Vývoj radiometrických metod pro stanovení enzymových aktivit jodothyronin dejodas: Vliv antidepresiva fluoxetinu na aktivity dejodas typu 1,2 a 3 v mozku potkana 1 2
Pavelka 1
2
Stanislav '
Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta MU, Brno Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Praha
Radiometrická enzymová stanovém jsou založena na enzymatické konverzi radioaktivně značených substrátů na značené produkty a měření radioaktivity, buď produktů nebo zbývajících substrátů, po jejich kvantitativním odseparování. Za vhodně zvolených podmínek separace a následné kvantifikace lze takto stanovit enormně malá množství, femtomoly radioaktivně značených nízkomolekulárních sloučenin (viz dále). Tyreoidální hormony (TH) jsou jednoduché organické sloučeniny odvozené od jodovaných zbytků aminokyseliny L-tyrosinu. NejdůležitějŠím z mnoha známých jodothyroninů je tyroxin čili 3,3\5,5'-tetrajodthyronin ( T 4 ) , který je fakticky prohormonem, prekursorem biologicky mnohem aktivnějšího 3,3\5-trijodthyroninu (T3). Zatímco všechen tyroxin je syntetizován ve štítné žláze, většina, minimálně 80 % cirkulujícího T 3 vzniká v periferních tkáních, dejodací lokálního tyroxinu. Je popsána řada metabolických přeměn molekul jodothyroninů, jichž se účastní různé enzymy (včetně dále zmiňovaných) v periferních tkáních . Nejdůležitějšími biotransformačními reakcemi TH jsou však postupné dejodace (viz Obr. 1). Počátečním krokem je monodejodace tyroxinu, ke které dochází buď na vnějším, fenolickém jádře, přičemž vzniká trijodthyronin; nebo na vnitřním, tyrosylovém jádře, kdy vzniká reverzní 3,3',5*-trijodthyronin ( r T 3 ) . Vedle dejodací se na metabolických přeměnách TH podílejí i další enzymatické procesy. Ty zahrnují především oxidativní deaminaci postranního alaninového řetězce a konjugaci fenolické hydroxylové skupiny buď s uridindifosfoglukuronovou kyselinou nebo sulfokonjugaci. Jen velmi malá množství TH jsou vylučována močí nebo výkaly bez předchozích biochemických obměn. Aktivaci, respektive inaktivaci TH prostřednictvím monodejodací katalyzují specifické selenoenzymy nazývané jodothyronin dejodasy (ID) typu 1, 2 a 3 (Dl, D2 a D3, respektive) . Tyto tři odlišné typy dejodas byly definovány na základě jejich rozdílné substrátové speciíity; rozdílného reakČního mechanismu; odlišné citlivosti k inhibici propylthiouracilem; a rozdílné změny jejich aktivity in vivo, k n í ž dochází jako odpověď na změnu tyroidního stavu živočicha (t.j., na změnu koncentrace kolujících TH). Všechny tři dejodasy jsou integrální membránové proteiny, které vyžadují pro svoji katalytickou funkci jako kofaktor dosud neidentifikované thioly. Konverzi prohormonu T 5*-monodejodací v T , hormon s nejvyŠší biologickou aktivitou, katalyzují dvě dejodasy, Dl a D2. Dejodasa D l se vyskytuje hlavně v játrech, ledvinách, štítné žláze a hypofýze; jaterní Dl díky své velmi vysoké aktivitě je považována za hlavní zdroj cirkulujícího T 3 . Naproti tomu dejodasa D2, která se vyskytuje vnejvyšších aktivitách v hnědé tukové tkáni, hypofýze, mozku, placentě a skeletálmm svalstvu je nezbytná pro lokální tvorbu T 3 v těchto tkáních. Dl katalyzuje také 5-dejodaci na vnitřním kruhu T za vzniku rT , látky nevykazující žádný biologický účinek. Selektivní 5dejodaci katalyzuje rovněž dejodasa D3, která inaktivuje jak T tak T za vzniku rT , resp. 3,3'-dijodthyroninu (T2). Dejodační reakce tak představují centrální mechanismy jak pro tvorbu T z T , tak pro degradaci jodothyroninů. Je zřejmé, že faktory regulující relativní rychlosti a podíly dejodací na vnějším versus vnitřním jádře T také determinují konečné biologické účinky sekretovaného tyroxinu. 1
2
4
4
3
3
4
3
3
4
4
-23-
3
NH 1
\ D ~ °
0
2
/-CH -CH-CO( 2
L-thyroxine (T )
J Ď ^ Y HO
s^m^
4
NH
L
2
'/
l n0 -i C J ^K C H - C H - C O O H
H
2
=
.
'
v y
0
0
V 7
N H C
H
2
CH-COOH
2
I
3,5,3-triiodothyronine
3,3',5'-triiodothyronine (reverse
HO
9
Vni
^
NH
NH
2
3,5-diiodothyronine (3,5-T )
HO
NH HO-/
V
(3,3'-T )
Y
2
NH
NH
2
CH -CH-COOH
3-monoiodothyronine
\
/
2
2
- Č H - C O O H
(3,5'-T ) 2
2
2
3'-monoiodothyronine
NH 0
V c H
CH -CH-COOH
HO
?
H
Vo-/
3',5'-diiodothyronine
3,3'-diiodothyronine
\
2
3
2
CH^-CH-COOH / 2
CH,-CH-COOH
T )
° \
/
C
H
2
2"ČH-C00H
Thyronine (T ) 0
Obr. 1 Enzymaticky katalyzované postupné dcjodace jodothyroninu, probíhající bud na vnějším (5', resp. 3') nebo na vnitřním (5, resp. 3) jádře. Předpokládá se, že TH mohou modulovat počet vazebných míst na receptoreeh, koncentraci neurotransmiterů a metabolitů v mozku a tím způsobem mohou kontrolovat aktivitu některých neurotransmiterů (např. serotoninu) které se podílejí, alespoň hypoteticky, na patogenesi depresivního onemocnění. Serotoninergní systém je spojen s celou řadou psychických onemocnění; nejspolehlivěji je probádána jeho úloha právě v etiologii endogenní deprese včetně sebevražedného chování, bulimických a anorektických neuróz a schizofrenie. Při depresi je pozorován nedostatek serotoninu (a noradrenalinu) na postsynaptických receptoreeh. Mechanismus působení v současné době široce používaných a vysoce účinných antidepresiv třetí generace, známých jako selektivní inhibitory zpětného vychytávání serotoninu (SSRI), je založen právě na inhibici znovuvstřebání (reuptake) serotoninu do presynapse a tak prodloužení jeho účinku na postsynaptických receptoreeh. Zvýšená koncentrace T 3 v mozkových buňkách, a tedy zvýšené hladiny serotoninu, jsou převážně výsledkem zvýšené lokální dejodace tyroxinu působením dejodasy D2. Naproti tomu dejodasa D3 způsobuje snížení hladin T a serotoninu v CNS. Neadekvátní enzymové aktivity mozkových ID tedy mohou zapříčinit nedostatečnou (dočasnou) lokální koncentraci T 3 a mohou tak být jedním z patogenních faktorů deprese . Nedávno jsme orientačně studovali změny v metabolismu TH u potkanů, způsobené dlouhodobým podáváním fluoxetinu v pitné vodě. Fluoxetin (Prozac, Obr. 2) je ne-tricyklické antidepresivum třetí generace, které řadíme právě do skupiny látek SSRI; je to v současné době nejčastěji předepisovaný prostředek pro léčení epizodických depresí. V našich studiích na úrovni celého organismu, v nichž jsme sledovali vliv podávaného fluoxetinu, eventuelně 3
3
-24-
v kombinaci s T3, na sérové hladiny TH jsme získali mimo jiné také některé neočekávané výsledky. V předkládané práci jsme se snažili o vysvětlení dřívějších nálezů a zaměřili jsme se proto na vypracování extrémně citlivých a přitom robustních radiometrických metod pro stanovení enzymových aktivit ID a na jejich použití pro kvantifikaci dejodas všech tří typů v různých Částech mozku a některých dalších tkáních experimentálních zvířat, kterým byly dlouhodobě podávány fluoxetin, T3, T4 a jejich různé kombinace.
Obr. 2 Fluoxetin hydrochlorid (Prozac ), ne-tricyklické antidepresivum třetí generace ze skupiny selektivních inhibitorů zpětného vychytávání serotoninu (SSRI). Experimentální část Vývoj radiometrických metod pro stanoveni enzymových aktivit ID Radiometrická stanovení enzymových aktivit D l , D2 a D3 se prováděla principielně obdobným způsobem jako jsme už dříve uvedli , avšak s některými zásadními modifikacemi, jako např. vyvíjecflio systému pro TLC. Dejodasy se stanovovaly buď v mikrosomálních frakcích (játra a ledviny) nebo v postmitochondriálních supernatantech (mozky, hypofýzy, Štítné žlázy) připravených standardním postupem ze zamrazených vzorků příslušných tkání s použitím 2-200 uig celkového proteinu (v závislosti na typu tkáně a typu ID) v konečném objemu 40 u.1. Radioaktivní produkty enzymových reakcí I-jodid, I-dijodthyronin (T ) a I_T (a neradioaktivní jodid) byly separovány od nespotřebovaných radioaktivních substrátů ( I-rT , L T a I - T v případě stanovení D l , D2 a D3, respektive) tenkovrstevnou chromatografií s použitím silikagelových TLC desek (20 x 20 cm s koncentrační zónou 2,5 x 20 cm; Merck, KGaA, Germany). Latentní obrazy radiochromatogramů, získané bezfilmovou autoradiografíí expozicí TLC desek s rozdělenými reakčními směsmi na fólie BAS-MS 2025 "storage phosphor screens" (Fujifilm Co., Japan), byly vyhodnoceny s použitím laserového skaneru BAS-5000 (Fujifilm Co., Japan) a kvantifikovány s použitím software Aida, v. 3.28 (raytest Isotopenmessgeráte GmbH, Germany). Hodnoty specifické enzymové aktivity byly vyjádřeny v jednotkách pikomoly (v případě stanovení D l ) , resp. femtomoly (v případě D2 a D3) příslušného jodothyroninů konvertované za hodinu a vztažené na mg celkového proteinu (např. fmol T3/h/mg prot.). 4
125
2
12Í
3
125
12S
3
125
4
3
Experimenty na zvířatech Farmakologické studie byly prováděny na mladých rostoucích samcích laboratorního potkana kmene Wistar, krmených ad libitum standardní peletovanou dietou (ssniff R-Z; Spezialdiaten GmbH, Soest, Germany). Celkem 90 zvířat bylo náhodně rozděleno do jedné kontrolní a osmi experimentálních skupin (po 10 v každé skupině). Po sedmi dnech adaptace byla zvířatům v průběhu experimentálního období po dobu 25 dní podávána v pitné vodě různá množství fluoxetinu (Ratiopharm), 3,3',5-trijodo-L-thyroninu (Sigma), 3,3',5,5*-tetrajodo-L-thyroninu (Sigma), nebo jejich kombinace. Pro každé zvíře byl denně registrován přírůstek tělesné hmotnosti, objem vypitého roztoku a spotřeba diety. Koncentrace aplikovaných substancí v roztocích byly denně adjustovány tak, aby v průběhu celého experimentálního období vzhledem k měnícím se tělesným hmotnostem zvířata obdržela předem definovaná stále stejná množství příslušných látek vztažená na 100 g tělesné hmotnosti a den. Kontrolní zvířata pila vodu bez přídavku jakékoliv látky. Na konci experimentálního období byla zvířata v hluboké
-25-
éterové narkóze zabita přestřižením jugulární žíly. Od každého zvířete bylo zajištěno maximální množství krve pro získání krevního séra a byly vypreparovány orgány: štítná žláza, adenohypofýza, různé části mozku, játra, ledviny a některé další tkáně. Vzorky byly okamžitě zamraženy v kapalném dusíku a uloženy v hlubokomrazícím boxu při -80 °C před izolací postmitochondriálních supernatantů, event, irúkrosomových frakcí standardními postupy. Výsledky a diskuse Vliv podávaných farmakfluoxetinu, T3 a jejich kombinací na hladiny TH v sérech potkanů Subchronické podávám samotného fluoxetinu způsobilo iriírný pokles sérových hladin celkového tyroxinu (53.2 ± 7.9 vs. 66.4 ± 8.5 nmol L u kontrolních zvířat; průměr ± S.D. pro n - 10). Tento nález byl ve shodě s literárními údaji . Trijodthyronin podávaný samostatně (10 Jig na zvíře a den) způsobil velmi markantní pokles koncentrace tyroxinu (na 7.1 ± 1.5 nmol L" ), z důvodu negativní zpětnovazebně regulace, tedy opět ve shodě s očekáváním. Avšak fluoxetin podávaný spolu s T 3 nezměnil vliv trijodthyroninu na koncentraci celkového tyroxinu (8.6 ± 3.0 nmol V ). To bylo v ostrém kontrastu s účinky fluoxetinu na sérové hladiny trijodthyroninu. Podávání samotného fluoxetinu mělo zanedbatelný vliv na sérové koncentrace celkového T 3 (1.12 ±0.16 vs. 1.29 ± 0.11 nmol L" u kontrol; průměr ± S.D. pro n = 10), což bylo opět ve shodě s literaturou . Avšak u zvířat s experimentálně zvýšenými suprafyziologickými hladinami sérového T 3 , navozenými dlouhodobým podáváním samotného T 3 , došlo po subchronickém podávání fluoxetinu společně s T 3 k jednoznačnému, velmi výraznému poklesu koncentrace trijodthyroninu k téměř noirnálriím hodnotám sérových hladin celkového T (ze 7.65 ± 3.18 na 1.70 ± 0.35 nmol L" ). Jedním z více možných vysvětlení tohoto nálezu by mohla být fluoxetinem způsobená indukce enzymů katalyzujících konjugaci fenolické skupiny TH, a tedy zvýšená exkrece konjugovaného T3-glukuronátu, případně T -sulfátu. Jiným důvodem by mohly být změny v enzymových aktivitách ID. 1
5
1
1
!
6
1
3
3
Vliv podávaných farmak fluoxetinu, T? a jejich kombinací na enzymové aktivity ID ve tkáních potkanů Obr. 3-5 uvádí příklady obrazů radiochromatogramů - výsledků separace enormně malých množství, femtomolů radioaktivně značených sloučenin, a následné extrémně citlivé kvantifikace v případě radiometrických stanovení enzymových aktivit jodothyronin dejodas D l , D2 a D3. Tato stanovení jsou založena na použití vytypovaných preferovaných substrátů - různých jodothyroninů značených radiojodem 1 ; optimalizované tenkovrstevné chromatografické separaci radioaktivních produktů od nespotřebovaných substrátů; a bezfilmové autoradiografii radiochromatogramů s použitím fólií „storage phosphor screens" s následnou kvantifikací latentních elektronických obrazů pomocí laserového densitometry Subchronické podávání potkanům samotného fluoxetinu způsobilo pouze mírné zvýšení aktivity D2 (55 ± 34 v*. 31 ± 9 fmol Tyh/mg prot. u kontrolních zvířat; průměr ± S.D. pro n = 8) a naopak, podle očekávání, rnírný pokles aktivit D3 v cerebelu a některých dalších částech mozku potkanů. Detekované změny aktivit D l nebyly signifikantní. Z hlediska možného ovlivnění metabolismu TH na úrovni celého organismu jsou však nejdůležitější lokální změny enzymových aktivit ID v hypofýze. Ve shodě s naším očekáváním jsme zjistili, že podávání samotného T (t.j. navození hypertyroidního stavu) způsobilo výrazný pokles enzymové aktivity D2 (45 ± 34 vs. 234 ± 62 fmol T /h/mg prot. u kontrol; průměr ± S.D. pro n - 8) v izolovaných adenohypofýzách potkanů (viz Obr. 6) a simultánní markantní nárůst D l (244 ± 31 vs. 70 ± 15 pmol Tyh/mg prot. u kontrol; průměr ± S.D. pro n = 8) a D3 aktivit (prakticky ve všech studovaných tkaních). V kontrastu s účinky samotného T , podávání kombinace fluoxetinu s T způsobilo u potkanů pouze nevýznamné zvýšení D l a D3 aktivit. Výsledky prezentované na Obr. 3-6 jasně dokumentují výbornou použitelnost vyvinuté a zavedené metodiky pro radiometrická stanovení enzymových aktivit ID. 2
3
3
3
3
-26-
Dl
I
m
m
m
m
< »
i
• jj^yjMr^k
^gM^^g, ^—i^^^fc
^..—w..
w
Sample 3
Bl
B2
B3
B4
B5
— —
B6
.;
Obr. 3 Radiochromatogram získaný při radiometrickém stanovení enzymové aktivity D1. D3
**** *••*•#* Sample Bl B2 B3 B4 B5 B6 Obr. 4 Radiochromatogram získaný při radiometrickém stanovení enzymové aktivity D3.
-27-
D2
######
»* * *
m
@
Itttttlfftlll S
Sample 1 1
2
3
4
Bl
B2
B3
B4
B5
B6
Obr. 5 Radiochromatogram získaný při radiometrickém stanovení enzymové aktivity D2. Elektronický obraz odseparovaných značených produktů enzymové reakce ( I - T 3 a I jodidu) od nespotřebovaného substrátu ( I - Ť 4 ) . V prvních šesti liniích jsou naneseny alikvoty reakčních směsí, obsahujících vzorky mikrosomálních frakcí (S1-S6) vyizolovaných z hypofýz experimentálních potkanů. Pro stanovení enzymové aktivity D2 byly tyto vzorky inkubovány za optimalizovaných reakčních podmínek po dobu 30 min při 37 °C. V dalších šesti liniích jsou naneseny příslušné blanky (B1-B6) - stejné vzorky ve stejných reakčních směsích, avšak inkubované při 0 °C. i25
400 o 350 M a jjjf
300
250
I
200
r4 150 — 100
«
J
II I
r
I Control BFluox BT3 B Fluox+T3
Obr. 6 Vliv podávání fluoxetinu, T 3 a jejich kombinace na specifické enzymové aktivity D2 (fmol i y h / m g prot.) v adenohypofýze potkanů.
Tato práce byla podpořena MŠMT (výzkumný záměr MSM0021622413), Akademií věd ČR (výzkumnýzáměr AV0Z50110509) a GA ČR (grant304/08/0256). 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Werner and Ingbar's The Thyroid. A Fundamental and Clinical Text. (Braverman L.E., Utiger R.D., eds.), 7th ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia 1996. fíohrle J., in Methods Enzymoi, 347 (2002)125. íCirkegaard C , Faber J., Eur. J. Endocrinol, 138 (1998)1. Pavelka S., Kopecký P., Bendlová B. et al, Pediatr. Res., 42 (1997)812. Halbreich U., Psvchopharmacol. Bull., 33 (1997)281. Joffe R.T., J. Clin. Psychiatry, 59 (Suppl. 5) (1998)26.
Development of radiometric methods for determination of enzyme activities of iodothyronine deiodinases: The influence of antidepressant drag fluoxetine on the types 1, 2 and 3 deiodinase activities in the rat brain Pavelka 1
2
12
Stanislav
Institute of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Brno Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague
The objectives of the present study were to establish valid assay conditions for measurement of the types 1, 2, and 3 (Dl, D2, and D3, respectively) iodothyronine deiodinases (IDs) activities, and to use the radiometric enzyme assays especially to follow the effects of antidepressant drug fluoxetine (Prozac) on the metabolism of thyroid hormones (TH) in the rat. In particular, the effects of subchronic administration of fluoxetine alone and in combination with 3,5,3'-triiodothyronine (T ) on T production and degradation in the CNS and peripheral tissues were investigated. The newly developed radiometric enzyme assays for IDs, based on the use of preferred I-Iabeled iodothyronines as substrates, TLC separation of radioactive products from the unconsumed substrates, film-less autoradiography of radiochromatograms using storage phosphor screens, and quantification of the separated compounds with the BAS-5000 laser scanner, proved to be very sensitive and rapid and, at the same time, reliable and robust. 3
3
l35
-29-
