2 e SMT Workshop Moleculaire Typeringen spa typering en MLST

2e SMT Workshop Moleculaire Typeringen spa‐typering en MLST 28‐30 Januari, 2013 UMC Utrecht en RIVM

Leo M Schouls Laboratorium voor Infectieziekten en Screening (LIS) Centrum voor Infectieziektebestrijding (CIb) Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM)

Moleculaire typeringen • Eerste generatie methoden: – Analyse van op gels gescheiden DNA fragmenten • Belangrijkste nadelen: – Methoden hebben weinig portabiliteit › Kleine variaties hebben vaak grote gevolgen – Data niet eenvoudig uitwisselbaar › Uitwisseling en normalisatie van grafische files (gel images) • Sequentie‐gebaseerde methode veel beter

2

2e SMT workshop | 28‐30 januari 2013 Leo Schouls

1

Sequentie‐gebaseerde moleculaire typeringen • Single‐locus sequence typing – Bacterieel gen bijv. spa‐typering – Viraal gen bijv. hepatitis B virus (www.HepSEQ.org) • Multi‐locus sequence typing – Meerdere virale genen bijv. MLST – Meerdere virale genen bijv. van hepatitis C virus • Meestal betreft dit het sequencen van delen van de genen • Veel beter zou zijn gebruik van complete genoomsequentie

3


Spa‐Typering, karakterisering Staphylococcus aureus • S. aureus was één van de eerste bacterie‐species waarin resistentie tegen penicilline gevonden werd – Reeds in 1947, 4 jaar na de start van penicilline productie • Daarna werd meticilline gebruikt, een sythetische variant van penicilline – Reeds in 1961, 2 jaar na de introductie van meticilline, werden de eerste Methicillin Resistant Staphylococcus aureus = MRSA gevonden (UK)

4


2

MRSA bestrijding in Nederland: Search & Destroy Search • Bij ziekenhuisopname, navraag of patiënt in risicocategorie valt • Zo ja, dan ‘MRSA kweek’ van patiënt en contacten

Destroy • Isolatie van patiënt • Bij kolonisatie behandeling met neuszalf en chloorhexidine zeep • Bij infectie antibioticum behandeling (vancomycine)

5


Waarom typering van MRSA Vragen zijn: • Vindt er MRSA transmissie tussen patiënten of tussen patiënten en personeel plaats in een zorginstelling? • Is er sprake van overdracht tussen zorginstellingen? • Wat zijn de trends in verspreiding en is er sprake van import van bepaalde MRSA stammen vanuit andere landen? Om deze vragen te beantwoorden typeren we de MRSA stammen

6


3

Hoe typeer je S. aureus (en MRSA)? ‘Vroeger’: – Faagtypering (1952) – Serologische typering (1962) Nu: moleculaire typering – Pulsed‐field gel electroforese (PFGE) – Multi‐locus sequence typing (MLST) – Spa‐sequence typing – Multiple‐locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA)

7


Proteine A • Het eiwit proteine A (SpaA) is een 56 kDa groot ‘microbial surface components recognizing adhesive matrix molecule’ (MSCRAMM) in S. aureus • Proteine A wordt gezien als een belangrijke virulentiefactor – Stammen zonder proteine A zijn minder virulent • Proteine A zit vast aan het oppervlak van de S. aureus en bindt immuunglobulines – Binding is in verkeerde orientatie waardoor opsonisatie en fagocytose gestoord worden

8


4

Het spa gen • Proteine A wordt gecodeerd door het spa‐gen the spa gene S

E

D

A

B

C

CWAS

repeats • • • •

S = signaalsequentie Repeats E t/m C = coderen voor Ig‐bindende domeinen (160 bp) Regio met 24 bp lange repeats CWAS = Cell wall associated sequence


9

Spa‐typering • Het aantal repeats in het spa‐gen is variabel S

E

D

A

B

C

S

E

D

A

B

C

S

E

D

A

B

C

CWAS

CWAS

CWAS

• Eigenschap wordt benut voor stamtypering

10


5

Variatie in repeat regio van het spa gen PCR met flankerende primers S

E

D

A

B

C

CWAS

spa‐gen PCR product Interne marker (16S rRNA PCR)

11


Mechanismen die variatie in het aantal repeats veroorzaken: Normale replicatie

Actie van DNA polymerase tijdens replicatie Perfecte kopie van template

12


6

Mechanismen die variatie in het aantal repeats veroorzaken: Backward replication slippage

Incorrecte replicatie, aantal kopieën neemt toe

13


Mechanismen die variatie in het aantal repeats veroorzaken: Forward replication slippage

Incorrecte replicatie, aantal kopieën neemt af

14


7

Spa‐typering Number of repeats based on PCR product size

Typing based sequence of PCR product

Development of currently used Spa‐ Typing technique  Ridom 2e SMT workshop | 28‐30 januari 2013 Leo Schouls

15

Repeatvariatie in spa‐gen: aantal en sequentie cattacaGAGGAAGACAACAACAAGCCTAGCGAGGAAGACAACAACAAGCCTAGCGAGGAAGACAACAACAAGCCTAGCttattgct

cattacaGAGGAAGACAACAACAAGCCTAGCGAGGAAGACAACAACAAGCCTAGC

ttattgct

cattacaGAGGAAGACAACAACAAGCCTAGCAAAGAAGACAACAAAAAGCCTGGCGAGGAAGACAATAACAAACCTGGTttattgct

01 02 03 cattacaGAGGAAGACAACAACAAGCCTAGC

GAGGAAGACAATAACAAACCTGGTttattgct

01 03 Spa‐Profielen: 01‐01‐01 01‐01 01‐02‐03 01‐03 16

Elk Spa‐Profiel vertgenwoordigt een Spa‐Type t001: 26‐30‐17‐34‐17‐20‐17‐12‐17‐16 t026: 08‐16‐34


8

Nomenclatuur standaardiseren Ridom

Repeatsequenties

Spa‐Typen met bijbehorende Spa‐Profielen 2e SMT workshop | 28‐30 januari 2013 Leo Schouls

17

Spa‐typering is gebaseerd op samenstelling van de repeat regio S

E

D

A

B

C

CWAS

Spa‐typering methode: • Voer PCR uit • Sequence het PCR product • Identificeer de repeats • Vergelijk de repeatsequenties met tabel en geef bijbehorende repeat‐ID • Vergelijk het onstane profiel van repeat‐ID’s met tabel en geef typenummer 18


9

Spa‐typering Voordelen • Techniek eenvoudig en betaalbaar: PCR en sequencing • Resultaten robuust en eenduidig • Grote internet‐toegankelijke database met standaard nomenclatuur • Wereldwijd gebruikt Nadelen • Slechts 1 locus: wat betekent één enkele mutatie? • Clustering is lastig  verwantschapsbomen moeilijk te maken

19


Deel II: MLST

Multi Locus Sequence Typing = MLST • Karakterisering door sequencing van meerdere gen‐segmenten

20


10

MLST is ontstaan uit de MLEE • Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE): variatie in enzymen

• Multi Locus Sequence Typing (MLST): variatie in de genen die coderen voor de enzymen

21


Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE) • Relative electrophoretische mobiliteit van cellulaire enzymen

Mannitol 1‐phosphate dehydrogenase in E. coli

Glucose 6‐phosphate dehydrogenase in N. meningitidis

Malate dehydrogenase in E. coli

22


11

MLEE bepaalt Zymovars • MLEE wordt nog steeds gebruikt

23


MLST het principe • Kies een aantal genen (meestal 7) van het bacterie‐species die – altijd aanwezig zijn – relatief weinig variëren › huishoud‐genen • Voer PCR uit op deze genen (ca. 500 bp) • Sequence deze PCR producten • Vergelijk de gensequenties met die in tabellen (allelen) • Geef allelnummer als de sequentie gelijk is aan die in de tabel • Als de sequentie niet gelijk is aan die in de tabel niet geef de variant dan een nieuw allelnummer (volgnummer)

24


12

MLST het principe • Resultaat is een soort telefoonnummer van allelen – Genen: arcC ‐ aroE – glpF – gmk – pta – tpi ‐ yqiL – Allelnummers: 1 ‐ 3 ‐ 1 ‐ 10 ‐ 11 ‐ 5 ‐ 11 – Verkorte schrijfwijze van allelprofiel is het Sequence Type: ST5 Let op! • Een enkele mutatie geeft al een ander allel • Het allelnummer zegt niets over de verwantschap – Allel 1 verschilt mogelijk 50 bp van allel 2 en 1 bp van allel 121

25


Verwerking van MLST data • MLST data kunnen op 2 manieren gebruikt worden voor clustering – Op basis van de MLST profielen – Op basis van de aan elkaar geknoopte sequenties (concateneren) • Hierover meer in de presentatie van Bruno Pot

26


13

MLST, een veelgebruikte techniek • Er is een grote verzameling van MLST databases beschikbaar via internet: • http://www.mlst.net/ en http://pubmlst.org/

27


MLST voor‐ en nadelen Voordelen • Zeer robuust en betrouwbaar • Data zijn makkelijk uitwisselbaar en geschikt voor internet‐ toegankelijke databases • Vooral geschikt voor analyses op populatieniveau Nadelen • Arbeidsintensief • Duur – Er zijn per stam 7 PCR’s nodig en 14 sequence‐reacties • Vooral geschikt voor analyses op populatieniveau 28


14

Spa‐typering tijdens cursus • Vandaag: PCR uitvoeren – 3 MRSA isolaten per groepje • Morgen: Sequencing door BaseClear • Overmorgen verwerking data in BioNumerics – Resultaten sequencing importeren en editten – Spa‐Profielen en Spa‐Typen bepalen in Bionumerics – Vergelijk met andere profielen in de database

29


Practicals • Inzetten van de PCR

30


15

MLST tijdens cursus • Geen praktische uitvoering

31


16

2 e SMT Workshop Moleculaire Typeringen spa typering en MLST

Recommend Documents