Výroba, kvalita a sortiment kefírů na českém trhu Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin

Výroba, kvalita a sortiment kefírů na českém trhu Bakalářská práce

Vedoucí práce: doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D.

Brno 2013

Vypracovala: Eva Háderová

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Výroba, kvalita a sortiment kefíru na českém trhu“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne……………………………… podpis …………………………..

PODĚKOVÁNÍ Děkuji doc. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za odborné vedení při vypracování bakalářské práce, za ochotu a pomoc při zpracování údajů. Děkuji také své rodině za podporu ve studiu.

ABSTRAKT Kefír patří mezi nejstarší fermentované mléčné výrobky. Obsahuje probiotické kmeny mikroorganismů osídlující střevní trakt a zlepšující trávicí procesy. Jeho obliba roste především v Rusku a asijských zemích. K výrobě tradičního kefíru jsou používána kefírová zrna obsahující smíšenou bakteriální a kvasinkovou kulturu. Mikroflóra těchto zrn není jednotná, přítomnost a obsah laktobacilů, laktokoků, streptokoků, kvasinek a jiných mikrorganismů se odvíjí od původu kefírových zrn. V současné době se využívají pro výrobu kefíru lyofilizované kefírové kultury určené přímo do pasterovaného mléka. Pro produkci kefírového mléka dostupného na českém trhu, se používá matečná kefírová kultura. Sortiment tohoto výrobku však není na trhu příliš rozšířený. Hlavními výrobci kefírového mléka jsou mlékárna Valašské Meziříčí, Kunín, Moravia Lacto a.s. a mlékárna Čeječičky. V rámci bakalářské práce byla provedena i senzorická analýza s účelem posouzení senzorické jakosti u dvou vybraných vzorků kefírového mléka. Klíčová slova: kefír, kefírová zrna, kefírové mléko, senzorická analýza

ABSTRACT One of the oldest fermented dairy products is kefir. It consists of probiotic strains of microorganisms inhabiting the intestinal system and easing digestion. Its popularity has been growing, especially in Russia and Asian countries. The kefir grains containing mixed bacterial and yeast culture are used in a traditional production of kefir. Microflora of kefir grains is not uniform, the presence and amount of lactobacilli, lactococci, streptococci and yeasts depends on the difference of kefir grains origin. Nowadays freeze-dried kefir culture are used that is directly given into the heattreated milk. For the production of kefir milk, which is available on Czech markets, is used mother culture. A range of this product is mainly widespread by dairy Valašské Meziříčí, Kunín, Moravia Lacto a.s. and dairy Čeječičky. In the bachelor thesis, there was performed a senzorial analysis to assses a senzory quality in two selected samples of kefir milk.

Key words: kefir, kefir grains, kefir milk, sensory analysis

OBSAH 1

ÚVOD ....................................................................................................................... 7

2

CÍL PRÁCE .............................................................................................................. 8

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 9 3.1

Kefír ................................................................................................................... 9

3.1.1

Kefírová zrna ............................................................................................ 11

3.1.2

Mikroflóra kefírových zrn ........................................................................ 13

3.1.3

Použití kefírových zrn k výrobě kefírové kultury ..................................... 14

3.1.4

Čistá kefírová kultura................................................................................ 16

3.1.4.1 Výroba lyofilizované kefírové kultury ................................................... 18 3.2

Biochemické procesy ....................................................................................... 18

3.2.1

Změny složek mléka během fermentace ................................................... 19

3.2.1.1 Laktosa .................................................................................................. 19 3.2.1.2 Bílkoviny ................................................................................................ 19 3.2.1.3 Mléčný tuk ............................................................................................. 20 3.2.1.4 Vitaminy ................................................................................................ 20 3.2.2

Mléčné kvašení ......................................................................................... 20

3.2.2.1 Homofermentativní mléčné kvašení ...................................................... 21 3.2.2.2 Heterofermentativní mléčné kvašení. .................................................... 21 3.2.3

Etanolové kvašení ..................................................................................... 22

3.2.4

Produkce exopolysacharidu ...................................................................... 23

3.3

Výroba kefíru ................................................................................................... 23

3.3.1

Požadavky na mléko ................................................................................. 23

3.3.2

Úprava mléka ............................................................................................ 24

3.3.3

Vlastní fermentace .................................................................................... 25

3.4

Výroba kefírového mléka ................................................................................. 27

3.5

Senzorické vlastnosti ........................................................................................ 28

3.5.1

Vady kefíru ............................................................................................... 29

3.6

Faktory ovlivňující kvalitu kefíru .................................................................... 29

3.7

Nutriční a chemické složení kefíru .................................................................. 31

3.7.1 3.8

Kefír jako probiotikum ............................................................................. 33

Sortiment kefíru na českém trhu ...................................................................... 35

3.8.1

Monitoring kefírů v obchodní síti ............................................................. 37

MATERIÁL A METODIKA.................................................................................. 41

4

4.1

Materiál ............................................................................................................ 41

4.2

Metodika .......................................................................................................... 41

5

VÝSLEDKY ........................................................................................................... 42

6

ZÁVĚR ................................................................................................................... 46

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .................................................................... 48

8

SEZNAM OBRÁZKŮ ............................................................................................ 53

9

SEZNAM TABULEK ............................................................................................ 53

10

SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................ 54

11

PŘÍLOHY ............................................................................................................... 55

1 ÚVOD Fermentované mléčné výrobky tvoří od nepaměti základní součást lidské výživy. Tyto výrobky mají svůj původ v lidových mléčných nápojích a jsou rozšířené po celém světě. Vznikaly přirozeným kvašením mléka, a to činností mléčných bakterií a kvasinek, které syrové mléko přirozeně obsahuje, nebo se do něho dostaly sekundární kontaminací. Na světě, podle odhadů, existuje několik set druhů kysaných mlék. Ve srovnání se sladkým mlékem mají mnoho předností a jsou velmi oblíbenou a nejrozšířenější formou konzumního mléka (Hylmar, 1986). Fermentované mléčné produkty, které jsou vyráběny za pomocí určitých kmenů bakterií mléčného kvašení a kvasinek, se nazývají kefír a kumys. Jejich smyslové vlastnosti jsou výsledkem produkce kyseliny mléčné, oxidu uhličitého, alkoholu a ostatních aromatických sloučenin, které jsou utvářeny při kvašení. Tyto výrobky jsou také někdy označovány jako alkoholické mléčné nápoje. Pocházejí ze střední Asie, z oblastí Kavkazských hor a z Mongolska. Jsou velmi oblíbené i v mnoha zemích východní Evropy. Kefír je jedním z nejstarších známých zakysaných mléčných výrobků. Tradičně se kefír vyráběl především doma, ale postupem času se začal vyrábět průmyslově (Tamime, 2006), (Davison & Jaine, 2006). V Rusku je kefír považován za národní nápoj, avšak označení kefír lze použít pouze tehdy, pokud byl vyroben z kefírových zrn. V současné době se v České republice setkáme pouze s kefírovým mlékem, které obsahuje menší množství kvasinek a jeho senzorické vlastnosti se liší od originálního kefíru (Suková, 2012). V Rusku je spotřeba tohoto výrobku 4 – 5 kg na osobu za rok (Janštová et al., 2012). Tradiční šumivý kefír se z technologicky-technických důvodů u nás přestal vyrábět (Hylmar, 1986).

7

2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce bylo: 

prostudování odborné literatury o výrobě kefíru,



vypracování literární rešerše o výrobě, kvalitě a sortimentu kefíru a kefírových mlék na českém trhu,



a senzorické posouzení jakosti vybraných kefírových mlék dostupných v českých obchodech.

8

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Kefír Kefír je fermentovaný mléčný výrobek s bakteriální a kvasinkovou kulturou. Jedná se o tradiční nápoj z oblasti Kavkazu, který se vyrábí z kravského, kozího, ale i buvolího

mléka.

Nejčastěji

však

z mléka

kravského

(Chandan,

Wouters

& Geuters, 2006). Tento mléčný nápoj je znám především v Rusku a jihozápadní Asii, ale v dnešní době je kefír či kefírové mléko průmyslově vyráběn v mnoha zemích po celém světě. (Walstra, Wouters & Geuters,

2006). Kefír byl konzumován po tisíce let

v Kavkazských horách, přestože se objevoval jen v některých oblastech světa, jeho popularita vzrostla především v zemích bývalého Sovětského svazu. Je také dobře znám ve Švédsku, Norsku, Finsku a Německu. Jeho oblíbenost roste i ve Spojených státech a v Japonsku (Otles & Cagindi, 2003). Kefíru podobné nápoje, vyrobené ze směsi mikroorganismů, které do jisté míry produkují senzorické vlastnosti podobné tradičnímu kefíru, ale chybí jim jeho charakteristické vlastnosti, jsou známé po světě jako Omaere (v jího.západní Africe), Rob nebo Roba (v některých arabských zemích), KjaKlder MjoKlk (v Norsku), Kellermilch (v Německu) nebo Tarag (v Mongolsku) (Otles & Cagindi, 2003). Kefír se vyrábí za použití kefírových zrn. Ačkoli jejich původ není znám, vypráví se legenda o tom, že zrna dostali obyvatelé Kavkazských hor od proroka Mohameda. Tradiční fermentace kefíru probíhala v koženém vaku z kozí kůže. Vždy se část zkvašeného obsahu odebrala a nahradila čerstvým mlékem. Vak byl zavěšen u vchodu, a když někdo prošel kolem, zaklepal na něj, aby mléko nezůstalo smíchané s kefírovými zrny (Chandan, Wouters & Geuters, 2006). Slovo kefír je odvozeno od tureckého slova „kef“, které lze přeložit jako „příjemný“ (Hui, 2007). Kefír patří mezi nejstarší fermentované mléčné nápoje a jeho technologie výroby a použití konkrétní startovací kultury se vyvíjelo po staletí (Tamime, 2006). Od jiných fermentovaných mléčných výrobků se kefír liší přítomností kvasinek, které v jiných mléčných nápojích nenajdeme. Dalším rozdílem je odlišný charakter biochemických pochodů, které probíhají při fermentaci. U kefíru se uplatňuje 9

homofermentativní i heterofermentativní mléčné kvašení a etanolové kvašení. Výsledné aroma je pak dáno rovnováhou mezi kyselinou mléčnou, biacetylem, acetaldehydem, etanolem a acetonem. Při fermentaci vzniká i oxid uhličitý, který dává kefíru šumivý charakter. Poměr mezi mléčným a etanolovým kvašením záleží na charakteru použité kultury (kefírová zrna, uměle sestavená kultura) a podmínkami kultivace (Kadlec, Melzoch & Voldřich 2009). Během fermentace se vytvářejí peptidy a exopolysacharidy, u kterých byly prokázány bioaktivní vlastnosti, a bylo také dokázáno, že kefíry mají antikarcinogenní, antimutagenní, antivirové a antimykotické vlastnosti (Lacmanová, 2010). Obsah kyseliny mléčné se pohybuje kolem 0,7 až 1 %, obsah alkoholu kolem 0,05 až 1 %, nejčastěji však kolem 0,5 %. Tyto hodnoty závisí na inkubaci a skladovacích podmínkách. Produkty fermentace by se měly tvořit v určitých poměrech, abychom získali vyváženou chuť. Některé přeměny mají negativní vliv na kvalitu, například když se začne tvořit nežádoucí kyselina octová z alkoholu pomocí bakterií octového kvašení za přístupu vzduchu (Walstra, Wouters & Geuters, 2006). Barva kefíru je bílá až nažloutlá, vůně je vyvážená a kvasnicová, chuť je kyselá, ale zároveň příjemná a osvěžující. Konzistence je hustá, ale ne lepivá. Hlavní složky kefíru, které se podílejí na senzorických vlastnostech kefíru, jsou kyselina mléčná, těkavé kyseliny, diacetyl, oxid uhličitý a etanol (Tamime, 2006). Na kvalitě výsledného kefíru se také podílí složení mikroflóry kefírových zrn a druh mléka, které použijeme k výrobě (Chandan, Wouters & Geuters, 2006). Podle ruského zákona č. 88-FZ o mléce a mléčných produktech lze pojmem kefír označit mléčně kysaný nápoj vyrobený z mléka (kravského, kozího aj.) za použití mléčného a alkoholového kvašení pomocí zákvasu z kefírových zrn, bez použití čistých kultur. Složení kefírové kultury (bakterie a kvasinky) je velmi komplikované a ne zcela známé, zatímco čisté kultury jsou sestavené z jednotlivých známých kmenů, ale v lepším případě mohou být získány i z kefírových zrn (Suková, 2012). V Rusku patří kefír k nejoblíbenějším kysaným mléčným výrobkům. Tradiční kefír vyrobený z fermentační kultury ve formě kefírového zrna se vyznačuje typickými senzorickými vlastnostmi a léčebně profylaktickými vlastnostmi. Tím se liší od kefíru vyráběného z čistých mlékařských kultur. Ruskému mlékárenskému výzkumnému institutu VNIMI se podařilo vyvinout postup kultivace stabilních kefírových zrn, který 10

je licenčně využíván i v Japonsku, USA a Kanadě. Kefír bývá bohužel často v zahraničí považován za produkt vyrobený jen z určitých druhů mikroorganismů (Suková, 2011). 3.1.1 Kefírová zrna Základem mikrobiální kefírové kultury jsou malá kefírová zrna želatinové konzistence a nažloutlé barvy připomínající jednotlivé miniaturní růžičky květáku. Zrna vznikají kombinací příslušných mikroorganismů a jejich produktů při látkové přeměně v mléce (Pinho et al., 2010), (Görner & Valík, 2004). Všechny přítomné mikroorganismy jsou zapojené v určité struktuře, v tzv. zrnech. V důsledku koagulace bílkovin během fermentace zrna rostou a spojují se díky vytvořenému exopolysacharidu kefiranu, který je produkován laktobacily (Walstra, Wouters & Geurts, 2006). Při fermentaci vyplouvají kefírová zrna na povrch mléka v důsledku produkce CO2. Po koagulaci kaseinu dochází k jeho nalepení na povrch zrn a v tomto kaseinovém povlaku se mikroorganismy dále množí a metabolizují. Takto kefírová zrna zvětší svoji hmotnost za týden o 30 - 50 % (Görner & Valík, 2004). V průměru se velikost zrn pohybuje od 0,3 do 2,0 cm. Zrna jsou tuhá, ale pružná a mají charakteristické aroma. Jsou specifická svojí strukturou a biologickou funkcí (Tamine,

2006).

Pozorování

kefírových

zrn

pod

skenerovým

elektronovým

mikroskopem ukázalo, že povrch kefírových zrn je velmi hrubý a ve vnitřní části jsou nepravidelné otvory. Na vnější části zrna byly kvasinky pozorovány jasněji než bakterie (Ahmed, Mohamed & Aymann 2011). Pokud kefírová zrna naočkujeme do mléka, začnou produkovat více biomasy a předávají svoje vlastnosti následující generaci nově vzniklých zrn. Mimo jiné je mikroflóra kefírových zrn stabilní a udržuje si svoji činnost, pokud je inkubována a zachována ve vhodných podmínkách a není kontaminována jinou mikroflórou (Tamime, 2006). V suchém stavu obsahují kefírová zrna 12,35 % vody, 75,71 % bílkovin, 3,79 % tuku, 6,62 % popela a 1,44 % kyseliny mléčné. Kefírová zrna uchováváme buď ve stavu latentním, tj. vysušená, nebo živá, tj. v živném roztoku. Použijeme-li k výrobě kefíru kefírová zrna, musí nejprve dojít k jejich aktivaci, a to tím, že je uložíme na 24 h do převařené vody, která je zchlazená na 25 až 30 °C. Po promytí se tato operace opakuje. 11

Kefírová zrna nabobtnají, dostanou světlejší barvu a pružnou konzistenci. Tímto způsobem se oživená zrna přenesou do převařeného mléka, které je vytemperováno na 20 °C. V něm se zrna kultivují po dobu 24 h při teplotě 18 až 20 °C, nejvýše však při 22 °C. Na oživení zrn lze použít také mléko. V tomto případě se suchá zrna vloží do vody 30°C teplé, ale pouze jen na 3 h. Voda se slije a zrna se přelijí svařeným mlékem o teplotě 20 °C. Každý den je pak nutné mléko vyměňovat, dokud zrna nezměknou a dostanou formu podobnou květáku. K dosažení optimálního poměru mikroflóry se vyžaduje často delší než desetinásobné přeočkování. Dobrá kefírová zrna se poznají podle typicky příjemné kefírové vůně a lehce štiplavé chuti. U oživených, původně vysušených zrn je další postup stejný jako při použití zrn živých (Kněz et al., 1960). Jako přírodní startovací kultura mají kefírová zrna vysoký počet bakterií mléčného kvašení a kvasinek. Biomasa zrn se pomalu zvyšuje po sobě jdoucích fermentacích. Kefírová zrna jsou nezbytná pro výrobu tradičního kefíru, avšak jsou k dispozici komerční lyofilizované startovací kultury pro průmyslovou výrobu kefíru. (GuzelSeydim et al., 2010). Tradiční výroba kefíru je omezena pomalým růstem biomasy kefírových zrn. Účelem jedné studie v Turecku bylo zvýšit biomasu kefírových zrn aplikací různých procesních parametrů pomocí různých růstových médií jako je syrovátkový proteinový izolát, modifikovaný syrovátkový protein, nebo inulin a fermentace probíhala za určitých atmosférických podmínek. Studie ukázala, že nejvyšší byl nárůst biomasy zrn u mléka s přídavkem syrovátkového proteinového izolátu při zachování původní mikroflóry kefírových zrn. Je tedy možné využití syrovátkové bílkoviny při výrobě kefíru, ale je potřeba dalších výzkumů (Guzel-Seydim et al., 2010). Kefírová zrna jsou ohrožena reinfekcí a vyvolávají různé jakostní vady. Jestliže se vychází při výrobě kefíru vždy ze zrn, hrozí nebezpečí, že vyrobená kultura bude mít kolísavou jakost, která může být také ovlivněna různými vadami zrn, nejčastěji mikrobiálního původu. Mezi nejčastější vady patří znečištění mléčnou plísní, vznikající při nedostatečném ošetření, znečištění bakterií Bacterium coli, slizovitost zrn nebo vada zrání, projevující se zpomalením zrání kefíru, kdy se mléko nesrazí vůbec (Kněz et al., 1960).

12

3.1.2 Mikroflóra kefírových zrn Mikroflóra kefírových zrn je složitá a velmi proměnlivá. Liší se svým složením v různých zeměpisných oblastech a někdy i rámci dané oblasti (Chandan, Wouters & Geurts, 2006). V mikroflóře zrn nalezneme mléčné kvasinky, mléčné streptokoky Streptococcus thermophilus, lactobacily a laktokoky typické pro kefírovou kulturu. Z laktokoků jsou to především Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris. Z laktobacilů jsou Lactobacillus delbrueckii, Lactobacilus brevis, Lactobacillus casei a Lactobacillus kefir. Z mléčných kvasinek jsou to například Kluyveromyces fragilis, Torulopsis kefir (Candida kefir), případně i laktosu nefermentující kvasinky rodu Saccharomyces a Pichia. Informace o složení původní kefírové mikroflóry se podle jednotlivých autorů u laktobacilů a kvasinek liší. Je to způsobené různým původem kefírových zrn (Görner & Valík 2004). Z celkového počtu mikroorganismů tvoří 80 % laktokoky, 12 % kvasinky a zbylých 8 % je tvořeno laktobacily. Další mikrobiální druh, který je v kefírových zrnech přítomný, je Acetobacter rasens a Acetobacter aceti. Jeho přítomnost je považována jako znečištění, ovšem podle některých autorů je žádoucí součástí kefírových zrn (Tamine, 2006). Protože mikroflóra kefírových zrn není jednotná, používají se v praxi při výrobě oddělené kultury streptokoků, laktobacilů a kvasinek. Bývají izolované z kefírových zrn, ale mohou pocházet i z jiných zdrojů. V umělé kefírové kultuře můžeme nahradit laktokoky mezofilním (smetanovým) zákysem (Görner & Valík, 2004).

13

Obr. 1 Mikroflóra kefírového zrna (Chandan, 2006) Byla zkoumána i jednotlivá bakteriální rozmanitost u tibetských kefírových zrn z různých oblastí Číny. Celkem byly k dispozici 4 vzorky z různých míst. Rod Lactococcus byl zastoupen v rozmezí 40 – 70 %, Lactobacillus 10 – 48 %, Acetobacter 4 - 14 %, Shewanella 1,7 – 7,6 %, Leuconostoc 0,6 - 0,8 %, Pseudomonas 0,07 - 0,6 %, Streptococcus 0,02 - 0,22 %, Acinetobacter 0,05 - 0,12 %, Pelomonas 0 - 0,01 %, Dysgonomonas 0 - 0,01 %, a Weissella 0 - 0,01 %. Shewanella, Acinetobacter, Pelomonas, Dysgonomonas, Weissella, a Pseudomonas byly u tibetských kefírových zrn nalezeny poprvé (Gao et al., 2013). Je tedy zřejmé, že mikrobiální flóra kefírových se zrn se v každé zemi liší a v důsledku toho, mají pak výsledné produkty jiné senzorické vlastnosti (Tamine, 2006). 3.1.3 Použití kefírových zrn k výrobě kefírové kultury Vybraná jakostní oživená či živá zrna se promyjí sterilní vodou a vloží se do pasterovaného mléka vytemperovaného na 20 - 25 °C a kultivují se při teplotě 15 – 20 °C 36 až 72 h. Sražené mléko, tj. získanou kefírovou kulturu, přefiltrujeme přes sterilní síto a plníme do připravených lahví. Na sítě zůstávají kefírová zrna, která musíme před dalším použitím ošetřit, a to tak, že je nejdříve promyjeme 1 až 2% roztokem sody a následně sterilní vodou. Hotová kefírová kultura, jejíž kyselost 14

dosahuje kolem 45 až 50 SH, je smetanové barvy s dosti hustou konzistencí a dle obsahu oxidu uhličitého je méně či více pěnivá (Kněz et al. 1960). Kefírová zrna používající se při výrobě, se musí přenášet do čerstvého živného roztoku každý den, nejméně však třikrát až čtyřikrát týdně. Zrna, která se zrovna ve výrobě nepoužívají, se ukládají do sterilního nasyceného cukerného roztoku nebo do syrovátky v tmavých hnědých lahvích do chladu a temna. Vydrží zde až několik měsíců a k jejich opětovnému použití je stačí promýt sterilní vodou (Kněz et al., 1960). K výrobě kefírové kultury není vždy nutné používat kefírová zrna. Matečnou kefírovou kulturou, připravenou ze zrn, se naočkuje pasterované mléko, nechá se kultivovat a vznikne expediční kefírová kultura, která má značné přednosti oproti kultuře vyprodukované přímo z kefírových zrn (Kněz et al., 1960). Podle Tamime (2006) se kefírová zrna uchovávají v izotonickém solném roztoku. Množení kefírových zrn je založeno na každodenním vkládání do odstředěného mléka, které se předtím musí zahřát na 95 °C po dobu 30 minut. Následně je zchlazeno na 18 20 °C a zaočkováno kefírovými zrny. Inkubace probíhá 20 – 24 hodin a zrání 7-8 h při 10 - 12 °C, aby se podpořil růst kvasinek. Zrna jsou odstraněna pomocí sterilního síta. Takto získaný fermentát bez kefírových zrn nazýváme matečnou kulturou, kterou následně naočkujeme do čerstvě připraveného mléka, abychom připravili provozní zákys. kefírová zrna → kefírová zrna + mléko → přecezení → matečná kultura → provozní zákys kefírová zrna na další použití

mléko

Obr. 2Schéma výroby kefírové kultury z kefírových zrn (upraveno podle Tamime, 2006) Jedním z nejdůležitějších aspektů při přípravě kefírové kultury je manipulace se zrny. Nedoporučuje se propláchování kefírových zrn, pokud jsou každý den převáděny do čerstvě připraveného mléka. V praxi je oplachování běžné, ale může to mít za následek snížení počtu laktokoků a kvasinek, a tím se změní rovnováha mezi různými mikroorganismy (Tamime, 2006). 15

3.1.4 Čistá kefírová kultura Kefírová kultura má zvláštní postavení mezi čistými mlékařskými kulturami. K její přípravě se používá buď originálních kefírových zrn, nebo se ve speciálních závodech na

výrobu

čistých

mlékařských

kultur

(ČMK)

uměle

sestavuje

z čistých

mikroorganismů příslušného rodu, a proto nebývá složení jednotlivých kefírových kultur jednotné. Uměle sestavená čistá kefírová kultura má ve srovnání s kefírovými zrny tu výhodu, že při jejím používání nedochází k vadám, které se vyskytují u originálních zrn a nemůže dojít ke ztrátě standardní jakosti (Teplý et al., 1968). Čisté kultury se sestavují, z různých druhů vybraných kefírů, izolováním koků a tyčinek mléčného kysání a kefírových kvasinek. Těchto mikroorganismů se využije pro sestavení nové směsné kefírové kultury. Druhým způsobem je využití přímo čistých kultur streptokoků, laktobacilů a kvasinek zkvašující laktózu. Při sestavování umělé kultury je nutno dbát na kvantitativní poměr mezi jednotlivými skupinami mikroorganismů (Kněz et al., 1960). Firmy, které vytvářejí ČMK nebo také jinými slovy startovací kultury, vynaložily spoustu úsilí, aby vyrobily startovací kefírovou kulturu, která nebude produkovat zrna během výroby kefíru. V důsledku toho jsou vlastnosti konečného produktu odlišné od tradičního kefíru (Tamine, 2006). ČMK se vyrábějí v podobě různých forem a pro různé aplikace. Mohou být ve formě tekuté, mražené nebo lyofilizované a mohou se aplikovat jako matečné, provozní nebo pro přímé očkování výroby (Milcom, 2013). Používání tekuté kultury na výrobu matečné kultury se omezuje (Kadlec, 2006). Kefírová kultura je velmi náročná na uchovávání a je potřeba dodržovat specifické podmínky. Řešením jsou lyofilizované kultury, které nabízí např. společnost Sojuzsnab (Rusko), a při jejichž použití lze dosáhnout prodloužení skladovatelnosti (14 dní při teplotě do 6 ºC) (Suková, 2004). V současné době se ve většině podniků vyrábějící kefír používají právě tyto lyofilizované kefírové startovací kultury (tj. směs mikroorganismů sestavených na základě původní mikroflóry přítomné v kefírových zrnech, s kmeny kvasinek, které neprodukují příliš mnoho CO2). Jen velmi málo podniků stále množí kefírová zrna. V takových případech je kvašený nápoj prosazován jako speciální produkt, tedy tradiční kefír výjimečné kvality se zdravotními výhodami (Tamime, 2006). 16

Komerční lyofilizované startovací kultury pro průmyslovou výrobu kefíru mají obvykle méně bakterií mléčného kvašení a kvasinek, a protože komerční kultury neobsahují autentické mikroorganismy kefírových zrn, je u finálního výrobku pozorován výrazný pokles v chuti a vůni. Kromě toho by omezený mikrobiální obsah mohl být známkou omezených zdravotních výhod (Guzel-Seydim et al., 2010). Vědci a výrobci mléčných startovacích kultur se snaží vyvinout kefír smícháním bakterií mléčného kvašení, ABT kultury (směs probiotických bakterií Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria a Streptococcus thermophilus) a probiotické mikroflóry kvasinek tak, aby se vyrovnal tradičnímu kefíru vyrobenému ze zrn (Tamime, 2006). Firma Danisco Biolacta Spolka z o.o. v Polsku vyvinula různé DVI (direct-to-vat set inoculation) nebo DVS (direkt-to-vat set) lyofilizované kefírové kultury (Tamime, 2006). Jsou to vysoce koncentrované a standardizované kultury (10 10 až 1011 KTJ/ml), které nepotřebují žádnou aktivaci před použitím (Šustová & Sýkora, 2013). Na obrázku 3 jsou znázorněny různé typy kultur pro výrobu kefíru. M-typ je známý jako matečná kultura, která je pěstována dvakrát, pro výrobu meziproduktů a provozního zákysu. S-D-kultura (tj. polo-přímá) se používá pro výrobu provozního zákysu a D-kultura (DVI nebo DVS) na přímé očkování se přidává přímo do zpracovaného mléka pro výrobu kefíru. Pokud jsou tyto kultury pěstovány v mléce, nejsou produkována žádná zrna (Tamime, 2006).

Obr. 3 Diagram pro průmyslovou výrobu kefíru pomocí různých typů kultur (Tamime, 2006) 1 - lyofilizovaná zákysová kultura, 2 - matečný zákys, 3 - provozní zákys, 4 - kefír 17

3.1.4.1 Výroba lyofilizované kefírové kultury Propagace lyofilizovaných kultur má následující fáze: 1. Propagace kefírových zrn – provádí se v automatizovaném a přísně kontrolovaném procesu, který vyžaduje 7x1-denní růstový cyklus. Zrna se pěstují v mléce, po fermentaci se oddělí odstředěním, přemístí se do čerstvého mléka, a po sedmém cyklu se biomasa zvýší o 100 - 120 %. 2. Část zrn je zachována pro výrobu dalších dávek, zatímco zbytek se homogenizuje, smísí s kryoprotektivní složkou, lyofilizuje (suší vymrazováním) a je skladován při teplotě 4 °C. 3. Lyofilizovaná kultura je standardizována ve vztahu k její aplikaci, balena v ochranné atmosféře. Pro zlepšení DVI/DVS startovací kultury se přidávají probiotické bakterie jako Lb. acidophilus nebo Bifidobacterium spp. (Tamime, 2006). K výrobě lyofilizované kultury lze použít syrovátku, která se ukázala, jako dobrá kryoprotektivní látka omezující tvorbu ledových krystalů uvnitř buněk, a umožňuje 86% přežití kefírové kultury a vykazuje uspokojivou metabolickou aktivitu lyofilizovaných kultur (Papavasiliou et al., 2008).

3.2 Biochemické procesy Principem při výrobě kysaných mléčných výrobků jsou fyzikálně-chemické procesy, které jsou důsledkem působení specifické mikroflóry, zejména na laktose a bílkovinách mléka. (Janštová et al., 2012). Fermentace mléka je ve své podstatě prodloužení trvanlivosti výrobků biologickou konzervací, kdy část přítomné laktosy v mléce je během fermentace přeměněna na kyselinu mléčnou a současně vznikají v závislosti na typu použitých mikroorganismů pro fermentaci karbonylové sloučeniny, těkavé mastné kyseliny, aminokyseliny, etanol, oxid uhličitý, polysacharidy a jiné. Všechny tyto sloučeniny v součinnosti s dalšími faktory jsou zodpověděné za nutriční, senzorické a příp. dietetické vlastnosti fermentovaných mlék. Kyselina mléčná, která vzniká při kvašení, přirozeně snižuje pH výrobku na hodnoty 3,8 – 4,6 a tím zamezuje růstu nežádoucích bakterií (Kadlec, Melzoch & Voldřich, 2009). 18

3.2.1 Změny složek mléka během fermentace 3.2.1.1 Laktosa Laktosa je redukující disacharid složený z D-glukosy a D-galaktosy, které jsou spojené

glykosidickou

vazbou

(4-O-β-D-galaktosyl-β-D-glukopyranosa) (Kadlec,

Mezolch & Voldřich, 2009). Laktosa tvoří základní zdroj energie pro mikrobiální metabolismus. Příkladem katabolického rozkladu je homofermentativní mléčné kvašení, kdy vzniká z laktosy, po enzymové hydrolýze na glukosu a galaktosu, kyselina mléčná. Glukosa je fermentována na kyselinu mléčnou přímo, galaktosa po enzymové přeměně na glukosu. V závislosti na aktivitě dehydrogenas a racemas použitých mikroorganismů vzniká směs různých optických isomerů kyseliny mléčné (Forman, 1996). 3.2.1.2 Bílkoviny U zfermentovaných mléčných výrobků se celkový obsah a složení aminokyselin nemění. Slabá proteolytická aktivita je patrná u výrobků získaných fermentací čistými kulturami, obsahující rody Lactobacillus. Část proteolyticky uvolněných aminokyselin je bakteriemi mléčného kvašení využívaná jako zdroj dusíku (Forman, 1996). Kvasinky přítomné v kefíru umí degradovat kasein na peptidy a volné aminokyseliny. Větší rozsah proteolýzy je u kefíru než např. u jogurtu (Tamime, 2006). Fermentační procesy laktosy mají vliv na texturní a senzorické vlastnosti kysaných mléčných výrobků. Produkcí kyseliny mléčné dojde ke snížení pH až do izoelektrického bodu kaseinu (pH = 4 - 5), a to vede ke koagulaci kaseinu (= kyselé srážení) a vzniku charakteristické gelovité konzistence. Proteolytickou činností kvasinek v kefíru dochází ke vzniku degradačních produktů kaseinu (Janštová et al., 2012). Degradace kaseinu je dále ovlivněna použitým rodem a druhem čisté mlékařské kultury, pH, teplotou a délkou skladování (Forman, 1996). Hydrolýza bílkovin je závislá na poměru kefír:mléko a na inkubační době. Kefír obsahuje peptidy odvozené od proteolýzy α-laktoglobulinu, α, β a κ-kaseinu (Pinho et al., 2010).

19

3.2.1.3 Mléčný tuk Při výrobě kysaných mléčných výrobků dochází pouze k minimálním změnám na tukové složce, které spočívají ve zvýšeném zastoupení volných mastných kyselin (Janštová et al., 2012). Volné mastné kyseliny vznikající lipolýzou tuku v mléce se stávají prekurzorem chuťových a aromatických sloučenin v kefíru jako jsou metylketony, alkoholy, laktony a estery (Tamime, 2006). Množství volných mastných kyselin se mění v závislosti na druhu mléka, složení mléka, a mikrobiologických a technologických procesech během výroby i při enzymových změnách na laktose a degradaci aminokyselin (Forman, 1996). 3.2.1.4 Vitaminy Během fermentace lze pozorovat metabolické využívání vitamínů bakteriemi mléčného kvašení a následnou syntézu vitamínu těmi samými mikroorganismy (Kadlec, 1996). Kvasinky v kefíru syntetizují vitamíny skupiny B. Acetobacter spp. produkuje vitamín B12, který podporuje růst ostatních mikroorganismů přítomných v kefírovém zrnu (Tamine, 2006). 3.2.2 Mléčné kvašení Všechny bakterie mléčného kvašení (BMK) potřebují organický uhlík jako zdroj uhlíku a energie. Neumí získávat energii pomocí dýchání, a proto energii ve formě ATP (adenosintrifosfát) získávají glykolýzou (Walstra, Wouters & Geuters, 2006). Dá se říct, že hlavní činností bakterií mléčného kvašení je degradace sacharidů přítomných v mléce na kyselinu mléčnou pro vytvoření energie potřebné pro syntézu biomasy (Tamine, 2006). BMK fermentují sacharidy v závislosti na jejich rodu a druhu metabolické dráhy (Görner & Valík, 2004). Některé BMK mají schopnost metabolizovat kyselinu citrónovou, jejíž obsah v mléce je malý, na diacetyl, který je důležitou aromatickou sloučeninou ve fermentovaných mléčných výrobcích (Wasltra,Wouters & Geuters, 2006). Rozklad laktosy začíná její hydrolýzou pomocí enzymu laktázy (β-galaktosidázy) na glukózu a galaktózu: C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6 20

Galaktóza pak přechází na glukózu a obě molekuly glukózy jsou přes řadu meziproduktů rozloženy na kyselinu pyrohroznovou (CH3-CO-COOH), která je základním meziproduktem společným všem typům rozkladu (Mlékárenské technologie, 2007). 3.2.2.1 Homofermentativní mléčné kvašení Homofermetativní BMK ze sacharidů vytvářejí téměř výhradně kyselinu mléčnou, asi z 90 %. Mezi homofermenativní BMK patří rody Lactococcus, Streptococcus a některé bakterie rodu Lactobacillus (Görner & Valík, 2004). Při tomto způsobu fementace se kyselina pyrohroznová redukuje na kyselinu mléčnou. Homofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice: CH3COCOOH + 2 H → CH3-CHOH-COOH (Mlékárenské technologie, 2007) 3.2.2.2 Heterofermentativní mléčné kvašení. Heterofermemtativní BMK ze sacharidů tvoří nejenom kyselinu mléčnou (> 50 %), ale i CO2, kyselina octovou a etanol. Součástí kefírových zrn je Lactobacillus kefir, který je heterofermentativní složkou kefíru, dále zde patří bakterie rodu Leuconostoc (Görner & Valík 2004). Heterofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice: 2 C6H12O6 + H2O → 2 CH3-CHOH-COOH + CH3COOH + CH3CH2OH + CO2 + H2 (Mlékárenské technologie, 2007).

21

Obr. 4 Obecné schéma fermentace glukózy u BMK (upraveno dle Caplice a Fitzgerald 1999) 3.2.3 Etanolové kvašení Metabolické procesy kvasinek zahrnují biochemickou asimilaci, kdy dochází ke spotřebě energie a tvorbě nového buněčného materiálu, a disimilace, u které dochází ke katabolickým dějům, tedy k výrobě energie. Většina kvasinek využívá sacharidy jako hlavní zdroj uhlíku a energie (Tamime, 2006). U kefíru je využíváno fermentačních schopností kvasinek rodu Torula, kdy zkvašováním glukosy vzniká etanol a oxid uhličitý (Janštová et al., 2012). Kvasinky rodu Saccharomyces a Kluyveromyces jsou schopné metabolizovat široké spektrum sacharidů zahrnující glukosu, laktosu, galaktosu a fruktosu (Tamime, 2006). Etanolové kvašení probíhá dle následující reakce: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 92 kJ Kefír obsahuje kromě 0,5 - 2 % alkoholu i významné množství oxidu uhličitého (Janštová et al., 2012).

22

3.2.4 Produkce exopolysacharidu Mikroflóra kefírových zrn je držena pohromadě v unikátní matici bílkovin a polysacharidů (Seydim et al., 2013). Bakterie mléčného kvašení a kvasinky jsou uloženy v slizkém exopolysacharidu (EPS) nazývaném kefiran. Mezi mikroorganismy zde existuje symbiotický vztah (Pinho et al., 2010). Kefiran je rozpustný ve vodě, obsahuje přibližně stejné množství D-glukosy a D-galaktosy a je produkován homofermentativními druhy rodu Lactobacillus, jako je L. kefiranofaciens a L. kefir (Otles & Cagindi, 2003). Bakteriální růst je právě doprovázen produkcí EPS, který má různé fyziologické funkce. EPS může být pevně připojen k povrchu buňky nebo je vylučován do jejího okolí. Roste zájem o studium exopolysacharidů produkovaných BMK, protože je lze použít v potravinářství, jelikož zlepšují texturní vlastnosti fermentovaných mléčných výrobků a jsou obecně považovány za bezpečné (Zajšek, Kolar & Goršek, 2011). Exopolysacharid kefiran zlepšuje texturu a pocit v ústech při konzumaci kefíru. V posledních letech se kefiran používá v potravinářském průmyslu jako guma, stabilizátor, emulgátor a zlepšující přípravek ve vývoji nových obalových materiálů. Kefiran může mít terapeutický, imunostimulační, antimutagenní účinek a může působit jako prebiotická směs (Seydim et al., 2013). Kromě toho, kefiran zvyšuje produkci interferonu β-kortizolu a noradrenalinu v lidských buňkách a lze ho využít jako potravinový doplněk snižující stres (Zajšek, Kolar & Goršek, 2011).

3.3 Výroba kefíru 3.3.1 Požadavky na mléko Na jakost mléka, které je určeno pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků, jsou kladeny nejpřísnější požadavky. Kromě optimálního složení mléka je velmi důležitým kritériem celkově nízký počet mesofilních mikroorganismů, a to jak aerobních, tak i fakultativně anaerobních (Gajdůšek, 2002). Nežádoucí je vysoký počet psychrotrofních mikroorganismů. Ti mohou ještě před tepelným ošetřením mléka naprodukovat metabolity, které inhibují růst bakterií mléčného kvašení (mastné kyseliny) nebo negativně ovlivnit chuť, vůni a konzistenci výrobku. Mléko musí být také prosté inhibičních látek (antibiotika, zbytky čistících 23

a dezinfekčních prostředků), které mohou negativně ovlivnit růst čistých mlékařských kultur. Žádoucí je i dobrá kysací aktivita mléka (Kadlec, Melzoch & Voldřich, 2009). 3.3.2 Úprava mléka U syrového mléka se po vyčištění filtrací upravuje tuk a tukuprostá sušina. Standardizace obsahu tuku zahrnuje úpravu tuku ve výrobku, a to v podobě přidání smetany nebo odtučněného mléka, abychom dosáhli produktu s požadovaným obsahem tuku. Nejobvyklejší rozmezí tuku u fermentovaných mlék je 0,5 - 3,5 %. U kefíru je obsah tuku v rozsahu od 0,5 až do 6 % (Kadlec, Melzoch & Voldřich, 2009). Obsah tuku se v Rusku upravuje mezi 0,1 - 3,3 % a v Polsku v rozmezí 2 - 3,1 % (Tamime, 2006). Obsah tukuprosté sušiny fermentovaných mlék je minimálně 8,2 %. Zvýšením obsahu tukuprosté sušiny, zvláště podílu kaseinu a bílkovin syrovátky, dojde ke zvýšení pevnosti koagulátu fermentovaného výrobku a ke snížení oddělování syrovátky na povrchu (Kadlec, 2009). Úpravy tukuprosté sušiny lze dosáhnout odpařováním vody na odparkách, ultrafiltrací, reverzní osmózou, přídavkem odtučněného sušeného mléka, sušené syrovátky nebo přídavkem mléčných koncentrátů (Gajdůšek, 2002). Obsah vzduchu v mléce, které se používá na výrobu fermentovaných výrobků, musí být co nejnižší. Zvlášť pokud při fermentaci využíváme striktně anaerobních mikroorganismů (rod Bifidobacterium). Deaerace neboli odvzdušňování zlepšuje průběh homogenizace, snižuje riziko napalování při tepelné úpravě mléka, zvyšuje viskozitu a odstraňuje nežádoucí těkavé látky (Kadlec, Melzoch & Voldřich, 2009). Homogenizací mléka zabráníme vyvstávání mléčného tuku v průběhu inkubace a docílíme rovnoměrného rozdělení mléčného tuku ve výrobku. Homogenizace směsi příznivě ovlivňuje chuť a reologické vlastnosti finálních výrobků. Nízkou a střední homogenizací docílíme rozptýlení mléčného tuku, avšak při vysoké homogenizaci dochází k výraznému zjemnění tukové emulze a k ovlivnění fyzikálně-chemických vlastností mléčných bílkovin, kdy sérové bílkoviny částečně denaturují (Forman, 1996). Mléko se obvykle homogenizuje při tlaku 20 - 25 MPa a teplotě 65 - 70 °C. Po homogenizaci následuje tepelné ošetření mléka. Po pasteraci je mléko zchlazeno na teplotu inokulace, která je závislá na typu mikroflóry použité při fermentaci (Kadlec, Melzoch & Voldřich, 2009). 24

Z hlediska zdravotnických předpisů se nesmí používat syrové mléko, proto se vždy musí pasterovat. Nejvhodnější je pasterace vysoká, která devitalizuje přítomnou mikroflóru, čímž se zlepší vlastnost mléka jako substrátu pro mikroorganismy zákysové kultury a eliminuje termolabilní inhibiční látky mléka. Dále dochází ke štěpení bílkovin a rozpustný hydrofilní albumin při vysoké pasteraci koaguluje a spojuje se s molekuly kaseinu, a tím zlepšuje vazbu vody. Sraženina se tak stává hustější, trvanlivější a nedochází k oddělování syrovátky ve finálním výrobku (Görner & Valík, 2004). Optimálních výsledků pasterace je dosaženo při použití tepelného záhřevu při 90 – 95 °C po dobu 5 minut nebo při teplotě 80 - 85 °C a době výdrže 15 až 30 minut (Gajdůšek, 2002). 3.3.3 Vlastní fermentace Mléko je po tepelném ošetření vychlazeno na teplotu inokulace, která je odvozena od použitého typu mikroflóry. U kefíru při průmyslové výrobě je mléko zchlazeno na 18 až 24 °C. V létě je mléko zchlazeno na teplotu 19 °C a v zimě na 22 °C, poté následuje inokulace (Kadlec, Melzoch & Voldřich, 2009), (Tamime, 2006). Mléko, u kterého bude použita DVI startovací kultura, musí být tepelně ošetřeno a zchlazeno na teplotu inokulace 32 – 35 °C (Tamime, 2005). Obvykle se kefír nebo kefírové mléko vyrábí: a) přímo z kefírových zrn b) z kultur uměle sestavených (Forman, 1996) Pasterované mléko se naočkuje 3-4% připraveným provozním zákysem. Naočkované mléko se plní do lahví (při klasické metodě, set type) nebo do polotuhých obalů. Fermentace probíhá 10 - 12 h v 19 - 22 °C (do kyselosti 0,7 ml/100 ml), chladí se na 9 °C a kefír zraje 1 až 3 dny, poté se pomalu zchlazuje na 6 °C před expedicí. U kefíru vyráběného ve fermentačních uzrávačích (stirred type), probíhá fermentace také 10 - 12 h při teplotě 19 - 22 °C, ale poté je zchlazen na 15 °C a následně plněn do obalů, kde zraje pouze po dobu 15 h při 9 °C a je skladován při 6 °C.

25

Provozní zákys

Syrové mléko ↓ Standardizace ↓ Homogenizace (15 MPa) ↓ Tepelné ošetření (93 °C) ↓ Chlazení ↓ Inokulace

Balení ↓ Fermentace (10-12 h, 21 °C) ↓ Chlazení (9 °C) ↓ Zrání (1-3 dny, 9 °C)

Fermentace (10-12 h, 21 °C) ↓ Chlazení (15 °C) ↓ Balení ↓ Zrání (15 h, 9 °C) Chlazení (6 °C) ↓ Distribuce

Obr. 5 Obecné schéma průmyslové výroby kefíru klasickou a takovou metodou (Pozměněno dle Tamine, 2006) Alternativou pro komerčně vyráběný kefír je místo provozního zákysu DVIlyofilizovaná startovací kultura (Tamime, 2006). Je to koncentrovaná kultura bakterií a kvasinek, které se přidávají rovnou do mléka ve fermentačním uzrávači. Po skončení fermentace je vzniklý nápoj jemně promíchám, vychlazen a naplněn do obalů (Šustová & Sýkora, 2013). Výrobní kroky jsou podobné jako u obrázku 5 jen s následujícími rozdíly: 1. Klasická metoda: naočkované a naplněné mléko do obalů kvasí do pH 4,6 - 4,7, ochladí se pod 10 °C a zraje po dobu 15 - 20 h. 2. Tanková metoda: fermentát je zchlazen na 15 - 20 °C (tj. na vyšší teplotu), zabalen a následně pomalu chlazen pod 10 °C a zraje po dobu 15 - 20 h (Tamime, 2006). 26

Na obrázku 6 je ukázáno, jak se dle Hutkinse (2006) liší výroba kefíru v délce fermentace a teplotě chlazení. Tradiční výroba

Moderní výroba

↓

↓

Syrové mléko

Syrové mléko ← standardizace

↓

↓

100 °C, 10 min

Homogenizace

↓

↓

Chlazení na 20 °C

85-95 °C, 5-30 min

↓

↓

Zaočkování kefírovými

Chlazení na 20 °C

zrny ↓ Inkubace, 20 °C, 24 h

↓ Zaočkování kefír. startovací kulturou

↓

↓

Oddělení zrn prosíváním

Inkubace, 20 °C, 24 h

↓

↓

Chlazení 4 °C

Chlazení 4 °C, jemné protřepání

↓

↓

Plnění do obalů

Plnění do obalů

Obr. 6 Tradiční a moderní výroba kefíru (Pozměněno dle Hutkinse, 2006)

3.4 Výroba kefírového mléka Požadavky na mléko jsou stejné jako u výroby kefíru. Mléko se standardizuje na obsah tuku 0,5 – 6 % tuku, homogenizuje při 65 – 70 °C a tlaku 17,5 - 20 MPa a tepelně ošetřuje vysokou pasterací (90 – 95 °C, 5 minut). Takto připravené mléko se zchladí na 23 °C a zakysává kefírovou kulturou. Fermentace probíhá 14 – 18 h při 18 – 22 °C.

27

Inkubace zahrnuje dvě fáze: a) fermentace 12 h do dosažení titrační kyselosti 35 – 40 SH (pH 4,5), koagulát se promíchá, zchladí na 14 – 16 °C, tím se zastaví další fermentace. b) zrání, kdy se vyvíjí typická kvasinková chuť během dalších 12 - 14 h a dosažení konečného pH 4,4. Finální výrobek je zchlazen pod teplotu 10 °C a plněn do obalů (Janštová et al., 2012).

3.5 Senzorické vlastnosti Kefír vyrobený z kefírové startovací kultury má v porovnání s kefírem vyrobeným tradičně, tzn. z kefírových zrn, odlišné vlastnosti (Tamime, 2006). Kvalitní kefír se vyznačuje hustou, hrubou, nehomogenní konzistencí a hladkou měkkou sraženinou, je lehce šumivý a při zaštěrchání vytváří pěnu podobnou pivní pěně. Je to způsobeno přítomností oxidu uhličitého, který je produkován kvasinkami a heterofermentativními druhy bakterií mléčného kvašení. Barva kefíru je bílá až nažloutlá. Chuť je typická, lehce alkoholická a kvasnicová, ale s různými příchutěmi (Chandan, Wouters & Geurts, 2006), (Teplý et al., 1968). Chuť kefíru závisí na konečném obsahu kyseliny mléčné, která se obvykle pohybuje okolo 0,8 – 0,9 ml/100 ml. Mezi těkavými kyselinami převládá kyselina octová spolu s etanolem a aldehydy. V kefíru ale můžeme nalézt i kyselinu mravenčí, orotovou nebo propionovou. Diacetyl a acetaldehyd patří mezi aroma tvořící látky kefíru, ale jejich množství je ovlivněno typem startovací kultury. Množství alkoholu závisí na typu kvasinek přítomných v kefírových zrnech nebo ve startovací kultuře a na rozsahu zrání. Nejčastější obsah alkoholu je kolem 0,1 – 1 g/100 ml (Tamime, 2006). Množství etanolu ovlivňuje chuť a vůni, CO2 má vliv chuť, vůni a texturu kefíru (Fox & McSweeney, 1998). Šumivý kefír má vysoký obsah oxidu uhličitého, kterého lze dosáhnout při fermentaci mléka s 3 – 10% kefírovou kulturou, a má mírně zvýšený obsah alkoholu (0,2 až 0,6 %) (Görner & Valík, 2004). Kefír, u kterého probíhá fermentace v obalu, má kyselou, mléčnou, lehce kvasnicovou chuť a aroma. Textura je jednotná s viditelnými bublinami CO2 bez nadměrné šumivosti. Kefír vyrobený ve fermentačním

28

uzrávači má podobné organoleptické vlastnosti, ale viskozita výsledného produktu je nízká (Tamime, 2006). Komerční kefírové startovací kultury obsahují termofilní a mezofilní kmeny BMK a kvasinkové kultury, které umožňují, aby výsledný výrobek byl chuťově a aromaticky přijatelný pro spotřebitele (Tamime, 2005). 3.5.1 Vady kefíru Mezi hlavní běžné chyby paří máselná chuť a velmi kvasnicové aroma kefíru. Tato závada

může

být

způsobena

rychlým

množením

Saccharomyces

cerevisiae

v nepřítomnosti kyslíku. Často je tato vada doprovázena octovým aromatem. Nadměrné množství kyseliny octové je způsobeno přítomností Acetobacter spp., kromě toho přítomnost Dekkera spp. v kefírových zrnech nebo ve startovací kultuře může způsobit octové aroma (Tamime, 2006). Pokud je chuť příliš kyselá na úkor šumivosti, je to způsobeno silným pomnožením bakterií mléčného kvašení, a to z důvodu vysoké kultivační teploty. Naopak vysoká šumivost, kvasnicová chuť a nedostatečná kyselost je způsobena nízkou kultivační teplotou, kdy se kvasinky rozmnožují na úkor BMK. Při vyšších skladovacích teplotách může vzniknout, především u kefíru s vysokým obsahem tuku, nepříjemná chuť a vůně vlivem pomnožených kontaminujících bakterií máselného kvašení (Teplý et al., 1968). Kvasinky způsobující vady na chuti jsou Candida rugosa, Candida tenuis nebo Pichia fermentates. Hořkou chuť kefíru způsobují plísně a některé druhy atypických kvasinek přítomných v kefíru (Tamime, 2006). Bakterie octového kvašení, koliformní bakterie a křísové kvasinky způsobují nečistou kyselou chuť kefíru (Teplý et al., 1968).

3.6 Faktory ovlivňující kvalitu kefíru Jakost a vlastnosti kefíru jsou velmi variabilní. Kvalita je velmi ovlivněna původem a složením mikroflóry použitých kefírových zrn a kvalitou a druhem použitého mléka při jeho výrobě (Chandan, Wouters & Geurts, 2006). Mezi další faktory ovlivňující kvalitu kefíru patří typ kefírové kultury (kefírová zrna, čistá kefírová kultura), očkovací poměr, teplota a čas (Seydim et al., 2013) Na kvalitu kefíru působí i podmínky výroby. Používáním lyofilizované kefírové startovací kultury dochází ke snížení počtu kvasinek a ke snížení obsahu alkoholu ve 29

výrobku (Tamime, 2006). Inkubační doba a teplota ovlivňují vlastnosti výrobku jako je výsledný obsah kyseliny mléčné, alkoholu, oxidu uhličitého a celkové aroma (Walstra, Wouters & Geurts, 2006). BMK potřebují vyšší optimální teplotu (26 – 30 °C) než kvasinky, proto při vyšších teplotách kefír rychleji kvasí a tvoří se koagulát, ale zároveň dochází k minimální tvorbě etanolu a CO2. Produkce kvasinek je podporována nižší teplotou fermentace (20 – 15 °C) a provzdušňováním (Görner & Valík, 2004). Fermentace při vyšších teplotách zvyšuje především počet laktobacilů a snižuje počet laktokoků a kvasinek (Tamime, 2006). V oblasti fermentace byl zkoumán vliv různých fermentačních parametrů na kvalitu kefíru. Vzorky kefíru byly vyrobeny pomocí kefírových zrn nebo kefírové startovací kultury. Fermentace probíhala za podmínek normální nebo ochranné atmosféry (CO2). U vzorků byly zkoumány mikrobiologické, chemické, reologické a senzorické vlastnosti po dobu 21 dnů. Použití kefírových zrn nebo startovací kultury při výrobě kefíru významně neovlivnil obsah mikroorganismů. Vzorky kefíru, u kterých probíhala fermentace

pod

ochrannou

atmosférou,

vykazovaly

relativně

vyšší

obsah

exopolyposacharidu. Léčebné vlastnosti kefíru jsou přičítány fyziologickým a zdraví podporujícím vlastnostem EPS (hlavně kefiranu). V tomto ohledu, relativně vyšší obsah EPS ve vzorcích fermentovaných pod 10 % CO2 poskytuje dodatečnou výhodu (Seydim et al., 2013). Systematická a efektivní kontrola kvality je důležitá u jakéhokoli fermentovaného mléčného výrobku, proto je důležité, aby syrové mléko, startovací kefírová kultura, kefírová zrna nebo jakákoli jiná přídatná látka, byly kontrolovány a byla tak zajištěna bezpečnost a kvalita finálního výrobku. Dle systému HACCP je důležitá při výrobě kefíru identifikace kontrolních bodů (CP) nebo kritických kontrolních bodů (CCP) (např. standardizace tuku a mléčné sušiny, tepelné ošetření mléka, fermentační fáze a balení, skladování lyofilizované startovací kultury a sledování obalových materiálů), která pomůže zajistit, že je kefír produkován za vyhovujících hygienických podmínek, ačkoli kefír může být považován za bezpečný fermentovaný mléčný nápoj díky svému nízkému pH a antibakteriální aktivitě. Nicméně, konečné posouzení výrobku, např. vyšetření na patogeny a zhodnocení senzorických vlastností, pomáhá výrobci k zajištění bezpečnosti výrobku (Tamime, 2006). 30

3.7 Nutriční a chemické složení kefíru Složení kefíru je variabilní a není zcela objasněno. Záleží na druhu použitého mléka a jeho tučnosti, složení kefírových zrn a technologickém procesu. Hlavními produkty, které vznikají při fermentaci, jsou již zmiňovaná kyselina mléčná, oxid uhličitý a alkohol, aromatické sloučeniny diacetyl a acetaldehyd. Kefír obsahuje kromě užitečných bakterií a kvasinek vitamíny, minerály a esenciální aminokyseliny, které pomáhají tělu se uzdravit (Otles & Cagindi, 2003). Kefír běžně obsahuje ve 100 g 3 – 3,4 g bílkovin, 1,5 g tuku a 2,0 – 3,5 g laktosy. Obsah kyseliny mléčné bývá mezi 0,6 – 1 ml/100 ml a obsah alkoholu 0,1 ml při výrobě ze startovací kefírové kultury a 0,03 – 1,8 ml při výrobě z kefírových zrn (Tamime, 2006). Dle Walstra (2006) je obsah alkoholu od 0,05 % do 1 %, ale nejčastěji bývá přes 0,5 %. Toto množství závisí na podmínkách fermentace a skladování. Fox (1998) uvádí, že množství etanolu je 1 – 6 %. Z vitamínů je kefír bohatý na vitamíny B1, B12, kyselinu listovou a vitamín K. Je také dobrým zdrojem biotinu, který pomáhá tělu asimilovat ostatní vitamíny skupiny B, jejichž výhody spočívají v regulaci ledvin, jater a nervového systému a pomáhají zmírnit kožní onemocnění. V kefíru obsažené bílkoviny jsou snadno stravitelné a tělo je lépe využije. Za pozornost stojí také vysoký obsah nízkomolekulárních dusíkatých látek (peptidů a aminokyselin). Tryptofan patří mezi základní aminokyseliny, které nalezneme v kefíru, a je znám pro svoje relaxační účinky na nervový systém. Z minerálů jsou tu vápník a hořčík, důležité pro zdravý nervový systém, a fosfor, který pomáhá využít sacharidy, tuky a bílkoviny na energii. Kefír je vhodnou potravinou i pro jednice trpící intolerancí na mléčný cukr, protože obsah laktosy je v důsledku fermentace snížen (Otles & Cagindi, 2003). S výjimkou hromadění vedlejších metabolických produktů fermentace, poklesu koncentrace laktózy a mléčných bílkovin, se složení kefíru neliší od mléka, ze kterého bylo použito k jeho výrobě (Chandan, Wouters & Geurts, 2006).

31

Tab. 1Chemické složení kefíru (Pozměněno Otles, 2003) Složka

v 100 g

Složka

Energie

65 kcal

Esenciální

v 100 g

aminokyseliny (g) Tuk (%)

3,5

Tryptofan

Bílkoviny (%)

3,3

Fenylalanin

0,05 + 0,35

tyrozin Laktosa (%)

4,0

Leucin

0,34

Voda (%)

87,5

Izoleucin

0,21

Kyseliny mléka (g)

0,8

Threonin

0,17

Etanol (g)

0,9

Methionin + cystein

0,12

Kyselina mléčná (g)

1

Valin

0,22

Cholesterol (mg)

13

Lysin

0,27

Fosfatázy (mg)

40

Tab. 2 Obsah vitamínů, minerálních látek a stopových prvků v kefíru (Pozměněno dle Otles, 2003) Složka

v 100 g

Vitamíny (mg)

Složka

v 100 g

Minerální látky (g)

A

0,06

Ca

0,12

Karoten

0,02

P

0,10

B1

0,04

Mg

12

B2

0,17

K

0,15

B6

0,05

Na

0,05

B12

0,5

Cl

0,10

Niacin

0,09

Stopové prvky

C

1

Fe (mg)

0,05

D

0,08

Cu (µg)

12

E

0,11

Zn (mg)

0,36

32

Několik studií zkoumalo protinádorovou aktivitu kefíru a kefírových zrn, a dále antimikrobiální účinky in vitro proti G+, G- bakteriím a některým houbám (Otles & Cagindi, 2003). Kefír se používá k léčbě nebo kontrole některých chorob po mnoho let např. v Rusku. Začal se konzumovat v některých oblastech světa, jako je jihozápadní Asie, východní a severní Evropa, Severní Amerika a Japonsko pro jeho nutriční a léčebné aspekty (Otles & Cagindi, 2003). Kefír je lehce stravitelný a je doporučován dětem, nastávajícím a kojícím matkám, starším lidem, a lidem trpících zácpou. Kefír má mírné projímavé účinky. V Německu a v mnoha částech Asie je využíván při chronických zácpách a je určen pro širokou škálu střevních poruch. Doporučuje se také při obnově střevní mikroflóry u lidí, kteří jsou v rekonvalescenci po těžké nemoci nebo jsou léčeny antibiotiky (Novil, 2011). Kefír byl mimo jiné použit k léčbě tuberkulózy, rakoviny gastrointestinálního traktu a mnoha různých onemocnění. Pro nedostatek vědeckých důkazů a pro potvrzení všech hypotéz a terapeutických účinků, jsou nutné další klinické studie k doložení takových tvrzení (Tamine, 2006). Antimikrobiální studie kefíru, kefiranu a kefírových zrn ukázala antibakteriální aktivitu proti některým jednobuněčným bakteriím a nově také antifugální aktivitu proti vláknitým druhům hub. Navíc studie poukazuje na dobrou účinnost v inhibici tvorbě spor a aflatoxinu B1, který je produkován plísní Aspergillus flavus. Kefír by snad v budoucnu mohl být použit jako přírodní konzervační prostředek proti intoxikaci z aflatoxinu B1 (Ahmed, Mohamed & Aymann 2011). 3.7.1 Kefír jako probiotikum Kefír je přírodní probiotikum. Probiotika jsou potraviny obsahující živé bakterie, které jsou zdraví prospěšné. Podle další definice jsou to živé mikrobiální kultury zlepšující mikrobiální rovnováhu trávicího traktu uživatele a jsou používány v potravinách, jako jsou fermentované mléčné výrobky (Otles & Cagindi, 2003). Mikroorganismy používané jako probiotika jsou humánního původu, produkující látky, jako jsou organické kyseliny, peroxid vodíku a bakteriociny, které inhibují bakterie a ovlivňují jejich metabolismus jako je produkce toxinů. Některá probiotika mají schopnost se navázat na stěnu střevního epitelu, a tím zabrání přilnutí patogenních

33

organismů. Předpokládá se, že probiotické kmeny spotřebovávají živiny, které by byly využity patogeny (Anděl, 2010). Kefír obsahuje tyto živé aktivní kultury přirozené flóry, které jsou tvořeny silnými rozmanitými mikrobiálními kmeny. Ty osídlují střevní trakt více než patogenní organismy a pomáhají při trávení (Otles & Cagindi, 2003). Výzkumní pracovníci firmy Danisco prozkoumávali kefír jako prostředek pro růst probiotických

bakterií

Bifidobacterium

lactis,

Lactobacillus

acidophilus

a

Lb. rhamnosus, které mají význam ve výživě. Výzkum prokázal růst a životaschopnost probiotických bakterií a kefírové mikroflóry vytvořené během výroby kefíru skladovaného po dobu 4 týdnů. Dalším sledovaným ukazatelem byl vliv probiotických bakterií na délku fermentace a na senzorické vlastnosti kefíru. Počty bifidobakterií se nezvyšoval, ale naopak se během výroby zvýšil počet Lb. rhamnosus a to až 2,5krát. Probiotika v inokulované dávce 106 – 107 KTJ/ml nevykazovala negativní vliv na rovnováhu kefírové kultury, na dobu fermentace, a senzorické vlastnosti se neodlišovaly od tradičního kefíru. Z výzkumu tedy vyplývá, že kefír lze použít jako prostředníka k dodání probiotik, která jsou ze zdravotního hlediska prospěšná, a tím zlepšit informovanost o kefíru, který sám o sobě vykazuje probiotický efekt (Kolakowski & Pawlikowska, 2012). Kefír je používán již dlouhou dobu k prevenci a léčení různých chorob. Podle výsledků výzkumů jsou účinky způsobeny probiotickými a symbiotickými účinky na mikroflóru střeva. Za účelem profylaxe se kefír doporučuje konzumovat při poruchách trávení, pro zlepšení peristaltiky střev, pro zmírnění důsledků nadměrného požívání alkoholických nápojů a pro potlačování růstu nežádoucích střevních mikroorganismů (Suková, 2004). V posledním desetiletí se zvýšil zájem o kefír právě díky jeho pozitivním zdravotním účinkům (Guzel-Seydim et al., 2011). Jeho obliba roste např. v USA. Kefír s probiotickými kmeny, jako je Lb. rhamnosus se vyrábí v Estonsku a Lotyšsku (Tamime 2005). Vědci z Masarykovy univerzity v Brně zkoumali vliv pravidelné konzumace kefíru na výskyt Enterococcus faecalis v lidské stolici. Kefírový nápoj obsahoval probiotické kmeny bakterií

(Bifidobacterium

animalis,

Lactococcus

lactis,

Streptococcus

thermophilus, Lactobacillus sp., Leuconostoc mesenteroides), inulin, a kvasinky (Debaryomyces hansenii, Pichia fermentas, Torulopsis holmii). Výzkumu se zúčastnilo 34

50 dobrovolníku, kteří 14 dní každý večer po večeři zkonzumovali 200 ml kefíru. Vzorky jejich stolice byly odebrány před začátkem výzkumu a po uplynutí 14 dnů. Test prokázal významné snížení počtu bakterií Enterococcus faecalis. V dotazníku 93,5 % dobrovolníků potvrdilo zlepšení zažívání po konzumaci kefíru (Forejtm et al., 2007).

3.8 Sortiment kefíru na českém trhu Fermentovaných mléčných výrobků je na českém trhu od jogurtů po sýry velká škála, ovšem malý sortiment tvoří právě kefír a kefírové mléko, které se u nás vyrábí nejčastěji. Od výroby šumivého kefíru se z technologicko-technických důvodů ustoupilo (Hylmar, 1986). Potravinářské výrobky, jejich názvy, vlastnosti a kategorie jsou dány zákonem č.110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů a vyhláškou 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. Kefírem může být označován mléčný kysaný výrobek z kefírových zrn, který musí obsahovat určené druhy kvasinek (10 tisíc v 1 ml) a určené druhy bakterií mléčného kvašení (minimálně 100 tis. v 1 ml). Kefírové mléko je kysaný mléčný výrobek, který obsahuje bakterie mléčného kvašení (v koncentraci 1 milion v 1 ml) a kvasinky (minimálně 100 v 1 ml) (Anděl, 2010).

35

Vyhláška č. 77/2003, kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje (novelizovaná) Příloha č. 2 k vyhlášce č. 77/2003 Sb. – Fyzikální, chemické a mikrobiologické požadavky na jednotlivé mléčné výrobky a na druhy mikroorganismů mléčného kysání. Tab. 3 Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích Druh výrobku Acidofilní mléko

Jogurty*)

Kysané mléko, vč. smetanového zákysu, podmáslí a kysané smetany Kefír

Kefírové mléko

Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou

Použité mikroorganismy Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. termofilní kultury bakterií mléčného kvašení protosymbiotická směs Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kvašení zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Kluyveromyces marxianus i nezkvašující laktózu Sacharomyces unisporus, Sacharomyces cerevisce, Sacharomyces exitus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Bifidobacterium sp. V kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléčného kvašení

Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g 106 Lactobacillus acidophilus 107

106

bakterie mléčného kvašení 106 kvasinky 104

bakterie mléčného kvašení 106 kvasinky 102

106 bifidobakterie

*) U jogurtových výrobků mohou být kromě základní jogurtové kultury přidávány kmeny produkující kyselinu mléčnou a pomáhající dotvářet specifickou chuťovou nebo robatick charakteristiku výrobku. Musí však být zachován optimální poměr obou základních kmenů jogurtové kultury.

36

3.8.1 Monitoring kefírů v obchodní síti V současné době se v naší obchodní síti můžeme setkat pouze s kefírovým mlékem. Nejvíce na trhu jsou zastoupeny výrobky mlékáren Valašské Meziříčí, Kunín, mlékárna Čejetičky a jihlavské mlékárny Moravia Lacto a.s. Pro privátní značky supermarketů vyrábí kefírové mléka např. mlékárna Valašské Meziříčí. Mlékárna ve Valašském Meziříčí nabízí nízkotučné kefírové mléko v několika příchutích: čisté, meruňkové, višňové a jahodové. Obsah tuku se pohybuje od 0,8 do 1,10 % tuku ve 100 g výrobku. Kefírová mléka jsou obohacena o bifidogenní mikroorganismy, které příznivě působí na lidský organismus, především na trávicí ústrojí a přispívající k obnovení střevní mikroflóry. Obsahují i probiotickou ABT kulturu. Nízkotučná kefírová mléka ochucená jsou navíc kromě probiotických bakterií obohacena o komplex vitamínů A, C, a E. Kefírové mléko nízkotučné čisté Složení: mléko, mléčné kultury, probiotická kultura ABT Tab. 4 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Valmez): Energetická hodnota

170 kJ / 40 kcal

Tuk

1,2 g

Bílkoviny

3,3 g

Sacharidy

5,4 g

Sodík

0,04 g

Kefírové mléko nízkotučné ochucené (jahodové, meruňkové, višňové) Tab. 5 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Valmez) : Energetická hodnota

290 kJ / 69 kcal

Tuk

0,8 g

Bílkoviny

2,6 g

Sacharidy

12 g

37

Mlékárna Kunín vyrábí kefírová mléka o tučnosti min 1,5 % taktéž v několika příchutích: neochucené, jahodové a banánové. Kefírové mléko neochucené Složení: mléko, kefírová kultura obsahující bakterie mléčného kysání a kvasinky Tab. 6 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Kunín): Energetická hodnota

170 kJ / 41 kcal

Tuk

1,5 g

Bílkoviny

3g

Sacharidy

2,6 g

Vápník

120 mg

Kefírové mléko ochucené (banánové, jahodové) Složení: mléko, ovocná složka 14 %, mléčné kultury Tab. 7 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Kunín) : Energetická hodnota

305 kJ / 74 kcal

Tuk

1,3 g

Bílkoviny

2,8 g

Sacharidy

12 g

Mlékárna Čejetičky nabízí mléko a mléčné produkty pod označením Milkin a Mlada. Vyrábějí kefírové mléko neochucené a s příchutěmi jahoda, meruňka, čokoláda, černá třešeň, vanilka, citrón limeta s obsahem tuku nejméně 1 %. Tato kefírová mléka jsou obohacena o bifidogenní bakterie.

38

MILKIN kysané kefírové mléko Složení: mléko, mléčná a kvasinková kultura Tab. 8 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): Energetická hodnota

161 kJ / 38 kcal

Tuk

1,0 g

Bílkoviny

3,3 g

Sacharidy

4g

MILKIN ochucený kysaný mléčný výrobek s příchutí (jahoda, meruňka a citron limeta) Složení (jahoda): mléko, cukr, 4 % jahodový sirup, mléčná a kvasinková kultura Tab. 9 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): Energetická hodnota

270 kJ / 63 kcal

Tuk

1,0 g

Bílkoviny

3, g

Sacharidy

10,7 g

Složení (meruňka): mléko, 14% meruňkový sirup, mléčná a kvasinková kultura Tab. 10 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): Energetická hodnota

297 kJ / 70 kcal

Tuk

1,0 g

Bílkoviny

3,3 g

Sacharidy

12,3 g

Složení (citron limeta): mléko, cukr, citrusová dužina, citronová koncentrát, modifikovaný kukuřičný škrob, aroma, mléčná a kvasinková kultura Tab. 11 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): Energetická hodnota

285 kJ / 68 kcal

Tuk

0,9 g

Bílkoviny

2,9 g

Sacharidy

11,7 g 39

Jihlavská mlékárna Moravia Lacto a.s. nabízí kefírové mléko bez příchutě. Složení: mléko, kefírová kultura Tab. 12 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku: Energetická hodnota

185 kJ / 44 kcal

Tuk

1,1 g

Bílkoviny

3,1 g

Sacharidy

4,1 g

Kozí farma Dvůr Ratibořice se zabývá produkcí a prodejem kozího mléka a výrobků z něj. Jedním z jejich produktů je i kozí kefír. Kozí kefír lze zakoupit v prodejnách zdravé výživy nebo přímo na farmě. Tab. 13 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Kozí mléko) : Energetická hodnota

251 kJ / 60 kcal

Tuk

3,1 g

Bílkoviny

3,5 g

Sacharidy

3,9 g

Ekofarma St. Pierre v Petrovicích nabízí kozí kefír s označením BIO, tedy produktem ekologického zemědělství. Výrobky St. Pierre lze zakoupit ve vybraných super/hypermarketech, přímo na farmě nebo ve specializovaných bioprodejnách Country Life (Praha) a v ochodech se zdravou výživou po celé ČR. Složení: kozí mléko, kefírová kultura Tab. 14 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (StPierre): Energetická hodnota

230 kJ / 55 kcal

Tuk

3,4 g

Bílkoviny

2,9 g

Sacharidy

3,3 g

40

Sortiment kefíru a kefírových mlék není na českém trhu dostatečně rozšířený. Ve většině případů se jedná o výrobky s obsahem tuku kolem 1 % a mezi nejčastější příchutě patří jahoda. Baleny jsou do papírových kartonových obalů nebo do PET lahví. Reklamní propagace těchto výrobků je omezená, přitom jejich pozitivní účinek na zdraví je stejný jako u jogurtů, které jsou více propagované, protože obsahují probiotické bakterie, avšak kefírové mléko je může obsahovat také. Příkladem je kefírové mléko s ABT kulturou. Kefír lze vyrobit i doma. Na internetových stránkách jsou k dostání kefírová zrna pod názvem Tibetská houba, spolu s návodem na přípravu kefíru.

4 MATERIÁL A METODIKA V rámci bakalářské práce bylo provedeno senzorické hodnocení u dvou vybraných vzorků kefírového mléka. Účelem bylo jejich porovnání a posouzení senzorické jakosti.

4.1 Materiál K senzorické analýze byly vybrány dva vzorky kefírového mléka. Vzorkem 1 bylo označeno nízkotučné neochucené kefírové mléko z mlékárny Valašské Meziříčí, s obsahem tuku minimálně 1,1 %, a ve složení: mléko, mléčné kultury, probiotická kultura ABT. Cena za 500 g výrobku byla 14,90 Kč. Toto kefírové mléko bylo označeno jako vzorek 1. Vzorkem 2 bylo označeno nízkotučné neochucené kefírové mléko z mlékárny Valašské Meziříčí, prodávané pod privátní značkou Milblu společnosti Kaufland, s obsahem tuku 1,1 %, ve složení: mléko, mlékařské kultury, probiotická kultura. Cena výrobku za 500 g byla 10,50 Kč. U vzorku 2 nebyla specifikována probiotická kultura, zatímco u vzorku 1 bylo na obale vyznačeno, že se jedná o ABT kulturu.

4.2 Metodika Senzorická analýza výrobků byla hodnocena studenty Mendelovy Univerzity, kteří byli vždy před hodnocením seznámeni, jak mají postupovat při hodnocení a byly jim 41

vysvětleny jednotlivé zkoumané deskriptory. Celkový počet studentů byl 61. Studenti hodnotili vzorky anonymně a podle sestaveného dotazníku (viz. příloha). Vzorky byly podávány postupně, nejdříve hodnotili výrobek z mlékárny Valašského Meziříčí (vzorek 1), po jeho zhodnocení byl hodnocen druhý výrobek privátní značky Kaufland Milblu (vzorek 2). Kefírová mléka byla podávána při teplotě ± 8 °C a v množství 20 ml. Jako neutralizátor chuti byla použita voda.

5 VÝSLEDKY Z vyhodnocených dotazníků byly sestaveny sloupcové grafy (obrázek 7 až 12) ukazující četnost odpovědí na dané otázky.

Obr. 7 Vyhodnocení vůně Jako první deskriptor byla hodnocena vůně. Na obrázku 7 vidíme, že vůně byla příjemná více u vzorku 1. U vzorku 2 byla vůně především málo výrazná.

42

Obr. 8 Vyhodnocení konzistence Konzistence u obou vzorků byla hodnocena téměř totožně, jako hladká, resp. hrubší.

Obr. 9 Vyhodnocení chuti U vzorku 1 převažovala chuť charakteristická, příjemná a osvěžující. Vzorek 2 byl v chuti téměř shodně charakteristický, příjemný a osvěžující až silně výrazný.

43

Obr. 10 Vyhodnocení kyselosti Kyselost u vzorku 1 byla primárně hodnocena jako příjemná, u vzorku 2 jako silná.

Obr. 11 Vyhodnocení napěněnosti Napěněnost u obou vzorků byla nízká až žádná.

44

Obr. 12 Vyhodnocení celkového dojmu Celkový dojem byl velmi dobrý u vzorku 1. Vzorek 2 byl spíše průměrný až ne zcela uspokojivý. I když kefírová mléka pocházela od stejného výrobce, jsou tu patrné rozdíly ve vůni, chuti a kyselosti. Senzoricky přijatelnější se ukázal vzorek 1, který chutnal 36 hodnotitelům, zbylým 25 chutnal více vzorek 2. Dalo by se říci, že hodnotitelé, kteří preferovali vzorek 2, mají raději ostřejší a kyselejší chuť kefírového mléka. Ta může být způsobena větším množstvím BMK, díky nimž má výrobek kyselou chuť. Vzorek 1 vyšel jako příjemnější a jemnější ve vůni, chuti i kyselosti.

45

6 ZÁVĚR Kefír je fermentovaný mléčný nápoj pocházející z Kavkazských hor. Obsahuje BMK a kvasinky, a proto zaujímá zvláštní postavení mezi ostatními fermentovanými mléčnými výrobky. V Rusku patří mezi tradiční nápoj, ale v posledních letech roste jeho oblíbenost např. v USA nebo Japonsku. K jeho výrobě se dříve používala kefírová zrna, která vznikají kombinací příslušných mikroorganismů, jako je Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacilus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefir, Kluyveromyces fragilit nebo Torulopsis kefir, díky koagulaci bílkovin a produkci exopolysacharidu (EPS) nazývanému kefiran. Je prokázáno, že mikroflóra zrn se liší podle původu, a tím jsou ovlivněny i senzorické vlastnosti finálního produktu. V současnosti roste zájem o studium EPS kefiranu, který je složen z D-glukosy a D-galaktosy a produkován homofermentativními laktobacily v kefírových zrnech. Kefiran zlepšuje texturní vlastnosti kefíru. Různými studiemi byla potvrzena jeho antimikrobiální aktivita, antikarcinogenní a antimutagenní účinky, a je možno jej využívat v potravinářství jako gumu nebo stabilizátor. Dříve se kefír vyráběl za pomocí kefírových zrn, která se vložila do pasterovaného mléka a nechala kultivovat. Vznikla tak matečná kultura, která se použila na výrobu provozního zákysu určeného ke konečné výrobě kefíru. Dnes mlékárny vyrábějící kefír přecházejí na uměle vytvořenou lyofilizovou kefírovou startovací kulturu, která je sestavena na základě původní mikroflóry kefírových zrn a přidávána přímo do vychlazeného tepelně ošetřeného mléka, které se nechá fermentovat. K výrobě kefíru a kefírového mléka, které si můžeme zakoupit na našem trhu, je využívána matečná kefírová kultura. Podle české legislativy musí kefír obsahovat 10 6 BMK a 104 kvasinek, a kefírové mléko 106 BMK a 102 kvasinek, proto má kefírové mléko jemnější chuť a netvoří se velké množství oxidu uhličitého. Kefír obsahuje vitaminy B1, B12, kyselinu listovou a vitamín K, a velké množství peptidů a aminokyselin jako je např. tryptofan, který patří mezi esenciální aminokyseliny. Kefír patří mezi přírodní probiotikum, protože obsahuje probiotické kmeny mikroorganismů, které osidlují střevní trakt, a zabraňují rozmnožování patogenních mikroorganismů. Doporučuje se konzumovat při obnově střevní mikroflóry např. při léčbě antibiotiky. Kefír je lehce stravitelný a je doporučován dětem, 46

nastávajícím a kojícím matkám, nebo starším lidem. Z těchto důvodu bych doporučovala zařazení kefíru do jídelníčku všem věkovým kategoriím. Bylo by žádoucí zvýšit v ČR informovanost o pozitivním vlivu konzumace kefíru a kefírového mléka. Sortiment těchto výrobkům je malý oproti sortimentu jogurtů, a na českém trhu je zastoupen pouze čtyřmi mlékárnami: Valašské Meziříčí, Kunín, mlékárna Čejetičky a jihlavská mlékárna Moravia Lacto a.s. Kefírové mléko se u nás vyrábí o tučnosti kolem 1 %, kefírové mléko s vyšším obsahem tuku naše mlékárny nevyrábějí. Senzorická analýza ukázala, že dvě kefírová mléka od stejného výrobce se stejným složením, mohou mít odlišnou vůni, chuť a kyselost. Hodnotitelé preferovali vzorek 1, který vyrábí a je prodáván pod značkou mlékárny Valašské Meziříčí, z důvodu příjemné vůně, chuti a kyselosti. Vzorek 2 pocházel také z mlékárny Valašské Meziříčí, ale je prodávané pod privátní značkou Milblu společnosti Kaufland a hodnotiteli byl hodnocen jako kyselý, v chuti silně výrazný, a průměrný až ne zcela uspokojivý.

47

7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY AHMED A. I., MOHAMED F. G. & AYMANN K. E., 2011: Milk Kefir: Ultrastructure, Antimicrobial Activity and Efficacy on Aflatoxin B1 Production by Aspergillus flavus. Current Microbiology. 62 (5): 1602-1609. ANDĚL M., 2010: Mléko a mléčné výrobky ve výživě. Potravinářská komora České republiky, Praha, 34 s. Publikace České technologické platformy pro potraviny. ISBN 978-80-254-9012-9. CAPLICE E. & FITZGERALD G. F., 1999: Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. International Journal of Food Microbiology 50 (1): 131–149. DAVIDSON A. & JAINE T., 2006: The Oxford companion to food. Oxford University Press, New York, 907 s. ISBN 978-019-2806-819 FOREJT M., ŠIMŮNEK J., BRÁZDOVÁ Z. & LEFNEROVÁ D., 2007: The influence of regular consumption of kefir beverage on the incidence of Enterococcus faecalis in the human stool. Scripta Medica (Brno). 80 (6): 279–286. FORMAN L., 1996: Mlékárenská technologie II. Vysoká škola chemickotechnologická, Praha, 217 s. ISBN 80-708-0250-2. FOX P. & MCSWEENEY P. L., 1998: Dairy chemistry and biochemistry. Blackie Academic & Professional, London, 478 s. ISBN 0-412-72000-0. GAJDŮŠEK S., 1998: Mlékařství II. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 135 s. ISBN 80-715-7342-6. GAO J., GU F., HE J., XIAO J., CHEN Q., RUAN H. & HE C., 2013: Metagenome analysis of bacterial diversity in Tibetan kefir grains. European Food Research and Technology. 236 (3): 549-556.

48

GÖRNER F. & VALÍK L., 2004: Aplikovaná mikrobiológia požívatín: princípy mikrobiológie požívatín, potravinársky významné mikroorganizmy a ich skupiny, mikrobiológia potravinárskych výrob, ochorenia mikrobiálneho povodu, ktorých zárodky sú prenášané požívatinami. Malé centrum, Bratislava 528 s. ISBN 80-9670649-7. GUZEL-SEYDIM Z., KOK-TAS T., ERTEKIN-FILIZ B. & SEYDIM A. C., 2011: Effect of different growth conditions on biomass increase in kefir grains. Journal of Dairy Science. 94 (3): 1239 – 1242. HUI, Y. H., 2007: Handbook of food products manufacturing – Health, meat, milk, poultry, seafood and vegetables. John Wiley & Son, Inc., Hoboken, New Jersey, 745 s. ISBN 978 – 0 – 470 – 12525 – 0 HUTKINS, W. R., 2006: Microbiology and Technology of Fermented foods. Blackwell Publishing, Iowa, p, ISBN HYLMAR B., 1986: Výroba kysaných mléčných výrobků. SNTL-Nakladatelství technické literatury, Praha, 212 s. ISBN 04-812-86 CHANDAN R. C, WOUTERS J. T. & GEURTS T. 2006: Manufacturing yogurt and fermented milks. Blackwell Pub., Ames, Iowa: 364 p. ISBN 978-081-3823-041. JANŠTOVÁ B., VORLOVÁ L., NAVRÁTILOVÁ P., KRÁLOVÁ M., NECIDOVÁ L. a MAŘICOÁ E., 2012: Technologie mléka a mléčných výrobků. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 142 s. ISBN 978-80-7305-637-7 KADLEC P., MELZOCH K. a VOLDŘICH M., 2009: Co byste měli vědět o výrobě potravin? Key Publishing, Ostrava 536 s. ISBN 978-80-7418-051-4. KNĚZ V., MAŠEK J., MAXA V., TEPLÝ M. a VEDLICH M., 1960: Čisté mlékařské kultury a jejich použití v mlékárenském průmyslu. Státní nakladatelství technické literatury, Praha, Bratislava, 297 s.

49

KOLAKOWSKI P. & PAWLIKOWSKA K., 2012: Kefir as a probiotic delivery vehicle. Milchwissenschaft. 67 (2): 159-163. KOZÍ

MLÉKO.

Kozí

bio

kefír.

[cit.

2013-03-17].

Dostupné

z:

http://www.kozimleko.cz/22/kozi-kefir-bio LACMANOVÁ I., DRÁB V. a VOLNÁ L., 2010. Aplikace probiotických kultur laktobacilů v mléčných výrobcích typu kefíru. [cit. 2012-09-17]. Dostupné z: http://www.mlekarskelisty.cz/upload/soubory/pdf/2010/123_s._xviii-xxi.pdf MILKIN.

Kysané

mléčné

výrobky

[cit.

2012-09-17].

Dostupné

z:

Dostupné

z:

http://www.milkin.cz/ochuceny-kysany-mlecny-vyrobek-milkin/ MILCOM.,

2013

Mlékařské

kultury.

[cit.

2013-01-13].

http://www.milcom-as.cz/vum-a-laktoflora/produkty-laktoflora/mlekarske-kultury.html MLADA.

Kysaná

výrobky

tekuté.

[cit.

2013-03-08].

Dostupné

z:

http://www.mlada.cz/vyrobky.html MLÉKÁRNA

KUNÍN.

Kefírové

mléko.

[cit.

2012-09-17].

Dostupné

z:

http://www.mlekarna-kunin.cz/produkty/kefirova-mleka/kefirove-mleko480-g/ MLÉKÁRNA VALMEZ. Kefírové mléko nízkotučné s příchutí. [cit. 2012-09-17]. Dostupné

z:

http://www.mlekarna-valmez.cz/produkty-kysane-vyrobky-kefirove-

mleko-nizkotucne-s-prichuti MLÉKÁRNA VALMEZ. Kefírové mléko nízkotučné čisté. [cit. 2012-09-17]. Dostupné z:

http://www.mlekarna-valmez.cz/produkty-kysane-vyrobky-kefirove-mleko-

nizkotucne-ciste MLÉKÁRENSKÉ TECHNOLOGIE., 2007. Biochemický rozklad laktosy. [cit. 201301-24].

Dostupné

z:

http://utb-

files.cepac.cz/moduly/M0029_mlekarenska_technologie/distancni_text/M0029_mlekare nska_technologie_distancni_text.pdf 50

NOVIL

S.,

2011.

Kefir.

[cit.

Dostupné

2013-03-15].

z:

http://www.lifeway.net/LifewayWorld/KefirProbiotics/Kefir.aspx OTLES S. & CAGINDI O., 2003. Kefir: A Probiotic Dairy-Composition, Nutritional and

Therapeutic

Aspects.

[cit.

2013-02-06].

Dostupné

z:

http://www.pjbs.org/pjnonline/fin94.pdf PAPAVASILIOU G., KOURKOUTAS Y., RAPTI A., SIPSAS V., SOUPIONI M. & KOUTINAS A. A., 2008. Production of freeze-dried kefir culture using whey. International Dairy Journal. 18(3): 247-254. PINHO O., MONTEIRO D., FARIA S., CRUZ S., PERREIRA A., ROQEU A. C. & TAVARES P., 2010: Effect of kefir grains on proteolysis of major milk proteins. Journal of Dairy Science. 93 (1): 27-31. SEYDIM A. C., BARBAROS Ö., ZEYNEP B. & GUZEL-SEYDIM Z., 2013: Effects of different fermentation parameters on quality characteristics of kefir. Journal of Dairy Science. 96 (2): 780-789. STPIERRE. Produkty. [cit. 2013-03-17]. Dostupné z: http://www.stpierre.cz/produkty/ SUKOVÁ I., 2004. Kultury pro výrobu kefíru. [cit. 2013-01-29]. Dostupné z: http://www.agronavigator.cz/default.asp?ids=314&ch=13&typ=1&val=28798&sessioni d=B9E915B8-4315-4BD4-B3D9-26BB6868B14B SUKOVÁ I., 2012 Kefír kontra kefírové mléko. [cit. 2013-01-13]. Dostupné z: http://www.agronavigator.cz/default.asp?ids=162&ch=13&typ=1&val=120524 SUKOVÁ

I.,

2011.

Co

je

kefír?

2011

[cit.

2012-12-17].

Dostupné

z:

http://www.agronavigator.cz/default.asp?ids=154&ch=13&typ=1&val=107909 ŠUSTOVÁ K., SÝKORA V., 2013: Mlékárenské technologie. Brno: Mendelova univerzita v Brně, 223 s. ISBN 978-80-7375-704-5.

51

TAMIME, A., 2005: Probiotic dairy products. Blackwell Pub., Oxford, 216 p. ISBN 978-1-4051-2124-8. TAMIME A., 2006: Fermented milks. Blackwell Science/SDT,Oxford, 262 p. ISBN 978-063-2064-588. TEPLÝ M., HYLMAR B., KALINA Č. a RUMLOVÁ V., 1968: Kefír, jogurt, acidofilní a jiné kyšky. Státní nakladatelství technické literatury, Praha, 185 s. Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje, v pozdějším znění. WALSTRA P., WOUTERS J. T. & GEURTS T., 2006: Dairy science and technology. CRC Press Taylor &Francis Group, Boca Raton, 782 p. ISBN 08-247-2763-0. ZAJŠEK K., KOLAR M. & GORŠEK A., 2011: Characterisation of the exopolysaccharide kefiran produced by lactic acid bacteria entrapped within natural kefir grains. International Journal of Dairy Technology. 64 (4): 544–548.

52

8 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Mikroflóra kefírového zrna (Chandan, 2006) ..................................................... 14 Obr. 2 Schéma výroby kefírové kultury z kefírových zrn (upraveno podle Tamime, 2006) ........................................................................................................................................ 15 Obr. 3 Diagram pro průmyslovou výrobu kefíru pomocí různých typů kultur (Tamime, 2006) ............................................................................................................................... 17 Obr. 4 Obecné schéma fermentace glukózy u BMK (upraveno dle Caplice a Fitzgerald 1999) ............................................................................................................................... 22 Obr. 5 Obecné schéma průmyslové výroby kefíru klasickou a takovou metodou (Pozměněno dle Tamine, 2006) ...................................................................................... 26 Obr. 6Tradiční a moderní výroba kefíru (Pozměněno dle Hutkinse, 2006) ................... 27 Obr. 7 Vyhodnocení vůně ................................................................................................ 42 Obr. 8 Vyhodnocení konzistence ..................................................................................... 43 Obr. 9 Vyhodnocení chuti ............................................................................................... 43 Obr. 10 Vyhodnocení kyselosti........................................................................................ 44 Obr. 11 Vyhodnocení napěněnosti .................................................................................. 44 Obr. 12 Vyhodnocení celkového dojmu .......................................................................... 45

9 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Chemické složení kefíru (Pozměněno Otles, 2003) ............................................. 32 Tab. 2 Obsah vitamínů, minerálních látek a stopových prvků v kefíru (Pozměněno dle Otles, 2003) ..................................................................................................................... 32 Tab. 3 Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích ......................... 36 Tab. 4 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Valmez): ................... 37 53

Tab. 5 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Valmez) : .................. 37 Tab. 6 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Kunín): ..................... 38 Tab. 7 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Mlékárna Kunín) : .................... 38 Tab. 8 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): ...................................... 39 Tab. 9 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): ...................................... 39 Tab. 10 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): .................................... 39 Tab. 11 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (Milkin): .................................... 39 Tab. 12 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku: ................................................. 40 Tab. 13 Průměrné výživové hodnoty ve 100 g výrobku (Kozí mléko) : ........................... 40 Tab. 14 Průměrné výživové hodnoty ve 100g výrobku (StPierre): ................................. 40

10 SEZNAM ZKRATEK ABT – probiotická kultura Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Streptoccocus thermophilus ATP - adenosintrifosfát BMK - bakterie mléčného kvašení EPS - exoplysacharid DVI/DVS - kultury pro přímé očkování HACCP - Hazard Analysis and Critical Control Points - Analýza nebezpečí a kritické kontrolní body

54

11 PŘÍLOHY SENZORICKÁ ANALÝZA KEFÍROVÝCH MLÉK (ŠUSTOVÁ K., HÁDEROVÁ E., 2013) Zdravotní stav:………………………………… Číslo vzorku:………………………………….. 1) Vůně:

Datum:…………………… Hodina:…………………...

a) nevýrazná b) málo výrazná c) typická, příjemná d) ostřejší, kyselejší, výraznější e) ostrá, kyselá, příliš výrazná cizí:

výrazně kvasničná nečistá jiná:

2) Konzistence a) hladká, jemná b) hrubší c) hrubá, krupičkovitá 3) Chuť

a) málo výrazná až prázdná b) charakteristická, ale ne příliš výrazná c) charakteristická, příjemná osvěžující d) silně výrazná e) příliš výrazná, ostrá cizí příchuť:

4) Kyselost

hořká mýdlovitá výrazně kvasničná jiná:

a) nevýrazná b) slabá c) příjemná d) silná e) velmi silná až nepříjemná

5) Napěněnost: a) žádná b) nízká c) silně napěněná 6) Celkový dojem:

a) vynikající, lahodný, harmonický b) velmi dobrý, lahodný, lepší než průměrný c) průměrný d) ne zcela uspokojivý e) špatný, nevyhovující

7) Který ze vzorků Vám chutnal více?

55