ISOLASI PROMOTER /?-ACTIN IKAN KERAPU BEBEK Cromileptes altivelis DENGAN METODE DEGENERATE PCR
WEDARANINGTYAS NUGRAHANI
SKRIPSI
PROGRAM STUD1 TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INPORMASI
Dengan inj saya menyampaikan bahwa Skripsi yang berjudul: ISOLASI PROMOTER P-ACTZN IKAN KERAPU BEBEK Cromileptes altivelis DENGAN METODE DEGENERATE PCR adalah benar merupakan hasil karya yang belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Januari 2008
WEDARANINGTYAS NUGRAHANI C14103054
WEDARANINGTYAS NUGRAHANI. Isolasi Promoter /?-Actin Ikan Kerapu Bebek Cromileptes altivelis dengan Metode Degenerate PCR. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan M. ZAIRIN Jr. Induk berkualitas genetik baik akan menghasilkan benih ikan yang baik pula. Usaha yang dapat dilakukan untuk memperbaiki kualitas induk adalah manipulasi DNA/gen yaitu dengan cara transgenesis. Ran transgenik adalah ikan hasil transgenesis yang menlbawa gen asing hasil introduksi. Dalam menghasilkan ikan transgenik dibutuhkan konstruksi DNA yang tersusun atas gen penyandi protein tertentu dan elemen regulator/promoter. Promoter yang digunakan untuk mengaktiflan gen yang akan ditransfer akan lebih baik jika menggunakan promoter yang berasal dari spesies yang sama dengan ikan target transgenik. Selain ekspresi gen yang baik, penggunaan promoter yang berasal dari spesies yang sama memungkinkan penerimaan konsumen terhadap ikan transgenik akan baik pula. Oleh karena itu, dalam rangka pembuatan ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis transgenik dibutuhkan promoter dari ikan itu sendiri. Untuk mengisolasi promoter /?-actin ikan kerapu bebek perlu dilakukan isolasi DNA genom. Selanjutnya DNA tersebut diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer degenerate yang disusun berdasarkan database gen /?-actin dari berbagai spesies ikan di Bank Gen. Hasil amplifikasi diketahui dengan elektroforesis. Fragmen DNA selanjutnya dipurifikasi menggunakan kit dan selanjutnya diligasi ke pGEM-T Easy. Plasmid tersebut ditransformasi ke bakteri E.coli DH5a yang bertujuan agar dapat mengalami replikasi (penggandaan). Penyeleksian koloni hasil transformasi dilakukan dengan penambahan antibiotik ampisilin, IPTG dan X-gal pada media seleksi. Koloni kandidat pembawa plasmid adalah koloni yang benvama putih, selanjutnya plasmid tersebut diisolasi. Kemudian plasmid disekuensing dan hasilnya dianalisis menggunakan program GENETYX versi 7 dan TFBind. Hasil isolasi mencakup sekuen promoter sampai parsial ekson 3 genom /?actin ikan kerapu bebek dengan nukleotida sebanyak 1630 bp. Hasil analisis menunjukkan urutan nukleotida yang dimulai dari ekson 2 sampai sebagian ekson 3 pada gen /?-actin ikan kerapu bebek hampir sama dengan gen /?-actin ikan kerapu lumpur Epinephelus coioides. Begitu juga dengan sekuen asam amino yang ditranslasikan dari nlRNA mempunyai kemiripan dengan ikan kerapu lumpur. Analisis sekuen lebih lanjut dilakukan menggunakan program TFBind menunjukkan adanya faktor transkripsi yang mempengaruhi aktivitas promoter /?actin seperti boks TATA, motif CCAAT, motif CArG atau CC(A/T)6GG. Hasil analisis menunjukkan bahwa sekuen CCAAT terletak pada nukleotida 16-21, motif CArG pada nukleotida 46-55 pada sekuen proksimal promoter dan nukleotida 1059-1068 pada intron 1, sekuen TATA pada nukleotida 582-586. Dengan adanya faktor transkripsi tersebut diduga promoter ini dapat aktif mengontrol gen asing yang akan ditransfer.
ISOLASI PROMOTER B-ACTIN IKAN KERAPU BEBEK
Cromileptes altivelis DENGAN METODE DEGENERATE PCR
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor
Oleh: WEDARANINGTYAS NUGRAHANI C14103054
PROGRAM STUD1 TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
Judul
: ISOLASI PROMOTER /?-ACTIN IKAN KERAPU
Nama NRP
BEBEK Cromileptes altivelis DENGAN METODE DEGENERATE PCR : Wedaraningtyas Nugrahani : C14103054
Menyetujui, Pembimbing I1
Pembimbing I
Prof. Dr. M. Zairin Jr. NIP. 131 578 846
Dr. Alimuddin NIP. 132 133 953
Mengetahui, erikanan dan Ilmu Kelautan
DAFTAR RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta tanggal 24 Juli 1985 dari ayah Drs. Karsono, M.Si dan ibu Sri Sutini. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Pendidikan formal yang dilalui penulis adalah SMUN 2 Bekasi dan lulus tahun 2003. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) dan memilih Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Selma mengikuti perkuliahan, penulis pemah magang di Taman Akuarium Air Tawar, Taman Mini Indonesia Indah dan praktek lapang (PL) di Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut Gondol, Bali. Penulis juga pemah menjadi asisten mata kuliah Fisiologi Reproduksi semester ganjil 200512006 dan 200612007, asisten luar biasa mata kuliah Dasar-Dasar Limnologi semester genap 2005/2006, asisten mata kuliah Dasar-Dasar Akuakultur semester ganjil 2006/2007 dan Dasar-Dasar Genetika Ikan semester genap 2006/2007. Selain itu penulis juga aktif menjadi pengurus Hiinpunan Mahasiswa Akuakultur (HIMAKUA) periode 200412005 dan 200512006. Penulis pemah menjadi pemrasaran dalam Seminar Nasional XI11 Perhimpunan Alumni dari Jepang (Persada) pada tanggal 9 Agustus 2007. Tugas akhir dalan pendidikan tinggi diselesaikan dengan menulis skripsi yang berjudul "Isolasi Promoter P-Actin
Ikan Kerapu Bebek Cromilegtes altivelis dengan Metode Degenerate PCR".
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2007 sampai dengan Juni 2007 adalah genetika ikan, dengan judul "Isolasi promoter b-actin ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis dengan metode degenerate P C P .
Keberhasilan penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini tidak semata didapatkan sendiri, melainkan dengan bantuan semua pihak. Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Bapak Dr. Alimuddin selaku Pembimbing I yang telah membimbing dan
mengarahkan penulis selama melakukan penelitian sampai dengan penyusunan karya ilmiah ini. 2. Bapak Prof. Dr. M. Zairin Jr. selaku Pembimbing I1 dan Pembimbing Akademik yang telah membimbing penulis sejak awal perkuliahan sampai dengan penyusunan karya ilmiah ini. 3. Bapak Ir. Tatag Budiardi M.Si selaku dosen Penguji Tamu yang telah memberikan saran dalam penyusunan karya ilmiah ini. 4. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Drs. Karsono M.Si dan Ibunda Sri
Sutini, adik-adikku Wiwit, Dhini dan Adhit serta keluarga besar Achmad Subadri dan Sumadi yang telah memberi kasih sayang dan doa tanpa henti serta dukungan moril dan materil.
5. Sahabat tersayang Anna, Novi, Lina, Pegy, Icool, Mba Lina (S2), Mba Lina (Lab), Septin, Dewi dan Lucky atas dukungan, persahabatan, persaudaraan dan kasih sayang.
6. Pak Ranta, Pak Jajang, Mba Astrid, Mba Yuli, Pak Maranta, Kang Asep atas kemudahan yaig diberikan selama penelitian dan dalam pengurusan 7. Teman-teman seperjuangan BDP 40 atas kebersamaan, kekeluargaan dan pengalaman indah selama kuliah. 8. BDP 38, BDP 39, BDP 41 dan BDP 42 atas persahabatan selama ini.
9. Warga "Wisma Andri"; Tutut, Mba Dim, Rahma, Puji, Nisa d m Erna atas kebersamaan dan kekeluargaan. 10. Selullosa; Harra, Mas Heny, Wina dan Mba Dim atas pengalaman yang tak terlupakan. Penulis telah berusaha semaksimal mungkin dalarn penulisan ini. Akhiiya, diantara kelebihan dan kekurangannya, penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan para pembaca pada umumnya.
Bogor, Januari 2008
Wedaraningtyas Nugrahani
DAVTAR IS1 Halaman
KATA PENGANTAR ...................................................................................i DAVTAR TABEL ..........................................................................................
v
..................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR
.
..................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................... 1 1.2 Tujuan ............................................................................................... 3
I PENDmULUAN
.
I1 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4 2.1 Ikan Kerapu Bebek .............................................................................. 4 2.2 Promoter /3-actin................................................................................... 5
....................................................................... 6 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) ..................................................... 7 . . 2.5 Llgasi ................................................................................................... 9 2.6 Transformasi dan Seleksi Koloni ........................................................ 11 2.7 Sekuensing .......................................................................................... 12
2.3 Ekstraksi DNA Genom
.
....................................................................... ..........................................................................
111 BAHAN DAN METODE
13
3.1 Waktu dan Tempat
13
3.2 Prosedur Kerja ................................................................................ 3.2.1 Ekstraksi DNA Genom
13
..............................................................13
3.2.2 Amplifikasi DNA dengan Polimerase Chain Reaction (PCR) .. 14
............................................................................. 15 3.2.4 Isolasi DNA dari Gel .................................................................. 15 3.2.5 Ligasi ke Vektor pGEM-T Easy ................................................16
3.2.3 Elektroforesis
3.2.6 Transformasi ..............................................................................
16
3.2.7 Seleksi Koloni Bakteri dan Pembuatan Master Plate .................17 3.2.8 Isolasi Plasmid
...........................................................................
17
............................................................................... 18 3.2.10 Analisis Sekuen ..................................................................... 18
3.2.9 Sekuensing
.
IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................................
19
.................................................................................................. 4.1.1 Ekstraksi D N A Genom ..............................................................
19
4.1 Hasil
19
4.1.2 Amplifikasi D N A Kandidat Promoter dan Isolasi D N A dari Gel ............................................................................................
19
.................................. 20 21 4.1.4 Isolasi Plasmid .......................................................................... 4.1.5 Sekuensing dan Analisis Sekuen Promoter p-actin ................... 21 4.2 Pembahasan ......................................................................................... 24 4.1.3 Transformasi dan Seleksi Koloni Bakteri
DAPTAEk PUSTAKA ....................................................................................
28
DAFTAR TABEL Halaman 1. Jenis dan jumlah bahan dalam pembuatanpremix untuk PCR
.....................
14
2. Kuantifikasi DNA genom ikan kerapu bebek Cro~nileptesaltivelis ............. 19 3. Konsentrasi plasmid yang mengandung fragmen kandidat sekuen promoter
P-actin ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis
........................................... 21
DAFTAR GAMBAR
Halaman
..................................................... 7 2. Tahapan kerja PCR (Erlich, 1989) ............................................................ 9 3. Peta plasmid pGEM-T Easy ........................................................................ 10 1. Ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis
4. DNA genom hati ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis ......................... 19
5. Fragmen DNA kandidat promoter 8-actin kerapu bebek Cro~nileptes
........................................................................................................ 20 6. Seleksi koloni bakteri transformasi ............................................................. 20 altivelis
7. Seleksi koloni bakteri yang diduga membawa insersi ................................
8. Plasmid yang membawa insersi
..................................................................
21 21
9. Sekuen genom p-actin ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis hasil isolasi yang mencakup sekuen promoter dan sebagian ekson 3 ................. 22 10. Perbandingan ekson 2 dan sebagian ekson 3 dari genb-actin ikan kerapu bebek Crotnileptes altivelis dan gen pactin ikan kerapu lumpur Epinephelus coioides
......................................................................23
1 1. Perbandingan residu asam amino dari gen Factin ikan kerapu
bebek Cromileptes altivelis dan gen 8-actin ikan kerapu lurnpur .
.
Epinephelus cozoides .................................................................................
23
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Penyusunan primer berdasarkan database gen /?-actin dari berbagai spesies
ikan
............................................................................................................
32
2. Alat-alat yang digunakan dalam mengisolasi promoter /?-actin ikan kerapu
bebek Cromileptes altivelis
...........................................................................
33
3. Hasil sekuensing genompactin ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis ... 35
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Untuk menghasilkan benih ikan yang baik dibutuhkan induk berkualitas genetik baik. Salah satu usaha yang bisa dilakukan untuk memperbaiki kualitas induk adalah manipulasi DNNgen, yaitu dengan cara transgenesis. Transgenesis adalah suatu proses mengintroduksikan DNA eksogenous atau DNA asing ke hewan uji dengan tujuan untuk memanipulasi struktur genetiknya (Glick & Pasternak, 2003). Menurut Devlin et al. (1995), salah satu keuntungan transgenesis adalah mampu meningkatkan laju perhmbuhan secara drastis. Keuntungan lain yang didapatkan dari transgenesis adalah meningkatkan daya tahan &an terhadap penyakit (Dunham, 2004) dan mengurangi laju konsumsi oksigen pada ikan (Cook et al., 2000). lkan transgenik adalah ikan yang membawa gen asing hasil introduksi. Menurut Hacket (1993), ada tiga tahapan utama untuk menghasilkan ikan transgenik, yaitu (1) mempersiapkan konstruksi gen yang tersusun atas gen penyandi protein tertentu dan elemen regulator; (2) mengintroduksi konstruksi gen ke dalam inti sel pada embrio yang sedang berkembang supaya bisa didistribusikan ke semua jaringan ikan; (3) mengidentifikasi individu ikan yang mengekspresikan gen asing atau transgen. Elemen regulator/promoter suatu konstruksi gen menentukan keberhasilan pembuatan ikan transgenik. Promoter adalah bagian
dari
DNA
dimana RNA
polimerase menempel
dan
mengarahkannya sellingga transkripsi terjadi (Glick & Pasternak, 2003). Promoter tersebut ada yang bekeja di semua jenis jaringanlsel; promoter bersifat ubiquitous, dan ada yang bekerja pada jaringan spesifik (Hacket, 1993).
Selanjutnya, waktu ekspresi gen juga diatur oleh promoter. Oleh karena itu, promoter bisa dianalogikan sebagai switch suatu gen. Pada awal perkembangan transgenik pada ikan, promoter yang digunakan berasal dari mamalia atau virus, namun hasilnya kurang efektif. Kemudian masalah ini dipecahkan dengan menggunakan elemen regulator yang diperoleh
dari spesies yang sekerabat seperti yang telah dilaporkan oleh beberapa peneliti (Alam er a1.,1996 dan Hanley et a1.,1998 dalam Hwang et al., 2003). Selain
tingkat ekspresi gen tinggi, ikan transgenik yang dibuat menggunakan elemen regulator dari ikan kemungkinan lebih mudah diterima konsumen daripada yang dibuat menggunakan promoter dari mamalia atau virus (Hwang et a1.,2003). Salah satu promoter yang banyak digunakan dalam pembuatan ikan transgenik adalah promoter ,f?-actin. Promoter &actin mempunyai sifat constitutive (Volckaert et al., 1994) yang berarti bahwa promoter ini bisa aktif
tanpa diberikan rangsangan dari luar seperti suhu dan hormon. Promoter p-actin dari berbagai macam ikan telah diisolasi seperti pada ikan mas (Liu et al., 1990) ikan zebra (Higashijima et al., 1997), ikan medaka (Hamada et al., 1998), ikan mud loach (Noh et al., 2003), ikan nila (Hwang et al., 2003) dan red sea bream
(Kato et al., 2007). Meskipun promoter p-actin ikan medaka telah diuji pada berbagai macam spesies ikan seperti pada ikan rainbow trout (Yoshizaki, 2001), ikan zebra (Alimuddin et al., 2005), ikan nila (Kobayashi et al., 2007), ikan lele (Ath-thar, 2007) dan ikan mas (Punvanti, 2007) tetapi berdasarkan hasil penelitian Hwang et al. (2003) penggunaan promoter dari spesies yang sama atau dari yang sekerabat adalah lebih baik. Oleh karena itu dalam rangka pembuatan ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis transgenik dibutuhkan promoter dari ikan itu sendiri. Ikan kerapu bebek
dipilih karena ikan ini merupakan komoditas ekspor dengan harga yang relatif tinggi bila dijual dalam keadaan hidup ke luar negeri seperti Singapura, Hongkong, Taiwan, dan Cina (Chou & Lee, 1998 dalam Suwirya et al., 2005). Selain itu, ikan kerapu bebek merupakan salah satu komoditas yang termasuk dalam revitalisasi perikanan budidaya yang dicanangkan oleh pemerintah. Metode yang biasa digunakan untuk mengisolasi promoter adalah menggunakan metode PCR Vectorette. Tetapi metode ini mempunyai kekurangan, yaitu membutuhkan biaya yang tinggi dan waktu pengerjaan yang cukup lama. Untuk itu dibutuhkan metode alternatif yaitu metode degenerate PCR. Hwang et al. (2003) menggunakan metode degenerate PCR untuk mengisolasi promoter 8actin ikan nila. Metode degenerate PCR ini menggunakan primer mix yang
didapat dari me~lderetkaninformasi sekuens yang konserf dari berbagai spesies ikan. Metode ini biasa digunakan untuk kloning suatu gen. Belum diketahui apakah metode ini bisa digunakan untuk mengisolasi promoter ikan kerapu bebek.
Untuk itu, pada penelitian ini diujicobakan metode degenerate PCR untuk mengisolasi promoter 8-actin ikan kerapu bebek. 1.2 Tujuan Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi promoter Factin menggunakan metode degenerate PCR dan melakukan analisis sekuens promoter 8-actin ikan kerapu bebek.
11. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ikau Kerapu Bebek Ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis (Gambar 1) termasuk dalam famili Serranidae
yang mempunyai bentuk tubuh memanjang gepeng
(compressed) dan bisa mencapai panjang 1 meter dengan tub& tertutup oleh sisik-sisik kecil. Seluruh permukaan tubuh kerapu bebek benvama putih keabuan, berbintik bulat hitam serta moncong kepala lancip menyerupai tikus atau bebek (Heemstra & Randall, 1993). Klasifikasi kerapu bebek menurut Heemstra & Randal1 (1993) yaitu: Sub Filum : Vertebrata Kelas
: Teleostei
Sub Kelas : Osteicanthopterygii (Actinopterygii) Ordo
: Perciforma
Sub Ordo : Perciodea Famili
: Serranidae
Genus
: Cromileptes
Spesies
: Cromileptes altivelis
Gambar 1. Ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis Ran ini di dunia internasional dikenal sebagai humpback grouper, rockod,
hinds dan sea basses yang tergolong dala~nsub famili Epinephelinae dengan 15 genus dan 159 spesies. Ikan kerapu bebek mempunyai banyak nama lokal. Ikan ini di Australia dikenal dengan nama Baramundi cod, Sarasa-hata (Jepang), LapuLapung Senorita (Tagalog, Filipina), Polka-dot grouper. Sedangkan di Indonesia
dan Malaysia, ikan ini dikenal dengan nama kerapu bebek, kerapu tikus, kerapu belida dan kerapu sonoh (Heemstra & Randall, 1993). Kerapu bebek termasuk ke dalam predator yang dominan pada habitat karang dengan makanan utama adalah ikan, krustasea dan cephalopoda (Heemstra & Randall, 1993). Kerapu bebek banyak dijumpai pada perairan berbatu karang
atau karang berlumpur dengan kedalaman 40-60 meter. Dalam siklus hidupnya, ikan kerapu bebek muda hidup di perairan karang dengan kedalaman 0,5-3 meter, kemudian saat dewasa menuju ke perairan yang lebih dalam, dimana perpindahan ini biasanya terjadi pada siang dan senja hari. Telur dan larva kerapu bebek bersifat pelagis, sedangkan kerapu muda hingga dewasa bersifat demersal (Tampubolon & Mulyadi, 1989). Ikan kerapu bebek mempunyai strategi seksual protogini dimana ikan pertama matang gonad sebagai betina kemudian berubah kelamin menjadi jantan (Sadovy, 1996). 2.2 Promoter /?-actin
Promoter nle~pt3kansekuens DNA yang terletak upstream (terminal 5) dari lokasi diiulainya transkripsi (Hacket, 1993). Sekuens ini dikenali oleh RNA polimerase yang kemudian menempel dan mengendalikan proses transkripsi (Hacket, 1993; Glick & Pasternak, 2003). Promoter ada yang lnengendalikan ekspresi gen di semua jenis jaringanlsel (ubiquitous) dan ada yang bekerja pada jaringan spesifik, sehingga promoter dianalogikan sebagai switch suatu gen. Promoter /?-actin menliliki beberapa sifat yang terkait dengan aktivitas elemenelemennya yaitu contitutive, ubiquitous dan house keeping (Liu, 1990 dalam Volckaert, 1994). Constitutive berarti promoter ini dapat aktif tanpa diberikan rangsangan dari luar seperti suhu dan hormon. Promoter /?-actin bersifat ubiquitous (terdapat dimana-mana) artinya dapat aktif pada semua jaringan otot. Sedangkan bersifat house keeping berarti promoter /?-actin dapat aktif kapan saja bila diperlukan. Di dalam promoter terdapat sekuens faktor transkripsi, yaitu elemen yang menentukan aktivitas promoter. Sekuens faktor transkripsi yang berperan dalam aktivitas promoter /?-actin adalah boks TATA, boks CCAAT, dan CC(A/T)6GG atau motif CArG (Takagi et al., 1994). Motif CArG berada pada 2 tempat, yang
pertama ada di antara boks TATA dan boks CCAAT sedangkan yang lain berada di intron 1. Motif CArG yang terdapat pada intron 1 berfungsi sebagai peningkat (enhancer) dalam aktivitas transkripsi (Liu et al., 1990; Noh et al., 2003). Motif
CArG berperan dalam pengaturan ekspresi transgen (Takagi et al., 1994). Boks TATA merupakan elemen yang umum dijumpai pada sekuens promoter, sebagai tempat melekatnya RNA polimerase pada saat transkripsi RNA akan berlangsung (Glick & Pastemak, 2003). Penghapusan boks TATA membuat promoter tidak aktif pada in viho dan mengurangi aktivitas pada tingkat basal in vivo. Sedangkan elemen CCAAT merupakan elemen promoter yang bertempat sekitar 75-80 bp upstream dari daerah transkripsi dimulai. Aktivitas promoter pactin tergantung
pada keberadaan elemen CCAAT, dengan adanya elemen ini transkripsi tingkat tinggi akan terjadi (Quitschket et al., 1989).
2.3 Ekstraksi DNA Genom Ekstraksi DNA dilakukan untuk menlisahkan genom DNA dari molekulmolekul lain di dalam satu jaringan yang dilarutkan. Ada dua tahap yang dilakukan dalam ekstraksi DNA. Tahap pertama adalah menghancurkan sel dan mengisolasi asam nukleat. Penghancuran sel dilakukan dengan menambahkan larutan deterjen pekat seperti sodium dodecyl suphate (SDS). Deterjen ini bertindak sebagai penghancur inti sel sehingga DNA akan terlepas dan meningkatkan viskositas larutan, sehingga molekul DNA terlihat lebih nyata. Deterjen juga bertindak sebagai penghambat aktivitas semua enziin nuklease yang ada selama proses ekstraksi (Brown, 1995). Tahap kedua adalah pemisahan DNA dari bahan-bahan kontarninan seperti RNA dan protein. Enzim ribonuklease (RNase) digunakan untuk menghilangkan RNA. Kontarninan lain yaitu protein, dihilangkan dengan memberikan enzim proteolitik pada larutan DNA (Nicholl, 1994; Brown, 1995). Proses sentrifugasi akan menyebabkan cairan DNA terletak di lapisan atas larutan. Selanjutnya cairan DNA dipindahkan dari tabung mikro. Setelah tidak ada lagi protein yang dapat dipindahkan dari larutan DNA, asam nukleat diendapkan dari larutan supematan dengan penambahan etanol dingin. Setelah proses sentrifi~gasi,pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan buffer yang
mengandung Ethylenediaminetefraacetic (EDTA) (Boffey, 1986 dalam Ekasari, 1999) atau Steril Distilluted Water (SDW). Metode untuk menghitung jurnlah ekstrak DNA yang dihasilkan adalah dengan melihat hubungan DNA dengan absorbansi optikalnya pada panjang gelombang 260 nm dimana 1 mg DNA mempunyai daya absorbansi sebesar 20 unit (Stine, 1973 dalam Ekasari, 1999). Rasio absorbansi 260 d 2 8 0 nm yang kurang dari 1,8 inenunjukkan bahwa hasil ekstraksi telah terkontaminasi oleh protein atau fenol (Brown, 1990 dalam Ekasari, 1999). 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifkasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya (Saiki et al., 1988 dalam Wahyudi, 2001). Pada dasamya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA barn (extension) ole11 DNA polimerase dari arah terminal 5' ke 3'. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan
dengan
cara
mencampurkan
sampel
DNA
dengan
primer
oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (WTP), enzim termostabil Tag DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campman secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan. Proses PCR memerlukan sejumlah siklus untuk mengamplifikasi suatu sekuens DNA spesifk. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing (hibridisasi), dan ekstensi (polimerasi). Denaturasi dilakukan pada suhu 90-95"C, sehingga terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (template) tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase. Selanjutnya, suhu diturunkan untuk penempelan primer
oligonukleotida pada sekuens yang komplementer pada nlolekul DNA cetakan. Tahap ini disebut annealing. Suhu campuran diturunkan sampai mencapai -55OC atau sesuai melting temperature (Tm) dari primer oligonukleotida (Glick & Pastemak, 2003). Selama tahap ini, primer berpasangan dengan sekuens komplementernya di dalanl DNA cetakan. Primer oligonukleotida melekat pada masing-masing utas tunggal DNA dengan arah yang berlawanan; satu primer melekat pada ujung utas DNA sense, sedangkan primer yang lain inelekat pada ujung utas DNA antisense. Tahap selanjutnya adalah tahap ekstensi yang dilakukan pada suhu 72°C. Suhu ini merupakan suhu optimum untuk kej a enzim Taq DNA polimerase. Pada tahap ini enzim Taq DNA polimerase mengkatalis reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang sesnai dengan utas DNA komplemen yang berada di sebelahnya. Suhu pada setiap tahap diatur sedemikian rupa sehingga dihasilkan amplifkasi sekuens target DNA yang efisien (Saiki et al., 1989 dalam Wahyudi, 2001). Tahapan kerja PCR secara singkat digambarkan dalam Gambar 2. Degenerate PCR mempunyai banyak kesamaan dengan PCR biasa. Perbedaan utamanya adalah primer spesifk pada PCR biasa diganti dengan primer mix. Banyak gen dalam satu famili mempunyai struktur yang mirip. Dengan menderetkan sekuens nukleotida dari sejumlah nukleotida yang berhubungan &an dapat ditemukan bagian nukleotida yang konserf (conserve). Berdasarkan informasi tersebut dapat ditemukan motif nukleotida yang konserf yang dapat digunakan sebagai titik awal pembuatan primer degenerate PCR (Koelle, 1996). Pada penelitian ini menggunakan primer yang didesain berdasarkan database di Bank Gen (Lampiran 1). Database yang digunakan meliputi genp-actin dari ikan mas (no. Aksesi Bank Gen: M24113), ikan nila (no. Aksesi Bank Gen: AY116536), ikan medaka (no. Aksesi Bank Gen: S74868), ikan Mylophmyngodon piceus (no. Aksesi Bank Gen: AY289135), ikan Megalobrama amblycephala (no. Aksesi Bank Gen: AY170122), ikan grass carp (no. Aksesi Bank Gen: M25013) dan ikan Indian ca@sh (no. Aksesi Bank Gen: AY531754).
Keterangan: 1. Tahap denaturasi; 2. Tahap annealing 3. Tahap ekstensi; 4. Perkembangan pada siklus seianjutnya; P: Polimerase Gambar 2. Tahapan kej a PCR (Erlich, 1989) 2.5 Ligasi
Ligasi adalah pemasukan sekuens DNA yang mengandung gen yang diingiukan ke dalam elemen genetik yang dapat bereplikasi sendiri (vektor), seperti plasmid (Voet & Voet, 1994). Enzim yang mengkatalis reaksi ini adalah DNA ligase. Enzim ini dapat mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester pada DNA utas ganda antara ujung basa 3' dan ujung fosfat 5'. Jenis enzim ligase yang sering digunakan adalah T4-DNA Ligase yang dapat menyambung kembali DNA plasmid yang terbuka setelah dipotong oleh endonuklease restriksi. Pada proses penyambungan ini dapat juga disisipkan potongan DNA yang lain sehingga diperoleh plasmid rekombinasi yang baru (Smith, 1985 dalam Asikin, 2003). Proses ligasi ini menghasikan produk yang disebut DNA rekombinan. Penelitian ini menggunakan vektor Honing berupa plasmid.
Plasmid merupakan suatu molekul yang dapat bereplikasi sendiri (selfreplicating), terdii atas utas ganda DNA yang berbentuk sirkular (Glick & Pasternak, 2003). Kemampuannya untuk bereplikasi sendii dan tidak bergantung pada kromosom inang disebabkan oleh adanya titik awal replikasi pada plasmid (origin of replication; ori). Plasmid pada umurnnya mengandung satu atau lebih gen yang menyandi ketahanan (resisten) terhadap antibiotik, sehingga sel inang yang mengandung plasmid dapat bertahan dalam lingkungan yang mengandung antibiotik tertentu, misalnya ampisilin, kanamisin, tetrasiklin dan kloramfenikol. Hal ini dapat digunakan untuk membedakan (menyeleksi) bakteri yang mengandung plasmid atau tidak (sebagai selectable marker) (Brown, 1995). Plasmid juga mengandung cloning site, yaitu sekuens yang mengandung situs restriksi untuk memasukkan insersi tanpa mengganggu fungsi plasmid secara keseluruhan (Feinbum, 1998 dalam Hadi, 2004). Pada penelitian ini digunakan plasmid pGEM-T Easy yang berukuran sebesar 3015 bp dan peta plasmid pGEMT Easy dapat dilihat pada Gambar 3. Plasmid pGEM-T Easy berasal dari plasmid pGEM-SZf(+) yang dipotong dengan EcoR V dan ditambah gngus timin di kedua ujungnya. Plasmid pGEM-T Easy merupakan plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah ori dan gen ketahanan terhadap ampisilin @mpR) serta mengandung multi cloning site. Karena memiliki kelebihan Timin yang menggantimg di ujung terbuka plasmid (T overhang) plasmid ini sering dipakai sebagai vektor dari produk PCR yang selalu terdapat kelebihan Adenin (A) pada ujungnya, sehingga penempelan gen insert tidak perlu menggmakan enzim restriksi. Selain itu, plasmid pGEM-T Easy termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam suatu inang (bakteri).
Gambar 3. Peta plasmid pGEM-T Easy (Promega)
2.6 Transformasi dan Seleksi Koloni Plasmid rekombinan yang dihasilkan dari ligasi sela~~jutnya dimasukkan ke dalam sel kompeten. Proses ini disebut transfonnasi (Old & Primrose, 1994). Sel kompeten adalah sel yang telah memperoleh perlakuan kimiawi atau perlakuan fisik tertentu yang meningkatkan kemampuan sel tersebut untuk dapat dimasuki oleh plasmid (Hanahan, 1983 dalam Darmawan, 2004). Introduksi plasmid rekombinan ke dalam sel bertujuan agar dapat mengalami replikasi (penggandaan). Bertambahnya jumlah vektor rekombinan menyebabkan DNA yang tersisip juga mengalami replikasi. Sel kompeten yang digunakan dalam penelitian ini adalah Escherichia coli DH5a yang merupakan salah satu galur yang sering digunakan sebagai inang. Sel E. coli kompeten dibuat dengan merendam sel dalam larutan CaC12. Saat DNA ditambahkan pada sel yang telah menjalani perlakuan, DNA tersebut akan melekat pada permukaan luar sel, belum ditranspor ke sitoplasina. Pemasukkan DNA ke dalam sel kompeten distimulasi ole11 peningkatan temperatur lingkungan sel sampai 42°C. Teknik transfonnasi ini disebut kejutan panas (heat shock). Teknik ini sederhana dan tidak memerlukan peralatan khusus (Brown, 1995). Sel inang yang membawa DNA sisipan dapat diietahui dengan penanda seleksi, yaitu berupa sifat ketahanan terhadap antibiotik. Bakteri yang membawa plasmid rekombinan (mengandung DNA sisipan) akan resisten terhadap antibiotik tertentu dan yang bukan plasnlid rekombinan akan mati. Plasmid pGEM-T Easy yang digunakan pada penelitian ini mengandung penanda seleksi ampisilin (&npR). Sel inang yang inembawa plasmid rekombinan yang membawa DNA sisipan atau tidak, dapat diseleksi dengan penambahan X-gal (5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-P-D-galactopyranoside) dan IPTG (isopropil thiogalaktosida) pada media tumbuh, sehingga memberikan koloni bemama biru dan putih. Gel1 LacZ pada vektor kloning yang menyandi p-galactosidase akan mengubah molekui Xgal dari tidak berwarna menjadi molekul benvama bii. Gen Lac2 diinduksi oleh IPTG. Apabila gen LacZ tersisipi oleh molekul DNA lain, maka LacZ tidak dapat diekspresikan, sehingga sel yang mengandung sisipan tidak mampu merubah Xgal menjadi biru (Sdlarsono, 2000).
2.7 Sekuensing
Informasi mengenai sekuens DNA sangat diperlukan pada penelitian DNA rekombinan. Informasi ini sangat membantu terutama jika DNA rekombinan tersebut akan diekspresikan menjadi protein melalui vektor ekspresi. Sekuens nukleotida dari suatu ffagmen DNA dapat ditentukan menggunakan prosedur kimia yang dikembangkan oleh Alan Maxam dan Walter Gilbert atau menggunakan prosedur enzimatik yang dikembangkan oleh Fred Sanger (Glick & Pasternak, 2003). Kedua metode ini berbeda dalam teknik yang digunakan untuk menyusun tangga oligonukleotida. Metode kimia menggunakan reaksi kimia spesifik bagi tiap basa untuk memotong DNA berlabel, sedangkan metode enzimatik menggunakan DNA polimerase untuk mensintesis DNA berlabel yang komplementer dengan DNA cetakan (Ausubel et al., 1999 dalam Hadi, 2004). Metode Sanger mengalami modifikasi yang memiliki sensitivitas dan efektivitas analisis yang lebih baik dari metode Sanger tanpa modifikasi. Teknik ini berbeda dengan metode terdahulu karena digunakan label senyawa berfluoresensi.
111. BAHAN DAN METODA
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan Juni 2007 bertempat di Laboratorium Pengembangbiakan dan Genetika Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Prosedur Kerja
Tahapan kerja yang dilalui untuk mengisolasi promoter Factin adalah isolasi DNA genom, amplifikasi DNA dengan PCR dan elektroforesis, isolasi DNA dari gel, ligasi ke pGEM-T Easy, transformasi ke bakteri E.coli, seleksi koloni kandidat pembawa plasmid, isolasi plasmid dari bakteri, sekuensing dan selanjutnya dianalisis hasilnya. 3.2.1 Ekstraksi DNA Genom
Jaringan yang digunakan untuk mengambil DNA adalah hati ikan kerapu yang telah difiksasi atau diawetkan menggunakan Etanol 70%. Hati ditirnbang dengan berat 20-25 g dan dimasukkan ke dalam 3 buah tabung mikro. Masingmasing tabung mikro ditambahkan 300 pl Cell Lysis Solution (Puregene, Minneapolis, USA) dan 2 p1 Proteinase K (20 mglml) menggunakan mikropipet (Lampiran 2-A), kemudian dihomogenasi dengan vortex (Lampiran 2-B). Inkubasi menggunakan Dry Thermo Unit (Lampiran 2-C) pada suhu 55°C selama 1 malam (overnight). sebanyak 2 p1 RNase (4 mgtml) ditambahkan dan diaduk dengan hati-hati dengan cara membalik-balik tabung mikro. Inkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit dan disimpan dalam suhu 4°C selama 5 menit. Ditambahkan 200 p1 Protein Precipitation Solution (Puregene, Minneapolis, USA), diaduk perlahan lalu disentrifuse (Lampiran 2-D) dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Disiapkan tabung nlikro 1,5 ml b m yang diisi dengan 500 p1 Isopropanol, supernatant dipindahkan ke dalam tabung mikro b m , lalu diaduk sebanyak 50x dengan hati-hati. Sentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 10-15 menit. Supematan dibuang dan ditambahkan 300 p1 Etanol 70% dingin.
Sentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 inenit, supernatan dibuang, pelet DNA dikering-udarakan sekitar 20 menit. Ditambahkan 50 p1 Steril Distillated Water (SDW), diaduk dengan hati-hati dan DNA dapat disimpan dalam ffeezer (suhu -20°C). Kualitas dan kuantitas DNA genom hasil isolasi dapat diketahui dengan analisis kemurnian dan kandungan DNA dengan menggunakan spektrofotometer GeneQuant (Lampiran 2-E). Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 dan
280 nm. Kemurnian DNA d i t u n g dengan membandingkan absorbans pada panjang gelombang 260 nm dengan absorbans pada panjang gelombang 280 nm. Kandungan DNA ditentukan dari pengukuran pada panjang gelombang 260 nm. Selanjutnya dilakukan elektroforesis pada gel agarosa 0,7%.
3.2.2 Ampmkasi D N A dengan Polimerase Cl~ailrReaction (PCR) Tahap ini dimulai dengan membuat premix yang dapat dilihat pada Tabel berikut ini: Tabel 1. Jenis dan jumlah bahan dalam pembuatanpremix untuk PCR
I Bahan
(
10 x Buffer LA Taq
Jumlah (pl)
1 1,00 x jumlah sampel
dNTP
1,00 x jumlah sampel
LA Taq
1,00 x jumlah sampel
MgC12
1,00 x jumlah sampel
Primer: Forward (GTGWGTGACGCYGGACCAATC)
1,00 x jumlah sampel
Reverse (TAGAAGGTGTGRTGCCAGATCTTC)
1,00 x jumlah sampel
Steril Destilation Water (SDW)
3,00 x jumlah sampel
Keterangan: W= A + T; R=A+G; Y= C + T
Konsentrasi primer yang digunakan adalah 10 pmol. Sebagai pelarut dalam pelarutan primer digunakan SDW. Pencampuran bahan-bahan di atas dilakukan di atas es (on ice). Larutan premix diasukkan ke dalam masingmasing tabung mikro sebanyak 9 pl untuk setiap sampel. Setelah itu, ditambahkan sampel DNA masing-masing 1 p1. Lalu tabung mikro tersebut diasukkan ke dalam mesin PCR (Lampiran 2-F) dengan program PCR yang digunakan adalah 1
siklus pada suhu 94OC selama 3 menit; 5 siklus pada suhu 94°C selama 30 detik dan 62°C selama 3 menit; 30 siklus pada suhu 94°C selama 30 detik, 58°C selama 30 detik, 72°C selama 3 menit; dan 1 siklus pada suhu 72°C selama 5 menit. Setelah mesin menunjukkan suhu 4"C, maka mesin dapat dimatikan. Lalu hasil PCR dapat langsung dianalisis dengan elektroforesis atau disimpan di dalam refiigerator dengan suhu 4°C. 3.2.3 Elektroforesis
Pembuatan gel agarosa (konsentrasi 0,7%) dimulai dengan melarutkan serbuk gel agarosa sebanyak 0,14 gram dalan 20 ml larutan tris boric EDTA (TBE) yang mengandung etidiurn bromida (0,Ol glml). Kemudian dipanaskan dalam microwave (Lampiran 2-G) sampai agarosa larut dan larutan menjadi berwama bening, larutan tersebut didiamkan sampai hangat lalu dituangkan ke dalam cetakan dengan ketebalan 3-5 mm. Sementara itu di dalam cetakan sudah terpasang sisir pembuat lubang (Lampiran 2-H). Kemudian gel dibiarkan sampai membeku. Setelah itu sisir dilepaskan dan padatan gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis (Lampiran 2-1) yang berisi buffer elektroforesis (TBE). Kemudian sampel DNA dicampurkan dengan loading buffer, lalu dimasukkan ke dalam lubang-lubang yang terdapat dalam gel dengan menggunakan mikropipet. Sementara itu marker DNA juga dimasukkan ke dalam lubang yang mengapit lubang-lubang yang berisi sampel. Setelah itu, bak elektroforesis ditutup dan listrik dialirkan dengan tegangan 200 Volt dan kuat arus 70 mA. Lalu DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke positif. Setelah DNA berrnigrasi sampai tiga per empat bagian dari panjang gel, aliran listrik dihentikan. Lalu gel diangkat dan dilepaskan dari cetakannya. Kemudian keberadaan DNA dilihat dengan ultraviolet illuminator (Lampiran 2-5). 3.2.4 Isolasi DNA dari Gel
Isolasi DNA dari gel ini menggunakan Gene Mate Purification Kit (ISC BioExpress, Kaysville). Hasil PCR yang telah dielektroforesis sebanyak 9 p1, kemudian gel dipotong pada bagian yang terdapat band DNA dengan panjang yang sesuai yaitu 1,5 kb lalu gel ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung
mikro 1,5 ml. Selanjutnya ditambahkan TBE Gel Melt sebanyak ?4dari berat gel dan juga ditambahkan Sodium Iodide sebanyak 4,5 kali berat gel, dicampur dengan cara vortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55°C selama 5 menit, sementara itu vortex Glass Blind selama 30 detik. Selanjutnya Glass Blind ditarnbahkan sebanyak 6 p1, dibolak-balik beberapa kali. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu ruang selama 5 menit. Kemudian disentrifuse pada kecepatan 13000 rpm selama 5 detik dengan suhu 4°C. Supematan yang ada dibuang, lalu ditambahkan 1 ml Wash Buffer yang telah ditambahkan Etanol kemudian tabung mikro divortex sampai pelet larut. Selanjutnya disentrifuse selama 5 detik dengan kecepatan 13000 rpm dan Wash Buffer dibuang sampai bersih. Lalu ditambahkan 9 p1 SDW, diaduk sampai pelet hancur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya sentrifuse dengan kecepatan 13000 rpm selanla 1 menit pada suhu ruang, supernatan dipindahkan pada tabung mikro dan dapat disimpan padafreezer (suhu -20°C). 3.2.5 Ligasi ke Vektor pGEM-T Easy Tahap selanjutnya adalal~ligasi fragmen DNA dengan vektor Honing pGEM-T Easy (Promega). Komposisi reaksi ligasi meliputi 5 pl larutan DNA, 0,5 p1 pGEM-T Easy; 6,5 p1 5x Buffer Ligasi, dan 1 pl enzim T4 DNA ligase (TAKARA).
Inkubasi dilakukan selama 2 jam pada suhu ruang, kemudian
inkubasi dilanjutkan semalanlan di refrigerator (suhu sekitar 4°C). 3.2.6 Transformasi Hasil reaksi ligasi digunakan dalam proses transformasi; suatu proses memasukkan plasmid berupa vektor Honing yang mengandung fragmen DNA insersi ke dalam bakteri E. coli DH5a.
Sebanyak 6,5 pl hasil reaksi ligasi
dicampur ke dalam tabung mikro berisi sel kompeten. Transformasi dilakukan dengal cara kejutan panas suhu 42OC selana 45 detik. Setelah diinkubasi on-ice selama 2-3 menit, ke dalam tabung mikro ditambahkan larutan SOC sebanyak 900 p1. Lamtan SOC mengandung 1,2 g Polypeptone, 0,3 g Yeast Extract, 0,035 g NaC1,0,011 g KCl, 600 p1 MgClz lM, 600 p1 MgS04 lM, dan 60 p1 Glucose 2M dalam 60 ml SDW. Selanjutnya tabung mikro berisi bakteri hasil transformasi
diinkubasi pada suhu 37OC selama 1 jam. Kemudian bakteri disebar di atas cawan agarosa 2xYT (I, X, A). Larutan 2xYT (I, X, A) mengandung 1,6% Polypeptone, 1% Yeast Extract, 0,5% NaCl dan 1,5% Agarosa dalam SDW, IPTG (40 pglml), X-gal (0,25 g/ml) dan Ampisilin (100 pglml). Inkubasi dilakukan pada suhu 37OC selama semalanlan. 3.2.7 Seleksi Koloni Bakteri dan Pembuatan Master Plate
Sebanyak 10 koloni putih transforman diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke tabung mikro 1,5 mi dan dilanjutkan dengan pembuatan
master plate agarosa 2xYT ( I , X, dan A). Masterplate diinkubasi pada suliu 37OC sekitar 8 jam. Ke dalam tabung mikro berisi bakteri ditambahkan 10 p1 Buffer
Cracking, 10 p1 larutan EDTA 1 M dan sekitar 2 pl6x Loading Buffer berisi KC1 1 M dengan perbandingan volume 1:l. Buffer Cracking mengandung 0,2 g Saccharosa, 40 p1 NaOH 5 M, 50 p1 SDS 10% dan sisanya SDW hingga larutan menjadi 1 ml. Setelah diiiubasi sekitar 5 menit, dilakukan sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 10 p1 supematan yang terbentuk dielektroforesis dengan gel agarosa 0,7%. Sebanyak 3 koloni bakteri yang membawa insersi kemudian diambil menggunakan tusuk gigi steril dan disentuhkan ke dalam media cair 2xYT berisi ampisilin. Inkubasi bakteri dilakukan pada suhu 37OC selama sekitar 14jam. 3.2.8 Isolasi Plasmid Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit FlexiPrep (Arnersham) dengan prosedur sesuai manual. Bakteri dari setiap tabung kultur dituang ke dalam tabung mikro 1,5 ml. Bakteri diendapkan dengan cara senhifuse pada kecepatan 13.000 rpm sekitar 1 menit. Supematan dibuang dan ke dalam tabung mikro berisi pelet bakteri ditambalkan larutan 1 sebanyak 200 p1, dilanjutkan dengan vortex hingga semua pelet bakteri lepas dari dasar tabung. Kemudian ditambahkan larutan 2 sebanyak 200 p1, tabung mikro dibolak-balik sekitar 10 kali sebelum ditambahkan dengan larutan 3 sebanyak 200 pl. Tabung dibolak-balik hingga terbentuk gumpalan-gumpalan putih, dilanjutkan dengan sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru,
disentrifuse sekali lagi pada kecepatan dan lanla waktu yang sama dengan sebelumnya. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro berisi Isopropanol420 p1. Vortex selama sekitar 1 menit, dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian dilakukan sentrifuse kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Setelah Isopropanol dibuang dengan bantuan aspirator, ke dalam tabung mikro berisi pelet DNA ditambahkan Sephaglass sebanyak 150 p1, vortex selama
1 menit dan dilanjutkan dengan sentrifuse 13.000 rpm selama 30 detik. Supematan dibuang d m ke dalam tabung ditambahkan larutan Wash Buffer sebanyak 200 p1, vortex selama 1 menit dan kemudian sentrifuse 13.000 rpm selama 30 detik. Larutan Wash Buffer dibuang dan diganti dengan Etanol 70% dingin sebanyak 300 p1, vortex selama 1 menit dan kemudian disentrifuse 13.000 rpm selama 30 detik. Setelah semua Etanol dibuang, tabung mikro dibiarkan kering udara selama sekitar 10 menit. Plasmid DNA dilarutkan menggunakan SDW sebanyak 30-50 p1, vortex dan tabung mikro berisi plasmid dibiarkan selama 5 menit di suhu ruang. Sentrifuse pada suhu ruang dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1-2 menit. Supernatan yang berisi plasrnid DNA dipindahkan ke tabung yang baru. Sebanyak 1 p1 hasil isolasi digunakan untuk elektroforesis. Konsentrasi DNA diukur menggunakan spektrofotometer GeneQuant. 3.2.9 Sekuensing
Selanjutnya plasmid yang telab diisolasi dikirim ke Department of Marine Biosciences, Tokyo University of Marine Science and Technology, Minato, Tokyo, Jepang untuk disekuensing. Sekuensing dilakukan menggunakan mesin
ABI PRISM 3 100-Avant Genetic Analyzer (Lampiran 2-K). 3.2.10 Analisis Sekuens
Urutan nukleotida yang diperoleh dari hasil sekuensing dilakukan analisis dengan menggunakan program GENETYX versi 7 untuk menganalisis kemiripan nukleotida dengan ikan lain. Selanjutnya program TFBind untuk menganalisis karakteristik promoter pactin yang dimiliki oleh ikan kerapu bebek.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil
4.1.1 Ekstraksi DNA Genom Ekstraksi DNA genom dari hati ikan kerapu bebek telah berhasil dilakukan dengan kuantifikasi berdasarkan spektrofotometer (Tabel 2) dan pengecekan kualitas berdasarkan elektroforesis pada gel agarosa 0,7% (Gambar 4). Tabel 2. Kuantifikasi DNA genom ikan kerapu bebek (Cromileptes altivelis) Sampel Rasio (126011280)
Konsentrasi DNA (nglpl)
1
1,854
169,64
2
1,877
92,40
3
1,836
349,76
Keterangan: M adalah Penanda, 1-3 adalah sampel DNA dari ikan yang sama
Garnbar 4. DNA genom hati ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis 4.1.2 Amplifiiasi DNA Kandidat Promoter dan Isolasi DNA dari Gel
Hasil ekstraksi selanjutnya dianlplifikasi dan kemudian dilakukan pengecekan menggunakan elektroforesis gel agarosa 0,7% (Gambar 5-A). Fragmen DNA yang terlihat memiliki panjang sekitar 1,5 kb dan diduga sebagai sekuens promoter &actin. Fragmen tersebut dipurifikasi menggunakan kit dan selanjutnya dielektroforesis kembali (Garnbar 5-B).
Keterangan: A adalah Fragmen DNA hasil PCR, B adalah Fragmen DNA hasil isolasi dari gel, M adalah Penanda, 1-2 adalah sample DNA
Gambar 5. Fragmen DNA kandidat promoter pactin kerapu bebek Cromileptes altivelis 4.1.3 Transformasi dan Seleksi Koloni Bakteri
Hasil transformasi terlihat koloni bakteri benvama putih dan biru (Gambar 6 ) pada media seleksi. Selanjutnya untuk membuktikan kebenaran koloni putih membawa insersi plasmid kandidat promoter dilakukan pengecekan elektroforesis dengan koloni biru sebagai kontrol. Ukuran pita DNA plasmid koloni putih yang membawa insersi lebih besar dibandingkan dengan koloni biru yang digunakan sebagai kontrol (Gambar 7).
Koloni Biru
Putih
Keterangan: Koloni Putih adalah koloni yang membawa insersi, Koloni Biru adalah koloni yang tidak membawa insersi, Lmgkaran Merah adalah koloni yang diambit untuk elektroforesis dan dikultur untuk diisolasi plasmidnya
Ganlbar 6. Seleksi koloni bakteri transfomasi
Keterangan: K adalah kontrol (Koloni Biru); 1-10, Koloni bakteri yang diduga membawa insersi (Koloni Putih)
Gambar 7. Seleksi koloni bakteri yang diduga membawa insersi
4.1.4 Isolasi Plasmid Koloni putih yang sama dikultur kemudian diisolasi plasmidnya dan selanjutnya dilakukan pengecekan dengan elektroforesis (Gambar 8) mendapatkan ukuran plasmid sekitar 4 kb. Konsentrasi DNA didapat kisaran antara 304-348 ng/pl (Tabel 3).
M
I
2
3
Keterangan: M adalah Penanda; 1-3 adalah Bakteri pembawa insersi plasmid
Gambar 8. Plasmid yang membawa insersi Tabel 3.
Konse~itrasiplasmid yang mengandung fiagmen kandidat sekuens
4.1.5 Sekuensing dan Analisis Sekuens Promoter $-actin Plasmid yang telah diisolasi selanjutnya disekuensing (Lampiran 3) sehingga ~nendapatkannukleotida-nukleotida seperti pada Gambar 9. Fragmen
DNA kandidat promoter p-actin kerapu bebek terdapat nukleotida sebanyak 1630
ntclaa.2aacoccaflaccaatcagcgggcgccgtgcggaaagttctccttttataq -.
agaggggctgcagcgcgagctctgataaaaccctgcaatttattggcgtccattg cagtcaagttcagacactaaaccctaccggagtgtagcgctcagtcacagccttc ccaacgccgacaaccctccctctaacaggtaagacaactgcggtgcgaagatgag aatttctatcacatttcaaatacttctattttaacacaaatatatatattatcac - - - a~tctgg~gccggttaagttacgatgc~gggtcttctgtgtgacttccaagttgc agcaatcgttacaactgctaactgaaattcccgtagcctgtcattcattacatgt c~ttgaatgggcaccgttaaagtttaaggggatgc~gtaacatttaacgcc
tcaaagtgtggctgtttgtcggcatgctgtcgtttgtgttaaagcgctggtgtga aataacccggctgctccgtgctgtcaccgcttcatcactgaaacaaatcagacgg cgttaaaaaaagcctgaccttctcgcttacatataagcatctgctttggcacggt cgccgggtCTGCTGTCTCCGAllTCACACACGGATGATGACG
GA1TAAACTTAAACGACTTCAllTAGAlTGCgtggagagataggaaaatgCCgCg
gtgacattgcagccacaatgtcatttggtgat~aagttaacgttacgtcttgcaa atgtcagaagttgctatttatcatataacctttgtagggatgaataatggtcacg acaaaactgtgcatctgatggctgacatgatagtgaatggaagtttatgcacgtc agaactgctgtatgaaattgtgcgaaagaggtgtgtgtgtgtgtgtggttggtta atttcagtgatggtgatcccggtaagggagtggtcggctgtcggtgtcatttgga ggtttaactaaacacggggcggcttcgcgggccgggctgccgccgtctctaagct gctctcacttttgccttatataqccatggccag~gagggagaaactgcctttg
tttctcagcgctggatttgggctgggacctgcgccactgcgacatccagcgtcca gtctccataatgacaaggctttcatccagctgatgattgccagatgtaactgtca cagagcatcagttgtaaccacccttcctctttttttcatccttcctcctgctcag &AATGGATGATGAAATCGCCGCCCTCGTTGl-rGACAACGGATCCGGTATGTGCA AAGCTGGCmGCAGGAGATGATGCTCCACGTGCTGTG1TCCCCTCCAl-rG1TGG ACGTCCCAGACATCAGgtaCagtttgtgCagaagatCatatCaaaCatCgataCC
taaacttattctacatttatCttaattttaaccttctatcttcttccctaaGGTG
Keterangan: llumf kecil adalah intron sedangkan humf kapital yang digaris bawah adalah ekson. Huruf merah digaris bawah merupakan sekuens primer. Hurul kecil h e n v m a hitam digaris bawah mempakan sekuens CArG dan TATA.
Gambar 9. Sekuens genom 8-actin ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis hasil isolasi yang mencakup dari sekuens promoter sampai sebagian ekson 3.
Dari sekuens genonl 8-actin ikan kerapu bebek yang didapat, dianalisis menggunakan program GENETYX mendapatkan 3 ekson dan 2 intron (Gambar
9). Penderetan (alignment) sekuens gen 8-actin ikan kerapu bebek dengan gen 8actin ikan kerapu lumpur Epinephelus coioides (Gambar 10) terdapat kemiripan yang tinggi, begitu juga dengan sekuens asam aminonya (Gambar 11).
.......................................
Kerapulumpur
0
Kerapu bebek
1 T':TG,:TGTT-:,:GATTT,'A:P.
Kerapulumpur
1
'A,: GGA~:P.GATGY.TGG::P.GBTTBGA':GGATTkA.kITTAP.
61 A G R - T T BTTTAGATTG GTGGAGt.GRTP.GA.4
Kerapu lumpur
28
Kerapu bebek
121
Kerapu bebek
181
87 ?~
[
?
~
4
~
180 ?
umTia;ITu;m
147 240
Kerapu lumpur 148 Kerapu bebek
241
Kerapu lumpur 268 Kerapu bebek
361
60
.................................
Kerapu bebek
Kerapu lumpur
0
207 300
T
.AP.'GhG,-TGP.GAGTTG.:,-
i'TG.%GGBGP.-,'TGT
'
T W T 'ds-i.G>.GG^,'
.......................................................
'7%-327
Gambar 10. Perbandingan ekson 2 dan sebagian ekson 3 dari gen D-actin ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis dan gen p-actin ikan kerapu lumpur Epinephelus coioides
Gambar 11. Perbandingan residu asam amino dari gen p-actin ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis dan gen p-actin ikan kerapu lumpur Epinephelus coioides Analisis sekuens lebih lanjut dilakukan menggunakan program TFBind untuk mengetahui sekuens faktor transkripsi. Faktor transkripsi yang mempengaruhi aktivitas promoter pactin adalah boks TATA, motif CCAAT, motif CArG atau CC(A/T)6GG. Hasil analisis (Ganlbar 9) menunjukkan bahwa sekuens CCAAT terletak pada nukleotida 16-21, motif CArG pada nukleotida 4655 pada sekuens proksimal promoter dan nukleotida 1059-1068 pada intron 1, sekuens TATA pada nukleotida 582-586.
3 65
~
4.2 Pembahasan
Ekstraksi DNA dari hati ikan kerapu bebek telah berhasil dilakukan. DNA diamplifikasi dengan menggunakan primer yang didesain dengan mengurutkan sekuens yang konserf dari berbagai spesies ikan atau primer degenerate. Dengan primer degenerate tersebut telah berhasil mengamplifikasi DNA sepanjang 1,5 kb sesuai dengan primer yang disusun sebelumnya. Fragmen tersebut selanjutnya diligasi dengan vektor kloning berupa plasmid. Plasmid tersebut diinduksikan ke dalam sel kompeten (transfomasi) bertujuan agar dapat mengalami replikasi (penggandaan) (Hanahan, 1983 dalam Darmawan, 2004). Untuk menyeleksi hasil transformasi digunakan gen resisten terhadap ampisilin yang terdapat pada vektor kloning. Selain itu, seleksi juga dilakukan dengan penambahan IPTG dan X-gal
pada media seleksi. Keberhasilan
transformasi ditunjukkan dengan adanya koloni putih pada media seleksi. Koloni putih adalah transforman yang mengandung sisipan fragmen DNA kandidat promoter, sedangkan koloni biru adalah nontransforman. Bakteri yang dapat hidup pada media seleksi yang mengandung ampisilin adalah bakteri E. coli DH5a yang mengandung vektor kloning pGEM-T Easy rekombinan. Bakteri ini tidak mampu menghasilkan b-galrrktosidase karena adanya sisipan fragmen DNA kandidat promoter pada gen LacZ sehingga X-gal tidak dapat dipotong dan koloni tetap benvama putih. Sedangkan koloni yang mengandung pGEM-T Easy non rekombinan tidak mengalami penyisipan fragmen DNA kandidat promoter pada gen LacZ sehingga mampu menghasilkan P-galaktosidase yang mengubah molekul X-gal dari tidak berwama menjadi molekul berwarna biru pada koloni. Koloni putih yang mengandung insersi dikultur dan diisolasi plasmidnya. Plasmid selanjutnya disekuensing sehingga mendapatkan urutan nukleotida. Urutan nukleotida dari fragmen DNA kandidat promoter b-actin kerapu bebek yang diisolasi sebanyak 1630 bp. Untuk mengetahui kemiripan nukleotida dengan ikan lain, dilakukan analisis dengan program GENETYX. Persentase homologi sekuens genom P-actin ikan kerapu bebek hasil isolasi dengan ikan inas adalah sebesar 55,23%, ikan kerapu bebek dengan ikan Mylopharyngodon 54,52%, ikan kerapu bebek dengan ikan Megalobrama 52,96%, ikan kerapu bebek dengan ikan nila 49,55% dan ikan kerapu bebek dengan ikan medaka
46,66%. Selanjutnya, sekuens DNA yang diisolasi memiliki 3 ekson. Ekson adalah bagian utas DNA yang ditranskripsi menjadi messenger RNA (mRNA) dan ditranslasi menjadi protein (Griffrths et al., 1999). Ekson 1 merupakan sekuens yang tidak mengkodekan asam amino atau disebut untranslated region. Ekson 2 dan 3 merupakan sekuens yang mengkodekan asam amino. Sekuens awal yang memulai transkripsi yaitu ATG yang terdapat pada ekson 2 pada nukleotida 1269 yang d i t u n g dari ujung sekuens terminal 5. Urutan nukleotida ekson 2 dan ekson 3 pada gen /?-actin ikan kerapu bebek hampir sama dengan gen &actin ikan kerapu lurnpur Epinephelus coioides, begitu juga dengan asam amino yang ditranslasi dari &A
mempunyai kemiripan dengan ikan kerapu lumpur. Hal ini
m e m b u k t i i dugaan bahwa sekuens DNA basil isolasi merupakan sekuens /?Selain ekson, dalam sekuens gen &actin ikan kerapu bebek juga terdapat intron, yaitu bagian utas DNA yang tidak ditranskripsi menjadi mRNA karena telah dipotong dan dikeluarkan dari utas RNA sebelum proses translasi berlangsung (Page & Holmes, 1998). Walaupun intron tidak ditranslasikan menjadi protein tetapi informasi sekuens DNA intron dapat digunakan sebagai data karakteristik gen. Intron 1 terdapat diantara ekson 1 dan ekson 2 yang diawali dengan nukleotida GT dan diakhiri nukleotida AG. Nukleotida GTIAG adalah nukleotida yang selalu diienali oleh protein spliceosome. Spliceosome adalah suatn protein yang memotong intron (Griffiths et al., 1999). Analisis sekuens lebih lanjut dilakukan menggunakan program TFBind untuk mengetahui sekuens faktor transkripsi. Faktor transkripsi (Transcription Factor) adalah elemen sekuens pendek yang berada dalam sekuens promoter yang beraksi sebagai sinyal yang dikenali ole11 protein trans-acting sehingga transkripsi terjadi. Faktor transkripsi yang mempengaruhi aktivitas promoter /?-actin adalah boks TATA, motif CCAAT, motif CArG atau CC(A/T)6GG. Dengan adanya ketiga elemen tersebut diduga promoter pactin ikan kerapu bebek dapat aktif, sama halnya seperti yang dijumpai pada promoter Factin ikan mas (Liu et aL, 1990), ikan zebra (Higashijima et al., 1997), ikan medaka (Hamada et al., 1998), ikan mud loach (Noh et al., 2003), ikan nila (Hwang el al., 2003) dan red sea bream (Kato et al., 2007). Keja sama antara elemen-elemen penyusun promoter
tersebut, membuat promoter dapat aktif dan mengendalikan ekspresi transgen pada waktu dan tempat yang tepat. Hacket (1993) menyatakan jika terdapat kesesuaian antara elemen cis-acting dengan trans-acting, maka unumnya ekspresi gen yang dikendalikan tinggi. Elemen cis merupakan sekuens dalam promoter sedangkan elemen trans merupakan protein atau faktor-faktor lain yang menempel pada elemen cis. Dalam pembuatan konstruksi gen diperlukan promoter dengan elemen CCAAT, boks TATA, motif CArG, ekson 1 dan intron 1, jadi dibutuhkan sekuens sepanjang 1,3 kb. Hal ini didukung oleh Higashijima et al. (1997) yang memasukkan intron 1 sebagai bagian dari promoter dalam penelitiannya. Uutuk membuat ikan kerapu bebek transgenik sekuens promoter dapat disambungkan dengan gen penyandi protein tertentu dan selanjutnya ditransfer ke embrio ikan kerapu bebek. Gen penyandi yang digunakan dapat disesuaikan dengan tujuan dari pembuatan ikan transgenik. Gen penyandi yang dapat digunakan untuk ikan kerapu bebek antara lain gen hormon pertumbuhan (Growth hormone, GH) yang berasal dari ikan kerapu bebek sehingga dapat meningkatkan laju pertumbuhan dengan drastis. Pada ikan mud loach (Nam et al., 2001) kecepatan tumbuh menjadi 35 kali lebih cepat dengan mentransfer konstruksi gen yang terdiri atas promoter dan gen hormon pertumbuhan yang berasal dari ikan yang sama. Dengan menggunakan konstruksi gen "all-fish" kemungkinan penerimaan konsumen juga akan lebih baik (Hwang et a1.,2003). Menurut Wu et al. (2003) mentransfer GH "all-fish" tidak memproduksi protein baru atau produk biologi baru tetapi hanya memproduksi hormon pertumbuhan baru.
V. KESIMPULAN
Promoter p-actin ikan kerapu bebek telah berhasil diisolasi dengan panjang 1,3 kb. Pada sekuens yang diisolasi terdapat faktor transkripsi yang biasa dijumpai pada promoter pactin, yaitu boks TATA, motif CCAAT dan motif CArG (CC(A/T)6GG).
DAFTAR PUSTAKA Alimuddin, Yoshizaki G, Kiron V, Satoh S, Takeuchi T. 2005. Enhancement of EPA and DHA Biosynthesis by Over-expression of Masu Salmon A6Desaturase-Like Gene in Zebrafish. Transgenic Research 14: 159-165 Asikin Y. 2003. Isolasi DNA dari lingkungan dan studi transformasi. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor Ath-thar MHF. 2007. Efektivitas promoter p-actin ikan medaka Oryzias latipes dengan penanda gen hrGFP (Humanized Renilla reniformis Green Fluorescent protein) pada ikan lele Clarias sp. Keturunan FO. Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor Brown TA. 1995. Gene Cloning And Introduction. London: Chapman & Hall Cook JT, McNiven MA, Sutterlin AM. 2000. Metabolic rate of pre-smolt growthenhanced transgeilic atlantic salmon Salmo salar. Aquaculture 188: 33-45 Darmawan N. 2004. Isolasi, kloning dan sekuensing gen putatif enzim PQQ glukosa dehidrogenase dari Agrobacterium lumefaciens. Skripsi. Departemen Kimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor Devlin RH, Yesaki TY, Donaldson EM, Du SJ, Hew CL. 1995. Production of germline transgenic pacific salmonids with dramatically increased growth performance. Canadian Journal of Fisheries Aquatic Sciences 52: 13761384 Dunham RA. 2004. Aquaculture And Fisheries Biotechnology: Genetic Approaches. Cambridge: CAB1 Publishing Ekasari J. 1999. Isolasi DNA mitokondria (rntDNA) ikan patin Pangasius
hypophthaalmus. Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilrnu Kelautan. Institut Pertanian Bogor Erlich HA. 1989. PCR Technology Principles And Application For DNA Amplification. New York: M Stockton Press Glick BR, Pastemak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles And Application Of Recombinant DNA. Ed ke-3. Washington DC: ASM Press Griffiths AFJ, Gelbert WM, Miller JH, Lewontin RC. 1999. Modem Genetic Analysis. New York: WH Freeman & company
Hacket PB. 1993. The molecular biology of transgenic fish. in: Hochachka and Mommesen (Eds.). Biochemistry and Molecular Biology of Fishes 2: 21 822 1 Hadi SN. 2004. Kloning dan ekspresi daerah determinan "a" gen s virus hepatitis B pada khamir Saccharomyces cerevisiae YRD15. Skripsi Departemen Kimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor Hamada K, Tamaki K, Sasado T, Watai Y, Kani S, Wakamtsu Y, Ozato K, Kinoshita M, Kohno R, Takagi S, Kimura M. 1998. Usefulness of the medaka p-actin promoter investigated using a mutant GFP reporter gene in transgenic medaka Oryzias latipes. Molecular Marine Biology and Biotechnology 7: 173-180 Heemstra TC, Randall JE. 1993. FA0 Species Catalogue Vol 16. Rome: FA0 Fisheries Synopsis Higashijima S, Okamoto H, Ueno N, Hotta Y, Eguchi G. 1997. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoter of zebrafish origin. Developmental Biology 192: 289-299 Hwang G-L, Rahman MA, Razak SA, Sohm F, Farahmand H, Smith A, Brooks C, Maclean N. 2003. Isolation and characterisation of tilapia p-actin promoter and comparison of its activity with carp p-actin promoter. Biochimica et Biophysica Acta 1625:ll-18 Kato K, Takagi M, Tamaru Y, Akiyama S-I, Konishi T, Murata 0, Kumai H. 2007. Construction of an expression vector containing a p-actin promoter region for gene transfer by microinjection in red sea bream Pagrus major. Fisheries Science 73: 440-445 Kobayashi S, Alimuddin, Morita T, Miwa M, Lu J, Endo M, Takeuchi T, Yosliizaki G. 2007. Transgenic nile tilapia Oreochromis niloticus overexpressing growth hormone show reduced ammonia excretion. Aquaculture 270: 427-435 Koelle M. 1996. Degenerate PCR. http://www.d&~~outh.edn. Kamis, 9 September 2007 Liu Z, Moav B, Faras AJ, Guise KS, Kapuscinski AR, Hackett PB. 1990. Functional analysis of elements affecting expression of the P-actin gene of carp. Molecular Cell Biology 10: 3432-3440 Nam YK, Noh JK, Cho YS, Cho HJ, Cho KN, Kim CG, Kim DS. 2001. Dramatically accelerated growth and extraordinary gigantism of
transgenic mud loach Misgurnus mizolepi. Transgenic Research 10: 353362 Nicholl DST. 1994. An Introduction To Genetic Engineering. Cambrige: University Press Noh JK, Cho KN, Han EH, Kim A, Lee JS, Kim DS, Kim CG. 2003. Genomic cloning of mud loach Misgurnus mizolepis (Cypriniformes, Cobitidae) beta-actin gene and usefulness of its promoter region for fish transgenesis. Marine Biotechnology 5: 244-252 Old RW, Primrose SB. 1994. Principles Of Genetic Manipulation. Ed ke-5. Oxford: Blackwell Sciencetific Page RDM, Holmes EC. 1998. Molecular Evolution A Phylogenetic Approach. New York: Blackwell Sci, Inc Purwanti LI. 2007. Uji efektivitas promoter B-actin ikan medaka Oryzias latipes dengan penanda gen hrGFP (Humanized Renilla reniformis Green Fluorescent protein). Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor Quitschke WW, Lin Z-Y, DePoti-Zilli L, Paterson EM. 1989. The P-actin promoter. Journal of Biology and Chemistry 264: 9539-9546 Sadovy YJ. 1996. Reproduction Of Fishery Reef Species. Di dalam Polunin NVC, Robert CM (Eds.) Fish Fisheries. Reef Fisheries. London: Chapman & Hall Suharsono S. 2000. Dasar-dasar pengklonan gen kumpulan bahan M i a h dalam pelatihan peningkatan dan keterampilan teknisi. Laboratorium Biologi molekuler. Bogor, 29 Februari 2000 - 11 Maret 2000. K e j a sama proyek pembinaan. Kelembagaan Penelitian dan Pengembangan PertaniadARMP 11, Badan Litbang Pertanian. Departemen Pertanian & PAU. IPB Suwirya K, Priyono A, Marzuqi M, Giri NA, Andamari R. 2005. Pemijahan dan pemeliharaan larva kerapu sunu halus Plectropomusn leopardus. Warta Penelitian Perikanan Indonesia Edisi Aquaculture 11:7- 10 Takagi S, Sasado G, Tamiya G, Ozato K, Wakamatsu Y, Takeshita A, Kimura M. 1994. An efficient expression vector for transgenic medaka construction. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 192-199 Tampubolon GH, Mulyadi E. 1989. Synopsis Ikan Kerapu di Perairan Indonesia. Semarang: Balitbangkan Voet D, Voet JG. 1994. Biochemistry. Ed ke-2. New York: Jhon Willey & Sons
Volckaert FA, Hellemans BA, Galbusera P, Ollevier F. 1994. Replication, expression and fate of foreign DNA during embryonic and larval development of the Afiican catfish Clarias gariepinus. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 57-69 Wahyudi TH. 2001. Pengaruh suhu annealing dan jumlah siklus berbeda pada program PCR terhadap keberhasilan isolasi dan amplifikasi mtDNA ikan patin Pangasius hypophthalmus. Skripsi. Departeinen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor Wu G, Yonghua S, Zuoyan Z. 2003. Growth hormone gene transfer in common carp. Aquatic Living Resources 16: 416-420 Yoshizaki G. 2001. Gene transfer in salmonidae: applications to aquaculture. Suisanzoshoku 49: 137 - 142
LAMPIRAN Lampiran 1. Penyusunan Primer Berdasarkan Database Gen &actin dari Berbagai Spesies Ikan Forward
gra;s c2ry.t-t mas. t::t loegalolrlua. t ;:t uyophary~aodon.t::t ued&.a.t::t
g r a s s carp-txt mas. t x t uegalobrama.tnt rnyopharyngodun.tit &xed&*. t x t g r a s s carp.txt IP95.tXt megslubrsuia,z:!c
n ~ c p k a q ~ ~ g a dtrcon. nad&a. r;xc
:'ic :7i -0, L
?lo: -
,.,
z6' 251
Lampiran 2. Alat-Alat yang Digunakan dalam Mengisolasi Pronloter pactin Ikan Kerapu Bebek Cromileptes altivelis
A. Mikropipet dan Tip
B. Vortex
C. Dry Thern~oUnit
D. Sentrifuse
F. Mesin Thennocycle (PCR)
G. Microwave
H. Cetakan & Sisir Pembuat Sumur
I. Bak Elektroforesis
J. Ultraviolet Illuminator
K. Mesin Sekuensu~gABI PRISM 3 100
Lampiran 3. Hasil Sekuensing Genom p-actin Tkan Kerapu Bebek Cromileptes altivelis
