HERTENTAMEN BIOCHEMIE (8S135) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld 28-01-2013 09:00 – 12:00 (totaal 100 punten + 5 bonuspunten) 6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! 1 (~20 minuten; 20 punten) a.
Eiwitten zijn in hun basis opgebouwd uit 20 verschillende aminozuren. Vaak vind men evolutionaire verschillen in de aminozuursequentie van dezelfde eiwitten tussen verschillende soorten organismen. Wat opvalt, is dat glycine echter vaak hoog geconserveerd is in de evolutie van eiwitten. Waarom is dat volgens u? (4P) Glycine is het kleinste aminozuur vd 20 en het enige aminozuur zonder zijstaart op de alfakoolstof. Hiermee is glycine buitengewoon flexibel en cruciaal bij de vorming van bepaalde secundaire structuren en niet vervangbaar door andere aminozuren. b.
Een ander belangrijk aminozuur dat vaak geconserveerd is, is cysteine. Dit aminozuur komt onder andere veel voor in het eiwit keratine, wat een belangrijk bestanddeel van haar is. Na uw studie besluit u een kapsalon te beginnen. Hoe gaat u, met uw biochemiekennis over cysteine, een permanent(je) zetten bij een klant met lang stijl haar, die graag krullen wil? Met andere woorden, wat voor type chemische reactie(s) doet u op het haar van uw klant zonder en met de krulspelden, en waarom? (4P) Cysteine kenmerkt zich door de vorming van intra- en intermoleculaire dissulfide bindingen. Deze covalente bindingen verstevigen de structuur van eiwitten en eiwitassemblages. In het geval van een permanent moeten eerste de bestaande dissulfide bindingen worden verbroken dmv reductie, waarna het haar opnieuw gestyled kan worden en de dissulfide bindingen opnieuw vastgelegd worden dmv oxidatie. c.
Keratine is een zogenaamd coiled-coil eiwit. Legt u uit wat een coiled-coil eiwit is. Gaat u daarbij in op de moleculaire structuur en hoe deze gestabiliseerd wordt. Maak in uw antwoord eventueel gebruik van een helical wheel diagram. (4P) Een coiled-coil is een eiwitstructuur waarin twee rechtsdraaiende alfa-helices in elkaar zijn gedraaid tot een linkshandige superhelix. Daar waar de 2 helices met elkaar in direct contact zijn (a en d in het diagram) zitten hydrophobe aminozuren welke dmv van der Waals interacties en het hydrophobe effect de drijvende kracht zijn achter de coiled coil vorming. Op de daarnaast gelegen posities (e en g) komen vaak geladen aminozuren voor welke met hun tegenover gelegen partner (g’ en e’) een ionpaar vormen wat additioneel stabiliseren werkt.
g
e’
c d
b’
a’
f’
f a b
e
d’ g’
c’
d.
Uw werk in de kapsalon is sociaal bevredigend, maar u wilt toch wat meer wetenschappelijke uitdaging. U gaat daarom “samples” nemen van de hoofdhuid van uw nietsvermoedende klanten. U isoleert de eiwitten uit de huidcellen en analyseert deze met behulp van SDS-PAGE. Legt u uit, hoe SDS-PAGE werkt. Verklaart u daarbij ook op welk principe de scheiding van de eiwitten baseert. (4P) SDS-PAGE scheidt eiwitten op basis van grootte. Eiwitten worden gedenatureerd met behulp van SDS (waarbij er gemiddeld 1 SDS molecuul aan 2 aminozuren in het eiwit bindt). Hiermee krijgt het eiwit een overall negatieve lading. De eiwitten worden opgebracht op een (polyacrylamide) gel en dmv gel electrophorese door de gel heen getrokken. Ieder eiwit ondervindt gemiddeld dezelfde kracht omdat de lading correleert met de grootte van het eiwit, maar omdat de gel vernet is lopen de kleinere eiwitten er sneller doorheen. e.
U besluit uw heimelijke experiment te gelde te maken en aan te bieden als een screeningsmethode voor hoofdhuidkanker. U detecteert hierbij middels Western-Blotting de aanwezigheid van een oncogeen (een eiwit verantwoordelijk voor tumorontwikkeling). Om uw eiwit selectief te detecteren na de scheiding via SDS-PAGE heeft u onder andere een antilichaam tegen het oncogeen nodig. Waarom hebt u dat antilichaam nodig? En beschrijf een manier om dit antilichaam, en daarmee het oncogeen, vervolgens te detecteren (meerdere antwoorden mogelijk). (4P) Na het scheiden van de eiwitten op grootte dmv SDS-PAGE moet u specifiek uw eiwit visualiseren. Hiervoor heeft u een antilichaam nodig dat specifiek aan uw eiwit bindt en tevens een moleculaire marker bevat welke gevisualiseerd kan worden. Het antilichaam kan bijvoorbeeld gemerkt / gelabeld zijn met een fluorescente groep of radioactiviteit, of middels een sandwich assay met een gelabeld antilichaam gedetecteerd worden.
2 (~20 minuten; 15 punten) Proteasen zijn enzymen die specifieke substraateiwitten knippen door middel van het hydrolyseren van peptidebindingen. a.
Beta-sheets moeten minimaal uit 2 peptideketens bestaan om een stabiele secundaire structuur te vormen. De binding van een substraateiwit aan een protease vindt plaats door middel van een enkele peptide keten die volledig uitgestrekt, analoog aan een beta-sheet, aan het enzym bindt. Waarom is in dit geval deze “beta-sheet” structuur van 1 peptideketen toch stabiel? (3P) Omdat deze gestabiliseerd wordt door binding aan het enzym in een “beta-sheet” manier. b.
Er zijn verschillende soorten proteasen, zoals serine en aspartyl proteasen. Hoewel beide klassen van proteasen leiden tot dezelfde chemische reactie is het mechanisme van de reactie in de actieve site fundamenteel verschillend. Zo is er bij serine proteasen sprake van een tweestaps reactie met twee overgangstoestanden en bij aspartyl proteasen slechts 1 overgangstoestand. Leg dit uit. (3P) In het geval van serine proteasen wordt eerst de amide binding van het substraat verbroken door een serine in het eiwit welke addeert aan de carbonyl functie van de amide binding. In een tweede stap wordt deze nieuwe verbinding gehydrolyseerd mbv water en de daarbij behorende overgangstoestand. In het geval van aspartyl proteasen wordt direct water geactiveerd door het enzym en vindt er geen additie van het substraat aan het enzym plaats. c.
Maak met behulp van een tekening duidelijk hoe de activatiestrategie van een aspartyl protease functioneert. Laat hierbij de aminozuren van de actieve site zien en maak hun rol duidelijk. (4P)
d.
Een proteasereactie wordt doorgevoerd in aanwezigheid van een vaste concentratie competitieve inhibitor en de initiële snelheid van substraatomzetting wordt bij verschillende substraatconcentraties bepaald. De resultaten hiervan worden uitgezet in een Lineweaver-Burk plot (zie figuur). Bereken/bepaal KM en Vmax voor dit enzym in aanwezigheid van de competitieve inhibitor. (3P) 5
1/V0 (min./mol)
4
3
2
1
0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 -1
-1
1/[S] (M )
KM ~ 2.3 microM Vmax ~ 1.4 micromol/min. e.
Hoe veranderen KM en Vmax als dezelfde reactie doorgevoerd wordt zonder inhibitor? (2P) KM wordt kleiner; Vmax blijft gelijk.
3 (~20 minuten; 15 punten + 5 punten bonus) Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit specifieke lipiden en eiwitten. a.
Verwacht u dat een homopolymeer van leucine eerder een alfa-helix vormt in een waterige omgeving of in een membraan? Legt u uw antwoord uit. (3P) In een hydrophobe omgeving wordt de vorming van intramoleculaire waterstofbruggen gestabliseerd en worden de naar buiten stekende hydrophobe zijstaarten van de leucines goed gesolvateerd. In een polaire omgeving is er een stabiliserende interactie van het water met de amide atomen en juist sprake van een stabilisatie als de hydrophobe zijstaarten van de leucines niet in aanraking zijn met water (en dus niet netjes aan de buitenkant van een alfa-helix zitten). b.
Geef schematisch de structuur van een phospholipide. Beschrijf daarbij kort de karakteristieken van iedere moleculaire unit. (3P) De twee vetzuurstaarten zijn hydrophoob en willen in water graag afgezonderd zitten van het water (maw samenklonteren in een hydrophobe omgeving). De glycerol unit is het moleculaire platform waarop de verschillende groepen geassembleerd worden. De fosfaat groep maakt onderdeel uit van de polaire kopgroep die graag met water een interactie aangaat en zich daarmee aan de buitenkant van membranen bevindt. Aan de phosphaat groep bevindt zich een alcohol groep (verbonden als phosphoester) die nog weer verschillende polaire kopgroepen kan bevatten.
c.
Verklaar waarom de onverzadigde dubbele bindingen in vetzuurstaarten van phospholipiden bijna altijd cis-dubbele bindingen zijn (3P). Trans-dubbele bindingen hebben ongeveer dezelfde lineaire conformatie als een verzadigde alkylstaart en zullen daarmee weinig invloed hebben op de eigenschappen van een membraan (en daarmee relatief nutteloos). Cis-dubbele bindingen hebben een gekinkte/gebogen conformatie welke de pakking van de vetzuurstaarten in het membraan verstoord en daarmee de fluïditeit van het membraan controleert. d.
Bepaalde membraaneiwitten zorgen voor transport van ionen en organische verbindingen over/door membranen. Hier onderscheidt men zogenaamde pompen en kanalen. Maak met behulp van een aantal schematische tekeningen duidelijk hoe een ionenpomp (bijvoorbeeld voor calcium ionen) werkt. Gaat u daarbij in op het moleculaire mechanisme achter de drijvende kracht van dit proces. (6P) Eventueel in vereenvoudigde vorm met uitleg:
Bonusvraag: Voor welke ontdekking is de Nobelprijs voor de fysiologie of geneeskunde in 2012 toegekend? (max. 5P extra) Voor de ontdekking dat gedifferentieerde cellen geherprogammeerd kunnen worden tot pluripotente cellen.
4 (~20 minuten; 15 punten) a.
Teken het Watson en Crick basepaar guanine - cytosine. U mag daarbij de suikergroep weglaten, maar teken wel het waterstofbruggenpatroon tussen de basen. (5P)
Zie b b.
Leg (eventueel met behulp van het antwoord op bovenstaande vraag) uit welk deel van het basepaar de major-groove vormt en welk deel de minorgroove, in de dubbelhelix van B-DNA. (2P)
c.
U doet een polymerase chain reaction (PCR) op een gen en de gel waarmee u uw reactieproducten analyseert laat 3 even sterke DNA banden zien. De lengtes van de drie stukken DNA verhouden zich volgens de ratio 1 : 2 : 3. U snijdt de band van het langste DNA uit de gel en amplicificeert deze weer middels PCR met dezelfde primers als voorheen. Wederom vind u in uw gel 3 banden in dezelfde verhoudingen. Wat lijdt u uit deze resultaten af met betrekking tot de structuur van het eiwit waarvoor dit DNA codeert? (4P) Het gecodeerde eiwit bevat 3 herhalingen van een specifieke sequentie. d.
Een succesvolle PCR hangt van veel factoren af, onder andere van het correct ontwerp van de primers. Welke parameter beïnvloedt u met de lengte van uw primers? (4P) De smelttemperatuur van de primers (maw de temperatuur waarbij gehybridiseert moet worden en waar de PCR moet verlopen.
5 (~30 minuten; 20 punten) a.
Vergelijkt u de DNA polymerase en de RNA polymerase en geeft u aan op welke van onderstaande punten ze met elkaar verschillen en wat die verschillen dan zijn: (5P) -geactiveerde monomeren deoxyribonucleoside triphosphaten vs ribonucleoside triphosphaten -richting van de keten/polymeer verlenging beide 5’ 3’ -noodzaak voor een primer DNA polymerase heeft een primer nodig RNA polymerase niet. -drijvende kracht (energetisch) achter de polymerisatie beide de hydrolyse van het triphosphaat. -noodzaak voor een additionele helicase DNA polymerase heeft een additionele helicase nodig, RNA polymerase vervult zelf deze functie.
b.
U wilt DNA, maar niet RNA, radioactief labelen in groeiende en zich delende bacteriën. Welk radioactief molecuul doet u bij het groeimedium? (2P) Radioactief (bijvoorbeeld tritium gelabeld) thymine of thymidine. c.
Wat is de functie van het enzym DNA ligase tijdens de replicatie van DNA. Verklaar uw antwoord met een tekening van de replicatie vork. (3P) DNA ligase plakt de Okazaki fragementen van de lagging strand aan elkaar.
d.
Cordycepine blokkeert de synthese van de mRNA. Wat is de moleculaire basis van het inhiberende effect van cordycepine op mRNA synthese? (3P)
Omdat cordycepine een 3’-OH groep mist kan het niet participeren in de vorming van een 3’5’ phosphodiester binding en stop de elongatie van de groeiende RNA keten.
e.
Hoe moet cordycepine nog gemodificeerd worden in de cel om effectief te kunnen worden als inhibitor van de mRNA synthese? (2P) Het moet nog omgezet worden in cordycepine 5’-triphosphaat. f.
Eukaryotisch mRNA wordt na translatie chemisch gemodificeerd in de cel, het zogenaamde mRNA processing. Dit proces bestaat uit drie verschillende stappen / drie verschillende mRNA modificaties. Benoem deze 3 stappen, leg kort uit wat er (moleculair) gebeurt en verklaar hun functie. (5P) -5’-cap. Er wordt een methylguanylaat toegevoegd alsmede methyleringen van 2’OH posities. Verhoogt de stabiliteit van het mRNA en dient als herkenningspunt voor het ribosoom -3’-poly A staart. Een lange keten van adenylaten wordt toegevoegd door een poly(A) polymerase. Verhoogt stabiliteit, vergemakkelijkt meervoudig uitlezen van het mRNA -RNA splicing. Bepaalde stukken niet coderende RNA (intronen) worden er tussenuit gehaald en de overblijvende stukken RNA (exonen) worden aan elkaar geplakt. Staat toe dat uit een gen meerdere verschillende eiwitten worden gesynthetiseerd door een ander splicing product te genereren.
6 (~20 minuten;15 punten) Een puntmutatie (G naar A) gevonden in een patiënt met thalassemia resulteert in een nieuwe 3’ splice (knip en plak) positie (blauw), vlak in de buurt bij de normale positie (geel). Normale 3’ einde van intron ↓ 5’-CCTATTGGTCCAGGTTCCAACCTTAGGCTGCTG-3’ ↓ 5’-CCTATTAGTCCAGGTTCCAACCTTAGGCTGCTG-3’ a. Wat is de aminozuursequentie van het extra segment van het eiwit van de patiënt met verkeerde splicing? (Het reading frame begint met TCC en u mag de tabel hieronder gebruiken). (4P)
Ser-Arg-Phe-Gln-Pro-Stop b.
U wilt de translatie van mRNA naar eiwit inhiberen/verhinderen. Beschrijf kort een moleculaire strategie om dit te doen (er zijn meerdere antwoorden mogelijk; 1 is voldoende). (3P) -Ribosoom inhibitor (met uitleg) -siRNA / antisense RNA (met uitleg) -tRNA synthetase inhibitor (met uitleg) -etc.
c.
Welke twee chemische reactiestappen zijn noodzakelijk voor de vorming van een aminoacyl-tRNA. (4P) Eerst de vorming van het aminoacyl adenylaat, welke dan reageert met het tRNA tot het aminoacyl-tRNA
d.
Waarom moeten tRNA moleculen zowel unieke structurele en moleculaire kenmerken hebben alsook overeenkomstige kenmerken? (4P) Unieke kenmerken zijn nodig zodat het aminoacyl-tRNA synthetase een onderscheid kan maken tussen de verschillende tRNA en het juiste aminozuur op het juiste tRNA kan zetten. Overeenkomstige kenmerken zijn nodig omdat alle tRNAs een interactie aan moeten gaan met dezelfde eiwit-synthese fabriek (ribosoom).
