XX. CHRONICKÁ LYMFATICKÁ LEUKEMIE – přednášky 101. CLL S RIZIKOVÝMI FAKTORY LÉČENÁ FLUDARABINEM + CYKLOFOSFAMIDEM (F+CY) NEBO F+CY+ABMT Koza V.1, Vozobulová V.1, Černá K.1, Jindra P.1, Lysák D.1, Škopek P.1, Karas M.1, Gumulec J.2, Hausdorf P.3, Kessler P.4 1 HOO Plzeň, 2HO Nový Jičín, 3Int.odd. Český Krumlov, 4HTO Pelhřimov V léčbě CLL se uplatňují nové postupy - purin. analoga, monokl. protilátky, ABMT a aloBMT. Stanovení optimální léčeby však chybí. Cíl: Srovnat riziko relapsu a DFS u CLL léčené F+CY a F+CY+ABMT. Metoda: Nově dg. pac. s CLL Rai st.III/IV nebo st. I/II a rizik. faktorem léčeni max. 6 cykly F+CY 30 mg/m2 + 250 mg/m2 1.-3 d. á 4 týdny Při dosažení CR nebo PRnod indikována ABMT po přípravě HD CY. Nemobilizující pac. a/nebo nesouhlasící s ABMT pouze sledováni. Výsledky: Do září 2002 analyzováno 70 pac. Po F+CY dosaženo 63x (90%) CR nebo PRnod, 4x PR, 1x resist., 3 pac. ztraceni. 42 pac. v CR+PRnod pouze sledováno (F+CY sk.), 21 následně transplantováno (F+CY+ABMT sk.). DFS 3 roky obou sk. bez signif. rozdílu (49%vs66%, p=0,2592). Ovšem F+CY sk. sestávala z 19 pac. s histol., IgH a FACS negat. dření po léčbě a 23 pac. s alespoň 1 pozitivitou se signif. rozdílným DFS 3 roky obou podskupin (71%vs33%, p=0,008). Rovněž F+CY+ABMT skupina sestávala ze 3 pac. s histol., IgH a FACS negat. dření před ABMT - všichni bez známek nemoci v době hodnocení - a 18 pac. s alespoň 1 pozitivitou před transplantací s DFS 3 roky 62%. Srovnání 23 pac. residuálně pozit. v F+CY skupině a dále neléčených a 18 pac. residuálně pozit. po F+CY a následně transplantovaných, vykázalo signif. rozdílný DFS 3 roky (33%vs60%, p=0,0684). ABMT konvertovala 13 pac. (72%) s resid. pozit. dření před transplantací v kompletní negativitu. DFS 3 roky 13 konvertovaných vs 5 pozit. i po ABMT 60% vs 0%. Závěry: 1. 90% CLL dosáhne po F+CY CR+PRnod, 28% s histol., IgH a FACS negat. dření. 2. Další léčba kompl. negat. pac. zůstává spekulativní. Vyléčení části z nich nelze vyloučit (DFS 3 roky bez ABMT 71%, po ABMT 100%). 3. U pac. s resid. infiltrací dřeně po F+CY zlepšuje DFS následná ABMT (33%vs62%). 4. U pac. pozit. i po ABMT (DFS 3 roky 0%) je na místě jiná terapii (BMT, RIT, imuno). 102. CHROMOZOMOVÉ ZMĚNY U B-CLL A JEJICH PROGNOSTICKÝ VÝZNAM Šindelářová L.1, Michalová K.1,2, Zemanová Z.1, Březinová J.2, Kurková Š.2, Karban J.3, Smolíková A.4, Schwarz J.2, Cmunt E.3 1 Centrum nádorové cytogenetiky ÚKBLD VFN a 1.LF UK, 2Ústav hematologie a krevní transfuze, 31. Interní klinika VFN a 1. LF UK, 4KlinLab spol. s r.o., Praha B-chronická lymfatická leukémie (B-CLL) je nejčastější forma leukémie dospělých západní polokoule. Je charakterizována klonálními chromozomovými abnormalitami, které nacházíme u více než 50% vyšetřovaných pacientů. Nejčastější chromozomové změny jsou delece 13q14, trisomie 12 a delece 17p13. Cílem studie je identifikace chromozomových změn u pacientů s B-CLL molekulárně-cytogenetickou metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a stanovení jejich vztahu pro průběh onemocnění.S použitím DNA sond pro lokusy 13q14, 17p13 a centromerickou oblast chromozomu 12 (VYSISTM) jsme během posledních pěti let vyšetřili metodou
interfázické FISH (I-FISH) z kostní dřeně a/nebo z nátěrů periferní krve 214 nemocných s B-CLL (129 mužů, 85 žen, průměrný věk 61,6 let). Hodnota „cut-off level“ (dělícího bodu, od kterého považujeme nálezy za pozitivní) byla stanovena vyšetřením kontrolního souboru na 2,5%. Trisomie 12 byla nalezena u 37 (17,3%) z 214 nemocných. Vyšetření na deleci 13q14 bylo provedeno u 208 pacientů a byla prokázána u 110 (52,9%). Delece oblasti 17p13 byla nalezena u 33 (16,1%) nemocných z 205 vyšetřených. Budou prezentovány korelace molekulárněcytogenetických nálezů s klinickým průběhem onemocnění a dalšími rizikovými faktory. Opakovaně bylo vyšetřeno 25 pacientů u kterých bude sledována změna rozsahu patologického klonu v závislosti na klinickém stavu. Diskutován bude význam rozsahu buněčných klonů s chromozomovými změnami pro klinický stav a zhodnocení významu kombinovaných chromosomových změn u nemocných s BCLL. Tato práce byla podporována granty IGA MZ ČR NC 6470-3/2001 a J 13/98 1111 0000 4 MŠMT ČR 103. SYBR-GREEN-BASED REAL-TIME PCR QUANTITATIVE DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA Peková S.1, 2, Marková J.1, Pajer P.2, Dvořák M.2, Starostka D.3, Cetkovský P.1, Schwarz J.1 1 Institute of Hematology and Blood Transfusion, Prague, Czech Republic, 2Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, 3Dept. Of Clinical Hematology, Havířov Hospital, Havířov, Czech Republic Patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) tend to relapse even after aggressive therapies and autografts. We assumed that to prevent relapses, the level of minimal residual disease should be minimized as much as possible. To evaluate MRD precisely, highly sensitive quantitative assays are urgently needed. In the present study, for the diagnostic identification of IgVH families (as a prerequisite for later detection of MRD), a touch-down RT-PCR method using degenerated primers was introduced, allowing successful IgVH family identification in 147/150 (98%) diagnostic CLL samples. Biclonal CLL was found in 12/150 (8 %) cases. To study MRD, we have developed a real-time RT-PCR assay using patient-specific primers and the cost-saving Sybr-Green reporter dye for quantifications of the IgVH genes in 12 CLL patients. For precise quantification and calibration of the assay, cloned patient-specific IgVH sequences were used. Data are presented to demonstrate high specificity and sensitivity (10-6) of the assay. We could demonstrate MRD in 4/4 CLL patients following autologous and 1 patient after allogeneic hematopoietic stem cell "mini"-transplant. However, RQ-PCR negativity could be reached in a patient treated by fludarabine-cyclophosphamide-rituximab. We advocate our PCR methods for further clinical studies. 104. NEÚČINNOST „VYSOCEDÁVKOVANÉHO“ G-CSF JAKO 2. „REMOBILIZAČNÍHO“ REŽIMU U NEMOCNÝCH S CLL LÉČENÝCH FLU+CY Jindra P., Koza V., Lysák D., Vozobulová V., Černá K. Hematologicko-onkologické oddělení FN Plzeň
Úvod: Fludarabin (FLU) a cyklofosfamid (CY) s následnou autologní transplantací krvetvorných buněk (ASCT) je již obecně akceptovanou primoléčbou progn. nepříznivé CLL. Opakovaně byl však doložen nepříznivý vliv FLU (±CY) na mobilizaci periferních krvetvorných buněk (PBPC). Pokusili jsme zhodnotit mobilizační účinnost samostatných vysokých dávek (HD) G-CSF jako remobilizačního režimu u nemocných s CLL u nichž selhala 1. mobilizace. Metodika a výsledky: 11 nem. s progn. nepříznivou CLL (med. věku 56 let, 41-65) bylo vstupně uniformně léčeno kombinací FLU +CY (FLU 30 mg/ m2 den 1-3, CY 250 mg/ m2 den 1-3) až do maximální odpovědi. Po mediánu 5 (4-6) podaných výše uvedených cyklů léčby všichni dosáhli minimálně nodulární PR, 5 z nich dokonce CR. Pokus o 1. mobilizaci (CY 3 g/m2 + filgrastim 5µg/kg) byl proveden s 2-3 měsíčním odstupem (med. 2) po posledním cyklu FLU-CY, u všech mobilizace selhala (tj.<10 CD34+/µl nebo výtěžek<2x106CD34+/kg) při následujících hodnotách: med. maxim vyplavených CD 34+ byl 4/µl (4-9) a došlo k němu 10-16 dnů (med. 13) po CY.Pokus o 2. mobilizaci byl proveden 3-12 měsíců (med. 7) po 1. mobilizaci a 5-15 měsíců (med. 9) od posledního cyklu FLU-CY, tentokrát pouze HD G-CSF (filgrastim, 20-25 µg/kg). Léčebná odpověď dosažená FLU-CY trvala u všech nem. Med. max. počtu CD 34+ po HD G-CSF byl 3/µl (1-11) a došlo k němu v med. 5 dní od zahájení G-CSF. U 3 pac. byla zahájena feréza, ale s nedostatečnými výtěžky: 0,54 megaCD34/kg, 0,56 megaCD34/kg a 0,95 megaCD34/kg . Rozdíl maxim vyplavených CD 34+ mezi oběma mobilizačními režimy statisticky nevýznamný. Závěr: 1. Mobilizace HD GCSF není u těchto pacientů účinná 2. Účinnější režim a/nebo delší doba od FLU jsou nezbytné. 3. Protokoly CLL využívající FLU a ASCT musí kalkulovat s dlouhotrvajícím a relativně resistentním postižením mobilizace PBPC u části nemocných. 105. ANALÝZA GENU TĔŽKĖHO ŘETĔZCE IMUNOGLOBULINŮ U PACIENTŮ S CHRONICKOU LYMFATICKOU LEUKEMIĺ Kuhrová V., Francová H., Brychtová Y., Doubek M., Zapletalová P., Mayer J., Dvořáková D. Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika FN Brno B-buněčná chronická lymfatická leukemie (B-CLL) je nejčastější formou leukemie dospělého věku a zahrnuje asi 30% všech případů. Klinicky má variabilní průběh a na základě současných znalostí je rozdělována do dvou subtypů, vznikajících 1. akumulací monoklonálních B buněk s výskytem malých CD5+ a CD23+ zralých lymfocytů, svědčících pro maligní transformaci naivních buněk 2. v důsledku somatických mutací ve variabilní oblasti těžkého Ig řetězce v germinálním centru a svědčících pro maligní transformaci paměťových buněk. V naší práci jsme aplikovali jako významný prognostický faktor pro průběh a délku přežití pacientů determinaci mutačního statusu s kalkulací hypermutací variabilního segmentu v oblasti FR1 a FR3. Z krve byla izolovaná RNA, reverzní transkripcí připravena cDNA a po amplifikací přeskupených „family“ specifických VH-D-JH genů metodou PCR byla provedena sekvenace DNA. Pomocí programu DNA PLOT a IMGT databáze jsme stanovili typ klonální expanze a procento homologie s nejbližší zárodeční linií. Současně jsme na základě exprese Ig isotypu potvrdili subtyp B-CLL. U pacientů s < 2% mutací a s méně diferencovanými naivními buňkami, které mají větší maligní potenciál, se
předpokládá agresivnější průběh onemocnění a kratší přežití než u pacientů s >5 % mutací a s postgerminálními paměťovými buňkami. Tato práce je podporována VZ MZ č.00065269705 106. ANALÝZA KLONALITY TCR GAMA A IGH V MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ LABORATOŘI ŠIKLOVA PATOLOGICKO-ANATOMICKÉHO ÚSTAVU V PLZNI V LETECH 1999 – 2002 Šíma R.1, Vaněček T.1, Boudová L.1, Michal M.1, Jindra P.2 1 Šiklův patologicko anatomický ústav FN Plzeň, 2Hematologicko onkologické oddělení FN Plzeň V posledních letech nabývají molekulárně biologické metody ve vyšetření nádorových onemocnění stále většího významu. Analýza klonality IgH a TCR gama přispívá významnou měrou k rychlé a přesné diagnostice lymfoidních malignit, která je kritická pro další osud pacientů. Genové segmenty VH, DH, JH, CH kódující jednotlivé stavební složky genů IgH jsou lokalizovány na chromozómu 14. Subgeny Vγ, Jγ, Cγ kódující složky receptoru TCR gama jsou umístěny na chromozómu 7. Tyto segmenty obou genů podléhají během dozrávání B a T lymfocytů genovým přesmykům a sekvence rearanžovaných IgH a TCR genů je specifická pro každou klonální populaci. Toho využívají citlivé PCR metody amplifikující fragmenty těchto genů, které lze využít k detekci monoklonality v lymfatických uzlinách, krvi, či kostní dřeni. V Laboratoři speciálních analýz při FN Plzeň jsme od roku 1999 vyšetřili pomocí molekulárních metod téměř 2000 pacientů. K analýze klonality IgH používáme tři různé PCR metody, lišící se velikostí amplifikované oblasti, která zahrnuje regiony VH, DH a JH. Produkty reakcí jsou vizualizovány na high-resolution agarose. Vyšetření klonality TCR gama provádíme pomocí multiplex PCR se směsí 12 primerů, z nichž devět se váže k různým segmentům Vγ a zbývající tři jsou komplementární s různými oblastmi Jγ. Produkty PCR jsou analyzovány teplotní gradientovou gelovou elektroforézou (TGGE). Ve sporných případech provádíme u obou vyšetření doplňkovou analýzu na automatickém analyzátoru fragmentů Alf Express.
P - VI. CHRONICKÁ LYMFATICKÁ LEUKEMIE – postery P34. MOBLIZACE HEMOPOETICKÝCH PROGENITOROVÝCH BUNĚK U NEMOCNÝCH S CLL PO LÉČBĚ FLUDARABINEM Lysák D., Vozobulová V., Koza V. Hematologicko- onkologické oddělení FN Plzeň Úvod: Cílem studie bylo analyzovat faktory ovlivňující mobilizovatelnost autologního štěpu u nemocných s CLL po léčbě fludarabinem. Metoda: Hodnotili jsme mobilizovatelnost hemopoetických progenitorových buněk u nemocných (n = 44, median věku 56 let) léčených kombinovanou chemoterapií fludarabinem a cyklofosfamidem (FLU 30 mg/m2 + CY 250 mg/m2, 3 dny). Jako stimulační režim byl použit CY 3 g/m2 a G-CSF 10 µg/kg/den, interval mezi poslední
chemoterapií a mobilizací byl u všech nemocných obdobný (median 76 dní). Porovnávali jsme rozdíly mezi skupinou úspěšně (> 2.0 x 106 CD34+ bb./kg) a neúspěšně mobilizovaných. Výsledky: Dostatečný štěp se podařilo získat u 45 % nemocných, u 55 % bylo konstatováno selhání mobilizace. Průměrné množství CD34+ bb. získaných u úspěšných mobilizací bylo 3.8 x 106/kg (SD 2.26), nejčastěji 2 aferezami (1- 5) v den 10. a 11. Skupina úspěšně mobilizovaných byla charakterizována nižším klinickým stadiem onemocnění v době diagnozy (Rai I-II: 85 % vs 67 %, ns), menším počtem dávek FLU (> 4 cykly: 20 % vs 50 %, p = 0.06) a méně frekventní kompletní odpovědí v době primingu (CR 15 % vs 37 %, ns). Dynamika hladin leukocytů a CD34+ bb. sledovaných v periferní krvi mezi 8. a 14. dnem stimulace G-CSF byla u úspěšně mobilizovaných nápadně strmější. Hladina cirkulujících progenitorů > 5/µl v den +10 umožňovala predikovat výsledek stimulace (mean cirk. CD34+ bb. den +10: úspěšně mob. 17.3/µl, neúspěšně mob. 1.8/µl). Opakování stimulace ve skupině neúspěšně mobilizovaných pomocí samostatného G-CSF (20 µg/kg/den) bylo bez efektu (9 nemocných). Závěr: Pravděpodobnost úspěšné mobilizace pozitivně koreluje s nízkým počtem předchozích chemoterapeutických cyklů a s nižším klinickým stadiem onemocnění v době diagnozy. Léčba fludarabinem kompromituje mobilizovatelnost HPC u části nemocných s CLL. Použití agresivnějších mobilizačních režimů (DexaBEAM apod.) může zvýšit počet úspěšných primingů. P35. EXPRESE PROTEINU ZAP-70 INDIKUJE SUBTYP B-CLL S VÝRAZNĚ HORŠÍ PROGNÓZOU Trbušek M., Borská R., Bukovská S., Mayer J. Centrum molekulární biologie a genové terapie, IHOK, FN Brno Chronická lymfatická leukémie (CLL) je nejčastější leukémie diagnostikovaná v západním světě. Navzdory této skutečnosti není její molekulární patogeneze příliš jasná. Je to způsobeno zejména tím, že pro maligní transformaci B-lymfocytů nestačí endogenní mutace v rakovinné buňce samotné (ty jsou však nutným předpokladem), ale nezbytné je i spolupůsobení signálních drah některých dalších krevních buněk. Rovněž účinná léčba této choroby není dosud navržena. Buňky B-CLL jsou rezistentní ke klasickým cytostatikům interferujícím se syntézou DNA nebo indukujícím její poškození. Je bezpečně prokázáno, že existují dva základní subtypy B-CLL s výrazně odlišnou agresivitou a délkou doby přežití. B-CLL vzniklá z B-lymfocytů, které ještě neprošly germinálním centrem je agresivní a pacienti mohou očekávat střední dobu přežití 8 let. B-CLL vzniklá z B-lymfocytů, které prošly germinálním centrem má výrazně lepší prognózu a průběh, se střední dobou přežití 25 let. Protože v germinálním centru jsou B-lymfocyty vystaveny indukci somatických hypermutací v imunoglobulinovém lokusu, lze je na základě stanovení frekvence mutací v IgH rozlišit. Toto stanovení je však metodicky obtížné, zahrnující multiplex-PCR, sekvenování a počítačovou analýzu frekvence mutací. V poslední době bylo vytipováno několik genů, jejichž exprese (zdá se) velmi dobře koreluje se subtypy B-CLL. Nejlepší korelace (téměř 100%) se dosud jeví mezi silnou expresí proteinu ZAP-70 a agresivní, IgH-nemutovanou formou B-CLL. Prezentujeme jednoduchou metodu detekce exprese proteinu ZAP-70, Western-bloting s protilátkou specifickou pro tento protein. Protože na našem pracovišti detekujeme rovněž
mutace v IgH lokusu, diskutujeme i naše předběžné výsledky týkající se korelace mezi expresí proteinu ZAP-70 a mutacemi v IgH lokusu. P36. NAŠE ZKUŠENOST S PODÁNÍM MABCAMPATH U PACIENTKY S CLL Brejcha M., Gumulec J., *Papajík T. Onkologické centum J.G. Mendela, Nový Jičín, *Hemato-onkologická klinika FN Olomouc Pacientka (M. Ž. 1942) s anamnezou resekce sigmoidea pro karcinom v r. 1992 s následnou chemoterapií, byla sledována od IX/97 v naší ambulanci pro chronickou lymfatickou leukemii.V r. 1998 byla pro progresi leukocytosy a B symptomy léčena Leukeranem s dosažením hematologické odpovědi. Od IX/00 bylo pro vzestup leukocytů, splenomegalii a trombocytopenii podáno 6 cyklů fludarabinu v monoterapii. Došlo k úpravě leukocytosy a vymizení splenomegalie, stále přetrvávala lehká trombocytopenie. Pro opětovný vzestup leukocytů a zvětšení sleziny byly v I/02 podány 4 cykly MabThery s dosažením normálního počtu leukocytů a vymizení splenomegalie. Léčbu MabTherou pacientka tolerovala bez potíží. Od IV/02 byl patrný opětovný nástup počtu leukocytů a zvětšování sleziny. XII/02 bylo zahájeno podávání MabCampath i.v. ve standartním dávkování. Při každé aplikaci došlo k přechodné třesavce, zimnici a vzestupu teploty. Stav se podařilo vždy upravit krátkým přerušením infuze a podáním paracetamolu. V krevním obrazu bylo patrné snížení počtu lymfocytů, došlo ke zmenšení velikosti sleziny z 12 na 3 cm pod oblouk žeberní. Po třech týdnech byla léčba přerušena pro neutropenii, která byla upravena podáváním leukocytárních růstových faktorů. Při opětovném zahájení podávání MabCampath i.v. došlo k přechodnému poklesu krevního tlaku, opět zimnice a třesavka. Proto další dávky léku byly podány s.c. Podkožní aplikaci pacientka snášela zcela bez potíží, třesavka ani zimnice se při tomto způsobu podání neobjevily. Po dalších 5-ti týdnech podávání MabCampath byla pacientka hospitalizována pro febrilní neutropenii. Nyní je pacientka observována, v krevním obraze je patrná lymfopenie, přetrvává mírná splenomegalie. Závěr: Naše zkušenost s podáním MabCampath u CLL ukazuje na výrazně lepší toleranci s.c. aplikace ve srovnání s i.v. podáním.
