Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní obor: Biologie
Dagmar Bezděková
Využití nanovlákenných nosičů pro regeneraci cév Applications of nanofiber scaffolds for blood vessel regeneration
Bakalářská práce
Vedoucí práce: Doc. RNDr. Evžen Amler, CSc. Praha, 2011
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze, 8. 5. 2011
Podpis
Chtěla bych poděkovat vedoucímu práce Doc. RNDr. Evženovi Amlerovi, CSc. a dále také Mgr. Matěji Buzgovi za četné konzultace a trpělivost.
Abstrakt Systémů pro cévní regeneraci bylo vyvinuto již mnoho, žádný však zatím není úspěšný v použití pro náhrady cév s průměrem menším než 6 mm. Syntetické materiály jako Dacron a ePTFE sice mají dobré výsledky v nahrazení velkých cév, u malých cév ale způsobují trombózu. Navíc nejsou degradabilní, takže neumožňují přirozenou remodelaci cévního systému. Navíc na tyto materiály neadherují endoteliální buňky, které jsou esenciální pro vytvoření přirozené antitrombogenní vrstvy, ani hladké svalové buňky. Xenogenní decelularizované štěpy jsou další, nesyntetickou alternativou pro vytváření náhrad. Příhodný detergent odstraní buňky dárce a zbude pouze extracelulární matrix, kde mohou být poté kultivovány hostitelské buňky. Nevýhodou xenogenních štěpů je náročnost na výchovu zvířecích donorů a porušení struktury extracelulární matrix po použití detergentu. Jako nejpříhodnější materiál se zatím jeví nosiče vytvořené elektrostatickým zvlákňováním. Relativně jednoduchý proces se může různými způsoby modifikovat a vytvoří se tak nosič, který strukturou připomíná extracelulární matrix. Velikou výhodou je možnost inkorporace bioaktivních látek do jádra vlákna, takže slouží jako atraktant pro cévní buňky, nebo jako antikoagulační faktory. V kombinaci s využitím progenitorových buněk se zdá být elektrostatické zvlákňování velkou nadějí pro regeneraci malých cév.
Klíčová slova: Elektrostatické zvlákňování, fyziologie cévy, endoteliální buňky, hladké svalové buňky, progenitorové buňky, regenerace cév.
1
Abstract Although plenty of systems for vessel regeneration have been developed, no system is successful in small diameter (under 6 mm) vessel replacement yet. Synthetic materials, such as Dacron and ePTFE, have good results in large vessels replacement, but they cause thrombosis in small vessels. In addition, they are not degradable and do not allow a natural remodeling of the vessel system. Furthemore, endothelial cells, which are essential for creating natural antithrombogenic endothelium, do not adhere on these materials, as well as smooth muscle cells. Decellularized xenogenic material is the non-synthetic alternative for vessel regeneration. Appropriate detergent removes donor’s cells and only extracellular matrix remains, which is able to host acceptor’s cells. The main disadvantages of this system are difficulties with animal’s nurture and structure violations after detergent is used. It appears that electrospun materials are the best alternative. The relatively simple process can be modified in many ways and provides then a scaffold, which mimics extracellular matrix. A big advantage of this process is the possibility to incorporate bioactive substances into a fiber. The substances serve there as an attractant for blood cells or as an anticoagulation factor. In combination with the progenitor cells seems electrospinning to be the great hope for the regeneration of small vessels.
Key words: Electrospinning, blood-vessel physiology, endothelial cells, smooth muscle cells, progenitor cells, vessel regeneration.
2
Obsah Seznam zkratek .......................................................................................................................... 4 1.
Úvod.................................................................................................................................... 5
2.
Elektrostatické zvlákňování ................................................................................................ 6 2.1
Princip elektrostatického zvlákňování......................................................................... 6
2.2
Faktory ovlivňující zvlákňování.................................................................................. 7
2.2.1
Environmentální faktory ...................................................................................... 7
2.2.2
Vlastnosti polymerního roztoku ........................................................................... 8
2.3
3.
2.3.1
Kapilární............................................................................................................... 9
2.3.2
Zvlákňování z hladiny.......................................................................................... 9
2.3.3
Koaxiální zvlákňování........................................................................................ 10
2.4
Kolektory ................................................................................................................... 10
2.5
Používané materiály .................................................................................................. 12
Anatomie a fyziologie cévy .............................................................................................. 12 3.1
Endoteliální buňky jako stavební složka cév............................................................. 14
3.1.1
Růstový faktor VEGF......................................................................................... 14
3.1.2
Základní adhezivní molekuly endoteliálních buněk........................................... 15
3.2 4.
Systémy ....................................................................................................................... 9
Hladké svalové buňky ............................................................................................... 15
Regenerace cév ................................................................................................................. 17 4.1
Systémy cévní regenerace ......................................................................................... 17
4.1.1
Dacron a ePTFE ................................................................................................. 17
4.1.2
Decelularizované xenogenní štěpy..................................................................... 18
4.2
Nosiče vytvořené elektrostatickým zvlákňováním.................................................... 18
4.2.1
Struktura cévy vytvořené nanovlákennými nosiči ............................................. 19
4.2.2
Materiály a povrchová úprava zvlákněných nosičů ........................................... 21
5.
Shrnutí............................................................................................................................... 23
6.
Závěr ................................................................................................................................. 25
7.
Seznam použité literatury.................................................................................................. 26
3
Seznam zkratek Dacron
polyethylene tetraphtalate
EC
endothelial cell
ECM
extracelular matrix
EPC
endothelial progenitor cell
ePTFE
extended polytertafluorethylene
ICAM-1
inter celular adhesion molecule
IL-1
interleukin-1
LFA-1
lymphocyte function - associated molecule
NO
oxid dusnatý
PCL
poly (ε-caprolactone)
PLLA
poly (lactid acid)
PU
poly (urethane)
PVA
poly (vinylalcohol)
SMC
smooth muscle cell
SOC
smooth muscle outgrowth cell
SPC
smooth muscle progenitor cell
TNF-α
tumor necrosis factor alpha
VCAM-1
vascular cell adhesion molecule
VEGF
vascular endothelial growth factor
VEGFR-1,2
vascular endothelial growth factor receptor
4
1. Úvod Na následky kardiovaskulárních chorob ročně zemře téměř osm milionů lidí1, dalších mnoho milionů se s tímto onemocněním léčí. Nejčastější příčinou kardiovaskulárních chorob je arteroskleróza, kdy plaky usazené v lumen cévy zužují její průchodnost a tím vedou ke zdravotním obtížím. Kvůli rozvinuté arteroskleróze nebo předchozímu chirurgickému zákroku nemá celá třetina pacientů dostatečně vitální cévy, které se daly použít k vytvoření bypassu. Přestože bylo během let vyvinuto několik systémů cévní regenerace, hlavním problémem je stále vytvoření příhodného umělého štěpu. Tento štěp by měl nativní cévu co nejvíce napodobovat v mechanických vlastnostech, aby byl schopen vydržet vysoký krevní tlak a také by měl vytvořit přirozené prostředí, aby nedocházelo k vzniku trombů a imunitní reakci. Proto je důraz kladen na tvorbu nosičů z biokompatibilních materiálů, které umožňují růst endoteliálních buněk na svém povrchu a tím vytváří přirozeně antitrombogenní prostředí. Dále je důležitá i biodegradabilita, díky které dochází k přirozenému růstu a remodelaci cévního systému spolu s pacientem. V posledních letech vzrostl zájem o techniku elektrostatického zvlákňování, neboť tímto poměrně jednoduchým procesem lze vytvořit vlákenný nosič, který napodobuje strukturu extracelulární matrix. Tato práce se bude zabývat využitím elektrostatického zvlákňování v cévní regeneraci a porovnáním se současnými systémy.
1
World Health Organisation: Cardiovascular diseases (CVDs), [on-line], 2011, [cit. 2011-05-07], dostupné z www: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/en/index.html.
5
2. Elektrostatické zvlákňování Elektrostatické zvlákňování je všestranný výrobní proces produkující kontinuální vlákna, jejichž průměr se pohybuje v rozmezí několika mikrometrů až desítek nanometrů. Elektrostatickým zvlákňováním lze připravit vlákna ze široké škály materiálů, jak syntetických, tak přírodních. Dodnes bylo zvlákněno více jako dvě stě polymerů [1]. Tento jev, kdy je z roztoku vytažena kapilární tryska působením silného elektrického pole prvně pozoroval v roce 1897 Rayleigh. Detailně ji poté studoval Zelený a tato technika byla patentována Formhalsem v roce 1934 [2]. Základem oboru se nakonec stala Taylorova práce o elektricky řízených tryskách [3]. V posledních letech výrazně vzrostl zájem o tuto metodu, neboť jednoduchost, univerzálnost a možnost modifikovat povrch materiálu činí elektrostatické zvlákňování velmi atraktivní pro mnoho různých oborů, kterými jsou například farmacie, kosmetika a textilní průmysl. Systémy vytvořené elektrostatickým zvlákňováním nacházejí uplatnění také v oborech jako je biomedicína a tkáňové inženýrství. Nanovlákenné materiály vytvořené touto technikou se využívají například v řízeném dodávání bioaktivních látek, hojení ran, regeneraci cév, kostí, nervů a imobilizaci enzymů [4]. Tyto systémy využívají vlastnosti připraveného materiálu, kdy velký poměr povrchu a objemu připomíná přírodní strukturu extracelulární matrix (ECM). Nanovlákenné materiály se také vyznačují vysokou porozitou, což umožňuje buňkám usadit se i uvnitř nosiče. Porozita je také důležitá pro výměnu plynů, difuzi živin a odvod odpadních látek. Vlákna vytvořená z vhodných polymerů navíc zajišťují biokompatibilitu, čímž se redukuje imunitní reakce pacienta. Neméně významnou vlastností je možnost vytvoření biodegradabilního nosiče, který organismus rozloží na nereaktivní monomery, ty vyloučí nebo dále metabolizuje, a tak již není nutný další chirurgický zásah pro vyjmutí nosiče [5]. 2.1
Princip elektrostatického zvlákňování Principem elektrostatického zvlákňování je působení silného elektromagnetického
pole na roztok polymeru nebo jeho taveninu [2]. Elektrostatické síly vznikají působením přitažlivých sil mezi záporně nabitou zvlákňovací elektrodou s naneseným roztokem polymeru a opačně nabitým kolektorem. V důsledku působení silného elektrického pole se mění povrchová struktura kapaliny. Taylorův kužel se tvoří při rovnovážném stavu mezi elektrostatickými silami a povrchovým napětím kapaliny. Když elektrostatické síly převáží nad povrchovým napětím, dochází k vypuzení polymerní kapky a vzniku vlákenné trysky [6]. Vlákenné trysky vznikající z Taylorova kužele jsou sice v jeho blízkosti stabilní, ale s rostoucí 6
vzdáleností se postupně destabilizují. Tato nestabilita se projeví prodloužení délky letu vlákna od zvlákňovací elektrody ke kolektoru a tím se usnadňuje vypařování rozpouštědla. Během letu dochází ke zrychlení polymerní kapky v elektrickém poli a její prodloužení, které vede ke vzniku dlouhých a tenkých vláken. Takto vzniklá vlákna jsou zachytávána na kolektoru [1, 6]. Základní vybavení pro elektrostatické zvlákňování je vysokonapěťový zdroj, kladně nabitá zvlákňovací elektroda (nejčastěji kapilára) a kolektor zachytávající vytvářená vlákna (Obr. 1)
Obr. 1: Schéma vybavení pro elektrostatické zvlákňování. Převzato z [2] a upraveno.
2.2 Faktory ovlivňující zvlákňování Elektrostatického zvlákňování je velmi komplexní proces, a proto je ovlivněn celou řadou parametrů. Tyto parametry ovlivňují vznik vlákenných trysek, průměr vláken a neposledně také jejich morfologii. Dají se rozdělit do dvou skupin, na faktory environmentální a vlastnosti polymerního roztoku [5]. 2.2.1
Environmentální faktory Základním parametrem pro vznik procesu elektrostatického zvlákňování je aplikované
napětí. Při příliš nízkém napětí elektrostatické síly nepřekonají povrchové napětí polymerního roztoku, tudíž nedochází k tvorbě vláken. Naopak velmi vysoké napětí může způsobit to, že vlákno se netvoří kontinuální, ale v kuličkových formacích [7]. Ve většině případů vyšší aplikované napětí způsobí větší natahování vlákna a tím redukci jeho průměru [2].
7
Vzdušná vlhkost a teplota ovlivňují proces hlavně tím, že působí na odpařování rozpouštědla. Vysoká vlhkost způsobuje nedostatečné odpaření rozpouštědla, takže se na kolektor ukládá nezaschnutý roztok. Vysoká teplota zase může způsobit velmi rychlé odpaření a tím zaschnutí polymeru na zvlákňovací elektrodě [6]. Vzdálenost kapilára-kolektor ovlivňuje intenzitu elektrického pole. Čím je vzdálenost mezi elektrodami větší, tím více se snižuje intenzita pole. Na druhou stranu tak ale dochází k tvorbě tenčích vláken. Při velmi krátkých vzdálenostech dochází k nedostatečnému odpaření rozpouštědla a tím ke vzniku nevlákenných vrstev. Bohužel se nedá říct, jaká vzdálenost je ideální, protože je rozdíl mezi pracovní vzdáleností a délkou letu vlákenné trysky. Ovlivnit lze však pouze pracovní vzdálenost. To znamená, že i při nižší pracovní vzdálenosti může být díky působení elektrostatických sil komplikovanější trajektorie, tím delší let vlákna a naopak, což má v konečném součtu vliv na průměr vlákna a morfologii [8]. 2.2.2
Vlastnosti polymerního roztoku Koncentrace je jeden z nejdůležitějších parametrů ovlivňující schopnost roztoku
vytvořit Taylorův kužel, protože mění povrchové napětí roztoku a jeho viskozitu [9]. Ukázalo se jako téměř nemožné zvláknit velmi koncentrované roztoky, protože se rozpouštědlo vypařuje ještě před tím, než se vytvoří Taylorův kužel a polymer tak zasychá. To vede k obtížím s údržbou, neboť dochází k ucpání kapiláry [10]. Obecně platí, že čím vyšší koncentrace roztoku, tím větší průměr mají vytvořená vlákna a také se zvyšuje variabilita ve velikosti [7]. Naopak při nízké koncentraci se vlákna netvoří vůbec. Dochází k jevu „electrospraying“, při kterém se vytvářejí a ukládají kuličkovité formace na kolektor namísto kontinuálních vláken. [8]. Jak je uvedeno již dříve, těkavost rozpouštědla je dalším, velmi důležitým faktorem. Při procesu se rozpouštědlo odpařuje během letu a na kolektor se tak ukládají pevná a suchá vlákna. Při použití málo těkavého rozpouštědla sice dochází k procesu elektrostatického zvlákňování, ale rozpouštědlo se během letu nestihne odpařit, takže se na kolektor ukládá nevlákenný roztok polymeru [5]. Molekulová hmotnost polymeru ovlivňuje hlavně elektrické vlastnosti polymeru. S rostoucí molekulovou hmotností stoupá viskozita roztoku, tudíž při příliš nízké hmotnosti
8
vůbec nedochází k tvorbě vláken, vysoká hmotnost má za následek vyšší viskozitu. Tím se zvětšuje průměr vláken a také velikostní variabilita [6].
2.3 Systémy Během vývoje elektrostatického zvlákňování a jeho optimalizace samozřejmě nezůstalo jen u jednoho systému, ale bylo jich vyvinuto několik. Všechny jsou složeny ze zvlákňovací elektrody, na kterou je přiváděn polymerní roztok a kolektoru, kam se vlákna zachytávají [5]. Různé modifikace tohoto vybavení tak daly vzniknout komplexnějším systémům, které zvyšují výtěžnost anebo upravují vlastnosti vláken. 2.3.1
Kapilární Když bylo poprvé popsáno elektrostatické zvlákňování, jako elektroda sloužila
jednoduchá kapilára. Skrz ni se přiváděl polymerní roztok a na konci kapiláry se vytvořila kapka. Působením vysokého napětí následně vznikl Taylorův kužel [1]. Nevýhodou kapilárních systémů je velmi nízká výtěžnost a také složitá údržba. Pro zvýšení produkce se vytvořil novější systém paralelních kapilárních elektrod [11]. Princip je úplně stejný jako u jedné kapiláry, výtěžnost je však vyšší a dokonce se touto metodou dá připravit směs vláken z různých materiálů. Nevýhodou těchto paralelních elektrod je to, že mezi tryskami vznikají deformace elektrického pole, které vedou k aberantnímu elektrostatickému zvlákňování. Tento jev vede k nerovnoměrnému uložení vláken na kolektoru a tvorbě nežádoucích vlákenných agregací [1]. 2.3.2
Zvlákňování z hladiny Jelikož kapilární zvlákňovací elektrody mají velmi nízkou výtěžnost, není jejich
využití pro praktické aplikace dostačující. Proto se vyvinul systém, kdy se polymerní trysky samoorganizují z volné hladiny [12]. Jako první se o nahrazení jehel pokusili Yarin a Zussman, kdy vytvořili dvouvrstevný systém, spodní vrstva obsahovala ferromagetickou suspenzi a na ní byla nanesena vrstva polymeru. Při současném působení magnetického a elektrického pole se díky spodní vrstvě vytvořilo více vlákenných trysek a výsledkem byla vyšší výtěžnost [13]. Tato metoda se však neprosadila, neboť má komplikované nastavení a variabilita ve velikosti vláken je velká. Jako zatím nejvýhodnější pro produkci velké masy vláken se ukázal systém NanospiderTM vyvinutý Technickou univerzitou v Liberci. Princip sytému je založen na samoorganizaci vlákenných trysek z téměř ploché hladiny. Jako
9
zvlákňovací elektroda slouží pomalu rotující válec, který je umístěn ve vaně a nabaluje se na něj tenká vrstva polymeru. V důsledku koncentrace pole na povrchu zvlákňovací elektrody dochází k vytvoření obrovského množství Taylorových kuželů, což velmi výrazně zvyšuje výtěžnost výroby [12]. 2.3.3
Koaxiální zvlákňování Jednou z možností, jak vytvořit vlákna i z téměř nezvláknitelného polymeru, například
takového, který má nízkou molekulární hmotnost, je vytvoření blendu (směsi), kdy se tento polymer smíchá se snadno zvláknitelným roztokem. Jelikož ale všechny polymery nejsou mísitelné, používá se metoda koaxiálního zvlákňování [14]. Koaxiální elektroda je vytvořena ze dvou kapilár, kdy jedna je umístěna uvnitř druhé. Používá se k výrobě vláken ze dvou různých materiálů, kdy vnitřní polymer tvoří jádro a vnější plášť [15]. Plášťový polymer nejenže pomáhá k utvoření vlákna jádra, ale také může vylepšovat jeho vlastnosti a může se dále modifikovat nebo úplně odstranit, přičemž zbude pouze vnitřní jádro [16]. Takto připravená vlákna slouží v tkáňovém inženýrství buňkám nejen jako opora, poněvadž se mohou do jádra inkorporovat různé proteiny a růstové faktory. Fungují tedy i jako regulátory buněčné adheze a proliferace. Tato vlastnost se využívá hlavně v řízeném dodávání bioaktivních látek a v ošetřování ran [17].
2.4 Kolektory Kolektory slouží jako úložiště vznikajících vláken. Mohou být nabité, nebo uzemněné. Existují dva základní typy kolektorů, statické a dynamické. Na statické kolektory se vlákna ukládají pouze v náhodném uspořádání, zatímco vhodně vybranou rychlostí rotace dynamického kolektoru lze tvořit orientovaná vlákna. Překročením hranice rychlosti dochází k polámání vláken [1]. Tkáňové inženýrství využívá spíše kolektory dynamické než statické, díky možnosti vytvářet orientovaná vlákna. Ukázalo se, že buňky proliferují ve směru orientace vláken a tvoří tak kompaktnější vrstvu [18]. Limitem takto vytvořených vláken je pouze jejich komprese a nízká porozita, což znemožňuje buňkám migrovat skrz nosič. Proto se objevily pokusy vytvořit 3D nosič [19]. Upravením statického kolektoru lze dosáhnout 3D formace vláken. Systém funguje na stejném principu jako klasické elektrostatické zvlákňování, jen místo plochého nebo válcovitého kolektoru se použije sférický kolektor, který způsobí, že se vlákna utvoří do objektu připomínajícího bavlněnou kuličku, čímž se mnohonásobně zvýší porozita, takže
10
buňky jsou schopné migrovat ve 3D prostoru a vykazují i vyšší proliferaci než na vláknech plochých [19].
Obr. 2: Schéma elektrostatického zvlákňování,
Obr. 3: Schéma vytváření tubulárního nosiče.
sférický kolektor umožňuje tvorbu 3D strukturu
Převzato z [20] a upraveno.
připomínající bavlněnou kuličku. Převzato z [19].
Jako kolektor lze použít i dynamický válec o vybraném průměru, na který se zvlákňuje roztok polymeru. Takto připravený nosič má poté tubulární tvar, jehož povrch je možné modifikovat dalšími vrstvami materiálu a tím zlepšit mechanické vlastnosti [21]. Je dokázáno, že buňky lépe proliferují na orientovaných vláknech (zejména hladké svalové a neurální buňky), proto jsou tubulární nosiče s orientovanými vlákny vhodnou náhradou pro poškozené cévy [22] a nervy [23].
Obr. 4: Fotografie ze SEM. Levá fotografie zobrazuje náhodně uspořádaná vlákna, pravá fotografie zobrazuje orientovaná. Převzato z [24] a upraveno.
11
2.5 Používané materiály Existuje široký rozsah materiálů, které se dají použít pro elektrostatické zvlákňování. Dosud se podařilo zvláknit více jak dvě stě polymerů, které jsou syntetického anebo přírodního původu. Přírodní polymery mají pro použití v tkáňovém inženýrství výhodu v tom, že jsou bioa imunokompatibilní, protože kolagen a elastin jsou přirozenou součástí ECM. Argumentem pro použití přírodních polymerů je, že obsahují sekvenční motivy podporující adhezi buněk, jako například Arg-Lys-Asp. Typické přírodní polymery jsou například kolagen, chitosan, želatina, elastin, hedvábí, kyselina hyaluronová [2]. Ze syntetických polymerů jsou používány nejčastěji poly-α-hydroxykyseliny a poly-εkaprolakton, protože jsou netoxické a biodegradabilní. Rozloží se po několika týdnech nebo měsících v závislosti na struktuře a molekulární hmotnosti [4]. Biodegradabilita je velmi důležitá při výběru materiálu pro různé použití, jelikož u nosiče, který je designován jako opora, je příhodnější, aby se rozložil pomaleji. U řízeného dodávání léčiv je naopak vhodnější rychlejší degradabilita [5]. Syntetické polymery
Průměr vláken [2, 5]
Biodegradabilita [4]
PVA (polyvinylalcohol)
250-300 nm
Rychlá
PCL (poly-ε caprolactone)
200 nm-4 µm
Pomalá
PLLA (poly glycolic lactic acid)
300-3500 nm
Pomalá
PU (polyurethane)
100-500 nm
Pomalá
Chitosan
130 nm
Rychlá
Kolagen
100-500 nm
Pomalá
Hedvábí
590 nm
Pomalá
Želatina
100-700 nm
Pomalá
Kyselina hyaluronová
70-300 nm
Rychlá
Přírodní polymery
Tab. 1: Přehled nejčastěji používaných polymerů v tkáňovém inženýrství.
12
3. Anatomie a fyziologie cévy Téma anatomie a fyziologie cév je velmi obsáhlé a jeho zpracování by svým rozsahem překročilo rámec této práce, vybrala jsem proto pouze nejpodstatnější části, které slouží k pochopení problematiky vytváření umělých cévních náhrad. Céva je složena ze tří koncentrických vrstev, kde každá vrstva má svou úlohu pro zachování funkci cévy. Jsou to tunica intima, tunica media a tunica adventitia. Tunica intima je tvořena jednou vrstvou endoteliálních buněk (EC). EC zabraňují adhezi krevních destiček, upravují cévní permeabilitu, udržují homeostázu a podílí se na vazokonstrikci a dilataci produkcí látek, které ovlivňují chování hladkých svalových buněk (SMC) [25]. Tunica media se skládá z jedné nebo i několika vrstev SMC a ECM. SMC jsou uspořádány kruhově a s podporou proteinů ECM elastinu a kolagenu zajišťují cévě mechanickou odolnost, která je nutná pro to, aby céva vydržela vysoký tlak. Dále způsobují konstrikci a dilataci cévy díky signálním molekulám z vnějšího prostředí [26]. Poslední vrstvu, tunica adventitia, tvoří podélně orientované fibroblasty, kolagen a elastin. Jsou zde také přítomné makrofágy, žírné a dendritické buňky. Tato vrstva je konektivní, poskytuje spojení nervových vláken a cév a tím napomáhá k udržení cévního tonu [27]. Rozměr těchto tří segmentů závisí na typu cévy. Největší variabilita je v tunica media, kdy může obsahovat tři až čtyřicet vrstev SMC [27].
Obr. 5: Struktura cévy. Zdroj: Vascular system [on-line], 2000, [cit. 2011-05-07], dostupné z www: http://lecannabiculteur.free.fr/SITES/UNIV%20W.AUSTRALIA/mb140/CorePages/Vascular/Vascula r.htm
13
3.1
Endoteliální buňky jako stavební složka cév Endoteliální buňky formují vnitřní lumen cév a tvoří tak selektivně permeabilní vrstvu
mezi krví a tkání. Mají mnoho funkcí, jako je například regulace vzniku trombu, přilnavost krevních destiček, modulaci vasomotoriky a průtoku krve, regulace imunitních reakcí a zánětlivých procesů. Tyto funkce jsou umožněny strukturou, kde EC jsou propojeny těsnými spoji a tvoří tak kontinuální jednovrstevnou plochu. EC produkují mnoho látek, které ovlivňují nejen je samotné, ale i hladké svalové buňky nebo cirkulující elementy (krevní destičky a bílé krvinky). Aby docházelo ke kontaktu buněk s ECM a leukocyty, exprimují EC mnoho adhezivních molekul, z nichž nejzákladnějšími jsou integriny a selektiny. Interakce s imunitními buňkami má význam hlavně při zánětlivých procesech. EC hrají také velmi významnou roli ve vaskulogenezi a angiogenezi [28]. EC jsou mesodermálního původu. Při vzniku embrya splanchnopleurní mesoderm diferencuje v mesenchymální buňky a ty poté na hemangioblasty. Hemangioblast je společný prekurzor endoteliálních a hematopoetických buněk [28]. Endoteliální progenitorové buňky (EPC) jsou prekurzory endoteliálních buněk. Dají se izolovat z kostní dřeně nebo z periferní krve jako mononukleární buňky. Vhodným působením růstových faktorů nebo kultivací s již diferencovanými EC lze dosáhnout jejich maturace. EPC poté exprimují stejné povrchové markery jako EC a jsou schopny vytvořit kontinuální vrstvu a plně zastoupit funkci endotelia [29]. 3.1.1
Růstový faktor VEGF VEGF (vascular endothelial growth factor) je vysoce specifický mitogen pro cévní
endoteliální buňky [30]. VEGF indukuje proliferaci EC, angiogenezi, buněčnou migraci, inhibuje apoptózu. Alternativním sestřihem jednoho VEGF genu se generuje více izoforem VEGF, z nichž každý má trochu odlišnou biologickou funkci. Tyto formy se váží na dva hlavní tyrozin-kinázové receptory, VEGFR-1 a VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor), které jsou exprimovány téměř výhradně na endoteliálních buňkách [30]. Exprese VEGF je nejvyšší v embryonálním mozku a ledvinách, kde je esenciální pro angiogenezi a vaskulogenezi. VEGF je také faktorem permeability cév, takže v mozku dospělého organizmu je jeho exprese téměř utlumena (nutné pro zachování hematoencefalické bariéry), zatímco v glomerulárních podocytech ledvin zůstává zachována vysoká [25].
14
3.1.2
Základní adhezivní molekuly endoteliálních buněk Endoteliální buňky exprimují široké spektrum adhezivních molekul. Jejich hlavní
funkce spočívá v interakci s extracelulárním matrix a dalšími buněčnými komponenty což je esenciální pro zachování fyziologických úloh endoteliálních buněk [31]. Integriny představují skupinu heterodimerních proteinů skládající se z různých kombinací řetězců α a β. Hrají klíčovou roli v přenosu signálu mezi ECM a vnitřním buněčným cytoskeletem. Umožňují buňce dynamicky regulovat interakci s ECM a jinými buňkami, díky čemu mají zásadní úlohu v buněčné fyziologii eukaryotických buněk [32]. Selektiny jsou jednořetězcové transmembránové glykoproteiny s Ca2+ dependentní lektin-vázající doménou.
Existují tři typy selektinů: E-selektin (endothelial), P-selektin
(platelet), L-selektin (leukocyte). E-selektin a P-selektin jsou exprimovány na endoteliálních buňkách, L-selektin pouze na leukocytech. Tyto proteiny, vážící cukernaté zbytky, slouží k interakci endotelia a krevních elementů [31]. ICAM-1 (inter-cellular-adhesion-molecule), je povrchový glykoprotein, typicky exprimovaný na endoteliálních a imunitních buňkách. V malé míře je konstitutivně sekretován na povrch membrány leukocytů a endoteliálních buněk. Jeho koncentrace vzroste po stimulaci prozánětlivými cytokiny IL-1 (interleukin-1) a TNFα (tumor necrosis factor α). Receptor pro ICAM-1 je LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen) integrin, což je receptor exprimovaný na leukocytech. Jakmile se tedy aktivují ICAM-1 na EC, leukocyt se na ně naváže svým receptorem a dochází k jeho transmigraci do tkáně a vytvoření zánětu [31]. Dalším zástupcem adhezivních molekul je VCAM-1 (vascular-cell-adhesion-molecule), k jehož expresi dochází až po aktivaci cytokiny. VCAM-1 exprimovaný na EC způsobuje vazbu mononukleárních leukocytů a jejich diapedezi [33]. .
3.2 Hladké svalové buňky Hladké svalové buňky tvoří elastickou část cévy spolu s proteiny extracelulární matrix. Jsou tedy zodpovědné za elasticitu a ohebnost cévy a díky ovlivnění oxidem dusnatým a dalším množstvím vazoaktivních látek také za vasokonstrikci a vasodilataci. Během vývoje organismu se SMC vyskytnou v mnoha různých variacích zastávající rozdílné funkce. Hlavní typy jsou kontraktilní a sekreční SMC. Ve vyvíjejícím se organismu převažuje sekreční forma SMC vytvářející proteiny ECM. V dospělém organismu už je většinová část ECM vytvořena, a tak je hlavní funkcí regulovat vasomotoriku [34].
15
Strukturně se tyto dva typy liší zastoupením buněčných organel. Kontraktilní SMC exprimují hlavně aktinová filamenta a SM myosin. Sekreční SMC mají velmi rozsáhlé hrubé endoplasmatické retikulum, vysoký počet volných ribozomů a mitochondrií na úkor cytoskeletu [34]. Během života jsou kontraktilní SMC schopny změnit svoji formu zpátky na sekreční a zúčastnit se tak opravy tkáně. Po poškození endoteliální vrstvy se část SMC změní na sekreční typ a migruje do tunica intima, kde produkuje velké množství ECM proteinů k zacelení rány. Zároveň však zužuje lumen cévy a tím snižuje průchodnost. Tato změna je typická pro arterosklerotické cévy [34].
16
4. Regenerace cév V současné době trpí cévními chorobami mnoho milionů lidí na celém světě. Cévní choroby vznikají v důsledku arterosklerózy. Tuto nemoc provází zúžení cév, které může vést až k jejich ucpání a také se významně zvyšuje riziko trombózy. Pokud pacient nemá odpovídající cévy na odebrání autologního štěpu a celá třetina pacientů s arterosklerózou je nemá, je nutno vytvořit umělé cévní náhrady. Náhrada by tedy měla mít podobnou strukturu jako nativní céva, aby byla schopna plně nahradit její funkci. To znamená, že je kladen důraz na biokompatibilitu, biodegradabilitu a také na výjimečné mechanické vlastnosti, aby umělý štěp vydržel vysoký krevní tlak.
4.1 Systémy cévní regenerace Během vývoje tkáňového inženýrství byla vyvinuta již spousta systémů pro cévní regeneraci, od použití autologních štěpů po umělé materiály. Současná regenerativní medicína má za úkol skloubit dobré vlastnosti starších systémů s novými poznatky a vyvinout tak náhradu, která bude co nejpodobněji zastávat funkci nativní cévy. 4.1.1
Dacron a ePTFE V dnešní době se nejčastěji používá k vytvoření umělých cévních štěpů materiál jako
je Dacron (polyetylentetraftalát) a ePTFE (extended polytetrafluorethylen). Takto připravené náhrady jsou ale implantovány s úspěchem pouze tehdy, je li jejich vnitřní průměr větší než 6 mm. U průměru menšího než 6 mm vznikala téměř okamžitě po transplantaci akutní trombóza a docházelo k selhání štěpu [35]. Významným krokem ke zlepšení vlastností umělé cévy je vytvoření endoteliální vrstvy z autologních buněk. Endoteliální buňky vytvoří na povrchu souvislou vrstvu a zabraňují adhezi krevních destiček a tím i trombóze. Jelikož na Dacron ani ePTFE, nejsou endoteliální buňky schopny adherovat, musí se vytvořit na povrchu adhezivní plášť. Další překážkou pro využití těchto materiálů pro cévy s vnitřním průměrem <6 mm je to, že nejsou degradabilní a brání tak přirozené remodelaci cévního systému, z čehož vyplývá, že se nedají použít například u dětských pacientů [35]. Dacron má navíc nevýhodu, že EC po osazení a interakci s jeho povrchem, který není ničím modifikovaný, vykazují vysokou expresi P-selektinu, který má za následek adhezi polymorfonukleárních neutrofilů k endoteliálnímu povrchu a způsobují zánět, vedoucí k snížení průchodnosti štěpu až jeho selhání [36]. 17
4.1.2
Decelularizované xenogenní štěpy Využití xenogenních štepů je nesyntetickou alternativou k autologním štěpům
v případě, že pacient nemá vhodné cévy, ze kterých by se dal odebrat štěp. Proto se využije štěp odebraný ze zvířete. Jelikož by ale po transplantaci nastala okamžitá imunitní reakce a rejekce transplantátu, musí se tomu předcházet. Řešením je decelularizace cévy pomocí enzymů a detergentů, kdy je zachována pouze lamina bez jakéhokoli buněčného materiálu, který by mohl imunitní reakci vyvolat. Takto připravené ECM bez buněčné opory je ale náchylnější k infiltraci hostitelskými buňkami a tedy i ke vzniku imunitní reakce a degradaci. Proto se upravuje ECM síťovacím činidlem, aby se infiltraci co nejvíce zabránilo. Materiál jako je glutaraldehyd byl zavržen, neboť je cytotoxický a nedochází k osídlení xenogenního štěpu hostitelskými buňkami. Proto se používá přírodní extrakt genipin z rostliny Gardenia. Nejen že vykazuje mnohem nižší toxicitu, ale prokazatelně podporuje adhezi a růst EC na takto upraveném povrchu [37]. I takto ošetřená cévní náhrada je ale bez vnitřní vrstvy zabraňující adhezi destiček, což znamená, že po transplantaci do pacienta by vznikalo velmi vysoké riziko trombózy (po šesti měsících asi 58%) [38]. Řešením je endotelizace in vitro nebo ošetření holé ECM heparinem, který znemožňuje vznik trombu. Náhradní céva je tedy funkční a po několika měsících jsou buňky hostitele schopné osídlit xenogenní ECM [38]. I přes všechny snahy ale xenogenní materiály podléhají poměrně rychlé degradaci a snižují tak výkon štěpu [39].
4.2 Nosiče vytvořené elektrostatickým zvlákňováním Materiály vytvořené elektrostatickým zvlákňováním se vyznačují vlastnostmi, jako jsou velký poměr povrchu k objemu a vysoká porozita. Průměr vláken se pohybuje v rozmezí od stovek nanometrů po desítky mikrometrů. Vytvořené nosiče se tak velmi podobají extracelulární matrix. Nosiče mohou být vytvořena z mnoha různých materiálů, zahrnujících syntetické i přírodní polymery. Díky tomu se metoda elektrostatického zvlákňování stala slibnou pro regeneraci tkání [2]. Elektrostatickým zvlákňováním lze připravit nosič, který se osadí buněčnou kulturou, a poté transplantují. Existuje také alternativní možnost transplantace přímo bez předchozí kultivace buněk na povrchu. Holé nosiče však musí mít vytvořen antitrombogenní povrch, aby se zabránilo okamžitému vzniku trombu při kontaktu s krevním řečištěm. Vznik imunitní reakce závisí také na expresi adhezivních molekul endoteliálními buňkami po kontaktu s umělým povrchem, díky čemu existuje určité riziko imunitní reakce. 18
Biodegradabilní materiály jsou žádoucí ve vytváření cévních náhrad, aby mohlo docházet k růstu a remodelaci cévního řečiště. Je nutno je vybrat tak, aby jejich degradace nebyla příliš rychlá a nedošlo k ní dřív, než se stihne vytvořit vlastní extracelulární matrix a poskytnout tak oporu pro cévní buňky [40]. 4.2.1
Struktura cévy vytvořené nanovlákennými nosiči Struktura umělého štěpu by se měla co nejvíce podobat struktuře nativní cévy. Jelikož
nativní céva se skládá ze tří, různě designovaných vrstev, kde každá z nich plní jinou funkci, je nutné toto zohlednit při tvorbě štěpu. Základem je tedy vytvoření vícevrstevného nosiče. Minimálním požadavkem jsou dvě vrstvy, vnitřní vrstva je vytvořena pro osazení EC a vnější pro osazení SMC [18]. Jako vnější vrstva mohou také sloužit náhodně orientovaná vlákna, která napodobují fibrilární kolagenovou strukturu a tím tak zlepšují mechanické vlastnosti umělého štěpu [41]. Důvodem pro použití dvou vrstev je to, že každý typ cévních buněk adheruje lépe na jiný typ nosiče. Navíc bylo prokázáno, že dvojvrstevná struktura má mnohem větší elasticitu než jedna vrstva a tím spíše vydrží stres způsobený vysokým tlakem [42]. Vnější vrstvu je důležité vytvořit tak, aby vlákna byla orientovaná do kruhu, jako je tomu u tunica media v cévě. Nanovlákenné nosiče s radiálně orientovanými vlákny vykazují vyšší odolnost vůči tlaku. Radiální orientace se dosáhne použitím rotujícího válcovitého kolektoru. Pokud má nosič takovouto strukturu, SMC osazené na tento nosič proliferují ve směru orientace vláken a jsou převážně kontraktilního fenotypu. SMC zde zajišťují stabilitu a kontraktilitu cévní stěny a zároveň umožňují i růst a remodelaci [18]. Obecně vrstva pro osazení SMC by měla mít větší póry (až mikrometrového rozsahu), protože menší nedovolí SMC usadit se uvnitř nosiče [43]. Pokud se buňky usadí pouze na povrchu, způsobují tak zúžení lumen a zmenšení průchodnosti dlouho po implantaci [44]. Větších pórů v nosiči lze dosáhnout více způsoby, například zvlákňováním směsi o dvou polymerech, z nichž jeden je ve vodě rozpustný, ten poté rozpustit a tím dosáhnout menšího propojení mezi vlákny [2]. Tímto způsobem se ale narušuje pevnost a odolnost vlákna, proto je výhodnější ovlivněním parametrů vytvořit větší vlákna, která mají méně konexí mezi sebou [43]. Dalším klíčem k úspěchu je také kontrola buněčného fenotypu, jelikož sekreční SMC produkují enormní množství kolagen bohatého ECM a tím způsobují zúžení lumen štěpu. Hu
19
et al. ukázali, že na 3D nosiči z orientovaných vláken rostly přednostně buňky s kontraktilním fenotypem a byla tedy zachována průchodnost štěpu [44]. Zdrojem SMC pro použití v tkáňovém inženýrství jsou většinou maturované SMC z cév. Jelikož k jejich získání je ale zapotřebí chirurgický zákrok, je tedy nasnadě, že jsou zkoumány i další, méně invazivní metody získání SMC [45]. Jednou z nich je využití progenitorových buněk (SPC), které se ve formě mononukleárních buněk izolují z periferní krve. Xie et. al. izolovali tyto buňky a diferencovali v SOC (smooth muscle outgrowth cells). Buňky po kultivaci vykazovaly expresi markerů typických pro SMC a proliferovaly vysokou rychlostí i na připraveném nosiči. [45]. Tato metoda je proto slibnou pro regeneraci cév bez většího zásahu do organismu pacienta. Rychlé vytvoření stabilní nepřerušované vrstvy EC ve vnitřní vrstvě cévní protézy je hlavním krokem k dlouhodobému zachování průchodnosti štěpu a tím snížení rizika trombózy a imunitní reakce hostitele na minimum [46]. Endoteliální buňky nepotřebují migrovat dovnitř nosiče, naopak je žádoucí, aby vytvořily kompaktní vrstvu na povrchu nosiče. Tato plocha musí být bez fenestrací, aby byla zachována nepropustná bariéra mezi tkání a krví. Na rozdíl od SMC se EC spontánně zachycují na nejmenších vláknech [43]. Problémem ale zůstává to, že EC nejsou schopny vytvořit kontinuální vrstvu na celém povrchu nosiče. Proto se často využívá blendu syntetického a přírodního polymeru (hlavně kolagen), protože prokazatelně poskytuje buňkám adhezivní místa. Tato kompaktní vrstva bez přerušení je teprve odolná proti adhezi krevních destiček a plně funkční [47]. Uměle vytvořené nosiče je možno osadit autologními endoteliálními buňkami. Pro extrakci těchto buněk existují dvě strategie nazývané jedno- a dvoustupňové osazení. [48]. Jednostupňové osazení znamená, že autologní buňky jsou extrahovány a neprodleně použity pro osazení. Dvoustupňové zahrnuje extrakci a následné pěstování po delší dobu v podmínkách in vitro, aby se dosáhlo velkého počtu endoteliálních buněk. Pro úspěšnou kultivaci buněk na nosiči je ale nutné štěp kontinuálně osazovat alespoň týden, což vyžaduje obrovské množství EC. Proto se jednostupňové osazení nedá v tomto případě využít [48]. Autologní endoteliální buňky se nejčastěji získávají biopsií tkáně pacienta. Následně se kultivují na nosiči, dokud není dosaženo úplné endotelizace. V případě pacientů trpících arterosklerózou je však téměř nemožné vypěstovat kulturu z autologních buněk, jelikož už jsou často stárnoucí [49]. Takto získané buňky jsou dále vystaveny působení vysoké koncentrace enzymů (trypsin, kolagenáza), kterým se preparují z tkáně. Při vícenásobném 20
ošetření enzymem se sice zvýší zisk, ale EC poté mohou mít díky tomu mít značně sníženou viabilitu, navíc se riskuje kontaminace bakteriemi. Proto se dnes obrací pozornost na kultivování EPC (endothelial progenitor cell). Odběr EPC je mnohem jednodušší než získání diferencovaných EC. Dají se získat z kostní dřeně, i když tento zákrok je pro pacienta často nepříjemný. Pozornost se proto obrací na izolaci z periferní krve, protože není nutný chirurgický zákrok, jako u diferencovaných EC, kde se pacientovi musí odebrat část cévy [29]. Nevýhodou pro klinické využití je nízké množství EPC je v periferní krvi a kultivace je tedy časově náročnější. Proto se testuje nový systém kultivace in situ založený na zvlákněném nosiči [49]. Nosič se připravil elektrostatickým
zvlákňováním
polyurethanu
a
na
jeho
povrch
byla
přidána
fotopolymerizovaná želatina. V ní je obsažený heparin a povrch je ošetřen VEGF. Takto upravená vrstva byla vystavena izolovaným mononukleárním buňkám (kde jsou obsaženy i EPC) z periferní krve. Kontinuální sekrece heparinu by měla zabránit formaci trombů a růstový faktor VEGF zde působí jako atraktant pro EPC a EC, jelikož ostatní buňky pro něj nemají receptor. Předpokládá se, že EPC vytvoří kontinuální vrstvu a diferencují ve zralé EC [49]. 4.2.2
Materiály a povrchová úprava zvlákněných nosičů Nejpříhodnějším syntetickým materiálem pro vytvoření štěpu se zdá být PCL. Je
biodegradabilní, ale degradace probíhá relativně pomalu, takže tkáň příjemce je schopna PCL paralelně nahradit vlastním materiálem. I přes to, že je to syntetický polymer, má ale částečnou aktivitu pro EC i SMC [50]. Ke zlepšení adheze proto se používá směs PCL a přírodního polymeru (kolagen, elastin) anebo jiná povrchová úprava pro adhezi EC [21]. Dalším materiálem používaným ke zvlákňování je polyurethan díky jeho velmi dobré odolnosti proti vnějším stresům. Po zvlákňování na rotující válec vykazoval polyurethanový štěp dokonce lepší mechanické vlastnosti než nativní céva. EC se prokazatelně prospívají na PU nosiči a tvoří pevnou vrstvu na povrchu. Nedošlo ke zvýšení exprese ICAM-1 a VCAM-1, což jsou velmi senzitivní prvotní známky zánětlivého procesu. [51]. Hedvábí se zdá být velice slibným materiálem pro využití v tkáňovém inženýrství a regenerativní
medicíně
díky
stabilitě,
mimořádným
mechanickým
vlastnostem
a
biokompatibilitě [52]. Hedvábí je přírodní polymer produkovaný bourcem morušovým (Bombyx mori) a je velmi dobře zvláknitelný. Buňky kultivované na tomto polymeru poměrně rychle proliferují a jsou pevně adherovány. Jsou schopné pokrýt celý povrch a také migrovat dovnitř nosiče. 21
Nanovlákna připravená z blendu více polymerů jsou velmi slibným matrix pro tvorbu cévních náhrad. Chen et. al. zkoumali blend kolagenu a chitosanu a jejich interakci s EC a SMC. Nanovlákna připravená z kolagenu a chitosanu byla poté zesítěna glutaraldehydem. Při procesu síťování dochází k propojení volných aminoskupin kolagenu a chitosanu s aldehydovou skupinou glutaraldehydu, a tak se zvyšuje stabilita vláken. Biokompatibilita těchto vláken byla dokázána tím, že SMC i EC kultivované na nosiči byly schopny vytvářet kontinuální vrstvy [53]. Další možností, jak vytvořit vysoce adhezivní nosič je modifikace povrchu vláken nebo inkorporace bioaktivních látek do vlákna. Pokud totiž materiály nemají pro buňky dostatečnou biologickou aktivitu, ale jejich mechanické vlastnosti nebo biokompatibilita jsou nenahraditelné, používá se právě modifikace. Jako atraktant pro cévní buňky slouží NO. Proto byla vytvořena jádro-plášť vlákna pomocí koaxiálního zvlákňování, kdy jádro tvoří PCL s N,N′-dibutyl-1,6-hexanediaminem. Po reakci PCL vláken s N2O2 se z nich kontinuálně uvolňuje NO. Holá vlákna připravená tímto způsobem byla pro buňky toxická, proto se využilo koaxiálního zvlákňování a byl vytvořen želatinový plášť. NO se tak uvolňovalo v menších dávkách kontinuálně a tvořilo antiadhezivní prostředí pro krevní destičky [54]. Na podobném principu funguje systém s amfifilními peptidy. Jak je uvedeno výše, jediným omezením syntetického PCL je neúplná biologická aktivita, která by kontrolovala buněčné chování. Proto se vytvořily peptidy se sekvencí KKKKK (polylysin), které zde fungují jako NO donor. Takto připravené peptidy se samoorganizovaly na povrch PCL a kontinuálně uvolňovaly NO, čímž zvýšily adhezi EC, snížily adhezi krevních destiček a tím i riziko trombózy. Navíc byla zpočátku snížena i adheze SMC, která je kritická několik hodin po implantaci. Zvýšená adheze a proliferace SMC dříve, než se vytvoří kompaktní a funkční vrstva EC je zodpovědná za zúžení lumen štěpu. Tvoří se převážně sekreční forma SMC, která vytváří obrovské množství proteinů, což způsobuje zúžení štěpu a tím i horší funkci [55].
22
5. Shrnutí Zlatou střední cestou v dnešních operacích bypassů je použití autologních štěpů, které se odebírají buď ze stehenní, nebo prsní tepny. Jelikož však celá třetina pacientů nemá díky rozvinuté nemoci nebo předchozí operaci odpovídající cévy, je nutno vytvořit umělou náhradu. Cévy musí odolávat stresu obvodovému, podélnému torznímu a střihu. Nativní céva se tomu brání tak, že má tři funkční vrstvy, proto by měl mít nosič více vrstev, aby dokonaleji napodoboval strukturu cévy a mohl tak odolávat lépe odolávat vysokým tlakům a zachoval si tak plnou funkčnost [21, 22]. Důraz je v neposlední řadě také kladen na biokompatibilitu a biodegradabilitu. Biodegradabilitou je míněno to, že se nosič po čase v těle rozloží. Důležitá je pro zachování přirozené remodelace cévy a časem i nahrazení polymeru vlastní tkání, dále pak není nutná další operace za účelem odstranění podpory. Nutné je také zajištění biokompatibility, kdy nosič není cytotoxický a nevyvolává imunitní reakci. Neméně důležité je předcházet tomu, aby se po rozpadu polymeru uvolňovaly pouze nereaktivní a netoxické monomery a organismus je byl schopný rozložit nebo vyloučit. [4] Aby nedocházelo k okamžitému vzniku trombu po kontaktu uměle vytvořené cévy a krevního řečiště a byla zachována průchodnost štěpu, musí být povrch ošetřen antikoagulačními substancemi, jako je například heparin, nebo přírodní bariérou vytvářející antirombogenní prostředí - endoteliální vrstvou. Na povrch materiálů, které se stále používají nejčastěji k vytvoření cévních náhrad (Dacron, ePTFE) ale žádné buňky neadherují a při kontaktu s krevním řečištěm se okamžitě vytvoří trombus a následně i imunitní reakce. Pokud je ale nahrazován štěp s průměrem menším než 6 mm, vede tato reakce k ucpání lumen a selhání štěpu. Navíc tyto látky nejsou biodegradabilní, takže nedochází k jeho rozpadu a přirozenému růstu spolu s pacientem [35]. Podle mne jsou tyto materiály naprosto nevhodné k výrobě cévních náhrad s menším průměrem, i když poskytují uspokojivé výsledky v nahrazení velkých tepen. Další možností, jak nahradit cévu je použití decelularizovaných xenogenních štěpů. Pokud se buňky dárce odstraní pečlivě a kostra ECM se osadí EC, eventuelně i SMC, má tato metoda dobré výsledky v testech [37, 38]. Nevýhodou systému je poměrně rychlá degradace ECM, způsobená detergentem a infiltrací hostitelskými enzymy, což znemožňuje správnou funkci štěpu [39]. Klinické využití se dále podle mne bude pravděpodobně potýkat s problémy, jako je velká nákladnost systému a eventuelně etickými aspekty. Zvíře je
23
vystavené stresu při odběru, navíc vyrůstá pod velmi přísným dohledem a musí být naprosto zdravé, čímž se celý systém prodražuje. Nejperspektivnější metodou se zdá být elektrostatické zvlákňování. Příprava nosiče je poměrně jednoduchá a díky možnosti zvláknění obrovského množství materiálů také velmi variabilní. Významným vylepšením je také možnost zvláknění přírodních materiálů, biokompatibilních syntetických materiálů nebo jejich blendu. Syntetické materiály mají výborné výsledky v mechanických testech, některé mají i částečnou biologickou aktivitu [50], přírodní materiály jsou zase velkým atraktantem pro buňky, jelikož kolagen nebo elastin, z nichž se často připravují vlákna, jsou součástí přírodní extracelulární matrix [53]. Při procesu zvláknění lze také ovlivnit morfologii, průměr vlákna a jeho 3D strukturu, je možno tvořit náhodná nebo orientovaná vlákna. Neméně významným faktorem je možnost inkorporace bioaktivních látek použitím koaxiálního zvlákňování. V součtu těchto vlastností lze v podstatě říci, že použitím elektrostatického zvlákňování se vytvoří „štěp na míru“. Aby byla zachována biologická funkce náhrady, je důležité vytvořit antiadhezivní povrch pro leukocyty a krevní destičky, tedy endoteliální vrstvu. Tu je možno vytvořit in vitro použitím autologních EC [46], nebo diferencovaných EPC. Osobně preferuji využití EPC, jelikož odběr diferencovaných EC je poměrně invazivní, buňky izolací z tkáně mohou ztrácet viabilitu a v neposlední řadě je u pacientů s pokročilou arterosklerózou tento odběr prakticky nemožný. Naproti tomu EPC se dají, i když v malém množství izolovat z periferní krve, diferencovat in vitro a poté osadit na nosič. Poměrně novou, velmi slibnou metodou je vytváření endoteliální vrstvy in vivo. Náhrada se musí před vložením do pacienta ošetřit atraktanty a antikoagulačními faktory, ale poté se už nemanipuluje s buňkami a riziko kontaminace bakteriemi se snižuje téměř na nulu. Navíc je postup mnohem rychlejší než diferencovat EPC in vitro [49]. Ke zlepšení funkce přispívá také osazení nosiče SMC, neboť poskytují mechanickou oporu a elasticitu. SMC se v rámci neinvazivních metod také dají izolovat z periferní krve jako progenitorové buňky. V případě vytváření vrstev SMC na umělém nosiči je ale třeba dbát velké opatrnosti a mít pod kontrolou proliferaci a typ SMC. Ukázalo se sice, že na orientovaných vláknech přednostně proliferují buňky s kontraktilním fenotypem [44], ale pokud není vytvořena kompletní endoteliální výstelka, vzniká riziko migrace SMC do míst s chybějícím endoteliem a změna typu na sekreční. Sekreční SMC způsobí vysokou produkcí ECM proteinů a tím zúžení lumen štěpu [34].
24
6. Závěr Porovnáním současných systémů cévní regenerace se zdá být vytvoření nosiče elektrostatickým zvlákňováním jako nejperspektivnější cesta pro klinické využití, neboť je univerzální a umožňuje velmi přesně ovlivňovat morfologii vláken. Zároveň věrohodně napodobuje extracelulární matrix, čímž se stává atraktantem pro adhezi buněk, zvláště tehdy, pokud se použijí ke zvlákňování přírodní materiály, jako je kolagen, elastin nebo jejich blend se syntetickým polymerem. Je možné také inkorporovat bioaktivní látky dovnitř vláken, čímž lze cíleně dopravit buňky na místo určení. Zvlákněné nosiče mají další výhodu v tom, že mohou být vytvořené z biodegradabilních nosičů a tím je umožněna přirozená remodelace. Relativní jednoduchost a téměř neomezené možnosti designování nosiče jsou výsadní vlastností právě tohoto procesu, což jej dělá atraktivním nejen pro cévní regeneraci. Tato metoda je proto velmi slibná pro všechny pacienty trpící vaskulárními chorobami. V kombinaci s endotelizací in vivo se v budoucnu možná dočkáme minimálně invazivních cévních operací.
25
7. Seznam použité literatury 1.
Teo, W.E. and S. Ramakrishna, A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology, 2006. 17(14): p. R89-R106.
2.
Bhardwaj, N. and S.C. Kundu, Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnology Advances, 2010. 28(3): p. 325-347.
3.
Taylor, G., Electrically Driven Jets. Proceedings of the Royal Society of London Series a-Mathematical and Physical Sciences, 1969. 313(1515): p. 453-&.
4.
Agarwal, S., J.H. Wendorff, and A. Greiner, Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer, 2008. 49(26): p. 5603-5621.
5.
Sill, T.J. and H.A. von Recum, Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials, 2008. 29(13): p. 1989-2006.
6.
Lukáš, D., et al., Physical principles of electrospinning (Electrospinning as a nanoscale technology of the twenty-first century). Textile Progress, 2009. 41(2): p. 59-140.
7.
Jacobs, V., R.D. Anandjiwala, and M. Maaza, The Influence of Electrospinning Parameters on the Structural Morphology and Diameter of Electrospun Nanofibers. Journal of Applied Polymer Science, 2010. 115(5): p. 3130-3136.
8.
Tong, H.W. and M. Wang, An Investigation into the Influence of Electrospinning Parameters on the Diameter and Alignment of Poly(hydroxybutyrate-cohydroxyvalerate) Fibers. Journal of Applied Polymer Science, 2011. 120(3): p. 16941706.
9.
Yu, D.G., et al., Electrospinning of Concentrated Polymer Solutions. Macromolecules, 2010. 43(24): p. 10743-10746.
10.
Theron, S.A., E. Zussman, and A.L. Yarin, Experimental investigation of the governing parameters in the electrospinning of polymer solutions. Polymer, 2004. 45(6): p. 2017-2030.
11.
Varesano, A., R.A. Carletto, and G. Mazzuchetti, Experimental investigations on the multi-jet electrospinning process. Journal of Materials Processing Technology, 2009. 209(11): p. 5178-5185.
12.
Lukas, D., A. Sarkar, and P. Pokorny, Self-organization of jets in electrospinning from free liquid surface: A generalized approach. Journal of Applied Physics, 2008. 103(8): p. -.
13.
Yarin, A.L. and E. Zussman, Upward needleless electrospinning of multiple nanofibers. Polymer, 2004. 45(9): p. 2977-2980.
14.
Li, D., et al., Nanofibers of conjugated polymers prepared by electrospinning with a two-capillary spinneret. Advanced Materials, 2004. 16(22): p. 2062-+.
26
15.
Wang, C., et al., Biodegradable Core/Shell Fibers by Coaxial Electrospinning: Processing, Fiber Characterization, and Its Application in Sustained Drug Release. Macromolecules, 2010. 43(15): p. 6389-6397.
16.
Han, X.J., et al., Coaxial electrospinning of PC(shell)/PU(core) composite nanofibers for textile application. Polymer Composites, 2006. 27(4): p. 381-387.
17.
Ji, W., et al., Fibrous scaffolds loaded with protein prepared by blend or coaxial electrospinning. Acta Biomaterialia, 2010. 6(11): p. 4199-4207.
18.
Xu, C.Y., et al., Aligned biodegradable nanofibrous structure: a potential scaffold for blood vessel engineering. Biomaterials, 2004. 25(5): p. 877-86.
19.
Blakeney, B.A., et al., Cell infiltration and growth in a low density, uncompressed three-dimensional electrospun nanofibrous scaffold. Biomaterials, 2011. 32(6): p. 1583-1590.
20.
Marelli, B., et al., Compliant electrospun silk fibroin tubes for small vessel bypass grafting. Acta Biomaterialia, 2010. 6(10): p. 4019-26.
21.
McClure, M.J., et al., A three-layered electrospun matrix to mimic native arterial architecture using polycaprolactone, elastin, and collagen: A preliminary study. Acta Biomaterialia, 2010. 6(7): p. 2422-2433.
22.
Wu, H., et al., Electrospinning of small diameter 3-D nanofibrous tubular scaffolds with controllable nanofiber orientations for vascular grafts. Journal of materials science. Materials in medicine, 2010. 21(12): p. 3207-15.
23.
Subramanian, A., U.M. Krishnan, and S. Sethuraman, Fabrication of uniaxially aligned 3D electrospun scaffolds for neural regeneration. Biomedical Materials, 2011. 6(2): p. -.
24.
Meng, J., et al., Electrospun aligned nanofibrous composite of MWCNT/polyurethane to enhance vascular endothelium cells proliferation and function. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2010. 95A(1): p. 312-320.
25.
Risau, W., Development and differentiation of endothelium. Kidney international. Supplement, 1998. 67: p. S3-6.
26.
Bank, A.J., et al., Contribution of collagen, elastin, and smooth muscle to in vivo human brachial artery wall stress and elastic modulus. Circulation, 1996. 94(12): p. 3263-70.
27.
Rey, F.E. and P.J. Pagano, The Reactive Adventitia: Fibroblast Oxidase in Vascular Function. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2002. 22(12): p. 1962-1971.
28.
Sumpio, B.E., J.T. Riley, and A. Dardik, Cells in focus: endothelial cell. The international journal of biochemistry & cell biology, 2002. 34(12): p. 1508-12.
29.
Shirota, T., et al., Human endothelial progenitor cell-seeded hybrid graft: proliferative and antithrombogenic potentials in vitro and fabrication processing. Tissue engineering, 2003. 9(1): p. 127-36. 27
30.
Neufeld, G., et al., Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 1999. 13(1): p. 9-22.
31.
Carlos, T.M. and J.M. Harlan, Leukocyte-endothelial adhesion molecules. Blood, 1994. 84(7): p. 2068-101.
32.
Zovein, A.C., et al., Beta1 integrin establishes endothelial cell polarity and arteriolar lumen formation via a Par3-dependent mechanism. Developmental cell, 2010. 18(1): p. 39-51.
33.
Carlos, T.M., et al., Vascular cell adhesion molecule-1 mediates lymphocyte adherence to cytokine-activated cultured human endothelial cells. Blood, 1990. 76(5): p. 965-70.
34.
Ip, J.H., et al., Syndromes of accelerated atherosclerosis: role of vascular injury and smooth muscle cell proliferation. Journal of the American College of Cardiology, 1990. 15(7): p. 1667-87.
35.
Ranjan, A.K., et al., Human blood vessel-derived endothelial progenitors for endothelialization of small diameter vascular prosthesis. PloS one, 2009. 4(11): p. e7718.
36.
Guidollet, J., et al., Enhanced expression of P-selectin (CD62P) by endothelial cells seeded onto synthetic arterial prostheses (PET, Dacron®) is correlated with leukocyte interactions. Journal of Biomedical Materials Research, 1999. 44(2): p. 156-161.
37.
Chang, Y., et al., Cell-free xenogenic vascular grafts fixed with glutaraldehyde or genipin: in vitro and in vivo studies. Journal of biotechnology, 2005. 120(2): p. 20719.
38.
Wang, X.-N., et al., Implantation of Decellularized Small-caliber Vascular Xenografts With and Without Surface Heparin Treatment. Artificial Organs, 2007. 31(2): p. 99104.
39.
Guhathakurta, S., et al., Technique to process xenogenic tissues for cardiovascular implantation - A preliminary report. Current Science, 2006. 91(8): p. 1068-1073.
40.
Hong, Y., et al., A small diameter, fibrous vascular conduit generated from a poly(ester urethane)urea and phospholipid polymer blend. Biomaterials, 2009. 30(13): p. 2457-67.
41.
Soletti, L., et al., A bilayered elastomeric scaffold for tissue engineering of small diameter vascular grafts. Acta Biomaterialia, 2010. 6(1): p. 110-22.
42.
Vaz, C.M., et al., Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multilayering electrospinning technique. Acta Biomaterialia, 2005. 1(5): p. 575-582.
43.
Ju, Y.M., et al., Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials, 2010. 31(15): p. 4313-21.
28
44.
Hu, J., et al., Porous nanofibrous PLLA scaffolds for vascular tissue engineering. Biomaterials, 2010. 31(31): p. 7971-7.
45.
Xie, S.Z., et al., Differentiation of smooth muscle progenitor cells in peripheral blood and its application in tissue engineered blood vessels. Journal of Zhejiang University. Science. B, 2008. 9(12): p. 923-30.
46.
Ku, S.H. and C.B. Park, Human endothelial cell growth on mussel-inspired nanofiber scaffold for vascular tissue engineering. Biomaterials, 2010. 31(36): p. 9431-7.
47.
Tillman, B.W., et al., The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials, 2009. 30(4): p. 583-8.
48.
Zilla, P., et al., In situ cannulation, microgrid follow-up and low-density plating provide first passage endothelial cell masscultures for in vitro lining. Journal of vascular surgery : official publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter, 1990. 12(2): p. 180-9.
49.
Miyazu, K., et al., Luminal surface design of electrospun small-diameter graft aiming at in situ capture of endothelial progenitor cell. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2010. 94B(1): p. 53-63.
50.
Del Gaudio, C., et al., Structural characterization and cell response evaluation of electrospun PCL membranes: micrometric versus submicrometric fibers. Journal of biomedical materials research. Part A, 2009. 89(4): p. 1028-39.
51.
Grasl, C., et al., Electrospun polyurethane vascular grafts: in vitro mechanical behavior and endothelial adhesion molecule expression. Journal of biomedical materials research. Part A, 2010. 93(2): p. 716-23.
52.
Alessandrino, A., et al., Electrospun Silk Fibroin Mats for Tissue Engineering. Engineering in Life Sciences, 2008. 8(3): p. 219-225.
53.
Chen, Z.G., et al., Electrospun collagen-chitosan nanofiber: a biomimetic extracellular matrix for endothelial cell and smooth muscle cell. Acta Biomaterialia, 2010. 6(2): p. 372-82.
54.
Zhang, L., et al., Core-shell fibrous vascular grafts with the nitric oxide releasing property. SCIENCE CHINA Chemistry, 2010. 53(3): p. 528-534.
55.
Andukuri, A., et al., A hybrid biomimetic nanomatrix composed of electrospun polycaprolactone and bioactive peptide amphiphiles for cardiovascular implants. Acta Biomaterialia, 2011. 7(1): p. 225-33.
29
