HASJL DAN PEMBAHASAN I. Pemilihan Genotipe dan Penentuan Kadar A1 Untuk Induksi Gen Agar ekspresi gen hasil induksi menampakkan hasil atau ada perbedaan dengan yang tidak diiiduksi, maka respon bagian tanaman yang mengalami induksi atau menarnpakkan gejala cekaman harus mempunyai perbedaan yang cukup jelas. Penentuan kadar cekaman A1 untuk induksi gen, didasarkan pada perbedaan (reduksi panjang dan atau bobot kering akar mutlak) antam kontrol deng& perlakuan cekaman minim1 sebesar 50 persen (Basu et al., 1994; Hoa Le Van et al., 1994: Ryan et al., 1994:
dan Samuels et al., 1997).
Sedangkan untuk menentukan genotipe yang
mewakili galur toleran dan peka, didasarkan pada konsistensi hasil diantara kedua peubah (panjang dan bobot kering akar) tersebut terhadap cekaman A1 untuk setiap galurnya. Hasil percobaan (Tabel 5, Gambar 7) menunjukkan bahwa: galw-galur toleran
(YBL,Sicinang, Genjah Jepang, Sriyono, Sindon, dan Slamet) memberikan respon yang berbeda untuk mencapai penurunan minimal 50 persen ( A l y s ~ )panjang dan bobot kering mutlak akar dari kontrol, yakni mulai dari cekaman 1,60 m M A1 sampai 2,80 m M Al. Bila dibmdingkan dengan menggunakan kedua peubah tersebut (Lampiran 1 dan 2), hasil yang konsisten diantara galur toleran ini adalah galur-galur YBL, Sicinang, Sindoro dan Slamet, sehingga galur-galur ini dapat dipakai untuk tahapan selanjutnya dengan cekaman A1 yang dipiiih sebesar 2,4 mM Al. Selain ity pada galur-galur yang dianggap peka (Lurnut dan Arksoy), juga terdapat variasi respon panjang dan bobot kering akar mutlak terhadap perlakuan Al. Untuk galur Arksoy, pemberian cekaman A1 sampai 3,2 mM belum menunjukkan reduksi hasil SO%, sedangkan galur Lumut memberikan penurunan hasil50% terhadap
Tabel 5. Perbandingan rataan panjang dan bobot kering mutlak akar (%) relatif terhadap kontrol pada beberapa galur kedelai oleh cekaman aluminium Table 5. Relative ratio between root Iength and mass of root of soybean by A1 stress and control
Ketennean (Notes): 4.0tO.wi media la& 4.0 dan tanpa AI; 4,OIO,&pH4,0olnmdkam' M A S 4,010.4=pH media laMm 4.0dan 0.4 mM Al; 4,OIO,4=pH4,Qofmedi..rd O,4mMM; 4.W.8.pH medialaam 4,0da10,8 nhlN 4,OIO,&pH4,0ofmed/a am'0.8mMAP
4.0+1.*
medialanam 4Pdm 1.2 mM Al;
4,Wl.Z;pnCOofmedianrI1.2MAP 4,O+lb=pH media tanam 4.0 dan 1.6 mM Al: CWf,&M4,Oolmedmardf,BmMAl; 4,012.4;pH media laarn 4.0 dan 2.4 mM Al; 4.012,4=pH4,0afrmdk d 2 . 4 mM N;
4.012,W msda tanam4.0 dm 2 8 mM Al 4,DI2,8.pH4.0ofmediaardZBMAl 4 . D t 3 , W medmtnam4PMm32 mM Al
4,0+3,2==4,0afmed~~3,2~N
" "
= Ikra =k
kedua peubah tersebut terjadi pada cekaman A1 sebesar 0,8 mM.
Ketidakkonsistenan
hasil dari galur Akrsoy ini juga dilaporkan oleh Sopandie et al. (1996) dan ada kemungkiian disebabkan oleh tidak murninya lagi sumber benih yang digunakan. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa genotipe dan kadar cekaman A1 terpilih pada galur toleran (YBL, Sicinang, Sindon, dan Slarnet) untuk penginduksian gen dapat dilakukan dengan induksi cekaman A1 sebesar 2,4 mM, sedangkan pa& galur peka (Lumut) dapat dilakukan induksi sebesar 0,8 mM Al. Selanjutnya dipilii Lumut @eka) dan Yellow Biloxy (toleran) untuk percobaan-percobaan berikutnya.
II. Pengklonan Gen-gen Yang Diinduksi Oleh Aluminium 1. Konstruksi Pustaka cDNA
Gambaran ringkas proses konstruksi cDNA disajikan pada Gambar 8 di bawah
ini. RNA total yang dihasilkan sangat baik. Integtitas mRNA, rRNA, dan tRNA yang baik dan tidak mengalami degradasi, dicirikan oleh pita rRNA (28s dan 18 s) yang utuh
dan pita mRNA berupa usapan (smear,Gambar 8A). Dari mRNA telah berhasil
Gambar 7. PenampiIan bibit kedelai hasil cekaman aluminium Figure 7. Performance of soybean's seedling by AI stress
disintesis cDNA pada galur Lumut dan YBL, baik utas pertama maupun utas kedua, dengan kualitas yang sangat baik dan mempunyai ukuran berkisar antara 500 bp sampai 8000 bp, suatu ukuran cDNA yang sangat baik (Gambar 8B). Untuk selanjutnya, hanya cDNA yang berasal dari galur Lumut saja yang dijadikan sumber pembuatan pustaka cDNA, sedangkan cDNA yang berasal dari YBL hanya digunakan sebagai pelacak. Hasil fiaksinasi menunjukkan bahwa cDNA berukuran cukup besar (Gambar 8C) dan. dari fiaksi P saja, yang merupakan gabungan dari fiaksi no.5-13, yang berukuran di atas 500 pb selanjutnya digunakan untuk pembuatan pustaka cDNA. Klon yang diambil secara acak dari pustaka cDNA dan dikeluarkan sisipannya dengan pemotongan menggunakan enzim NotI-SalI menunjukkan bahwa ukuran sisipan berkisar antara 500 bp sampai 3000 bp (Gambar 8D), suatu ukuran cDNA yang cukup bewariasi dan baik. Secara kuantitatif hasil isolasi RNA total, pemurnian mRNA dan sintesis cDNA tercantum pada Tabel 6. Untuk setiap gram ujung akar kedelai dapat dihasilkan 1,88 mg sampai 2,13 mg RNA total. Sedangkan mRNA yang dapat dimumikan dari populasi RNA total tersebut berkisar antara 15,68 pg/mg sampai 16.00 pg/mg total RNA (1,57%1,60% dari total RNA). Hasil pernumian ini tergolong baik, karena populasi mRNA pada suatu organisme berkisar antara 1-2%. Demikian pula, hasil yang baik didapatkan pada sintesis cDNA yang dibuat dari populasi rnRNA, memberikan hasil 187% sampai 195% dari mRNA (secara teoritis maksimal dihasilkan 200%). Transformasi cDNA ke dalam Escherichia coli DHlOB menunjukkan hasil yang baik, yang dicerminkan oleh nilai efisiensi transformasi yang tinggi sebesar 8,25 x 10' cfdug dan rasio koloni yang mcngandung vektor r e k o m b i i (vektor yang mengandung sisipan klon) dan yang mengandung vektor nonrekombii (vektor yang tidak mengandung sisipan klon) tergolong tinggi yaitu sebesar 85: 15. Selanjutnya pustaka cDNA ini ditapis dari populasi 140.000 koloni (Tabel 7).
TOTAL RNA
mRNA first strand synthesis
XtI
1
I
.
second strand 1 synthesis
1
Not1 digestion I
cut
[
Vektor
size fractionation
3
1
Transformation ke E.coli -b 0.1
Gambar 8. Ringkasan konstruksi pustaka cDNA A =total RNA, B = Utas pertama dan kedua cDNA dari galur YJ3L dan Lumut, C = Fraksinasi cDNA dan D = variasi ukurm sisipan klon cDNA Figure 8. Summmy of cDNA librmy construction A = RNA t o t 4 B = First andsecondstrand of cDNAfrom YBL and Lumut lines, C =fractionation of cDNA and D = variation of insert of the cDNA clone
Tabel 6. Hasil ekstraksi RNA Total, mRNA dan cDNA ujung akar kedelai Table 6. Ertraction of total RNA. mRNA and cDNAfrom the root tips ofsoybean
9.36 (187%)
15.68 (1.57%)
2.13
1. Lumut
I
I
I
Tabel 7. Hasil transfonnasi pustaka cDNA ujung akar kedelai Lumut Table 7. Yield of cDNA libraries tramformation of the root tips ofsoybean
8.25 x lo8cfu/ug 15:85 Keterangan (note) : cfu = colonyforming unit
140.000 (120.000putih)
2. Penapisan Pustaka cDNA
Penapisan Diferensial.
Sebanyak 140.000 koloni ditapis secara diferensial.
Penapisan pertama (Gambar 9) mendapatkan 68 kandidat klon untuk selanjutnya ditapis ulang (Gambar 10). Dari 68 kandidat tersebut 25 klon menunjukkan positif secara diferensial. Delapan dari 25 klon ini dilanjutkan untuk konfirmasi melalui bibridisasi dot-blot (hibridisasi DNA-DNA).
Kedelapan klon tersebut dinamai gmalil, gmalr2,
gmalil5, gmali22, gmalil4, gmali20, gmali49, dan gmali50 Cgmali singkatan untuk Glycine max &luminium induced). -
L i m a
diantara delapan klon tersebut, yaitu gmalil,
gmalil4, gmala20, gmali49, dan gmali50 dilaporkan dalam disertasi ini. Sedangkan tiga lainnya masing-masing gmala2, gmalil5, data gmali22 tidak dilaporkan dalam penelitian ini.
Gambar 10. Penapisan diferensial kedua pustaka cDNA yang dilacak dengan pelacak cDNA yang mendapat cekaman A1 (A) dan cDNA kontrol (B). -+ Kandidat klon yang terinduksi A1 Figure 10.
Second d~~erentiol screening of cDNA libraries by d l N A probejiom Al stress (A) and control (B). Candidate of cDNA clone ( + )
Penapisan Pustaka eDNA dengan tehnik P C R
Dengan menggunakan tiga
macam primer, yaitu Plf dan PIr, P2f dan P2r, P3f clan P3r, untuk melacak pustaka cDNA, maka didapatkan beberapa kandidat klon cDNA. Dengan primer PI (Gambar 11) dihasilkan dua pita. Karena pita yang d i i p k a n bendcuran sekitar 650 pb, yaitu yang sesuai dengan ukuran gen awal primer, maka hanya pita yang diiaksud saja yang diklonkan Iangsung ke plasmid pGEM-T. Dengan primer P2 (Gambar 12) didapatkan satu jenis pita dan ukurannya sesuai dengan yang diharapkan, yaitu sekitar 816 pb dan juga diionkan pada pGEM-T. Demikian pula hasil yang sama dengan menggunakan primer jenis P3, d i i i l k a n satu pita berukuran sekitar 1100 pb (Gambar 13). Satu diantara tiga kandidat klon tersebut dilaporkan dalam disertasi ini (klon cDNA dengan menggunakan primer PI), sedangkan dua klon lainnya w o n cDNA dengan menggunakan primer P2 dan P3) tidak dianalisis pada penelitian ini.
Gambar 1 1. Hasil amplifikasi pustaka cDNA dengan primer P1, menghasilkan dua pita masing-masing berukuran a = 85Opbdanb=650bp(A). Reamplifikasi pita berukuran 650 pb (B) dan 850 pb (C). M = penanda ukauaa DNA 1,2,..6 = contohlsampel. Figure 11. Amplij?cPtrcPtron of cDNA libraries by primer PI result two band, each a = 850 bp and b = 650 bp (A). Remnplifcation of each band 650 bp (B) and 850 bp (C). M =markerDNA I,2..,6 =sample
Gambar 12. Hasil amplifikasi pustaka cDNA dengan primer P2, menghasilkan satu pita berukuran850 pb. M = penanda ukuran DNA 1,2,..6 = contohlsampel Figure 12. Ampl~~cation of cDNA libraries by primer P2 result one band 850 bp. M = marker DNA 1.2. ..,6=sample
Gambar 13. Hasil amplifih i pustaka cDNA dengan primer P3, menghasilkan satupitabetukuran IlOOpb M = penanda ukuran DNA. 1,2,..6 = contoWsampe1. Figure 13. Ampl~j?cationof cDNA Iibrmies by primer P3 result one bmd 1100 bp M = marker DNA 1.2. ..,6 -sample
3. Konfirmasi Klon cDNA Sasaran
Konfirmasi klon cDNA dilakukan terhadap kandidat klon yang telah melewati penapisan tahap kedua. Setelah plasmid diisolasi, kemudian sisipannya (cDNAnya) dikeluarkan dengan cara dipotong dengan enzim restriksi NotI-Salk dilanjutkan dengan analisis hibridisasi southern (hibridisasi DNA-DNA) dengan menggunakan pelacak yang sama dengan sebelumnya, yalcni cDNA yang mendapat cekaman A1 dan cDNA kontrol. Hasil konfimasi hibridisasi southern ditunjukkan pada Gambar 14.
Gambar 14. Hibridisasi southern kandidat klon cDNA dengan pelacak cDNA perlakuan (A) dan cDNA kontrol (B). Hibridisasi diferensial tejadi pada Won no. 14,20,49 dan 50. Figure 14.
Southern hybridization of the candidace's cDNA clone with cDNA probe from A1 stress (A) and control (B). Clone no.14.20.49 and 50 shown dt@ierential hybridization
Dari Garnbar 14 tersebut dapat ditunjukkan bahwa sinyal hibridisasi tejadi pada sisipan kaodidat klon cDNA nomor 14, 20, 49 dan 50 dengan menggunakan pelacak cDNA dari tanaman yang terkena cekaman Al, tetapi sinyal itu tidak didapatkan bila menggunakan pelacak cDNA dari tanaman kontrol. Sehingga dapat dipastikan bahwa kandidat Won cDNA tersebut (sisipan) benar-benar merupakan hasil induksi dari cekaman Al. Klon-klon tersebut dinamai dengan gmalil4, gmali20, gmali49, dan gmali50. Untuk klon nomor 1 (gmalil), hasil konfinnasi menunjukkan bahwa gmalil
rneningkat ekspresnya mulai 8 jam setelah mendapat cekaman 0.8 mM A1 (Gambar 15).
Gambar 15. Induksi gen gamlzl selama eekarnan 0.8 mM A1 24 jam Figure IS. Innkction of gmcrlil gene during 24 hours aposurc lo A1
Untulc klon yang diisolasi dari pustaka cDNA melalui teknik penapisan pita pada
PCR dengan menggunakan dua macam primer Plf dan Plr, m e n g h a s i i dua pita (Gambar 16) masing-masing berukuran 850 pb (pita 1) dan 650 pb (pita 2). Karena klon yang diharapan berukuran 650 pb, sesuai dengan disain primer awal, maka hanya pita 2 yang diisolasi dan diklonkan di pGEM-T. Klon ini diberi nama sapali (goybean
aminoacyl geptidase aluminium induced), karena dari hasil penelusuran di bank data Gen Bank mempunyai kesamaan dengan peptidase arninoacyl (sdah satu jenis serine
protease) Arabidopsis thaliana.
Hasil transkrip (Gambar 17) menunjukkan bahwa
sapali ekspresinya diiduksi oleh Al. Hasil ini mengindikasikan adanya peningkatan
aktivitas enzim proteolitik khususnya peptidase aminoacyl oleh cekaman Al.
sapali
Gambar 16. Pola pita gen sapali hasil PCR (2) Figure 16.
Bandpanern of sapallgene by PC" (2)
Gambar 17. Induksi gen sapali oleh cekaman A1 selama 24 jam Figure I Z Indudion of sopoUgene by Al stressfor 24 h
111. Pengurutan cDNA Klon
Pengurutan (secara parsial) cDNA dilakukan terhadap klon-klon gmali dan sapali. Hasil pengurutan clan penelusuran pada data bank gen secara ringkas tertera
pada Tabel 8.
Tabel 8. Karakteristik klon gen basil isolasi dan identifikasi Table 8. Characteristics of the clonegenes
KLON Clone
gmalil gmalil4 gmal120 gmali49 gmali50 sapali *)
KARAKTERISTM
GENEBANK/EMBL
Characteristics
GeneBankBMBL
265 pb, 88 aa, tidak ada kodon awal dan akhir. 771 pb, 137 aa, ATG=57-59 TAGz465-467. 780 pb, 164 aa, ATG=235-237 TGA=727-729. 517 pb, 134 aa, ATG=66-68 TAAz468-470. 731 pb, 197 aa, ATG=65-67 TAA=656-658. 657 pb, 202 aa, ATG = 1-3 TGA = 607-609
= Hsyati - IPB Journal (submitted)
~ ~ ~ a s eton') - ~ r o Membran Plasma Histone H3 **) Catalase *') Dehydrogensse NADH*') Auxin Induced Protein *'I Peptidsse ~ r n i n o a c ~ l * ) ** )
= Aspac Journal (submitted)
Klon gmalil mempunyai ukuran 265 pb dengan 88 asam amino (Gambar 18), tidak mempunyai kodon awal maupun akhiir. Hasil ini mengindikasii bahwa klon
gmalil ini merupakan gen yang tidak utuh. Dari peneluswan di bank data GeneBank menunjukkan bahwa klon gmalil mempunyai kesamaan yang tinggi dengan gen penyandi ATPase-proton Membran Plasma (mendekati ujung 3', Gambar 19), yang mempunyai peranan dalam mengatur keseimbangan konsentrasi H'lproton rntara di luar d m di dalam membran plasma (sel). Hasil ini menunjukkan bahwa cekaman A1 &pat
meningkatkan hiperpolarisasi membran plasma sel (Lino et al, 1998; Macdonald, 1997)
dan berakibat pada : (1) peningkatan kebutuhan energi (dalam bentuk ATP) dan (2) sebagai tanda sinyal pada "K+-channel" untuk meningkatkan aktivitasnya (Maathuis et
al, 1997); yang pada gilirannya bersama-sama dengan "anion channel" menstimulir sintesis asam-asarn organik untuk proses adaptasi tanaman terhadap cekaman Al.
1 CAATCCGCTACGTCCTGAGTGGGAAGGCTTGGGATAATCTTTTGGAGAACMGACTGCCT I R Y V L S G K A W D N L L E N K T A F
60
6 1 TCACTA~GAAAGACTATGGCAAAGAAGAGAGAGAAGCACAGTGGOCAACTGCTCAGA 1 2 0
T
T
K
K
D
Y
G
K
E
E
R
E
A
Q
W
A
T
A
Q
R
1 2 1 GGACTCTTCATGGTCTTCAGCCACCTGAAACAACCAACCTTTTCAATGACAAGAACAGTT 1 8 0
T
L
H
G
L
Q
P
P
E
T
T
N
L
F
N
D
K
N
S
Y
1 8 1 ACAGGGAGCTTTCAGAGATTGCTGAGCAAGCTAAGAGACGTGCCGAGGTTGCAAGGCTCA2 4 0
R
E
L
S
E
I
A
E
Q
A
K
R
R
A
E
'
V
A
R
L
R
2 4 1 GGGAGCTTCATACTCTGAAAGGACA 2 6 5
E
L
H
T
L
K
G
Jenis enzim vang d a ~ a tmemotone : CviJI
Act1 AIuI
DdeI
Eco571 Mae11
Jenis enzim vanp tidak d a ~ a tmemotonp: BamHI Sau3AI
ClaI Sau96I
Gambar 18.
WoRI SmaI
Hind111 Xba I
PstI XhoI
Sal I
Susunan nukleotida dan asam amino klon gmalil yang rnenyandikan ATPase-proton Membran Plasma. Susunan asam amino terletak di bawah susuaan nukleotida. Susunan nukleotida ini dapat diakeee di data Bank Gen dengan nomor AF91303.
Figure 1 8 . Nucleotide and amino a c i d sequence o f the gmalil Clone encoded Plasma Membrane proton-ATPase. The amino a c i d sequnce i s under t h e n u c l e o t i d e sequence. This sequence could b e accessed i n GeneBank database no. AF91303.
Klon gmalil4 mempunyai ukuran sekitar 771 pb dtngan 137 asam amino dan menyandii protein Histon H3 (posisi kodon awal ATG = 57-59 dan kodon akhir TAG = 465-467).
Protein Histon H3 ini bersama-sama dengan protein Histon lainnya (HI,
H2A, H2B, H4 dan H5) serta protein nonhiston berperan dalam membentuk
-
Zea mays
:840
I R P V L S Q I U W D N L W ) ~ I ~ ~ L ~ Q E ~ A T T Q P P E 8 L899 K S S Y
G. m u
:
1 8 3 RELSEIA8QAKMA8VARLRELETLKQ 2 6 3
Zea mays
:
9 0 0 R8LSEIA8QMRRAEIARLRELNTLKQ 926
-
Gambar 19. Perbandingan asam amino ATPase-proton Membran Plasma kedelai terhadap ATPase-proton Membran Plasma tanaman Lain Figure 19.
Alignment of amino acld sequence of soybean PIema Membranprofon-ATPase (PM.4) with other plans PMAs
struktur nukleosomfluomatin saat sel membelah (Lewin, 1985). Fenomena ini &pat menduga bahwa pada saat tejadi cekaman A1 protein histon H3 ini diinduksi untuk berperan melindungi DNA dari kerusakan. Susunan nukleotida dan deduksi urutan asam amino dari klon gmalil4 ditunjukkan pada Gambar 20 dan perbandingan asam amino penyusun Histone H3 pa& tanaman kedelai dan spesies lainnya ditunjukkan oleh Garnbar 21. Kesamaan identifikasi ini berkisar antara 94% @a& Arabidopsis thaliana, nomor akses S06250; Oryza saliva, nomor akses x13678 dan ~13680)sampai 98% @a& Medicago sativa, nomor akses ~13674,~000937dan AF26803; Tritimm aestivwn, nomor akses U09459).
Untuk gnraIi20, yang mempunyai nukleotida sepanjang 780 pb dan 164 asam amino dengan kodon awa1 ATG pa& posisi nuklcotida ke 235-237 dan kodon akhir
TGA=727-729,menunjukkan kesamaan dengan enzim Catalase yang berperan sebagai
,
61 C T C G T A C G A A ~ C A G C ~ G n : C A C C G G A ~ G C T C C M G G M G C A G C T 120 cG A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L 121 181
CCACCMGGCAGCAC~Gn:C~GGNWCGGGCGGCG~(SM(3CCCCACCGT 180 T A T K A A R K S A P G T G G V K K P E R ~GOCCUj00ACAGTGGCn:TOAGGGAGATIY:GOAAGTM:CAGAAGAGWU3~TPC240
F
241
S
P
G
T
V
A
L
R
E
I
R
K
Y
Q
K
S
T
E
L
m m O O M G C m C 1 T K : m O A ~ G m ~ T C U : m G A C ~ O A C 300 C G
L
I
R
K
L
P
F
Q
R
L
V
R
E
I
A
Q
D
F
K
T
361 ~ ~ ~ T A C C M C C n : T G C ~ I T C A T G C T M G A G O G ~ C 42 A 0~ T O C V G L F E D T W L C A I E A K R V R I M
I T A ~ T O A ~ 421 C U L A ~ ~ A ~ ~ G C n : O ~ T G A ' I T A ~ ~ G A O C I T A 480 P K D I Q L A R M I R G E R A *
Gambar 20.
Susunan nukleotida den amam amino klon 60na.2114 yang lnenyandikan Hiatone H3. Kode aaam amino terletak di bawah suaunan nuklsotida.
Figure 2 0 . Nucleotide and amino a c i d sequence o f the -1114 clone enooded Histone X3. me amino a c i d sequence i s under the n u c l e o t i d e seqaence
0.
sativa
:
61
U I ~ P P Q R L V I ( E l l Q D F K T D L R F Q S S A V M L Q ~ A ~ V Q L F E ~ C I I ~120 RVT1
Gambar 21. Perbandingan asam amino Histone H3 kedelai terhadap Histone H3 tanaman lainnya. Figure 21.
antioksidan
.
Alignment of amino acidsequence of soybean Histone H3 with other plants Histone H3
Hasil ini dapat menjelaskan bahwa protein gmali20 mempunyai peran
dalam proteksi sel baik terhadap cekaman A1 maupun oksidasi. Susunan nukleotida hasil pengurutan dan asam aminonya tertera pada Gambar 22. Sedangkan perbandingan
asam amino penyusun Catalase tanaman kedelai dengan Catalase jagung ditunjukkan pada Gambar 23. Klon gmali49 berukuran 517 pb yang menyandikan 134 asam amino (kodon awal ATG-66-68 dan kodon akhir TAA=468-470). Dari penulusuran GeneBank/EMBL menunjukkan bahwa grnali49 mempunyai kesamaan dengan Dehydrogenase NADH dari Flexarnia picta (nomor akses U88510). Dehydrogenase NADH merupakan salah satu
enzim yang berperan di dalam transfer elektron dalarn proses oksidasi-reduksi untuk penyediaan sumber energi yang dibutuhkan dalam metabolisme tanaman khususnya
dalam siklus sitrat dan detoksifikasi cekaman oksidasi bersama-sama dengan beberapa senyawa antioksidan lainnya seperti Catalase, SOD (Superoxide Dismutase), GST (Gluthation S-Transferase), Peroxidase dan Phenylalanin Amonia Liase (PAL).
2 4 1 GTTATATGTCTTGGGGGATCCACTAGTTCTAAAGCGGCCCCCACCGCGQTGQAGCTCCAG3 0 0
V
I
C
L
G
G
S
T
S
S
K
A
A
A
T
A
V
E
L
Q
3 0 1 CTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTMTTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTT360
L
L
F
P
L
V
R
V
N
C
A
L
G
V
I
M
V
I
A
V
4 2 1 GTGTTAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACT 4 8 0
V
L
S
L
G
C
L
M
S
E
L
T
H
I
N
C
V
A
L
T
4 8 1 GCCCGCTTTCCAQTCGGGAWL!CTGTCGTGCCAGCTGCATTMTGAATCGGCClULCDCGC540
A
R
F
P
V
C
K
P
V
V
P
A
A
L
I
N
R
P
T
R
5 4 1 G G G G A G A G G C G G T T T G C G T A T T O O O C G C T C T T C C G C T T C T G A C G C T C 600
G
E
R
R
F
A
Y
W
A
L
B
R
F
L
A
H
D
'
S
L
R
6 0 1 TCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAACGGTATCAGCTCACTCMAGGCGGTMTACGGTTATCC660
S
V
661 A
V
R
L
I
A R
G
C
T
E
R
R
T
I
~ T
R
G
V
S
A
E
~ K
T
T
H
S
K
F
M Y
Q
T
A
V
I
K
G A
T
C
R
L
S
K
T D
Q
C
G 7 2 0G
7 2 1 U U I C C ( 3 ~ ~ T T Q C T o O C G T T T T T C C A T A G G G C a c C C C C C C C7T8 0~
K
P
*
Jenis enzim vanp daaat memotone: AciI
AluI
ApoI
DpnI
DraI
MseI
Not1
Sau3AI
EcoRI
H i m
TaqII
Jenis enzim vanp tidak dapat memotonp: AatII AccI
Mu1
PstI
RIoI PYUI
Gambar 22.
AhvNI SaZI
ApaI
SmaI
BgZII
Tag1
ClaI XbaI
on1
&I
Susunan nukleotida dan amam amino klon Oma1120 yang menyandikan Catalase.
Kode asam amino terlstak di bawah eueunan nukleotida. Figure 2 2 .
N u c l e o t i d e and amino a c i d sequence o f t h e gmali20 c l o n e encoded C a t a l a s e . The amino acid sequence i s under t h e n u c l e o t i d e sequence.
C
Kedelai
327
Jagung
478
LRAWRNHGHSCFLCEIVIRSQFHTTYEPEA 416 +RAWRNHGH CFLCEIVIRSQFHTTYEPEA IRAWRNHGHRCFLCEIVIRSQFHTTYEPEA 5 0 7
Gambar 23. Perbandingan asam amino Catalase kedelai terhadap Catalase tanaman jagung. Figure 23.
Alignment of amino acid sequence of soyheon's catalase with maize S catalase
Hasil ini menunjukkan bahwa cekaman A1 menstimulir penyediaan salah satu surnber energi dalam bentuk ATP melalui peningkatan aktivitas Dehydrogenase NADH untuk tetap mempertahankan kelancaran proses metabolisme tanaman. nukleotida clan asam aminonya tercantum pada Gambar 24.
Susunan
Sedangkan perbandiigan
asam amino penyusun Dehydrogenase NADH tanaman kedelai dengan Dehydrogenase NADH Flexamiapicta ditunjukkan pada Gambar 25 Untuk gmali50, urutan nukleotida dan deduksi asam aminonya tertera pada Gambar 26. Gen gmali50 mempunyai nukleotida sekitar 73 1 pb dengan "open reading
fiame/ORF" sepanjang 594 pb dengan start pada asam amino methionin (ATG kodon pada posisi nukleotida 65-67; TAA kodon pada posisi 656-658; dm mengandung 197
asam amino).
Hasil penelusuran menunjukkan bahwa gmali50 ini mempunyai
kesamaan dengan Auxin-Induced Protein GIycine mux (56% pada tingkat DNA dan 64% pada tingkat protein). Perbandingan asam amino penyandi Auxin Induced Protein
dari tanaman kedelai dengan Auxin Induced Protein tanaman lainnya ditunjukkan pa& Gambar 27. Fenomena ini mengindikasikan adanya peran auksin dalam proses toleransi terhadap cekaman Al. Empat dari lima klon tersebut, yalcni ATPase-proton Membran Plasma, Histone H3, Dehydrogenase NADH dan Auxin-Induced Protein merupakan temuan gen baru yang ekspresinya diinduksi oleh Al.
6 1 T T T A T ~ A T A A T ~ C T C A R A T A T A T A C A T T A A W G C C T A T T T A T T G A C C T T A1 T2 0 Y I I K K T Q I Y T L K A Y L L T L Y 121 ACGGCCAAACACCCTTACAARTTACTCCTATTCTAAGCTOCAATAAGATAATCCAAAATA 180 G Q T P L Q I T P I L S C N K I I Q N R
181 G M T A T T T T T T T C T A A A T T A C A A A T G A C G A T A A A T T A T T d C 2 4 0 I F F S K L Q M T I N Y C I P K I L N K 241 AGTCATGGAAACTGATAAACAAATTTACATTATGTAGTGAGACGATGTGGAMAATATGT 300 S W K L I N K F T L C S E T M C X N Y Y 3 0 1 ATAAGAAGGAAGGCAACTTCTCCAATTTTTTTTTTTTAATCCCTTCTGTTATTTTCTGTT 360 K K E G N F S N F F P L I P S V I F C L 361 TGTTATTATTATTTTATTYATTTTTTTTCTCTCTTTTMTTTGGGTGmmTTTTW 420 L L L F Y L F F F S L L I W V L N P Q R
421 G G C G A A T G T G C A A A T C C A C T G A W A W i T G C G T T C T D A 4 8 0 R M C K S T E K M R S E L N T *
4 8 1 AAAAAAAAAGGGCGGCCGTCGCGATCTAAAACTAGTC 517
Jenis enzim vang dapat memotong:
AciI
AluI
ApoI
CviRI
DdeI
DpnI
Haen Sau3AI
Ssp1 Tsp509
Jenis enzim vang tidak dapat memotonp:
AIwM ApaI BamHI BglZ SmaI Tag1 XhoI Gambar 24.
Figure 2 4 .
ClaI
DraI
MspI
Psi1
SaA Sfir
Susunan nukleotida dan asam amino klon Gmali49 yang menyandikan Dehydrogenase NADH. Kode asam amino terletak di bawah Susunan nukleotida. Nucleotide and amino a c i d sequence o f t h e gmali49 clone encoded NADH Dehydrogenase. The amino a c i d sequence i s under the n u c l e o t i d e sequence.
Kedelai: 261 CLSVSMTYLGFLVCNNLSSWI+KKINFOLSYCSLE*E'FVRVFDRIRSINRPLMY 91 CL +S+++L FL C++L +GL C + G IRSI++ + Y F. p i c t a : 9 5 CLEMSLSFLFFLCCSSLG---------IYGLMICGWSSNSIYSMU;CIRSIS~ISY 142
Gambar 25. Perbandingan asam amino Dehydrogenase NADH kedelai terhadap Dehydrogenase NADH Flexamiapicta. Figure 25.
Alignment of amino acidsequence of soy6erm's NADH Dehydrogenme with Flexamiapicta 's NADH Dehydrogenase
1TACTMTCCGCCAGCT~Wa06TGGTTDaTTWCACa~~TCATAC 60 A~ C2 0 M T C A G 61 O M ~ A T A Q C A G T A ~ ~ ~ G C A A ~ ~ D T A ~ T M T A C T A 1
X
I
A
V
Q
K
V
S
N
E
E
V
A
D
N
T
T
I
S
1 2 1 CACTCTTOCTMTTCT0000CGTPTGTCCAOOTTTCCATCU3ATDOA~CCTTACCIT~ 180
T
L
A
N
S
G
A
F
V
Q
V
S
I
D
G
A
P
Y
L
R
1 8 1 C M C a T D O A C C T C C C M T C C P A ~ G ~ A C A T M G A C T T A T C E C X T O C C T T D D2C 40 ~
K
V
D
L
P
M
Y
K
S
Y
I
R
L
I
G
C
L
G
Q
N
2 4 1 T G T T C A a C r C ~ C C A ~ T A C C T A T 0 0 0 0 C C C T A ~ ~ T A T A ~3 0 C0A ~ M A
V
Q
L
L
H
H
G
Y
L
W
G
P
R
N
D
I
F
M
N
D
T
D
301 TAGCAAATTGATGGATCTTCCTCCCAGCTCTOAGTATC(T
S
K
L
Y
D
L
P
P
S
S
E
Y
V
P
P
H
Q
N
360
3 6 1 TGGTGACTGGATGCTCGTGGGTGATGTCCCATGGQAGATGTTTGTGGTGGTCATGCAACC4 2 0
G
D
W
X
L
V
G
D
V
P
W
E
M
F
V
V
V
M
Q
P
4 2 1 O C C T ~ ~ T T A T C A A T O O A T C A ~ C D A T T G G T C C T T G C G T C ~ C A R G G4A 80 AA
P
G
E
I
M
N
G
S
E
T
I
G
P
C
V
Q
N
I
G
K
4 8 1 M T O ~ ~ ~ C C h A T A C A l r C G ~ C T A ~ Q A T C C C ( C P5 A 4 0C Q C
X
Q
K
Q
K
G
K
L
A
E
Y
N
V
L
R
E
I
P
Y
A
-
5 4 1 U L ~ C C T A T O O ~ T T A T A T C A C C C A C T T C M E C T A ~ C T A ~ C O O M T 600 QTT
T
G
P
X
E
Q
I
I
S
P
T
S
A
T
L
W
S
G
X
L
-
661 ~ O C ~ M C C T A T A ~ G T G T P E A D D A T G T ~ T C O T C C A 7 ~2T0 C C G 7 2 1 GATGGTATTTG 73 1
Jenis enzim vane d a ~ amemotong: t
AM
AciI
AluI
AheI
Sau3AI Tag11 Tthl 1111 XcmI
Apal
BccI
VePI
CviRI
DdeI
DpnI
Hid1
EcoRII
Jenis enzim vanP tidak davat memotong : AatU
ApoI
BamHI
BglI
Bsal
ClaI
DraI
EcoRI
en1
Not1
PstI
SalI
SmaI
Tag1
XbaI
XhoI
Gambar 26. Susunan nukleotida dan asam amino klon QnaliSO yang menyandikan Auxin Induced Protein. Kode asam amino terletak di bawah sueunan nukleotida. Figure 2 6 .
Nucleotide and amino acid sequence o f the gmali50 clone encoded Auxin Induced Protein. The amino acid sequence i s under the nucleotide sequence.
-
~~
~
-~
- - - - -
--
A. thaliana: 19 V R N Y R I ( N V H R N Q K S G B A G E A M S S G G G N A - - - - N K V S ~ R P Y L R K M ~ S Y K D L74 S V. radiacs : 77 IRSYR)(NNVQQRKBEESE--- - - - - - - --GNGMYVKVSWYLRKIDLKVYKSYPELL 125 P. sativvn 7 7 I R S Y R L M S L H E I \ D V G - - - - - - - - - - - - - - - - G I F W S ~ ~ R X I D L R W O G Y 120 SELL
.
A. thaliana: 75 D A L A ~ F ~ S P T H G ~ S Y G A Q G M I D F H N E S K V W L & S P E W P S ~ D W D D ~ L V G D V P W P M133 V. radidca :I26 ~ E l * r P K C - - - - - - - - - - - - - I F G E Y S E R E G Y N G S - E Y A P ~ E D K D O D W M L V G D V 172 PWNH P. sacivum :I21 W E T M F K L T - - - - - - - - - - - - - I G E Y S E H E G Y M S - E Y A P ~ B U 1 ( U O U W M L V G D V P W165 D-
Gambar 27. Perbandingan asam aminoAuxin Induced Protein kedelai terhadap Auxin Induced Protein taoaman lainnya Figure 27.
Alignment of amino acidsequence ofsoybean's Auxin Induced Protein with other plant's Aurin Induced Protein
Klon sapali mempunyai ukw:an 637 pb dengan 202 asam amino dan
menyandikan protein peptidase aminoacyl (posisi kodon awal ATG = 1-3 clan kodon akhir TAG = 607-609). Karena dalam ekspresinya gen ini terinduksi o1eh cekaman Al,
maka diberi nama sapali (Soybean gminoacyl peptidme gluminium induced). Hasil pengurutan nukleotida dan asam amino tercantum pada Gambar 28, dan perbandingan
asam amino penyandi peptidase aminoacyl kedelai dengan peptidase aminoacyl Arabidopsis thaliana ditunjukkan pa& Gambar 29. Adanya kesamaan klon sapali ini
dengan peptidase aminoacyl (salah satu jenis serine protease) Arabidopsis thaiiana mengindikasikan adanya peningkatan aktivitas enzim proteolitik khususnya peptidase aminoacyl oleh cekaman A1 untuk proses ketahanan terhadap aluminium
1
BTOOCAOCTACTCAOGAAGATGTGTACTCTDATCCCGGTTCTCCTAT~T~OOAGAACT 60 M A A T Q E D V Y S D P G S P W M R R T
61
CAAGCTGGGACATACATTATTGCCAGGATJAAGAAGGAAAGTGATGAAGGAAGATATATT 120 Q A G T Y I I A R I K K E S D E G R Y I
121
ATACTGAATGGAAATGGTGCTACACCAGAAGGAIACATTCCATTCCTTGATCTGTTTGAC 180 1 L N G N G A T P E G N I P F Y . D L F D
181
ATAAATACAGGTAAIUAAATGGAACGAATCTGGGAGAGCGATAAGGAGAAGTATTATGAG 240 I N T G K K M E R I W E S D K E K Y Y E
241
ACTGTTGTTGCTCTAATGTCTGATCAAGAAGAAGGGGATTTGTATTTAGATJAACTGAAG 300 T V V A L M S D Q E E G D L Y L D K L K
301
ATACTGACTTCTAAAGAGT~CTGAAAACACCCAATACTACTTTGTTAGCTGGCCA
I
361
481
K
E
S
K
T
E
N
T
Q
Y
Y
F
V
S
W
360
P
K
N
I
V
Q
V
T
N
F
P
H
P
Y
P
Q
L
A
S
L
480
CTACCACCAGGTTACAATCCATCAACAGATGGCCCTTTGCCATGCCTGGTTTGGTCTTAC 540 P
P
G
Y
N
P
S
T
D
G
P
L
P
C
L
V
W
S
Y
CCAGGAGAATTTAAGAACAAAGATGCTGCTGGACAAGTTCGTGGTCTCCARATGAATTTG 600 P
601
S
CAGAAAGAGATGATCAGATATGRRAGAAAAGACGGGGTTCAACTTACTGCTACATTATAC Q K E M I R Y E R K D G V Q L T A T L Y
L
541
T
GAT~CATAGTTCAGGTTA~TTTCCCTCATCCATACCCTCAGCTTDCATCATTG 420
D
421
L
G
E
F
K
N
K
D
A
A
G
Q
V
R
G
L
Q
M
N
L
CMOAATBEGCTCCACATCTTCCTGAGTAGCTGCCATCGCCCGAAACTTCATTCGTT L
E
*
Jenis enzim vane daaat memotong: Ah1 ApoI BsaI DdeI DpnI
MboII
Jenis enzim vane tidak daaat memotong: AatlZ AloZ ApaI A v d BarnHz BgU ~ p n z~ d e z Notl ~ s t l P V ~ S& SwaI TaqZ XbaI XhoZ XmnZ
Gambar 28.
MseI
Clal SmaI
TaqII
Tat1
XcmI
DraI EcoRZ Hindlll ~ p d~ p ssp1 h ~
Susunan nukleotida dan aeam amino klon Saali yang menyandikan Aminoacyl peptidaee Kode asam amino terletak di bawah sueunan nukleotida. Sekuen ini dapat diaksee pada Bank Den Data No. AF91304
Figure 28. Nucleotide and amino a c i d sequence of the s a p a l i Clone encoded Aminoacyl peptidase The amino acid sequnce i s under t h e nucleotide sequence. This sequence could be accessed i n GeneBank database no. AF91304.
.
G.max
1 5 4 QLTATLYLPPGYNPSTDGPLPCLVWSYPGEFKNKDAAGQVRG 195
A.thaliana
665 QLTATLYLPPGYDPSKDGPLPCLFWSYPGEFKSKDAAGQVR5 7 0 6
IIIIIIIIIIII.I1 1 1 1 1 1 1 1 1 l l l l l l l . l l f l l l l l l
Garnbar 29. Perbandingan asam amino peptidase aminoacyl kedelai dengan peptidase aminoacyl Arabidopsis thaliana. Figure 29.
Alignment of amino acid sequence of soybean's Aminoacylpeptidase Arabidopsis thaliana's Aminoacylpeptidme
IV. Studi Permulaan Ekspresi Klon cDNA di Escherichia coli Studi ini bertujuan untuk mengkaji peran Mon cDNA terpilih dalam sifat
ketoleranan terhadap cekaman aluminium di Escherichia coli pada taraf A1 yang bersif5t toksik baginya. Hasil percobaan terhadap penentuan kadar aluminium yang bersifat toksii bagi bakteri E. coli DHlOB memperliitkan bahwa : (1) pertumbuhan bakteri kontrol (tanpa a& vektor) menemui kematian hanya setelah diberi 100 ppm A1 (tanpa antibiotik), (2) pertumbuhan bakteri transforman (mengandung vektor pengklonan, pBluescript dan pGEM-T) mengalami p e n m a n pertumbuhan sampai 25% pada taraf A1 300ppm dan tidak &pat tumbuh pa& 500 ppm A1 (Gambar 30). Perbedaan pertumbuhan ini, antara bakteri kontrol dan transforman, disebabkan adanya peran vektor yang menghasilkan beberapa produk genlprotein seperti p-lactamase (resisten terhadap ampisilin) dan galaktosidase (akibat adanya induksi senyawa IPTG).
P-
Dengan hasil tersebut rnaka kadar A1 300 ppm digunakan untuk menentukan sifat ketoleranan klon-klon terpilih seperti gmalil, gmalil4, gmali20, gmali49, gmali50, dan
sapali. Hasil percobaan (Gambar 31, 32, 33, 34, 35 dan 36) mengindikasikan bahwa semua klon gen tersebut terlibat dalam sifat detoksifikasi terhadap cekaman Al, yang ditunjukkan oleh masih tumbuhnya bakteri sampai umur 48 jam.
Dengan kata lain,
produk dari klon gen tersebut diduga berperan di dalam meliidungi bakteri terhadap cekaman aluminium. Hasil awal ini sebagai dasar untuk pengujian lebii lanjut semua klon gen terhadap karakteristik protein produk hasil ekspresinya dengan menggunakan vektor ekspresi khusus, sekaligus peluang untuk membuat antibodiya untuk dipakai sebagai alat deteksi dini dan cepat terhadap seleksi galur-galur tanaman terhadap sifat ketoleranan aluminium.
Gambar 30. Pertumbuhan Ecoli DH103 (kontrol dan transforman) terhadap cekaman aluminium selama 24 jam Figure 30.
E
m of A1 slrcss to growth of EscherWIia CON DHlOB for 24 h
Jam
Gambar 31. Ekspresi Mon gmalil (PMA) selama 48 jam oleh cekaman 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB Figure 31.
Expression of thegmalil clone (PW)in Escherichia colt DHlOB by 300ppm A1for 48 h
Jam
1
Gambar 32. Ekspresi Mon gmalil4 @istone H3) selama 48 jam oleh Cekama 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB Figure 32.
Expression of thegmalil4 clone (Hisone H3) In Escherichia w l i DHIOB by 300ppm A1for 18 h
Gambar 33. Ekspresi klon gmali20 (Catalase) selama 48 jam oleh Cekama 300 ppm Al di Escherichia coli DHlOB Figure 33.
Expression of the gmalt20 clone (Catalase) in Escherichia coli DHl OB by 300 ppm A1for 48 h
INo Vec
N o nR
Jam
Gambar 34. Ekspresi klongmali49 (Dehydrogenase NADH)selama 48 jam oleh cekaman 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB Figure 34.
Expression of the gmali49 clone (NADHDehydrogenase) in Escherichia coli DHIOB by 3OOppm A1for 48 h
Gambar 35. Ekspresi Mon GmaliSO (Auxin induced protein) selama 48 jam-oleh cekaman 300 ppm Al di ~schhichiacoli DHlOB Figure 35.
fipression of the gmali50 clone (Auxin Induced Protein) in Escherichia c o ~Di H I O B 360ppm ~~ AIfor 48 h
Gambar 36. Ekspresi Mon sapali (soybean aminoacyl peptidase aluminium induced) selama 48 jam oleh cekaman 300 DDm Al di ~scherichiacoli DHGB
-
m
Figure 36. Expression of the sapali clone (soybean aminoaql peptidase aluminium induced) in Escherichia coli DHIOB by 300ppm A?for 48 h
