrációban, 20 µl térfogatban, 5% fetális borjúsavó tartalmú médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe. A sejtek viabilitását előzetes tripánkék festéssel ellenőriztük. Az alsó részbe savómentes médiumban oldott 100 µg/nl fibronektint helyeztünk, amely kemotaktikus ingerként szolgált. 6 órás inkubációs periódus után (37 C°, 5% CO2) a nem migrált sejteket a a 8 µm pórusú membránról eltávolítottuk, a fibronektin felőli sejteket metanolos fixálás után toluidinkék oldattal festettük, majd megszámoltuk a látóterenkénti sejtszámot. a) A migráció alatt a sejtek a migráció teljes fázisa alatt kezelve voltak ZD1839-el. Hogy kiszűrjük az anyag toxikus hatását, ezért tripánkék festéssel ugyanezen kezelési koncentrációk mellett megmértük a sejtek 6 órás túlélését is. Mivel a sejtpusztulás teljesen megegyezett a migrációgátlás mértékével, ezért az észlelt gátlás a ZD1839 toxikus hatásával magyarázható, semmint antimigrációssal.
57
b) Migráció előtti kezelésnél a sejteket kitettük 6-well multiplate-re, 24 órás inkubációs periódus után 5% FCS-t tartalmazó médium mellet történt az ZD1839 különböző koncentrációival való kezelés, amely 48 órán keresztül tartott. Ezután a sejteket 0,02%-os EDTA segítségével felszedtük, majd minden mintát 106 sejt/ml koncentrációban 5% FCS-t tartalmazó médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe, 100 µg/ml fibronektinnel szemben. 70. ábra.
ZD1839 48 órás előkezelés hatása M1/9 melanoma sejtek migrációjára 90
Migráció 80
70
Sejtszám / látótér
p<0,05
p<0,05
60
100%
98% 79%
50
75%
40
p<0,05 30
39% 20
10
0
Kontroll
0,01 uM
0,1 uM
1 uM
10 uM
Megállapítottuk, hogy az EGFR TK aktivitásának gátlása (az így kondicionált sejtek esetében) jelentősen gátolta a migrációs képességet is. A hatás matematikailag szignifikánssá 0.1 µM-tól, biológiailag szignifikánssá 10 µM-tól vált. Az EGFR-ra vonatkozó vizsgálatainkat összefoglalva megállapíthatjuk, hogy először igazoltuk, hogy emberi melanómában az EGFR (ha nem is annak un. vad típusa) nagy gyakorisággal expresszálódik és a termék magába foglalja a tirozin kináz domént. Az melEGFR expressziónak funkcionális jelentősége van, mert specifikus EGFR TK gátló szerekkel antiproliferatív, apoptosis-indukciós és antimigrációs hatást lehet kiváltani in vitro. Mindezen eredményeink alapján felmerül az, hogy az emberi melanómában, a tüdőrákok bizonyos formáihoz hasonlóan egy daganatos EGFR expresszálódik, amely terápiás célpontként szolgálhat. Természetesen ezen feltételezésünket további preklinikai és patológiai vizsgálatoknak kell alátámasztaniuk.
58
7.4.4 rh Erythropoetin hatása a sugárkezelésre és a daganatos erekre Vizsgálataink során a korábbi eredményeinkből kiindulva az epoetinum alfa (EPREX) hatóanyagot teszteltük in vitro és in vivo körülmények között humán laphámrák (A431) tumorvonalon. A korábbi in vitro vizsgálatainkban az epoetinum alfa humán terápiás dózisban nem befolyásolta a tumorsejtek proliferációját, valamint a tumorok in vivo subcutan növekedését hosszabb távon. Ugyanakkor kiemelendő az az új megfigyelésünk, hogy az EPREX angiogenezis-stimuláló hatású lehet a subcutan növő tumorok esetében. Ezen felül irodalmi adatok szerint az erythropoietin endothel proliferációt stimuláló hatású in vitro, ezért az új kísérleteinkkel vizsgáltuk a subcutan növő laphámrák erezettségi sajátosságait, valamint ebből következően a daganatok kemo- és sugárérzékenységét. A kezelési dózisok jelen vizsgálatainkban is a korábbi humán protokollok alapján állapítottuk meg: az alapdózis a 150U/tskg volt, és ezt a koncentráció tartományt alkalmaztuk az in vitro kezelések alatt is (0,1 U-10U/ml). EPREX hatása A431 tumorok subcutan növekedésére besugárzással kombinálva Kísérleteinkben 2x106 tumorsejtet oltottunk SCID egerekbe, és az tumoroltással egyidejűleg megkezdtük a EPREX kezelést a humán protokollnak megfelelően: heti 3 alkalommal 150U/tskg dózisban. A tumorokat, miután elérték a 50mm3-es nagyságot (14 nappal az oltás után) besugaraztuk (5Gy dózisban), és 7-10 nappal a sugárkezelés után meghatároztuk a tumorok tömegét (2 független kísérletet végeztünk). Az eredményekből megállapítható, hogy az EPREX kezelés szignifikánsan fokozta a sugárkezelés hatását, míg a kísérleti periódus alatt az állatok nem különböztek jelentősen oxigenizáltságukban. 71. ábra: EPREX hatása humán laphámrák daganat subcutan növekedésére a sugárkezelés (5 Gy) után 10 nappal I.
Kontroll
EPO 150 U / ttkg
Kontroll + 5 Gy
EPO + 5 Gy
59
72. ábra: EPREX hatása humán laphámrák subcutan növekedésére sugárkezelés (5 Gy) után 10 nappal 125
tumortömeg (%)
100
75
50
*
25
0
Kontroll
EPO 150
Irradiáció
EPO + irrad
73. ábra: Hemoglobin (a) és vörösvértestek (b) mennyiségének változása EPREX kezelés hatására humán laphámrák tumor subcutan növekedés alatt SCID egerekben A/ haemoglobin szint B/ vvt szám alakulása 14
13
l d / g
10
Tumor nélkül Tumor + Fiz. só Tumor + EPO 150
9
l u /6 0 1 * b d
12
11
8
7
6
10 0
5
10
15
20
5
25
0
Tumor oltás utáni napok
5
10
15
20
25
Tumor oltás utáni napok
EPREX és sugárkezelés hatása A431 laphámrák in vitro proliferációjára, valamint klónképző képességére Az irodalomban újabban folyamatosan jelennek meg az olyan közlemények, amelyekben különböző eredetű daganatokat vizsgáltak és megállapították, hogy azok expresszálják a erythropoietin receptort. Ezek az eredmények, és a mi megfigyeléseink felvetik azt a kérdést, hogy az EPREX-nek nem csak a tumoros állat oxigenizáltságában játszik szerepet, hanem esetleg a daganatsejtekre is hat közvetlenül. Leteszteltük, hogy az A431 laphámrák tumorvonal expresszálja-e az EPO receptort, és azt az eredményt kaptuk, hogy a sejtek 51 több mint felén jelen van a membránjukon a receptor .
60
74. ábra. Erythropoietin receptor (EPO-R) kimutatása A431 laphámrák tumorsejteken flowcytométerrel. Negatív kontroll (a), pozitív reakció (b)
a
b Pozitív sejtek (%) 3
51 Intenzitás
4,5
11,9
Ezek után kíváncsiak voltunk arra, hogy az EPO-nak in vitro is van-e valamilyen hatása a sugárkezelésre a tumorsejteken. 72 órás proliferációs tesztet, valamint 14 napos klónképző képességet vizsgáltunk a tumorsejteken különböző koncentrációjú (0,1-1-10 U/ml) EPREX kezelés során eltérő sugárdózisokat alkalmazva (0,5-8Gy). Megállapítottuk, hogy az epoetinum alfa in vitro is képes volt fokozni a sugárkezelés hatását mind a proliferáció gátlásában (40. ábra) mind a klónképző képességben. 75. ábra. EPREX hatása A431 humán laphámrák in vitro proliferációjára sugárkezelés után (72 óra, Se+).
125
kontroll%
100
Kontroll
75
EPO 1,0
50
*
25 0 0
1
2
3
4
5
6
7
Sugárdózis (Gy)
61
8
9
10
76. ábra. EPREX hatása A431 laphámráksejtek klónképzésére 5 Gy besugárzás után. 125
kontroll %
100
* 75
**
50 25 0
0
0,1 1 10 U/ml EPO Vizsgálataink másik részében abból a megfigyelésből indultunk ki, hogy az EPREX-el kezelt állatokban a subcután növő daganatokban kitágult ereket figyelhetünk meg a kezeletlen állatokhoz képest. Az érdilatációt direkt CD31 ér-jelöléssel (42,43 ábra) is kimutattuk, valamint képanalizáló szoftver segítségével kvantitatívan is mértük: az EPREX hatás szignifikánsnak adódott. Sikerült kimutatnunk, hogy az EPREX valóban angiogenezis fokozó hatású, amit embrionált csirke chorioallantois membrán beereződési kísérletben vizsgáltunk. Ebben a kísérletben a 3 napig kezelt tojásokban szignifikánsan megnőtt az erek száma a kontrollhoz képest. Ezen felül arra kíváncsiak voltunk, hogy a megnövekedett érfelület jobb perfúzióhoz is vezete a daganatokban. Ezért a subcután laphármrákot hordozó SCID egerekbe supravitális magfestéket (Hoecst) juttatunk i.v. 15 percre, majd a tumorokból fagyasztott metszeteken meghatároztuk a jelölt területek százalékos nagyságát és arányát. Eredményeink azt mutatják, hogy az EPREX kezelés (150 IU/tskg) hatására kétszer akkora területet jelölt meg a festék, mint a kezeletlen kontrollokban. 77. ábra. EPREX hatása A431 humán laphábrák daganat beereződésére I. CD31-pozitív erek a tumorban. Kontroll (a), EPREX kezelt (b)
a
b
62
78. ábra. EPREX hatása A431 humán laphámrák ereire II. CD31-pozitív erek a tumorban. Kontroll (a), EPREX kezelt (b)Konfokális mikroszkópia A/akontroll
b B/EPREX
Zöld: CD31+ erek, piros: sejtmagfestés
79. ábra. Intratumorális erek átmérője subcutan humán laphámrák tumorban a tumor oltás utáni 10. és 17. napon EPREX kezelés hatására
µ m2) erek mérete (µ
30
10. nap 17. nap
20
10
0
kontroll
epo100
epo1000
63
80. ábra. EPREX hatása az angiogenezisre csirke chorioallantois membrán tesztben. Kontroll (a), EPREX kezelt (b) tojások, valamint kvantitatív kiértékelés (c). A/ kontroll
B/ EPREX
C/ EPREX hatása a vaszkulogenezisre csirketojáson
érszám/cm x 100
300 250 200 150 100
Kontroll
EPO 2
EPO 20
IU/tojás
64
81. ábra. Hoecst festék perfúziója A431 humán laphámrák subcután daganatokban SCID egerekben. Kontroll tumor (a), EPREX kezelt tumor (b), statisztikai kiértékelés (c).
a: kontroll c: morfometria
b: EPREX
változás a kontrollhoz képest (%)
250
200
150
100
50
0
perfundált terület
+ ter. átlaga (T)
érkerület átlag (K)
65
T/K
•
4.4./ rhErythropoetin hatása az angiogén fenotípusra és az áttétképzésre colonrák esetében Vizsgálataink során a korábbi eredményeinkből kiindulva az epoetinum alfa (EPREX) hatóanyagot teszteltük in vivo körülmények között humán colon carcinoma (HT25) tumorvonalon. QPCR technikával és flow-citométeres méréssel is igazoltuk, hogy a HT25 sejtek expresszálják az EPOR-t (31. ábra). A korábbi in vitro vizsgálatainkban az epoetinum alfa humán terápiás dózisban nem befolyásolta a tumorsejtek proliferációját, valamint a tumorok in vivo subcutan növekedését. Azonban más (laphám) tumor xenograftban kapott eredményeinkkel egyezőleg, az EPREX (150 IU/kg) fokozta az 5-FU kezelés (750 mg/m2) hatását a subcutan növő tumorok esetében (2. ábra). 82. ábra. EPO receptor expressziója különböző humán daganatsejtvonalakban. 75
mRNA protein
3 50 2 25 1
0
protein (% positive cells)
mRNA (relative units)
4
0
A431
HT25
83. ábra: EPREX (150 IU/kg) hatása humán colon carcinoma daganat subcutan növekedésére 5-FU kezelés (750 mg/m2) után. Control Control + 5-FU EPO EPO + 5-FU
350
300
250
tumor volume (mm3)
* 200
**
150
100
50
5-FU 0 0
5
10
15
20
days after tumor inoculation rHuEP O
66
25
30
Ez a fokozott hatás a megnövekedett perfúziós kapacitás miatt léphetett fel, amelyet a szignifikánsan nagyobb erek (3. ábra), és a pericita borítás megszakadása eredményezhet (4. ábra). Ezekkel a vizsgálatokkal megerősítettük a korábbi eredményainket, és újabb bizonyítékokat adtunk arra, hogy az rHuEPO fokozza a tumoros erek átmérőjét, amely a citosztatikus kezelés hatékonyságát növeli az EPO receptort expresszáló tumor xenograftokban. 84. ábra. EPREX (150 IU/kg) hatása human colon carcinoma xenograft ereire. CD31: zöld, sejtmag: piros.
kontroll
rHuEPO
85. ábra. EPREX (150 IU/kg) hatása az erek pericita borítására human colon carcinoma xenograftban. CD31: zöld, SMA: piros. A nyíl a folytonos pericita borítás megszakadását mutatja az rHuEPO kezelt tumorokban.
rHuEP O
kontroll
Fenti vizsgálataink igazolták, hogy az A431 emberi laphámrák esetében megfigyelt EPOindukált érelváltozások egy másik daganatféleségben, a HT25 colon adenocarcinomában is kialakulnak, tehát nem tumortípus specifikusak. Ezen eredmények fényében megfigyeléseinknek klinikai jelentősége lehet, hiszen vizsgálataink az 5-FU antitumorális htaásának potencírozását igazolják. Ezt a citosztatikumot a colorectalis daganatok mellett a fejnyaki laphámrákokban is kiterjedten használják. Ezutóbbiak esetében EPO kezeléssel gyakran kombinációban.
67
5. Klinikai vizsgálatok a daganatok progressziós készségének fékezésére (Janssen-Cilag, Pfizer kft.)
5.1. Fragmin hatása előrehaladott melanóma progressziójára 20-20 stage III szervi áttétben még nem szenvedő melanómás beteg esetében kívánjuk megvizsgálni a Fragmin adagolás hatását a progressziós folyamatra, amikoris a két csoport a standard Dacarbazine terápiát is kapja. Monitorozásra elsősorban képalkotó módszereket használunk. Az anticoaguláció mértéke a szokásos DVT profilaktikus napi dózis lesz 1 hónap időtartamban. Az anticoagulatiot heti coagulogrammal ellenőrizzük. A vizsgálat célja a progresszióig eltelt idő mérése illetve ennek módosulása a Fragminnal kezelt betegcsoportban. A vizsgálat protokollja az ETT-hez beadásra került.
5.2. Az oxigenizáció javításának hatása az angiogén fenotípusra és a terápiás érzékenységre előrehaladott cervix- és rectumrákban rhErythropoetin segítségével 20-20 előrehaladott rectumrákos beteget vonunk be vizsgálatainkba, akik a megfelelő protokoll szerinti kombinált sugár- és cytostatikus neoadjuváns kezelésben részesülnek. A kezelés előtt meghatározzuk a Hgb szintet és a vvt számot és a tumorszövetből tájékozódó szövettani mintavétel (PREX) történik. A daganatgátló kezeléssel párhuzamosan az irodalmi javallatoknak megfelelően rhEPO adagolás történik, amelynek során folyamatosan követjük nyomon a vvt és Hgb szintet a vérben, valamint a tumorok méretét. A terápia sikerességét az ciklus leadása végén a sebészeti beavatkozáskor eltávolított tumor analízisével határozzuk meg. A kezelés előtti és után szövettani mintákban meg kívánjuk határozni az angiogén fenotípus jellemző elemeit, a tumorok érdenzitását, a daganatos erek paramétereit (átmérő, pericita boríték) valamint a VEGF, bFGF és VEGFR2 illetve HIF1a szinteket immunhisztokémiai módszerrel. A vizsgálat klinikai protokollja az Intézeti etikai bizottsághoz beadásra került. A kutatási periódus közleményei 1.
2.
3. 4. 5. 6.
7. 8.
Ádám Zs, Ádány R, Ladányi A, Tímár J, Balázs M. Liver metastatic ability of human melanoma cell lines is associated with losses of chromosome 4 and 9p and the extreme aggressive behaviour of human melanoma cell lines. Clin Exp Metast 18:295-302, 2001 Aszalos A, Ladányi A, Bocsi J, Szende B. Induction of apoptosis in MDR1 expressing cells by daunorubicin with combinations of suboptimal concentrations of P-glycoprotein modulators. Cancer Letters 167:157-162, 2001 IF Döme B, Somlai B, Ladányi A, Fazekas K, Zöller M, Tímár J. Expression of CD44v3 splice variant is associated with the visceral metastatic phenotype of human melanoma. Virchow Arch 439:628-635, 2001 Fazekas K, Csuka O, Köves I, Rásó E, Tímár J. Experimental and clinicopathologic studies on the function of the HGF receptor in human colon cancer metastasis. Clin Exp Metast 18:639-649, 2001 Fazekas K, Janovics Á, Döme B, Koska P, Albini A, Tímár J. Effect of HGF-like basic hexapeptides on angiogenesis. Microvasc Res 62:440-444, 2001 Forster-Horváth Cs, Bocsi J, Rásó E, Orbán TI, Olah E, Tímár J, Ladányi A. Constitutive intracellular expression and activation-induced cell surface up-regulation of CD44v3 in human T lymphocytes. Eur J Immunol 31:600-608, 2001 Ladányi A, Gallai M, Paku S, O Nagy J, Dudás J, Tímár J, Kovalszky I. Expression of a decorin-like molecule in human melanoma. Path Oncol Res 7:260-266, 2001 Lukits J, Tímár J, Juhász A, Döme B, Paku S, Répássy G. Progression difference between cancers of the larynx and hypopharynx is not due to tumor size and vascularization. Laryngol Head Neck Surg 125:1822, 2001
68
9. 10. 11.
12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.
20. 21.
22.
23. 24.
25.
26.
27. 28.
29. 30. 31.
32.
Magyarosy E, Sebestyén A, Tímár J. Expression of metastasis associated proteins CD44v3 and NM23-H1 in pediatric acute lymphoid leukemia. Anticancer Res 21:819-824, 2001 Paku S, Döme B, Tóth R, Tímár J. Organ-specificity of the extravasation process: An ultrastructural sutdy. Clin Exp Met 18:481-492, 2001 Rásó E, Tóvári J, Tóth K, Paku S, Trikha M, Honn KV, Tímár J. Ectopic aIIbb3 integrin signaling involves 12-lipoxygenase- and PKC-mediated serine phosphorylation events in melanoma cells. Thrombosis Haemostasis 85:1037-42, 200 Tímár J, Csuka O, Orosz Zs, Jeney A, Kopper L. Molecular pathology of tumor metastasis. I. predictive pathology. Pathol Oncol Res 7:217-230, 2001 Tímár J, Döme B, Fazekas K, Janovics Á, Paku S. Angiogenesis-dependent diseases and angiogenesis therapy. Pathol Oncol Res 7:85-95, 2001 Döme B, Paku S, Somlai B, Tímár J. Vascularization of cutaneous melanoma involves vessel co-option and has clinical significance. J Pathol 197:355-362, 2002 Fazekas K, Rásó E, Zarándi M, Dudás J, Tímár J. Basic HGF-like peptides inhibit generation of liver metastases in murine and human tumor models. Anticancer Res 22:2575-2580, 2002 Lapis K, Tímár J. Role of elastin-matrix interactions in tumor progression. Semin Cancer Biol 12:209217, 2002 Tímár J, Csuka O, Orosz Zs, Jeney A, Kopper L. Molecular pathology of tumor metastasis. II. Molecular Staging and differential diagnosis. Pathol Oncol Res 8:204-219, 2002 Tímár J, Lapis K, Dudás J, Sebestyén A, Kopper L, Kovalszky I. Proteoglycans and tumor progression: Janus-faced molecules with contradictory functions in cancer. Semin Cancer Biol 12:173-186, 2002 Tímár J, Rásó E, Döme B, Ladányi A, Bánfalvi T, Gilde K, Raz A. Expression and function of the AMF receptor by human melanoma in experimental and clinical systems. Clin Exp Metastasis 19:225-232, 2002 Trikha M, Tímár J, Zacharek A, Nemeth JA, Cai Y, Döme B, Somlai B, Rásó E, Ladányi A, Honn KV. Role for β3 integrins in human melanoma growth and survival. Int J Cancer 101:156-167, 2002 Trikha M, Zhou Z, Tímár J, Rásó E, Kennel M, Emmell E, Nakada MT. Multiple roles for platelet GPIIb/IIIa and αvβ3 integrins in tumor growth, angiogenesis, and metastasis. Cancer Res 62:2824-2833, 2002 Bánfalvi T, Udvarhelyi N, Orosz Zs, Gergye M, Gilde K, Tímár J. Heterogenous S-100B protein expression patterns in malignant melanoma and association with serum protein levels. Oncology 64:374379, 2003 Döme B, Tímár J, Paku S. A novel concept of glomeruloid body formation in experimental cerebral metastases. J Neuropath Exp Neurol 62:655-661, 2003 Lövey J, Fazekas K, Ladányi A, Németh Gy, Tímár J. Low-dose irradiation and short-exposure suboptimal dose of Paclitaxel adversely modulate metastatic potential of sqamous cell carcinoma cells. Strahlentherapie und Onkologie, 179:812-818, 2003 Magyarosy E, Varga N, Tímár J, Rásó E. Follow-up of minimal residual disease in acute childhood lymphoblastic leukemia by WT1 gene expression in the peripheral blood: The Hungarian experience. Pediatric Haematol Oncol 20:65-74, 2003 Paku S, Tóvári J, Lőrincz Zs, Timár F, Döme B, Kopper L, Raz A, Tímár J. Adhesion dynamics and cytoskeletal structure of gliding human fibrosarcoma cells: a hypothetical model of cell migration. Exp Cell Res 290:246-253, 2003 Rásó E, Paku S, Kopper L, Tímár J. Trace elements inprove survival of DTIC-treated mice with overt liver metestases of lewis lung carcinoma. Pathol Oncol Res 9:96-99, 2003 Tímár J, Forster-Horváth Cs, Lukits J, Döme B, Ladányi A, Remenár É, Kásler M, Bencsik M, Répássy G, Szabó G, Velich N, Suba Zs, Élő J, Balatoni Z, Bajtai A, Chretien P, Taylor E. The effects of leukocyte interleukin injection treatment on the peritumoral and intratumoral subpopulation of mononuclear cells and tumor epithelia. Laryngoscope 113:2206-2217, 2003 Tímár J, Ladányi A, Peták I, Jeney A, Kopper L. Molecular pathology of tumor metastasis III. Target array and combinatorial therapies. Pathol Oncol Res 9:49-72, 2003 Dobos J, Tímár J, Bocsi J, Burian Zs, Nagy K, Barna G, Peták L, Ladányi A. In vitro and in vivo antitumor effect of 2-methoxyestradiol on human melanoma. Int J Cancer 112:771-776, 2004 Forster-Horváth Cs, Döme b, Paku S, Ladányi A, Somlai B, Jalkanen S, Tímár J. Loss of vascular adhesion protein-1 expression in intratumoral microvessels of human skin melanoma. Melanoma Res 14:135-140, 2004 Forster-Horváth Cs, Mészáros L, Rásó E, Döme B, Ladányi A, Morini M, Albini A, Tímár J. Expression of CD44v3 protein in human endothelial cells in vitro and in tumoral microvessels in vivo. Microvascular Res 68:110-118, 2004
69
33.
34. 35.
36.
37. 38. 39.
40.
41.
42.
43. 44. 45.
Ladányi A, Somlai B, Gilde K, Fejős Zs, Gaudi I, Tímár J. T-cell activation marker expression on tumorinfiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous malignant melanoma. Clin Cancer Res 10:521530, 2004 Lőrincz T, Tímár J, Szendrői M. Alterations of microvascular density in bone metastases of adenocarcinomas. Pathol Oncol Res 10:149-153, 2004 Lőrincz T, Tóth J, Szendrői M, Tímár J. Her2/neu status in bone metastases of breast cancers. 2nd Congress of the World Society for Breast Health, 2003 - Monduzzi Editore International Proceedings Division, Bologna, pp. 35-38 Rásó E, Döme B, Somlai B, Zacharek A, Hagmann W, Honn KV, Tímár J. Molecular identification, localization and function of platelet-type 12-lipoxygenase in human melanoma progression, under experimental and clinical conditions. Melanoma Res 14:245-250, 2004 Rásó E, Mészáros L, Albini A, Tímár J. A WT1 expressing metastatic human Kaposi sarcoma xenografts model. Pathol Oncol Res 10:22-25, 2004 Tímár J, Csuka O, Remenár É, Répássy G, Kásler M. Progression of head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Metast Rev 24:105-125, 2005 Tímár J, Udevarhelyi N, Bánfalvi T, Gilde K, Orosz Zs. Accuracy of the determination of S100B protein expression in malignant melanoma using polyclonal or monoclonal antibodies. Histopathology 44:180184, 2004 Bereczky B, Gilly R, Rásó E, Vágó Á, Tímár J, Tóvári J. Selective antimetastatic effect of heparins in preclinical human melanoma models is based on inhibition of migration and microvascular arrest. Clin Exp Metast 2005 (elfogadva) Döme B, Rásó E, Dobos J, Mészáros L, Varga N, Puskás LG, Fehér LZ, Lőrincz T, Ladányi A, Trikha M, Honn KV, Tímár J. Parallel expression of αIIbβ3 and αvβ3 integrins in human melanoma cells upregulates bFGF expression and promotes their angiogenic phenotype. Int J Cancer 2005 (elfogadva) Tímár J, Ladányi A, Forster-Horváth Cs, Lukits J, Döme B, Remenár É, Gődény M, Kásler M, Bencsik B, Répássy G, Szabó Gy, Velich N, Suba Zs, Élő J, Balatoni Zs, Pócza K, Zemplén B, Chretien P, Talor E. Neoadjuvant immunotherapy of oral squamous cell carcinoma modulates intratumoral CD4+/CD8+ ratio and tumor microenvironment. A multicenter phase II clinical trial. J Clin Oncol 2005 (elfogadva) Tímár J, Mészáros L, Orosz Zs, Albini A, Rásó E. WT1 expression in angiogenic tumors of the skin. Histopathology 2005 (elfogadva) Tímár J, Tóvári J, Rásó E, Mészáros L, Bereczky B, Lapis K. Thrombocyte-mimicry of cancer cells: rationale for the prevention and treatment of hematogenous dissemination. Oncology 2005 (elfogadva) Tóvári J, Gilly R, Paku S, Bereczky B, Varga N, Vágó Á, Tímár J. Recombinant human erythropoietin alpha targets intratumoral blood vessels improving chemotherapy in human xenografts models. Cancer Res 2005 (elfogadva)
70
