SAMENVATTING
130 Een van deze methoden is de microencapsulatie techniek. Microencapsulatie van eilandjes van Langerhans is een reeds veel bestudeerde mogelijkheid die transplantatie van eilandjes zonder immunosuppressie mogelijk maakt door ze te verpakken in kleine semi-permeabele microkapsels. Deze microkapsels zijn wel doorlaatbaar voor kleine stoffen zoals insuline en glucose, maar niet voor de veel grotere antilichamen en cellen van het immuunsysteem. De semi-permeabele membraan werkt als een mechanische barrière die het ook mogelijk kan maken cellen van dierlijke afkomst te transplanteren. Microencapsulatie is dus niet alleen een alternatief voor immunosuppressie, maar zou ook kunnen bijdragen aan het oplossen van het donortekort. In dit proefschrift wordt nader in gegaan op immunoprotectie van pancreaseilandjes door middel van microencapsulatie. Microkapsels bestaan uit een matrix van alginaat, met een doorsnede van circa 750 µm, bedekt met poly-L-lysine voor het aanbrengen van de semipermeabele eigenschappen. Alginaat-poly-L-lysine microkapsels werden voor het eerst met succes toegepast bij diabetische ratten door Lim en Sun in 1980. Zij hebben geëncapsuleerde eilandjes naar de buikholte getransplanteerd en bereikten daarmee, gedurende 2-3 weken, normoglycemie zonder immunosuppressie. Deze microencapsulatie-techniek is sindsdien op veel fronten verbeterd, maar de transplantaatoverleving in proefdieren blijft nog beperkt tot perioden van drie tot zes maanden. Dit is te kort om deze behandeling toe te passen bij patiënten. Om de transplantaatoverleving te verlengen is meer inzicht nodig in de oorzaken van de beperkte overlevingsduur. Daarom is het onderwerp van dit proefschrift onderzoek naar de oorzaken van het falen van het geëncapsuleerde eilandjestransplantaat. HOOFDSTUK 1 behandelt de literatuur over microencapsulatie en bespreekt de mogelijkheden en de belangrijkste knelpunten van transplantatie van geëncapsuleerde eilandjes van Langerhans. Drie belangrijke oorzaken die bijdragen aan falen van het transplantaat worden onderscheiden. De eerste oorzaak heeft te maken met de poriegrootte van de semi-permeabele membraan. De poriën, die groot genoeg zijn voor insuline en afvalstoffen, laten waarschijnlijk ook kleine toxische verbindingen door zoals sommige cytokines en radicalen. Deze stoffen zijn schadelijk voor eilandjes. De tweede oorzaak heeft betrekking op de biocompatibiliteit van de geëncapsuleerde eilandjes. Deze is onvolledig waardoor een deel van het transplantaat overgroeid wordt door macrofagen en fibroblasten. De derde oorzaak is de lage zuurstofspanning (hypoxie) in de kapsels als gevolg van afwezige bloedvatvoorziening. Het is niet bekend in welke mate beperkingen van de semi-permeabele membraan, overgroei van geëncapsuleerde eilandjes, en hypoxie binnen het kapsel elk een bijdrage leveren.
128 Diabetes Mellitus, ofwel suikerziekte, is een stofwisselingsziekte die wordt veroorzaakt door een absoluut of een relatief tekort aan het hormoon insuline. Insuline is verantwoordelijk voor de opslag van glucose in het lichaam. Door het tekort aan insuline kan glucose niet meer door cellen worden opgeslagen en blijft het in het bloed circuleren (hyperglycemie), waardoor op termijn bloedvaten en zenuwen worden aangetast. In circa 85% van de gevallen wordt de diabetes gekarakteriseerd door een relatief tekort aan insuline. Het relatieve tekort betekent dat de aanmaak van insuline onvoldoende is of, zoals in de meerderheid van de gevallen, dat de lichaamscellen ongevoelig zijn geworden voor insuline. In deze gevallen spreekt men van diabetes type 2. Traditioneel werd dit type ouderdomsdiabetes genoemd, maar deze benaming is in feite niet meer correct omdat een relatief tekort aan insuline steeds vaker op jonge leeftijd wordt aangetroffen. Het Diabetes Fonds Nederland schat het totaal aantal personen met diabetes op 840.000. Bij ongeveer de helft van dit aantal mensen is de diabetes niet bekend bij de huisarts of bij de patiënt zelf. Oorzaak hiervan is dat het relatieve insulinetekort niet altijd gepaard gaat met duidelijke klachten. Bij de overige 15% van alle mensen met diabetes wordt de ziekte gekarakteriseerd door een absoluut tekort aan insuline. Meestal is dit het gevolg van een afwijkende afweerreactie (auto-immuunreactie) die leidt tot de volledige vernietiging van insuline producerende cellen. In Nederland lijden meer dan 68.000 mensen aan deze vorm van diabetes, die diabetes type 1 wordt genoemd. De afwezigheid van insuline leidt tot ernstige hyperglycemie. Het teveel aan glucose in het bloed verlaat het lichaam via de urine, wat gepaard met overmatige urineproductie, hevige dorst en gewichtsverlies. Het lichaam gaat vet en spieren verbranden om het glucoseverlies te compenseren, waardoor type 1 diabeten verder afvallen en waardoor grote hoeveelheden zuren (ketonen) vrijkomen. De patiënt kan als gevolg hiervan in een diabetisch coma geraken en zonder behandeling aan de gevolgen van verzuring (acute ketoacidose) overlijden. Diabetes type 1 wordt behandeld door toediening van insuline door middel van injecties. Dankzij insuline kunnen de meeste mensen met diabetes type 1 de bloedsuikerspiegel zelfstandig afdoende reguleren. Echter, insuline-injecties kunnen de glucose huishouding niet volledig herstellen en zij kunnen daardoor de ontwikkeling van aandoeningen aan ogen, nieren, zenuwen en bloedvaten niet volledig voorkomen. De gemiddelde levensverwachting van mensen met type 1 diabetes ligt ondanks insuline therapie ongeveer vijftien jaar lager dan die van de bevolking in zijn geheel. Een klein aantal mensen met type 1 diabetes komt in aanmerking voor een andere behandeling dan insuline-injecties. Insuline wordt geproduceerd door de ²-cellen van de eilandjes van Langerhans, die verspreid liggen in de alvleesklier
SAMENVATTING
129
(pancreas). Het alternatief voor insuline-injecties is het transplanteren van deze insuline-producerende cellen. Dat wordt meestal gedaan door de gehele pancreas te transplanteren, maar het is ook mogelijk om alleen de eilandjes van Langerhans te transplanteren. Na een geslaagde transplantatie kan het getransplanteerde weefsel de glucosehuishouding beter handhaven dan insuline toegediend middels injecties. Succesvolle pancreastransplantatie zorgt voor een volledig herstel van de regulatie van de bloedsuikerspiegel, voorkomt op deze wijze de ontwikkeling van diabetische complicaties en kan bestaande complicaties soms zelfs genezen. Transplantatie kent echter ook een paar nadelen. Een nadeel is dat een pancreastransplantatie een grote operatie verreist, wat risico’s voor de patiënt met zich meebrengt. Wat dit betreft is transplantatie van eilandjes aantrekkelijker. De pancreas bevat 1 tot 2 miljoen eilandjes van Langerhans die bij elkaar minder dan 2% van het totale volume van de pancreas in beslag nemen. Dit geringe volume heeft als voordeel dat de transplantatie slechts een bescheiden ingreep vergt met minimaal risico voor de patiënt, die in feite neerkomt op een wat ingewikkelde injectie of infusie. Bijkomend voordeel is dat eilandjesweefsel gemakkelijker dan een gehele pancreas voorafgaand aan de transplantatie bepaalde behandelingen kan ondergaan, bijvoorbeeld om de kans op afstoting te verkleinen. Eilandjestransplantatie kent dus voordelen ten opzichte van pancreastransplantatie. Echter, de isolatieprocedure voorafgaand aan implantatie is gecompliceerd en pas sinds een aantal jaren effectief genoeg om eilandjestransplantatie met succes bij patiënten toe te passen. Helaas zijn er nog meer dan twee pancreassen nodig om voldoende eilandjes te verkrijgen voor één transplantatie. Dit is duidelijk een beperking van eilandjestransplantatie gezien het wereldwijde tekort aan donoren. Er zit nog een groot nadeel aan zowel pancreastransplantatie als eilandjestransplantatie. Beide vormen van transplantatie hebben levenslang immunosuppressieve medicatie nodig om afstoting te voorkomen. Deze middelen gaan gepaard met een verhoogd risico op infectie en op het ontwikkelen van tumoren. Transplantatie wordt daarom meestal alleen uitgevoerd bij patiënten die als gevolg van nierfalen in aanmerking komen voor een niertransplantatie. De niertransplantatie kan dan evengoed gecombineerd worden met een pancreas- of eilandjestransplantatie, want de patiënt krijgt toch al immunosuppressieve medicatie om afstoting van de getransplanteerde nier te voorkomen. Naar gangbaar inzicht wegen de bijwerkingen van immunosuppressie voor de meeste mensen met diabetesniet op tegen de nadelen van insuline therapie. Transplantatie kan insulinetherapie pas op grote schaal vervangen wanneer hij kan worden uitgevoerd met minder nadelige neveneffecten. Daarom wordt onderzoek verricht naar methoden die transplantatie zonder immunosuppressie mogelijk maken.
SAMENVATTING
131
HOOFDSTUK 2 beschrijft de opbouw van het proefschrift en geeft de reden voor het onderzoek. De reden is het vergroten van inzicht in de drie belangrijke oorzaken van transplantaatfalen met als doel een betere transplantatiestrategie te kunnen definiëren. In HOOFDSTUK 3 wordt onderzoek beschreven naar de mogelijkheden de bescherming van eilandjes door microkapsels te verbeteren door de semi-permeabiliteit van de kapsels te moduleren. Om analyse van geëncapsuleerde eilandjes op moleculair niveau middels RT-PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) mogelijk te maken werd een methode ontwikkeld die kapsels van eilandjes verwijdert zonder de eilandjes te beschadigen. Deze methode staat beschreven in HOOFDSTUK 4. Een onderzoek naar het effect van overgroei op naburige geëncapsuleerde eilandjes staat beschreven in HOOFDSTUK 5, en een onderzoek naar de reactie van geëncapsuleerde eilandjes op hypoxie in HOOFDSTUK 6. In HOOFDSTUK 7 worden de resultaten uit de afzonderlijke hoofdstukken samengevat en bediscussieerd. De poriegrootte van de semi-permeabele membraan van kapsels hangt af van onder andere de incubatietijd van alginaatdruppels met poly-L-lysine (PLL) tijdens de encapsulatie procedure. Hoe langer de incubatie met PLL, des te kleiner zijn de poriën. HOOFDSTUK 3 beschrijft een onderzoek naar de diffusie van insuline (6 kDa), Il-1β (17.5 kDa) en TNF-α (51 kDa) bij vier verschillende typen kapsels waarbij de poriegrootte werd gevarieerd door tijdens de encapsulatieprocedure gedurende respectievelijk 5, 10, 15, en 20 minuten te incuberen met PLL. Deze kapsels zijn ook getest op hun vermogen eilandjes te beschermen tegen de cytokines Il-1β en TNF-α. Uit dit onderzoek blijkt dat microkapsels, waarbij tijdens de encapsulatieprocedure gedurende 10 minuten met PLL werd geïncubeerd (10 min PLL), reeds met bijna 98% de diffusie van cytokines verhinderen terwijl de insulinesecretie behouden blijft. Na twee dagen kweken in de aanwezigheid van cytokines is de insulinesecretie door eilandjes in 10 min PLL kapsels significant hoger dan de insulinesecretie door eilandjes in 5 min PLL kapsels. Diffusie van cytokines is nog verder verlaagd in 15 min PLL, maar deze verlaging gaat gepaard met een reductie van de insulinesecretie. De 15 min PLL kapsels leveren dus uiteindelijk geen voordeel op. We kunnen concluderen dat microkapsels bescherming kunnen bieden tegen cytokines en dat de mate van bescherming verbeterd kan worden zonder dat dit ten koste gaat van de insulinesecretie. De optimale balans tussen bescherming en functiebehoud wordt bereikt door kapsels tijdens de encapsulatieprocedure gedurende tien minuten in PLL te incuberen. Analyse van genexpressie middels RT-PCR maakt het mogelijk te bepalen hoe cellen reageren op specifieke omstandigheden. Zo kan bijvoorbeeld gekeken worden naar de expressie van het anti-apoptotische gen Bcl-2 of het pro-
132 apoptotische gen Bax om te bepalen of cellen onder fysische of chemische stress neiging tot apoptose vertonen of juist niet. Genen waarvan de expressie beïnvloed wordt door Il-1β zijn bijvoorbeeld het gen voor induceerbare stikstofoxide synthase enzym (iNOS) en het gen voor Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1). Analyse van genexpressie middels RT-PCR bleek niet mogelijk te zijn op geëncapsuleerde eilandjes omdat PLL interfereert met zowel met cDNA synthese als met de PCR amplificatie. Daarom is een methode ontwikkeld die het mogelijk maakt eilandjes uit kapsels te verwijderen zonder dat de eilandjes worden beschadigd. Deze methode, waardoor RT-PCR van geëncapsuleerde eilandjes mogelijk wordt, staat in HOOFDSTUK 4 beschreven. De vitaliteit en de gestimuleerde insuline secretie veranderd niet door deze ontkapselingmethode, en genexpressie van niet geëncapsuleerde eilandjes en van ontkapselde eilandjes blijft gelijk voor wat betreft een viertal genen (Bcl-2, Bax, GAPDH en β-actine). Ontkapseling is in de volgende twee hoofdstukken toegepast om het mogelijk te maken genexpressie te analyseren. Macrofagen zijn een belangrijke oorzakelijk factor bij het falen van transplantatie van geëncapsuleerde eilandjes. Ongeveer 40% van het oorspronkelijk aantal getransplanteerde eilandjes gaat verloren doordat kapsels overgroeid raken met macrofagen en fibroblasten. Een deel daarvan (10-15%) kan worden verklaard door onregelmatigheden aan de oppervlakte van de kapsels, waardoor de kapsels als lichaamsvreemd (niet biocompatibel) worden gezien. In de meeste gevallen (circa 10%) wordt deze onregelmatigheid veroorzaakt doordat het eilandje niet in het midden, maar aan de rand van het kapsel zit. Het verlies van eilandjes door overgroei is aanzienlijk, maar niet onoverkomelijk zolang de rest van het transplantaat goed blijft functioneren. Maar de bijdrage van macrofagen aan het falen van het transplantaat blijft waarschijnlijk niet beperkt tot de overgroei van kapsels. Macrofagen produceren toxische stoffen zoals Il1β, TNF-α en stikstof oxide (NO), waarvan is aangetoond dat ze de functie en de vitaliteit van eilandjes kunnen aantasten indien ze het kapsel passeren. In HOOFDSTUK 5 is onderzocht of macrofagen op overgroeide kapsels naburige nietovergroeide geëncapsuleerde eilandjes nadelig beïnvloeden. Hiertoe werden vers geëncapsuleerde eilandjes gedurende twee dagen in kweek gebracht met door macrofagen overgroeide kapsels (coculture). Deze overgroeide kapsels werden geïsoleerd uit de buikholte van een rat met diabetes, drie weken na transplantatie van geëncapsuleerde eilandjes. De resultaten uit dit onderzoek leiden tot twee belangrijke bevindingen. Ten eerste blijkt dat macrofagen op overgroeide kapsels inderdaad de functie en vitaliteit van naburige geëncapsuleerde eilandjes schaden. Ten tweede blijkt dat deze schade niet zozeer bewerkstelligd wordt door cytokines, maar door NO. Deze bevinding is in overeenstemming met de resultaten uit
SAMENVATTING
133
hoofdstuk drie waaruit blijkt dat kapsels bescherming kunnen bieden tegen de kwalijke effecten van cytokines. NO is echter een zeer klein (30 Da) en agressief molecuul dat de semi-permeabele membraan gemakkelijk kan passeren. Deze resultaten benadrukken het belang om overgroei tot een minimum te beperken. Aangezien het lastig is overgroei volledig te elimineren in de macrofaagrijke buikholte, is het gewenst encapsulatie te combineren met methoden die additionele bescherming bieden tegen NO-toxiciteit. Naast macrofagen draagt een lage zuurstofspanning (hypoxie) in de kapsels bij aan het falen van het transplantaat. Deze hypoxie is het gevolg van de afwezige bloedvatvoorziening. Om meer inzicht te krijgen in de relatie tussen zuurstoftekort en transplantaatfalen zijn in HOOFDSTUK 6 eilandjes in vitro onderzocht onder hypoxische omstandigheden. Er is gekozen voor een model van ernstig zuurstoftekort (1% O2) zoals zich dat lokaal in de buikholte kan voordoen. Hypoxie leidt tot functieverlies, tot necrose en in mindere mate tot apoptose. Een belangrijke bevinding is dat hypoxie de genexpressie van de chemokine Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1) verhoogd. Deze verhoogde MCP1 expressie werd gevonden op mRNA-niveau, maar hij werd niet teruggevonden op eiwit-niveau. De lage eiwitconcentratie is het gevolg van het feit dat door de hypoxie minder vitale cellen aanwezig zijn die eiwitten produceren. Daarbij wordt het MCP-1 eiwit waarschijnlijk afgebroken door lyserende enzymen, die vrijkomen door de hoge celsterfte. Aanwijzingen uit de literatuur maken een posttranscriptionele neerwaartse regulatie van de expressie niet aannemelijk als verklaring van de discrepantie in expressie op mRNA- en eiwit-niveau. De verhoogde expressie onder invloed van hypoxie kan begrepen worden als een signaal van eilandjes om de aanmaak van nieuwe bloedvaten te stimuleren. MCP1 trekt macrofagen aan die onder andere een rol spelen bij neovascularisatie. Nieuwe bloedvaten kunnen echter niet dicht bij de eilandjes komen door de aanwezigheid van de kapsels. Door het aantrekken van macrofagen neemt de kans op overgroei van het kapsel toe, wat een verklaring kan zijn voor de aanwezigheid van overgroei die niet verklaard kan worden door fysische of chemische imperfecties van de kapsels. Deze resultaten impliceren dat eilandjes zelf een rol spelen bij het tot stand komen van transplantaatfalen. Het is dus van groot belang het probleem van zuurstoftekort op te lossen. Dit zal niet alleen de functie en de vitaliteit van het transplantaat verbeteren, maar kan ook bijdragen aan een vermindering van overgroei van geëncapsuleerde eilandjes. Eerder onderzoek in ons laboratorium liet zien dat geëncapsuleerde eilandjes na transplantatie naar de buikholte gemiddeld tien keer vaker delen dan eilandjes in een gezonde pancreas. Aangezien cellen een beperkte delingscapaciteit hebben (maximaal circa 40 keer) draagt deze verhoogde celdeling bij aan de verkorte
134 overlevingsduur van het geëncapsuleerde eilandjestransplantaat. De oorzaak van deze hoge proliferatie is vermoedelijk gerelateerd aan cytokines of aan bij necrose vrijgekomen stoffen, maar wat de werkelijke oorzaak is, is nog niet duidelijk. Om te achterhalen of proliferatie verhoogd wordt door cytokines-producerende macrofagen of door bij necrose vrijgekomen stoffen, is de celdeling tijdens coculture (HOOFDSTUK 5) en hypoxie (HOOFDSTUK 6) bepaald. Helaas geven onze resultaten geen verklaring voor de verhoogde replicatie in geëncapsuleerde eilandjes. Tijdens coculture was de replicatie zelfs significant verlaagd. Deze verlaging kan verklaard worden door de aanwezigheid van stikstofoxide, waarvan is aangetoond is dat het de replicatie remt. Hypoxie had in onze experimenten geen effect op de mate van celdeling. Vermoedelijk is de glucoseconcentratie in het kweekmedium te hoog geweest om een eventueel effect van hypoxie op eilandjesreplicatie te kunnen vaststellen, want de replicatie in de controlegroep was al hoger dan normaal. In HOOFDSTUK 7 wordt een aantal suggesties gegeven die het succes van transplantatie van geëncapsuleerde eilandjes van Langerhans kunnen verbeteren. Deze verbeteringen richten zich op het bieden van extra bescherming tegen stikstofoxide en op het oplossen of verminderen van het zuurstoftekort. Encapsulatie biedt de mogelijkheid om naast eilandjes andere celtypen te coencapsuleren die extra bescherming zouden kunnen bieden tegen NO-toxiciteit. Gedacht kan worden aan erytrocyten die NO wegvangen, of aan Sertoli cellen die locaal immunosuppressieve stoffen secreteren zodat de NO-productie door macrofagen wordt onderdrukt. Een andere benadering om extra bescherming te bieden tegen NO-toxiciteit is eilandjescellen genetisch te modificeren zodat zij weerstand kunnen bieden tegen een aanval van NO. Gedacht kan worden aan het kunstmatig omhoog brengen van de expressie van het Bcl-2 gen, waarvan is aangetoond dat verhoogde expressie schade door NO kan beperken. Een mogelijkheid om het probleem van het zuurstoftekort op te lossen is gebruik te maken van de zogeheten Brockmann lichaampjes. Dit zijn, net als de eilandjes van Langerhans, insuline producerende lichaampjes van de Tilapia vis. Deze vissen leven in warm, stilstaand en zuurstofarm water, waardoor de cellen weerbaar zijn tegen lage zuurstofspanning. Er zijn meer redenen waarom het gebruik van deze hypoxie-resistente lichaampjes als donormateriaal voor transplantatie aantrekkelijk is. Tilapia vissen zijn goedkoop, gemakkelijk in grote aantallen te kweken en Brockmann lichaampjes zijn relatief eenvoudig te isoleren. Een belangrijk voordeel van de vis ten opzichte van andere potentiële dierlijke donoren, zoals het varken, is het feit dat de vis fylogenetisch weinig overeenkomsten heeft met de mens. Dit betekent dat het risico van een virale infectie van vis naar mens veel kleiner is dan bijvoorbeeld van het varken naar de mens.
SAMENVATTING
135
Het risico een levensbedreigend virus in de menselijke populatie te introduceren is de belangrijkste reden waarom xenotransplantatie van varkensweefsel tot op heden niet wordt toegelaten. Een andere mogelijke oplossing voor het zuurstoftekort is het creëren van een kunstmatige transplantatieplaats met een nieuwe en uitgebreide bloedvoorziening. Implantatie onder zowel een geprevasculariseerde huid als in een kunstmatig transplantatieplaats met nieuwe bloedvaten in de buikholte is succesvol gebleken voor eilandjes zonder microkapsels. Wellicht biedt dit mogelijkheden voor geëncapsuleerde eilandjes. Tenslotte, microencapsulatie is een techniek die eilandjestransplantatie bij mensen met diabetes wellicht mogelijk kan maken zonder immunosuppressie te gebruiken. De techniek kent nog een aantal obstakels die verholpen moeten worden voordat microencapsulatie met succes kan worden toegepast. De tekortkomingen van de techniek kunnen verholpen worden door bijvoorbeeld co-encapsulatie met Sertoli cellen, genetische modificatie van eilandjescellen, het gebruiken van niet humane donoren zoals de Tilapia vis, of door een combinatie hiervan. Bij de ideale combinatie zal transplantatie van geëncapsuleerde eilandjes bij mensen met type 1 diabetes op een veilige manier niet alleen tot het voorkomen van late complicaties kunnen leiden, maar tot genezing van de aandoening zelf.
136
