BAHAN DAN METODE
Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian yang dilakukan oleh Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan Bogor, yang dilaksanakan pada bulan Juni 2010 - bulan Januari 2011, yang berjudul “Efektivitas Suplementasi Zat Gizi Mikro Terhadap Status Besi dan Vitamin A Pada Murid SLTP” Titik berat penelitian ini adalah pada prohepsidin dan status besi dalam darah pada murid SMP kelas VII, VIII dan IX di Kabupaten Bogor.
Disain, Lokasi dan Waktu Penelitian Disain penelitian ini adalah kuasi eksperimen dengan jenis penelitian terapan. Penelitian dilakukan di dua SMP di Kabupaten Bogor yaitu SMP Purnawarman di Kecamatan Rancabungur dan MTs Fathusa’adah di Kecamatan Sukaraja selama 8 bulan dari bulan Juni 2010 - bulan Januari 2011.
Populasi dan Sampel Penelitian Populasi penelitian adalah murid-murid SMP di Kabupaten Bogor, sedangkan sampel penelitian adalah remaja putri murid-murid SMP Purnawarman Kecamatan Rancabungur dan Mts Fathusa’adah kecamatan Sukaraja kelas VII, VIII dan IX usia 12-15 tahun, dengan kriteria inklusi: tidak menderita sakit infeksi menahun, tidak sedang menstruasi pada saat pengambilan darah dan bersedia ikut serta dalam kegiatan penelitian serta menandatangani surat pernyataan bersedia menjadi objek penelitian. Penelitian ini terdiri dari dua kelompok yaitu: kelompok perlakuan yang diberi kapsul besi (ferro sulfate) Dosis 60 mg + 0,25 mg asam folat dua kali seminggu selama 12 minggu dan kelompok kontrol yang diberikan placebo.
Jumlah sampel dihitung dengan harapan kenaikan hemoglobin sebesar rata-rata 1,2 g/dl, dengan rumus sebagai berikut (Lemeshaw, 2000) : 2(Z 1-α/2 + Z 1-β )2 σ2 n = --------------------------------(μ c - μ I )2
31
2(1,96 + 1,28)2( 1, 32) n = ---------------------------------- = 24,6 (1,2)2 Keterangan : n
= Besar sampel
σ
= Simpang baku kadar hemoglobin = 1,3 (Saidin, 2009)
δ
= harapan kenaikan kadar hemoglobin 1,2g/dl.
Z 1-α/2
= nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan tingkat kemaknaan (untuk α = 0,05 adalah 1,96)
Z 1-β
= nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan kekuatan (power) sebesar yang diinginkan (untuk β = 0,10 adalah 1.28)
μc
= mean outcome sebelum intervensi
μI
= mean outcome setelah intervensi
Jumlah sampel dihitung dengan harapan perubahan prohepsidin sebesar 13 ng/ml, dengan rumus sebagai berikut (Lemeshaw, 2000) : 2(Z 1-α/2 + Z 1-β )2 σ2 n = --------------------------------(μ c - μ I )2 2(1,96 + 1,28)2( 1, 32) n = ---------------------------------- = 20,7 (13)2 Keterangan : N
= Besar sampel
σ
= Simpang baku kadar prohepsidin = 12,9 (Young et al, 2009)
δ
= harapan kenaikan kadar prohepsidin 13 ng/ml.
Z 1-α/2
= nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan tingkat kemaknaan (untuk α = 0,05 adalah 1,96)
Z 1-β
= nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan kekuatan (power) sebesar yang diinginkan (untuk β = 0,10 adalah 1.28)
μc
= mean outcome sebelum intervensi
μI
= mean outcome setelah intervensi
32
Berdasarkan perhitungan rumus tersebut di atas diperlukan 28 orang remaja putri per kelompok perlakuan (dengan memperhitungkan kemungkinan terjadinya drop out sekitar 10%). Kemudian diambil jumlah sampel tertinggi yaitu berdasarkan perhitungan kenaikan kadar hemoglobin.
CARA PENGUMPULAN DAN ANALISIS DATA Cara Pengambilan Sampel Karena penelitian ini merupakan bagian dari penelitian yang dilakukan oleh Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan Bogor maka cara pengambilan sampel (sampling) mengikuti pelaksanaan dalam penelitian Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor tersebut. Pemilihan SMP dilakukan secara purposive berdasarkan hasil penelitian Saidin, 2009. Terhadap semua anak kelas VII, VIII dan IX dari SMP terpilih akan dilakukan pemeriksaan kadar Hb untuk mendapatkan siswi-siswi yang menderita anemia. Penelitian ini terdiri dari dua kelompok yaitu kelompok perlakuan (29 orang), dan kelompok kontrol (26 orang). Kemudian kepada seluruh anak diberikan obat cacing Pirantel Pamoat dosis tunggal. Selanjutnya mulai dilakukan pemberian suplemen selama 12 minggu. Kelompok perlakuan mendapat kapsul besi (ferro Sulfat) dosis 60 mg + 0,25 mg asam folat. Kelompok kontrol adalah kelompok pembanding mendapatkan plasebo.
Pemberian tablet besi pada
kelompok kontrol dilakukan setelah kegiatan penelitian selesai.
Cara Pemberian Kapsul Besi Kapsul besi yang diberikan kepada sampel penelitian berasal dari tablet tambah darah (TTD) dari program pemerintah yang mengandung 200 mg fero sulfat atau 60 mg besi elemental dan 0,25 mg asam folat yang dikapsulkan. Kapsul besi dibuat di Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor dilakukan oleh Apoteker yang sudah berpengalaman. Tablet besi program tersebut dibuat dalam bentuk kapsul dengan tujuan untuk menghindarkan bias pada saat pengumpulan data, agar antara tablet besi dan plasebo tidak dapat dibedakan oleh petugas dilapangan dan responden kecuali peneliti yang bertanggung jawab dalam membagi kelompok suplemen.
33
Kapsul besi dikirim sebanyak 25 kali (satu minggu dua kali selama tiga bulan) ke sekolah selama penelitian berlangsung dilakukan dimulai setelah pengumpulan data dasar (pada awal penelitian). Pemberian kapsul besi dilakuan di sekolah oleh petugas dari Puslitbang Gizi dan Makanan dibantu oleh guru, kecuali bagi responden yang tidak masuk sekolah, kapsul besi diantarkan ke rumah oleh guru atau responden temannya yang tempat tinggalnya berdekatan. Untuk mencegah agar tidak ada responden yang terlambat minum kapsul besi, guru atau setiap murid yang bertugas sebagai distributor kapsul besi dibekali buku catatan yang berisi daftar nama-nama responden dan jadwal waktu minum kapsul besi yang sudah ditentukan, beserta surat pernyataan yang harus ditanda tangani oleh orang tua sampel yang menyatakan bahwa orang tua benar menyaksikan anaknya memakan kapsul yang diberikan oleh sekolah. Bila ada keluhan dari responden dilaporkan kepada guru koordinator dan dicatat, kemudian dilaporkan kepada petugas dari Puslitbang Gizi dan Makanan.
Cara Pengumpulan Data Sampel yang dipilih adalah murid-murid SMP Purnawarman Kecamatan Rancabungur dan Mts Fathusa’adah Kecamatan Sukaraja kelas VII, VIII dan IX berusia 12-15 tahun. Terhadap seluruh murid terpilih dilakukan pengumpulan data identitas diri, seperti nama, umur, nama orang tua, pekerjaan dan pendidikan orang tua, besar keluarga, keadaan ekonomi keluarga; data anthropometri meliputi berat badan dan tinggi badan; status kesehatan; data konsumsi makanan; pengambilan darah untuk pemeriksaan status besi dan kadar hormon prohepsidin. Data menggunakan
identitas
responden
kuesioner.
Data
dikumpulkan berat
badan
dengan
cara
dikumpulkan
wawancara
dengan
cara
penimbangan menggunakan timbangan injak dengan ketelitian 0,1 kg, tinggi badan diukur dengan menggunakan microtoise dengan ketelitian 0,1 cm. Data konsumsi makanan dikumpulkan dengan cara recall dua kali 24 jam dan diolah dengan menggunakan program nutrisof. Semua pengukuran dan wawancara dilakukan oleh tenaga terlatih dari Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Data kesehatan diperoleh dengan pemeriksaan secara fisik yang dilakukan oleh dokter dari Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Sedangkan data kadar hemoglobin,
34
kadar feritin dan kadar
prohepsidin yang merupakan prekursor bagi hormon
hepsidin dikumpulkan dengan cara pengambilan contoh darah dari responden sebanyak 2,5 ml melalui vena menggunakan vacutainer dengan ukuran jarum 23G yang dilakukan oleh tenaga analis kesehatan yang terlatih dari Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Kadar hemoglobin diukur dengan metode Cyanmethemoglobin dilakukan di laboratorium Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor, sedangkan kadar feritin dan kadar prohepsidin dilakukan dengan metode ELISA oleh tenaga-tenaga terlatih di laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia IPB. Setelah tiga bulan pemberian kapsul besi berlangsung, selanjutnya dilakukan pemeriksaan evaluasi dengan mengumpulkan data BB dan TB, konsumsi makanan serta darah untuk pemeriksaan status besi dan hormon prohepsidin.
Variabel Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kadar hemoglobin awal, feritin awal, prohepsidin awal, tingkat kecukupan energi, protein, vitamin A, vitamin C, zat besi, dan,
sedangkan variabel terikatnya
adalah
perubahan
kadar
hemoglobin, perubahan kadar feritin, dan perubahan kadar prohepsidin.
Pengolahan dan analisis data Manajemen data meliputi kegiatan editing, entri dan cleaning data sebelum dilakukan analisis. Editing mulai dilakukan oleh pewawancara semenjak data diperoleh dari jawaban responden. Pengolahan data diarahkan untuk menjawab tujuan penelitian dengan membuat tabulasi untuk masing-masing variabel. Analisis data dilakukan dengan univariat dan bivariat dengan menggunakan SPSS 17. Analisis univariat ditujukan untuk menjelaskan masing-masing variabel yang diteliti. Data disajikan dalam bentuk rata-rata, simpang baku dan sebaran meliputi kadar Hb, umur, jumlah suplemen (kapsul) yang dikonsumsi, asupan energi dan protein, konsumsi vitamin A, vitamin C dan zat besi. Selanjutnya data numerik yang tidak terdistribusi normal dianalisis dengan menggunakan prosedur uji statistik nonparametrik.
35
Untuk mengetahui kemungkinan variabel-variabel bebas (kadar Hb, kadar Feritin, kadar prohepsidin dan tingkat kecukupan zat gizi) yang mungkin berpengaruh terhadap variabel terikat (perubahan biomarker status besi; perubahan kadar Hb, feritin dan prohepsidin) dilakukan dengan analisis regresi linear berganda.
ANALISIS DARAH Cara Pengambilan darah Sampel darah yang digunakan untuk analisis hemoglobin adalah whole Blood sebanyak 20 µl, sedangkan sampel darah yang digunakan untuk analisis kadar feritin dan kadar hepsidin adalah berupa serum masing-masing sebanyak ± 300 µl dan ditambah untuk back up sampel serum 300 µl sehingga darah yang diambil adalah ± 2,5 ml. Pengambilan darah vena untuk memperoleh darah sebanyak 2,5 ml adalah sebagai berikut:
Alat-alat dan Bahan Alat-alat yang diperlukan untuk pengambilan darah adalah spuit 2.5 ml, jarum ukuran 23 G, alkohol swab 70%, tabung centrifugasi, tabung serum, handyplast, label nama, tourniquit, rak tabung, dan cool box.
Cara pengambilan contoh darah Pertama-tama disiapkan alat-alat dan bahan-bahan untuk keperluan pengambilan darah. Diperhatikan vena yang akan ditusuk, letaknya yang supervisial dan cukup besar, selanjutnya tourniquit dipasang pada lengan atas, jangan terlalu kencang dan tidak boleh terlalu lama. Tempat yang akan ditusuk didesinfeksi dengan alkohol 70 % kemudian vena ditusuk perlahan-lahan. Bila berhasil akan terlihat darah memasuki spuit, kemudian zuiger ditarik perlahanlahan sampai didapatkan jumlah darah yang diinginkan. Setelah itu tourniquit dilepaskan dan sepotong kapas steril yang kering ditempatkan pada tempat penusukkan tadi, lalu jarum dikeluarkan perlahan-lahan. Responden diminta untuk
36
meneruskan menekan kapas tadi selama 2-3 menit sambil lengan direntangkan kemudian bekas tusukkan tadi ditutup dengan handyplast. Jarum dilepaskan dari spuitnya lalu darah dimasukkan ke dalam botol/ tabung perlahan-lahan supaya tidak menimbulkan buih dan sebaiknya dialirkan melalui dinding tabung atau botol. Bila digunakan anticoagulant segera dikocok perlahan-lahan agar tercampur rata. Selanjutnya bekas jarum dibuang pada tempat yang sudah disediakan dan tidak boleh dicampur dengan sampah yang lain. Darah yang sudah didapat disentrifugasi dan diambil serumnya, serum dibagi menjadi tiga dan dimasukkan ke dalam tabung serum, masing-masing untuk analisis kadar feritin, kadar prohepsidin dan untuk cadangan, masing-masing tube serum diberi nama responden dan tanggal pengambilan atau kode yang sudah dibuat untuk masing-masing responden, kemudian dibawa ke laboratorium untuk dianalisis. Apabila tidak langsung dianalisis maka harus disimpan pada suhu -20 0C atau -70 0
C stabil sampai ± 6 bulan.
Analisis hemoglobin Sampel darah yang digunakan adalah whole blood sebanyak 20 µl dari darah vena yang diambil bersamaan dengan darah vena untuk analisis kadar feritin serum dan kadar prohepsidin serum. Darah yang sudah didapat dari vena sebelum dibiarkan membeku dan dicentrifugasi untuk diambil serumnya, terlebih dahulu diambil sebanyak 20 µl untuk pemeriksaan hemoglobin, dilakukan duplo (2 analisis) agar lebih akurat. Kadar hemoglobin diukur pada panjang gelombang 546 nm menggunakan spektrofotometer HUMALYZER type 840 dilakukan di laboratorium Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Pereaksi kit yang digunakan untuk pemerikasaan hemoglobin adalah merek HUMAN dari German siap pakai dengan menggunakan metode cyanmethemoglobin.
Prinsip reaksi Hemoglobin dengan larutan K 2 Fe(CN) 6 berubah menjadi methemoglobin kemudian menjadi hemoglobin sianida ( HbCN ) oleh KCN dengan absorbansi maksimum pada 546 nm. Pengaturan pH dilakukan dengan menambah KH 2 FO 4 ,
37
untuk mempercepat lisis eritrosit dan mengurangi kekeruhan HbCN ditambah non ionic detergent. Absorbansi warna berbanding lurus dengan konsentrasi Hb.
Alat Alat dan Bahan Bahan yang digunakan untuk pemeriksaan kadar hemoglobin adalah darah vena dan pereaksi cyanmethemoglobin sedangkan alat yang dibutuhkan adalah pipet mikro 20 µl, pipet mikro 5000 µl, tabung reaksi, rak tabung dan spektrofotometer.
Prosedur Analisis Disiapkan 3 tabung reaksi seukuran 5 ml, masing-masing diberi label pereaksi blanko ( blk), Pereaksi standar ( std ) dan Pereaksi Sampel ( spl ), pada tabung blk diberi 5000 µl ( 5 cc ) Pereaksi Hb Cyanida, dan tabung std diberi 20 µl sample darah standar dan ditambah dengan 5000µl Pereaksi Hb Cyanida dicampur hingga homogen, tabung spl diberi 20 µl sample darah dan ditambah dengan 5000 µl Pereaksi Cyanida, kemudian didiamkan selama minimal 5 menit pada suhu kamar, selanjutnya diukur absorbansi std dan absorbansi spl terhadap pereaksi blanko pada panjang gelombang 546 nm
Analisis Feritin Kadar feritin dianalisis dengan menggunakan EIAgen Feritin merek ADALTIS dari Milano Italy
Cat:
LI4023 96 test, dengan metode ELISA.
Analisis feritin dibaca dengan alat Microplate reader merek BIO-RAD Model 680 Series. Dilakukan di laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia IPB Bogor.
Prinsip Reaksi EIAgen Feritin Kit berdasarkan pada pengikatan feritin manusia dengan dua antibodi monoklonal: satu diimobilisasi pada sumur mikroplate, konjugat yang lain dengan horserasdish peroxidase (HPR). Setelah inkubasi pelepasan ikatan ditunjukkan dengan pencucian fase padat sederhana. Enzim pada fraksi ikatan bereaksi dengan substrat tetrametilbenzidin (TMB) membentuk warna biru yang berubah menjadi kuning setelah penambahan stop solution (H 2 SO 4 ). Konsentrasi
38
feritin dalam sampel dikalkulasi berdasarkan seri kalibrator. Intensitas warna proporsional dengan konsentrasi feritin dalam sampel.
Alat-alat dan Bahan Alat-alat yang diperlukan untuk anlisis kadar feritin adalah pipet mikro 20 µl, pipet mikro multichannel 100 µl, dispenser otomatis, microplate reader dengan kemampuan mengukur panjang gelombang 405, pipet tips disposible, tissue penyerap dan kertas grafik. Sedangkan bahan yang diperlukan adalah serum sampel, serum kontrol, aquadest, Microplate dengan 12 x 8 sumur yang di coated dengan antibodi monoklonal anti-feritin yang dapat dipatahkan, 6 vial kalibrator yang mengandung 0, 5, 20, 100, 400, 1000 ng/ml feritin hati manusia dengan gentamicin 0,01% sebagai pengawet, Conjugate yang mengandung antibodi monoklonal anti-feritin yang berkonjugasi dengan horseradish peroksidase (HRP), substrat yang mengandung campuran 0,25 g/l TMB (tetrametilbenzidin) dan H 2 O 2 (hidrogen peroksida), Stop Solution yang mengandung H 2 SO 4 0,3 M, Buffer pencuci 20x yang mengandung 50 ml konsentrat bufer pencuci yang mengandung bufer fosfat 50 mM pH 7,4 dan tween 201 g/l
Preparasi Pereaksi Larutan pencuci diencerkan 1:19 dengan aquadest, contoh : 25mL larutan pencuci + 475 mL aquadest. Stabil sampai tanggal kadaluarsa setelah diencerkan.
Prosedur Analisa Semua pereaksi harus berada pada suhu kamar (18-250C) sebelum digunakan, dan semua pereaksi harus dikocok perlahan sebelum digunakan jangan sampai berbusa, untuk kurva standar harus disiapkan masing-masing dua sumur, satu sumur untuk blanko dan dua sumur untuk masing-masing sampel. Pertama-tama dipipet 20 µl tiap kalibrator dan sample ke dalam masingmasing sumur yang sudah diberi nomer, lalu dipipet 100 µl konjugat ke dalam semua sumur dengan menggunakan pipet mikro multichannel. Setelah itu diinkubasi 60 menit suhu ruang (22-280C), kemudian dicuci dengan Microplate Washer atau dengan pipet mikro multichannel sebanyak 3 kali dengan isi tiap
39
sumur 300 µl. Setelah selesai buang sisa cairan dengan tisue pembersih. Selanjutnya dipipet 100 µl substrat ke dalam tiap sumur lalu diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu ruang (22-280C) pada tempat gelap. Terakhir dipipet 100 ul Stop Solution ke dalam tiap sumur, goyang 5 detik dan dibaca plate dengan Microplate Reader pada 450nm.
Analisis Prohepsidin Pereaksi yang digunakan untuk analisis prohepsidin adalah pereaksi DRG® Hepcidin Prohormone ELISA (EIA-4644) dari Amerika Serikat untuk penentuan kadar prohepsidin dalam serum dan urin
manusia. Metode yang
digunakan adalah metode ELISA. Analisis Prohepsidin dibaca dengan alat Microplate reader merek BIO-RAD Model 680 Series. Dilakukan di laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia IPB Bogor.
Prinsip Analisis DRG
Hepcidin
Prohormone
ELISA
Kit
adalah
enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) fase padat, berdasarkan pada prinsip pengikatan kompetitif. Sumur-sumur mikrotiter dilapisi dengan antibodi poliklonal langsung pada sisi antigenik molekul prohepsidin. Prohepsidin endogenus dari sampel pasien bersaing dengan konjugat biotin prohormon hepsidin untuk berikatan pada antibodi yang dilapisi pada sumur-sumur microplate. Setelah inkubasi konjugat yang tidak terikat dicuci. Jumlah yang terikat dengan konjugat biotin adalah berbanding terbalik dengan konsentrasi prohepsidin dalam sampel. Setelah penambahan larutan substrat intensitas warna yang terbentuk berbanding terbalik dengan konsentrasi prohepsidin dalam sampel
Alat-alat dan bahan Alat-alat yang digunakan dalam analisis ini adalah: 1. pipet mikro 50 µl, 2. pipet mikro multichannel 100 µl, 3. dispenser otomatis, 4. microplate reader dengan kemampuan mengukur panjang gelombang 405, 5. pipet tips disposible, 6. tissue penyerap dan 7. kertas grafik. Sedangkan bahan yang digunakan adalah: 1. serum sampel, 2. serum kontrol, 3. Microtiterwells, 12x8 (dapat dipatahkan) strips
40
96 sumur yang sudah dilapisi dengan antibodi poliklonal anti prohepsidin, 4. Standard (Standard 0-6) 7 vial (lyophilized), 1 mL; konsentrasi: 10, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/mL peptida hepsidin sintetik yang mengandung < 0.02% methylisothiazolone dan < 0.02% bromonitrodioxane sebagai pengawet, 5. kontrol, 1 vial (lyophilized) 1 mL dengan nilai kontrol dan rentangnya sesuai dengan yang tertera di label vial, 6. Assay Buffer 1 vial 14 mL, siap pakai, mengandung < 0.02% methylisothiazolone dan < 0.02% bromonitrodioxane sebagai pengawet, 7. Biotin Conjugate (fragment prohepsidin berkonjugasi dengan biotin, 1 vial 14 mL yang megandung < 0.02% methylisothiazolone dan < 0.02% bromonitrodioxane sebagai pengawet; siap pakai, 8. Enzyme Complex horseradish peroksidase 1 vial 14mL mengandung < 0.02% methylisothiazolone dan < 0.02% bromonitrodioxane sebagai pengawet, 9. Substrate Solution Tetramethylbenzidine (TMB) 1 vial mengandung 0.5M H 2 SO 4
14 mL siap pakai, 10.
Stop Solution
1 vial 14 mL siap pakai, 11. Wash Solution
(konsentrat 40 X) 1 vial 30 mL, 12. Aquades.
Preparasi Pereaksi Diencerkan 30 mL konsentrat Wash Solution dengan 1170 mL aquades, stabil selama dua minggu pada suhu kamar.
Prosedur analisis Setiap kali menjalankan analisis harus termasuk satu seri kalibrasi. Pertama-tama harus dipastikan semua sumur mikrotiter berada pada mikrotiter holder sesuai nomornya. Dipipet 100 μl Assay Buffer ke dalam masing-masing sumur lalu dipipet 50 μl masing-masing standar, kontrol dan sampel dengan tips sekali pakai baru ke dalam tiap sumur yang sudah dinomori dan untuk masingmasing sampel harus dibuat duplo. Selanjutnya dipipet 100 μl konjugat biotin ke dalam masing-masing sumur, lalu dikocok selama 10 detik, ini penting agar tercampur homogen. Setelah itu diinkubasi selama 120 menit pada suhu kamar (tanpa menutup plate), kemudian isi sumur dibuang dengan cepat dan sumur dibilas 5 kali dengan Wash Solution (400 μl per sumur). Sumur dihentakkan dengan keras ke tissue penyerap untuk membuang sisa-sisa residu. (sensitivitas
41
dan ketepatan pengukuran dipengaruhi kebersihan pada saat pencucian). Selanjutnnya ditambahkan 100 μl Enzyme Complex ke masing-masing sumur, lalu diinkubasi lagi selama 60 menit pada suhu ruang. Isi sumur selanjutnya dibuang dengan cepat dan dibilas 5 kali dengan Wash Solution (400 μl per sumur). Kemudian sumur dihentakkan dengan keras ke tissue penyerap untuk membuang sisa-sisa residu, lalu ditambahkan 100 μl Substrate Solution pada masing-masing sumur. Diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu ruang. Reaksi enzimatik distop dengan menambahakan 100 μl Stop Solution pada masing-masing sumur dan terakhir dibaca pada panjang gelombang 450 ± 10 nm dengan mikrotiter plate reader dalam waktu 10 menit setelah penambahan Stop Solution. Hasil pembacaan dihitung berdasarkan kurva standar (kalibrator).
Analisis C-Reactive Protein (CRP) CRP adalah suatu protein fase akut yang terdapat di dalam serum manusia sebagai respon terhadap berbagai kondisi imflamasi dan nekrosis jaringan dan menghilang seiring dengan kondisi kesembuhan. CRP biasanya ditemukan pada kasus infeksi bakteri, rheumatoid fever aktif dan beberapa neoplasma yang menular dan sering berhubungan dengan kasus rheumatoid arthritis, infeksi virus, dan tuberkulosis. Pereaksi yang digunakan untuk analisis CRP ini adalah CRP Latex Test yang diproduksi oleh Antec Diagnostic dari United Kingdom untuk analisis kulitatif dan semi kuantitatif CRP dalam serum manusia.
Prinsip Analisis Pembacaan ditunjukkan dengan menguji suspensi partikel lateks yang di lapis dengan antibodi CRP manusia terhadap serum yang tidak dikenal. Adanya aglutinasi yang tampak mengindikasikan suatu peningkatan kadar CRP yang bermakna secara klinis yang menunjukkan kemungkinan adanya infeksi atau peradangan.
42
Alat-alat dan bahan Alat-alat yang digunakan dalam analisis ini adalah: pipet mikro 40 µl, 50 µl dan 100 µl, slide test, batang pengaduk (stirer pipet), tabung kecil, larutan salina, rotator dan timer. Bahan - bahan yang dibutuhkan dalam analisis CPR adalah: serum sampel yang jernih, kontrol serum positif dengan konsentrasi ˃ 15 mg/l, kontrol serum negatif mengandung˂
0,1% azide, buffer konsentrat
glisin (sebelum digunakan harus diencerkan 10 kali) pH antara 8,0 – 8,2.
Prosedur Analisis Metode Kualitatif Semua pereaksi harus dipastikan mencapai suhu kamar, kemudian kocok perlahan pereaksi latex untuk membuyarkan partikel latex yang menumpuk agar tidak mengendap. Diambil 40 µl pereaksi latex dengan menggunakan pipet mikro, dan letakkan pada tiap lingkaran pada slide test. Dengan menggunakan stirer pipet tambahkan satu tetes serum ke satu lingkaran pada slide test yang sudah ada pereaksi latexnya, kemudian campur dengan menggunakan stirer dan ratakan di seluruh lingkaran.
Slide test dimiringkan sambil digoyang ke depan dan ke
belakang perlahan-lahan selama sekitar dua menit, lalu interpretasikan hasil gumpalannya (aglutinasinya) kemudian dibandingkan dengan kontrol positif dan negatif.
Catatan: Mereaksikan serum dengan latex jangan lebih dari dua menit karena dapat menyebabkan hasil yang salah (positif palsu). Terakhir hasil dicatat dan slide test dicuci dengan aquadest dan dikeringkan untuk dipakai kembali. Adanya aglutinasi mengindikasikan bahwa kadar CRP sampel sama dengan ˃ 6 mg/l (Regen Kit CRP Antec Diagnostic, 2010)
43
Tabel 6. Seri pengenceran CRP Pengenceran Serum sampel Saline
1/2 100 µl 100 µl
1/4
1/8
1/16
100 µl
100 µl
100 µl
100 µll Volume sample 6 x titer Mg/ml
50 µl 6x2 12
50 µl 6x4 24
100 µl 50 µl 6x8 48
100 µl 50 µl 6 x 16 96
Metode Semi-kuantitatif Semi-kuantitatif test dapat dilakukan seperti cara kualitatif dengan menggunakan seri pengenceran serum dalam larutan salina, bufer fosfat, atau saline glycin dengan cara seperti pada Tabel 6. Titer CRP diperlihatkan dengan adanya aglutinasi pada pengenceran tertinggi. Misalnya jika terjadi aglutinasi pada pengenceran ke 3, titernya adalah 8 berhubungan dengan konsentrasi 48 mg/l.
