Papp Krisztina (FOK V/11) Társszerző: Polyák Angéla (ÁOK IV/8)
Témavezetők: Dr. Papp Tamás, Dr. Felszeghy Szabolcs
Debreceni Egyetem, Fogorvostudományi Kar Anatómiai, Szövet-és Fejlődéstani Intézet
A fogcsíra fejlődésének sematikus áttekintése 11.nap
13.nap 14.nap
Főbb jelátviteli útvonalak a fogfejlődés folyamán: •FGF •SHH •TNFα •BMP •Notch •Wnt
16.nap
18.nap
(Ábra forrása: Thesleff I., Tummers M.: Tooth organogenesis and regeneration, StemBook, 2009)
A hősokkfehérjék
Két fő csoport: kis (15-30 kDa) és nagy (40, 60, 70, 90, 110 kDa) hősokkfehérjék
HSP 60: főként mitokondriális elhelyezkedés, 15-20% a citoplazmában, 1-4% extracellulárisan található meg
HSP 60: fehérje folding segítése”chaperonin”, jelátviteli útvonalak befolyásolása
A HSP 60 szerepe az NF-κB jelátviteli útvonalban
HSP 60
(Ábra forrása: F Clauss et al.:Journal of dental research. 2008)
Metodikai eszköztár:
Immunhisztokémia
Trowel- típusú szövettenyészet
Hisztokémia
Apoptag TUNEL Assay
BrdU inkorporációs teszt
HSP 60 immunhisztokémiai detektálása 16,5 napos alsó metszőfog csírában
HSP 60 monoklonális antitest 1:200
Kontroll
HSP 60 fehérje kimutatása immunhisztokémiai módszerrel 18,5 napos alsó metszőfog csírában
2 1 30 µm
HSP 60 1:200
2 30 µm
30 µm
Kontroll
HSP 60 1:200
HSP 60 immunhisztokémiai detektációja a fogcsíra képleteiben Fejlődési stádium
Struktúra
DAB csapadék mennyisége
Kezdeti stádium
bazális réteg suprabazális réteg
x
Bimbó stádium
centrum perifériás rész
x x
Sapka stádium
fogcsíra centruma külső zománchám belső zománchám zománccsomó
x xx xx xx
Harang stádium
reticulum stellátum stratum intermédium belső zománchám külső zománchám zománccsomó odontoblasztok
x xxx xxx x xxx x
In vitro szövettenyésztés
16,5 napos alsó incisor fogcsíra szeparációja sztereomikroszkóp segítségével
A tenyésztés időtartama 5 nap, a kontroll minták esetén 15 % FBS-t tartalmazó DMEM médium, a kezelt minták esetén 15 % FBS tartalmú DMEM médium + 2 µg/ml exogén HSP 60 fehérje felhasználásával (a médiumot minden második nap lecseréltük)
Fotódokumentáció a tenyésztés 1., 3. és 5. napján történt
In vitro szövettenyésztés menete
Trowel-típusú szövettenyészet: a vizsgált minta egy fémhálóra helyezett filteren található, így a tenyésztés a levegő-médium határon vihető végbe. A fogcsírák a fémháló kis fenesztráin nyugszanak, megkönnyítve így a fotódokumentáció menetét. (Bal oldali ábra forrása: Gregory J. Seymour et al: Methods in Molecular Biology 2010. Jobb oldali ábra: saját felvétel.)
16,5 napos alsó metszőfog csíra morfológiai változásai exogén HSP 60 fehérje hatására (cc.: 2µg/ml)
1. nap
3. nap
5. nap
Kontroll fogcsíra fejlődése
1. nap
3. nap
5. nap
A HSP 60 fehérjével kezelt fogcsírákból szövettani metszeteket készítettünk, majd hisztokémiai vizsgálattal (Picrosirius festés) tettük jól dokumentálhatóvá
Kezelt minta
Kontroll minta
ApopTag TUNEL Assay vizsgálat eredményei
(thymus)
A perzisztáló zománccsomó környezetében számos apoptotikus sejt látható.
BrdU inkorporációs teszt eredményei
• A vizsgálat során nem volt szignifikáns eltérés a kezelt és kontroll minták között a gyökérnyúlvány területén éppen osztódó sejtek tekintetében. A statisztikai vizsgálat során MannWhitney tesztet végeztünk (p:0,853). Az Y tengely mentén az osztódó sejtek számát láthatják a kezelt illetve a kontroll minták esetén.
100 µm
Kezelt minta
100 µm
Kontroll minta
Összegzés
A HSP 60 fehérjét sikerült kimutatni a fogfejlődés különböző stádiumaiban (11,5-18,5 napos korig) immunhisztokémiai módszer segítségével.
Trowel-típusú szövettenyészetben egyértelmű a fogcsíra morfológiai változása exogén HSP 60 hatására. A szövettenyésztéssel elért morfológiai változásokat hisztokémiai vizsgálattal (Picrosirius festés) tettük jól dokumentálhatóvá.
Az Apoptag TUNEL-Assay számos apoptotizáló sejtet mutatott ki a kezelt minták zománccsomójának környezetében, míg feltételezhetően a HSP 60 nem hat a sejtek proliferációs aktivitására.
További vizsgálatokkal választ szeretnénk kapni a következőkre: • A HSP 60 esetleges egyéb esetlegesen specifikus hatásainak vizsgálata (odontoblasztok, stratum intermédium esetén) • A HSP 60 mRNS szintű detektálása (extracelullárisan is megtalálható a HSP 60)
Fő célunk, hogy a HSP 60 fehérje IKK α jelátviteli útvonalra gyakorolt pontos szerepét felderítsük.
IKK α K.O. egerek metszőfogai és exogén HSP 60 fehérjével kezelt fogcsíra közti morfológiai hasonlóság. (Bal oldali módosított ábra: Sharpe P.T. et al. : A dual role for Ikk alpha in tooth development. Dev. Cell. 6: 21927, 2009, jobb oldali ábra saját felvétel.)
Köszönetnyilvánítás Dr. Papp Tamás és Dr. Felszeghy Szabolcs témavezetőknek, Polyák Angéla TDK hallgatónak a vizsgálatokban történő segítségükért, hasznos tanácsaikért. Pálné Terdik Tünde laboratóriumi analitikusnak a vizsgálatok során nyújtott segítségéért. „A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése konvergencia program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.”
Függelék Önálló munka:
Hisztokémiai vizsgálatok kivitelezése (Picrosirius festés) Immunhisztokémiai vizsgálatok kivitelezése (HSP 60 fehérje kimutatása) Immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeinek kiértékelése, dokumentálása ApopTag TUNEL Assay, BrdU inkorporációs vizsgálatok eredményeinek kiértékelése, dokumentálása
