Základy analýzy potravin Přednáška 9

Základy analýzy potravin

Přednáška 9

SACHARIDY Analytické úkoly: • stanovení dominantního sacharidu v určitém materiálu (sacharosa v cukrovinkách, škrob v cereáliích, glykogen v mase…) → nutriční hodnota potraviny, výrobku, (stanovení celkového obsahu všech sacharidů je neobvyklé) • stanovení určitého sacharidu, jehož obsah souvisí s použitím určité suroviny (přídavek škrobu v kysaných mléčných výrobcích…) • stanovení sumy určité skupiny sacharidů se společnou vlastností (redukující cukry, aldosy, pentosy…) • stanovení jednotlivých monosacharidů a oligosacharidů → identifikace původu suroviny, důkaz falšování potravin → sledování průběhu technol. procesů (fermentace) • stanovení jednotlivých polysacharidů • stanovení vlákniny • identifikace sacharidové složky glykosidů, glykolipidů, glykoproteinů

1


Přednáška 9

MONOSACHARIDY A OLIGOSACHARIDY: KVALITATIVNÍ A SEMIKVANTITATIVNÍ ANALÝZA Chemické zkoušky používané k důkazům cukrů • Molischova reakce: roztok cukru + α-naftol +H2SO4 → červenofialové zbarvení reagují všechny sacharidy kromě 2-deoxycukrů • reakce s Fehlingovým činidlem (CuSO4+vinan sodno-draselný+NaOH) záhřevem cukru s činidlem vzniká cihlově červený Cu2O reakci dávají jen redukující cukry a je nespecifická (reagují také aldehydy...) • reakce s Tollensovým činidlem (amoniakální roztok oxidu stříbrného) 2 Ag(NH3)2OH+RCH=O → 2 Ag + RCOONH4+ 3NH3 + H2O Planární chromatografie cukrů Chromatografické materiály • papír • celulosa (TLC) • silikagel (TLC), někdy impregnace kys. boritou... Činidla pro detekci cukrů: • • • •

anilin+difenylamin+H3PO4 (modré, zelené, červené skvrny) naftoresorcinol+H2SO4 anisaldehyd+ H2SO4 anilin+kys. ftalová, trifenyltetrazoliumchlorid...

2


Přednáška 9

TLC cukrů – příklady Vrstva

Mobilní fáze

Dělené cukry

Detekce

celulosa

CH3COOEt-pyridinH2O (6:3:1) CH3CN-H2O (85:15)

Lac, Gal, Glc, Fru Raf, Mel, Lac, Mal, Sach, Gal, Glc, Fru, Xyl, Rha, dRib Raf, Fru, Gal, Glc, Sach, Xyl

anilin-ftalová kys. anilindifenylaminH3PO4

silikagel

BuOH-iPrOH0,5% H3BO3 (3:5:2)

thymolH2SO4

Denzitometrický záznam HPTLC dělení cukrů (A roztoky standardů, B extrakt z jogurtu) Podmínky: silikagel / acetonitril-fosfátový pufr pH 5,9 (85:15) + 0,05% 2-aminoethyldifenylborinát, dvojí vyvíjení, detekce: anilin-difenylamin-H3PO4, aktivace 5 min 120°C, měření log 1/R , λ = 560 nm

3


Přednáška 9

Identifikace cukrů přípravou derivátů • příprava arylosazonů resp. triazolových derivátů nejběžnější činidlo: fenylhydrazin CH=O CHOH

CH

C6H5NHNH2

N

C6H5

NH

CHOH

R

C6H5NHNH2

R fenylhydrazon

CH C

N N

NH NH

C6H5 C6H5

HC Cu2+,

N

H+

N C

R

C6H5

N

R

osazon

triazol

osazony resp. triazolové deriváty cukrů lze identifikovat podle teploty tání cukry lišící se pouze konfigurací na C2 tvoří stejný osazon (např. glukosu, fruktosu a manosu takto nelze rozlišit) • příprava acylderivátů cukrů (reakce s acetahydridem nebo benzoylchloridem) → rozlišení podle teploty tání derivátu CH2OH O OH OH OH

CH2OAc O OAc

(CH3CO)2O CH3COONa

OAc OAc

OH

OAc Ac = COCH3

β-D glukopyranosa

pentaacetát

4


Přednáška 9

STANOVENÍ MONOSACHARIDŮ A OLIGOSACHARIDŮ Příprava vzorků potravin pro stanovení cukrů Kapalné vzorky • zředění (např. sirupy, limonády... → polarimetrie n. titrace) • čiření a zředění (ostatní → polarimetrie n. titrace) • odstranění iontů (→ HPLC) Tuhé a polotuhé vzorky • (odstranění tuku extrakcí nepolárním rozpouštědlem vzorky s vysokým obsahem tuku) • extrakce cukrů vodou, 80% EtOH (možnost hydrolýzy) • čiření • zředění vodou (polarimetrie, titrace...), mobilní fází (HPLC) Čiření je odstranění zákalu a rozpuštěných nesacharidových opticky aktivních látek (bílkoviny, AK...), příp. také barviv z cukerného extraktu. Zpravidla se přídavkem činidla n. činidel k extraktu tvoří sraženina, filtrací je získán čirý roztok Některá činidla používaná k čiření • Carrezovo činidlo: roztoky síranu zinečnatého a hexakyanoželeznatanu draselného 2 Zn2+ + [Fe(CN)6]4- → Zn2[Fe(CN)6] • • • • •

neutrální octan olovnatý zásaditý octan olovnatý: (CH3COO)2Pb + PbO zásaditý dusičnan olovnatý: Pb(NO3)2 + NaOH kyselina fosfowolframová další: tanin, Al(OH)3, aktivní uhlí, spec. ionexy 5


Přednáška 9

POLARIMETRICKÉ METODY Hlavní využití • analýza cukrovarnických surovin a produktů • analýza čokolády a ostatních cukrovinek Specifické rotace některých cukrů: [α]D20 sacharosa invertní cukr D-fruktosa D-glukosa

+ 66,53 - 20,59 - 93,78 + 52,74

[α]D20 laktosa maltosa D-galaktosa

+ 55,3 +137,5 + 80,47

Běžná polarimetrická stanovení • Stanovení sacharosy v nepřítomnosti jiných sacharidů: prosté měření optické rotace roztoku koncentrace sacharosy: cw = α / (l . 66,53)

[g/ml]

• Stanovení sacharosy v přítomnosti redukujících cukrů: varem s roztokem Ba(OH)2 dochází k destrukci red.cukrů na opticky inaktivní produkty aplikace: stanovení sacharosy v čokoládě

6


Přednáška 9

• Stanovení sacharosy vedle monosacharidu nebo laktosy nebo maltosy měří se optická otáčivost roztoku vzorku před a po inverzi sacharosy kyselinou chlorovodíkovou nebo citronovou (citronová kyselina nehydrolyzuje maltosu ani laktosu). Hydrolýza probíhá podle rovnice C12H22O11 + H2O → 2 C6H12O6. Z 342 g sacharosy vzniká 360 g invertního cukru. Pro hodnotu otáčivosti před inverzí platí

α1= l . ([α]D20(S) . cwS + [α]D20(B) . cwB) index S se vztahuje k sacharose, index B k druhému cukru a index I k invertnímu cukru. Pro hodnotu otáčivosti po inverzi (hydrolýze) sacharosy platí α2 = l . ([α]D20(I) . cwI + [α]D20(M) . cwM), kde cw(I) = (360/342) . cwS . Dosazením získáme soustavu dvou rovnic

α1= l . ([α]D20(S) . cwS + [α]D20(B) . cwB) α2 = l . ([α]D20(I) . (360/342) . cwS + [α]D20(B) . cwB) o dvou neznámých cwS a cwM.

7


Přednáška 9

CHEMICKÉ METODY STANOVENÍ REDUKUJÍCÍCH CUKRŮ 1. Metody založené na stechiometrických reakcích Oxidace aldos jodem ve slabě alkalickém prostředí se aldosy oxidují nadbytkem jodu na soli příslušných aldonových kyselin: R-CH=O + I2 + 3OH → R-COO + 2I + 2H2O

Po okyselení reakční směsi se přebytek jodu určí titrací thiosíranem sodným: I2 + 2S2O32- → 2I- + S4O62Oxidace aldos hexakyanoželezitanem v prostředí uhličitanu sodného se aldosy oxidují přebytkem hexakyanoželezitanu draselného: R-CH=O + 2[Fe (CN)6]3- + 3OH- → R-COO- + 2[Fe (CN)6]4- + 2H2O Ekvivalentní množství vzniklého hexakyanoželeznatanu se stanoví titrací odměrným roztokem dichromanu draselného: 6[Fe (CN)6]4- + Cr2O72- + 14H+ → 6[Fe (CN)6]3- + 2Cr3+ + 7H2O.

8


Přednáška 9

2. Metody založené na nestechiometrických reakcích Základní princip • oxidaci redukujících cukrů měďnatými ionty v alkalickém prostředí za horka (obvykle za varu) • činidla jsou např. Fehlingův roztok (CuSO4 + vinan sodno – draselný + NaOH) nebo Luffův roztok (CuSO4 + citronová kyselina+ Na2CO3) • oxidačně redukční reakci lze pro aldosy zapsat takto: R-CH=O + 2Cu2+ + 5OH- → R-COO- + Cu2O + 3H2O. Ve skutečnosti probíhá i řada jiných reakcí (isomerace, štěpení cukrů). Výše uvedená rovnice tedy stechiometricky nevystihuje probíhající chemické děje. Provádí-li se však reakce za přesně definovaných podmínek (objem roztoku vzorku, objem přidaného činidla, doba ohřevu reakční směsi k varu, doba varu), reakce doběhne do určitého stupně (je dosaženo určité konverze reaktantů na produkty), přičemž tento stupeň je závislý na množství cukru ve vzorku. Různé redukující cukry reagují různou rychlostí a také vedlejší reakce nejsou u různých cukrů zcela totožné. • Množství konkrétního cukru se tedy určuje empiricky ze složení reakční směsi po ukončení reakce (ochlazení na laboratorní teplotu). Lze stanovit buď • množství vyloučeného oxidu měďného (červenohnědá sraženina) nebo • zbytkové množství měďnatých iontů.

9


Přednáška 9

Postupy založené na stanovení Cu2O • Metoda podle Ofnera - oxid měďný vyloučený reakcí cukru s alkalickým roztokem měďnaté soli se po okyselení HCl oxiduje nadbytkem odměrného roztoku jodu na Cu2+. Přebytek jodu se určí titrací thiosíranem: Cu2O + 2H+ + I2 → 2Cu2+ +2I- + H2O I2 + 2S2O32- → 2I- + S4O62-. • Metoda podle Bertranda (Rotsche) - oxid měďný se rozpustí v roztoku síranu železitého a kyseliny sírové. Železitá sůl se přitom redukuje na železnatou. Ekvivalentní množství železnatých iontů se stanoví manganometrickou titrací: Cu2O + 2H+ + 2Fe3+ → 2Cu2+ + 2 Fe2+ + H2O 5Fe2+ + MnO4- + 8H+ → 5Fe3+ + Mn2+ + 4H2O. • Komplexometrická metoda - oxid měďný se po odfiltrování rozpustí v kyselině dusičné a vzniklé měďnaté ionty se stanoví titrací komplexonem III (chelatonem 3) s použitím murexidu nebo PAR jako indikátoru: 3Cu2O + 2NO3- + 14H+ → 6Cu2+ + 2NO + 7H2O Cu2+ + H2Y2- → CuY2 + 2H+ • Vážkové metody – oxid měďný se odfiltruje a stanoví vážkově (váží se buď Cu2O nebo kovová měď po redukci oxidu v parách methanolu)

10


Přednáška 9

Postupy založené na stanovení přebytku Cu2+ • Metoda podle Luffa-Schoorla - cukerný extrakt reaguje za horka s definovaným množstvím Cu2+ ve formě tzv. Luffova roztoku (CuSO4+ citronan sodný + Na2CO3) a vzniká oxid měďný. Směs se vaří přesně 10 minut. Po ochlazení a okyselení se nadbytek Cu2+ stanoví jodometricky: Cu2+ + 4I- → 2CuI + I2 I2 + 2S2O32- → 2I- + S4O62-. Provádějí se dvě titrace thiosíranem. První bez vzorku (místo cukerného extraktu se odpipetuje stejný objem vody) a druhá se vzorkem. Z rozdílu spotřeb 0,1M Na2S2O3 se z tabulky určí množství příslušného cukru. 0,1M Na2S2O3 [ml] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Glc, Fru, invert [mg]

Maltosa (bezv.) [mg]

Laktosa(bezv.) [mg]

2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2

3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 75,5 80,9 85,4 90,0 94,6

3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0

11


Přednáška 9

• Komplexometrická metoda - přebytek Cu2+ po reakci s cukrem se stanoví titrací komplexonem III (chelatonem 3): Cu2+ + H2Y2- → CuY2- + 2H+. Zvláštní postup alkalický roztok měďnaté soli se za varu titruje cukerným roztokem (vzorkem) do vymizení modrého zabarvení (metoda podle Lanea-Eynona). KOMBINOVANÉ POSTUPY STANOVENÍ NĚKOLIKA CUKRŮ Stanovení fruktosy vedle glukosy Glukosa se předem oxiduje jodem v alkalickém prostředí, po okyselení se nadbytek jodu odstraní opatrným přídavkem Na2SO3. V roztoku se pak stanoví fruktosa např. podle LuffaSchoorla Stanovení glukosy, fruktosy a sacharosy • první alikvotní podíl: stanovení glukosy titrací jodem v alkalickém prostředí ⇒ m1 = mGlc • druhý alikvot. podíl: stanovení glukosy a fruktosy na základě redukce měďnaté soli (např. metoda Ofnerova, Luffova-Schoorlova...) ⇒ m2 = mGlc + mFru • třetí alikvot. podíl: inverze sacharosy kys. chlorovodíkovou, stanovení sumy všech red. cukrů ⇒ m3 mSach = 0,95 mInv = 0,95 (m3-m2)

12


Přednáška 9

Stanovení laktosy a sacharosy vedle sebe Laktosa se hydroxidem barnatým převede na opticky inaktivní produkty a zbylá sacharosa se stanoví polarimetricky, laktosa se stanoví titračně podle Luffa-Schoorla Stanovení glukosy, maltosy a dextrinů Suma glukosy a maltosy se stanoví jodometricky na základě redukce měďnaté soli v prostředí NaOH. V jiném alikvotním podílu se stanoví samotná glukosa obdobně v prostředí octanu sodného (maltosa nereaguje). V dalším alikvotním podílu se dextriny hydrolyzují na glukosu a stanoví se suma všech redukujících cukrů. Obsah dextrinů se určí jako mdex = 0,9 (mcelk – mGlc – mMal)

13


Přednáška 9

SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODY STANOVENÍ CUKRŮ 1. Metody enzymové viz biochemické metody 2. Metody založené na redukčních účincích cukrů Neokuproinová metoda Měďné ionty (Cu+) vzniklé reakcí Cu2+ s cukrem reagují s neokuproinem (2,9-dimetyl-1,10-fenanthrolin) za vzniku oranžového komplexu rozpustného v EtOH (λmax = 457 nm) Metoda dle Nelsona a Somogyiho Měďné ionty (Cu+) vzniklé reakcí Cu2+ s cukrem dále redukují arsenomolybdenovou kyselinu na molybdenovou modř (λmax = 820 nm) Reakce s tetrazoliovými solemi trifenyltetrazolium chlorid nebo bromid se redukujícími cukry v alkalickém prostředí (pH >12,5) redukuje na červenofialový trifenylformazan:

N N +

N

X N

2H - HX

trifenyltetrazolium chlorid (bromid)

N N N H

N

trifenylformazan

14


Přednáška 9

Reakce s pikrovou nebo dinitrosalicylovou kyselinou Pikrová kyselina se při reakci s cukry v alkalickém prostředí redukuje na červenou pikraminovou kyselinu: OH

OH NO2

O2N

NH2

O2N

NO2

NO2

Redukcí 3,5-dinitrosalicylové kyseliny vzniká v alkalickém prostředí (0,3M KOH) červenohnědá 3-amino-5nitrosalicylová kyselina (λmax = 520 nm) COOH

COOH

OH O2N

OH

NO 2

O2N

NH 2

reakci je vhodné provádět v inertní atmosféře, vzdušný kyslík ovlivňuje výsledky. 3. Metody založené vzniku a reakcích furanových derivátů Dehydratací cukrů v prostředí minerálních kyselin vznikají deriváty furfuralu R

pentosy → furfural

O

CH

O

(R = H)

methylpentosy → 5-methylfurfural (R = CH3) hexosy → 5-hydroxymethylfurfural (R = CH2OH) uronové kyseliny → 5-formylfuroová kyselina (R = COOH) (2-deoxycukry takto nereagují) 15


Přednáška 9

Furfural a odvozené sloučeniny kondenzují s fenoly aromatickými aminy nebo polycyklickými sloučeninami za vzniku barevných produktů Nejčastěji používaná činidla CH 3

O

OH

OH

OH

orcinol

anthron

1-naftol

Přehled reakcí: Činidlo orcinol/ HCl nebo H2SO4 anthron/ H2SO4 1-naftol/H2SO4

Doba reakce, teplota Cukry 30-45 min , 100°C pentosy > hexosy 10-15 min, 90-100°C všechny všechny 3 min, 100°C

Zbarvení zelené hnědé modrozelené purpurové

Vlastnosti metod skupiny 3: • málo selektivní (⇒ kombinace s PC, TLC, HPLC) • málo robustní (vliv doby a rychlosti ohřevu) • vysoce citlivé (možno stanovit µg množství cukrů) Automatizace spektrofotometrických meření Flow Injection Analysis (FIA)

16


Přednáška 9

BIOCHEMICKÉ METODY ANALÝZY CUKRŮ využívají většinou enzymově katalyzovaných oxidačně – redukčních reakcí cukrů, při nichž dochází k přeměně kofaktoru nebo kosubstrátu. Vznik nebo úbytek těchto složek je sledován spektrofotometricky případně elektrochemicky. Nejčastěji jde o dehydrogenace fosforečných esterů cukrů pyridinovými dehydrogenasami za současné konverze NAD+ (nebo NADP+) na NADH+H+ (neb NADPH+H+). Redukovaná forma kofaktoru se stanoví měřením absorbance při 340 nm.

Absorpční spektra oxidované a redukované formy nikotinamidadenindinukleotidu (c = 5 mmol/l)

Stanovení glukosy hexokinasa

glukosa + ATP → glukosa-6-fosfát + ADP glukosa-6-fosfátdehydrogenasa

glukosa-6-fosfát + NADP+ → 6-fosfoglukonát + NADPH+H+

Jiný princip: glukosa se oxiduje kyslíkem na glukonát: glukosaoxidasa

glukosa + H2O + O2 → glukonát + H2O2

vzniklý peroxid následně oxiduje (katalýza peroxidasou) leukoformu barviva na barvivo, jehož absorpce se měří. 17


Přednáška 9

Stanovení fruktosy hexokinasa

fruktosa + ATP → fruktosa-6-fosfát + ADP glukosafosfát-isomerasa

fruktosa-6-fosfát → glukosa-6-fosfát další reakce probíhají jako při stanovení glukosy

Stanovení sacharosy Sacharosa se za katalysy invertasou (β-fruktosidasou) hydrolyzuje na glukosu a fruktosu. Dále viz glukosa, fruktosa. Stanovení laktosy Laktosa (O-β-D-galaktopyranosyl-(1→4)-α-D-glukopyranosa) se za katalýzy β-galaktosidasou hydrolyzuje na glukosu a galaktosu. Galaktosa se enzymově dehydrogenuje: +

D-galaktosa:NAD-oxidoreduktasa

Gal + NAD → galaktonová kys.+NADH+H+

Stanovení rafinosy Rafinosa (α-D-galaktopyranosyl-(1→6)-α-D-glukopyranosyl(1-2)- β-D-fruktofuranosid) může být hyrolyzována buď • na galaktosu a sacharosu (enzym α-galaktosidasa) nebo • na fruktosu a melibiosu (enzym invertasa=β-fruktosidasa). Detekce je založena na dehydrogenaci vzniklé galaktosy. V druhém případě je nutné nejprve hydrolyzovat melibiosu na galaktosu a glukosu (enzym α-galaktosidasa).

18


Přednáška 9

Zhodnocení enzymových metod Výhody

Problémy, nevýhody

specifičnost nalezení opt. podmínek pro více enzymů jednoduchá příprava vzorku nečistoty v enzymových preparátech rychlost vysoká cena čistých enzymů

19

Základy analýzy potravin Přednáška 9

Recommend Documents