3/22/16
Az immunassay-k jelentősége “Az analitikai biokémia hátaslova” Alkalmazás
IMMUNOASSAY
Immunoassay típusok Homogén - Heterogén Direkt - Indirekt Kompetitív - Nem kompetitív
Részesedé Analit típusa s
Koncentráció tartomány
Gyógyszerszint meghatározás
26%
Kis molekulák
10 nM-mM
Fertőző betegségek
21%
Baktériumok, vírusok, nagy molekulák, antitestek, metabolitok
low
Endokrinológia
33%
Kis molekulák, nagy molekulák beleértve az antitesteket is (70% <5 kDa)
pM-nM
Immunológia allergia, autoimmunitás, egyéb
7%
Antitestek
pM-nM
Tumor
5%
Nagy molekulák, antitestek
pM-nM
Egyéb (specifikus proteinek stb.)
8%
Nagy molekulák
> nM
AZ IMMUNASSAY-K TÍPUSAI
Kompetitív (a reagens mennyisége limitált) szimultán: Ab + Ag + Ag-L Ab:Ag + Ab:Ag-L + Ag-L több lépéses: 1. lépés: Ab + Ag Ab:Ag + Ab Ab:Ag + Ab:Ag-L + Ag-L 2. lépés: Ab:Ag + Ab + Ag-L Nem kompetitív (a reagens feleslegben van) L=ligand: radioaktív izotóp, fluorofór, enzim, chemiluminescens, kofaktor, inhibitor, fém, partikulum, szubsztrát, polinukleotid HETEROGÉN: a komplexben kötött és szabadon lévő ligandummal jelzett reagenst a lekötődött jel detektálása előtt elválasztjuk
HOMOGÉN: a kötött és szabad jelzett reagens elválasztása nem szükséges
1
3/22/16
RADIOIMMUNOASSAY (RIA)
Csak abban az esetben használatos, ha egy specifikus és nagyon érzékeny módszerre van szükség. A RIA hátrányai: • a nagy γ-sugárzó izotóp atomokkal történő jelölés, mint a I125 gyakran nem megfelelő (a gyógyszerek kis molekulák, nem hatékony a jelölés vagy csökken az antigenitásuk) • a tríciummal való jelölés megfelelő, de ennek hátránya, hogy a H3 β-sugárzó és a β -scintillációs számlálás lassú és körülményes. • Csak heterogén módszer lehet.
Antigén helyett az antitest jelölése izotóppal: immunoradiometric assay (IRMA)
FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) II.
(az összes jelzett antigén antitesthez kötött – lassú rotáció)
At
+
A módszer elve: • egy fluoreszkáló anyaghoz (fluorofór) kémiai kötéssel antigént (gyógyszer, hormon, metabolit) kapcsolnak (konjugátum) • a fluorofórhoz kötött antigént megvilágítják polarizált fénnyel • Ha a konjugátumhoz nem kötődik antitest, szabadon rotál az oldatban és a beeső és az emittált fény síkja egymáshoz képest elmozdulhat. • Ha a konjugátumhoz antitest kötődik, az antitest molekula nagy mérete kb. 100x-ra csökkenti annak rotációs relaxációs idejét. Ez azt jelenti, hogy csak kis elmozdulás jöhet létre ugyanannyi idő alatt, ezért az elnyelt és kibocsátott fény ugyanabban a síkban polarizált. • Az emittált fény polarizációjának mértéke arányos a szabad konjugátum mennyiségével. • Ha a mintában lévő szabad antigén korlátozott mennyiségű antitest kötőhelyeiért versenyez a konjugátummal, a fény polarizációjának mértéke jelzi a minta antigén koncentrációját.
FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) III.
A mintában jelen van az antigén
A mintában nincs antigén
antitest
FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) I.
Ag
At-Ag
jelzett antigén
(a mintában lévő antigén az antitesthez kötődik – a jelzett antigén szabadon rotál) At + Ag At-Ag + Ag + Ag antitest
jelzett antigén
minta
síkban polarizált beeső fény
antigén a mintában
minta
ugyanabban a síkban kibocsátott fluoreszcencia
síkban polarizált beeső fény
Depolarizált fluoreszcencia A detektálás síkjában csökkent fluoreszcencia intenzitás
2
3/22/16
FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) IV.
Immunoassay típusok - nem kompetitív jel második At
jel
• A készülékek a polarizált fény intenzitását mérik, ami fordított arányban áll a minta antigén koncentrációjával.
At
első At
Ag
Ag
direkt at polarizáció
jel
indirekt
jel
Ag
At 2
Ag At
At 1
direkt ag
antigén koncentráció
szendvics
Immunoassay formációk - kompetitív 1
Immunoassay formációk - kompetitív 2
!!! jelzett Ag a reagensben
Ag jelöletlen At a mintában
jelzett At a reagensben
Ag a mintában
jelöletlen At a reagensben vagy a felszínen
3
3/22/16
JELZÉSEK 1.
A szilárd felszín típusai
• 96 lyukú mikrotitráló lemez felszíne (polystirol, PVC stb) (ELISA) • Reakciócső felszíne (RIA) • Latex partikulumok felszíne (pl. MEIA) • Mágneses partikulumok felszíne (automatizált heterogén immunoassay-k)
Izotóp
Enzim
(125I:
γ, T1/2= 60 nap γ, T1/2= 270 nap 3H: β, T 1/2= 12.26 év 14C: β, T 1/2= 5760 év) tormaperoxidáz HRPO (oxidoreduktáz) alkalikus foszfatáz AP (primer alkoholok, fenolok és 57Co:
aminok foszfát észtereinek hidrolízise)
β-D- galaktozidáz glükóz oxidáz glükóz-6-foszfát dehidrogenáz kataláz ureáz
JELZÉSEK 2.
Fluorofór
(megvilágítva fényt emittál) 1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP⇒ MU Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) acridium észter acridium szulfonamid isoluminol Biotin Protein A Kofaktor Inhibitor DNS
4
3/22/16
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Microwell Products
Ha az elfogó antitest biotinált és streptavidinnel bevont ELISA lemezt használunk, az elfogó, jelző antitesteket és a mintát egyszerre is bemérhetjük. Az inkubálási idő letelte után mossuk a lemezt majd bemérjük az enzim szubsztrátját és detektálunk (egylépéses ELISA).
Biotinilált anti-FXIII-B elfogó antitest
FXIII
A
A
B
B
Enzyme-Linked ImmunoSorbent (ELISA) – leggyakrabban peptidek, proteinek, antitestek és hormonok kimutatására és meghatározására szolgál.
Általában 96-well plate-t használunk (Corning’s/Nunc/Costar stb.), de lehet 384 well, stb.
Lépései:
•
A lemezt bevonjuk (capture) az antigénre specifikus elfogó antitesttel (1-10µg/ ml) leggyakrabban karbonát-bikarbonát pufferben (pH:9.5), inkubálás 2 h szobahőn vagy egy éjszakán át 4°C-on
• mosás
•
A szabadon maradt felszín blokkolása (0,5-1% BSA), inkubálás 0,5-1 h szobahőn
• mosás
•
Standardok/minták bemérése (50-100 µl/well), inkubálás 1 h szobahőn
• mosás
•
Az antigénre specifikus, enzimmel (HRP/AP) konjugált jelző antitest bemérése, inkubálás 1 h szobahőn
• mosás
•
Szubsztrát adása és detektálás
Az inkubálási időket és hőmérsékleteket minden ELISA esetén optimalizálni kell.
ELISA kalibrációs görbe
ELISA (szendvics típus)
Reagensek
ELISA (szendvics típus)
Szükség van istmert ag koncentrációjú standardra!
Reakció
HRP-vel jelölt anti-FXIII-A jelzô antitest
A
A
B
B
Streptavidinnel fedett felület
A lemez rázatása szükséges!
Az egy lépéses szendvics ELISA FXIII meghatározás elve
5
3/22/16
Indirekt ELISA módszer (adott antigénre specifikus antitest kimutatása)
MEIA (Mikropartikuláris Enzim Immuno Assay)
Anti-Troponin I monoklonális
antitesttel fedett Latex szemcsék
Üvegszál mátrix
A Mikropartikuláris Enzim Immunoassay (MEIA)
elméleti alapjai A mérendő anyagra specifikus elfogóval fedett szubmikron nagyságú latex részecskéket alkalmaz a módszer. Következmény: nagy, hatékony felületet az immunreakció számára. a kinetikus reakció felerősödik, csökken az inkubációs idő. Mintavevő egységben: A mérendő minta és a szükséges reagensek egy reakcióedénybe kerülnek Mérőegységben: 1. A minta inkubálódik 2. A reakcióelegy egy inert üvegszálas mátrix felületére kerül át. Az immunkomplex fennmarad az üvegszálakon, a reakcióelegy többi összetevője átáramlik, kimosódik. 3. Az üvegszálas mátrix felületére egy a mérendő anyagra specifikus, alkalikus foszfatázzal jelzett konjugátum kerül. 4. Az üvegszálas mátrix felületére 4-Methylumbelliferyl-foszfát (MUP) kerül, melyet az enzim Methylumbelliferonná (MU) hidrolizál. 4. A reakció során a mátrix felületén keletkező fluoreszcens MU képződési rátáját mérjük, ami arányos a mintában lévő analit koncentrációjával.
A MEIA reakció lépései Kétlépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG • Minta • Mikropartikulumok • Alkalikus foszfatáz konjugát REAKCIÓ EGYSÉG A minta és a Mikropartikulumok keverednek Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik
Egylépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG • Minta • Mikropartikulumok • Alkalikus foszfatáz konjugát REAKCIÓ EGYSÉG A minta a Mikropartikulumok és az Alkalikus foszfatáz konjugát keverednek Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik
MOSÁS MOSÁS Alkalikus foszfatáz konjugát a mátrixra
Fluoreszcencia mérés
MOSÁS Fluoreszcencia mérés
6
3/22/16
JELZÉSEK
Tipikus standard görbe MEIA módszer esetén
Fluorofór
(megvilágítva fényt emittál) 1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP⇒ MU DELFIA: a TRF (Time Resolved Fluorometry) elvén működik
JELZÉSEK
Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál)
Enzim szubsztrátja kemiluminescens fényemisszióval stabilizálódik, pl: AP szubsztrátja az adamantil 1,2-dioxetan arylfoszfát (AMPPD) isoluminol (A HRPO hatására, H2O2 jelenlétében bekövetkező luminol oxidáció fényemisszió
acridium
A DELFIA rendszerben a fluorometer 1000 excitációs fényfelvillanást szolgáltat másodpercenként, melyek kevesebb, mint 1 mikrosecundumig tartanak. A fluoreszcencia mindegyik impulzus után 400 és 800 mikrosecundum között mérhető
jelerősségét 1000-szeresre növelhetjük, ha a közegben szubsztituált fenolok, vagy naftolok vannak (pl. 4-jodofenol). Az enhanced kemilumineszcenciás jel 2-20 perc időtartamban jól leolvasható. Ezt a jelképzést sok automatizált módszer használja) észter, acridium szulfonamid (A jel keletkezésekor alkalikus közegben az észter kötés hasad s egy instabil N-metilakridon származék keletkezik, amely jellemző hullámhosszúságú fény felvillanások emissziójával stabilizálódik. A fényintenzitás mértéke a közeg lumineszcens anyag koncentrációjával arányos.)
Eltérően a fluoreszcencia méréstől, itt nincs besugárzási fény, és jel csak a lumineszcens molekulából származik, így a háttér teoretikusan nem ad jelet. Eltérően a radioaktív bomlástól, a kémiai reakcióból származó összes foton rövid idő alatt rendelkezésre áll, így növelve a potenciális specifikus aktivitást.
7
3/22/16
JELZÉSEK 4.
Elektrokemiluminescens immunoassay (ECLIA)
A rutenium(II) tris (bipiridil) [Ru(bpi)33+], egy platina elektród felületén gerjesztődik, majd alapállapotba kerül fény (elektrokemilumineszcens) emisszióval. A reakcióban elektron donorként tripropilamin (TPA) vesz részt. A Ru(bpi)33+ komplex redukciójával nyerjük a gerjesztett állapotú Ru(bpi)32+ komplexet, amely elektronleadás mellet fénykibocsátással tér vissza alapállapotába. Ezt a fénykibocsátást (620 nm) mérik egy átfolyó elektrokémiai cellában. Elektrondonor felesleg mellett a ruténium sokszorosan gerjeszthető, ami a jel erősödését eredményezi.
8
