2-[18F]fluoroetil-tozilát előállítása és tisztítása
Oktatási segédanyag a Jelzett vegyületek elválasztástechnikája (TKML0431) gyakorlathoz radiokémikus szakirányú vegyész MSc hallgatók számára
Összeállította:
Szikra Dezső
Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Nukleáris Medicina Intézet
Debrecen 2013
Tartalom
1. A gyakorlat célja ................................................................................................................3 2. Elméleti áttekintés ..............................................................................................................3 2.1. Receptorok kimutatása izotópjelzett vegyületekkel ..................................................................... 3 2.2. 2-[18F]fluoretil-tozilát ................................................................................................................... 4 2.2.1. Előállítás ................................................................................................................................ 4 2.2.2. A 2-[18F]fluoretil-tozilát felhasználása ................................................................................... 5 2.3. A gyakorlaton használt technikák ................................................................................................ 6 2.3.1. Radio-HPLC ............................................................................................................................ 6 2.3.2. Szilárdfázisú extrakció ........................................................................................................... 8
3. A gyakorlaton alkalmazott kromatográfiás rendszer ...........................................................9 3.1 Hardver .......................................................................................................................................... 9 3.2. Szoftver ...................................................................................................................................... 10
4. A gyakorlaton elvégzendő feladatok ..................................................................................14 5. Kérdések önálló felkészüléshez .........................................................................................15 6. Felhasznált és ajánlott irodalom .......................................................................................16
2
1. A gyakorlat célja 2-[18F]fluoroetil-tozilát manuális előállítása és SPE tecnikával történő tisztítása. A tisztítás hatásosságát befolyásoló paraméterek vizsgálata. A termék tisztaságának meghatározása radio-HPLC-vel
2. Elméleti áttekintés 2.1. Receptorok kimutatása izotópjelzett vegyületekkel PET (pozitron emissziós tomográfia) technika lényege, hogy pozitron emittálással bomló izotóppal jelzett molekulákat juttatunk az élő szervezetbe, és PET kamera segítségével detektáljuk elhelyezkedésüket. A PET kamera segítségével kapott kép attól függ, hogy milyen hordozó molekulát választunk az izotópjelöléshez, és hogy az hogyan dúsul-, illetve áramlik a szervezetben. A legelterjedtebben alkalmazott [18F]FDG segítségével elsősorban tumorok jelenléte vizsgálható, mivel a rákos sejtek felfokozott anyagcseréjük miatt több cukrot vesznek fel, így jobban halmozzák az [18F]FDG-t mint az egészséges sejtek. A megfelelő képalkotáshoz szükséges, hogy radioaktív izotóp csak a vizsgált molekulához kötötten legyen jelen a szervezetben. A radiofarmakonok radiokémiai tisztasága általában 95% fölötti kell legyen. Az izotópjelzett vegyületeket emellett jellemezhetjük még kémiai tisztaságukkal és specifikus aktivitásukkal is. A specifikus aktivitás azt adja meg, hogy mekkora a minta radioaktivitásának és a benne lévő jelzett molekula anyagmennyiségének aránya (Bq/g v. Bq/mol). Az anyagcsere folyamatokban résztvevő molekulák izotópjelzési hatásfoka kevésbé fontos, azonban a receptorok kimutatására használt farmakonokkal szemben elvárás a minnél magasabb specifikus aktivitás. A sejtek felszínén lévő receptorok száma általában igen alacsony, így kis specifikus aktivitású radiofarmakon felhasználásakor a feleslegben lévő „hideg”, vagyis radioaktív izotópot nem tartalmazó molekulák telítik a receptorok kötőhelyeit, és az izotópjelzett molekula nem tud kellő számban kötődni ahhoz, hogy feldúsulása láthatóvá váljon a PET felvételen.
3
2.2. 2-[18F]fluoretil-tozilát A
18
F-al végzett radiojelölések során a direkt nukleofil szubsztitúció a legkedveltebb és
leghatékonyabb eljárás. Ez azt jelenti, hogy a megfelelő védőcsoportokkal és távozócsoporttal ellátott molekulát [18F]fluorid ionokkal reagáltatjuk, és a kapott terméket védőcsoport eltávolítás és tisztítás után rövid időn belül felhasználhatjuk. Amennyiben a jelölendő vegyület szerkezete miatt ez az út nem járható, szekunder prekurzorok előállítása szükséges. Például hidroxil-, amino-, amido- és tiol-csoportokat tartalmazó molekulák esetén fluoroalkilezést használhatunk. A leggyakrabban alkalmazott másodlagos jelölő anyagok 18Ffluoro-(CH2)n-X szerkezetűek, ahol n=1-3 és X csoport szulfonátot jelöl (mezil, nozil, tozil, triflát), vagy bromidot, illetve jodidot. A 2-[18F]fluoretil-tozilát (FETos) előnyös tulajdonsága, hogy kevéssé illékony, kémiailag stabil és megfelelően reaktív. Szélesebb körű felhasználását gátolja, hogy hagyományos SPE technikával nem tisztítható megfelelően, így HPLC tisztítása szükséges, ami nagyban megnöveli a szintézisek idejét. Ha a FETos-t nem tisztítják meg a kiindulási anyagként használt ditoziláttól, a jelzendő molekula dimerizációja vagy térhálósodása mellett hidroxi-etil származékok is keletkezhetnek, melyek a termékbe átkerülve jelentősen lecsökkenthetik specifikus aktivitását. B. W. Schoultz és munkatársai egy olyan SPE tisztítási módszert dolgoztak ki, mely lehetővé teszi megfelelő tisztaságú FETos előállítását HPLC-s elválasztás nélkül (lásd: ajánlott irodalom). A gyakorlaton ezt a tisztítási eljárást fogjuk vizsgálni.
2.2.1. Előállítás
A prekurzor [18F]fluorral történő jelölését nukleofil szubsztitúcióval valósítjuk meg. Intézetünkben a [18F]fluorid-ion radionuklid előállítása
18
O(p,n) 18F magreakcióval történik a 4
ciklotronban, ahol nagy dúsítási fokú [18O]H2O-t sugárzunk be [18F]FDG (2-fluor-dezoxiglükóz) előállításához. A besugárzott
18 -
F -iont tartalmazó [18O]H2O vizet a ciklotron targetből
közvetlenül a felhasználás helyére, az automatizált FDG gyártó panelre juttatjuk 0,8 mm belső átmérőjű PEEK vezetéken keresztül, sűrített levegő segítségével.
A besugárzások után a
targetben maradt dúsított víz maradékát vizes öblítéssel lehet a szintézispanelre juttatni. Ez általában még jelentős mennyiségű
18
F-at tartalmaz. Kísérleteinkhez a második mosóvizet
használjuk fel, amely 1-3 GBq aktivitású. Az automatizált szintézisek során a 18F--iont anioncserélő oszlop (Waters QMA) segítségével választják el a besugárzott víztől. Erre azért van szükség, mert a target fém alkatrészeiből hosszú felezésiidejű izotópok keletkeznek, melyek nem kerülhetnek át a termékbe, valamint a dúsított víz tisztítás után újradúsítható, ezért visszanyeréséről gondoskodni kell. A QMA oszlopon adszorbeálódott
18 -
F -iont nagytisztaságú hélium gáz segítségével szárítják, és
kálium-karbonát oldattal eluálják. Az eluátum a vízben oldott kálium-karbonáton kívül fázistranszfer katalizátort (kriptofix 2.2.2.) és acetonitrilt tartalmaz. Ezt az elegyet azeotróp bepárlással szárítják, melynek előnye az, hogy a víztartalom alacsonyabb hőmérsékleten és gyorsabban távozik. A fluorid iont felhasználó radiokémiai szintéziseket nukleofil szubsztitúcióval (SN2) végezzük. A szubsztitúciót vízmentes közegben kell végrehajtani a megfelelő hozam eléréséhez. Amennyiben víz marad a reakcióelegyben, úgy a
18 -
F -kriptofix 2.2.2.-K+ komplex nem kellő mennyiségben
alakul ki, következésképpen a szubsztitúció alacsony hatásfokkal játszódik le. A fázistranszfer katalizátor vízmentes acetonitril közegben növeli a [18F]fluorid nukleofilitását, ami kulcsfontosságú az izotópjelzés sikeressége szempontjából. A szubsztitúció kezdetén a vízmentes acetonitrilben oldott prekurzort hozzáadjuk a beszárított komplexhez, majd az elegyet az optimális hőmérsékleten tartjuk a reakció végbemeneteléig. A kapott termékelegyet adszorpciós vagy kromatográfiás módszerrel tisztítjuk.
2.2.2. A 2-[18F]fluoretil-tozilát felhasználása A FETos többek között felhasználható [18F]FDPN ([18F]fluoroetil-diprenorfin) előállítására, mely az agy opioid receptoraihoz kötődő radiofarmakon.
5
A [18F]FDPN érdekessége, hogy ezzel a farmakonnal sikerült először igazolni azt a feltételezést, hogy a hosszútávfutók „mámoráért” az agyban keletkező endorfinok a felelősek, melyek az opioid receptorokhoz kötődnek (Bonni Egyetem, Müncheni Műszaki Egyetem 2008). 2 órás futás előtt és után készített PET felvételeken látszik, hogy a testmozgás hatására felszabaduló endorfinok blokkolják az agyi opioid receptorokat, így az agy [18F]FDPN felvétele jelentősen csökken. Minnél „magasabbra repülnek” a futók, annál alacsonyabb a farmakon felvétel.
2.3. A gyakorlaton használt technikák 2.3.1. Radio-HPLC A reakció követésére, és a termék tisztaságellenőrzésére radio-HPLC technikát alkalmazunk. A rendelkezésre álló berendezés kisnyomású gradiens rendszer UV és radioaktivitás detektorral. Kisnyomású gradiensképzésről akkor beszélhetünk, ha a HPLC rendszer az oldószereket a pumpa előtt, a kisnyomású oldalon elegyíti. Általában 4 oldószer keverésére van lehetőség. Az oldószereket 1/8 inch külső átmérőjű teflon csövön keresztül szállítjuk a keverőkamrába egy-egy mágnesszelepen keresztül. Az egyes szelepek nyitva tartásának idejével szabályozható, hogy milyen arányban keverjük össze az oldószereket. Gradiens képzésnél ezek az idők változnak, melyet a szelepek kattogási sebességének változásán keresztül észlelhetünk. A kisnyomású gradiensképzés legnagyobb problémája, hogy a szerves oldószerekben oldott levegő buborékokat képez a vízzel való elegyítés hatására, melyek a pumpa működését megzavarják. Ez mindenképpen kerülendő, ezért különféle gázmentesítési eljárásokat használunk: 1. Ultrahangos gázmentesítés (szonikálás). Az ultrahang által mikroszkopikus méretekben keltett, gyorsan váltakozó nagy nyomás és vákuum hatására az oldószerben oldott gázokból makroszkopikus méretű buborékok képződnek, amelyek kibuborékolnak az oldatból. Alapos
6
gázmentesítéshez 10-15 perc szonikálás szükséges, ez vákuum egyidejű alklamazásával 2-3 percre csökkenthető. 2. Héliumos gázmentesítés. A hélium gyakorlatilag elhanyagolható mértékben oldódik az oldószerekben, ezért héliummal alaposan átbuborékoltatva az eluenst vele ki lehet űzni az oldott gázokat. Folyamatos hélium átbuborékoltatás megváltoztatja az eluens szerves oldószertartalmát, így célszerűbb az oldószereket enyhe hélium túlnyomás alatt lezárva használni. 3. Vákuumos gázmentesítés. Megvalósítható akár úgy, hogy az oldószert alacsony nyomáson kevertetve éppen forrásba hozzuk, amikor is az oldott gázok eltávoznak, vagy úgy, hogy az oldószeráramlás útjába (on-line) helyezünk egy folyamatosan működő, vákuumkamrás gázmentesítő egységet, amely mindig csak annyi oldószert gázmentesít, amennyi éppen felhasználásra kerül. Ez a legelterjedtebb, és legmegbízhatóbb módszer, azonban sok hiba forrása lehet ha az on-line degasser elszennyeződik a benne hagyott eluenstől.
Nagynyomású gradiens rendszer
Kisnyomású gradiens rendszer
7
2.3.2. Szilárdfázisú extrakció A szilárdfázisú extrakció (SPE) egy kromatográfiás tisztítási/mintaelőkészítési eljárás, melynek lényege, hogy az elválasztandó komponenseket tartalmazó oldatot egy SPE tölteten átáramoltatva belőle egyes komponensek megkötődnek, míg mások áthaladnak. Az állófázison megkötött anyagok megfelelő eluenssel leoldhatóak. Napjainkra a szilárdfázisú extrakció a legfontosabb HPLC-s mintaelőkészítési eljárássá vált. Legfontosabb előnyei a folyadék-folyadék extrakcióval szemben: •
A vizsgált komponensek hatékonyabb kinyerése
•
Jobban elválaszthatók a zavaró komponensek
•
Alacsonyabb szerves oldószer felhasználás
•
Kényelmesebb manuális műveletek
•
Szilárd szennyeződések eltávolítása
•
Egyszerűen automatizálható
•
Nem képződhet emulzió
Hátrányai: •
Az SPE töltetek tulajdonságai sarzsonként változhatnak
•
Egyes komponensek irreverzibilisen kötődhetnek a tölteten
•
Egyes esetekben összetettebb módszerfejlesztés válhat szükségessé
Szilárdfázisú extrakcióra leggyakrabban műanyag házban (fecskendő) elhelyezett fordított fázisú tölteteket alkalmazunk. A hagyományos töltetek átlagosan 40um-es szemcseméretű szilikagél alapúak és a HPLC-s állófázisokra hasonlítanak. Az utóbbi években igen népszerűvé váltak a polimer alapú állófázisok, melyek számos előnnyel bírnak: •
nagyobb felületűek, ezért nagyobb a kapacitásuk
•
jobban nedvesíthetőek
•
jobban tűrik a beszárítást a kondícionálás után
•
a szilanol csoportok hiánya miatt kisebb a valószínűsége az erős bázisok irreverzibilis adszorpciójának
•
szélesebb pH tartományban használhatóak
8
Az alkalmazott retenciós mechanizmustól függően az alábbi SPE technikák valósíthatóak meg: apoláros, poláros, kationcserés, anioncserés és kevert módú. A leggyakrabban alkalmazott mód az apoláros SPE, mely a fordított fázisú kromatográfiával analóg módon működik. A gyakorlaton is ezt a módot fogjuk alkalmazni.
Apoláris szilárdfázisú extrakció lépései 1. Kondícionálás Néhány töltet térfogatnyi acetonitrillel vagy metanollal kondícionáljuk a töltetet. Ennek során eltávolítjuk a levegőből adszorbeálódott szennyeződéseket és szolvatáljuk az adszorbenst. Ezután a szerves oldószert kevés levegővel eltávolítjuk a töltetről, majd vízzel vagy a mintának megfelelő összetételű oldattal mossuk. Ezután nem szabad a töltetet sokáig állni hagyni, mert az állófázist szolvatáló oldószer lassan kidiffundál a vízbe, így a töltet szolvatáltsága lecsökkenhet („de-wetting”). 2. Mintafelvitel A mintát gyenge oldószerben kell a töltetre felvinni (általában 10% alatti szerves oldószer tartalom) néhány ml/perces sebességgel. 3. Mosás A töltetet olyan oldószerrel mossuk, amely a mérendő komponenseket nem eluálja, de a jelenlévő szennyezőket eltávolítja. 4. Elúció A mérenndő komponensek elúciója erős eluenssel. Gyakran szükséges eltérő pH-jú eluens használata
3. A gyakorlaton alkalmazott kromatográfiás rendszer 3.1 Hardver A gyakorlat során Waters LC Module 1 HPLC rendszeren végzünk méréseket, amely UV és radioaktivitás detektorral van ellátva. A készülék vezérlését és a mérési adatok gyűjtését számítógép segítségével végezzük, Waters Millenium programmal.
9
A készülék tetején hélium alatt lezárt üvegekben találhatóak az eluensek (A,B,C,D ág). A gradiensképzés a pumpa előtti kisnyomású keverőkamrában történik az egyes eluens ágakra kötött mágnesszelepek nyitvatartási idejének vezérlésével. A beépített Waters 600-as pumpa 0,1-15 ml/perc tartományban 4000 psi nyomásig használható, tipikusan 20-40 psi pulzálás mellett szállítja az eluenst. A minták injektálása a készülék alján lévő 96 férőhelyes tálcából autosampler segítségével történik. A kolonnáról érkező effluens UV, majd radioaktivitás detektoron halad át.
3.2. Szoftver A Waters Millenium32 V4.0 (2001) egy gyógyszeripari követelményeknek megfelelő kromatográfiás szoftver. A jelenleg elterjedten használat Empower 3 elődje. Lehetővé teszi a kromatográfiás mérések elvégzése mellett a méréssel kapcsolatos összes információ kezelését, 10
a mérések, a számolások és a jelentéskészítés teljes automatizálását. A gyakorlaton röviden megismerkedünk a szoftver legfontosabb funkcióival: •
Kromatográfiás módszer írása (mérési körülmények megadása)
•
Mintatábla megírása, mérés indítás
•
Kromatogrammok manuális kiértékelése és riport nyomtatás
„Run samples” ablak Az ablak alsó részén láthatók az aktuális nyomás-, áramlási sebesség-, és eluens összetétel értékek. Itt állíthatjuk le a pumpát, illetve itt állíthatjuk be a fenti paramétereket manuálisan. Korábban megírt „Instrument method”-nak megfelelő értékeket is behívhatunk, illetve alapvonalfigyelést indíthatunk. Az ablak közepén lévő táblázat kitöltésével írhatunk mintatáblát, melyet elindítva a program soronként hajtja végre az egyes minták mérését a megadott módszer szerint. Az ablak jobb oldalán láthatjuk az éppen futó minta valós idejű kromatogrammját, illetve a nyomásgörbét.
„Instrument method” ablak Itt állíthatjuk be a mérési körülményeket. A pumpa ikonjára kattintva a „Flow” fülön a 11
nyomáshatárokat, az áramlási sebességet valamint izokratikus módban az eluensek keverési arányát adhatjuk meg. Gradiens módot választva egy táblázatot kell kitöltenünk, ahol soronként egy-egy időponthoz tartozó eluensösszetételt írhatunk be. A detektor ikonjára kattintva a detektálási hullámhossz mellet az adatgyűjtési frekvencia változtatható. Ha keskeny csúcsokra számítunk, érdemes a maximális adatgyűjtési sebességet választani, azonban ekkor az alapvonali zaj is növekedhet (főleg alacsony hullámhosszon).
„Project” ablak A kromatogrammokat és a mérési módszereket „project”-ekbe csoportosítva tárolja a program. A korábbi méréseket injektálásonként nézhetjük meg az „Injections” fülön, az egyszerre elindított méréseket „Sample sets”-en belül a mintatábla neve és mérési ideje alapján tekinthetjük át. Ha kijelölünk egy- vagy több injektálást, a hozzá tartozó 12
kromatogrammokat a „Channels” fülön láthatjuk. Minden detektor kromatogrammja külön tárolódik, és rögzíthető a futás során mért nyomás is, melynek a hibaelhárításban van nagy szerepe. Az adott minta egyik csatornájára kattintva új ablakban megjelenik a kromatogramm, melyet egy korábban megírt módszer megnyitása után automatizáltan, vagy kézzel integrálhatunk. A kiintegrált kromatogrammok a „Results” fülön láthatóak, ahonnan egy „Riport method” kiválasztásával nyomtathatók.
A „Review” ablakban egy vagy több kromatogramm kiértékelését végezhetjük el. Az integrálás eredménye csak úgy menthető el, ha megnyitunk egy „Processing method”-ot. Ezután akár kézi integrálást is végezhetünk, de a szoftver lényege az automatizált integrálási módszerek minnél hatékonyabb támogatása. Számos paramétert megadhatunk, amelyel a szofter által automatikusan megtalált fölösleges, vagy hibásan integrált csúcsokat kizárhatjuk, illetve a szabálytalan alakú csúcsok pontos integrálását beállíthatjuk. Több kromatogrammot is egymásra hívhatunk, illetve a „2D channels” fülön válthatunk is közöttük. Itt, az ablak alsó részén láthatjuk az integrálási eredményeket is a „Peaks” fülön.
13
Radiokromatogrammok értékelése A kromatogrammon kiintegrált csúcsok területét bomláskorrigálni kell, ha a csúcsok detektálása között eltelt idő nem hanyagolható el a vizsgált izotóp felezési idejéhez képest. A bomláskorrekciónál referenica időre számoljuk vissza a csúcsterületet, és ebből számítunk aktivitáskoncentrációt. Referencia idő lehet az injektálás ideje, a szintézis vége, esetleg a besugárzás vége (EOB). A csúcsterület bomláskorrekciójánál az alábbi egyenletet használjuk:
Amért = Akorr . e − λt t1/2 (18F) = 109,8 perc
λ=
ln 2 t1 / 2
4. A gyakorlaton elvégzendő feladatok A gyakorlat során védőszemüveg folyamatos használata kötelező! A folyadékok mozgatására elsősorban egyszerhasználatos műanyag fecskendőket és finnpipettákat használunk. A használt tűket és fecskendőket külön, feliratozott gyűjtőedénybe 14
tegyük. A pipettahegyeket rögtön a használat után eltávolítjuk, nedves heggyel a pipettákat nem fektetjük a laborasztalra. A radioaktív oldattal szennyezett fecskendőket, pipettahegyeket ólomvédelem mögött elhelyezett gyűjtőedénybe tegyük.
FETos előállítása 5ml-es Eppendorf-csőben ismert aktivitású
18
F oldathoz adjunk 350ul kriptofix/K2CO3
elegyet (80%ACN, 20% víz, 29umol kriptofix, 14umol K2CO3). Az oldatot 85oC-ra előmelegített fűtőblokkban 40 l/h hélium áramban pároljuk szárazra, majd ezt követően 3x1 ml abs. acetonitrillel is pároljuk be. Az acetonitril hozzáadása idejére a hélium bevezető tűt távolítsuk el az edényből az elegy kifröccsenésének elkerülésére. Az utolsó bepárlás után távolítsuk el a gázbevezető tűt, az edénybe tegyünk mágneses keverőbotot, és 1ml abs. acetonitrilben oldott 7,5mg etilénglikol-ditozilátot adjunk a beszárított fluoridhoz. 5 percig kevertessük az elegyet 85oC-on, majd mérjük le aktivitását. Határozzuk meg a reakcióelegy FETos tartalmát HPLC-vel. Mintaelőkészítés: a termékelegy hígítása vízzel 1:1arányban.
FETos tisztítása A termékelegyhez adjunk 3ml 0,007M ecetsavat. Szűrjük át 0,45um-es fecskendőszűrőn, majd vigyük fel előzetesen aktivált Waters C18plus sep-pak-ra. Az spe cartridge-ot mossuk át 5ml vízzel, majd eluáljuk 35%-os metanollal. 1ml-es frakciókat szedjünk, és mérjük az oldatok valamint a mosóvíz aktivitását. Ellenőrizzük a tisztítás hatásosságát HPLC-vel.
FETos koncentrálása Egyesítsük a tisztított termékfrakciókat, és mérjük le összaktivitását. Számoljuk ki a kiindulási aktivitásra vonatkoztatott hozamot bomláskorrekcióval és anélkül. Dolgozzunk ki eljárást az oldat töményítésére.
5. Kérdések önálló felkészüléshez •
FETos előállításának lépései
•
HPLC rendszer részei
•
Apoláros SPE lépései
•
Csúcsterület bomláskorrekciója 15
6. Felhasznált és ajánlott irodalom [1] Bent W. Schoultz, Brian J. Reed, János Marton, Frode Willoch and Gjermund Henriksen, A Fully Automated Radiosynthesis of [18F]Fluoroethyl-Diprenorphine on a Single Module by Use of SPE Cartridges for Preparation of High Quality 2-[18F]Fluoroethyl Tosylate,
Molecules 2013, 18, 7271 [2] L.R.Snyder, J.K.Kirkland, J.W.Dolan: Introduction to modern liquid chromatography, 3rd ed. John Wiley ans Sons 2010
16
