15.* A sejtbiológia gyakorlata 15.1. Sejt- és szövettenyésztés: módszertani alapismeretek MADARÁSZ EMÍLIA 15.1.1. A sejt- és szövettenyészetek típusai 15.1.2. Sejttenyészetek készítése 15.1.2.1. Primer sejttenyészetek 15.1.2.2. Sejtvonal tenyészetek indítása 15.1.2.3. Felszíni sejttenyészetek 15.1.2.3.1. A sejtek folyadékkörnyezete 15.1.2.3.2. A sejtek „szilárd” környezete 15.1.3. Sejtszámváltozás a sejttenyészetekben Bevezetés Az egyes szervek, szövetek, sejtek élettani tulajdonságainak elemzése sok esetben szükségessé teszi, hogy a szervezet sokoldalú szabályozó hatásaitól független körülmények között végezzünk vizsgálatokat. Fiziológiás sóoldatban néhány órán át fenntartott, ún. túlélő szervpreparátumok (békaszívkészítmény, bélpreparátum) felhasználásával már a múlt században
születtek
fontos
szervélettani
eredmények.
A
sejtbiológiai
ismeretek
gyarapodásával és a laboratóriumi eszköztár fejlődésével fokozatosan alakultak ki azok a módszerek, amelyek a természetes környezetükből kiemelt szövetszeletek és egyedi sejtek hosszú idejű, in vitro fenntartását lehetővé teszik. A tenyésztőedényben fenntartott vagy növesztett szövet- és sejtpreparátum kedvező kísérleti objektum, mert: I. Az élő sejtek folyamatos mikroszkópos megfigyelés mellett növekedhetnek. Elrendeződésük, beavatkozásokra adott morfológiai válaszaik közvetlenül detektálhatók. Mikroelektrofiziológiai, farmakológiai vizsgálatok egyedi élő sejteken végezhetők. Egyes gének hatásai – transzfekció, génbevitel után – közvetlenül tanulmányozhatók. II. A tenyészetben növekvő sejtegyüttes összetétele pontosan meghatározható és megfelelő eljárásokkal szabályozható. Előállíthatók kizárólag egyféle szöveti sejtet vagy többféle sejtet meghatározott arányban tartalmazó preparátumok.
*
A fejezetben a leggyakrabban alkalmazott sejtbiológiai vizsgálómódszereket, eljárásokat tekintjük át – nem követjük a „Jelenség”,... stb. tagolást.
720
III. Nagyszámú (egyetlen tenyésztő tálcán 24, 96 vagy 384, ipari vizsgálatokra akár 1541), jó közelítéssel azonos preparátum állítható elő sorozatvizsgálatok számára. A nagyszámú preparátum viszonylag kevés élő szervezet feláldozásával létrehozható. A „mikrotenyészetek” (pl. 104 sejt 50 μl-nél kevesebb médiumban) alkalmazása a kezelésre használt anyagmennyiséget jelentősen csökkenti. IV. Sejtbiológiai és molekuláris biológiai módszerek felhasználásával folytonosan osztódó, geno- és fenotípus tekintetében azonos (klónozott) sejtek nagy tömege állítható elő nemcsak laboratóriumi vizsgálatok, hanem ipari alkalmazás (pl. ellenanyag-termelés) céljaira is. V. A sejtek folyadékkörnyezete könnyen változtatható és elemezhető. Hatóanyagok pontosan ismert koncentrációban juttathatók a sejtek környezetébe, és a sejtek által kibocsátott anyagok mennyisége folyamatosan ellenőrizhető. Az előnyös feltételek magyarázzák, hogy mára a sejt- és szövettenyészet a modern biológiai kutatások szinte minden területén alapvető kísérleti objektummá vált. A kísérletek tervezésénél és az eredmények élettani/farmakológiai értékelésénél azonban nem szabad megfeledkezni arról, hogy tenyészetmodellen megfigyelt reakciók nem jelzik biztosan az azonos típusú sejtek in vivo várható válaszait. Az in vitro sejtreakciók a sejtek lehetséges „saját” válaszai, amelyek a sokszorosan szabályozott in vivo környezetben nem, vagy jelentős eltérésekkel valósulhatnak meg. A hosszú ideig fenntartott tenyészetek esetén azzal is számolni kell, hogy a sejtsajátságok a tenyésztés során módosulhatnak. A sejtek feno- és genotípusának folyamatos ellenőrzése elengedhetetlen a tenyészeteken kapott eredmények értékeléséhez. 15.1.1. A sejt- és szövettenyészetek típusai Sejt- vagy szövettenyészetnek azokat a preparátumokat nevezzük, amelyekben sejteket legalább 24 órán át tartunk fenn. A tenyésztési körülményeket a felhasználás céljának megfelelően
választjuk
meg.
Változtathatjuk
a
tenyésztett
sejtek
mennyiségét,
elrendeződését, a tenyészetek sejtösszetételét, a sejtnövekedés és/vagy specializálódás megengedett mértékét stb. A különböző felhasználásoknak megfelelően, a sejt- és szövettenyészetek igen sok típusa alakult ki. Készíthetünk olyan tenyészeteket, amelyek jobban vagy kevésbé őrzik meg, illetve egyáltalán nem tükrözik az intakt szövet szerkezetét.
721
A szelettenyészet 200–400 μm vastag, steril körülmények között lemetszett szövetszeleteket tartalmaz. A szeletek egy megfelelő hordozófelületen tapadnak, és a sejtek – a szelet „vágott” felületeitől eltekintve – egy-két hétig tartják eredeti elrendeződésüket és kapcsolataikat. Az ún. explantátumtenyészet úgy készül, hogy 1 mm3-nél nem nagyobb szövetdarabkákat olyan hordozófelületre helyeznek, amelyre a sejtek le tudnak tapadni, illetve amelyen vándorolni tudnak. A kiültetés után a sejtvándorlás azonnal megindul, a szövetdarabka szegélyén a kivándorló sejtek egyre növekvő zónát képeznek: a zóna sejtösszetétele az egyes sejttípusok migrációs aktivitását tükrözi. A szövetdarabka fokozatosan vékonyodik, a belsejében együtt maradó, vastag szövetrész – megfelelő tápanyag-ellátás hiányában – egykét nap alatt elhal. Az elsődleges vagy primer sejttenyészetek a szövetből kiszabadított egyedi sejtek kiültetésével készülnek. A primer tenyészet a kiindulási szövetben jelenlevő sejttípusok heterogén preparátuma. Ha a sejtosztódást nem korlátozzuk, a gyorsan osztódó sejtféleségek aránya a tenyésztési idővel nő. A primer tenyészetben sejtdifferenciációs és regenerációs folyamatok révén újraalakulhatnak egyes szövetre jellemző sejtkapcsolatok. Átültetéssel a primer sejttenyészetekből másodlagos, harmadlagos stb. tenyészetek hozhatók létre. Ezek sejtösszetétele minden átültetéssel módosul: a gyorsabban osztódó sejtféleségek aránya fokozatosan nő. A normális szöveti sejtek csak korlátozott ideig maradnak osztódóképesek. A minden szövetben kis számban megtalálható „elkötelezetlen” sejtek (őssejtek, törzssejtek [stem cells]) megfelelő növekedési faktorok jelenlétében azonban korlátlan ideig megtarthatják osztódóképességüket. A már differenciálódó sejtek között is megjelenhetnek folytonosan osztódó sejtek: ezek általában spontán vagy környezet indukálta mutáció következtében alakulnak ki. Azokat a sokszorosan átültetett sejtpreparátumokat, amelyek 40–70 átültetés után is osztódóképes, egymáshoz hasonló fenotípusú sejteket tartalmaznak, sejtvonalaknak nevezik. Egyetlen sejtből származó, folytonosan osztódó, geno- és fenotípusukat tekintve is homogén sejtpreparátumok a sejtklónok. Az általánosan használt (megvásárolható) klónozott sejtvonalak általában mesterségesen halhatatlanná tett (génbevitellel immortalizált) vagy spontán (ismeretlen) mutáció révén transzformált (pl. tumorokból izolált) sejtek származékai. A klónozott sejtvonalak fenntartása során számolni kell az edényenként és sejtgenerációkként rendszeresen előforduló – fenotípusos változást is okozó – stabil mutációkkal. Ezért a vonalakat rendszeres időközönként, ismételten klónozni kell.
722
Az izolált sejtek a tenyészedényben különböző módon növekedhetnek attól függően, hogy milyen letapadásra, vándorlásra alkalmas felületet biztosítunk számukra. A normális szöveti sejtek ún. letapadásfüggő sejtek, szuszpenzióban általában 16–24 órán belül elpusztulnak. Szuszpenziós kultúrákban tartósan csak speciálisan transzformált sejtféleségek (pl. az antitest termelő hibridómasejtek) növeszthetők. A tápfolyadékban szuszpendált szöveti sejtek gömbhöz közeli alakot vesznek fel (15.1/1 ábra). Ez a sejtalak elsősorban a mikrofilamentum (aktin-miozin) rendszer (lásd 5.1.2) aktivitásának, az ún. sejtkontraktilitás jelenségének köszönhető. Az élő sejtben dinamikusan felépülő/lebomló és membránhoz kötődő/leváló aktin-szálak, a miozin-szálakon elcsúszva a sejtmembrán adott szakaszát a sejt belseje felé húzzák. Ez az aktivitás a sejt felszíni kiterjedését csökkenti. A felszínen időről időre átmeneti kitüremkedések (filopódiumok, membránhólyagocskák) jelennek meg (15.1/1 B ábra). Ezek a képletek a felületet növelik, és ha letapadásra alkalmas pontokat „találnak”, a sejt-letapadás ezek segítségével indul meg. 10 m
15.1/1. ábra Szuszpenzióban
2 m tatott
csontvelő-sejtek
fázis-kontraszt
mikroszkópos és pásztázó elektronmikroszkópos felvételen
Aggregátumtenyészetekben a szöveti sejtek egymással aggregálnak (15.1/2 ábra): a letapadási felületet a kapcsolódó sejtek felszínei biztosítják. Az aggregátumtenyészeteket olyan edényben lehet létrehozni, amelynek a falára a sejtek nem tudnak tapadni (pl. szilikonnal bevont felületek). Az aggregátumokon belül a sejtek folytonosan mozognak, és ez a mozgás megváltoztatja az eredetileg véletlenszerűen egymás mellé kerülő sejtek elrendeződését. Az egymás számára erős adhéziós felszíneket biztosító sejtek, idővel, egymás mellé kerülnek, és egymással létesítenek kapcsolatot. A velük kisebb adhéziós affinitással kapcsolódó, más típusú sejtek ebből a sejt-együttesből kiszorulnak (adhéziós kiválogatódás; sorting-out jelensége) (15.1/2 B ábra). A sejt-elrendeződés olyan háromdimenziós kapcsolatok kialakulására vezet, amely emlékeztet az in vivo szöveti szerveződéshez. A
B
ES fibroblaszt
50 m
100 m
723
15.1/2. ábra Aggregációs tenyészetben tartott neuroepitél sejtek (A) fázis-kontraszt mikroszkópos képe. Egymástól szegregálódó embrionális őssejtek és fibroblaszt sejtek közös aggregátuma. Felszíni, kétdimenziós tenyészetekben a sejtek letapadására alkalmas hordozó felületet a kísérletező alakítja ki. A letapadáshoz megfelelő felület szükséges, amely i. elegendő szilárdsággal rendelkezik ahhoz, hogy ellenálljon a sejt-kontraktilitás által kifejtett erőnek, ii. olyan molekula-csoportokat hordoz, amely attraktív kapcsolatba (lásd később) léphet az adott sejt-féleség adhéziós molekuláival. A letapadás-függő sejtekben – amilyenek a szilárd szövetek sejtjei - adhézió hiányában belső (programozott) sejtpusztulási folyamatok indulnak. Az adhézió-hiány okozta sejtpusztulás az anoikis. A sejtadhézió hiányában bekövetkező sejtpusztulást két tényezővel magyarázzák: i) az adhéziós molekula-kötődés – a letapadás-függő sejtekben - olyan jelátvitelt indít, amely anti-apoptotikus tényezőket aktivál. Hiányában az apoptotikus / antiapoptotikus tényezők egyensúlya az apoptózis felé tolódik el. ii) adhézió hiányában, a gömbhöz hasonló sejtalak olyan kis felszín/tömeg arányt (azaz intracelluláris és sejtfelszíni membránfelületet) biztosít, amely nem elegendő a sejt határfelületekhez kötött anyagcsere folyamatainak fenntartásához.
A letapadás-függő sejteket leggyakrabban integrinekkel kapcsolódni tudó molekulafelületeken (fibronektin, laminin, matrigel), vagy a sejtek által termelt extracelluláris mátrix molekulákat hatékonyan megkötő, kollagén vagy polikationos (pl. poli-lizin) bevonatú tenyésztőedényekben növesztik. A kereskedelemben kapható tenyésztőedények (jelzésük: TC = tissue culture) olyan speciálisan kezelt felületet biztosítanak, amelyen a legtöbb sejtféleség képes letapadni. Vannak azonban sejtek (pl. izom-, idegsejtek stb.), amelyek letapadásához megfelelő (pl. laminin, kollagén, fibronektin, polilizin stb.) molekulabevonatot kell létesíteni az edény alján. Ha a tenyésztőfelület jobb letapadást biztosít a sejtek számára, mint a szomszédos sejtek felszínei, akkor a sejtek – idővel – egyenletes bevonatot képeznek a felszínen: egyrétegű (monolayer) tenyészet alakul ki (15.1/3 ábra). Heterogén sejtek tenyészeteiben gyakori jelenség, hogy a felszínhez legerősebben tapadni tudó sejtféleség egy aljzatréteget alkot, a felszínnel kevésbé kapcsolódó sejttípusok pedig az aljzatsejtek felszínén helyezkednek el (15.1/4 ábra)1. (ahogy azt az elmult evekben azert tettuk) 1
Felszíni tenyészeteket alkalmaznak nagy tömegű sejttenyésztésre félüzemi/ipari körülmények között is. Ehhez igen nagy belső felületű edényeket fejlesztettek ki, amelyek elágazó belső „mikrogerendákon” hordozzák a sejteket. Nagy mennyiségű sejt növesztését biztosítják az ún. gyöngytenyészetek. Ezekben állandó lassú keverés mellett, mikrogyöngyök – összességében hatalmas – felszínén nőnek a sejtek.
724
10 m 15.1/3 ábra Neuroepiteliális sejtvonal sejtjeinek monolayer tenyészete. (Fázis-kontraszt mikroszkópos felvétel)
5 m
15.1/4 ábra Primér felszíni idegi sejttenyészet 15 napos egérembrió előagyából. A tenyésztőedény alját az asztroglia sejtek (jobb oldali inzertum) egy rétegben borítják, a felszínükön az idegsejtek (bal oldali inzertum) hálózatokat alkotnak.
15.1.2. Sejttenyészetek készítése 15.1.2.1. Primer sejttenyészetek A primer sejttenyészetek készítésénél a szöveti kapcsolataikból „kiszabadított” sejtek szuszpenzióit ülepítjük a megfelelően előkezelt tenyésztőfelületekre. A tenyésztendő szövet kiválasztásánál figyelembe kell venni, hogy milyen mértékű túlélés, sejtosztódás, regeneráció várható a szöveti szerkezet megbontása után. Végdifferenciált (sejtciklusból végleg „kilépett”, specializált) sejteket tartalmazó szövetek (pl. idegszövet, vázizom stb.) tenyészeteit fiatal posztnatális vagy embrionális mintákból érdemes indítani.
725
A sejtszuszpenzió előállításának módszereit úgy kell megválasztani, hogy az adott szövettípusra jellemző extracelluláris mátrix és sejt–sejt kapcsolatok hatékony megbontása mellett a lehető legkisebb sejtkárosodást okozzák. Kevés extracelluláris mátrixanyagot tartalmazó (pl. embrionális vagy limfoid) szövetek megbontására sok esetben elegendő az ún. mechanikus disszociáltatás. Ilyenkor a szövetet szérumot tartalmazó tenyésztőfolyadékban feldaraboljuk, és szűk nyílású Pasteur-pipettába vagy egyre kisebb lyukméretű injekciós tűbe többször egymás után felszívjuk, míg a nagyobb szövetdarabok „eltűnnek”. A disszociáltatást végezhetjük meghatározott pórusméretű (40–80 μm) steril szita felett: a szitán átfolyó folyadék egyedi sejteket tartalmaz, a nem disszociált szövetdarabok a szita felett tovább disszociáltathatók. Sokszoros
sejtkapcsolatokkal
vagy
nagy
mennyiségű
sejten
kívüli
makromolekularendszerrel rendelkező szövetek esetén a kapcsolatokat enzimes kezeléssel kell fellazítani, a sejtszuszpenzió enzimatikus disszociáltatással állítható elő. A szövetet feldaraboljuk, és a megfelelő proteolitikus enzim(ek) oldatával inkubáljuk. Az alkalmazott enzim vagy enzimkeverék típusa, az enzimek koncentrációja, a kezelés időtartama a szövet sajátságaitól függ2. Az enzime(ke)t az emésztés után inaktiváljuk, majd az előemésztett szövetdarabkákat mechanikusan disszociáltatjuk. A mechanikus disszociáció általában a további tenyésztésre használt – szérummal vagy sejtvédő makromolekulákkal (pl. poli-vinil-pirrolidon, dextránszármazékok) kiegészített – tápoldatban történik. A szuszpenzió „minőségét” és sejtkoncentrációját meghatározzuk (Bürker-kamra vagy automatizált sejtszámláló segítségével), és ha szükséges, a nagyobb szövetdarabokat, illetve a sejttörmeléket differenciálcentrifugálással eltávolítjuk (200-300 g, az ép sejtek 600-800 g mellett ülepednek 10% szérum tartalmú közegben, 5 perc ülepítés mellett). A sejtszuszpenzió meghatározott térfogatát az előkészített (bevonattal ellátott és a megfelelő gáztérben előinkubált
tápfolyadékot
tartamazó)
tenyésztőedénybe
pipettázzuk.
A
kiültetett
sejtmennyiség függ a sejtek osztódóképességétől. Gyorsan osztódó sejtek esetén általában
2
A kollagénrostokban gazdag szöveteket lehet kollagenázzal előkezelni, majd a sejtkapcsolatokat tripszinnel bontani, illetve proteolitikus enzim keveréket tartalmazó pronázkészítménnyel egy lépésben emészteni. A szénhidrátokban gazdag sejten kívüli molekularendszer emésztésére alkalmazhatók poliszénhidrátokat bontó (pl. hialuronidáz) enzimek. A főként sejtkapcsolatokkal összetartott szövetek bontásához leggyakrabban 0,05–0,25% (w/v) tripszinoldatot használnak, kalciummentes közegben. A proteolitikus enzim kezelés során szükségszerűen pusztulnak a disszociáltatott szövet sejtjei is. A belőlük kiszabaduló DNS-szálak olyan „ragasztó”-felületként működhetnek, amelyekre rácsapódnak élő és elhalt sejtek, valamint a szöveti törmelék. Ezért a proteolizís leállításával egyidőben érdemes DNS-t bontó (DN-áz) enzimmel is kezelni a preparátumot. Miután a DN-ázok az ép sejtek membránján nem jutnak át, az ép sejtek DNS-ét bontani nem tudják, külön hatástalanításukra nincs szükség.
726
5104–105 sejt/cm2 tenyésztőfelület, lassan növekvő tenyészetek esetén 5105 sejt/cm2 sűrűséggel érdemes a tenyésztést indítani. 15.1.2.2. Sejtvonaltenyészetek indítása A megvásárolható vagy tárolt sejtvonalak lefagyasztott állapotban (szárazjégben vagy cseppfolyós levegőben, illetve nitrogénben) kerülnek a tenyésztőlaboratóriumba. A fagyasztóampullában levő sejteket 37 ˚C -os melegítőbe tesszük. A felolvasztás során ügyelni kell arra, hogy a felmelegedés gyors legyen (hogy ne következhessek be a főleg –30 és –10 Co között történő, jégkristályok okozta, sejtpusztulást okozó membránkárosodás), ugyanakkor a sejteket ne melegítsük túl. A fagyasztáshoz használt oldat tartalmaz olyan adalékokat (krioprotektív anyagokat, pl. dimetil-szulfoxid, glicerol), amelyek a fagyasztás során a makromolekulák közvetlen környezetében segítenek megőrizni a vízszerkezetet és ezzel a natív konformációt, de felolvasztás után jelentősen károsíthatják a sejteket. Ezért a felolvadás után azonnal legalább 10-szeres térfogatú tápoldattal „hígítjuk” az ampulla tartalmát. Az így kapott sejtszuszpenziót – letapadásfüggő sejtek esetén – azonnal tenyészedénybe vihetjük. A sejtek letapadása után (1–2 óra) a tápoldatot lecseréljük: a fagyasztóadalékokat már nem tartalmazó tápoldatban a tenyészet „elindul”. Fagyasztóadalékra
érzékeny sejtek
esetén,
a
fagyasztóadalékokat
még tartalmazó
hígított
sejtszuszpenzióból centrifugálással kiülepítjük a sejteket, az oldatot eltávolítjuk és a sejteket friss
tápoldatban
szuszpendáljuk.
Az
így
nyert
szuszpenziót
pipettázzuk
a
tenyésztőedényekbe. Le nem tapadó sejtek esetén (de sok esetben letapadó sejtek indításánál is) érdemes a sejteket centrifugálással kiülepíteni a fagyasztó-adalékokat még tartalmazó szuszpenzióból. A kiülepített sejteket friss tápoldatban szuszpendáljuk, és az így nyert szuszpenziót pipettázzuk a tenyésztő edényekbe. 15.1.2.3. Felszíni sejttenyészetek 15.1.2.3.1. A sejtek folyadékkörnyezete A tenyésztett sejtek folyadékkörnyezetét a mesterségesen összeállított tápoldat, illetve annak sejt-anyagcsere révén folyamatosan módosuló változata biztosítja. Mivel a különböző fajok extracelluláris folyadékkörnyezete jelentősen eltérhet, a sejttenyészetek tápoldatait a 727
tenyésztendő sejt / szövet sajátságai alapján kell kiválasztani. A tápoldatot úgy kell összeállítani, hogy az minél jobban közelítsen a tenyésztendő sejtek in vivo környezetében levő extracelluláris folyadék összetételéhez. Az I. táblázat tartalmazza azokat az alapvető fiziko-kémiai sajátságokat és az élettani értékektől való eltérések még megengedhető mértékét, amelyeket a tápoldat kiválasztásánál figyelembe kell venni. I.táblázat Fiziko-kémiai sajátság Ozmotikus koncentráció
Megengedhető eltérés
(Emlős fajok : 280-320 mOsm Békák : 220-230 mOsm Rája: 1000-1050 mOsm) Ion-összetétel
~ 30 mOsm
(Na+, K+, Ca2+, Mg2+ Cl-, PO4-, HCO3- koncentrációk)
~ 10%
pH (szöveti mikrokörnyezet figyelembe vételével)
Max. 0,3 pH egység
Gáz-környezet (a sejt a médiumban oldott O2, CO2 parciális nyomását "érzi" ) O2, CO2 Hőmérséklet Halak, békák: 17-26 Co Emlősök: 36-39 Co
Levegő O2-ingadozása Halak: levegő CO2-ingadozása Emlős: max 1 tf % (a gáztérben) 3 – 5 Co 0,5-1,5 Co
A médiumnak – mint a tápoldat név is mutatja – tartalmaznia kell azokat a metabolitokat, amelyek a sejtanyagcsere „tápanyagai”. Minden tenyésztőoldatnak tartalmaznia kell glükózt. A zsírsav- és aminosavtartalomban azonban már jelentős különbségek lehetnek. Fajra jellemző sajátság például, hogy a szervezet, illetve a kérdéses sejttípus milyen aminosavakat tud (nem esszenciális aminosavak) vagy nem tud (esszenciális aminosavak) más anyagokból előállítani. A tápoldatot ennek megfelelően kell kiválasztani, illetve aminosavakkal kiegészíteni. Hasonlóan, a tápoldat vitamin- és esszenciális hormon összetétele is meggondolást igényel.3
3
Különböző fajok különböző sejtjeinek tenyésztéséhez sok gyártó kínál kiváló minőségű tápoldatokat. A kísérletező feladata a céljainak megfelelő oldat kiválasztása. A tápoldatok bonyolult összetétele miatt – hacsak a megoldandó feladat ezt nem teszi elengedhetetlenné – nem érdemes „házilag” készíteni tenyésztőoldatokat.
728
A legtöbb sejtféleség növekedéséhez/in vitro életben maradásához az említett összetevők gondos adagolása nem elég. A sejtek fenntartásához, növesztéséhez, speciális funkcióik kialakításához meghatározott hormonok, növekedési és „trofikus” faktorok adott arányú keverékére van szükség, amelyet ma még mesterségesen nem mindig tudunk biztosítani. Ezért a tápoldatokat „biológiai oldatokkal” (szérummal, embriókivonattal vagy már jól szaporodó sejtek kibocsátott termékeivel dúsított, ún. kondicionált médiummal) vagy – az ún. definiált médiumok esetén – ismert faktorokat tartalmazó speciális oldatokkal kell kiegészíteni4. A leggyakrabban használt tápoldatok „biológiai adalékként” 5–10% (tf) szérumot tartalmaznak. A szérumot általában fötális vagy újszülött borjú véréből, illetve ló vérből állítják elő. A szérum megválasztásánál azt kell figyelembe venni, hogy a tenyésztendő sejtek gyors növekedését vagy lassú növekedés mellett „felnőttre” jellemző sejtfunkcióik fenntartását kívánjuk-e elérni. A fejlődő állatok véréből nyert savók több mitogén faktort tartalmaznak, a kifejlett állat széruma inkább a differenciált sejtműködéseket támogatja. A sejtek számára a folyadékkörnyezet nemcsak az anyagcseréhez szükséges táp- és szabályozómolekulák forrása, hanem az anyagcsere-végtermékek eltávolításának közege is. A sejtek életben tartásának elengedhetetlen feltétele a tápoldat (tenyésztőmédium) rendszeres frissítése. A tápoldatban azonban megtalálhatók azok a sejtek által termelt – ma még nem teljesen ismert, autokrin – növekedési és trofikus faktorok is, amelyek szükségesek a fennmaradáshoz. Túl gyakori médiumcsere vagy túlságosan nagy térfogatú tápoldat esetén ezek a faktorok olyan mértékben hígulhatnak, ami a sejtek túlélését veszélyeztetheti. 15.1.2.3.2. A sejtek „szilárd” környezete A szilárd környezet a letapadásra alkalmas tenyésztőfelület, a szomszédos sejtek felszínei és a sejtek által termelt extracelluláris mátrix összessége. A szilárd környezet alapvetően befolyásolja a sejtek alakját, vándorlását, a sejtkapcsolatok alakulását, a sejtnövekedés mértékét, azaz a sejtek in vitro életlehetőségeit. A sejtalak – a sejttípusra jellemző határok között – a szilárd felületekre való letapadás viszonyait tükrözi. A letapadni nem tudó vagy gyenge adhéziós kölcsönhatásokkal tapadó sejtek gömbhöz közeli alakot vesznek fel, mert a citoszkeleton sejtmembránra gyakorolt húzó hatása a felszínt csökkenti (sejtkontraktilitás jelensége). A 4
A szérummentes tápoldatok kiegészítő komponenseit a tenyésztendő sejt igényeinek megfelelően állítják össze. Minden sejt számára biztosítani kell azonban a kolloidozmotikus viszonyokat stabilizáló fehérjekoncentrációt (kb. 25 mg %-os fehérjeoldat), a vasszállításhoz nélkülözhetetlen transzferrint (általában 100 g/ml), 20 nM szteroidot (leggyakrabban progeszteront), növekedési faktor pótlásként inzulint vagy inzulinszerű növekedési faktort (IGF-1) (5 ng/ml) és a nyomelemként szelént (általában 30 nM).
729
sejtszuszpenzióban gömbhöz közeli alakú sejtek felszínén is állandóan képződnek filopódiumok, hólyagocskák (15.1/1. ábra) Ezek a felszíni kitüremkedések nagy sűrűségben hordozzák az adott sejtre (sejt-állapotra) jellemző adhéziós mlekulákat és receptorokat (lásd 9.2). A szilárd hordozóra való „kiültetésekor”, mint környezetet pásztázó „szenzorok”, kémiai kapcsolatba lépnek a sejt környezetében lévő molekulákkal. Akár attraktív, akár repulzív felületekkel találkoznak, a felszíni reakciók komplex intracelluláris folyamatokat indítanak el. Az ún. attraktív szignalizáció eredményeképpen az adhéziós receptor közvetlen környezetébe további adhéziós molekulák épülnek be, adhéziós fókuszok (adhéziós foltok) alakulnak ki, amelyekhez polimerizált aktin-szálak kapcsolódnak. Aktiválódik a lokális mikrofilamentum (aktin-miozin)-rendszer, ami az adott membrán-foltot a sejt belseje felé „húzza”. Ha sejtfelszín kémiai kapcsolata a külső partnerrel elég erős, akkor megakadályozza, hogy a mikrofilamentumok által kifejtett húzóerő a sejtfelszínt felszakítsa a letapadási pontról. A letapadt filopódium nem húzódik vissza, kialakul a kezdeti letapadást jelző nyúlványos sejtalak (15.1/5 ábra). A húzóerő következtében a sejt „súlypontja” a rögzített felület felé tolódik. A letapadt folt környezetéből újabb filopódiumok / hólygocskák nyúlnak ki, és a folyamat ismétlődik. Az egymás közelében letapadt filopódiumokból a letapadási foltok felett kialakul a sejt vándorlását „vezető él” (lamellipodium). Az adott helyen egyre több stabilan letapadt membrán-foltról generálódik húzóerő, ami az amorf sejttömeget elmozdítja a letapadást nyújtó hely felé („rágördülés” jelensége). 10 m
10 m 15.1/5 ábra Neuroepiteliális sejtek alakja a kezdeti letapadás (bal oldal) és kiterülés (jobb oldal) stádiumában. Fázis-kontraszt mikroszkópos felvétel) Ha a letapadó sejt körül a letapadási pontok egyenletesen oszlanak el, akkor a kezdeti letapadást követően a sejt egyenletesen „kiterül”. Miután a membrán-hólyagosodás, filopódium-képzés (az ún. lokomóciós membrán mozgások) az élő sejt állandó jellemzői, a sejt alakja, illetve a felületen való elmozdulása (vándorlása) attól függ, hogy van-e adhéziós gradiens a környezetében. Az erősebb letapadást nyújtó felület felé néző sejtszélen – sejttípustól is függő alakú – vezető él (lamellipódium) alakul, míg az ezzel ellentétes sejtvég elkeskenyedik, erős lokomóciós aktivitás esetén le is szakad. A sejt az erősebb letapadást nyújtó felület felé mozog (a sejtvándorlás differenciális adhéziós elve), és alakja jelzi a „vándorlás” irányát. Ha a „tapogató lábak” nem találnak kémiai kapcsolatra alkalmas csoportokat, a sejt - a membrán-kitüremkedések okozta „pörgés-úszás” következtében – elmozdul az adott felületről.
730
Attraktív adhéziós szignálok a három „klasszikus” letapadási molekula-család (integrinek, cadherinek, és az immunglobulin szupercsaládba tartozó CAM) tagjainak kapcsolódásával keletkeznek (lásd 9.2). Ezek az adhéziós receptorok a citoszkeletális aktiváció mellett, különböző jelátviteli útvonalakat aktiválnak, és alapvető sejtélettani folyamatokat, - pl. sejtosztódást - szabályoznak. A repulzív szignálok hatására az adott felszín környezetében a sejtmembrán lokomóciós mozgásai gátlódnak, a vezető él összeomlik. A sejt más felületein továbbra is aktív lokomóciós mozgások „elhúzzák” a sejtet a letapadásra nem alkalmas felületről. Repulzív hatást vált ki, ha i) a sejtfelszíni adhéziós molekula olyan ligandummal kapcsolódik, amely nem aktiválja vagy éppenséggel gátolja az aktin-kötő rendszer felépülését (adhéziós receptor-antagonista) ii) a receptor-ligandum kapcsolódás olyan tartós Ca-szint emelkedést (>1 M [Ca2+]i) vált ki, ami a mikrotubulusok szétesésére vezet iii) nem alakul ki a mikrofilamentum-rendszer aktiválásához szükséges lokális Caszint A repulzív hatásokat általában nem az adhéziós molekulák maguk, hanem az ún. adhéziós szignál-molekulák közvetítik (15.1/II. táblázat). Ezek olyan sejtfelszíni ligandum receptor molekula-párok, amelyek a szomszédos sejtek felszínei között közvetlen szignalizációt hoznak létre. A legtöbb ilyen molekulának azonban van szekretált (splice-) variánsa, amely az extracelluláris mátrix molekuláihoz kötődve fejti ki hatását. II. táblázat Adhéziót szabályozó molekula-párok Sejtfelszíni receptor
ligandum
Adhéziós szignál
DCC/Unc5
Netrin(ek)
repulzív/attraktív
Robo
Slit
repulzív
Neuropilin(ek)
Semaphorin(ok)
repulzív / attraktív
Eph (Trk receptor)
Ephrin(ek)
repulzív / attraktív
Nogo
MAG, OMgp
repulzív
Az adhéziós szignál molekulák a sejtfelszíni adhéziós rendszer által „megengedett” szélesebb letapadási lehetőségeket és vándorlási útvonalakat szűkítik, és a sejtek jellegzetes elrendeződési mintázatait biztosítják. A környezetben levő „szilárd” felületekhez a sejtfelszíni adhéziós molekulafoltok rögzítik a sejtet. Ha az adhéziós kapcsolat kiterjedése és a kémiai kapcsolat erőssége elég nagy ahhoz, hogy a felszínt csökkentő, membránt visszahúzó hatásokat „legyőzze”, a sejt a szilárd felszínen kiterül. Ha a környezet kínálta letapadási pontok a sejt környezetében egyenletesen helyezkednek el, a sejt a felületen nagyjából minden irányban egyenletesen – sík felületen, felülnézetben köralakban – ellaposodik, kiterül. Egyenetlen eloszlású letapadási foltok esetén
731
a sejt a jobb adhezivitással rendelkező felület felé „terjeszkedik”, és a környező felszín, valamint a sejtváz sajátságaiból adódó, elnyúlt alakot vesz fel. A sejtek kiterülését, terjeszkedését és vándorlását az teszi lehetővé, hogy a sejtfelszínen – a membránt befelé húzó hatások egyenetlensége miatt – időről időre kitüremkedések (filopódiumok, fodrok, hólyagocskák) alakulnak ki. Ezek a rövid életű kitüremkedések lépnek reakcióba a külső környezet letapadásra alkalmas felületeivel, és megfelelően erős kapcsolat esetén nem is húzódnak vissza. Az így rögzülő sejtfelszínrészlet közelében kitüremkedő újabb filopódiumok – ha hasonló kapcsolatokat tudnak kialakítani – erősítik az adott sejtfelszín tapadását. A filopódiumok visszahúzódnak a letapadásra nem alkalmas felületekről, de egyre nagyobb számban tapadnak az erősen adhezív felszínekhez, és egymással összeolvadva, egyre szélesedő tapadó sejtrészt képeznek. Kialakul egy lapos, húzó-vezető sejtél. A sejtfelszínt csökkentő kontraktilitás a sejt más részein érvényesül: a gyengébb kötőfelületekről „felszakad” a sejt. Ezzel a sejt súlypontja elmozdul az erősebb letapadási pontokat kínáló felület irányába. A sejt az erősebb adhezivitást biztosító felület felé elmozdul, és mindaddig vándorol, amíg a környezetében vannak erősebb tapadást kínáló felszínek. (A sejtvándorlás mechanizmusának egyik összetevője: a differenciális adhézió elve). Megfelelő letapadási felület esetén, a tenyésztett sejtek erősebb kapcsolatot létesítenek a mesterséges aljzattal, mint egymás felszíneivel. Mozgásaik során az aljzatra vándorolnak, és egyetlen rétegben (monolayer) helyezkednek el. Eközben, az osztódások révén a sejtszám nő, az érintkező sejtszélek között különböző sejtkapcsolatok alakulhatnak. Az egymással érintkező sejtek felszínén a membrán lokomóciós aktivitása – ma még nem teljesen tisztázott molekuláris mechanizmusok révén – csökken. Minél több más sejttel „ütközik” egy sejt, annál kisebb lesz a migrációs aktivitása. A jelenséget a sejtmozgás kontakt gátlásának nevezik. A tömötté váló rétegben a sejtek felülete szükségszerűen csökken. A felszín : tömeg arány csökkenésével a sejtek mitotikus aktivitása is csökken. Tömött sejttenyészetekben – megfelelő tápellátás mellett is – megáll a sejtszámnövekedés. Ez a jelenség a sejtosztódás kontakt gátlása. A jelenség mechanizmusa nem tisztázott teljes mélységében. 15.1.3. Sejtszám változás a sejttenyészetekben A sejtszaporodás mértéke – optimális tenyésztési feltételek mellett is – alapvetően függ a tenyésztett sejtek típusától, differenciációs állapotától és attól, hogy milyen fajból 732
származnak. Emlősállatokból nyert embrionális törzssejtek vagy tumorosan transzformált sejtek folytonosan osztódnak és ciklusidejük lehet igen rövid (10–12 óra). A kifejlett emlősszövetekből izolált, osztódásra képes sejtek viszont csak sporadikusan osztódnak; átlagos ciklusidejük 20–24 óra. Elméletben, a mitózisok következtében minden sejtciklusnyi idő elteltével kétszereződik az egyetlen sejtből származtatható utódsejtek száma. A sejtosztódások azonban nem szinkronizáltak, és a ciklusidők sem teljesen azonos hosszúságúak. Mindez nem ugrásszerű, hanem
folyamatos,
közel
exponenciális
sejtszámnövekedést
eredményez.
A
sejtszámemelkedés ütemét – optimálisan növekvő tenyészetekben is – mérsékli a mindig jelenlevő sejtpusztulás, és az, hogy a sejteknek csak egy változó hányada osztódik folyamatosan. Egy adott típusú sejt esetén a sejtszámváltozás alakulását jelentősen befolyásolják a tenyésztési körülmények. Azok a sejtféleségek, amelyek növekedésüket saját termelt és szekretált anyagaikkal serkentik vagy tartják fenn (autokrin faktor-függő sejtek), alacsony sejtsűrűség mellett nem vagy csak igen lassan nőnek. A sejtszám növekedésével a termelt autokrin faktor(ok) koncentrációja is nő, és ez a sejtproliferáció mértékének növekedését okozza (15.1/6. ábra). Ilyen sejtféleségek esetén, a kritikus induló sejtszámot előkísérletekben kell meghatározni. A kezdeti, un. exponenciális növekedési szakaszt egy szaturációs fázis követi (15.1/6. ábra). Hosszasan fenntartható sejtek esetén is kialakul egy „telítési sejtsűrűség”: a sejtek száma tovább nem növelhető. A jelenség több tényező hatásával magyarázható. 1. A sejtszám „túl”-növekedésével az adott térfogatú tápoldat már nem fedezi a sejtek tápanyag-igényét, és túl nagy koncentrációban tartalmaz anyagcsere-végtermékeket. A tápanyag-hiány,
a
végtermékek
felszaporodása
és
mindezek
következtében
a
folyadékkörnyezet sajátságainak – pl pH-jának, ionösszetételének és ozmotikus koncentrációjának - megváltozása a sejtszaporodás mértékét csökkenti (végső soron a sejtek pusztulását is okozhatja). 2. A sejtosztódás kontakt gátlása következtében a sejtek mitotikus aktivitása csökken egy kritikus sejtsűrűség felett. A növekedést ilyen esetben nem lehet fenntartani megfelelő exp. növekedés
Sejtszám / 9.6 cm2 felület
121000 101000 81000
autokrin faktor-függő növekedés
61000 reális növekedés
41000 21000
733
1000 1
3 5 7 9 A tenyészet indítása óta eltelt idő [napok]
11
tápanyag-ellátás és végtermék eltávolítás mellett sem. A folytonos sejtszaporodást csak úgy lehet biztosítani, ha a sejteket megnövelt felületre, vagy kisebb sejtsűrűségű szuszpenziós tenyészetbe ültetjük át (passzálás), mielőtt a rendelkezésükre álló eredeti tenyésztő-felszínt "benőnék", illetve a szuszpenzióban a sejtütközések megnövekedett gyakorisága az osztódási rátát csökkentené. Többféle sejtet tartalmazó tenyészetekben az egyes sejtek által termelt osztódást serkentő (mitogén) vagy gátló (antimitogén) faktorok jelentősen szabályozhatják a többi sejttípus szaporodását. Különböző típusú sejtek közös tenyészeteiben a gyorsan szaporodó sejtek „túlnőhetik” a ritkán osztódókat. Ilyen esetben antimitotikus kezeléssel „védhetjük” a lassan növő sejttípust. Osztódást mérséklő hatást elérhetünk a mitogéneket tartalmazó szérum elvonásával vagy osztódásgátlók rövid idejű adagolásával. Csatlakozási pontok egyéb fejezetekhez 7.1., 8.1., 8.5., 9.1., 10.1.-40.2.
734
