Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program
1. Főirány: Életminőség javítása
Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére
1/48/2001
3. Részjelentés: 2003. November 30.-2004. december 31.
RP7. A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása….
Dr. Tímár József Országos Onkológiai Intézet
1
RP7. A daganatos progresszió génexpressziós térképének kialakítása és felhasználása a prognózis megítélésére és új innovatív terápiás elvek kialakítására Témavezető: dr. Tímár József, Országos Onkológiai Intézet Résztvevők: dr. Németh Péter PTE Immunológiai Intézet dr. Puskás László MTA SZBK Dr. Hernádi Zsuzsa Pfizer kft. Dr. Sebeszta Miklós Janssen-Cilag kft. 1./ A daganatok áttétképzésében szerepet játszó adhéziós molekulák és jelátviteli pályáik meghatározása 1.1. Paralell b3 integrin expressziós modell kialakítása emberi melanóma sejtvonalban Miután emberi melanómában azzal lehet számolni, hogy a két b3 integrin együttesen expresszálódik, ezért olyan avb3-integrint expresszáló humán melanóma vonalakat állítottunk elő, amelyekbe aIIb és b3 gént transzfektáltunk. A klónok aIIb expresszióját mRNS és protein szinten kontrolláltuk. Valamennyi klón párhuzamosan expresszálta az av(b3) integrint, így modellezve a humán melanóma tumorok egyik fenotípusos jellegzetességét, a fokozott avb3 expressziót (Trikha et al.IJC2002). 1. táblázat. Sejtfelszini b3 integrin expresszió human melanoma klónokban (flow cytometry) clone 3.1 mock ESL 8F3 19L ESH 19H
aIIb 0.66+0.7 6.7+3.4 8.0 12.3+4.9 22.5+7.7 27.2+3.9
b3 80.0+3.2 64.0+3.0 79.0 67.0+5.6 69.3+2.3 78.0+6.2
avb3 44.0 31.0 nd 10.5 13.0 28.4
Data are in % of positive cells (aIIb and b3: mean+SEM, n=3-6, avb3: average of two samples), nd= not determined
A transzfektánsok in vitro proliferációs képességei változatlanok voltak, ugyanakkor SCID egerekbe oltva a primer tumorok növekedési üteme eltért, a kettős b3 integrint expresszáló klónok szignifikánsan jobban növekedtek in vivo. 1. ábra. aIIbb3 transzfektált humán melanóma proliferáció in vitro és in vivo A/ In vitro növekedési ütem B/In vivo növekedés SCID egérben
absorbance (BRdU+)
2.0
3.1P 19L 19H
1.5
1.0
0.5
0.0 0.0
volume (mean+SEM, mm3)
15
3.1P 19L 19H
10
5
0 2.5
5.0
7.5
10.0
0 1
2
3
4 5
6 7
8
9 10 11 12 13 14
days
cell number (x103)
Ez ellentmondásban látszott állni az in vitro eredményekkel, így megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy emögött nem állhat-e fokozottabb vaszkularizáció és megállapítottuk, hogy a transzfektánsokból képződő tumorok érdenzitása szignifikánsan emelkedett (Döme et al.2004).
2
2. ábra. Transzfektáns melanóma klónok intratumorális érdenzitása SCID egérben A/ érdenzitás CD31 jelölés alapján
*
20
15
10
5
0
100
% positive cells
MVD/field (mean+SEM)
B/ VEGF és bFGF protein mérés flow cytométerrel
VEGF bFGF
75
50
25
0
3.1P
19L
19H
3.1
19L
19H
Következő lépésként megvizsgáltuk, hogy a két fő melanóma-angiogenetikus faktor expressziója milyen a transzfektánsokban. Immuncytokémiai és flow cytometriai vizsgálataink kimutatták, hogy változatlan és maximális VEGF expresszió mellett az alapklónban minimális a bFGF expresszió, míg az aIIbb3 transzfektált (tehát av- és aIIb-b3 integrint egyaránt expresszáló klónokban csaknem 100%-os lett a bFGF expresszió amit az in vivo növekedő tumorokban is igazoltunk (2b. ábra). A fokozott bFGF expresszió mögött két nagyságrenddel megnövekedett bFGF mRNS szint áll kvantitatív PCR vizsgálataink alapján (Dömet et al.2005). Jelenleg folyó vizsgálataink arra keresik a magyarázatot, hogy humán melanómában milyen genetikai tényezők játszanak szerepet az egyes szervekbe történő áttétképző képességben. Vizsgálataink szerint ugyanis egyazon tumor a különböző szervekben szignifikánsan eltérő extravazációs képességgel rendelkezik (Paku et al. 2001). Valamennyi transzfektáns klón több szervbe is képes áttétet képezni (tüdő, máj, agy, csont) ezek között csak az áttétképzés hatékonyságában van eltérés, mert az aIIbb3 transzfektált klón(ok) fokozott májáttétképző képességgel rendelkeznek.
2. táblázat. Metasztázis incidencia különböző szervekben b3 integrin transzfektált human melanoma klónokban clone 3.1P ESL ESH 19L 19H
Tüdő (i.v.)
Máj (i.s.)
Agy (i.c.)
Csont (i.c.)
100 83 100 86 100
100 100 100 100 80
100 50 75 60 100
83 80 75 40 75
A tumorsejteket (106/animals) i.v. (tüdő), intrasplenikusan (máj) illetve intrakardiálian (agy, csont) injektáltuk SCID egerekbe. 4-6 hét után az állatokat Nembutallal túlaltattuk és az egyes szervekben az áttéteket sztereomikroszkóp alatt számoltuk meg. Minden csoportban min. 5 állat volt. Az adatok az áttétek %-os gyakoriságát jelenti a csoporoton belül.
3
3. ábra. aIIbb3 transzfektált melanóma klónok májáttétképző képessége SCID egérben
májáttétek száma
300
3 .1 P ESL ESH 19L 19H
250 200 150 100 50 0
3.1P
ESL
ESH
19L
19H
a IIb - k ló n o k 1.2.A két b3 (α αIIβ β és av) integrin paralell expressziójának következményei: angiogenetikus fenotípus Vizsgálataink arra utaltak, hogy az αIIbβ3 integrin transzfekciója αvβ3-at expresszáló humán melanóma vonalakba fokozza az apoptosis resistenciát, aminek következtében a sejtek tumorigenicitása növekedett. Ehhez azonban hozzá járult az is, hogy az in vivo növekedő tumorok kifejezettebb érdenzitással rendelkeztek, aminek egyik oka az volt, hogy a vizsgált transzfektáns klónban nagyságrendekkel emelkedett a bFGF expressziója, míg a VEGF szint konstitutíven magas maradt. Annak igazolására, hogy az αIIbβ3 pozitív humán melanóma klónokban emelkedett az bFGF expresszió, szubklónoztuk az eredeti populációt és a kapott mintegy 10 klónt is megvizsgáltuk bFGF expresszióra qPCR módszerrel (Dömet et al.2004). 4. ábra. aIIb és bFGF expresszió kapcsolata transzfektáns humán melanóma klónokban (cytokémia és qPCR)
(% of cells)
α IIb protein expression
20 15 10 5 0
3 .1 P
ESL 8F3 19L ESH ( t r a n s f e c t e d c lo n e s )
.8 .6 .4 .2 .0 .8 .6 .4 .2 .0
(Q-PCR relative unit)
1 1 1 1 1 0 0 0 0 0
25
bFGF mRNA expression
30
19H
Ahogy azt korábban bemutattuk, humán vizsgálataink arra utaltak, hogy a melanóma vastagságával (nagyságával) az αIIbβ3 integrin expressziója nő, míg az αvβ3 expresszió konstitutiven magas marad (Trikha 2002). Ezt a gondolatot emberi melanómás beteganyagon teszteltük, ahol kimutattuk, hogy az eltérő vastagságú és klinikai kimenetelű primer melanómák esetében, bár a peritumorális érdenzitás sokkal nagyobb mint az intratumorális, mégis az utóbbi denzitása függött csak össze az 5 éves túléléssel és a zsigeri áttétek kialakulásával (Döme et al.2002). Ezek a megfigyelések azt erősítették, hogy az intratumorális érdenzitás növekedése felelős a szervi áttétek kialakulásáért a használt
4
melanoma modellekben és felvetették, hogy ezért esetleg a megjelenő aIIb(b3) integrin és következményes bFGF expresszió felelhet. Kérdés volt továbbá, hogy a megnövekedett angiogenetikus képesség ténylegesen milyen érellátási formára való készséget jelent. Irodalmi adatok és saját vizsgálataink arra utalnak, hogy melanómában például elsősorban nem a klasszikus neoangiogenezis zajlik mint fő érellátási forma, hanem ér-kooptáció a domináló (Döme és mtsai 2002), de az un. vaszkuláris mimikri is gyakori jelenség (Hendrix 2003, Tímár és mtsai 2001). Genetikai vizsgálatok szerint a vaszkuláris mimikri hátterében endoteliális gének neoexpressziója állhat. DNS chip vizsgálataink szerint a 19H transzfektáns vonalban, melynek intratumorális erezettsége jelentősen megnő több un. endotél-specifikus gén fokozott expressziója figyelhető meg: CD34, endotelin receptorB, PI2 szintáz, ami felveti annak a lehetőségét is, hogy az aIIb ektópiás expressziója lehet egy olyan genetikai változás melanómában amely az endoteliális genotípus egyes elemeinek megjelenését indukálja. 1.3. A két b3 (α αIIβ β - és av-) integrin paralell expressziójának következményei: jelátvitel Az αIIbβ3-/+ humán melanóma klónokban microarray vizsgálattal teszteltük a génexpressziós változásokat egy 3200K humán cDNS chipen az SZBK DNS-chip laboratóriumával kollaborációban. Első elemzéseink azt mutatták, hogy az αIIbβ3 transzfektáns humán melanóma klónban az integrin-asszociált jelátviteli pálya több eleme is fokozottan expresszált: így a ABL, FYN, NEC2/3, TEC tirozin kinázok, valamint a farneziltranszferáz és a K-ras. (Fokozódás alatt >3x míg csökkenés alatt <50% expressziós változást tekintettünk). A lipid-szignálút vonatkozásában feltűnő volt a PLA2, a PI-3K számos cyclooxygenáz és az általunk már korábban megfigyelt PKCα izoforma fokozott expressziója. (Ugyanakkor csökkent volt a FAK és a MAPK expresszió). 3. táblázat. Metasztatikus szignálútvonal expressziós változásai in vivo metasztatizálás során aIIbb3 transzfektáns melanóma sejtvonalakban klón 3.1 (>3x) 19H (>5x) Tirozin-kaszkád c-abl EphA2 TEC NEK2 NEC3
Szerin/treonin kaszkád
PKA PKCa
K-ras Farnezil transzferáz PI3K PLA2 PKCa PKCb
Ezen vizsgálatok több ponton is megerősítik korábbi megfigyeléseinket az ektópiás αIIbβ3 melanóma sejtekben zajló jelátviteléről, hogy az ektópiás megakaryocyta integrin (αIIbβ3) jelátvitele FAK-gátlással, illetve fokozott arachidonsav bomlással és fokozott 12-LOX és PKC aktivitással jár (Rásó et al.2001). A kérdés azonban továbbra is fenn maradt, milyen molekuláris mechanizmus vezet az ektópiás aIIb(b3) integrin expresszió esetében a jelentős génexpressziós profilbeli változásokhoz. Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a b3 integrin lánc különleges abban a tekintetben, hogy citoplazmatikus doménje endonexin fehérjével áll kapcsolatban (Shattil,1995). Az endonexin kétféle szerepet tölt be, egyrészt a b3 lánc jelátvitelét 5
szabályozza, mediálja egy közelebbről még nem ismert módon, másrészt transzkripciós faktorként is szerepel, s így ennek révén a b3 integrin aktiválódása direkt transzkripciós változásokat indukálhat. Ismert target génjei a THRA, RXR, NFkB és a cyclinA (Ohtoshi,2000). Ennek ismeretében felmerült, hogy emberi melanómákban a b3 integrin fokozott expressziója endonexinen keresztül jelentős transzkripciós változások kiváltója lehet. 1. táblázat. Endonexin expresszió humán melanómában in vitro (QPCR/+ DNSchip)
WM35 (nem metasztatikus) HT199 A-2058 WM983B 3.1P 19H
Q-PCR 1 1.9 1 1 0.3 6.5
Különböző biológiai aktivitású humán melanóma vonalainkban in vitro meglehetősen egyenletes szinten van a b3endonexin expresszió QPCR vizsgálatok szerint. Feltűnő ugyanakkor, hogy az igen alacsony aIIb expressziójú (csak avb3-at kifejező) 3.1P klónunkban milyen alacsony az endonexin expresszió és ehhez képest az aIIbb3 transzfektált 19H vonalban ez a szint több mint 20x magasabb. Ez a jelentősen megemelkedett endonexin expresszió már magyarázatot adhat az észlelt globális génexpressziós változásokra. Továbbmenve azt is megvizsgáltuk, hogy hogyan alakul az b3endonexin expresszió in vivo körülmények között a tényleges áttétképzés során. Olyan modellt használtunk SCID egerekben, amikor spontán áttétképzés csak újszülött egerekben van, felnőttben nincsen és a kétféle primer tumort hasonlítottuk egymáshoz, illetve a primer tumort a belőle keletkezett áttétéhez. A 3.1P vonal esetében a kétféle primer tumor között gyakorlatilag nem volt jelentős endonexin expresszióbeli eltérés csak az áttétekben emelkedett meg a szint ~5x mértékben. A 19H vonal esetében ezzel szemben már a metasztatikus primer tumorban létrejött egy 5x mértékű endonexin expresszió fokozódás amely az áttétekben már nem emelkedett tovább. 5. táblázat. Endonexin expresszió in vivo aIIbb3 transzfektáns klónokban (DNS chip)
3.1P 19H
Metasztatikus primer/ Metasztázis/primer Nem-metasztatikus primer <0.6 >5 >5 <0.9
Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a b3 integrin asszociált transzkripciós faktor endonexin expressziója az emberi melanóma áttétképzése során jelentősen fokozódik. Felmerül annak a lehetősége, hogy endonexin expresszió alapján esetleg prognosztizálni lehet a primer tumor alapján annak későbbi biológiai viselkedését/áttétképzését is. Ehhez azonban a piacon még nem létező monospecifikus antitest előállítására van szükség.
6
2./ A tumorsejtek ektópiás génexpressziójának felhasználása a differenciál diagnosztikában 2.1. Az ektópiás aIIbb3 genetikai szerkezete Vizsgálataink során állandó problémát okozott az annak a ténynek a magyarázata, hogy szemben a trombocitával daganatsejtekben az ektópiás aIIb(b3) integrin minden kisérleti adatunk szerint un. aktív magas affinitású konformációban van jelen (Trikha et al.1997, Tímár et al.1998). Normális körülmények között ez más integrinek esetében csak ligand-kötéskor, trombociták esetében pedig aktiválódáskor jön létre. Felmerült az, hogy ennek a konstitutív aktív konformációnak, aminek funkcionális következménye az állandóan bekapcsolt jelátviteli pálya (FAK tirozin-fiszforiláció) esetleg az aIIb lánc szerkezeti változása állna. Kollaboráló munkacsoportom bemutatta, hogy az aIIb integrin-lánc daganatokban citoplazma-domén hiányos formában is megjelenhet (Trikha 1998). A nyitott kérdés csak az volt, hogy ez új splice variáns-e vagy igazi génkárosodás eredménye. Ezek a megfigyelések fordították figyelmünket az aIIb lánc szerkezetének vizsgálatára, ugyanis az emberi örökletes véralvadási/trombasténiás zavarok jelentős részében az aIIb integrin lánc mutációja mutatható ki, azonban ezen károsodások valamennyien az integrin extracelluláris doménjét érintik. A különféle trombasténiákban vagy maga a ligand kötő régió vagy az un Ca-kötő béta-propeller régiók (amelyből 4 van az aIIb láncban) károsodnak (Mitchell,2003). Ezért olyan primereket terveztünk amelyek aIIb specifikus Ca-kötő domén azonosítására alkalmasak. A probléma azért nehéz, mert ebben a régióban (is) meglehetős homológia van a másik, sokkal gyakoribb integrin az αv vonatkozásában. 5. ábra. aIIb lánc mRNS kimutatása humán melanómában nested PCR és qPCR segítségével. A/ nested PCR: αIIb extracelluláris régió outer primer gradiens és ionkoncentráció kalibráció
B/ Real-time PCR kalibráció: 250mM, 65°C – zöld: extracelluláris régió – outer lila: intracelluláris régió - outer
Az aIIb extracelluláris doménjét a 19H aIIbb3 transzfektánsban vizsgáltuk nested PCR segítségével. Meglepetésünkre 2 reakció-terméket kaptunk, melyek szekvenálása során a várt és autentikus (wt) aIIb mellett egy kisebb termék is megjelent a 19H sejtekben. A termék
7
szekvenálása a 1144-1152 nukleotida régióban deléciót jelzett, ami gyakorlatilag 3 aminósav deléciónak felelhet meg (372-373-374).
6. ábra. aIIb extracelluláris domén nukleinsav és aminósav szekvencia jelölve a 19H melanómában észlelt eddig még pontosan nem jellemzett eltérést. A/ nukleinsav-szekvencia 1081 accgaaaact ggccgaagtg gggcgtgtgt atttgttcctgcagccgcg ggcccccacg 1141 cgctgggtgc ccccagcctc ctgctgactg gcacacagct ctatgggcga ttcggctctg 1201 ccatcgcacc cctgggcgac ctcgaccggg atggctacaa tgacattgca gtggctgccc
B/ aminósav sorrend 301 ldsyyqrlhr lraeqmasyf ghsvavtdvn gdgrhdllvg aplymesrad rklaevgrvy 361 lflqprgpha lgapsllltg tqlygrfgsa iaplgdldrd gyndiavaap yggpsgrgqv 421 lvflgqsegl rsrpsqvlds pfptgsafgf slrgavdidd ngypdlivga yganqvavyr
A 1144-1152 régió (AA372-374) az aIIb nehézlánc Ca-kötő 2. béta-propeller régiójában helyezkedik el. Irodalmi adatok szerint a 374 pozicióban aminósav-csere megakadályozza az érett aIIb lánc keletkezését, trombasténiát okoz (Michell,2003). Mutagenezis vizsgálatok ebben a régióban azonban azt is kimutatták, hogy a környező aminósavak is befolyásolják a Ca++ kötést és az aIIb lánc érését és a 372-374 régió bizonyos aminósav-cseréi az aIIb lánc fokozott stabilitásához és ami ennél is érdekesebb, az un. aktív, magas affinitású konformáció konstitutív kialakulásához vezethet. Saját funkcionális vizsgálataink a humán melanóma vonalainkon azt mutatják, hogy különböző mértékig de az aIIbb3 komplex magas affinitású konformációban van jelen a sejtfelszinen és igen ritka az aIIbb3 hiánya, különösen nem áll ez a 19H klónra. A megfigyelt Ca-kötő régió-beli aminósav deléció nagy valószínüséggel nemhogy nem akadályozza meg a kóros fehérje felszinre jutását aIIbb3 komplexben, hanem valószínüleg a konstitutív aktiváltság egyik okozója is lehet. Másik okként természetesen az aIIb lánc citoplazmatikus domén-deléciója is állhat (ami a transzfektáns modellünkben természetesen nem állhat fenn). Ezek a vizsgálatok arra irányítják figyelmünket, hogy egy adott adhéziós molekula expressziója malignus daganatban önmagában még nem szolgáltat elegendő magyarázatot az esetleges különös vagy domináns funkciójára, annak hátterében génszerkezeti eltéréseket is érdemes keresni..... 2.2.Melanóma-specifikus gének expressziójának vizsgálata klinikai anyagban Korábbi globális genomikai vizsgálataink során több olyan gén expressziójára figyeltünk fel, melyek nevushoz képest fokozott expressziót mutattak és ezt qPCR módszerrel is igazolni tudtuk. Ezek között a sejtciklust szabályozó cyclinE, a neurogén sejtek egyik receptora a cannabioid receptor-1 és szívizom Ca-csatornája a ryanodin receptor 2 voltak. Kérdés volt, hogy ezeket a géneket fehérje szinten is ki tudjuk-e mutatni sebészeti mintákban és vajon paraffinos anyag is elegendő erre. 20 –20 nevus és melanóma vizsgálata alapján egyik fenti fehérje sem mutatható ki paraffinos melanóma mintákban a jelenleg hozzáférhető antitestek segítségével. Ugyanakkor valamennyi fehérje megbízhatóan detektálható fagyasztott anyagban, ebből azonban csak 10-10 paralell minta állt rendelkezésre. A cyclin E esetében elsősorban magi reakciós mintázatot kaptunk, bár a melanómák egy részében intenzív cytoplazmatikus reakció is észlelhető volt. A minták között több negatív melanómát is találtunk ugyanakkor a nevusok negatívnak bizonyultak immuncytokémiai vizsgálattal.
8
7. ábra. Cyclin E protein kimutatása nevusban (A) és VGP melanómában (B). A B
A nevusban a laphámsejtek pozitívak, míg a nevus sejtek negatívak. A melanóma sejtek intenzív magi és cytoplazmatikus reakciót mutatnak. Magfestés (piros), cyclin E (zöld). Immunfluoreszcencia.
RyR2 fehérje esetében a fentiekhez nagyon hasonló mintázatot kaptunk, bár ez a fehérje egyértelműen cytoplazmatikus lokalizációjú volt az SSM melanómákban. 8. ábra. Ryanodin Receptor-2 kimutatása nevusban (A) és SSM melanómában (B) immunfluoreszcens módszerrel. A B
A nevussejtek negatívak (A: zöld fluoreszcencia), míg a melanóma sejtek (B: zöld fluoreszcencia) erősen pozitívak RyR2-re. A sejtmagok pirosan fluoreszkálnak.
A továbbiakban a CB1 cannabioid receptor fehjérjét kiséreltük meg kimutatni emberi melanóma sejtvonalakban amihez igen agresszív biológiai viselkedésű vonalakat használtunk: a HT199 és M1-et melyek genetikailag egymással nem állnak kapcsolatban. Immunfluoreszcens vizsgálattal igazoltuk, hogy humán melanóma sejtvonalakban a CB1 receptor protein kimutatható, mégpedig 2 lokalizációban, a sejtfelszinen illetve cytoplasmában (ez nem csoda), de meglepő módon nagy mennyiségben van jelen a sejtmagban is amire nézve eddig még nem találtunk magyarázatot.
9
9. ábra. CB1 receptor kimutatása emberi melanóma sejtekben in vitro (immunfluoreszcencia) A/ HT199 humán melanóma sejtek B/ M1 humán melanóma sejtek
Cytoplazmatikus CB1 reakció A sejtmag pirosan jelölt.
Nnukleáris CB1 reakció (zöld).
Az elmúlt években számos közlemény jelent meg arról, hogy endogén cannabioidok jelentősen képesek különféle daganatféleségek proliferációját illetve apoptosisát befolyásolni, az adatok többsége proliferáció gátlásról és apoptosis indukcióról szól, ami in vitro és in vivo is kiváltható. (Bifulco, Di Matzo, Nat Med 8:547-550,2002). A vizsgálatok kimutatták, hogy a hatásért általában a CB1 receptor expresszió felelős, illetve annak daganatos szignalizációja melynek downstream targetje az EGFR illetve MAPK lehetne… Mindezen adatokról még nem tudva, magunk emberi melanóma sejtvonalak globális génexpressziós mintázatát tanulmányozva észleltük, hogy ezek CB1 mRNS-t tartalmaznak. Természetesen a kérdés az hogy ez a receptor funkcionálisan aktív-e. Ezért megvizsgáltuk 2 CB1 ligand biológiai hatásait több humán melanóma sejtvonalunkon és meglepő módon azt kaptuk, hogy mind a CB1 agonista 2met-F-AEA, mind a CB1 antagonista AM251 jelentősen gátolta a sejtproliferációt: az IC50 mindkét esetben 5 µM körül volt. Azt azért ehhez hozzá kell tenni, hogy a hatás elsősorban az apoptosis-érzékeny szérum-mentes közegben volt ilyen pregnáns, szérum jelenléte az IC50-et csaknem egy nagyságrenddel megemelte! 10. ábra. 2MetF-AEA CB1 agonista és AM251 CB1 antagonista hatása M1 melanóma in vitro proliferációjára (szerum mentes közegben) 0 .8
M et-F -AE A AM 251
0 .7
cell density
0 .6 0 .5 0 .4 0 .3 0 .2 0 .1 0 .0 0
5
10
15
20
µM
A melanóma az egyik legagresszívebb roszindulatú daganat mely egyben igen rezisztens a kemoterápiás szerekre. Ennek hátterében az áll, hogy a melanocyta és a melanóma sejtek is apoptosis rezisztensek. Azt tartja a köztudat, hogy az apoptosis rezisztencia áttörése nélkül nem lehet ezt a daganatot gyógyszeresen kezelni. Ebből a szempontból lenne jelentősége a melanóma CB1 receptorát moduláló farmakológiának….Ehhez azt kell igazolnunk, hogy melanóma esetében apoptosis indukcióról van szó, (más daganatokban is ez történik: emlőrák, prostatarák, vagy glioblasztóma). Pozitív esetben érdekes farmakológiai lehetőséget rejthet a funkcionális CB1 receptor jelenlétének kiaknázása emberi melanómában.
10
3./ A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása a tumorok individuális viselkedésének predikciójára • 3.1.Progressziós oligo- chip készítése • 3.1.1.Humán melanóma Az áttétképzés folyamatának kutatásában a microarray technika jelentős előrehaladással kecsegtet. Alkalmazásának azonban gátat szab, hogy a műtéti anyagokból származó minták lokalizációja, stádiuma valamint a host genetikai és fiziológiai státusza egyaránt rendkívül heterogén mintázatot mutat. Célunk egy olyan kísérletes metasztázis modell kidolgozása volt, amely a lehető legtöbb paraméter szempontjából standardizálható, ismételhető és az azonos típusú, de különböző genetikai eredetű humán tumoroknak, jelen project esetén humán melanómák vizsgálatára egységes platformot biztosít, amely alapján a valóban host vagy tumor eredetű változásokra lehet a kérdéseinket fókuszálni. A vizsgálatok végső célja az, hogy a melanómák un. metasztatikus génexpressziós újjlenyomatát meghatározzuk, miután erre nézve csak igen kezdetleges adatok állnak rendelkezésre, szemben pl. az emlőrákkal. A modell alapja az a tény, hogy veleszületetten vagy mesterségesen immunszupprimált újszülött rágcsálókban számos olyan humán tumor ad megbízható gyakorisággal áttétet, amely kifejlett állatokban soha. Ily módon lehetőségünk van arra, hogy genetikailag gyakorlatilag azonos hostba, azonos időpontban, azonos lokalizációba, azonos tumorsejt-szuszpenziót implantáljunk. A különbség a két host között fiziológiás, ám az áttétképzés szempontjából mégis döntőnek bizonyul. Mivel a tumor stromális komponensei host eredetűek, a host és tumor eredetű változások külön speciesspecifikus DNS-chipen (egér ill. humán), azonos mintából vizsgálhatóak. Az áttétek könnyen hozzáférhetőek, azaz azonos időpontban hasonlíthatjuk össze a primer és az áttéti tumor génexpressziós mintázatát is – és ezt is a stromális komponensek zavaró hatása nélkül. Veleszületetten immunhiányos újszülött (a születéstől számított 24 órán belül) és kifejlett scid/scid egérbe ugyanazon humán melanóma sejtvonal in vitro tenyészetéből származó egysejtszuszpenzióját implantáltunk azonos szubkután régióba (szemiortotop implantáció). A kiértékelés két időpontban történt, a tumor implantációjától számított 7. és 21. napon. A 7. napon a makroszkóposan színes gombostűfejnyi tumorból és környezetéből totál RNS-t izoláltunk. Ugyancsak RNS-t izoláltunk azonos alomból származó 7 napos állatok megfelelő szöveti régiójából. A 21. napon kizárólag a tokkal körülhatárolt primer tumort távolítottuk el mindkét állatcsoportból, illetve a tüdőáttéteket vágtuk ki egyenként az újszülöttként implantált állatok tüdejéből. Ugyanezen kísérletet három, genetikailag különböző eredetű humán melanóma sejtvonallal (WM983B, HT168M1, HT199) párhuzamosan végeztük el. Az expressziós mintázat változásának kiértékelését a 21. napon 18.000 gén-specifikus probeot (Operon-SIGMA) hordozó humán oligonucleotide microarray-vel (SZBK, Dr. Puskás László – Biorobotics TAS spotter) végeztük el. Szignálamplifikációt (Genisphere) követően a Cy5-jelölt mintákat Ventana Discoveries automata hibridizációs rendszerrel hibridizáltuk és olvastuk le. Az egyszínű jelölés lehetőséget nyújtott (az Affymetrix rendszeréhez hasonlóan) valamennyi minta összes más mintához történő összehasonlítására. A statisztikai elemzést Lowess normalizáció és T-teszt segítségével végeztük el. Az M és A értékeket alapján határoztuk meg azokat a géneket, amelyek expressziós változása szignifikánsnak volt tekinthető. A 7. napon nyert minták kiértékelésére a tumor eredetű faktorok esetén az Agilent 41,000 génre specifikus (60-mer oligo próbákat hordozó) Whole Human Genome Oligo Microarray Kit-jét, a host eredetű faktoroknál az Agilent 20,000 egér eredetű génre specifikus (ugyancsak 60-mer oligo próbákat tartalmazó) Agilent Mouse Oligo Microarray Kit-jét használtuk. A mintákat amplifikálás nélkül Cy3 és Cy5-jelölést követően páronként
11
egymással szemben hibridizáltuk és Agilent Microarray Scanner segítségével olvastuk le és a cég által biztosított Agilent Feature Extraction Software segítségével értékeltük ki. Az implantációtól számított 21. napon az újszülöttként implantált állatokban minden esetben tüdőáttétet, esetenként agyi és nyirokcsomó áttéteket találtunk. Kifejlett állatokban lényegesen hosszabb túlélés esetén sem tapasztaltunk áttétképzést ebből a lokalizációból egyetlen humán melanóma esetén sem Ez a modell számos előnnyel szolgál az áttétképzésben (potenciálisan) résztvevő gének felderítése szempontjából. Először is lehetőséget kínál annak eldöntésére, hogy az áttétképzésre alkalmas sejtpopuláció szelekcióját host vagy tumor eredetű tényezők befolyásolják. Azaz a host által biztosított környezet szelekciós nyomást gyakorol a kiindulási, in vitro tenyészetből származó sejtpopulációra, és ily módon egy olyan primer tumor alakul ki, amelyben már jelen vannak az áttétképzésre alkalmas sejtek. Ebben az esetben lényeges különbséget kell találnunk a kifejlett és az újszülött állatban kinőtt, azonos korú primer tumor génexpressziós mintázata között. Ez a szelekció, mivel ezen inbred állatok genetikai állománya gyakorlatilag azonos, azonos az implantáció lokalizációja, tehát a szöveti környezet is, mindössze a host fiziológiásnak tekinthető állapotkülönbségével, azaz a újszülött státusszal hozható összefüggésbe. A modell ebben a tekintetben egészen különleges lehetőségeket kínál a xenograft tumorok jól ismert szövettani sajátságai miatt. Ezen tumorokban ugyanis kizárólag a tumor humán eredetű, míg a stromális komponensek (kötőszövet, erek) host, azaz egér eredetűek. Amennyiben tehát a tumor génexpressziós mintázatában mutatkozó különbségeket szeretnénk vizsgálni, humán microarray-el nagy valószínűséggel megtehetjük. Nem szembesülünk azzal a humán műtéti anyagból származó mintákban oly gyakori problémával, hogy a tumorból származó RNS pool a stromális komponenseket is tartalmazza, annak arányától függően jelentősen torzíthatja „hígíthatja” a tumorra jellemző RNS mintát. Mivel a standardizálásra használt géneket a stromális komponensek is ugyanúgy expresszálják, a hígítás mértékét nem lehet kontrollálni. Izgalmas lehetőség, hogy eldöthető, hogy bizonyos, potenciálisan a host és a tumor által egyaránt expresszálható génekről eldönthető, hogy mely komponensből származnak. Ami ennél is lényegesebb, az újszülött és a kifejlett állat által a tumor számára „nyújtott” host eredetű faktorok egér microarray segítségével egyértelműen meghatározhatók és összevethetők. Mivel az eredmények validálása (humán gének esetén az Applied Biosystems TaqMan kártyája segítségével, host eredetű gének esetén kvantitatív PCR-ral, egyedileg tervezett primerekkel) most van folyamatban, végleges génlista még nem közölhető. 11. ábra. Humán 42000 oligochip hibridizálás M1 humán melanóma metasztatikus és nemmetasztatikus primer tumorának RNS-ével. A/ Oligo-chip spot-fluoreszcencia
B/ Génexpresszió változások megoszlása
A 21. napon vett minták alapján levonható következtetések (kizárólag olyan géneket figyelembe véve, amelyek a három tumor közül legalább kettőben több mint 2-szeres különbséget mutattak):
12
Az áttétképző és nem-áttétképző sajátossággal rendelkező primer melanómák (újszülött szubkután vs felnőtt szubkután) 72 eltérő módon expresszálódó gént hordoztak. Ez a szám a szelekciós teóriát támasztja alá, mivel lényegesen több, mit az újszülött primer tumora és tüdőáttéte közötti 42 gén különbség. Különösen ha tekintetbe vesszük, hogy ezen gének egy része nagy valószínűséggel az új mikrokörnyezet (szubkután vs tüdő) hatására váltott expressziós mintázatot. Érdekes módon feltűnően sok mRNS-splicingért felelős gén mutatott szignifikáns eltérés ebben az összehasonlításban. A legnagyobb különbséget (103 gén) az in vitro tenyészet (amiből a szubkután implantációk megtörténtek) és a szubkután növő tumor expressziós mintázatában találtunk, amely a tenyészeteken végzett kísérletek korlátolt értékelhetőségére hívhatja fel a figyelmünket.
A 7. napon értékelt minták esetében 846 up és 1175 down-regulált humán gén mutatott 2-szeresnél nagyobb expressziós különbséget egybehangzóan legalább kétféle humán melanóma esetében. Ez a változás arányaiban lényegesen nagyobb, mint a 21. napos változás. Az eltérő platformon kívül a host esetleges változása (az újszülött „felnő”) is magyarázhatja ezt a jelenséget. Az újszülött esetén szelekciós nyomást gyakoroló faktorok eltűntével ugyanis a tumor genetikai instabilitásának köszönhetően az új faktorok által támogatott populációkkal gyarapszik, s ezzel „kihígul” az áttétképzésre jellemző expressziós mintázat. Különös tekintettel figyelünk azon génekre, amelyek megváltozott expressziója a 21. napra még mindig megtartott. Az egér-gének vizsgálatakor (inváziós host) 36 down és 46 upregulált gént észleltünk (p<0.001) ami alaposan leszűkíti a szelekciós nyomásért felelőssé tehető faktorok számát. Ennek kiszűrése és a humán műtéti anyagok stromájából a megfelelő humán gének expressziójának kimutatása teljesen újszerű eredményeket ígér. 3.1.2. Fejnyaki laphámrák Régi klinikai megfigyelés, hogy a különböző anatómiai lokalizációjú fejnyaki rákok esetében a klinikai lefolyásban jelentős eltérések vannak, bár a szövettani típus vagy a klinikai stádium igen hasonló. Ennek egyik lehetséges magyarázata lehet az, hogy ugyanazon daganattípus génexpressziós profilja az anatómiai környezet (normál szövet) hatására eltérő lehet. Ennek tisztázására húsz glottikus gégerák esetében az un. metasztázis gének expressziós mintázatát vizsgáltuk egy 96 génből álló Superarray makrochip segítségével. A daganatokat larynngeaális és hypopharyngealisakra osztottuk és eltérő expresszió határának a 2x különbségeket vettük. A vizsgált 96 gén közül 18 esetében találtunk eltérő expressziót a két anatómiai lokalizációban (20%). Vizsgálataink szerint a jobb prognózisú laryngeális daganatokban 3 metasztázis szuppresszor gén: NME4, DCC és E-cadherin1 jelentős expressziót mutat a hypopharyngeális tumorokhoz képest, ami alátámaszthatja ezen tumorok kevésbé aggresszív viselkedését. Ugyanakkor a laryngealis rákokban számos u. metasztázis asszociált gén expressziója mutatható ki (integrin a5/a6, MMP1, CD44, osteopontin) amelyek nincsenek jelen a hypopharyngeális rákokban, igazolva azt, hogy a két daganatféleség progressziós képessége jelentősen eltérhet (1. táblázat).
13
6. táblázat. Glottikus tumorok differenciált metastasis-asszociált génexpressziója (SuperArray macrochip) Gene GeneBank
Description
nam
Larynx (n=5)
Hypopharynx (n=5)
e Rac1 NME1 S100A4 Osteopontin CD44 Integrin α5 Integrin α6 Collagenase1 PAI-1 Cystatin C DCC NME4 E-cadherin CD31 MT1-MMP
NM-006908 NM-000269 NM-002961 NM-000582 NM-000610 NM-002205 NM-000210 NM-002421 NM-000602 NM-000099 NM-005215 NM-005009 NM-004360 NM-000442 NM-004995
TMPRSS4 FGF2 c-Fes
NM-019894 NM-002006 NM-002005
Ras-related C3 botulinum toxin substrate Non-metastatic cell-1 protein (NM23A) S100 calcium binding protein A4 Secreted phosphoprotein-1 (osteopotin) CD44 antigen Integrin, alpha 5 (fibronectin receptor alpha) Integrin, alpha 6 Matrix metalloproteinase 1 (interstitial) Plasminogen activator inhibitor type 1 Cystatin C Deleted in colorectal cancer Non-metastatic cell-4, protein Cadherin 1, epithelial Platelet/endothelial adhesion molecule-1 Matrix metalloproteinase 14 (membraneinsert) Transmembrane protease, serine 4 Fibroblast growth factor 2 (basic) Feline sarcoma oncogene homolog
Human tumor metasztásis gene-array-t (SuperArray HS 007-N) használtunk 5-5 poolozott laryngeális és hypopharyngeális tumor exőressziós mintázatának megállapítására. A cDNS biotinylated-16-dUTP volt jelölve és chemiluminescens probával. A 4 párhuzamos spot intenzitását Alpha Innotech Chemi Imager 8900 készülékkel mértük. A gének expressziós szintjét GAPDH housekeeping genhez hasonlítottuk. Jelek: nincs= fehér, van=fekete, down-regulált=zöld, over-expresszált=piros, eltérés >2 fold
Hasonló következtetésekre lehetett jutni a génpolimorfizmus vizsgálatokkal: a DNS repair gének XRCC1 és XRCC3 polimorfizmusainak igen eltérő gyakorisága észlelhető a laryngealis illetve hypopharyngealis rákokban (Tímár és mtsai 2005). Ezek a megfigyelések előre vetítették annak a lehetőségét, hogy a kétféle anatómiai lokalizációban a rákok progressziója eltérő genetikai mechanizmusokkal történhet. A progresszióban szerepet játszó genetikai újjlenyomat meghatározására vonatkozó vizsgálatok eredményét az RP5. beszámoló tartalmazza.
14
3.2. Progressziós protein-chip tervezése (Németh P., PTE-IBI)
A projekt záró szakaszában elsősorban az anti-HBxAg ellenanyagon alapuló onkodiagnosztikai kit rendszer végső fejlesztéseit végeztük el. A kit egyik eleme a korábbi beszámolóban (2003. december) részletezett elméleti megfontolások alapján kifejlesztett immunszerológiai mérőrendszer, a másik, a szervezet immunológiai válaszreakciójának vizsgáló antitest meghatározás.A betegek vérszérumából történő HBxAg mennyiségi meghatározására kifejlesztésre került tesztrendszer is két részből áll: a.) individuális méréseket lehetővé tevő, un. ”szendvics ELISA” b.) fluoreszcens mikrogyöngy alapú multiparameteres vizsgálati esszé. Mindkét eljárás alapját azok az monokonális ellenanyag párok képezik, melyeket a korábban kidolgozott és rekombináns technikával expresszáltatott HBxAg ellen készültek. A teljes antigén elleni ellenanyag epitópjának meghatározása – az intézetben kidolgozott és publikált random fág könyvtár segítségével történt. A bioinformatikai analízis alapján kiválasztott második ellenanyag lehetővé tette, hogy mindkét esszét standardizálni lehessen. A szendvics ELISA alkalmas a rutin diagnosztikán kívül retrospektív és prospektív vizsgálatok elvégzésére. A mikrogyöngy alapú esszé más markerekkel történő korreláció vizsgálatára ad lehetőséget. Mindkét módszer fontos prognosztikai eszköz lehet az onkológus kezében, mert nagyfokú specificitásuk és érzékenységük a primér hepatocelluláris carcinoma rizikójának egyetlen előjelző markere jelenleg a HBxAg kimutatása. Mindkét esszé tesztelése megtörtént, a K+F fázisból a gyártási-forgalmazási fázisba történő átvitelük folyamatban van. A piacon jelenleg nincs hasonló szerodiagnosztikum forgalomban. A metodikák és a vizsgálati eredmények publikáció alatt állnak (Pál J, Pálinkás L, Nyárády Z, Czömpöly T, Marczinovits I, Lustyik Gy, Younes Saleh A, Berencsi Gy, Chen R, Varró R, Pár A, Németh P: Sandwich type ELISA and a fluorescent cytometric microbead assay for quantitative determination of Hepatitis B virus X antigen level in human sera. Hepatology, Manuscript ID: HEP-05-0022). A projekt másik részfeladatát a szervezet válaszreakciójának térképezése jelentette. Különböző – rekombináns technikával előállított – antigén fragmenseken végeztük a térképezést. A vizsgálatok eredménye azt mutatta, hogy a HBxAg molekula C terminális része a felelős az effektív humorális immunválasz (antitest termelés) kiváltásáért. Az elvégzett regresszió analízisek alapján egyértelműen azonosítani lehetett a C terminális fragmens szerepét a hordozóvá válás, ill. a krónikus hepatitisz kialakulásában. A vizsgálatok során sikerült a szűkebb szakasz térképezése is, ami alkalmas lehet további modellvizsgálatok után terápiás vakcina tervezésére. Az eredmények publikációja folyamatban van (Pál J, Nyárády Z, Marczinovits I, Younes Saleh A, Berencsi Gy, Németh P: The C terminal end of HBxAg is responsible for the efficient immune response against Hepatitis B virus: bioinformatic analysis of serum HBxAg level and the specific antibody production against their various epitopes.)
15
4./ Preklinikai vizsgálatok új innovatív antimetasztatikus terápiás eljárások kidolgozására •
4.1./ Antiaggregációs terápia 4.1.1.Thrombocyta αIIbβ β 3 –specifikus antitest terápia lehetősége melanómában Korábbi vizsgálatainkban bemutattuk, hogy b3 integrin-ellenes antitest kezeléssel (RheoPro) emberi melanóma tüdő-áttétképzése gátolható volt. Miután az antitest nem tesz különbséget a thrombocyta és daganatsejt aIIbb3 illetve az aIIbb3 illetve avb3 integrinek között, ezek az adatok csak felvetették annak lehetőségét, hogy a hatásért esetleg a melanóma sejtfelszini aIIbb3 is felelős lehet (Trikha et al.2002). Hogy a kérdést tovább vizsgáljuk B16a melanóma sejteket kezeltünk anti-aktív αIIbβ3 integrin antitesttel (PAC-1) 24-28 órára, ahol kontrollként IgM illetve a fiziológiás ligand, a fibrinogén szolgált. A kísérlet során meghatároztuk a mitózis-, apoptózis rátát és a sejtszámot. 24 órás antitestkezelés (2-20 µg/ml) nem okozott szignifikáns apoptózis szám emelkedést a kezelt sejtekben. Ugyanakkor 48 órára a mitózis-szám szignifikánsan (50%-kal) csökkent és a sejtproliferáció is drámaian lecsökkent. 12. ábra. PAC-1 antitest kezelés hatása B16a melanóma proliferációjára in vitro. A/ Sejtpoliferáció 48 óra B/ Mitózis szám 24 óra FBG PAC-1
2.5
2.0
1.5
1.0
0 0
0.1 0.2
1 2
10 FBG 20 PAC-1
15
number of mitosis/103 cells
cell density
3.0
10
5
0
concentration (µ µg/ml)
CTR
PAC-1
Ez a sejtproliferáció-gátlás lehetséges következménye lenne a jelátviteli kísérletekben PAC-1 hatásra bekövetkező foszfotirozin foszfatáz aktiválódásnak és következményes gátolt tirozinszignál-aktivitásnak. 13. ábra. PAC-1 kezelés hatása a tirozin foszforiláció dinamikájára B16 sejtekben
% positive cells
75
50
25
0 0
5
10
15
20
25
30
m in B16a sejteket in vitro inkubáltuk PAC1 antitesttel és a jelzett időpontokban mintát vettünk, melyekben a foszforilált tirozin-os fehérjéket immuncitokémiával jelöltük és a + sejtek százalékát flow cytométerben mértük.
Ezek a megfigyelések kisértetiesen hasonlítanak azon jelenségekhez, amit manapság több daganatféleségben leírtak. Az c-erbB2 amplifikált emlőrákokban és c-erbB1-et fokozottan kifejező laphámrákokban ezek a daganatsejtek a két tirozin-kináz un. konstitutív aktivitásával jellemzhetők és a receptor-ellenes un. gátló antitestekkel (extracelluláris domén16
specifikusakkal) a daganatsejtek proliferációját lehet gátolni és a daganatszövet növekedését fékezni, miközben a jelátviteli pálya kikapcsolódik. Melanóma-modell rendszerünkben az ektópiás aIIbb3 integrin konstitutívan aktivált állapotban van, amit a FAK konsitutív tirozinfoszforilációja igazol (Rásó 2001). Ezt a folyamatot a PAC-1 antitest fel tudja függeszteni (eddig még nem pontosan ismert módon), ami nem egyszerűen a ligand-kötő domén lefedése lehet, mert a fiziológiás ligand, a fibrinogén kezelés nem képes a sejtproliferációt leállítani a B16 sejtekben. Mindezek a kisérleti eredmények felvetették annak a lehetőségét, hogy antiaIIbb3 integrin elleni antitest-kezeléssel ilyen melanómák progressziója gátolható lenne. 4.1.2. LMWH heparin antimetasztatikus hatásának további elemzése Korábban bemutattuk, hogy az LMWH specifikus antimetasztatikus hatással bír. Egyes szerzők heparin ilyen hatásának vizsgálata során az endothel sejtekhez történő daganatsejt kitapadást és annak selectin mediált mechanizmusát tételezték fel. Ennek megfelelően mi is megvizsgáltuk humán melanóma sejtek és endothelsejtek felhasználásával, hogy az LMWH befolyásolja e az adhéziót. 14. ábra. M1 humán melanóma sejtek kitapadása emberi endotélsejt réteghez heparin és LMWH (Fragmin) jelenlétében in vitro (4 óra). 30
Control
number of adherent cells per field (mean ± SEM)
UFH LMWH
25
20
*p<0.05
*
15
*
10
5
0
Control
UFH
LMWH
Vizsgálataink szerint a pozitív kontrollként használt heparinhoz hasonlóan a Fragminnak (LMWH) is melanóma-endotél adhéziót gátló hatása volt, tehát ez lehet az egyik lehetséges magyarázat a korábban megfigyelt tüdőkolonizáció gátló hatásnak. További kérdés volt, hogy a keringésbe juttatott melanóma sejtek hová kerülnek LMWH hatása alatt. Korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy a célszervbe (tüdő) sokkal kevesebb daganatsejt jut el, más szervben pedig áttét nem keletkezik. Ezért az LMWH-val kezelt állatok véréből humán melanóma kimutatást végeztünk érzékeny q-PCR módszerrel amikor is a humán WT1 gént használtuk markerként.
17
15. ábra. Heparin és Fragmin (LMWH) előkezelés hatása a keringésben lévő melanóma sejtek számára SCID egérben 5
Control UHFFH LMWH H
4 3 2 1 0 5 min
60 min
Az állatokat a daganatsejtek i.v. bejuttaása előtt i.p. kezeltük humán ekvivalens dózis heparinnal illetve Fragminnal (200IU/kg). A bemutatott időpontokban vért vettünk, melynek sejtes elemeiből RNSt izoláltunk. Az adatok β-actinra normalizált relatív mRNS expressziót jelentenek és 3 mérés átlagai.
Megállapítottuk, hogy a daganatsejtek keringésbe juttatása után már 5 perccel jelentősen több daganatsejt reked a vérpályában LMWH kezelés alatt, mint anélkül és ez a hatás 60 percig áll fenn. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az LMWH kezelés egyrészt gátolja a melanóma sejtek endotélsejtekhez történő kitapadását a célszervben, emiatt a daganatsejtek tovább maradnak a keringésben és emiatt valószínűleg nagyobb eséllyel pusztulnak el (mivel más szervekben egyáltalán nem és a célszervben is csökkent mértékben képesek áttétet képezni). A célszervbe eljutott kevesebb daganatsejt pedig migrációjuk gátolt volta miatt nagyobb eséllyel pusztul el vagy lesz képtelen invázióra (korábbi kisérletek). •
4.2./ Az endocrin terápia lehetőségeinek kiterjesztése un. nem hormonérzékeny daganatokra Fejnyaki daganatok A kutatási project záró évében tovább folytattuk a fejnyaki daganatok hormonreceptor státuszának vizsgálatát. A hormonreceptor státuszt két alternatív módszerrel határoztuk meg, egyrészt fagyasztott mintában immuncytokémiai módszerrel vizsgáltuk az ösztrogén receptor (ER)a, ERb és a progeszteron receptor (PgR) fehérje tumorban történő jelenlétét fluoreszcens mikroszkópiával, majd a pozitív minták esetében adatainkat RT-PCR módszerrel is ellenőriztük és limitált esetben a kapott terméket meg is szekvenáltuk. Összesen 67 esetet vizsgáltunk ilyen kritériumok szerint, 24 szájüregi rákot és 43 glottikus tumort, az esetek döntő többsége férfi volt és a tumorok valamennyien laphámrákok. A fejnyaki daganatok 58.2%-a expresszált valamilyen sex hormon receptort és ebből a szempontból nem volt különbség a kétféle lokalizáció között. Jellemzően gyakoribb volt a többes hormonreceptor expresszió mint a szoliter és ezek között a leggyakoribb az ERa+PgR genotípus volt a leggyakoribb amit az ERa/b+PgR követett. Klinikai szempontból a funkcionális ER expressziónak lehet jelentősége az esetleges hormonterápia szempontjából, ezért külön is megvizsgáltuk az ER+PgR fenotípusú kombinációt, mert a PgR megjelenése ER mellett indirekt bizonyíték az ER funkcionális expressziójára, mivel a PgR ER transzkripciós kontroll alatt áll. A fejnyaki daganatok 41.8%-ban találtunk un. funkcionális ER expressziót, ami igen magas arány még az emlőrákokhoz képest is.
18
7. táblázat. Fejnyaki daganatok sex hormon receptor státusa (n=67) neg
ERa
ERb
ERa/b
PgR
ERaPgR
ERb+PgR ERa/b+PgR
Összes 28/67 0/67 (n=67) szájüregi rák 10/24 0/24 (n=24) Glottikus rák 18/43 0/43 (n=43)
1/67
5/67
5/67
15/67
4/67
9/67
0/24
4/24
0/24
6/24
1/24
3/24
1/43
1/43
5/43
9/43
3/43
6/43
A receptor pozitivitást immuncytokémiával és RT-PCR-ral határoztuk meg.
A 67 eset közül 48 esetében már rendelkezésre állt a 3 éves túlélési adat. A 48 daganat között 15 szájüregi rák volt, azonban ezek között nem volt kiegyenlített arányban receptor negatív tumor ezért a szájüregi rákok esetében nem lehetett statisztikai elemzést végezni, csak a glottikus tumorok esetében. A 33 glottikus tumoros beteg 3 éves túlélésének elemzése azt mutatta, hogy az ER negatív daganatos betegek túlélése lényegesen jobb mint a receptor pozitív eseteké (78.9% versus 42.8%). Hasonló eredményt kaptunk, amikor az un. funkcionális ER pozitivitás szempontjából vizsgáltuk a túlélést (ER+PgR+): mert a negatív csoportban 75% volt míg a pozitívban csak 46.2%. 16. ábra. Ösztrogén receptor státusz hatása glottikus rákok túlélésére survival fraction (%)
100
ER+ (n=14) ER- (n=19)
75
50
25
0 0
12
24
36
month Ezek a vizsgálatok elsőként igazolták molekuláris szinten, hogy a fejnyaki rákokban autentikus és funkcionális hormonreceptorok expresszálódnak. Előzetes adataink a vizsgált beteganyag mintegy felén azt mutatják, hogy az ösztrogén receptor expressziónak a túlélés szempontjából komoly prognosztikus ereje van. Ezen két megfigyelésünk alapján azt állítjuk, hogy a fejnyaki daganatok (de legalább is a glottikus tumorok) nagy valószínüséggel hormondependens daganatok és szelektív ösztrogén receptor antagonista gyógyszerekkel valószínüleg kezelni lehetne. A hipotézist klinikai vizsgálatban kellene tesztelni. Humán Melanoma Az irodalomban régóta folyik a vita, hogy humán melanóma hormonérzékeny daganat és hogy expresszálhat ösztrogén receptort. Korábbi vizsgálatainkban azt találtuk, hogy emberi melanóma vonalak kisérleti májáttétképzése jelentősen függött a host nemétől: a nóstány
19
állatokban sokkal kevésbé volt hatékony a folyamat. Ez felvetette azt, hogy a melanómákban ösztrogén receptor lenne és ez volna felelős az eltérésért. Jelen kutatási periódusban az un. glukokortikoid receptor család expresszióját térképeztük fel az általunk használt humán melanóma sejtvonal-panelen. A vizsgálatokat első lépésben RTPCR módszerrel végeztük és az ösztrogén receptorokat (ERa és b), a progeszteron receptort (PgR), az androgén receptort (AR) valamint a glukokortikoid receptort (GCR1) határoztuk meg. 17. ábra. Humán melanóma glukokortikoid receptor expressziós analízise RT-PCR módszerrel (n=15) ERα
1. 2. 3. 4. ERβ
5. 6.
7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
1. PGR
2.
1. AR
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
1.
2.
3. 4. 5. 6.
3.
4.
7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
5. 6.
7.
9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
1.marker, 2.+kontroll, 3. 8F3, 4. 9B4, 5.28/01tumor, 6. M29, 7. 35/01 tumor, 8. 32/01 tumor, 9. A2058, 10. WM983A, 11.6E5, 12. 3.1, 13. WM983B, 14. HT168, 15. M1, 16. WM35, 17. HT199, 18. negativ
GCR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9. 10. 11. 12. 13. 14.
1. marker, 2. M1, 3. HT168, 4. A2058, 5. HT199, 6. M35, 7. M24, 8. WM983A, 9. WM983B, 10. tumor, 11.1919H, 12.1919L, 13. + kontroll, 14. negativ
Eredményeink szerint a vizsgált humán melanóma vonalakban és a néhány tumorszövetben autentikus ER , PgR, AR és GCR expressziót lehet kimutatni. Feltűnő, hogy az ER izoformák a PgR és az AR tekintetében számos un. splice variáns is kimutatható, bár gyakoribb a vad típusú génforma. Amennyiben humán melanóma vonalaink megfelelő sex hormon receptort expresszálnak, felmerül annak lehetősége, hogy ezen hormonok befolyásolnák az áttétképzést. Ebből a célból két sejtvonal esetében un. arteriális kolonizációs tesztet végeztünk SCID egérben. A két sejtvonal elsősorban a májba képezett áttéteket, így vizsgálatainkat ezen modell esetében folytattuk.
20
A kísérleteket a tumorsejtek beoltását megelőzően orchiectomián ill. ovariectomián átesett hím ill. nőstény, valamint kontroll hím és nőstény egereken végeztük, két, korábbi vizsgálatokban erős májpreferenciát mutató melanoma sejtvonalon. Mindkét sejtvonal esetében jelentős különbség mutatkozott a szívbeoltást követően létrejött májáttétek számában a kontroll hím és nőstény állatok között, az előbbiek javára. Emellett az orchiectomián átesett hímekben a májkolóniák száma szignifikáns mértékben csökkent (különösen a HT168-M1 sejtvonal esetében). Ezzel szemben az ovariectomián átesett nőstényekben a kontrollokhoz viszonyítva a HT199 vonal esetén magasabb áttétszámot találtunk, és hasonló tendenciát figyeltünk meg a HT168-M1 vonalnál, bár itt a különbség nem volt szignifikáns. 8. táblázat. Hím, kontroll Hím, orchiect. Nőstény, kontroll Nőstény, ovariect.
Előfordulás 100% 67% 43% 67%
HT168-M1 Áttét (átlag) 130,7 1,7 0,6 2,6
Áttét (SEM) 33,2 0,8 0,8 1,0
Előfordulás 100% 100% 100% 100%
HT199 Áttét (átlag) 101,0 56,0 24,0 61,4
Áttét (SEM) 23,3 8,1 11,0 7,8
Ezen megfigyelésünk alapján egyértelmű, hogy az androgén hormon igen erős májmetasztázist potencírózó hatású humán melanóma esetében, míg az ösztrogénnek kisfokú, de esetenként jelentős májáttétképzést gátló hatása van. Természetesen az in vitro kimutatott receptor expresszió a humán melanóma vonalakban még nem elegendő bizonyíték arra, hogy a látott hatásért receptor-mediált folyamatokat tegyünk felelőssé, ehhez funkcionális receptor moduláns vizsgálatokra van szükség. Vizsgálataink egy másik részében fehérjeszinten is vizsgáltuk a glükokortikoid-receptor mint a szteroidhormon-hatás lehetséges közvetítője - jelenlétét humán melanómákban. Immuncitokémiai és immunhisztokémiai módszerekkel kilenc fagyasztott tumormintában ill. hét humán melanóma sejtvonalon mutattunk ki GCR-t különböző lokalizációkban. Előfordult sejtmagi, diffúz citoplazmás és kevert jelölődés is. 18. ábra. GCR protein kimutatása emberi melanómában. A monoklonális antitest a PTE munkacsoport saját fejlesztése (Németh P). A/ HT199 melanóma sejtek in vitro B/ 2404 sebészeti melanóma
A sejtmagok piros szinben tűnnek fel, míg a az antiGCR lokalizációját zöld fluoreszcencia jelzi. A sebészi mintát fagyasztva metszettük majd MetOHban fixáltuk hasonlóan a tenyészetekhez.
Annak ellenére, hogy a GCR (referenciaszekvencia: nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1; NR3C1) mRNS- és fehérjeszinten is megtalálható volt, dexametazonnal (Dex) in vitro tesztekben nem sikerült jelentős proliferációgátlást elérni. Két napos kezelés még az igen nagy, 80 µM koncentrációjú dexametazonnal (a legmagasabb alkalmazott humán dózis 21
kb.kétszeresének felel meg) is csak egyetlen sejtvonal esetén (WM983A) eredményezett 40%os proliferációgátlást, akár szérum (FCS) jelenlétében (19a. ábra), akár annak hiányában (19b. ábra) végeztük a vizsgálatokat. Huzamosabb kezeléssel (4-5 nap, 40 µM Dex, 5% FCS) két sejtvonal esetében ugyanezt a hatást értük el, és ezt a fenolvörös indikátor (melynek enyhe ösztrogénszerű hatása van) jelenléte vagy hiánya nem befolyásolta. 19. ábra. Dexametazon kezelés hatása humán melanóma sejtek proliferációjára in vitro. A/ Szerum+ B/ Szérum-
50
50 0 M
1
2 H 4 T1 W 9 M 9 9 W 83A M 98 M 3B 35 /0 1
M
M
1
0
100
22
2 H 4 T1 W 9 M 9 9 W 83A M 98 3 M B 35 /0 1
100
150
M
K Dex 80 Dex 40 Dex 20 Dex 10
150
4.3./ Tumorsejtmozgás felfüggesztésének alkalmazása az áttétképzés lelassítására
Kálcium-csatorna gátlás hatása humán melanóma-sejtvonalakra Az emberi melanoma sejtek inváziós szignalizációja nagymértékben függ a PKCa funkciójától korábbi kisérleti eredményeink szerint. Ez a PKC izoforma egyértelemű Cafüggő aktivitást mutat, ezért úgy gondoltuk, hogy a melanoma sejtek Ca-csatornáit moduláló anyagokkal indirect módon befolyásolni lehet a melanoma sejtek proliferációját és/vagy migrációs aktivitását. Elsőként megvizsgáltuk, hogy a korábban bemutatott RyanodinR2 Ca csatorna funkcionálisan aktiv-e melanómában. A vizsgálathoz ryanodint használtunk agonistaként és sejtproliferációs tesztben mértük a következményeket. 20. ábra. RyR2 agonista ryanodin hatása emberi melanoma sejtek proliferációjára in vitro.
% control
250
WM35 A2058 M1 HT199
200
150
100
50
0
1 10 100 Ryanodin koncentráció (µ µM log10) Megfigyeléseink szerint a ryanodin 10-100 µM koncentrációs tartományban eltérő mértékben, de stimulálja emberi melanoma sejtek proliferációját, ami a receptor funkcionális aktivitására utal. Ezen eredmények alapján (is) kívánatosnak tűnt különböző típusú Ca csatorna blokkolók tesztelése emberi melanómákon: vizsgálatainkhoz a RyR2-gátló ruthenium redet, valamint a klasszikus Ca csatornákat gátló Verapamilt és Felodipint használtuk.
Ca-csatorna blokkolás hatása emberi melanoma sejtek proliferációjára in vitro. 2 féle humánmelanóma sejtvonalat (HT168-M1/9 és HT199) 5 ezer sejt / well koncentrációban tettünk ki 96-well multiplate-re 5% FCS–tartalmú médiumban. A sejteket 24 órás inkubáció után kezeltük két kálcium-csatorna gátló különböző koncentrációival (Rutenium Red: 0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 100 µM; Felodipin: 1 µM, 5 µM, 10 µM, 25 µM, 50 µM) a sejteket 2,5% FCS-t tartalmazó, illetve savómentes körülmények között 48 órán keresztül. A proliferáció mértékének kiértékelése MTT-assay-jel történt.
23
21. ábra. Ca csatorna blokkolók hatása humán melanóma sejtek proliferációjára in vitro.
A proliferáció szignifikáns gátlása Ruthenium Rednél az 50 µM-os, míg a Felodipinnél a 25 µM-os dózisnál kezdődött mind a HT168-M1/9, mind pedig a HT199 melanóma sejtvonal esetében. Az 50 µM-os Felodipin-kezelés teljesen elpusztította a sejtjeinket. WM35 esetében a fenti metodikával megegyezően elvégeztük a proliferációs assay-t, de a Felodipinhez a Verapamil hatását hasonlítottuk (1 µM, 10 µM, 100 µM, 500 µM). A Verapamil esetében szignifikáns proliferációcsökkenést még 100 µM-os kezelésnél sem tapasztaltunk, míg 500 µM-ban teljesen elpusztultak a sejtek. Ebben a sejtvonalban már a Felodipin 1 µM-os dózisban hatásosnak bizonyult. 22. ábra. Ca csatorna blokkolók hatása WM35 humán melanóma proliferációjára in vitro. WM35 proliferációjának befolyásolása Verapamil és Felodipin kezeléssel 0,6
Sejtszám
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
50uM Felodipin
25uM Felodipin
10uM Felodipin
DMSO kontrol
Kezelés
1uM Felodipin
500uM Verapamil
10uM Verapamil
100uM Verapamil
Kontrol
1uM Verapamil
-0,1
Mean ±SE ±SD
Fenti vizsgálataink az irodalomban elsőként fedezték fel a Ca csatorna blokkolók mitogén szignalizációt gátló hatásait emberi melanoma sejteken. Korábbi irodalmi adatok azt mutatták, hogy a Ca csatorna blokkolók gátolják melanoma sejtek un. Multidrog rezisztenciáját. Másrészt korábbi vizsgálataink azt is kimutatták, hogy a Ca csatorna blokkolók jelentősen modulálják melanoma sejtek felszini adhéziós receptor expresszióját és a citoszkeletont. Új adataink ezeket a vizsgálatokat jelentősen kiegészítik. Ca csatorna blokkolás hatása human melanoma sejtek migrációjára M1/9 melanóma sejteket 106 sejt / ml koncentrációban, 20 µl térfogatban, 5% fetális borjúsavó tartalmú médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe. A sejtek viabilitását előzetes tripánkék festéssel ellenőriztük. Az alsó részbe savómentes médiumban oldott 100 µg/nl fibronektint helyeztünk, amely kemotaktikus ingerként szolgált. 6 órás inkubációs periódus után (37 C°, 5% CO2) a nem migrált sejteket a 24
a 8 µm pórusú membránról eltávolítottuk, a fibronektin felőli sejteket metanolos fixálás után toluidinkék oldattal festettük, majd megszámoltuk a látóterenkénti sejtszámot. a) A migráció alatti vizsgálatnál a sejtek a migráció teljes fázisa alatt jelen volt a kezelőanyag. Ebben az esetben nem volt szignifáns különbség a kontroll-csoport, valamint a Felodipin 10 µM-os dózisával kezelt sejtek migrációs készsége között. b) Migráció előtti kezelésnél a sejteket kitettük 6-well multiplate-re, 24 órás inkubációs periódus után 5% FCS-t tartalmazó médium mellet történt a Felodipin különböző koncentrációival (0,5 µM, 1 µM, 5 µM, 10 µM) való kezelés, amely 48 órán keresztül tartott. Ezután a sejteket 0,02%-os EDTA segítségével felszedtük, majd minden mintát 106 sejt/ml koncentrációban 5% FCS-t tartalmazó médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe, 100 µg/nl fibronektinnel szemben. Szignifikáns különbség itt sem volt tapasztalható. 23. ábra. HT168-M1/9 migrációjának befolyásolása szimultán Felodipin kezeléssel
HT168-M1/9 migrációjának befolyásolása felodipin előkezeléssel
90
95
88 90
86 84
85 80
80
Sejtszám
Sejtszám
82
78 76 74 72
75 70 65
70 60
68 66
55
64 62 Kontroll
Felodipin
10 µM
50
Mean ±SE ±SD
Kontroll
0,5 µM
1 µM
Felodipin
5 µM
10 µM
Mean ±SE ±SD
A fenti kisérleti felállásban alkalmazott Ca csatorna blokkolók a még nem anti-mitotikus dózisban (10 µM) nem rendelkeztek antimigrációs hatással. Jelenlegi kisérleteink azt vizsgálják, hogy az antititotikus dózis egyúttal rendelkezik-e antimigrációs hatással. Korábbi genomikai vizsgálataink emberi melanóma sejtvonalak esetében több Ca szignalizációban részt vevő fehérje fokozott expresszióját mutatta: a ryanodin receptor2 mellett a sorcin, calneurinét is. Ezek az adatok arra utaltak, hogy a malignus transzformáció során a melanóma sejteknek szükségük van a Ca szignálra. Ezért gondoltuk azt, hogy Ca csatorna blokkolókkal esetleg befolyásolni lehet a humán melanóma sejtek biológiai viselkedését. Kisérleti eredményeink egy új melanóma terápiás irányzat alapjait jelentheti, ahol az ismerten terápia rezisztens melanóma sejteken Ca csatorna blokkolók segítségével lehet legalább is antimitotikus hatást elérni. Természetesen a vizsgálatokat folytatni kell és preklinikai modelleken igazolni kell hogy a biológiai hatás szöveti környezetben is fenn áll.
EGF receptor moduláció hatása melanóma-sejtvonalakra Korábbi sporadikus eredmények alapján többször felmerült a lehetősége annak, hogy a melanómaák EGFR-t expresszálnának, azonban a kellően mély molekuláris vizsgálatok ezt nem tudták igazolni meggyőzően. Első lépésben tehát megvizsgáltuk a rendelkezésünkre álló 5 féle genetikai hátterű humán melanóma sejtvonalon hogy az EGFR kifejeződik e mRNS és fehérje szinten.
25
EGF-receptor expresszió vizsgálata emberi melanóma sejtvonalakon RT-PCR segítségével próbáltuk meghatározni az EGF-receptor intra- és extracelluláris doménjének jelenlétét humán melanóma sejtvonalainkon. Kontrollként az A431 humán laphám-carcinóma vonalat használtuk, amely amplifikáltan expresszálja a vad típusú EGFreceptort. Az alábbi ábrán látható a PCR-termékek agaróz gélen történő futtatásának etidium-bromiddal előhívott képe. Minden sejtnél az 1. oszlopban látható a kontroll β-globulinnak felel meg, a 2. oszlopban egy extracelluláris, ligandkötő régióban lévő lévő terméket kaptunk (a primerpár a 438-811 közötti bázisokat célozza). A 3. és 4. oszlopok az intracelluláris, tirozinkináz régiót reprezentálják (2650-3060., ill. 2523-2840. bázis). 24. ábra. EGFR expresszió emberi melanóma vonalakban (RT-PCR)
Megállapítható, hogy az a pozitív kontrollhoz (A431) hasonló expressziós mintázatot a 9 vizsgált melanóma vonal közül csak 2 az M24 és a WM983A tartalmaz. Az is látható, hogy 2 vonal negatívnak bizonyult. Ugyanakkor 5 melanóma vonalban az EGFR domének un. alternatív bendeket tartalmaznak. A szekvenálás igazolta az extracelluláris és a cytoplazmatikus termék autentikus voltát az M24 sejtvonalban, azonban a cytoplazmatikus 2.3. primerek esetében megjelenő alacsonyabb mólsúlyú termék természete még nem tisztázott. Eredményeinket q-PCR módszerrel is megerősítettük. Ha a HT199 EGF-receptor expresszióját vesszük egységnyinek, akkor az expressziós ráták az alábbiak szerint alakulnak az emberi melanóma sejtvonalakban: 9. táblázat. Sejtípus EGFR szint (RT-PCR analízis) HT199 1 A431 392926 M24met 30000 HT168 0,133 HT1680,0077 M1/9 A2058 0 M35 25,9 WM983A 17,6 WM983B 21,5
26
Ennek megfelelően az EGFR cytoplazmatikus doménje alapján jelentős eltérés van az emberi melanóma vonalak között: a wtEGFRt expresszáló M24 négy nagyságrenddel többet expresszál, mint a HT199, erős expresszió jellemzi a WM983 vonalakat és az M35-öt, míg igen gyenge a HT168 családot. Humán melanóma sejtvonalak EGF-receptor expressziójának vizsgálata flow-cytométerrel A felhasznált sejtvonalakban megvizsgáltuk az EGF-receptor expressziójának mértékét flowcytometria segítségével. Az 1%-os paraformaldehid fixálás után 0.2%-os szaponinnal permeabilizált mintákban mértük az expressziót. A felhasznált Transductional Laboratories által gyártott antitest az intracelluláris, míg a BD antitestje az EGF receptor extracelluláris doménjét ismerte fel. Az M24met sejtvonal 95%-ban volt pozitív az extracelluláris doménre, a többi sejtünk negatívnak bizonyult. 25. ábra. Az EGF-receptor TK domén expressziója humán melanóma sejtvonalakon 90% 80%
Expressziós %
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% M1/9
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM83B
M24met
26.abra.Emberi melanóma sejttek proliferációjának befolyásolása EGFR TK gátló ZD1839-el ZD1839 hatása különböző melanóma sejtek proliferációjára (0% FCS)
Proliferációs % (Kontrollhoz képest)
300,00% 0,1 uM 1 uM 10 uM 100 uM
250,00%
200,00%
150,00%
100,00%
50,00% 0%
0%
0,00%
A2058
M1/9
M24 met
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM983B
A 8 féle melanóma sejtvonalat (A-2058, HT168-M1/9, M24met, HT168, HT199, WM35, WM983A, WM983B) 5 ezer sejt / well koncentrációban tettünk ki 96-well multiplate-re 5%
27
FCS–tartalmú médiumban. 24 órás inkubáció után kezeltük ZD1839 különböző koncentrációival (0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 100 µM) a sejteket 2,5% FCS-t tartalmazó, illetve savómentes körülmények között 48 órán keresztül. A proliferáció mértékének kiértékelése MTT-assay-jel történt. A ZD1839 antititotikus hatása a 10 µM-os koncentrációnál kezdődött, a 100 µM-os dózis már teljesen elpusztította a sejteket. ZD1839 hatása különböző melanóma sejtek proliferációjára (2,5% FCS) 250,00% 0,1 uM 1 uM 10 uM 100 uM
Proliferációs % (kontrollhoz képest)
200,00%
150,00%
100,00%
50,00%
0%
0%
0%
0%
0,00%
A2058
M1/9
M24 met
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM983B
27. ábra. ZD1839 proliferációgátló hatásának összehasonlítása klasszikus EGFR TK gátló PD153035 kezeléssel HT168-M1/9, M24met, HT199, WM983A és B sejtvonalakon a fenti metodika alkalmazásával, savómentes körülmények között összehasonlítottuk az Iressa (ZD1839) hatását egy kísérletes célokra használt specifikus EGF-receptor tirozin-kináz gátlóval, a PD153035-tel. 28. ábra. ABCD. Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása M24met melanóma sejtvonalon
Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása HT168-M1/9 melanóma sejtvonalon 0,800
0,400 0,300
PD153035
0,300
Extinkció
0,500
Iressa
0,350
PD153035
0,600
Extinkció
0,400
Iressa
0,700
0,250 0,200 0,150
0,200
0,100
0,100
0,050 0,000
0,000 Kontroll
0,1 uM
1 uM
10 uM
Kontroll
100 uM
0,1 uM
Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása HT199 melanóma sejtvonalon 0,600 0,500
10 uM
100 uM
Iressa és PD153035 proliferációgátló hatásának összehasonlítása WM983A melanóma sejtvonalon Iressa
1,200
PD153035
1,000
0,400
Iressa
Extinkció
Extinkció
1 uM
Kezelési dózis
Kezelési dózis
0,300 0,200 0,100
PD153035
0,800 0,600 0,400 0,200
0,000 Kontroll
0,1 uM
1 uM
10 uM
0,000
100 uM
Kontroll
Kezelési dózis
0,1 uM
1 uM
10 uM
100 uM
Kezelési dózis
Vizsgálataink eredményeként megállapítható hogy a ZD1839 (Iressa) valamennyi emberi melanóma sejtvonalunkon minden dózisban hasonlóan hatásosnak bizonyult, mint a
28
PD153035. Ugyanakkor az is megállapítható, hogy a PD EGFR TK gátló is hatásos emberi melanóma sejtvonalakon. EGFR TK gátlása apoptózist okoz emberi melanóma sejtvonalakon A melanóma sejtvonalainkat 24 órás inkubáció után kezeltük az ZD1839 különböző koncentrációival (5 µM, 25 µM, 50 µM) 5% FCS-t tartalmazó médiumban 48 órán keresztül. 0,02%-os EDTA segítségével való felszedést követően a sejteket 70 %-os –20 °C-os alkohollal való inkubáció után kezeltük propidium-jodiddal, valamint RNAse-zal. Ezután flow-cytometria használatával következtettünk a sejtekben található DNS mennyiségére, ebből pedig a sejtciklusra. A sub-G1 fázisban lévő sejteket tekintettük apoptotikusnak. 29. ábra.
Az apoptózis aránya különböző dózisú ZD1839 kezelés hatására humán melanóma sejtvonalakon 80% Iressa 5 uM 70%
Iressa 25 uM
Apoptózis mértéke
Iressa 50 uM 60%
50%
40%
30%
20%
10%
0% A2058
M1/9
M24 met
HT168
HT199
WM35
WM983A
WM983B
Öt %-ot meghaladó apoptózis a legalacsonyabb 5µM-os dózisban 2 sejtvonalban volt tapasztalható (HT168 és WM983A) , míg a magasabb 25 µM-nál 10% feletti apoptosis ráta a HT168 családban (A2058, HT168 és M1) valamint a WM családban volt észlelhető, mely utóbbi bizonyult a legérzékenyebbnek ebből a szempontból. Megjegyzendő, hogy a wtEGFRt expresszáló M24 melanóma vonal a legrezisztensebb a TK gátló hatásra. EGFR TK gátlás hatása humán melanóma migrációjára M1/9 melanóma sejteket 106 sejt / ml koncentrációban, 20 µl térfogatban, 5% fetális borjúsavó tartalmú médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe. A sejtek viabilitását előzetes tripánkék festéssel ellenőriztük. Az alsó részbe savómentes médiumban oldott 100 µg/nl fibronektint helyeztünk, amely kemotaktikus ingerként szolgált. 6 órás inkubációs periódus után (37 C°, 5% CO2) a nem migrált sejteket a a 8 µm pórusú membránról eltávolítottuk, a fibronektin felőli sejteket metanolos fixálás után toluidinkék oldattal festettük, majd megszámoltuk a látóterenkénti sejtszámot. a) A migráció alatt a sejtek a migráció teljes fázisa alatt kezelve voltak ZD1839-el. Hogy kiszűrjük az anyag toxikus hatását, ezért tripánkék festéssel ugyanezen kezelési koncentrációk mellett megmértük a sejtek 6 órás túlélését is. Mivel a sejtpusztulás teljesen megegyezett a migrációgátlás mértékével, ezért az észlelt gátlás a ZD1839 toxikus hatásával magyarázható, semmint antimigrációssal.
29
b) Migráció előtti kezelésnél a sejteket kitettük 6-well multiplate-re, 24 órás inkubációs periódus után 5% FCS-t tartalmazó médium mellet történt az ZD1839 különböző koncentrációival való kezelés, amely 48 órán keresztül tartott. Ezután a sejteket 0,02%-os EDTA segítségével felszedtük, majd minden mintát 106 sejt/ml koncentrációban 5% FCS-t tartalmazó médiumban helyeztünk a Neuroprobe migrációs kamra felső kompartmentjébe, 100 µg/ml fibronektinnel szemben. 30. ábra.
ZD1839 48 órás előkezelés hatása M1/9 melanoma sejtek migrációjára 90
Migráció 80
70
Sejtszám / látótér
p<0,05
p<0,05
60
100%
98% 79%
50
75%
40
p<0,05 30
39% 20
10
0
Kontroll
0,01 uM
0,1 uM
1 uM
10 uM
Megállapítottuk, hogy az EGFR TK aktivitásának gátlása (az így kondicionált sejtek esetében) jelentősen gátolta a migrációs képességet is. A hatás matematikailag szignifikánssá 0.1 µM-tól, biológiailag szignifikánssá 10 µM-tól vált. Az EGFR-ra vonatkozó vizsgálatainkat összefoglalva megállapíthatjuk, hogy először igazoltuk, hogy emberi melanómában az EGFR (ha nem is annak un. vad típusa) nagy gyakorisággal expresszálódik és a termék magába foglalja a tirozin kináz domént. Az melEGFR expressziónak funkcionális jelentősége van, mert specifikus EGFR TK gátló szerekkel antiproliferatív, apoptosis-indukciós és antimigrációs hatást lehet kiváltani in vitro. Mindezen eredményeink alapján felmerül az, hogy az emberi melanómában, a tüdőrákok bizonyos formáihoz hasonlóan egy daganatos EGFR expresszálódik, amely terápiás célpontként szolgálhat. Természetesen ezen feltételezésünket további preklinikai és patológiai vizsgálatoknak kell alátámasztaniuk.
30
•
4.4./ rhErythropoetin hatása az angiogén fenotípusra és az áttétképzésre colonrák esetében Vizsgálataink során a korábbi eredményeinkből kiindulva az epoetinum alfa (EPREX) hatóanyagot teszteltük in vivo körülmények között humán colon carcinoma (HT25) tumorvonalon. QPCR technikával és flow-citométeres méréssel is igazoltuk, hogy a HT25 sejtek expresszálják az EPOR-t (31. ábra). A korábbi in vitro vizsgálatainkban az epoetinum alfa humán terápiás dózisban nem befolyásolta a tumorsejtek proliferációját, valamint a tumorok in vivo subcutan növekedését. Azonban más (laphám) tumor xenograftban kapott eredményeinkkel egyezőleg, az EPREX (150 IU/kg) fokozta az 5-FU kezelés (750 mg/m2) hatását a subcutan növő tumorok esetében (2. ábra). 31. ábra. EPO receptor expressziója különböző humán daganatsejtvonalakban. 75
mRNA protein
3 50 2 25 1
0
protein (% positive cells)
mRNA (relative units)
4
0
A431
HT25
32. ábra: EPREX (150 IU/kg) hatása humán colon carcinoma daganat subcutan növekedésére 5-FU kezelés (750 mg/m2) után. Control Control + 5-FU EPO EPO + 5-FU
350
300
tumor volume (mm3)
250
* 200
**
150
100
50
5-FU 0 0
5
10
15
20
days after tumor inoculation rHuEP O
31
25
30
Ez a fokozott hatás a megnövekedett perfúziós kapacitás miatt léphetett fel, amelyet a szignifikánsan nagyobb erek (3. ábra), és a pericita borítás megszakadása eredményezhet (4. ábra). Ezekkel a vizsgálatokkal megerősítettük a korábbi eredményainket, és újabb bizonyítékokat adtunk arra, hogy az rHuEPO fokozza a tumoros erek átmérőjét, amely a citosztatikus kezelés hatékonyságát növeli az EPO receptort expresszáló tumor xenograftokban. 33. ábra. EPREX (150 IU/kg) hatása human colon carcinoma xenograft ereire. CD31: zöld, sejtmag: piros.
kontroll
rHuEPO
34. ábra. EPREX (150 IU/kg) hatása az erek pericita borítására human colon carcinoma xenograftban. CD31: zöld, SMA: piros. A nyíl a folytonos pericita borítás megszakadását mutatja az rHuEPO kezelt tumorokban.
rHuEP
kontroll
Fenti vizsgálataink igazolták, hogy az A431 emberi laphámrák esetében megfigyelt EPOindukált érelváltozások egy másik daganatféleségben, a HT25 colon adenocarcinomában is kialakulnak, tehát nem tumortípus specifikusak. Ezen eredmények fényében megfigyeléseinknek klinikai jelentősége lehet, hiszen vizsgálataink az 5-FU antitumorális htaásának potencírozását igazolják. Ezt a citosztatikumot a colorectalis daganatok mellett a fejnyaki laphámrákokban is kiterjedten használják. Ezutóbbiak esetében EPO kezeléssel gyakran kombinációban.
32
5. Klinikai vizsgálatok a daganatok progressziós készségének fékezésére (Janssen-Cilag, Pfizer kft.) 5.1. Fragmin hatása előrehaladott melanóma progressziójára 20-20 stage III szervi áttétben még nem szenvedő melanómás beteg esetében kívánjuk megvizsgálni a Fragmin adagolás hatását a progressziós folyamatra, amikoris a két csoport a standard Dacarbazine terápiát is kapja. Monitorozásra elsősorban képalkotó módszereket használunk. Az anticoaguláció mértéke a szokásos DVT profilaktikus napi dózis lesz 1 hónap időtartamban. Az anticoagulatiot heti coagulogrammal ellenőrizzük. A vizsgálat célja a progresszióig eltelt idő mérése illetve ennek módosulása a Fragminnal kezelt betegcsoportban. A vizsgálat protokollja az ETT-hez beadásra került. 5.2. Az oxigenizáció javításának hatása az angiogén fenotípusra és a terápiás érzékenységre előrehaladott cervix- és rectumrákban rhErythropoetin segítségével 20-20 előrehaladott rectumrákos beteget vonunk be vizsgálatainkba, akik a megfelelő protokoll szerinti kombinált sugár- és cytostatikus neoadjuváns kezelésben részesülnek. A kezelés előtt meghatározzuk a Hgb szintet és a vvt számot és a tumorszövetből tájékozódó szövettani mintavétel (PREX) történik. A daganatgátló kezeléssel párhuzamosan az irodalmi javallatoknak megfelelően rhEPO adagolás történik, amelynek során folyamatosan követjük nyomon a vvt és Hgb szintet a vérben, valamint a tumorok méretét. A terápia sikerességét az ciklus leadása végén a sebészeti beavatkozáskor eltávolított tumor analízisével határozzuk meg. A kezelés előtti és után szövettani mintákban meg kívánjuk határozni az angiogén fenotípus jellemző elemeit, a tumorok érdenzitását, a daganatos erek paramétereit (átmérő, pericita boríték) valamint a VEGF, bFGF és VEGFR2 illetve HIF1a szinteket immunhisztokémiai módszerrel. A vizsgálat klinikai protokollja az Intézeti etikai bizottsághoz beadásra került. Közlemények 2004-ben 2. Dobos J, Tímár J, Bocsi J, Burian Zs, Nagy K, Barna G, Peták L, Ladányi A. In vitro and in vivo antitumor effect of 2-methoxyestradiol on human melanoma. Int J Cancer 112:771-776, 2004 3. Forster-Horváth Cs, Döme b, Paku S, Ladányi A, Somlai B, Jalkanen S, Tímár J. Loss of vascular adhesion protein-1 expression in intratumoral microvessels of human skin melanoma. Melanoma Res 14:135-140, 2004 4. Forster-Horváth Cs, Mészáros L, Rásó E, Döme B, Ladányi A, Morini M, Albini A, Tímár J. Expression of CD44v3 protein in human endothelial cells in vitro and in tumoral microvessels in vivo. Microvascular Res 68:110-118, 2004 5. Ladányi A, Somlai B, Gilde K, Fejős Zs, Gaudi I, Tímár J. T-cell activation marker expression on tumor-infiltrating lymphocytes as prognostic factor in cutaneous malignant melanoma. Clin Cancer Res 10:521-530, 2004 6. Lőrincz T, Tímár J, Szendrői M. Alterations of microvascular density in bone metastases of adenocarcinomas. Pathol Oncol Res 10:149-153, 2004 7. Lőrincz T, Tóth J, Szendrői M, Tímár J. Her2/neu status in bone metastases of breast cancers. 2nd Congress of the World Society for Breast Health, 2003 - Monduzzi Editore International Proceedings Division, Bologna, pp. 35-38 8. Rásó E, Döme B, Somlai B, Zacharek A, Hagmann W, Honn KV, Tímár J. Molecular identification, localization and function of platelet-type 12-lipoxygenase in human melanoma progression, under experimental and clinical conditions. Melanoma Res 14:245-250, 2004
33
9. Rásó E, Mészáros L, Albini A, Tímár J. A WT1 expressing metastatic human Kaposi sarcoma xenografts model. Pathol Oncol Res 10:22-25, 2004 10. Tímár J, Csuka O, Remenár É, Répássy G, Kásler M. Progression of head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Metast Rev 24:105-125, 2005 11. Tímár J, Udevarhelyi N, Bánfalvi T, Gilde K, Orosz Zs. Accuracy of the determination of S100B protein expression in malignant melanoma using polyclonal or monoclonal antibodies. Histopathology 44:180-184, 2004 12. Bereczky B, Gilly R, Rásó E, Vágó Á, Tímár J, Tóvári J. Selective antimetastatic effect of heparins in preclinical human melanoma models is based on inhibition of migration and microvascular arrest. Clin Exp Metast 2005 (elfogadva) 13. Döme B, Rásó E, Dobos J, Mészáros L, Varga N, Puskás LG, Fehér LZ, Lőrincz T, Ladányi A, Trikha M, Honn KV, Tímár J. Parallel expression of αIIbβ3 and αvβ3 integrins in human melanoma cells upregulates bFGF expression and promotes their angiogenic phenotype. Int J Cancer 2005 (elfogadva) 14. Tímár J, Ladányi A, Forster-Horváth Cs, Lukits J, Döme B, Remenár É, Gődény M, Kásler M, Bencsik B, Répássy G, Szabó Gy, Velich N, Suba Zs, Élő J, Balatoni Zs, Pócza K, Zemplén B, Chretien P, Talor E. Neoadjuvant immunotherapy of oral squamous cell carcinoma modulates intratumoral CD4+/CD8+ ratio and tumor microenvironment. A multicenter phase II clinical trial. J Clin Oncol 2005 (elfogadva) 15. Tímár J, Mészáros L, Orosz Zs, Albini A, Rásó E. WT1 expression in angiogenic tumors of the skin. Histopathology 2005 (elfogadva) 16. Tímár J, Tóvári J, Rásó E, Mészáros L, Bereczky B, Lapis K. Thrombocyte-mimicry of cancer cells: rationale for the prevention and treatment of hematogenous dissemination. Oncology 2005 (elfogadva) 17. Tóvári J, Gilly R, Paku S, Bereczky B, Varga N, Vágó Á, Tímár J. Recombinant human erythropoietin alpha targets intratumoral blood vessels improving chemotherapy in human xenografts models. Cancer Res 2005 (elfogadva)
34
