-1-
ZAP-70: ÚJONNAN AZONOSÍTOTT KAPCSOLÓDÁSI PONT A T-SEJT RECEPTOR ÉS GLUKOKORTIKOID HORMON JELÁTVITELI UTAK KÖZÖTT
PHD ÉRTEKEZÉS
DR. BARTIS DOMOKOS
Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar
Témavezetők:
Dr. Berki Tímea Dr. Boldizsár Ferenc
Alprogram vezető: Prof. Dr. Németh Péter
2007. Pécs
-2-
Összefoglalás A glukokortikoidok (GC) fontos szerepet játszanak a T-sejtek érésében, különböző aktivációs és apoptotikus szignálok szabályzásában. A thymusban a GC hormon igen fontos regulációs szerepet játszik a thymociták szelekciója során. Az eddigi irodalmi adatok alapján valószínűsíthető cross-talk mechanizmus(ok) létezése a Tsejt receptor(TcR) –CD3 komplexből kiinduló jelátvitel és a glukokortikoid receptor (GR) között. Munkánkban a GC rövid idejű, nem-genomikus úton kifejtett jelátviteli hatásait vizsgáltuk in vitro modellrendszerben, Jurkat T-sejtes leukémia sejtvonalon. Eredményeink szerint a GR agonista Dexamethasone (DX) 5 percen belül tirozin foszforilációs változásokat okoz Jurkat sejteken. A DX kezelés megváltoztatta mind a nyugvó, mind az anti-CD3 keresztkötéssel aktivált Jurkat sejtek tirozin-foszforilációs mintázatát. A ZAP-70 kináz központi szerepet tölt be a TcR-CD3 komplexből kiinduló jelátviteli folyamatokban. A ZAP-70 működésének defektusa esetén in vitro T-sejt aktivációs defektus, in vivo pedig súlyos kombinált immundeficiencia (SCID szindróma) figyelhető meg. Vizsgálatainkban a DX kezelés nyugvó és aktivált Jurkat sejtekben 5 percen belül ZAP-70 tirozin foszforiláció emelkedést okozott. A folyamatban a GR szerepére utal, hogy a foszforiláció GR antagonista (RU486) előkezeléssel gátolható. DX indukálta ZAP-70 foszforiláció nem jött létre p56-lck kináz deficiens JCaM-1 sejtvonalban. A GR és ZAP-70 közeli fizikai kapcsolatát ko-immunprecipitacióval és konfokális mikroszkópiával is vizsgáltuk. A GR ligandja jelenlétében asszociálódik a ZAP-70-hez mind Jurkat, mind transzgenikus, ZAP-70-et stabilan expresszló HeLa/trZAP-70 sejtekben. A T-sejt aktiváció nélkülözhetetlen lépése, hogy a ZAP-70 asszociálódik a CD3 komplexen található foszforilált ITAM-tirozinokhoz. Eredményeink szerint a ZAP-70 asszociáció a CD3 komplex láncokhoz GR ligand jelenlétében gátlódott. Eredményeink alapján a következő jelátviteli modellt javasoljuk: A GR ligandkötés után asszociálódik a ZAP-70-hez, ami foszforilációs változásokat indít el. A GR asszociációja egyben megakadályozza, hogy a ZAP-70 kötődjék a foszforilált ITAM szekvenciákhoz, így gátolva a TcR-CD3-hoz kapcsolódó jelátviteli komplex kialakulását. A GC-k és származékaik széles körben használatosak a jelenlegi terápiás protokollokban, ám mellékhatásprofiljuk igen kiterjedt. Az általunk feltárt jelátviteli folyamatoknak fontos szerepe lehet a GC mediálta immunszupresszióban. Ennek a hatásmechanizmusnak a pontos megismerése lehetővé teheti új támadáspontú immunoszupresszív hatóanyagok kutatását, tervezését, amelyek esetleg kedvezőbb mellékhatásprofillal rendelkeznek, mint a jelenleg alkalmazott gyógyszerek.
-3-
Bevezetés 1.1 A glukokortikoidok gyógyászati alkalmazása A glukokortikoid hormon származékai (GC) régóta igen széles körben használatosak gyógyászati célokra. Terápiás alkalmazási területük magában foglalja az akut és krónikus rheumatológiai gyulladásos betegségeket, autoimmun betegségeket, asztmás, allergiás megbetegedéseket, egyes malignus haematológiai kórképeket, de használatosak szerv- vagy szövettranszplantáció utáni immunszupresszív therápiában is. Kiterjedt alkalmazásuk ellenére sok téren még tisztázatlan a glukokortikoidok molekuláris hatásmechanizmusa.
1.2 A glukokortikoid receptor szerkezete A GC hatások egy része a glukokortikoid receptor (GR) közvetítésével zajlik. A GR az intracelluláris receptorok családjába (nuclear receptor superfamily) tartozik. Több más kémiailag steroid és más, nem steroid hormon rendelkezik hasonló receptorokkal, sőt vannak adatok olyan szerkezetileg a steroid receptorok családjába tartozó fehérjékről, amelynek nem ismert a ligandja (árva vagy orphan receptorok). A GR evolúciósan igen konzervált szerkezetű transzkripciós faktor. A humán GR alternatív splicing-je két izoforma expresszióját eredményezi: a hGRα és a hGRβ izoformákét. A klasszikus, majdnem minden sejtben expresszálódó hGRα 777 aminosavból álló fehérje. Inaktív állapotban ez a citoplazmában található, más fehérjékkel alkotott makromolekuláris komplexban. A hGRβ a 9. exon alternatív splicing-je révén jön létre. Csak a C-terminális régióban különbözik az hGRα izoformától és tartalmaz egy 15 aminosavas egyedi szekvenciát. A hGRβ fiziológiás szerepe vitatott: ligandkötésre nem képes és kizárólag a magba lokalizálódik. Több esetben kimutatták a szerepét patológiás GC rezisztenciában. Valószínűleg részt vesz a GC által szabályozott génexpresszió finom szabályozásában.
1. ábra. A glukokortikoid receptor elsődleges szerkezete szalagdiagrammon Funkcionálisan a GR-nek 4 szakasza különíthető el: az N-terminális részén a variábilis régió, amit regulátoros doménnek is neveznek. Ez a rész felelős a konstitutív transzkripciós aktivációs funkciókért. A DNS-kötő domén (DNA-binding domain, DBD) evolúciósan a legjobban konzervált része a molekulának, cink-ujj szerkezetű. A DBD rövid kapocs vagy hinge-régión keresztül kapcsolódik a ligandkötő doménhez (ligand binding domain, LBD). A LBD felelős a ligandkötésért, valamint a GR esetében a homodimer kialakításáért.
-4-
1.3 Genomikus GC jelátvitel A GC, mint lipidoldékony hormon, diffúzióval jut be a sejtbe a sejtmembránon keresztül és az intracellulárisan elhelyezkedő inaktív GR-hez köt. Az inaktív GR más fehérjékkel (pl. a Hsp-90) asszociálódva található a citoplazmában mint egy multimer fehérjekomplex tagja. A ligandkötést követő konformáció változások során a receptor disszociálódik a Hsp-90 komplexről és homodimer formájában a magba vándorol. A magban a ligandkötött GR fő funkciója szerint transzkripciós faktor: specifikus, palindróm DNS szekvenciákhoz, az ún. GRE-hez (Glucocorticoid Response Elemet) kötődve növeli egyes gének expressziójának mértékét. A GR transzkripciós faktorként negatív génregulációt is megvalósíthat: negatív regulátoros GRE szakaszokhoz (nGRE) is kapcsolódhat. Jelenleg ezek a DNS-szakaszok kevéssé karakterizáltak. A génexpresszió szabályozásának ez a két módja a DNS-függő szabályozás. Vannak példák DNS-független szabályozásra is: ebben az esetben az intracelluláris receptor fizikai interakcióba lép egy másik transzkripciós faktorral, így változtatva meg annak aktivitását. A GR esetében mindegyik típusú szabályozási mechanizmusra ismerünk példákat. A DNS független transzkripció szabályozás során a GR közeli fizikai kontaktusba kerül a másik transzkripciós faktorral és befolyásolja azok aktivitását. Több transzkripciós faktorról ismert, hogy interakcióba lép a GR-el: az NFκB, AP-1, CREB, valamint a STAT- család több tagja. Az előbb említett genomikus jelátviteli út fő jellemezője, hogy végső soron a fehérjeszintézis változik meg a GC érzékeny sejtben vagy szövetben a hormon hatására. A genomikus hatások létrejöttéhez minden esetben megfelelő hosszúságú időre van szükség (általában több órára) ahhoz, hogy a génexpresszióban, fehérjeszintézisben lezajló változások manifesztálódjanak.
1.4 A GC hormon nem-genomikus hatásai A nem-genomikus hatások közös jellemzője, hogy nem szükséges hozzá de novo protein szintézis, inkább a különböző jelátviteli molekulák poszttranszlációs módosulásai jellemzőek. Jelenleg a nem-genomikus GC hatásokat 3 csoportba sorolják: (1.) A klasszikus citoplazmatikus GR-en (cGR) keresztül létrejövő specifikus hatások, melyeket a GR más jelátviteli fehérjékkel történő citoplazmatikus interakciókon keresztül közvetít. (2.) nem specifikus fiziko-kémiai membrán-interakció (ez csak igen magas steroidkoncentrációknál lép fel) és (3.) a feltételezett membránrezidens GR-en keresztül közvetített specifikus hormonhatások.
1.5 A GC és TcR jelátviteli útvonalak közötti kommunikáció jelentősége A GC hormonnak különösen fontos szabályozó szerepe van T-sejtekben mind a thymusban lezajló érési folyamatok, mind az érett sejtek periférián betöltött funkciója során. A thymus epithel sejtek által lokálisan termelt GC parakrin módon szabályozza a thymociták érését. A kölcsönös antagonizmus modell („mutual antagonism theory”) szerint a GC a T-sejt receptoron (TcR) keresztül érkező szignállal együtt pozitív szelekciót indukál a DP sejtekben, és a nem-reszponzív TcR-t expresszáló thymocita
-5klónok apoptózisában is fő szerepe van a GC hatásnak. A perifériás, érett T-sejtek citokinszekrécióját a GC Th2 irányba tolja el, és többfajta mechanizmus útján fejt ki erőteljes gátló hatást a különböző proinflammatorikus citokinek (pl. IL-1β, IL-2, IL-6, TNFα) szintézisére. Figyelembe véve az anti-inflammatorikus hatást valamint a kölcsönös antagonizmus modellt, valószínűsthető valamilyen kommunikáció a GC hormon és a TcR jelátviteli utak között.
1.6 A TcR-ből kiinduló jelátvitel A TcR és az MHC-kötött antigén kapcsolódása után másodperceken belül megindul a tirozin-foszforiláció. Ez az aktivációs szignál olyan biokémiai változások kaszkádját indítja el, ami több órán át fennállva jelentős változást okoz a T-sejtek anyagcseréjében. 2 órán belül elindul a citokinreceptorok expressziója (a legjellegzetesebb az IL-2R), 2-6 órán belül a citokin szekréció. 24 órán belül elkezdődik a DNS replikáció, majd 48 órán belül sejtosztódás következik. Az optimális jelátvitel a koreceptorok (CD4 ill. CD8) részvételét is igényli. Ezek egyrészt stabilizálják a TcR-MHC kapcsolatot, másrészt citoplazmatikus részükhöz nemreceptor PTK-k kapcsolódnak, így résztvesznek a szignalizációban is. Ezek a nemreceptor PTK-k a src családba tartozó fehérjék. A TcR antigénkötése és a koreceptorok MHC-kötése után főként a CD3ζ láncok foszforilálódnak tirozinon, melyért elsősorban a p56-lck felelős. A foszforilált ζ-láncok dokkolási helyként szolgálnak a ZAP-70 kináz számára (zéta-lánc asszociált protein ).
1.7 A ZAP-70 kináz szerepe a TcR-ből kiinduló jelátviteli folyamatokban A ZAP-70 a syk-családba tartozó nem-receptor PTK, molekulasúlya 70 kDa. T- és NK sejtekben expresszálódik, szerepét B-sejtekben, neutrofilekben, eozinofilekben és hízósejtekben a Syk kináz tölti be, mellyel jelentős szerkezeti és funkcionális homológiát mutat. Elsődleges szerkezetét tekintve C-terminális kinázdoménre, két SH2 doménre és az ezeket elválasztó Interdomén A-nak és B-nek nevezett régiókra osztható a molekula. A ZAP-70 kináz nagy affinitással kötődik a CD3 komplexen levő ITAM-motívumok foszforilált tirozin maradékaihoz a tandem elhelyezkedésű SH2 domének segítségével.
2. ábra A ZAP-70 kináz szerkezeti diagramja a jelenleg ismert tirozin-foszforilációs helyek feltűntetésével A ZAP-70 fő feledata, hogy továbbítsa és felerősítse a TcR-ből kiinduló jelet. A ZAP70 kulcsszerepet játszik a TcR-CD3 jelátvitelben: ZAP-70 deficiens sejtekben T-sejt
-6receptor aktiváció vagy CD3 keresztkötés után nem mutatható ki Ca++ -jel. A ZAP-70 veleszületett funkcióvesztő mutációja emberben SCID szindrómát (súlyos kombinált immundeficiencia) okoz, amire a Tc sejtek teljes hiánya és a Th sejtek immunológiai válaszképtelensége jellemző. A nem-receptor PTK-k kinázaktivitás-szabályozásának egyik fő mechanizmusa a foszforiláció. A ZAP-70 maga is számos tirozin-maradékot tartalmaz, amelyek közül számos foszforilációs helyet írtak le. Egyes tirozinok foszforilációja közvetlenül befolyásolja a kinázaktivitást (pozitív vagy negatív irányban is) mások regulátoros jelátviteli molekulák számára szolgálnak dokkolóhelyül, melyek szintén modulálhatják a ZAP-70 kinázaktivitását.
-7-
2 Célkitűzések 1. A rövid idejű nem-genomikus GC hatások vizsgálata T-sejteken in vitro modell sejtvonalon (Jurkat). Nagy dózisú Dexamethasone (DX, GC analóg) kezelés után bekövetkező általános változások vizsgálata Jurkat sejtek tirozinfoszforilációs mintázatában. 2. A ZAP-70 kináz rövid idejű DX-kezelés hatására bekövetkező foszforilációs változásainak a karakterizálása. 3. A foszforilációs események függésének tisztázása.
GR-függésének,
illetve
upsteram-kináz
4. A DX indukálta ZAP-70 foszforiláció időbeli kinetikájának a tanulmányozása. 5. A GR és a ZAP-70 térbeli viszonyának tanulmányozása koimmunprecipitációval és konfokális mikroszkóppal. GR agonista hatására bekövetkező változások megfigyelése a két molekula egymáshoz való viszonyában. 6. A ZAP-70, a GR és a Hsp-90 chaperon egymáshoz való viszonyának tisztázása Jurkat sejtekben. 7. A ZAP-70, a GR és a Hsp-90 egymáshoz való viszonyának vizsgálata nem-Tsejtes környezetben, transzgénikus ZAP-70-et expresszáló HeLa sejteket használva modellként. 8. A CD3 komplexhez kötött és a GR jelátviteli útvonalai közötti kommunikáció lehetséges összefüggésének vizsgálata.
-8-
3 Anyagok és módszerek 3.1 Sejtvonalak A GC hormon T-sejt jelátvitelre gyakorolt azonnali hatásait in vitro modellrendszerben Jurkat sejteken (humán T-sejtes leukémia sejtvonal) és az előbbi sejtvonal p56-lck deficiens szubklónján (JCaM1) vizsgáltuk. Egyes kisérleteinkhez HeLa sejteket transzfektáltunk teljes-hosszú ZAP-70-et hordozó lentivirális vektorral.
3.2 Lentivirális transzfekció A ZAP-70 kináz viselkedésének T-sejt független celluláris környeztben történő vizsgálatához HeLa sejteket transzfektáltunk teljes hosszú ZAP-70 cDNS-t tartalmazó lentivirális vektort alkalmazva. A pWPTS lentivirális transzfer plazmidba klónoztuk a humán vad típusú ZAP-70 cDNS-t, a konstrukcióban EF-1 promóter kontrollt alkalmazva. A transzfer-plazmidot ezután az envelope-proteineket kódoló és a csomagoló-plazmidokkal együtt 293T sejtekbe vittük be kálcium-foszfátos tranziens transzfekciót alkalmazva. A vírusokat szekretáló csomagoló-sejtvonal felülúszójával ezután spinokulációval HeLa sejteket fertőztünk. A transzgénikus HeLa sejtek ZAP70 expresszióját Western-blottal és áramlási citometriával kontrolláltuk.
3.3 Geldanamycin, GR agonista és antagonista kezelés A sejteket 37oC-on inkubáltuk 4 órát szérummentes RPMI médiumban, 10µM Mifepristone (RU486, GR antagonista) illetve a kontrolloknál oldószere (DMSO) jelenlétében. Egyes kísérleteinkben 1,78mM Geldanamycint (GA, Hsp-90 gátlószer) használtunk. Ezután a sejteket 108sejt/ml koncentrációban inkomplett RPMI-ben vettük fel és a jelzett ideig 37oC-on inkubáltuk 10µM Dexamethasone (DX, GR agonista) vagy a kontrolloknál megfelelő mennyiségű oldószer (DMSO) jelenlétében.
3.4 Anti-CD3 aktiváció A DX kezelt vagy kezeletlen sejteket 37oC-on inkubáltuk 108sejt/ml koncentrációban inkomplett RPMI-ben. A sejtekhez hozzáadtunk az anti-CD3 antitestet 100 µg/ml végkoncentrációban. 2 perces 37oC-os inkubáció után a kezelést folyékony nitrogénes fagyasztással állítottuk le, a mintákat vizsgálatukig -80oC-on tároltuk.
3.5 Immunprecipitáció, Western blot A minták lízisét TX-100 tartalmú lízis pufferben illetve a ko-immunprecipitációs kísérletek esetében TEGM pufferben végeztük. A pufferekhez közvetlenül felhasználás előtt 2mM Na-ortho-vanadátot és proteázgátlókat adtunk. TEGM puffer alkalmazása esetén a puffer hozzádását követően a mintákat szonikáltuk 5 x 5sec-es impulzusokkal. 400µl citoplazma-frakción „pre-clearing”-et végeztünk fél óráig Protein G-Sepharose-zal, majd az előtisztított lizátumot 2 órán át 4oC-on inkubáltunk a
-9precipitáló antitesttel. Az immunkomplexeket ProteinG-Sepharose-on fixáltuk, majd alapos mosás után mintapufferben eluáltuk. A mintákkal SDS-poliakrylamid gélen Laemmli szerint elektroforézist végeztünk, és standard módszerek szerint indirekt Western blottokat készítettünk. A blotok vízualizálását ECL reagenssel végeztük, a kemiluminescens jelet röntgenfilmre (Fujifilm) rögzítetve. Egyes esetekben ún. „stripping-reprobing” módszert alkalmaztunk: Ekkor a blotokon ECL-es előhívás után „stripping-bufferes” kezelést alkalmaztunk az antitestek eltávolítására. Ezután ugyanazt a blottot másik antitettel is elő tudtuk hívni, anélkül, hogy az előző előhíváshoz használt antitest zavart volna.
3.6 Konfokális mikroszkópia A sejteket 107/ml koncentrációban FCS-mentes RPMI médiumban reszuszpendáltuk, és 10µM Dexamethasone vagy oldószere (DMSO) jelenlétében 5 percig 37oC-on inkubáltuk. Ezután 10x-es térfogatú jéghideg 0,1% Na-azidot tartalmazó PBS-t a sejkehez adva állítottuk le a reakciót. A sejteket lecentrifugáltuk, majd fixálást és permeabilizálást követően jégen inkubáltunk a megfelelő fluorescensen jelölt antitestkoktéllal. Alapos mosást követően a sejteket tárgylemezre csöppentettünk, majd ülepedés után a felesleges folyadékot óvatosan leszívtuk. 50%-os glicerolos lefedést követően a mintákat Olympus Fluoview 300 vagy későbbi minták esetében Olympus FV1000S-IX81 konfokális mikroszkóp rendszerrel vizsgáltuk.
- 10 -
4 Eredmények 4.1 A rövid idejű Dexamethasone kezelés megváltoztatja a Jurkat sejtek tirozin-foszforilációs mintázatát Kezdeti kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy DX kezelés okoz-e valamilyen tirozinfoszforilációs változást. Jurkat teljes sejtlizátumokat vizsgálva, 5 perces kezelés 10µM DX-al tirozin-foszforiláció növekedést okozott több foszfoproteinben az oldószer-kezelt kontroll mintához viszonyítva. Monoklonális anti-CD3 antitesttel történő aktiváció határozott tirozin-foszforiláció emelkedést okozott, azonban 5 perces DX előkezelés utáni anti-CD3 aktiváció ehhez képest gátolta a foszforilációt.
4.2 Nagy dózisú Dexamethasone gyors ZAP-70 tirozinfoszforilációt okoz Megvizsgálva a ZAP-70 foszfotirozin-tartalmának változását rövididejű DX kezelés hatására, azt találtuk, hogy 5 perces 10µM koncentrációjú DX kezlés 4-szeresére növelte a ZAP-70 foszfotirozin-tartalmát. Hasonló mértékű növekedést okozott az anti-CD3 aktiváció is. A tirozin foszforiláció a kombinált DX+anti-CD3 kezelés hatására további növekedést mutatott. A ZAP-70 foszfoszforiláció-növekedése szignifikánsnak bizonyult DX vagy anti-CD3 aktiváció, valamint DX+anti-CD3 kombinált kezelésnél is a kezeletlen kontrollhoz viszonyítva. A kombinált kezelésnél tapasztalható nagyobb foszforiláció-növekedés az egyedüli DX vagy anti-CD3 kezeléshez viszonyítva a 3 független kísérletnél következetesnek bizonyult, ám a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns. (Student-féle t-teszt, p>0,05)
4.3 A DX hatására bekövetkező ZAP-70 tirozin-foszforiláció p56-lck és GR függő folyamat A src-családba tartozó T-és NK sejt specifikus kináznak, a p56-lck-nak a ZAP-70 az egyik fő szubsztrátja Amikor kísérleteinkben JCaM-1 sejteket, a Jurkat sejtek egy p56-lck deficiens szubklónját kezeltük 10µM DX-el 5 percig, a ZAP-70 semmilyen tirozin-foszforiláció emelkedést nem mutatott. Ekvimoláris RU486 (Mifepristone, GR antagonista) előkezelést alkalmazva vizsgáltuk, hogy a DX indukálta ZAP-foszforiláció gátolható-e GR antagonistával. Eredményeink szerint 4 órás RU486 kezelés hatékonyan gátolta a DX által indukált ZAP-70 foszforilációt, míg előkezelés nélkül a DX kezelés jelentős foszfotirozin-szint növekedést okozott a ZAP-70-ben.
4.4 A ZAP-70 kináz foszforilációs kinetikája nagy dózisú DXkezelést követően Mivel a jelátviteli molekulák tirozin-foszforilációjának kinetikája fontos adat a sejtekben zajló jelátviteli folyamatok megértése során, megvizsgáltuk a ZAP-70 foszfotirozin-szintjének változását a nagy dózisú DX kezelés során. A ZAP-70 tirozin-
- 11 foszforilációja 1 percen belül növekszik a DX hozzáadását követően, a csúcsot 2 percen belül eléri. 5 perc után defoszforiláció következik be és a foszfotirozin-szint visszatér az alapra.
4.5 Ligandkötés után a GR asszociálódik a ZAP-70 kinázzal Miután tisztáztuk, hogy a DX hatására bekövetkező ZAP-70 foszforilációban a GR nélkülözhetetlen szerepet játszik, ko-immunprecipitációval és konfokális mikroszkópiával megvizsgáltuk, vajon lehetséges-e hogy a két molekula közeli fizikai kölcsönhatásban van egymással. A ko-immunprecipitációt anti-GR és anti-ZAP-70 antitesttel is elvégezve, mindkét típusú kisérletben hasonló eredményre jutottunk: a ZAP-70 és a GR kölcsönösen ko-precipitálódott Jurkat sejtek lizátumát vizsgálva. A DX kezelt mintákban nagyobb mértékű ko-precipitációt tapasztaltunk mindkét esetben. A két molekula GC hormon hatására bekövetkező ko-lokalizációt konfokális mikroszkópiával is megerősítettük: a DX kezelt Jurkat sejtekben a két molekula membrán-közeli ko-lokalizációja látszik, míg a kontroll mintában csak minimális kolokalizáció látszik.
4.6 A ZAP-70 asszociálódik a Hsp-90 chaperonnal A Hsp-90 chaperon makromolekuláris komplexet alkot az inaktív GR-el és fontos szerepet játszik abban, hogy a p56-lck kináz aktív konformációban legyen. Mivel eredményeink szerint a ZAP-70 asszociálódik a ligandkötésben levő, aktív GR-el és a szubsztrátja a p56-lck-nak ezért tisztázni szerettük volna a ZAP-70 viszonyát a Hsp-90-hez. Ko-immunprecipitációs kísérleteink szerint a ZAP-70 asszociálódik Jurkat sejtekben a Hsp-90-nel Jurkat sejtekben. Az asszociáció nem változott meg DX kezelés hatására. Geldanamycinnel (GA, Hsp-90 specifikus inhibitor) kezelt Jurkat sejtekben a ZAP-70-Hsp-90 kapcsolat megszűnt, míg a ZAP-70-GR asszociációt ugyanúgy kimutatható volt a GA kezelt mintákban is.
4.7 A ZAP-70, a GR és a Hsp-90 egymáshoz való viszonyának vizsgálata transzgénikus ZAP-70-et expresszáló HeLa sejtekben Fontosnak tartottuk tisztázni a p56-lck szerpét a ZAP-70, a GR és a Hsp-90 Jurkat sejtekben feltárt egymáshoz való viszonyában. A ZAP-70 T-és NK sejt specifikus molekula, így nem expresszálódik epitheliális eredetű sejtekben, mint a HeLa sejtvonal. A GR és a Hsp-90 ubikviter, HeLa sejtekben is expresszálódnak. Kísérleteinkhez lentivirális vektorral transzfektált, transzgénikus ZAP-70-et stabilan expresszáló HeLa sejteket (HeLa-trZAP-70) készítettünk. Ko-immunprecipitációs kísérleteink eredménye szerint ligandkötés hatására a GR asszociálódik a ZAP-70nel HeLa-trZAP-70 sejtekben, hasonlóképpen a Jurkat sejtekben tapasztaltakhoz. A két molekula ko-lokalizációját is sikerült kimutatni konfokális mikroszkóppal a DX kezelt mintákban. Érdekes, hogy a HeLa-trZAP-70 sejtekben a GR és a ZAP-70 kolokalizációja perinukleáris mintázatot mutatott, ellentétben a Jurkat sejtekben tapasztalt membrán-közeli mintázattól. HeLa-trZAP-70 sejtekben is ki tudtunk mutatni Hsp-90-hez asszociált ZAP-70 frakciót, melynek mennyisége nem változott a DX kezeléssel.
- 12 -
4.8 A nagy dózisú DX kezelés gátolja a ZAP-70 asszociációját a CD3-komplexhez Jurkat T-sejtekben. A T-sejt receptorból kiinduló jelátviteli folyamatokban a ZAP-70 igen fontos szerepet játszik. Tandem SH2 doménjeivel asszociálódik a CD3 komplex láncain található foszforilált ITAM-motívumokhoz. A ZAP-70 asszociáció a CD3 komplex láncaihoz kulcsfontosságú lépése a T-sejt aktivációnak. Eredményeink szerint a DX kezelés gátolja a CD3-aktiváció során a ZAP-70 asszociációját a CD3-komplexhez. Az antiCD3 antitesttel aktivált mintákban a ZAP-70 ko-precipitálható volt a CD3-komplexel. Ezzel ellentétben a DX kezelt mintában az asszociáció gátlódott.
- 13 -
5 Megbeszélés A fent röviden leírt eredményeinket irodalmi adatokkal összevetve úgy gondoljuk, hogy a p56-lck – ZAP-70 rendszer egy új, eddig ismeretlen szabályozási pont lehet a TcR és a GR jelátviteli utak között. Mások által még nem közölt adat, hogy a GC kezelés gyors (perceken belüli) tirozin-foszforilációs változásokat okoz T-sejteken. A TcR-ből antigén kötés hatására kiinduló jel fejlődésük különböző szakaszaiban különböző hatással van a T-sejtek sorsára. A nem-reszponzív TcR-t hordozó sejtek apoptózis útján való eliminálásában a GC hormon elsődleges szerepét feltételezik, míg a saját antigénekkel nagy affinitással reagáló, potenciálisan autoreaktív thymociták aktiváció indukálta apoptózis útján pusztulnak el. A „kölcsönös antagonizmus elmélet” („mutual antagonism theory”) alapja az, hogyha GC és TcR eredetű szignálok egyaránt érik a thymocitát, akkor ezek a jelek kölcsönösen anatgonizálják egymás apoptózist indukáló hatását, és a thymocita túlél. Az érett, perifériás T-sejtek esetében a TcR-en keresztül érkező szignál a megfelelő kostimulációs jelekkel együtt végső soron T-sejt aktivációt okoz, ami IL-2 szekréciót és klonális proliferációt eredményez. A GC-k gátolják a T-sejtek aktivációját, ezt a hatást használják ki immunszuppresszív therápiás alkalmzásuk során. A GC és a TcR jelátviteli utakon több kommunikációs pontot írtak le mások, ám azok a genomikus jelátviteli úton helyezkedtek el, mely hatások létrejöttéhez minimálisan több óra szükséges. Az általunk leírt, további jellemzés alatt álló szabályozó ponton a GC hormon poszttranszlációs módosulások útján (tirozin-foszforiláció), percek alatt fejti ki a hatását. Eredményünk, miszerint a GC kezelés a ZAP-70 tirozinfoszforilációját indukálja, felveti, hogy a GC hormon ezen a szinten is szabályozza a TcR-ből kiinduló jelet. A tirozin-foszforiláció a kinázok aktivitásának szabályozásában fontos szerepet játszik. Jelenleg 11 tirozin-foszforilációs hely ismert a ZAP-70 kinázon, lehetővé téve az igazán sokrétű funkcionális szabályozást. Egyes foszforilációs helyek közvetlenül befolyásolják a kinázaktivitást (akár pozitív, akár negatív irányban), mások jelátviteli fehérjék kötődését teszik lehetővé, melyek szintén befolyásolják a ZAP-70 aktivitását. Több foszforilációs hely funkciója jelenleg ismeretlen. Kísérleteink során a ZAP-70 GC indukálta foszforilációja GR függő folyamatnak bizonyult, így megvizsgáltuk, hogy van-e fizikai kapcsolat a 2 molekula között. A GR és a ZAP-70 fizikai kapcsolatára utaló ko-immunprecipitációs és konfokális mikroszkópiás eredményeink, miszerint a ligandkötés hatására a GR asszociálódik a ZAP-70-el, megerősítik azt a feltételezést, hogy a ZAP-70 fontos szabályozó pont lehet a TcR és a GC hormon jelátviteli utak között. Korábbi irodalmi adatokból ismert, hogy mind az inaktív GR, mind a p56-lck kapcsolódik a Hsp-90 hősokkfehérjéhez. Ezért tisztázni kívántuk a molekulák egymáshoz való viszonyát. Ko-immunprecipitációs kísérleteink eredménye szerint a GR ligandkötés után kapcsolódik a ZAP-70-hez. A ZAP-70-et Jurkat és HeLa/ZAP-70 sejtekben is Hsp-90 asszociált molekulának találtuk, ám a kapcsolódás független volt a GC hormon jelenlététől. Mivel a p56-lck kapcsolódik a Hsp-90-hez és a ZAP-70hez is, ezért megvizsgáltuk, hogy a GR-ZAP-70 kapcsolat függ-e a p56-lck vagy más T-sejt specifikus fehérje jelenlététől. A HeLa epitheliális karcinóma sejtekben transzgénikusan expresszált ZAP-70 hasonlóképpen asszociálódott ligand jelenlétében GR-el, mint Jurkat sejtekben. Ez az adat arra utal, hogy a p56-lck nak nincsen szerepe a GR-ZAP-70 kapcsolódásban. A Geldanamycin (GA) gátolja a Hsp-90 ATPáz aktivitását, ezáltal a fehérje elveszti chaperon funkcióját. Mivel a GA
- 14 kezelt Jurkat sejtekben is sikerült a ligand indukált GR-ZAP-70 asszociációt kimutatnunk, ezért nagy valószínűséggel kijelenthetjük, hogy a két molekula közvetlenül kapcsolódik egymással. Az az eredményünk, hogy a DX kezelés gátolta a ZAP-70 asszociációját a CD3komplexel, felveti a lehetőségét annak, hogy ez a nem-genomikus GC hatás közvetlenül részt vesz a GC hormon és származékainak T-sejt aktivációt gátló, immunszuppresszív hatásában. Jelen tudásunk szerint a jelátviteli molekulák pontos térbeli és időbeli elrendeződésének kritikus szerepe van a megfelelő jelátviteli folymatok leszjlásában. Ha a ZAP-70 dokkolása a CD3 láncok foszforilált tirozinjain gátolt, akkor a T-sejt aktiváció defektív vagy anergiához vezet. Bár a ZAP-70 GC hatására bekövetkező foszforilációs változásai, és ezek pontos jelátviteli szerepének jellemzése még további kísérleteket igényel, eredményeink hozzájárulhatnak a GC hormon nem-genomikus hatásainak mélyebb megértéséhez. 3. ábra. A T-sejt jelátvitel általunk feltételezett módosulásai GC hormon jelenlétében. Feltételezzük, hogy a ZAP-70-en kívül más molekulák foszforilációja is megváltozik a GC hormon hatására, erre utalhatnak teljes sejt lizátumokban látott foszforilációs változások. A GC hormon kezelés rövid idő alatt p56-lck által mediált foszforilációs változásokat okozott a ZAP-70 kinázban. A GC kötés után a GR asszociálódik a ZAP-70-el és a ZAP-70 asszociációja gátlódik a CD3 komplexhet. Elképzelhető, hogy ez a mechanizmus is felelős a GC hormon T-sejt aktivációt gátló hatásáért. Valószínűnek tartjuk, hogy további downsteram jelátviteli folyamatok is lejátszódnak a GC hormon hatására, ezeknek a pontos tisztázásához további kísérletek szükségesek.
- 15 -
Köszönetnyilvánítás: Mindenekelőtt szeretnék köszönetet mondani témavezetőimnek, Dr. Berki Tímeának és Dr. Boldizsár Ferencnek, akik lehetővé tették, hogy részt vegyek ebben a kutatásban, és akik végig segítették a munkámat és bízattak, amikor szükség volt rá. Köszönöm Prof. Dr. Németh Péternek, az Immunológiai és Biotechnológiai Intézet vezetőjének, hogy lehetővé tette, hogy PhD hallgatóként az intézetében dolgozzam. Köszönöm Dr. Monostori Éva (Szegedi Biológiai Kutató Központ) segítségét: mind értékes tanácsait, mind pedig a „materiális” segítséget: antitesteket, sejtvonalakat, stb. Köszönöm a konfokális mikroszkópiában nyújtott segítséget Dr. Matkó Jánosnak, Dr. Gombos Imrének és Dr. Kiss Endrének (ELTE-TTK Immunológia Tanszék) valamint Dr. Ifj. Sétáló Györgynek és Dr. Berta Gergelynek (PTE-ÁOK Orvosi Biológiai Intézet) Végül szeretnék köszönetet mondani minden kollegámnak az Immunológiai és Biotechnológiai Intézetben az érdekes tudományos vitákért, tanácsokért és a kitűnő társaságért.
- 16 -
A PhD értekezés alapját képező publikációk: Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár, Krisztián Kvell, Mariann Szabó, László Pálinkás, Péter Németh, Éva Monostori and Tímea Berki: Intermolecular relations between the glucocorticoid receptor, ZAP-70 and Hsp-90 (Biochem Biophys Res Commun 354 (2007) 253-258) IF: 3,000 Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár, Mariann Szabó, László Pálinkás, Péter Németh and Tímea Berki: Dexamethasone induces rapid tyrosine-phosphorylation of ZAP-70 in Jurkat cells (J Steroid Biochem Mol Biol 98. (2006) 147-154) IF: 2,715 Egyéb publikációk: Ferenc Boldizsár, László Pálinkás, Tamás Czömpöly, Domokos Bartis, Peter Németh, Tímea Berki: Low glucocorticoid receptor (GR), high Dig2 and low Bcl-2 expression in double positive thymocytes of Balb/c mice indicates their endogenous glucocorticoid hormone exposure (Immunobiology, 211 (2006), 785-796) IF: 1,812 Ferenc Boldizsár, László Pálinkás, Domokos Bartis, Péter Németh, Tímea Berki: Antigen and glucocorticoid hormone (GC) induce positive selection of DP thymocytes in a TcR transgenic mouse. (Immunol Lett. (2003) 90. (2-3):97-102.) IF: 1,714 László Pálinkás, Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, Péter Németh, Tímea Berki: Developmental shift in TcR mediated rescue of thymocytes from glucocorticoid-induced apoptosis. (Immunobiology, (2007) publikációra elküldve. Idézhető absztraktok: Boldizsár, F, Berki, T., Pálinkás, L., Bartis, D., Németh, P: Antigen and glucocorticoid hormone (GCs) induce positive selection of DP thymocytes in a TCR transgenic mouse model. Immunol Lett. Special Issue: Abstracts of the 15th European Immunology Congress, EFIS 2003, June 8-12, 2003, Vol. 87.(1-3) W11.09 Boldizsár, F, Czömpöly, T., Berki, T., Pálinkás, L., Bartis, D., Németh, P: Real time PCR analysis of murine thymocyte glucocorticoid receptor (GCR) mRNA expression. Immunol Lett. Special Issue: Abstracts of the 15th European Immunology Congress, EFIS 2003, June 8-12, 2003, Vol. 87.(1-3) W01.10 D. Bartis, F. Boldizsár, M. Szabó, L. Pálinkás, P. Németh and T. Berki: Glucocorticoid hormone elicited tyrosine-phosphorylation events involving T-cell specific kinases . The FEBS Journal, July 2005. 272(Suppl.1): 482 Abstracts of the 30th FEBS-Congress 9th IUBMB Conference Előadások száma (elsőszerzős): 13 (6) Poszterek száma (elsőszerzős): 17 (8)
-1-
ZAP-70: A NEWLY IDENTIFIED JUNCTION BETWEEN T-CELL RECEPTOR AND GLUCOCORTICOID SIGNALLING PATHWAYS.
PHD THESIS
DOMOKOS BARTIS M.D.
Department of Immunology & Biotechnology, Faculty of Medicine, University of Pécs, Hungary
Supervisors:
Tímea Berki M.D., PhD Ferenc Boldizsár M.D., PhD
Subprogram leader: Prof. Dr. Péter Németh
2007. Pécs
-2-
Summary Glucocorticoids (GC) play essential role in the regulation of the maturation and activation processes in T-cells, regarding especially apoptosis mechanisms. The mutual antagonism between GC signals and T-cell receptor (TcR) derived signals concerned to be crucial in thymocyte selection. The non-genomic actions of GCs are less characterised yet, but based on literature data the existence of cross-talk mechanisms between GC and TcR signal transduction pathways are feasible. We aimed in our work to reveal rapid, non-genomic GC signal transduction mechanisms in T-cells using in vitro cultured Jurkat T-cell leukaemia as a model cell line. Our results show that glucocorticoid receptor (GR) agonist Dexamethasone (DX) causes changes in tyrosine phosphorylation pattern of resting and activated Jurkat cells. These GC effects occurred rapidly, within 5 minutes. ZAP-70 kinase has a crucial role in signal transduction originating from the TcR-CD3 complex. ZAP-70 deficient T-cells fail to respond antigenic stimuli in vitro, and ZAP70 deficiency in humans and mice results in Severe Combined Immunodeficiency (SCID syndrome). We demonstrate that DX treatment induces rapid ZAP-70 phosphorylation in both resting and activated Jurkat cells. DX induced ZAP-70 phosphorylation is inhibited by GR antagonist (RU486) pre-treatment suggesting the process is GR dependent. However, DX fails to trigger ZAP-70 phosphorylation in p56-lck deficient JCaM-1 cells proposing the involvement of the upstream src-family kinase p56-lck. We investigated the close physical relation of GR and ZAP-70 by coimmunoprecipitation and confocal microscopy. We show, that the ligand-bound GR associates with ZAP-70 in both Jurkat cells and HeLa/trZAP-70 cells stably expressing transgenic ZAP-70. Examining the role of Hsp-90 we found, that a presumably inactive ZAP-70 fraction is associated with Hsp-90 which is most likely excluded from this signal transduction process. The association of ZAP-70 with phosphorylated ITAM tyrosines of the CD3 complex is indispensable for the appropriate transmission of signals derived from the TcR. Our results demonstrate that the association of ZAP-70 with the CD3 complex is inhibited in the DX treated samples. Based on our experimental data we suggest the following signal transduction model: GR, in the presence of its ligand, associates with ZAP-70, triggering tyrosine phosphorylation events. The alteration of tyrosine phosphorylation may influence the kinase activity of ZAP-70 or affect the clustering of other signal transduction molecules with ZAP-70. The GR association with ZAP-70 also inhibits its binding to the ITAMs of the CD3 complex. Recently GCs are widely used as immunosuppressive drugs although their sideeffects are often serious. We revealed here a new non-genomic signal transduction mechanism which may have a crucial role in GC mediated immunosuppression. The characterisation of this new non-genomic pathway may make possible the design and synthesis of new molecules which targets exclusively this immunosuppressive process. In the future this may contribute to the application of new immunosuppressive agents with more favourable side-effect spectra.
-3-
Introduction 1.1 Therapeutic application of glucocorticoids The glucocorticoid hormone (GC) and its derivates are widely used for various therapeutic purposes for a considerably long time. The application spectra of GCs include not only acute and chronic rheumatologic inflammations, asthmatic and allergic conditions, haematological malignancies, but they are also used for immunosuppressive treatment after tissue and organ transplantation. However, in spite of the really wide therapeutic applications of GC hormone derivatives, the exact mechanism of action remained obscure regarding many aspects.
1.2 Structure of the glucocorticoid receptor GCs exert their effects mainly via the glucocorticoid receptor (GR). GR belongs to the nuclear receptor superfamily. There are multiple steroid hormones acting on receptors of similar structure and other, structurally homologous proteins are known as “orphan receptors” their ligands being unknown. GR is an evolutionary conserved transcription factor. The alternative splicing of human GR (hGR) mRNA results in the expression of two isoforms: hGRα and hGRβ. The α isoform is the “classical” 777 amino acid protein expressed almost ubiquitously among tissues. The hGRβ isoform is formed via the alternative splicing of exon 9. It differs only in its C-terminal region from hGRβ containing a unique sequence of 15 amino acids. The function of hGRβ is controversial: it does not bind ligand and localised exclusively in the nucleus. Some studies demonstrate the role of hGRβ in pathological GC resistance cases. It may take part in the fine tuning of GR-regulated gene expression.
Figure 1.: The GR structure depicted on ribbon diagram. Functionally GR is built up from 4 different domains. The N-terminal domain is the regulatory domain (amino acid residues 1-421). This region is responsible for the constitutive transcription activation function. The DNA binding domain (DBD, amino acid residues 422-486) is the evolutionary most conserved part of the molecule possessing a zinc-finger structure. This part of the molecule binds to the specific palindrome DNA sequences called glucocorticoid response elements (GRE) thus regulating gene transcription. A short hinge region (amino acid residues 487-526) connects the ligand binding domain (LBD, amino acid residues 527-777) which is also responsible for the homodimer formation after ligand binding.
-4-
1.3 Genomic GC signal transduction GCs, being lipophilic molecules, diffuse freely through the cytoplasmic membrane into the cell and bind to inactive GR. The GR, after ligand binding, actively translocates into the nucleus and associates with special regulatory DNA sequences. The ligand-bound GR acts as a transcription factor enhancing or repressing the transcription of certain genes. This is called DNA-dependent regulation. There are also DNA-independent mechanisms of gene expression regulation: in this case GR interacts physically with other transcription factors modifying their activity. In case of GR there are examples of both regulation type.
1.4 Molecular mechanisms of genomic signal transduction mediated by GR Inactive GR is associated with other proteins (e.g. Hsp-90) in the cytoplasm as a member of a multimeric protein complex. Conformation changes after ligand binding result in dissociation the Hsp-90 complex and migration in the nucleus as a homodimer. Ligand-bound GR in the nucleus acts as a transcription factor: it binds to GRE (glucocorticoid response elements, which are specific, palindrome DNA sequences), enhancing the expression of certain genes. However, GR may exert negative regulation function when binding negative regulatory GREs (nGREs). Hitherto nGREs are less well characterised. Transcription regulation may be achieved also via communication with other transcription factors. In this case GR interacts directly with other transcription factors, modulating their activity. Many transcription factors are known of having physical contact with GR, e.g. NFκB, AP-1, CREB and several STAT family transcription factors. Common characteristic of the previously mentioned genomic signal transduction pathways are that the result is a change of the protein expression pattern in the GC sensitive cells or tissues. Genomic effects always need considerable time (usually a few hours) to manifest.
1.5 Non-genomic effects of GC hormone Common feature of the non-genomic steroid hormone effects is that no de novo protein synthesis is necessary. Non-genomic effects are mainly characterised by post-translational modifications of already existing signal transduction molecules. These reactions may occur considerably fast, as they show within seconds or minutes. The non-genomic GC effects are divided into 3 groups: (1) specific GC effects accomplished through the classical cytoplasmic GR (cGR). These cytoplasmic effects are mainly exerted via GR interactions with other signalling proteins. (2) Specific GC effects involving the putative membrane resident GR (mGR) and (3) nonspecific GC effects via physicochemical membrane interactions.
-5-
1.6 Importance of communication between GC and TcR signal transduction pathways GC hormones exert very important regulatory role in T-cells, regarding both thymocyte maturation processes and peripheral T-cell functions. Epithelial cells in the thymus secrete GCs thus being capable of the paracrine regulation of thymocyte maturation. According to the “mutual antagonism theory” GCs together with the signal originating from TcR induce positive selection of thymocytes. GCs presumably play a key role in the apoptosis of the thymocyte clones expressing non-responding TcR. GCs also cause Th2 shift in the cytokine secretion of mature peripheral T-cells and exert profound inhibition effects via multiple mechanisms on the synthesis of various pro-inflammatory cytokines, e.g. IL-1β, IL-2, IL-6 and TNFα. Taken together, the antiinflammatory effects and the mutual antagonism model strongly suggests the existence of communication mechanisms between the GC and TcR signal transduction pathways.
1.7 TcR-originating signal transduction pathways Seconds after the TcR engaged the antigen-primed MHC, tyrosine phosphorylation events occur in T-cells. This activation signal initiates a cascade of biochemical alterations which cause a profound change in the metabolism of T-cells. Within 2 hours, expression of cytokine receptors occur (the most characteristic is the IL-2R), and secretion of various cytokines begins in the first 2-6 hours. DNA replication is initiated within 24 hours followed by cell division within 48 hours. Optimal signal transduction needs the participation of co-receptors, such as CD4 and CD8. These co-receptors are required for the stabilization of the intercellular connection and they also participate in signal transduction. Non-receptor tyrosine kinases of the Src-family are attached to the intracellular part of CD4 and CD8 co-receptors, mediating tyrosine phosphorylation events. After the antigen binding of the TcR and the MHCbinding of the co-receptors mainly CD3 ζ (zeta) chains are phosphorylated on tyrosine, mediated primarily by p56-lck, a src-family kinase. The phosphorylated tyrosine residues of the ζ chains serve as docking sites for ZAP-70 kinase (Zetachain associated protein of 70 kilodaltons)
-6-
1.8 Role of ZAP-70 kinase in TcR-originating signal transduction ZAP-70 is a non-receptor tyrosine kinase of the Syk-family. It is expressed only in Tand NK cells, its role is fulfilled in B cells, neutrophils, eosinophils and mast cells by Syk kinase, showing high structural and functional homology to ZAP-70. Regarding its primary structure, ZAP-70 can be divided to a C-terminal kinase domain, two tandem SH2 domains and interdomain A and B regions.
Figure 2. Primary structure of ZAP-70 showing known tyrosine phosphorylation sites Main role of ZAP-70 is the augmentation of TcR-derived signal. ZAP-70 plays an indispensable role in TcR-CD3 signalling. In ZAP-70 deficient cells no Ca2+ signal is detected after TcR activation or CD3 cross-linking. Human ZAP-70 deficiency results in SCID syndrome (Severe Combined Immunodeficiency) characterised by the complete lack of cytotoxic T cells and immunological unresponsiveness of peripheral T helper cells. The activity regulation of non-receptor tyrosine kinases occur mainly via phosphorylation. There are 30 tyrosine residues in ZAP-70 and 11 of them are known phosphorylation sites. The phosphorylation of some tyrosine residues directly influence the kinase activity (either positive or negative) while others provide docking sites for other signal transduction proteins which can also modulate ZAP-70 function.
-7-
2 Objectives 1. Studying the rapid non-genomic GC effects on T-cells using an in vitro cultured model cell line (Jurkat). Definition of the alterations in the tyrosine phosphorylation pattern in Jurkat cells after high dose Dexamethasone (DX, GR agonist) treatment. 2. Characterisation of the rapid changes in the phosphotyrosine content of ZAP70 kinase after high dose DX treatment. 3. Determination of the upstream kinase responsible for DX induced phosphorylation of ZAP-70. Examination the role of GR in the process. 4. Studying the kinetics of the DX induced ZAP-70 phosphorylation. 5. Examination the possible physical linkage between GR and ZAP-70 using coimmunoprecipitation and confocal microscopy in the presence and absence of GR agonist in Jurkat cells. 6. Clarification of the relationship of Hsp-90 chaperone towards the GR and ZAP70. 7. Studying the relation of GR, ZAP-70 and Hsp-90 in a non-T cell environment using HeLa cells stably transfected with ZAP-70. 8. Investigation of the crosstalk between the TcR-CD3 complex and GR-related signal transduction pathways.
-8-
3 Experimental procedures 3.1 Cell lines For studying rapid GC effects in vitro, we used Jurkat cells (human acute T-cell leukaemia cell line) and its p56-lck deficient subclone (JCaM1.6). For some experiments, we transfected HeLa cells with a lentiviral vector carrying full-length ZAP-70.
3.2 Lentivirus production and transduction To examine the ZAP-70 association with GR in non-T-cells, we transfected HeLa human epithelial carcinoma cells using a lentiviral vector containing human full-length ZAP-70 cDNA. The transfer plasmid (pWPTS with EF1-ZAP-70), packaging plasmid and envelope construction were transiently co-transfected by calcium-phosphate method into 293T cells. The supernatant of the virus producing cells was used to transfect HeLa cells by spinoculation. The expression level of transgenic ZAP-70 was controlled by flow cytometry and western blotting.
3.3 Geldanamycin, GR agonist/antagonist treatment Cells were plated and incubated for 4 hours at 37oC in the presence or absence of RU486 (Mifepristone) or 1,78µM Geldanamycin. After a washing step, Dexamethasone (DX) or solvent (DMSO) were added at a concentration of 10µM for 5 minutes at 37oC. The treatment was stopped by placing the tubes into liquid nitrogen. In case of confocal microscopy samples DX treatment was stopped by addition of 9 volumes of ice-cold PBS supplemented with 0.1% sodium-azide.
3.4 Cell activation and lysis OKT-3 anti-CD3 monoclonal antibody was added to the DX treated or untreated samples. Following incubation for the indicated time at 37oC the activation was stopped by quickly freezing the cells in liquid nitrogen. The samples were lysed for 30 minutes in 500 µl ice-cold TX-100 or TEM lysis buffer freshly supplemented with protease inhibitor coctail and sodium orthovanadate. When TEM buffer was used for co-immunoprecipitation experiments, an additional sonication step was included.
3.5 Immunoprecipitation and Western blot Equal amounts of cell lysates were incubated on a rotator platform at 4oC with Protein G coupled Sepharose beads for 30 minutes. After the pre-clearing step, 10 µl precipitating antibody was added to the pre-cleared lysates for 2 hours. Immunocomplexes were fixed on Protein-G Sepharose beads. After extensive washing, beads were resuspended in 100 µl of SDS sample buffer and the immunoprecipitates were boiled for 10 minutes. The supernatants were collected and loaded on SDS-polyacrylamide gels. SDS-PAGE was performed according to Laemmli. Western blotting was carried out using standard protocols. For Western blot visualization chemiluminescent substrate was used, and the signal was recorded using X-ray film.
-9-
3.6 Confocal microscopy Dexamethasone treated or untreated Jurkat cells were fixed in 4% PFA, then permeabilized using saponine buffer. The fluorochrome labelled monoclonal antibodies or the appropriate negative control antibodies were added at a concentration of 1 µg/ml. After one hour incubation on ice the cells were washed and carefully layered onto slides. After the cells settled the remaining fluid was carefully aspirated and the slides were covered using 50 % glycerol-PBS. In case of HeLa cells the labeling procedure was carried out on monolayers grown on coverslips. An Olympus Fluoview 300 confocal microscope or later a Olympus Fluoview FV1000SIX81 system was used for the examination of the samples.
- 10 -
4 Results 4.1 Dexamethasone alters the tyrosine phosphorylation pattern of Jurkat cells 5 minutes of 10µM DX treatment alone caused increased tyrosine - phosphorylation of numerous proteins in whole Jurkat cell lysates, compared to the solvent-treated control. Activation with monoclonal anti-CD3 antibody markedly increased the tyrosine-phosphorylation of several proteins. Compared to activated cell lysates, 5 minute DX pre-treatment at 10 µM concentration inhibited the anti-CD3 induced tyrosine-phosphorylation of severeal phosphoproteins.
4.2 Dexamethasone rapidly induces ZAP-70 phosphorylation We investigated the tyrosine-phosphorylation of ZAP-70 after DX and/or anti-CD3 treatments. 5 minutes exposure to 10 µM DX caused an average of 4 fold increase in tyrosine-phosphorylation of the ZAP-70 kinase in the anti-ZAP-70 precipitated samples. Anti-CD3 treatment caused similar increase. The tyrosine-phosphorylation after combined DX + anti-CD3 treatment was higher than in case of anti-CD3 or DX treatment alone. Phosphorylation increase after single DX or anti-CD3 or combined treatments proved significant compared to the solvent treated control sample (Student’s t-test, P < 0.05). We observed higher phosphorylation after combined DX + anti-CD3 treatment than single DX or anti-CD3 treatment in all of our independent experiments, but this further rise was statistically not significant by Student’s t-test.
4.3 Dexamethasone induced ZAP-70 phosphorylation is p56-lck and GR dependent In addition to acting as a tyrosine kinase, ZAP-70 is a substrate of p56-lck, a lymphocyte specific src-family tyrosine kinase. When JCaM1.6, a p56-lck deficient subclone of Jurkat cells was subjected to high dose DX treatment, we observed no rise in the degree of tyrosine-phosphorylation of ZAP-70 kinase. We also investigated, whether DX induced tyrosine-phosphorylation alterations were GR dependent in Jurkat T-cells using RU486 (Mifepristone), a glucocorticoid receptor antagonist. Pre-treatment of Jurkat cells for 4 hours with equimolar RU486 prevented rapid phosphorylation of ZAP-70 induced by subsequent DX exposure. RU 486 treatment alone caused no remarkable tyrosine-phosphorylation change in ZAP-70.
4.4 Time kinetics phosphorylation
of
Dexamethasone
induced
ZAP-70
Since the kinetics of tyrosine-phosphorylation is a key feature to understand cellular signalling events, we further investigated the time course of DX induced ZAP-70 tyrosine-phosphorylation. The tyrosine-phosphorylation of ZAP-70 occurs rapidly after the addition of high dose DX. We measured a rise in tyrosine-phosphorylation after 1 and 2 minutes after DX administration, respectively. Dephosphorylation of ZAP-70 occurred after 5 minutes.
- 11 -
4.5 Upon ligand binding GR associates with ZAP-70 kinase Since previously we have found that sort term high dose DX treatment increased the phosphotyrosine content of the ZAP-70 molecule, we sought a possible association between the ZAP-70 and the GR molecules in Jurkat cells. We performed immunoprecipitation on DX or vehicle treated Jurkat cell lysates, both with anti-ZAP70 and anti-GR antibodies, to investigate whether there is a physical link between GR and ZAP-70 in the cytoplasm. The results of both experiments were similar: DX induced the association of GR and ZAP-70 compared to the vehicle–treated control samples. To further characterise the localization and relation of the ZAP-70 and GR molecules in the cytoplasm, we visualised the two molecules parallel by confocal microscopy. In vehicle treated, resting Jurkat cells both ZAP-70 and GR showed even, mostly cytoplasmic distribution, with almost no co-localization. Upon 5 min high dose DX treatment we found near-membrane co-localisation of GR and ZAP-70 molecules in Jurkat cells.
4.6 A fraction of ZAP-70 is associated with Hsp-90 in the cytoplasm Since the unliganded GR complexes Hsp-90 in the cytoplasm and the upstream kinase p56-lck is also an Hsp-90 client protein, we aimed to check the relation of ZAP-70 to Hsp-90. We found that Hsp-90 co-precipitated with ZAP-70 from Jurkat cell lysates. Hsp-90 and ZAP-70 co-precipitation was not influenced by the presence or absence of DX. To further elucidate the relations of ZAP-70, GR and Hsp-90 in Jurkat cells we used geldanamycin (GA) to specifically inhibit Hsp-90. We performed immunoprecipitation with anti-ZAP-70 antibody. Our results showed, that Hsp-90 failed to co-precipitate with ZAP-70 in the GA treated samples. Although GA inhibited the co-precipitation of ZAP-70 with Hsp-90, it could not abrogate the DX induced GRZAP-70 association. Therefore we conclude that the ZAP-70-GR association is Hsp90 independent.
4.7 Studying the relation of ZAP-70, GR and Hsp-90 in transgenic HeLa cells stably expressing ZAP-70 We aimed to clarify the molecular relations between ZAP-70, GR and Hsp-90 in nonT-cells. ZAP-70 is T- and NK-cell specific molecule, while GR and Hsp-90 is ubiquitously expressed. We prepared for these experiments transgenic HeLa cells stably expressing ZAP-70 (HeLa-trZAP-70) using a lentiviral vector. We performed co-immunoprecipitation and confocal microscopy similarly to Jurkat cells to examine the molecular relations in transgenic cells. We found that DX treatment induces the association of GR and ZAP-70 in HeLa-trZAP-70 cells which is similar that of we found in Jurkat cells. Interestingly, the co-localization of GR and ZAP-70 in transgenic HeLa cells showed perinuclear pattern upon DX treatment, while in Jurkat cells the two molecules clustered underneath the cell membrane. We found that a fraction of ZAP-70 associates in HeLa-trZAP-70 cells with Hsp-90 independent of the presence of DX.
- 12 -
4.8 High dose DX treatment rapidly abrogates ZAP-70 association with the CD3 complex in Jurkat T-cells. ZAP-70 plays a key role in the signal transduction pathways originating from the TcRCD3 complex. T-cell activation caused by either TcR engaged by peptide primed MHC or cross-linking with anti-CD3 antibody triggers tyrosine phosphorylation events. After ZAP-70 molecules becomes phosphorylated (autophosphorylation and src-family kinase mediated phosphorylation) associate with the ITAM-tyrosines by their tandem SH2 domains. This step is crucial considering further activation events. Our results demonstrate that ZAP-70 association with the CD3 complex in anti-CD3 activated Jurkat cells is abrogated in the presence of high dose DX, as it failed to coprecipitate in the DX treated samples.
- 13 -
5 Discussion Considering our results summarized above and the referring literature data we suggest that the p56-lck - ZAP-70 hierarchy might represent a new, hitherto unknown regulatory mechanism of GC and TcR signal transduction pathways. We published first that GC treatment causes rapid tyrosine phosphorylation changes of several molecules in T-cells. Antigen binding induced TcR signalling has different influence on T-cells during their different developmental stages. GCs are thought to play primary role in the elimination of thymocytes bearing non-responsive TcR, while clones with high-affinity TcR - being potentially autoreactive - are deleted via activation-induced apoptosis. According to the “mutual antagonism theory”, thymocytes receiving simultaneous signals from both TcR and GCs survive, because the two apoptotic signals are mutually antagonistic. Regarding mature, peripheral Tcells, TcR-activation together with the proper co-stimulatory signals causes T-cell activation, resulting in IL-2 secretion and clonal proliferation. GC hormones antagonize this effect, making them useful drugs in immunosuppressive and antiinflammatory therapy. Hitherto multiple communication points are known on GC and TcR signal transduction pathways, but all of them concerned the genomic signal transduction pathway. These genomic effects need considerable time (typically a few hours) to manifest and require de novo protein synthesis. In contrast to that, non-genomic effects in our studies occur within minutes via post-translational modifications (namely tyrosine-phosphorylation) of already existing signal transduction molecules. Our result, that GC treatment induces rapid ZAP-70 tyrosine phosphorylation suggests that GCs modulate TcR-derived signal at this level, too. Tyrosine phosphorylation is an important issue regarding the regulation of kinase activity. Currently 11 tyrosine phosphorylation sites are known on ZAP-70 making possible the fine-tuning of kinase activity and other signal transduction processes. Since our experimental results showed that DX induced ZAP-70 phosphorylation was GR dependent we examined the possibility of physical linkage between the two molecules. The results of our co-immunoprecipitation experiments and confocal microscopic images strongly suggest, that ligand binding (GR agonist) promotes the direct association of GR and ZAP-70. These results confirm our assumption of ZAP70 being a communication point between GC and TcR signal transduction pathways. It is known that both inactive GR and p56-lck are Hsp-90 client proteins. Therefore we investigated ZAP-70 relation to Hsp-90. Interestingly we found that a fraction of ZAP-70 co-precipitates with Hsp-90, examining both Jurkat and HeLa-trZAP-70 cells. However, the association of the two molecules is independent of the presence of GR ligand. Geldanamycin, a specific inhibitor of Hsp-90 prevented ZAP-70 association with Hsp-90 but showed no effect on ZAP-70-GR co-precipitation. These results strongly suggest that the association of GR and ZAP-70 is independent of Hsp-90. The fact that DX treatment inhibited the ZAP-70 kinase association with the CD3 complex in activated cells, raises the possibility that this non-genomic GC effect described here takes part in the well-known GC effect of suppressing T-cell activation and function. According to our recent knowledge in cellular signalling, the exact temporospatial organization of the participating molecules is of key importance in the proper signalling function. We found that DX treatment disrupts the CD3-associated signalling complex preventing ZAP-70 associating with the TcR-CD3 complex. If the
- 14 docking of ZAP-70 on the CD3 chains is inhibited, the T-cell activation is at least defective or can lead to anergy.
Figure 3 Our concept on TcR-CD3- and GR signal transduction crosstalk mechanisms. We suggest that GC hormone causes multiple tyrosine phosphorylation changes as we demonstrated on Jurkat cell lysates and precipitated ZAP-70 samples. The GC hormone caused rapid phosphorylation changes of the ZAP-70 kinase. After ligand binding, the GR associates with the ZAP-70 kinase and ZAP-70 recruitment to the CD3 complex is inhibited. We assume that these processes might be partly responsible for the inhibitory effect of the GC hormone on Tcell activation.
- 15 -
Acknowledgements First of all I would like to thank my supervisors Dr. Tímea Berki and Dr. Ferenc Boldizsár, who made me possible to participate in this research work and always helped and cheered me during the whole project. I would like to thank also for Prof. Dr. Péter Németh, Head of the Department of Immunology & Biotechnology, for giving me the possibility to work at his department as a postgraduate student. I would like to thank Dr. Éva Monostori at Biological Research Centre, Szeged for her valuable advices and also for “material help”: antibodies, cell lines, etc. I would like to thank to Dr János Matkó, Dr. Imre Gombos and Dr. Endre Kiss at Eötvös Loránd University and Dr. Ifj. György Sétáló and Dr. Gergely Berta at University of Pécs for helping me with confocal microscopy. Finally I would like to say thanks for all of my colleagues at the Department of Immunology and Biotechnology for interesting discussions, advices and company.
- 16 Publications related to this thesis: Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár, Krisztián Kvell, Mariann Szabó, László Pálinkás, Péter Németh, Éva Monostori and Tímea Berki: Intermolecular relations between the glucocorticoid receptor, ZAP-70 and Hsp-90 (Biochem Biophys Res Commun 354 (2007) 253-258) IF: 3,000 Domokos Bartis, Ferenc Boldizsár, Mariann Szabó, László Pálinkás, Péter Németh and Tímea Berki: Dexamethasone induces rapid tyrosine-phosphorylation of ZAP-70 in Jurkat cells (J Steroid Biochem Mol Biol 98. (2006) 147-154) IF: 2,715 Other publications: Ferenc Boldizsár, László Pálinkás, Tamás Czömpöly, Domokos Bartis, Peter Németh, Tímea Berki: Low glucocorticoid receptor (GR), high Dig2 and low Bcl-2 expression in double positive thymocytes of Balb/c mice indicates their endogenous glucocorticoid hormone exposure (Immunobiology, 211 (2006), 785-796) IF: 1,812 Ferenc Boldizsár, László Pálinkás, Domokos Bartis, Péter Németh, Tímea Berki: Antigen and glucocorticoid hormone (GC) induce positive selection of DP thymocytes in a TcR transgenic mouse. (Immunol Lett. (2003) 90. (2-3):97-102.) IF: 1,714 László Pálinkás, Gergely Talabér, Ferenc Boldizsár, Domokos Bartis, Péter Németh, Tímea Berki: Developmental shift in TcR mediated rescue of thymocytes from glucocorticoid-induced apoptosis. (Immunobiology, (2007) submitted for publication. Citable abstracts: Boldizsár, F, Berki, T., Pálinkás, L., Bartis, D., Németh, P: Antigen and glucocorticoid hormone (GCs) induce positive selection of DP thymocytes in a TCR transgenic mouse model. Immunol Lett. Special Issue: Abstracts of the 15th European Immunology Congress, EFIS 2003, June 8-12, 2003, Vol. 87.(1-3) W11.09 Boldizsár, F, Czömpöly, T., Berki, T., Pálinkás, L., Bartis, D., Németh, P: Real time PCR analysis of murine thymocyte glucocorticoid receptor (GCR) mRNA expression. Immunol Lett. Special Issue: Abstracts of the 15th European Immunology Congress, EFIS 2003, June 8-12, 2003, Vol. 87.(1-3) W01.10 D. Bartis, F. Boldizsár, M. Szabó, L. Pálinkás, P. Németh and T. Berki: Glucocorticoid hormone elicited tyrosine-phosphorylation events involving T-cell specific kinases . FEBS Journal, July 2005. 272(Suppl.1): 482 Abstracts of the 30th FEBS-Congress 9th IUBMB Conference Number of oral presentations (first authored): 13 (6) Number of poster presentations (first authored): 17 (8)
