MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
VROZENÁ IMUNITA PTÁKŮ Diplomová práce
Lucie Prokopová
Vedoucí práce: RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
Brno 2013
Bibliografický záznam Autor:
Bc. Lucie Prokopová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Experimentální Biologie
Název práce:
Vrozená imunita ptáků
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Experimentální biologie živočichů a imunologie
Vedoucí práce:
RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
Akademický rok:
2012/2013
Počet stran:
102+13
Klíčová slova:
Vrozená imunita; Fagocytóza; Respirační vzplanutí; Pholasin; Heterofily; Komplementový systém; Lysozym; Imunita a reprodukce; Imunita a ornamentace
Bibliographic Entry Author:
Bc. Lucie prokopová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology
Title of Thesis:
Innate immunity of birds
Degree programme:
Experimental Biology
Field of Study:
Experimental Biology of Animals and Immunology
Supervisor:
RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
Academic Year:
2012/2013
Number of Pages:
102+13
Keywords:
Innate immunity; Phagocytosis; Respiratory burst; Pholasin; Heterophils; Complement system; Lysozyme; Immunity and reproduction; Immunity and ornamentation
Abstrakt Imunitní systém ptáků jakožto jeden ze základních homeostatických mechanismů organismu zahrnuje stejně jako u ostatních obratlovců evolučně starší imunitu nespecifickou a získanou imunitu specifickou. Tématem této diplomové práce je imunita nespecifická, jejíž buněčné a humorální mechanismy jsou formou rešerše zpracovány v úvodních kapitolách. Pozornost však byla zaměřena také na roli imunitního systému v rámci reprodukce a spojitost jeho účinnosti s kvalitou signální ornamentace. Druhá polovina práce, zabývající se výzkumem, se týká zejména procesu fagocytózy a s ním spojeným respiračním vzplanutím. Stanovení aktivity tohoto oxidačního mechanismu je založeno na měření chemiluminiscence, která doprovází reakci jeho biologicky aktivních kyslíkových produktů s příslušným luminoforem. Ptačí heterofily však díky absenci myeloperoxidázy upřednostňují mechanismy neoxidační a hladina těchto kyslíkových sloučenin je tak v porovnání se savci až několikanásobně nižší. Nezbytné je proto použít vysoce citlivý luminofor Pholasin, jehož zavedení bylo cílem této diplomové práce. Pozorována byla variabilita v imunitní odpovědi 170 jedinců mláďat sýkory koňadry na dva bakteriální lipopolysacharidy s odlišnou kinetikou reakce. Výsledky vykazovaly statisticky významné rozdíly pozorovatelné nejen mezi jednotlivými hnízdy navzájem, ale i v rámci samotných hnízd. Doposud se v oblasti ptačí imunologie jedná o 4. studii svého typu, tedy stanovování respiračního vzplanutí heterofilů v přítomnosti Pholasinu. Vůbec poprvé proběhlo stanovení na sýkorkách či na mláďatech. Druhotně se výzkum zabýval také humorálními mechanismy, v rámci kterých byla metodou ELISA stanovena koncentrace lysozymu ve spermatu vlaštovek obecných. Pro potvrzení či vyvrácení hypotézy říkající, že kvalita ornamentů koreluje s imunitními parametry spermatu, byly získané hodnoty porovnány s délkou ocasu vlaštovek. Korelace zde však nebyla potvrzena, což ovšem nevylučuje souvislost s jiným z kondičních faktorů. V rámci vedlejších pokusů byly na vzorcích ptačí plazmy navíc vyzkoušeny metody stanovující aktivitu komplementu, antioxidační kapacitu či aktivitu enzymů a míru oxidačního stresu. Uvedené metody se prokázaly být použitelné pro ptačí vzorky tělních tekutin a mohou tak být využity pro testování imunitních parametrů během dalšího výzkumu.
Abstract The immune system of birds, one of the fundamental homeostatic mechanisms in the body, includes evolutionary older non-specific immunity and acquired specific immunity similarly to other vertebrates. This study examines cellular and humoral mechanisms of non-specific immunity, which are discussed in the introduction in form of the recherche. The role of immune system in reproduction and its effect on signal ornamentation quality is also discussed. The second part of thesis is devoted to the study of phagocytosis process and associated respiratory burst. Determination of oxidative activity is based on detection of the chemiluminiscence signal that accompanies the reaction of biologically active oxygen metabolites with the appropriate luminophore. However, thanks to the absence of myeloperoxidase, bird heterophils prefer non-oxidative mechanisms. The level of oxygen compounds is several times lower than in mammals, therefore the use of Pholasin, a highly sensitive luminophor, is necessary. Introduction and optimization of Pholasin based detection of oxygen metabolites in birds was the aim of this study. Immune response variability to two different bacterial lipopolysaccharides with different reaction kinetics was observed at 170 young great tits (Parus major). The results show statistically significant differences between different nests and in each nest itself. So far this is the fourth study of heterophil respiratory burst determination in birds' immunology with the use of Pholasin and the first study in which great tits and their brood are observed. The next part of the study is devoted to the humoral mechanisms such as lysozyme activity determination in barn swallow sperm by ELISA assay. To test the hypothesis, which claims that ornament quality correlates with sperm immune parameters, we compared the tail lengths with lysozyme activity. Correlation was not confirmed however that does not negate the coherence with the other fitness factors. Finally, the study includes experimental methods for determination of complement activity, antioxidant capacity, antioxidant enzyme activity and measurement of oxidative stress at bird plasma samples. These methods have been proven to be useful for bird samples of body fluids and can be used to test the immune parameters in further research.
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat především svému školiteli RNDr. Pavlu Hyršlovi, Ph.D. za jeho odborné vedení, cenné rady a náměty, stejně jako za jeho vstřícné a velmi ochotné jednání. Poděkovat bych chtěla také svému konzultantovi Mgr. Liboru Vojtkovi za výpomoc v rámci metodických postupů. Dále bych ráda poděkovala Bc. Jitce Vinklerové a RNDr. Michalu Vinklerovi, Ph.D z Karlovy univerzity za spolupráci během terénního odběru vzorků, pomoc při měření a vyhodnocování výsledků. Dík patří také jejich týmu, především pak Mgr. Haně Bainové a Ing. Janě Svobodové Ph.D. V neposlední řadě bych ráda poděkovala Mgr. Pavlu Dobešovi, Ph.D. za výpomoc při statistickém vyhodnocování dat. Stejně tak patří dík Bc. Jakubu Berkovi a Bc. Jaromíru Flösslerovi za spolupráci v rámci laboratorních metodik. Můj velký dík patří také mé rodině a přátelům za jejich podporu, trpělivost a pochopení po dobu mého studia.
Tato práce byla podpořena granty P506/12/2472, P506/12/2472 a P505/10/1871.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 15. května 2013
……………………………… Jméno Příjmení
OBSAH 1.
Úvod ............................................................................................................................. 12
2.
Imunitní systém obratlovců ........................................................................................... 14 2.1.
Mechanismy imunitního systému ........................................................................... 14
2.1.1.
Nespecifická imunita ...................................................................................... 15
2.1.2.
Specifická imunita .......................................................................................... 15
2.1.2.1. 3.
Orgány imunitního systému ptáků ................................................................................. 17 3.1.
Primární lymfatické orgány .................................................................................... 17
3.1.1.
Thymus........................................................................................................... 17
3.1.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.2.
Stavba thymu ........................................................................................... 18
Fabriciova burza ............................................................................................. 18
3.1.2.1.
Stavba Fabriciovy burzy .......................................................................... 19
Kostní dřeň ..................................................................................................... 20
Sekundární lymfatické orgány................................................................................ 21
3.2.1.
Gastrointestinální lymfatická tkáň (GALT) ..................................................... 21
3.2.1.1.
Peyerovy plaky ........................................................................................ 22
3.2.1.2.
Cekální tonzily ........................................................................................ 23
3.2.1.3.
Jícnové a Pylorické mandle ...................................................................... 23
3.2.1.4.
Meckelův divertikl ................................................................................... 23
3.2.2.
Bronchiální lymfatická tkáň (BALT) .............................................................. 24
3.2.3.
Lymfatická tkáň v oblasti hlavy (HALT) ........................................................ 24
3.2.3.1. 3.2.4. 4.
Lymfocyty ............................................................................................... 16
Harderova žláza ....................................................................................... 24
Slezina ............................................................................................................ 25
Buněčná složka nespecifické imunity ............................................................................ 26 4.1.
Komponenty buněčné imunity ............................................................................... 26
4.1.1.
Eozinofily ....................................................................................................... 27
4.1.2.
Bazofily .......................................................................................................... 27
4.1.3.
Heterofily ....................................................................................................... 28
4.1.4.
Monocyty ....................................................................................................... 28
4.1.5.
NK buňky ....................................................................................................... 29
4.2.
Funkce buněčné imunity ........................................................................................ 29
4.2.1.
4.3.
Heterofily a fagocytóza ................................................................................... 29
4.2.1.1.
Oxidativní mechanismy fagocytózy ......................................................... 31
4.2.1.2.
Neoxidativní mechanismy fagocytózy...................................................... 32
Toll – like receptory............................................................................................... 34
9
5.
Humorální složka nespecifické imunity ......................................................................... 35 5.1.
Komplementový systém ......................................................................................... 35
5.1.1.
Alternativní cesta ............................................................................................ 37
5.1.2.
Klasická cesta ................................................................................................. 39
5.1.3.
Lektinová cesta ............................................................................................... 41
5.1.4.
Lytická fáze komplementu .............................................................................. 41
5.2. 6.
Lysozym ................................................................................................................ 42
Imunita a reprodukce .................................................................................................... 43 6.1.
Stavba reprodukčního traktu .................................................................................. 43
6.2.
Imunita reprodukčního traktu samic ....................................................................... 44
6.3.
Ochrana spermií ..................................................................................................... 45
6.4.
Spermie a oxidační stres......................................................................................... 46
6.5.
Imunita a ornamentace ........................................................................................... 47
7.
Cíl práce ....................................................................................................................... 49
8.
Biologický materiál....................................................................................................... 50
9.
Metody a materiál ......................................................................................................... 52 9.1.
Stanovení aktivity respiračního vzplanutí chemiluminiscenčně .............................. 52
9.1.1.
Použitý materiál a přístroje ............................................................................. 53
9.1.2.
Postup............................................................................................................. 54
9.1.3.
Problematika měření ....................................................................................... 54
9.2.
Stanovení koncentrace lysozymu metodou ELISA ................................................. 55
9.2.1.
Použitý materiál a přístroje ............................................................................. 55
9.2.2.
Postup............................................................................................................. 56
9.3.
10.
Metodika vedlejších pokusů ................................................................................... 56
9.3.1.
Stanovení komplementové aktivity pomocí bioluminiscenčních bakterií ……. 57
9.3.2.
Stanovení koncentrace lysozymu metodou radiální difúze v agaróze ............... 57
9.3.3.
Metody stanovující aktivitu antioxidačních enzymů ........................................ 57
9.3.3.1.
Stanovení GST ........................................................................................ 57
9.3.3.2.
Stanovení SOD ........................................................................................ 57
9.3.4.
Stanovení celkové antioxidační kapacity – TRAP ........................................... 58
9.3.5.
Stanovení míry oxidačního stresu na základě přítomnosti MDA ...................... 58
Výsledky ................................................................................................................... 59
10.1.
Vyhodnocení aktivity respiračního vzplanutí ...................................................... 59
10.1.1.
Porovnání intenzity respiračního vzplanutí po aktivaci různými typy stimulantů za použití luminoforů luminolu a Pholasinu ................................ 59
10.1.2.
Porovnání intenzity respiračního vzplanutí za různých podmínek (optimalizace Pholasinu).............................................................................. 60
10.1.3.
Variabilita v imunitní odpovědi na LPS u sýkory koňadry ........................... 61
10
10.1.3.1.
Porovnání variability v imunitní odpovědi na LPS mezi jedinci v rámci hnízda ...................................................................... 62
10.1.3.2.
Porovnání variability v imunitní odpovědi na LPS mezi hnízdy navzájem .............................................................................. 73
10.1.3.2.1.
Variability v imunitní odpovědi na LPS S. enterica............................ 74
10.1.3.2.2.
Variability v imunitní odpovědi na LPS E. coli .................................. 76
10.2.
Stanovení koncentrace lysozymu metodou ELISA.............................................. 78
10.3.
Vyhodnocení výsledků vedlejších metodik ......................................................... 79
10.3.1.
Stanovení komplementové aktivity pomocí bioluminiscenčních bakterií...... 79
10.3.2.
Stanovení koncentrace lysozymu metodou radiální difúze ........................... 80
10.3.3.
Stanovení aktivity GST ............................................................................... 81
10.3.4.
Stanovení aktivity SOD ............................................................................... 81
10.3.5.
Stanovení antioxidační kapacity .................................................................. 82
10.3.6.
Stanovení MDA .......................................................................................... 83
11.
Diskuze ..................................................................................................................... 84
12.
Závěr ......................................................................................................................... 90
13.
Seznam zkratek ......................................................................................................... 92
14.
Použitá literatura ....................................................................................................... 93
15.
Internetové zdroje .................................................................................................... 101
16.
Příloha ..................................................................................................................... 102
11
1. Úvod Ptáci, kteří jsou pokládáni za potomky drobných teropodních dinosaurů, představují s necelými deseti tisíci druhů po rybách druhou nejpočetnější skupinu obratlovců osidlující prakticky celou planetu. Největší rozmanitosti přitom dosahují v tropických oblastech, směrem k pólům pak jejich druhová diverzita klesá. Některé druhy však můžeme nalézt i hluboko ve vnitrozemí Antarktidy. Co se našeho území týká pozorovat zde můžeme více než 400 druhů, přičemž polovina z nich zde také hnízdí (URL 1). V posledních třiceti letech byl však zaznamenán rapidní pokles jejich početního zastoupení vykazující úbytek deseti miliónů jedinců. Toto číslo se navíc z důvodu nedostatku vhodných míst, poskytujících prostor pro hnízdění, neustále zvyšuje. Význam ptáků nespočívá pouze v hospodářském či chovatelském využití, ale především v rámci potravního řetězce přírody, který udržuje její ekologickou stabilitu. Ptáci jsou nejen konzumenty obrovského množství hmyzích škůdců, ale i mršin či velmi často přemnožených hlodavců. Svůj význam mají také v zemědělství, které využívá ptačího trusu pro výrobu kvalitního hnojiva, označovaného jakožto guáno, jehož těžba se neustále rozrůstá. Ve většině případů vedou ptáci rychlý a energeticky náročný život, během kterého se setkávají s množstvím různých druhů patogenů, ať už se jedná o bakterie, viry, plísně či parazity, jejichž druhové zastoupení narůstá zejména v případě migrujících ptáků. Ti využívají globální rozdíly sezónních teplot k optimalizaci dostupnosti zdrojů potravy a hnízdních lokalit. Do kontaktu se tak dostávají s patogeny různých podnebných pásem, což klade značné nároky především na jejich imunitní systém. Imunitní systém ptáků společně s jejich vysokou tělesnou teplotou představuje pro všudypřítomné patogeny mnohdy nepřekonatelnou překážku, která především v podobě vrozených imunitních mechanismů čelí jejich každodennímu útoku. Tato nespecifická, neboli vrozená a pro život nepostradatelná imunita je výsledkem genetické výbavy každého jedince. Její důležitost spočívá nejen v roli první obranné linie organismu, ale i aktivačního podnětu k rozvoji imunity specifické. Celkově je imunitní systém ptáků v mnohém totožný s imunitním systémem savců. Sdílení těchto imunologických rysů je výsledkem evoluce, která říká, že ptáci se stejně jako savci vyvinuli ze společného plazího předka. Na druhou stranu však můžeme pozorovat řadu odlišných a v některých případech pozoruhodných, pro ptáky ojedinělých, strategií, prostřednictvím kterých dosahují stejného imunitního výsledku jako savci, avšak za využití odlišných mechanismů.
12
Z historického hlediska přispělo studium ptačí imunologie k porozumění mnohých imunitních mechanismů obratlovců. Nejvýznamnější roli přitom sehrálo
v rozvoji
vakcinologie, kdy se ptáci z pozice modelových organismů stali součástí mnohých prvenství. Konkrétně první vakcína objevená Luisem Pasteurem byla namířena právě proti choleře drůbeže, stejně tak vakcína použitá poprvé proti nádorovému onemocnění byla aplikována jakožto prevence před Markovou chorobou (Davisson a kol. 2008). Ta představuje jedno z nejzávažnějších infekčních onemocnění vyskytujících se taktéž u drůbeže. V současné době je z hlediska vakcinace brán největší zřetel na virové onemocnění ptačí chřipky, jejíž vysoce patogenní formy vedou nejen k likvidaci miliónů jedinců chovného ptactva, ale také možnému ohrožení lidského zdraví. Ačkoliv by se dalo předpokládat, že imunita ptáků je detailně prostudovanou kapitolou, ne vždy tomu tak opravdu je. Důležité je si uvědomit, že imunologické studie ptáků jsou primárně spjaty s jejich hospodářskou využitelností. Ze zřejmých důvodů se tak modelovým organismem stal kur domácí (Gallus gallus f. domestica), skrze kterého je převaha výsledků vztažena mnohdy na celou skupinu ptáků s chybějícími tematickyodpovídajícími studiemi pro jiné, chovatelsky méně významné či nevýznamné druhy ptactva. Nepřekvapí nás také, že druhotný zájem je spojen s okrasnými druhy, jejichž obliba u chovatelů v posledních letech značně narůstá. Volně žijící druhy ptáků tak až do nedávna unikaly pozornosti imunologů a v rámci jejich imunitních mechanismů tak nacházíme nejvíc otazníků. Důvody jsou zřejmé, jedná se nejen o náročnost odchytu, ale především o to vyhnout se možnému ovlivnění imunitních pochodů, ke kterému dochází nejen během laboratorního odchovu, ale také během stresových situací, kterými je pro ptáky nejen odchyt a následný odběr vzorků, ale i pouhá manipulace. I přesto všechno se naše pozornost zaměřila na mechanismy vrozené imunity především volně žijících druhů ptáků, konkrétně na mláďata sýkory koňadry (Parus major), o jejichž imunitě se toho ví ještě o něco méně. V části experimentů byla jako modelový organismus použita také vlaštovka obecná (Hirundo rustica), křepelka japonská (Coturnix japonica) či kur domácí. Tato práce by svým obsahem mohla napomoci zodpovědět některou z mnohých otázek a přispět tak k lepšímu porozumění vrozené imunity ptáků, které by tak zprostředkovaně mohlo mít význam také pro objasnění evoluce imunitních pochodů obratlovců.
13
2. Imunitní systém obratlovců Imunitní systém je tvořen soustavou orgánů, tkání, buněk a molekul, jejichž souhrn mechanismů zajišťuje integritu organismu rozeznáváním a likvidací cizích či vlastních, ale potenciálně škodlivých struktur. Tyto struktury označujeme jako antigeny, kterými může být jakákoliv cizorodá látka, původu exo- či endogenního, vyvolávající imunitní odpověď. Mezi základní projevy imunitního systému patří (Hořejší a Bartůňková 2009): a) Obranyschopnost - založena na rozpoznávání a likvidaci vnějších antigenů, nejčastěji patogenních mikroorganismů a jejich zplodin. b) Imunitní dohled - založen na rozpoznávání a likvidaci vnitřních antigenů, které představují staré, poškozené či zmutované buňky. c) Autotolerance - schopnosti organismu tolerovat struktury jemu vlastní. Účinnost imunitního systému je dále zajištěna extrémním polymorfismem, který umožňuje od sebe rozpoznat buňky či jejich součásti na základě velmi malých rozdílů v jejich molekulární struktuře.
2.1. Mechanismy imunitního systému Mechanismy imunitního systému obratlovců lze dle specifity rozdělit na dvě základní kategorie: imunitu nespecifickou (neadaptivní, vrozenou) a specifickou (adaptivní, získanou). Oba tyto typy mechanismů jsou pro obratlovce životně důležité, stejně tak je tomu s jejich vzájemnou kooperací a četnými vazbami, které dohromady tvoří unikátní celek patřící k nejsložitějším a zároveň nejsnáze zranitelným systémům organismu (Hořejší a Bartůňková 2009).
14
2.1.1. Nespecifická imunita Nespecifická neboli vrozená či neadaptivní imunita představuje první obrannou linii organismu. Je evolučně starší, vyskytující se v různé míře u všech mnohobuněčných organismů (Hořejší a Bartůňková 2009). Základním rysem tohoto typu imunity je kromě vrozenosti také nespecifičnost, díky níž je namířena proti širokému spektru patogenů. Toho je dosaženo reakcí zaměřenou na strukturní a funkční rysy sdílené různými skupinami mikroorganismů. Neméně důležitým znakem je absence imunologické paměti. Nespecifická imunita tak není ovlivněna předchozím setkáním s antigenem, díky čemuž zasahují příslušné buňky vždy stejnou silou, a to i po opakovaném kontaktu s konkrétním typem antigenu. Nespecifická imunita zahrnuje jednak složku buněčnou reprezentovanou buňkami myeloidní linie a cytotoxickými NK buňkami (natural killers, tj. „přirození zabíječi“) a jednak složku humorální tvořenou komplementovým systémem a mnohými sérovými proteiny (Toman a kol. 2009). Obě složky nespecifické imunity, popsané detailně v následujících kapitolách, se neustále nacházejí v krvi. Jejich aktivace je tak v případě potřeby téměř okamžitá, pohybující se řádově v minutách. K nespecifické imunitě řadíme též bariérovou funkci organismu. Tu představuje neporušený povrch kůže a sliznic a jejich přirozené neimunitní obranné mechanismy udržující integritu organismu vůči okolí.
2.1.2. Specifická imunita Specifická neboli získaná či adaptivní imunita je typem imunity evolučně vyspělejším (Hořejší a Bartůňková 2009). I přes vzájemnou kooperaci s výše uvedenou imunitou nespecifickou se liší hned v několika ohledech: není vrozená, specificky rozpoznává cizorodé struktury, vyznačuje se imunologickou pamětí. Díky těmto vlastnostem je každá její buňka geneticky předurčena k rozpoznání pouze jediného druhu antigenu, přičemž opakované setkání s konkrétním antigenem vyvolává vždy o něco rychlejší a efektivnější imunitní odpověď, tzv. sekundární (anamnestickou) odpověď. Zprostředkovateli specifické imunity jsou T a B-lymfocyty, které se společně s NK buňkami diferencují z lymfoidní linie (Hořejší a Bartůňková 2009). K úplnému rozvoji adaptivní imunity je zapotřebí několika dnů až týdnů. Její aktivace je přitom založena na klonálním (anticipačním) principu, díky kterému je imunitní systém schopen předvídat setkání s jakýmkoliv typem antigenu. Toho je dosaženo množstvím odlišných typů T a Blymfocytů, které jsou v organismu vždy předem připraveny.
15
2.1.2.1. Lymfocyty Lymfocyty
představují
u
některých
druhů
ptáků
nejpočetnější skupinu buněk periferní krve (Clark a kol. 2009). Morfologicky je dělíme do tří skupin: malé lymfocyty s kulatým jádrem, středně velké lymfocyty, jež se svojí velikostí podobají granulocytům a jejichž jádro je nepravidelně kulaté, a velké lymfocyty s vejčitým jádrem, jež jsou rozměrově podobné monocytům. V cytoplazmě lymfocytů můžeme nalézt také granula. Ačkoliv lymfocyty jedince vykazují značné rozdíly ve své morfologii, mezidruhové rozdíly pozorovány nejsou.
Obr.1a (nahoře): Lymfocyt slípky takahe (Porphyrio mantelli) v elektronovém mikroskopu. Obr.1b (dole): Velký lymfocyt kondora havranovitého (Coragyps atratus) ve světelném mikroskopu. (Clark a kol. 2009)
T-lymfocyty jsou zprostředkovateli tzv. buněčné imunity (Hořejší a Bartůňková 2009). Dle funkce je dělíme do dvou hlavních kategorií: pomocné neboli Th lymfocyty (T helper lymphocyte) regulující vývoj B-lymfocytů v plazmatické buňky a cytotoxické neboli Tc lymfocyty (T cytotoxic lymphocyte), jejichž specializace je zaměřena na rozpoznání a eliminaci intracelulárních antigenů. Malá část antigenem aktivovaných T-lymfocytů navíc diferencuje v buňky zodpovědné za imunologickou paměť, tzv. paměťové buňky. B-lymfocyty zprostředkovávají naopak imunitu látkovou (Hořejší a Bartůňková 2009). Jejich antigenní specializace je tentokrát namířena proti extracelulárním parazitům. Pod přímým vlivem antigenu přitom dochází ke vzniku dvou typů efektorových buněk. Prvním typem jsou krátce žijící plazmatické buňky produkující velké množství protilátek. Druhým typem jsou opět buňky paměťové schopné přežít v organismu i několik let. Plazmatické buňky ptáků produkují IgM, IgA a IgG (Toman a kol. 2009). Typ IgG, tedy hlavní imunoglobulin s protiinfekční aktivitou, je často označován jako IgY, důvodem je jeho strukturní odlišnost od IgG savců.
16
3. Orgány imunitního systému ptáků Orgány imunitního systému jsou vysoce specializované tkáně obsahující velké množství lymfocytů, jejich prekurzorů a řadu dalších buněk tvořících pro lymfocyty vhodné prostředí (Hořejší a Bartůňková 2009). Z funkčního hlediska je dělíme na orgány primární (centrální) a sekundární (periferní), jejichž uložení je patrné z následujícího obrázku (Obr. 2).
Obr. 2: Anatomie uložení lymfatických orgánů kura domácího (upraveno dle URL 2).
3.1. Primární lymfatické orgány Jako primární neboli centrální označujeme takové orgány, které jsou místem vzniku, diferenciace a zrání lymfocytů. U ptáků k nim řadíme thymus (brzlík), Fabriciovu burzu a kostní dřeň.
3.1.1. Thymus Thymus ptáků, stejně jako u ostatních obratlovců, zodpovídá za diferenciaci a funkční dozrávání T-lymfocytů. Strukturně se jedná o laločnatý orgán umístěný oboustranně v podkoží krku v blízkosti hrdelních žil a bloudivého nervu (Červený 2000). Jednotlivé laloky představují u kura nepravidelné oválné útvary o velikosti 0,5 - 1,5 cm. Na každé straně přitom nacházíme 7 - 8 takovýchto laloků (Kendall 1980). V průběhu embryogeneze je thymus prvním funkčně zcela vyvinutým lymfatickým orgánem (Jankovič a kol. 1975). Hematopoetickými kmenovými buňkami je během svého 17
vývoje kolonizován ve třech vlnách, konkrétně 6., 12. a 18. den inkubace (Lanza a kol. 2009). Po následné diferenciaci v imunokompetentní T-lymfocyty probíhá postupná migrace buněk s cílem obsazení sekundárních lymfatických orgánů. Maximální velikosti dosahuje thymus během 3 – 4 měsíců věku, tedy v období před dosažením pohlavní dospělosti, během které dochází k jeho postupné invoulci (Ciriaco a kol. 2003).
3.1.1.1. Stavba thymu Každý lalok thymu je opatřen jemným vazivovým pouzdrem, ze kterého vybíhají směrem do jeho parenchymu vazivové přepážky neboli septa (Davison a kol. 2008). Ty neúplně rozdělují laloky na menší fazolovité lalůčky. Septy probíhají kromě tepen, žil a vlásečnic také eferentní lymfatické cévy. Mikroskopická stavba parenchymu brzlíku je obdobná jako u savců. Každý lalok se skládá ze světlejší centrálně umístěné dřeně (medulla) obklopené kůrou (cortex) tmavší barvy. Hranici mezi těmito dvěma oblastmi nazýváváme kortikomedulární oblastí. Kůra thymu je tvořena jemnou sítí cytokeratinových vláken proplétajících se mezi epiteliálními retikulárními buňkami a ve velkém počtu přítomnými thymocyty a bazofily (Davison a kol. 2008). V menším počtu jsou zde zastoupeny také makrofágy. Většina lymfoblastů zde přítomných se nachází v S-fázi buněčného cyklu, což svědčí o tom, že kůra, přesněji řečeno její subkapsulární oblast, je hlavním místem proliferace neboli lymfopoézy. Dřeň thymu je tvořena velkým počtem vysoce variabilních buněk, které ačkoliv netvoří cytokeratinová vlákna, označujeme jako buňky epitelové (Davison a kol. 2008). Funkční význam těchto buněk není dosud znám, ačkoliv mnohými autory je navrhována funkce endokrinní. Kromě epitelových buněk jsou v dřeni zastoupeny také v menším množství přítomné thymocyty. Mezi klasické struktury dřeně patří stejně jako u savců tzv. Hassalova tělíska, která jsou u kuřat poměrně malá, špatně vyvinutá a jejichž funkce zůstává záhadou. Někteří vědci je považují za místo degradace thymocytů. Mnozí z nich však odhalili jejich schopnost produkovat biologicky účinné látky.
3.1.2. Fabriciova burza Fabriciova burza, též známá jako burza kloakální (bursa cloacalis) představuje unikátní orgán ptáků, jehož analogie u savců či plazů nebyla dosud objevena (Turner 1994). Její funkční význam spočívá v přeměně lymfopoetických kmenových buněk pocházejících ze stěny žloutkového váčku či kostní dřeně v imunokompetentní B-lymfocyty (Červený 18
2000). Ty následně migrují do periferních lymfatických orgánů a tkání, kde dochází k jejich maturaci a přeměně v plazmatické buňky. Mnozí vědci označují Fabriciovu burzu zároveň jakožto orgán sekundární. Důvodem je jinak neobjasněná přítomnosti T-lymfocytů a možná detekce antigenů, která je v případě primárních orgánů zcela vyloučena (Schaffner a kol. 1974). Fabriciova burza vzniká jakožto nepárovitá kapsovitá vychlípenina dorzální stěny konečného úseku primitivního střeva (Červený 2000). U kura se vyvíjí přibližně kolem 4. dne inkubace (Toman a kol. 2009). O necelé dva týdny později, přesněji řečeno 17. den embryonálního vývoje, je burza již plně vyvinutým orgánem (Meyer a kol. 1959). Po vylíhnutí mláděte dochází k jejímu postupnému růstu. Největší velikosti dosahuje mezi 8. - 10. týdnem života (Davison a kol. 2008). Po dosažení pohlavní dospělosti, tedy mezi 18. - 24. týdnem, dochází stejně jako v případě thymu k její postupné involuci (Ciriaco a kol. 2003).
3.1.2.1. Stavba Fabriciovy burzy Stěna burzy je na povrchu tvořena serózou a adventicií (Červený 2000). Střední vrstvu pak představuje hladká svalovina, vrstvu vnitřní - sliznice. Sliznice je uspořádána do 10 - 13 podélných řas, které označujeme jako řasy primární. Ty se dále dělí na řasy sekundární, ve kterých se nachází četné folikuly, oddělené vazivovými septy. Jednotlivé folikuly můžeme rozlišit na hustou tmavší kůru a řidší světlejší dřen (Obr. 3). Kůra burzy je kryta jemnou kolagenovou kapsulí (Davison a kol. 2008). Pod ní se nachází síť tvořená mezenchymálními retikulárními buňkami, které na rozdíl od dřeně folikulů produkují extracelulární matrix. Ta je bohatá na kolagen typu III a fibronektin, což zde indikuje intenzivní buněčnou migraci. Mezi retikulárními buňkami nacházíme hustě nahloučené B-lymfocyty, přičemž mnoho z nich prodělává mitózu. Přítomny jsou také makrofágy, vzácněji pak T-lymfocyty a plazmatické buňky. Od dřeně je kůra oddělena kortikomedulární hranicí. Dřeň burzy je tvořena sítí hvězdicovitých retikulárních buněk s volněji nahloučenými lymfocyty, které i zde podstupují proliferaci (Davison a kol. 2008). Jak již bylo zmíněno retikulární buňky dřeně neprodukují extracelulární matrix, což znamená, že migrace buněk je zde značně sporná. Z dalších buněčných typů jsou zde zastoupeny makrofágy či sekreční dendritické buňky, jejichž umístění je limitováno pouze na dřeň. Možné je zde zaznamenat také plazmatické buňky, jejichž počet se zvyšuje s věkem. Obecně je však jejich přítomnost značně omezena.
19
Obr. 3: Struktura Fabriciovy burzy: IFE (interfollicular epithelium) – interfolikulární epitel, FAE (follicle-associated epithelium) – folikulární epitel, FAE-SC (follicle-associated epithelium supportive cell) – podpůrné buňky folikulárního epitelu, MRC (mesenchymal reticular cell) – mezenchymální retikulární buňky, CMAFC (cortico-medullary arch-forming cell), Ma – makrofágy, Ly – lymfocyty, BSDC (bursal secretory dendritic cell) – sekreční dendritické buňky burzy, ERC (epithelial reticular cell) – epiteliální retikulární buňky, M – medulla, C – cortex. (upraveno dle Davison a kol. 2008).
3.1.3. Kostní dřeň Kostní dřeň je u ptáků zastoupena pouze omezeně, přesto zde probíhá řada důležitých dějů jako je erytro- či trombopoéza (Davison a kol. 2008). U dospělých jedinců navíc přebírá roli sleziny a stává se místem probíhající granulo- či lymfopoézy (Tuner 1994). Histologicky ji lze rozdělit do dvou kompartmentů: intravaskulární a extravaskulární. První z nich, tedy prostor krevních sinů zodpovídá nejen za trombopoézu, ale narozdíl od savců také za erytropoézu (Davison a kol. 2008). Po vylíhnutí mláděte je zde tak možno pozorovat mnoho nezralých buněk erytroidní linie či aktivní proliferující populace erytroidních progenitorů. Extravaskulární prostor zodpovědný za granulo-, mono- a lymfopoézu je tvořen převážně granulocyty a v menším počtu přítomnými tukovými buňkami (adipocyty) (Davison a kol. 2008). S narůstajícím věkem se však počet granulocytů znatelně snižuje, množství adipocytů naopak narůstá. Co se procesu lymfopoézy týká, její průběh je omezen pouze na malá ložiska této tkáně.
20
3.2. Sekundární lymfatické orgány Sekundární lymfatické orgány jsou místem, kde probíhá hlavní fáze specifické imunitní odpovědi (Hořejší a Bartůňková 2009). Tyto orgány jsou specializovány jak k vychytávání antigenů, tak ke koncentrování lymfocytů. Periferní lymfatická tkáň ptáků je na rozdíl od savců organizována spíše difúzně (Toman a kol. 2009). Důvodem je nedostačující či v případě většiny ptáků nulový výskyt lymfatických uzlin vedoucí ke vzniku malých ohnisek lymfatické tkáně takřka ve všech orgánech včetně myokardu, ledvin, jater, pankreatu či endokrinních orgánů a svaloviny. Výrazněji je potom vyvinuta slizniční lymfatická tkáň označovaná jakožto MALT (Mucosaassociated lymfoid tissue). V rámci té rozlišujeme lymfatickou tkáň gastrointestinálního traktu GALT (Gut-associated lymphoid tissue), bronchiální lymfatickou tkáň BALT (Bronchial-associated lymphoid tissue) či lymfatickou tkáň v oblasti hlavy označovanou jakožto HALT (Head-associated lymphoid tissue). Z kompaktních struktur pak mezi sekundární lymfatické orgány řadíme slezinu.
3.2.1. Gastrointestinální lymfatická tkáň (GALT) GALT neboli lymfatická tkáň gastrointestinálního traktu je klíčový imunologický systém, který dle mnohých odhadů sestává z více imunitních buněk, než kterákoliv jiná tkáň (Davison a kol. 2008). Komplexně GALT zahrnuje: 1) lymfoidní buňky nacházející se rozptýleně buď v povrchovém epitelu sliznice (lamina epithelialis) či pod vrstvou slizničního vaziva (lamina propria). 2) specializované lymfatické struktury umístěné na strategických místech podél střeva (Peyerovy plaky, cekální tonzily, jícnové a pylorické mandle, Meckelův divertikl). Co se struktury týká, více či méně organizované tkáně jsou ve své nejjednodušší podobě tvořeny specializovaným epitelem - lymfoepitelem a folikuly bohatými na B a T-lymfocyty. Specifičnost epitelu je dána přítomností tzv. M-buněk, které mají schopnost přenést antigen z lumen střeva k dendritickým buňkám a makrofágům lymfatické tkáně (Kitagawa a kol. 2000). Obecně je přední oddíl trávicí trubice v porovnání s oddílem zadním považován za relativně málo organizovanou lymfatickou tkáň (Befus a kol. 1980). Co se přechodové části týká, lymfatickou tkáň nacházíme v celém prostoru lamina propria žláznatého žaludku (Jeurissen a kol. 1989). Kromě jasně definovaných struktur jako jsou například Peyerovy plaky či cekální tonzily nacházíme po celé délce tenkého střeva řadu méně dobře 21
definovatelných, izolovaných lymfoidní folikulů. Lymfaticky méně vybavenou oblast představuje střevo tlusté. V oblasti kloaky, konkrétně v proktodeu a urodeu je však možné pozorovat značné zastoupení folikulů, které je nejvíce patrné v oblasti kanálků Fabriciovy burzy (Befus a kol. 1980). Mnoho z organizovaných struktur GALTu je místem iniciace imunitní reakce poskytující podmínky nezbytné k rozvoji adekvátní imunitní odpovědi.
3.2.1.1. Peyerovy plaky Jako Pyerovy plaky jsou u ptáků označovány organizované shluky lymfatické tkáně nacházející se ve sliznici tenkého střeva. Tyto struktury, jež mají u kura charakter lymfatických uzlíků (Obr. 4), vykazují mnohé znaky, jež jsou společné s Pyerovými plaky savců (Befus a kol. 1980; Burns 1982). Nalézt však můžeme rozdíly, týkající se jejich mikroskopické stavby a početního zastoupení (Davison a kol. 2008). A tak zatímco u prasete najdeme přibližně 20 plaků, v distální části ilea kura jich pozorujeme pouze 6 (Toman a kol. 2009). Makroskopicky jsou Peyerovy plaky pozorovatelné až několik dnů po vylíhnutí (Befus a kol. 1980). U kuřat jsou u každého druhého jedince přítomny po 10 dnech života 1 či 2 tyto plaky. Do 16. týdne se pak jejich počet zvýší na maximum. S narůstajícím věkem však dochází k postupné involuci, a tak v 58. týdnu života je přítomen pouze jeden z nich.
Obr. 4: Organizace imunitních buněk sliznice tenkého střeva s přítomnými Peyerovými plaky (upraveno dle Davison a kol. 2008).
22
3.2.1.2. Cekální tonzily Cekální tonzily označované též jako cekální mandle jsou shluky lymfatické tkáně lokalizované v místě odstupu slepého střeva (Obr. 5), které je v případě ptáků často párovitým orgánem (Červený 2000). Jejich velikost je u kura přibližně 0,5 x 2 cm. Základy tonzil se objevují Obr. 5: Cekální tonzily (upraveno dle URL 3)
po
deseti
dnech
embryonální
inkubace,
přítomnost
lymfocytů je možno zaznamenat o 8 dní později (Payne 1971 v Davison a kol. 2008).
Cekální tonzily i Peyerovy plaky obsahují stejně jako Fabriciova burza prekurzory B-lymfocytů (Muir a kol. 2000). Ty ihned po burzektomii (chirurgické odstranění burzy) rekolonizují laminu propriu střeva plazmatickými buňkami typu IgA+. GALT má tak zřejmě kromě role sekundární taktéž roli primární lymfatické tkáně.
3.2.1.3. Jícnové a Pylorické mandle Jícnové mandle představují masivní lymfoidní akumulaci nacházející se v přechodové oblasti mezi jícnem a žlaznatým žaludkem (Oláh a kol. 2002). Jedná se o trvalé struktury tvořené 6 až 8 podélnými záhyby, na jejichž distálních koncích tvoří lymfatická tkáň, kterou jako jedinou nacházíme kraniálně od žaludku, izolované mandle. Ty jsou tak vystaveny nestráveným antigenům prostředí. Kromě toho se jícnové mandle zřejmě taktéž podílejí na rozvoji B-lymfocytů. Poměrně nedávno byly objeveny struktury v oblasti vrátníku neboli pyloru pojmenované jakožto pylorické mandle (Nagy a Oláh 2007). Jejich dozírací role je tak strategicky uplatňována u vstupu do dvanáctníku. Analogické struktury pylorických či jícnových mandlí nebyly u savců dosud objeveny.
3.2.1.4. Meckelův divertikl Meckelův divertikl je lymfoidní tkáň, která v podobě přívěsku tenkého střeva (Obr. 6) tvoří hranici mezi jejunem a ilem (Červený 2000). Jedná se reziduum embryonálního spojení prvostřeva se žloutkovým váčkem, který je po svém vtažení Obr. 6: Meckelův divertikl (upraveno dle URL 4)
do
tělní
dutiny
mláděte
resorbován
prvních dvou týdnů života (Oláh a Glick 1984).
23
během
Tou dobou se také objevuje do té doby nepřítomná lymfatická tkáň, která je plně vyvinuta okolo 10. týdne (Oláh a Glick 1984). Funkci lymfoidní tkáně, která spočívá ve vychytávání antigenů a produkci velkého množství plazmatických buněk (IgA+, IgY+), vykonává Meckelův divertikl do 21 měsíců věku. Z anatomického hlediska je zde zřejmá podobnost s cekálními tonzily a Peyerovými plaky (Davison a kol. 2008). Svým charakterem, tedy velkým počtem plazmatických buněk, pak připomíná Harderovu žlázu popsanou níže.
3.2.2. Bronchiální lymfatická tkáň (BALT) Plíce ptáků vykazují přítomnost jak vysoce organizovaných lymfatických struktur, tak i difúzně rozptýlených lymfoidních a myeloidních buněk (Davison a kol. 2008). Poprvé byly tyto struktury popsány v práci Bienenstock a kol. (1973), který při porovnávání imunitního systému plic ptáků a savců objevil lymfoidní uzliny primární průdušky. Zde pozoroval mnoho podobností s Peyerovými plaky a dalšími strukturami GALTu, z toho důvodu byly tyto struktury označeny jakožto BALT. Struktury BALTu jsou v porovnání s ostatními druhy ptáků nejčastěji pozorovatelné právě u kura. Lokalizovány jsou především v oblasti přechodu párové primární průdušky v průdušky sekundární (Van Alstine a Arp 1988) či při ústí vzdušných vaků (Myers a Arp 1987). Organizované struktury jsou pozorovatelné až 4. týden po vylíhnutí. Plně vyvinutým BALTem pak disponují ptáci staří 6 a více týdnů.
3.2.3. Lymfatická tkáň v oblasti hlavy (HALT) Lymfatická tkáň v oblasti hlavy je soustředěna především v paraokulární žláze 3. víčka označované jakožto Harderova žláza (Montgomery a Maslin 1992). V menším zastoupení
ji
nacházíme
také
v slzných
kanálcích,
nosních
a
slzných
žlázách,
mukóze/submukóze nosní dutiny či v oblasti spojivek.
3.2.3.1. Harderova žláza Harderova neboli Harderská žláza je tuboloalveolární exokrinní žláza nacházející se při bázi třetího víčka neboli mžurky (Obr. 7) (Davison a kol. 2008). Sekret produkovaný tímto typem žlázy, která je v případě ptáků větší než u savců, zodpovídá za zvlhčování a čištění rohovky (Červený 2000). Obr. 7: Harderova žláza (převzato z URL 5). 24
Z hlediska role imunitní zajišťuje Harderova žláza produkci specifických protilátek podílejících se značnou měrou na protiinfekční ochraně oka. Kromě značného množství protilátky produkujících plazmatických buněk, jejichž množství narůstá s věkem, obsahuje Harderova žláza také malé zastoupení makrofágů, interdigitujících dendritických buněk, heterofilů či B a T-lymfocytů (Jeurissen a kol. 1989). Mnohé z těchto buněk můžeme pozorovat již u pětidenních kuřat.
3.2.4. Slezina Slezina ptáků představuje u většiny druhů kulovitý až vejčitý útvar červenohnědé barvy, který je na rozdíl od savců uložen nikoliv vlevo, ale vpravo od žaludku (Červený 2000). U kura dosahuje její průměr 1 - 2 cm. Důležitost sleziny ptáků se v rámci imunitního systému jakožto celku zdá být z důvodu absence lymfatických uzlin podstatnější, než je tomu u savců (Masteller a Thompson 1994). Embryonálně se slezina ptáků zakládá jakožto shluk mezenchymálních buněk v prvních 48 hodinách vývoje (Romanoff 1960 v Davison a kol. 2008). Během následujících 5 dnů se objevují krevní siny s erytrocyty. Granulopoéza začíná být patrná od 7. dne. Následuje erytropoéza, kterou můžeme pozorovat o 4 dny později. Během embryonálního vývoje zde dochází také k lymfopoéze, během níž podstupují progenitory B-lymfocytů přeskupování svých Ig genů před tím, než začnou kolonizovat Fabriciovu burzu (Masteller a Thompson 1994). V tomto období tak slezina funguje jakožto primární lymfatický orgán. Sekundárním orgánem se stává až po vylíhnutí mláděte, tedy po kontaktu s antigeny prostředí, kdy také dochází k jejímu hlavnímu vývoji. Na rozdíl od sleziny savců nefunguje jakožto zásobárna erytrocytů pro rychlé uvolnění do oběhu (Sturkie 1943). Slezina ptáků je na povrchu pokryta kapsulí tvořenou kolagenovými a retikulárními vlákny. Stejně jako u savců zde můžeme odlišit tzv. červenou a bílou pulpu (Červený 2000). Bílá pulpa představuje světlejší oblast kolem terminálních větví arterie sleziny (Oláh a Glick 1982). Z buněčných populací zde nacházíme T a B-lymfocyty či dendritické buňky (Turner 1994). Červená pulpa je tvořena venózními siny a množstvím retikulárních buněk (Davison a kol. 2008). Z leukocytů jsou zde zastoupeny především T-lymfocyty (převaha Tc), NK buňky, plazmatické buňky všech izotypů, makrofágy, heterofily a cirkulující erytrocyty. U vyvíjejícího se embrya je tato oblast hlavním místem hematopoetické aktivity. Po vylíhnutí je její funkce zaměřena na filtrování cirkulujících přestárlých erytrocytů.
25
4. Buněčná složka nespecifické imunity 4.1. Komponenty buněčné imunity Buněčná složka vrozené imunity ptáků zahrnuje v rámci nespecifické imunity následující typy leukocytů: heterofily, eozinofily, bazofily, monocyty (tkáňová forma – makrofágy) (Obr. 8), dendritické buňky a NK buňky.
Obr. 8: Leukocyty ptáků: A - heterofil, B - eozinofil, C - bazofil, D - monocyt (upraveno dle Claver a Quaglia 2009).
Jak je patrné z následující tabulky (Tab. 1) poměrné zastoupení jednotlivých typů leukocytů vykazuje zřejmou mezidruhovou variabilitu. Papoušek šedý
Andulka
Korela chocholatá
Kachna
Kur
Pštros
Heterofily (%)
45-75
45-70
40-70
30-70
10-20
55-85
Lymfocyty (%)
20-50
20-45
25-55
20-65
65-70
10-40
Monocyty (%)
0-3
0-5
0-2
0-3
3-8
0-1
Eozinofily (%)
0-2
0-1
0-2
0-4
1-3
0-2
Bazofily (%)
0-5
0-5
0-6
0-5
1-3
0-1
Typ buněk
Tab. 1: Hematologické parametry vybraných druhů ptáků (upraveno dle URL 6).
26
4.1.1. Eozinofily Eozinofily představují granulární buňky nepravidelného kulovitého tvaru s tmavým jádrem, tvořeným nejčastěji dvěma laloky (Clark a kol. 2009). Světlá cytoplazma buňky obsahuje množství eozinofilních granul, jejichž součástí jsou mnohé hydrolytické enzymy. Počet granul, ale i jejich tvar, velikost, hustota a zabarvení se mezi jednotlivými druhy ptáků liší (Maxwell a Siller 1972). Tato variabilita je pak obzvláště vysoká u řádu dravců (Falconiformes) (Lind a kol. 1990). Jak je patrné z tabulky, poměrné zastoupení tohoto typu leukocytů, jejichž funkce nebyla u ptáků dosud zcela objasněna, se v periferní krvi pohybuje kolem 2 % (Claver a Quaglia 2009). Obr.9a (nahoře): Eozinofil poštolky australské (Falco cenchroides) v elektronovém mikroskopu. Obr.9b (dole): Eozinofil orla okrového (Aquila rapax) ve světelném mikroskopu. (Clark a kol. 2009)
4.1.2. Bazofily Další typ granulocytů představují bazofily, jež jsou v periferní krvi ptáků zastoupeny o něco více, než granulocyty předchozího typu (kolem 5 %). Bazofily jsou popisovány jakožto nepravidelně kulovité buňky se světlým laločnatým jádrem a množstvím tmavě zabarvených cytoplazmatických granul (Clark a kol. 2009). Bazofily ptáků stejně jako bazofily savců obsahují granula několika typů, včetně těch, jejichž součástí je histamin či heparin (Turner a kol. 1998). Jejich velikost je v porovnání s granuly eozinofilů několikanásobně nižší (Claver a Quaglia 2009). Hustota je však natolik vysoká, že granula překrývají dokonce i jádro bazofilu a zabraňují svému individuálnímu rozpoznání (Clark a kol. 2009). Stejně jako v případě eozinofilů i zde existují mezidruhové rozdíly. O funkci ptačích bazofilů se toho doposud moc neví (Claver a Quaglia 2009). Dle mnohých však hrají důležitou roli na počátku zánětu a v reakci okamžité přecitlivělosti (Maxwell a Robertson 1995). Obr.10a (nahoře): Bazofil slípky takahe (Porphyrio mantelli) v elektronovém mikroskopu. Obr.10b (dole): Bazofil eklekta různobarvého (Eclectus roratus) ve světelném mikroskopu. (Clark a kol. 2009) 27
4.1.3. Heterofily Heterofily
jakožto
ekvivalenty
savčích
neutrofilů
představují nejpočetnějšími skupinu granulocytů periferní krve (Clark
a
kol.
2009).
Jejich
procentuální
zastoupení
se pohybuje mezi 30 - 75 %. Strukturně se jedná o nepravidelně kulovité buňky s laločnatým bazofilním jádrem a acidofilními cytoplazmatickými granuly. Jádro je tvořeno 2 - 3 granulypřekrytými laloky. Granula, jež můžeme rozdělit do dvou, podle některých autorů i tří typů představují hustě nahloučené robustní útvary vřetenovitého tvaru, jejichž relativní délka se stejně jako šířka mezi jednotlivými druhy poněkud liší (Lucas a Jamroz 1961). Heterofily ptáků vykazují mnohé podobnosti s neutrofily savců, stejně tak však nacházíme spoustu odlišností. Díky svému početnímu zastoupení a funkci představují heterofily jednu z nejdůležitějších složek vrozené imunity. Z toho důvodu je jim v následující části kapitoly věnováno více pozornosti. Obr.11a (nahoře): Heterofil slípky takahe (Porphyrio mantelli) v elektronovém mikroskopu. Obr.11b (dole): Heterofil tučňáka brýlového (Spheniscus demersus) ve světelném mikroskopu. (Clark a kol. 2009)
4.1.4. Monocyty Monocyty
jsou
velké
pleomorfní
buňky
s jádrem
nepravidelného oválného či ledvinovitého tvaru (Clark a kol. 2009). Jejich zastoupení v periferní krvi ptáků (přibližně 3 %) není nikterak výrazné. Na periferii jádra monocytů nacházíme heterochromatin, v jeho centru euchromatin (Maxwell 1974). Přítomna bývají 1 - 2 jadérka. Obecně, granula v cytoplazmě zastoupena nejsou, avšak vzácně je nalézt lze (Clark a kol. 2009). Ačkoliv je morfologie monocytů v krvi jedince poměrně pestrá, v rámci druhů žádné významné rozdíly neexistují. Tkáňovou formu monocytů představují stejně jako v případě savců makrofágy (Hale-McWilliams a kol. 2010). Obr.12a (nahoře): Monocyt slípky takahe (Porphyrio mantelli) v elektronovém mikroskopu. Obr.12b (dole): Monocyt jestřába australského (Grus rubicunda) ve světelném mikroskopu. (Clark a kol. 2009)
28
Funkcí monocytů i makrofágů je především fagocytóza a následná spoluúčast na aktivaci specifické složky imunity. Tuto schopnost mají také dendritické buňky představující druhý typ buněk, ve který se monocyty mohou diferencovat. Souhrnně jsou všechny zmíněné typy buněk označovány jakožto buňky prezentující antigen.
4.1.5. NK buňky NK buňky řadíme z vývojového hlediska po bok T a B-lymfocytů, i přesto však zastupují buněčnou složku imunity nespecifické. Jedná se o velké granulární buňky sdílející mnoho funkcí s cytotoxickými T-lymfocyty (Göbel a kol. 1994). Specializovány jsou na obranu organismu proti virům a nádorovým buňkám (Toman a kol. 2009). V případě kuřat je tento typ buněk zastoupen především ve střevním epitelu, v menší míře je nacházíme také ve slezině a v krvi. Jejich nízké poměrné zastoupení v těchto dvou tkáních se výrazně liší od poměrného zastoupení NK buněk u člověka a myši, kde představují až 15 % všech lymfoidních buněk (Göbel a kol. 1994).
4.2. Funkce buněčné imunity Jak již bylo předesláno, hlavní obranou linii buněčné složky nespecifické imunity představují heterofily. Důvodem je nejen jejich vysoké množství, ale i účinnost jejich likvidačních mechanismů a okamžitá aktivace, ke které dochází během 30 minut (Maxwell a Robertson 1998). Primární úlohou heterofilů je fagocytóza cizorodých částic. Kromě té se však podílejí na procesu zánětu a díky exkreci některých cytokinů mobilizují další složky imunitního systému.
4.2.1. Heterofily a fagocytóza Fagocytóza je proces pohlcování pevných částic z okolního prostředí buňky, kterou označujeme jakožto profesionální fagocyt (Hořejší a Bartůňková 2009). Kromě heterofilů k nim řadíme také monocyty, makrofágy, dendritické buňky a eozinofily. Tyto buňky mají schopnost měnit svůj tvar a vytvářet tzv. panožky – pseudopodia. Aktivace heterofilů je v rámci zánětlivé reakce zprostředkována cytokiny a chemokiny zvyšujícími jejich fagocytární a mikrobicidní aktivitu (Andreasen a kol. 1990). Tato aktivita se v porovnání s monocyty či makrofágy zdá být méně závislá na opsonizaci, což je proces, při kterém jsou antigeny určené k fagocytóze označeny látkami, které nenazýváme jako
29
opsoniny (Harmon a kol. 1992; Stabler a kol. 1994). Funkci opsoninů zastávají protilátky, složky komplementu a další sérové proteiny, které tak zvyšují účinnost fagocytózy. Aktivita heterofilů se navíc v porovnání s monocyty či mokrofágy zdá být k některým typům patogenů znatelně vyšší. Průběh fagocytózy je následující (Obr. 13): Chemotaxí přivolaný fagocyt nejprve kontaktuje cizorodou částici prostřednictvím povrchových receptorů, které buňce spolehlivě umožňují rozpoznání struktur, jež jsou pro daný mikroorganismus typické (1) (Hořejší a Bartůňková 2009). Tyto receptory označujeme zkratkou PRR (pathogen recognition receptors). Struktury na povrchu patogenů pak nesou označení PAMP (pathogen associated molecular patterns). V následující fázi dochází k postupnému panožkami-zprostředkovanému pohlcování (2), jehož výsledkem je uzavření částice do nově vzniklé vakuoly označované jako fagozom (3). Ten následně fúzuje s lysozomem obsahujícím množství baktericidních látek a hydrolytických enzymů (4). Výsledkem této fúze je vznik tzv. fagolysozomu, uvnitř kterého dochází k intenzivnímu trávení pohlcené částice (5). Nestravitelné zbytky jsou obsaženy v reziduálním tělísku (6), které v konečné fázi splývá s cytoplazmatickou membránou buňky a uvolňuje tak svůj obsah do jejího vnějšího prostředí (7).
Obr. 13: Průběh fagocytózy (upraveno dle URL 7).
30
4.2.1.1. Oxidativní mechanismy fagocytózy Během procesu fagocytózy dochází mimo jiné k aktivaci membránového enzymu NADPH-oxidázy, který katalyzuje reakci, při níž NADPH reaguje s kyslíkem za vzniku nikotin-amid-adenin-dinukleotid-fosfátu (NADP+) a superoxidového radikálu (O2 -) (Freitas a kol. 2009). NADPH + 2O2 → NADP+ +2O2•− + 2H+ Touto reakcí je započato tzv. respirační (oxidační) vzplanutí fagocytů, které je považováno za jeden z nejúčinnějších baktericidních mechanismů probíhající uvnitř cytoplazmatických granul (Hořejší a Bartůňková 2009). Označení respirační získal tento proces z toho důvodu, že je provázen výraznou spotřebou kyslíku. Produkty tohoto procesu označované jakožto reaktivní formy kyslíku neboli ROS (reactive oxygen species) jsou silnými oxidačními činidly schopnými narušit strukturu mikroorganismu, stejně jako jeho DNA či aktivitu enzymů. ROS však v organismu představují dvousečnou zbraň, která kromě baktericidní aktivity disponuje schopností poškodit buňky či celé tkáně organismu. K tomu dochází před stabilizací antioxidanty, mezi které řadíme například karotenoidy a různé druhy vitamínů. Produktem reakce respiračního vzplanutí, která následuje po vzniku superoxidového radikálu, je peroxid vodíku (H2O2) (Freitas a kol. 2009). 2O2•− + 2H+ → O2 + H2O2 Dalším krokem je reakce H2O2 s chloridovým aniontem, jejímž produktem je kyselina chlorná (HOCl). Tato reakce je katalyzována tzv. myeloperoxidázou, enzymem přítomným původně ve fagocytárních lysozomech. Kyselina chlorná představuje nejsilnější baktericidní oxidant, jehož toxicita je 100 - 1000x vyšší, než v případě superoxidového radikálu či peroxidu vodíku (Conner a Grisham 1996). Ptačí heterofily však na rozdíl od jejich eozinofilů či monocytů a makrofágů myeloperoxidázu postrádají (Andreasen a Latimer 1990; Brune a kol. 1972). Cl− + H2O2 + H+ → HOCl− + H2O Mezi reaktivní formy kyslíku vznikající z H2O2 patří také extrémně reaktivní hydroxilový radikál (HO• ) či singletový kyslík (Freitas a kol. 2009). H2O2 +Fe(II) → Fe(III) + HO• + HO− H2O2 + OCl− → 1O2 + H2O + Cl−
31
Dalším účinným mikrobicidním prostředkem ptačích fagocytů, je oxid dusnatý (NO), vysoce reaktivní radikál, který je produkován enzymovým komplexem NO syntáza (Crippen a kol. 2003). L-arginin → •NO + L-citrulin Heterofily ptáků jsou na těchto oxidačních procesech závislé spíše sekundárně, na rozdíl od savčích neutrofilů vykazují primární závislost k procesům neoxidativním (Stabler a kol. 1994). Naměřené oxidační reakce jsou tak ve srovnání s neutrofily výrazně nižší. I přesto jsou však ptačí heterofily schopni uspět v boji proti patogenům stejnou měrou. Tomu napomáhají látky obsažené uvnitř fagocytárních granul. Ty i navdory tomu, že tvoří součást humorální imunity jsou vzhledem k jejich neodmyslitelné spojitosti s procesem fagocytózy probírány v následující části kapitoly.
4.2.1.2. Neoxidativní mechanismy fagocytózy Granula heterofilů lze rozdělit přinejmenším do dvou hlavních typů (Harmon 1998). První z nich - největší granula (0,8 až 3 mm) eliptického tvaru obsahující kationtové peptidy, kyselou fosfatázu a lysozym, jehož naměřená hladina byla dokonce vyšší, než v případě savců (Brune a Spitznagel 1973; Daimon a Caxton-Martins 1977; Rausch a Moore 1975). Tato granula však zároveň postrádají peroxidázu a alkalickou fosfatázu, jež jsou běžnou součásti primárních granul savčích neutrofilů (Daimon a Caxton-Martins 1977; Rausch a Moore 1975; Styrt 1989). Menší sférická granula (0,2 až 1 mm) obsahují kyselou hydrolázu jako je β-glukuronidáza (Brune a Spitznagel 1973). Dále byla zjištěna aktivita katepsinu a α-glukosidázy, které však nebyly přiřazeny k žádnému z výše uvedených typů granul, čímž vzniká pravděpodobnost existence jejich třetího typu. Také eozinofily, monocyty a makrofágy obsahují podobné látky, které se však mezi jednotlivými typy těchto leukocytů mohou lišit. To, že se granula ptačích heterofilů od neutrofilů savců značně liší (Tab. 2), není překvapující. Dokonce i mezi jednotlivými druhy savců totiž nacházíme rozdíly týkající se nejen typů granul, ale i jejich obsahu (Styrt 1989).
32
Granulární složka
Lidské Ptačí neutrofily heterofily
Myeloperoxidáza Defensiny β-Defensin Katepsiny Lysozym Kataláza Kyselá fosfatáza Alkalická fosfatáza β-Glukuronidáza α-Glukosidáza
+ + + + + + + + +
+ + + + + +
Tab. 2: Porovnání granulárních složek lidských neutrofilů a ptačích heterofilů (upraveno dle Harmon 1998). Zmiňovaná složka heterofilních granul, tedy kationtové peptidy jsou zastoupeny především β-defensiny, označovanými v případě ptáků jako AvBD (avian β-defensin) (Harwing a kol. 1994). Doposud bylo pro AvBD objeveno 14 různých genů (van Dijk a kol. 2008). Účinnost těchto peptidů je zaměřena proti širokému spektru bakterií, ale i prvokům, houbám a dokonce i některým virům (Zasloff 2002). Kromě přímé antibakteriální aktivity, která může být bakteriocidní či bakteriostatická, vykazují AvBD také schopnost imunomodulace (van Dijk a kol. 2008). Strukturně sdílejí AvBD mnohé podobnosti s β-defensiny savců. Předpokládaný princip jejich bakteriocidních mechanismů, který se však dle typu AvBD a přítomného druhu mikroorganismu může různou měrou lišit, je skrze jejich kationtovou povahu založen na elektrostatické interakci s negativně nabitými membránovými komponenty (např. LPS), umožňující jejich následný průchod membránou (Hancock 1997). Ten je usnadněn vyšší afinitou AvBD k dvojmocným kationt-vázajícím membránovým komponentám. Zásluhou toho dochází dle modelu Ganz (2003) znázorněného na následujícím obrázku (Obr. 14) k vytěsnění iontů Ca2+ a Mg2+, které jsou pro stabilitu membrány vysoce důležité (1). Během prostupu poměrně velkých molekul defensinů dochází ke značnému narušení membránové konstrukce (Hancock 1997; Hancock a Chapple 1999). Následujícím krokem je seskupování defensinů do multimerních peptidových shluků, vedoucí ke vzniku stabilních či přechodných pórů (2), způsobujících ztrátu mnohých molekul včetně draslíku a následnou depolarizaci membrány (Lehrer a kol. 1989; Ganz 2003). Výsledkem je zastavení nejen aktivního membránového transportu, ale i rotace bakteriálních flagell, které vede k hladovění, ztrátě motility a případné lýze bakterie (Lehrer a kol. 1989). Defensiny navíc v nitru buňky mohou interferovat s DNA a RNA a skrze vazbu na tyto molekuly tak ovlivnit 33
syntézu proteinů (Lehrer a kol. 1989; Tang a kol. 1999). Pokud jsou navíc defensiny přítomny ve velkém množství, je tak pravděpodobné, že působí stejným mechanismem jako detergenty, jejichž účinnost se projeví disrupcí membrány (4) (Ganz 2003).
Obr. 14.: Hypotetický model mechanismu působení β-defensinů (převzato z Ganz 2003).
4.3. Toll – like receptory V rámci receptorů nespecifické imunity (PRR), nacházející se především na povrchu fagocytů, mají mimořádnou důležitost tzv. Toll-like receptory (TLRs) (Hořejší a Bartůňková 2009). Jejich schopností je rozpoznávat celou řadu chemických struktur, jež jsou součástí povrchu patogenů (PAMPs). Takovými strukturami jsou například lipopolysacharidy, lipoproteiny, prokaryotické a virové nukleové kyseliny a mnoho dalších. TLR tak představují jednu z prvních obranných linií organismu vedoucích k zneškodnění přítomného patogenu. Toho je dosaženo skrze složitou signální kaskádu, jež je aktivována po navázání patogenu na TLRs a jejímž výsledkem je aktivace jaderného faktoru kappa B (NFκB), skrze kterou dochází k syntéze chemokinů a mnoha dalších významných molekul (Cook a kol. 2004). U ptáků, konkrétně u kuřat, nacházíme geny 10 typů TLRs (Temperley a kol. 2008): · TLR2 (TLR2A, TLR2B), TLR3, TLR4, TLR5 a TLR7, jež jsou homologem savčích TLRs. · TLR21, který nacházíme také u ryb a obojživelníků. · TLR1 (TLR1LA, TLR1LB) a TLR15 - s největší pravděpodobností charakteristické pouze pro skupinu ptáků.
34
5. Humorální složka nespecifické imunity 5.1. Komplementový systém Komplementový systém, který je hlavní obrannou složkou nespecifické humorální imunity obratlovců, představuje 25 - 30 sérových a membránových proteinů, kooperujících jak mezi sebou, tak i s dalšími imunitními mechanismy (Hořejší a Bartůňková 2009). Tyto proteiny jsou produkovány zejména jaterními buňkami neboli hepatocyty. V menší míře se na jejich produkci podílejí také makrofágy (Carroll 2004) či některé koagulační faktory (Amara a kol. 2008). Hlavní složku komplementu představuje 9 sérových proteinů, označovaných jako C1 - C9 (Toman a kol. 2009). Tyto proteiny se v séru a tělních tekutinách vyskytují v neaktivní formě. K jejich aktivaci dochází skrze reakci na různé podněty vedoucí k tvorbě fragmentů, pomocí nichž rozvíjejí proteiny své chemotaktické a opsonizační vlastnosti, jejichž výsledkem je indukce mediátorů zánětu a usnadnění procesu fagocytózy. K eliminaci antigenu je však nejúčinnější tvorba membranolytického komplexu, tzv. MAC (membrane attack complex), který skrze perforaci membrány vede k jeho okamžitému usmrcení. Některé složky komplementu jsou však významné i při dějích jako je například regulace transportu antigenu do sleziny a uzlin či indukce zánětlivé reakce a mnoho dalších procesů uvedených na následujícím obrázku (Obr. 15) (Carroll 2004; Hořejší a Bartůňková 2009).
Obr. 15: Biologická aktivita komplementu (upraveno dle Toman a kol. 2009).
35
Ústřední složkou, skrze kterou je aktivován celý komplementový systém, je protein C3, jehož fragment C3b se kovalentně navazuje na mikrobiální povrch a zahajuje tak kaskádový sled aktivace dalších složek komplementu (Hořejší a Bartůňková 2009). V případě kuřat detekujeme složku C3 nejen v séru, ale i ve vaječném žloutku (Recheis a kol. 2005). Na rozdíl od člověka ho navíc můžeme detekovat ve třech molekulárních formách (Laursen a Koch 1989; Mavroidis a kol. 1995). Pro aktivaci C3 byly postupně popsány tři cesty aktivace komplementu – klasická, alternativní a lektinová (Obr. 16). Podnětem aktivace je v případě klasické cesty komplex antigen-protilátka, v případě cesty lektinové a alternativní pouze mikrobiální povrch. Poměrně nedávno však bylo zjištěno, že schopnost aktivace komplementu nehledě na jednotlivé cesty mají také různé serinové proteázy koagulačního systému (Amara a kol. 2008). Příkladem je trombin schopný štěpit složku C3 a C5 (Huber-Lang a kol. 2006).
Obr. 16: Cesty aktivace komplementu (upraveno dle Davison a kol. 2008).
36
5.1.1. Alternativní cesta Počátkem alternativní cesty, jež je považována za evolučně nejstarší je neustále probíhající samovolné štěpení proteinu C3 na C3a a C3b (Hořejší a Bartůňková 2009; Zarkadis a kol. 2001). Tomuto procesu však předchází hydrolýza C3 na C3i (Day a Schultz 2011). Alternativní dráha tedy zahrnuje dvě fáze. První z nich je označována jakožto „tick over“ fáze (Day a Schultz 2011). Na rozdíl od fáze druhé není asociována s buněčným povrchem a probíhá tak v rámci extracelulárního prostředí. K její aktivaci dochází spontánní hydrolýzou proteinu C3 za vzniku částice C3i (Obr. 17). Jedná se o kontinuální proces zajištující stálou přítomnost, i když jen nízké hladiny, C3i, která se v přítomnosti hořčíku pojí s faktorem B za vzniku C3iB. Navázaný faktor B je následně štěpen faktorem D na fragmenty Ba a Bb. Faktor Bb přitom zůstává asociovaný s C3i a tvoří tzv. C3-konvertázu – enzym schopný štěpit C3 na C3a a C3b.
Obr. 17: Tick over fáze alternativní dráhy komplementu (upraveno dle Day a Schultz 2011). C3b v přítomnosti spouštěcího faktoru, který je umístěn na povrchu cizorodé částice, vstupuje do druhé fáze alternativní dráhy vedoucí k jejímu zneškodnění (Day a Schultz 2011). Mezi cizorodé částice spouštějící alternativní dráhu patří především bakterie (polysacharidy, lipopolysacharidy), kvasinky (zymosan), rostliny (inulin), houby, viry, abnormální buňky těla, agregáty imunoglobulinů a cizí tělesa (Day a Schultz 2011; Lachmann a Hughes-Jones 1984). V případě nepřítomnosti těchto spouštěcích faktorů dochází k hydrolýze C3b a její následné inaktivaci (Day a Schultz 2011). Pokud se C3b naváže na povrch nepoškozené buňky vlastního těla, dochází taktéž k inaktivaci, tentokrát kombinací složek MCP (membrane cofactor protein), DAF (decay-accelerating factor), CR1 (complement receptor 1) 37
a faktorem H a I. U kuřat byl přitom objeven protein vykazující podobnost s lidským MCP a DAF (Inoue a kol. 2001). Kromě toho byly identifikovány také předpokládané sekvence pro faktor H. Jak již bylo zmíněno, v případě přítomnosti spouštěcího faktoru dochází k aktivaci druhé fáze alternativní dráhy. Ta je započata kovalentní vazbou C3b na povrch cizorodé částice, která aktivuje kaskádu dalších reakcí tak, jak je uvedeno na následujícím obrázku (Obr. 18) (Day a Schultz 2011; Hořejší a Bartůňková 2009). Po navázání C3b dochází k vazbě faktoru B za vzniku C3bB, který je štěpen sérovou proteázou - faktorem D na fragmenty Ba a Bb. Vzniká tak komplex C3bBb, který je nejprve stabilizován faktorem P (properdin) a poté působí jako tzv. alternativní C3-konvertáza štěpící opět C3 na C3a a C3b. Zatímco fragmenty C3a opouštějí reakci a působí chemotakticky na fagocytující buňky, C3b v místě enzymově aktivního komplexu C3bBb opsonizují cizorodou částici. Kromě toho dávají C3b fragmenty vznik dalším molekulám C3-konvertáz, čímž zajišťují mnohonásobné zesílení původního podnětu. Některé z nich se však navazují k již existujícímu komplexu C3bBb a vytvářejí tak komplex C3bBbC3b, jehož proteolytická aktivita je značně odlišná - schopna štěpit protein C5. Vznikají tak fragmenty C5b a menší C5a. C3bBbC3b je tedy alternativní C5-konvertázou.
Obr. 18: Druhá fáze alternativní dráhy komplementu (upraveno dle Day a Schultz 2011). V případě ptáků je jediným doposud charakterizovaným proteinem alternativní dráhy faktor B (Davisson a kol. 2008). I navzdory tomu, mnohé výsledky tento způsob aktivace vykazují. Obecně je tedy u ptáků alternativní dráha uznávána a charakterizována jakožto dráha závislá na faktoru B. 38
Kuřecí faktor B je 95 kDa geneticky polymorfní glykoprotein se třemi různými fenotypy (Kjalke a kol. 1993; Koch 1986). Zda k jeho aktivaci dochází či ne, závisí na způsobu navázání k fragmentu C3b. Pokud se navazuje způsobem závislým na hořčíku – k aktivaci dochází, pokud se však navazuje způsobem závislým na vápníku – k aktivaci v tomto případě nedojde (Jensen a Koch 1991; Kjalke a kol. 1993). Stejně jako u savců bylo i u kuřat zjištěno, že po navázání faktoru B dochází k jeho rozštěpení a následnému vzniku 37 kDa fragmentu Ba a 60 kDa faktoru Bb, což jak víme, vede k tvorbě aktivní C3-konvertázy.
5.1.2. Klasická cesta Klasická cesta aktivace komplementu se zdá být naopak fylogeneticky nejmladší (Song a kol. 2000). Objevuje se až u živočichů vyvíjejících protilátky, které navázané na povrch cizorodé částice slouží k její aktivaci. Přesněji se jedná o protilátky typu IgM a IgG (IgY), které jsou schopny rozpoznat polysacharidové antigeny mikrobiálního či virového původu (Carroll 2004; Davison a kol. 2008). Vazbou protilátky na povrch tohoto typu se její molekulární konformace změní tak, že odhalí vazebné místo pro komplementární složku C1 tvořenou 3 podjednotkami - C1q, C1r a C1s. Složka C1, konkrétně její podjednotka C1q se navazuje pouze na Fc fragmenty protilátek, které jsou v komplexu s antigenem či v menší míře přímo na povrch patogenu (některé viry, gramnegativní bakterie) (Davison a kol. 2008). Následuje aktivace C1r aktivující C1s. Výsledkem je změna tvaru molekuly C1 a nabytí proteolytické aktivity, čímž dochází ke štěpení proteinů C4 a C2 tak, jak je patrné z následujícího obrázku (Obr. 19). Vzniklé fragmenty štěpení, konkrétně fragment C4b a C2b (někdy označovaný též jako C2a), se navazují na povrch napadeného mikroorganismu a vytvářejí tak klasickou C3-konvertázu (C4bC2b), která stejně jako konvertáza alternativní štěpí velké množství C3 na C3a a C3b, které působí tak, jak bylo popsáno výše. Jedna molekula C4bC2b je přitom schopna rozštěpit v průměru až 1000 molekul C3. Konečnou fází klasické cesty je vazba fragmentu C3b k C3-konvertáze vytvářející klasickou C5-konvertázu (C4bC3bC2b), enzym štěpící C5 na C5a a C5b.
39
Obr. 19: Klasická cesta aktivace komplementu (upraveno dle Day a Schultz 2011). Kromě prospěšné protiinfekční imunity se však účinnost komplementu může obrátit také proti vlastním buňkám organismu (Hořejší a Bartůňková 2009). Nezbytná je proto kontrola aktivace komplementové kaskády pomocí plazmatických a membránových inhibitorů. Klasická cesta je již od počátku regulována C1 inhibitorem blokujícím aktivaci C1. Následují DAF a C4 vážící protein, jež jsou zodpovědné za rozpad C3-konvertáz. Za štěpení fragmentu C3b pak zodpovídá faktor I ve spolupráci s membránovým protein MCP či komplementovým receptorem CR1. Lytickou fázi blokuje membránový protein zvaný protektin. Podjednotka C1q má navíc schopnost navazovat se na proteiny akutní fáze a C-reaktivní protein (Agrawal 2005). Ten se mimo jiné váže skrze modifikované lipidy o nízké hustotě na povrch některých bakterií a apoptických buněk. Nicméně, tento způsob aktivace, ačkoliv generuje C3 konvertázu, není schopen vytvářet efektivní konvertázu C5. Z toho důvodu nedochází k sestavení komplexu MAC. Hlavní rolí tedy v tomto případě není likvidace cizorodé částice, nýbrž opsonizace. V případě kuřat je velmi dobře prostudována molekula C1q, která má stejně jako její lidský protějšek charakter tzv. "kytice tulipánů" - struktury se šesti kulovitými podjednotkami (Davison a kol. 2008). Doposud však nebyla objevena žádná biochemická struktura podobná C2 či C4. V dřívějších studiích se předpokládalo, že roli C2 zastává kuřecí faktor B (Kjalke a kol. 1993). Nedávno však byly identifikovány předpokládané sekvence aminokyselin nejen pro C2, ale částečně také pro C4. Kromě toho byla jejich aktivita detekována v řadě studií (Wathen a kol. 1987). Předpokládá se tak, že ptáci rozvíjejí běžnou klasickou cestu aktivace komplementu. 40
5.1.3. Lektinová cesta Nedávno popsaná lektinová cesta aktivace komplementu je variantou cesty klasické, namísto protilátek je však iniciována sérovým lektinem MBL (mannose binding lectin) či tzv. ficoliny H a L (Fujita a kol. 2004). Tyto molekuly jsou funkčním i strukturním ekvivalentem složky C1q klasické dráhy aktivace. MBL stejně jako ficoliny rozpoznávají a následně se navazují na polysacharidy s vysokým podílem opakovaných manosových sekvencí či aminosacharidy se značným zastoupením N-acetylglukosaminu (Matsushita a Fujita 2001; Matsushita a Fujita 2002). Tyto složky jsou charakteristické nejen pro stěny bakterií, ale i plísní a kvasinek. Po vazbě na povrch cizorodé částice, tedy po aktivaci, které se účastní také serinové proteázy označované jako MASP 1 a MASP 2 (MBL-associated serine protease), dochází ke štěpení složek C4 a C2 a následnému vzniku klasické C3-konvertázy (Holmskov a kol. 2003; Lynch a kol. 2005). MASP 1 a 2 představují tentokrát ekvivalenty podjednotek C1r a C1s. Následující procesy jsou shodné s procesy probíhajícími u klasické cesty aktivace komplementu. Co se komponent lektinové dráhy ptáků týká, přítomen je u kuřat MBL asociovaný s MASP 2 (Lynch a kol. 2005). Přítomnost MASP 1 nebyla dosud prokázána. Navzdory tomu k aktivaci komplementu dochází. Lze tak usuzovat, že ptáci jsou stejně jako savci schopni plného rozvinutí lektinové dráhy. Pokud jde o ficoliny, byl u kuřat objeven jediný gen představující předchůdce genů kódujících lidský ficolin M a L.
5.1.4. Lytická fáze komplementu Vznikem C5b fragmentů činností klasických i alternativních C5-konvertáz počíná terminální (lytická) fáze komplementu (Hořejší a Bartůňková 2009). Fragmenty C5b na sebe váží složky C6, C7 a C8, které již nejsou štěpeny, ale pouze vystaveny konformačním změnám. Tento komplex se zanoří do povrchové membrány atakované buňky a posléze se k němu připojí, do kruhu uspořádaných, 13 – 18 molekul C9. Tímto způsobem vzniknou v membráně asi 10 nm široké póry (Obr. 20), skrze které dochází k úniku cytoplazmatických komponent, narušení osmotické rovnováhy a v konečném důsledku i lyzi buňky. Pro destrukci jaderných buněk musí být takovýchto pórů přibližně 10. U ptáků dosud neexistují žádné údaje o molekulární podstatě lytické fáze komplementu. Nicméně byly objeveny předpokládané aminokyselinové sekvence složek C5-C9, což naznačuje, že proces tvorby membranolytického komplexu je obdobný tomu, který známe u savců (Davisson a kol. 2008).
41
Obr. 20: Lytický pór (upraveno dle URL 8).
5.2. Lysozym Lysozym, jehož označení pochází z řeckého slova lysis tedy rozpuštění je důležitým antibakteriálním enzymem nacházejícím se u ptáků v cytoplazmatických granulech některých leukocytů, tělesných sekretech a ve velkém množství také ve vaječném bílku (Arnheim 1975). Mnohé druhy ptáků disponují dvěma variantami lysozymu lišícími se nejen ve své molekulové hmotnosti, ale také ve složení aminokyselin. Mechanismus účinku lysozymu je založen na jeho schopnosti rozkládat polysacharid murein (peptidoglykan), který je základní komponentou buněčné stěny bakterií (Arnheim 1975). Konkrétně dochází ke štěpení b-1,4-glykosidické vazby, která spojuje zbytky n-acetylglukósaminu a kyseliny n-acetylmuramové. Inhibiční aktivita lysozymu je namířena především proti grampozitivním bakteriím, které na rozdíl od bakterií gramnegativních postrádají vnější fosfolipidovou membránu, která se nachází nad jejich buněčnou stěnou a tvoří tak ochranou bariéru.
42
6. Imunita a reprodukce Ačkoliv by se dalo očekávat, že imunita reprodukčního traktu je kapitolou velmi dobře prostudovanou, ne vždy tomu tak opravdu je. Imunitní reakce reprodukčního traktu, jakožto i lymfoidní tkáně s ní asociované, jsou prostudované pouze stroze (Davisson a kol. 2008). Paradoxně se tak s největší pravděpodobností jedná o jednu z nejméně prozkoumaných oblastí ptačí imunologie. Reprodukční orgány ptáků jsou častým cílem mnoha různých patogenů. Důležitost imunity reprodukčního traktu je tak nejen v souvislosti s konzumací vajec více než zřejmá. Pravděpodobně nás nepřekvapí, že pozornost studií je věnována převážně infekci bakterií Salmonella enterica sérotyp Enteritidis, která skrze vertikální přenos, ke kterému dochází ve vejcovodu i vaječníku, vede k infekci konzumních vajec a následnému ohrožení lidského zdraví (Davisson a kol. 2008; De Buck a kol. 2004; Keller a kol. 1995). Ze zřejmých důvodů je tak převážná část studií věnována reprodukční imunitě samic. Schopnost infikovat vyvíjející se vajíčko buď přímo či skrze infekci samičího reprodukčního traktu mají také spermie. V rámci imunologie samčího reprodukčního traktu je tak pozornost zaměřena především na ně.
6.1. Stavba reprodukčního traktu Reprodukční trakt samic, který ačkoliv se zakládá bilaterálně, dosahuje u většiny ptáků funkční zralosti pouze na levé straně (Červený 2000). Pravá strana tak zůstává zakrnělá. Pozice vaječníku je v úrovni kaudální třetiny levé plíce a kraniálního oddílu levé ledviny. Co se struktury týká, zralý vaječník má hroznovitý tvar, jenž je tvořený nestejně velkými šedými a většími žlutě zabarvenými vaječníkovými folikuly, které označujeme jako tzv. žloutkové koule. Ty po ovulaci vstupují do vejcovodu, který propojuje vaječník s kloakou a u dospělých slepic dosahuje délky 60 – 80 cm. Během průchodu žloutkové koule vejcovodem dochází k tvorbě bílku a vaječné skořápky. První částí vejcovodu je trychtýřovitá struktura označovaná jako infundibulum (Obr. 21), zde také dochází k oplození vajíčka (5 - 10 min po ovulaci) a tvorbě první vrstvy bílku (Červený 2000). Následující, nejdelší část označujeme jako magnum, které se na vzniku bílku podílí hlavní měrou. Na něj navazuje tzv. isthmus zodpovědný za vznik vnitřní bílkovinné a vnější podskořápkové vaječné blány. Vajíčko poté prochází do dělohy, místa, které dává vzniknout vaječné skořápce. Zde setrvává přibližně 20 hodin. Následuje pochva a nakonec kloaka, skrze níž je vajíčko kladeno. Pochva mimo jiné slouží jako úložiště 43
spermií, které zde přežívají až několik týdnů (1 - 3 týdny u kura, 3 - 7 týdnů u krůt). Celková doba nezbytná pro průchod vajíčka vejcovodem představuje přibližně 24 - 25 hodin.
Obr. 21: Anatomie reprodukčního traktu slepice (upraveno dle URL 9). Samčí pohlavní orgány zahrnují nejen párová varlata a vývodné pohlavní cesty, ale i specificky formovaný kopulační orgán – tzv. phalus a s ním asociované pomocné orgány, uložené v konečné části kloaky (Červeny 2000). Varlata se nacházejí v blízkosti ledvin a jejich velikost závisí nejen na druhové příslušnosti, plemeni a stáří, ale také na sezónní pohlavní aktivitě jedince. Přídatné pohlavní žlázy, jako známe u savců, v případě ptáků vyvinuty nejsou. Phalus ptáků je zevně patrný pouze u řádu vrubozobých (Anseriformes) či podtřídy běžců (Paleognathae), a to pouze ve stádiu erekce. U ostatních ptáků jako jsou hrabaví (Galliformes) či pěvci (Passeriformes) zevně patrný není. Ejakulát obsahuje spermie a semennou plazmu, která je tvořena epitelovou výstelkou vývodů nadvarlat, která jsou s phalem propojena skrze chámovody. Kolísající je u ptáků nejen množství ejakulátu (u kohouta 0,2 – 1,5 ml), ale i počty spermií v něm obsažených (1 – 2 x 109 ).
6.2. Imunita reprodukčního traktu samic V rámci buněk nespecifické imunity byla zjištěna přítomnost makrofágů či buněk makrofágům podobných v ovariálních folikulech kuřete (Barua a kol. 1998a), stejně jako po celé délce vejcovodu s nejvyšší koncentrací v infundibulu a pochvě (Withanage a kol. 1998). Co se týká granulocytů, situace je zde především v případě heterofilů ne zcela jasná, přítomnost eozinofilů však ve dřeni vaječníku zaznamenat lze (Hodges 1974 v Davisson a kol. 2008).
44
Daleko více je prostudována přítomnost lymfocytů. Ty se po celé délce vejcovodu nacházejí jak ve formě agregátů, tak volně rozptýlené (Biswal 1954). Co se B-lymfocytů týká, zastoupeny jsou zde buňky produkující IgA, IgM i IgY (Kimijima a kol. 1990). Jejich přítomnost je zde záležitostí více než nezbytnou. Důvodem je skutečnost, že vejcovod je hlavním místem přenosu mateřských protilátek (Zheng a kol. 2000). Jejich rozložení ve vajíčku je následující: IgA a IgM nacházím v bílku, IgY naopak v žloutku. Vzácně je výskyt B-lymfocytů zaznamenán také ve vaječníku. T-lymfocyty naopak zcela běžně nacházíme jak ve vaječníku, tak ve vejcovodu (Withanage a kol. 1997). Jejich poměrné zastoupení je přitom nejvyšší v oblasti pochvy. Na složení buněčných populací reprodukčního traktu má výrazný vliv věk a s ním spojené výkyvy hladiny steroidních hormonů související především s nástupem pohlavní zralosti (Davisson a kol. 2008). Pro zjištění více informací byly provedeny pokusy spojené s podáváním syntetického estrogenu (diaylstilboestrolu - DES). Výsledky těchto studií uvádějí, že zvyšující se hladina estrogenu vede ke zvýšení početnosti populace vaječníkových makrofágů a T a B-lymfocytů (Barua a kol. 1998a,b; Barua a Yoshimura 1999). Progesteron naopak tento vliv nevykazuje. Zvýšenou hladinu makrofágů v celém reprodukčním traktu lze pozorovat u mladých nosnic i v přirozených podmínkách, tedy bez podávání DES (Zheng a Yoshimura 1999). Estrogen se tak dle všech výsledků zdá být významným faktorem ovlivňujícím početnost populace imunitních buněk reprodukčního traktu samic. Dosud však není známa žádná funkční změna, která by byla v přímé souvislosti s navýšením buněčných populací (Davison a kol. 2008). V rámci hypotéz se dá domnívat, že tyto změny mají zabránit infekci či "vyčistit" vejcovod před samotným kladením vajec. Jedná se však o pouhé spekulace, nepodložené žádnou funkční studií
6.3. Ochrana spermií Jak již bylo řečeno více než na imunologii reprodukčního traktu samců je pozornost zaměřena na imunitu spermií. Ty nejsou k mikrobiální nákaze nikterak imunní a semeno tak může kolonizovat řada potencionálních patogenů (Poiani 2006; Westneat a Rambo 2000). Tomuto nebezpečí jsou spermie vystaveny nejen v přirozeném prostředí, ale také v reprodukčním traktu samice (White a kol. 2010). Pokud jsou spermie infikovány dochází ke zvýšení jejich úmrtnosti a následnému omezení fertility, či k možné nákaze oplozeného vajíčka (Moretti a kol. 2009). Spermie jsou proto chráněny antimikrobiálními látkami zahrnujícími lysozym a defensiny efektivní proti širokému spektru patogenů (Das a kol. 2011; Shimizu a kol. 2008). 45
Ze 14 doposud objevených AvBD jsou spermie schopny produkce 9 z nich (AvBD-1, -3, -5, -7, -8, -9, -10, -11, -12) (Das a kol. 2011). Po stimulaci spermií pomocí LPS přitom dochází k výraznému zvýšení hladiny AvBD-5, -9, -10 a -12. K rozpoznání patogenů využívají spermie taktéž již zmíněných Toll-like receptorů. Objevena přitom byla mRNA 5 typů ptačích TLRs, konkrétně TLR 2, 5, 7, 15 a 21. Jak již víme, reprodukční trakt samic zahrnuje buněčné populace imunitních buněk jako jsou makrofágy či B a T-lymfocyty. Spermie by tak především během svého uskladnění byly jasným terčem útoků vedoucích k jejich pravděpodobné likvidaci, v lepším případě poškození snižujícím úspěšnost oplození (Zheng a kol. 2001). Spermie tak musejí být nějakým způsobem chráněny. K tomu s největší pravděpodobností slouží transformující růstový faktor 3 (TGF3) (Das a kol. 2006) a β-defensin 126 (Yudin a kol. 2005), které chrání spermie před imunitním rozpoznáním a zabraňují tak rozvoji případné imunitní reakce.
6.4. Spermie a oxidační stres Dle nedávno navržené hypotézy je kvalita spermií výrazně ovlivněna tzv. oxidačním stresem (Blount a kol. 2001). Jako oxidační stres označujeme nerovnováhu mezi tvorbou oxidantů (ROS a RNS) a schopností organismu tyto oxidanty odbourávat (Sies 1991). Jak již víme z kapitoly pojednávající o fagocytóze, k tvorbě oxidantů dochází za účelem likvidace pohlceného patogenu během respiračního vzplanutí fagocytů. Oxidanty jsou však skrze mitochondriální dýchání tvořeny všemi typy buněk a své uplatnění tak nacházejí i v neimunitních procesech jako je například buněčná signalizace. Zvýšená oxidační zátěž je kromě aktivace imunity spojená také s intenzivním metabolizmem a růstem buněk. Oxidační stres, tedy nadměrná produkce oxidantů či absence antioxidantů, vede především k poškození buněčné membrány a DNA buněk, čímž je významně narušena jejich funkce (Hulbert a kol. 2007; Pamplona a kol. 2002). O míře poškození přitom rozhoduje stupeň nenasycenosti mastných kyselin, jež se významnou měrou podílejí na stavbě buněčné membrány. Spermie obratlovců jsou k oxidačnímu stresu značně citlivé (Tremellen 2008). Důvodem je nejen vysoký podíl nenasycených mastných kyselin, ale i hustě kondenzovaná DNA či snížená schopnost transkripce omezující její reparaci. Hlavním zdrojem volných radikálů jsou zde přitom mitochondrie (Surai a kol. 2002). Oxidační poškození spermií bylo pozorováno u několika druhů volně žijících ptáků (Helfenstein a kol. 2010). Kvalita spermií zde byla ovlivněna sníženou motilitou a rychlostí, což má jasný negativní dopad na úspěšnost daného jedince (Losdat a kol. 2011). Na významu tento problém nabývá především u druhů, u kterých samečci čelí tzv. konkurenci spermií. 46
K té dochází poté, co je samička oplodněna více jedinci. Rozhodující je zde tak nejen množství spermií (množství ejakulátu a procento pohyblivých spermií), ale také jejich kvalita, tedy rychlost a životnost (Pizzari a kol. 2008; Snook 2005).
6.5. Imunita a ornamentace V rámci reprodukce je často pozorovaným jevem upřednostňování samečků s více pestrými tóny barev či složitěji vyvinutými ornamenty. Za zbarvení ornamentů ptáků, které slouží nejen k zmiňované volbě partnera, ale i široké komunikaci, zodpovídají především karotenoidy – červené a žluté pigmenty přijímané spolu s rostlinnou potravou (Olson a Owens 1998). Karotenoidy však kromě role signalizační zastávají důležitou funkci antioxidantů, jež jsou v rámci imunitního systému organismu využity jakožto faktory odbourávající volné radikály (Krinsky 2001), či jako modulátory imunitní reakce (Chew a Park 2004). Jejich prospěšný vliv byl u ptáků potvrzen studiemi provedenými na zebřičkách (Taeniopygia guttata), kdy po podání karotenoidů došlo k pozitivnímu ovlivnění jak imunitní reakce, tak zbarvení daného jedince (Blount a kol. 2003, McGraw a Ardia 2003). Pro příděl karotenoidů mezi zmiňované dva kompartmenty byla navržena hypotéza předpokládající trade-off mezi karotenoidní signalizací a imunitním systémem (Lozano 1994). Tato hypotéza říká, že využití karotenoidů upřednostňovaným imunitním systémem snižuje jejich dostupnost pro funkci signalizační, což se projeví nižší intenzitou karotenoidních ornamentů. Následně provedené experimentální studie skutečně prokazují, že s aktivací imunitní reakce klesá intenzita ornamentů daných jedinců (Alonso-Alvarez a kol. 2004; Faivre a kol. 2003) (Obr. 22). Snížení imunitní zátěže se naopak projeví intenzivnější barvou signálu (Martinez-Padilla a kol. 2007).
Obr. 22: Barva zobáku kosa černého před (vlevo) a po (vpravo) aktivaci imunitního systému (Faivre a kol. 2003). Je tak zřejmé, že pouze samečci ve vynikajícím zdravotním stavu si mohou dovolit investice karotenoidů zvyšující kvalitu jejich ornamentů. Samičce tak podávají vizuální zprávu nejen o schopni obstarat si potravu bohatou na karotenoidy, ale i o svém zdravotním stavu a s tím spojené pravděpodobnosti přenosu kvalitních genů (Hamilton a Zuk 1982). 47
V souvislosti s touto skutečností byly v rámci ekoimunologie navrženy hypotézy, předpokládající navíc pozitivní korelaci mezi barevností ornamentů a kvalitou spermií jejich nositelů. Konkrétně se jedná o následující parametry kvality spermií: a) Antimikrobiální aktivita spermií -
potvrzeno studií Rowe a kol. (2011) zaměřenou na antibakteriální aktivitu spermií kachen divokých (Anas platyhynchos).
b) Schopnost odolávat poškození volnými radikály -
potvrzeno studií Helfenstein a kol. (2010) v rámci které docházelo ke zvyšování fyzické zátěže samečka sýkory koňadry (Parus major) a tedy ke stresu vedoucímu k produkci volných radikálů. Po pěti dnech bylo zjištěno, že u samců s vybledlejší barvou opeření klesla pohyblivost spermií daleko více než u jedinců s výraznějšími odstíny barev.
c) Přítomností nepigmentových antioxidantů -
potvrzeno studií Bertrand a kol. (2006). Nepigmentové antioxidanty chrání karotenoidy před útokem volných radikálů. Čím vyšší je tak jejich přítomnost, tím barevnější daný jedinec je. Tyto výsledky tak navíc naznačují, že samice využívají fenotypové vlastnosti samečků
k rozpoznání kvality jejich spermií. Na základě toho jsou schopni vyhnout se kopulaci s pravděpodobnými nositeli patogenů, což by pro ně generovalo značné náklady (Rowe a kol. 2011). Jak ukazuje následující obrázek (Obr. 23), na zbarvení ornamentů má kromě již zmíněných faktorů vliv také věk, hladina hormonů a samozřejmě genetická výbava daného jedince. Pouze imunitní systém je však s ornamenty ve vztahu, kdy se obě složky ovlivňují navzájem.
Obr. 23: Faktory ovlivňující kvalitu ornamentů. 48
7. Cíl práce Cílem této diplomové práce bylo:
Ø Na základě literárních zdrojů zpracovat problematiku vrozené imunity ptáků a roli imunity v rámci reprodukce. Ø Zavést metodiku stanovení respiračního vzplanutí za použití luminoforu Pholasinu a provést některé optimalizace. Ø Vyhodnotit variabilitu respiračního vzplanutí v reakci na bakteriální lipopolysacharid u mláďat sýkory koňadry v rámci hnízda. Ø Vyhodnotit variabilitu respiračního vzplanutí v reakci na bakteriální lipopolysacharid u mláďat sýkory koňadry v rámci všech hnízd navzájem. Ø Stanovit koncentraci lysozymu ve spermatu vlaštovek obecných. Ø Vyzkoušet metody používané laboratoří k běžnému stanovení imunitních parametrů u ryb a hmyzu také na vzorcích ptačí krve/plazmy. Ø Získanými výsledky přispět k celkovému poznání imunologie ptáků a poskytnout data pro spolupracující Ústav Biologie obratlovců AV ČR, v.v.i., Studenec (projekt GAČR P506/12/2472)
a Karlovu
univerzitu,
a P505/10/1871).
49
Praha
(projekt
GAČR P506/12/2472
8. Biologický materiál Biologický materiál (krev/plazma/sperma) použitý v rámci této diplomové práce byl odebírán ze čtyř následujících druhů ptáků: kura domácího (Gallus gallus f. domestica, obr. 24a), sýkory koňadry (Parus major, obr. 24b), křepelky japonské (Coturnix japonica, obr. 24c) a vlaštovky obecné (Hirundo rustica, obr. 24d).
Obr. 24a: Kur domácí (Gallus gallus f. domestica)
Obr. 24b: Sýkora koňadra (Parus major)
Třída: Ptáci (Aves) Podtřída: Letci (Neognathae) Řád: Hrabaví (Galliformes) Čeleď: Bažantovití (Phasianidae) Rod: Kur (Gallus) (URL 10)
Třída: Ptáci (Aves) Podtřída: Letci (Neognathae) Řád: Pěvci (Passeriformes) Čeleď: Sýkorovití (Paridae) Rod: Sýkora (Parus) (URL 11)
Obr. 24c: Křepelka japonská (Coturnix japonica)
Obr. 24d: Vlaštovka obecná (Hirundo rustica)
Třída: Ptáci (Aves) Podtřída: Letci (Neognathae) Řád: Hrabaví (Galliformes) Čeleď: Bažantovití (Phasianidae) Rod: Křepelka (Coturnix) (URL 12)
Třída: Ptáci (Aves) Podtřída: Letci (Neognathae) Řád: Pěvci (Passeriformes) Čeleď: Vlaštovkovití (Hirundinidae) Rod: Vlaštovka (Hirundo) (URL 13)
50
Odběr vzorků krve probíhal u: ·
kura domácího - jedinci pocházející z domácího chovu.
·
sýkory koňadry - mláďata (stáří 2 - 3 týdny) volně žijící populace Čimického a Ďáblického háje (Praha).
·
křepelky japonské - jedinci pocházející z chovu Ústavu biologie obratlovců ve Studenci.
Krev zmíněných ptáků byla odebírána buď z křídelní (vena cutanea ulnaris) či krční cévy (vena jugularis) (Obr. 25) do heparizovaných kapilár či mikrozkumavek typu Eppendorf s předem připraveným heparinem (50 U/ml krve).
Obr. 25: Odběr z vena jugularis mláděte sýkory koňadry (foto Pavel Hyršl). Krev byla během několika hodin po odběru využita pro okamžité měření či zpracována na plazmu a zamražena při -20 °C. Zpracování vzorků na plazmu probíhalo centrifugací při 2500 x g po dobu 10 minut.
Odběr vzorků sperma probíhal u: ·
samců vlaštovky obecné volně žijící populace
Vzorky sperma získané masírováním kloaky byly dodány Ústavem biologie obratlovců ve Studenci. Jejich skladování probíhalo při teplotě -80 °C.
51
9. Metody a materiál
9.1. Stanovení aktivity respiračního vzplanutí chemiluminiscenčně Princip této chemiluminiscenční metody je založen na schopnosti fagocytů uvolňovat reaktivní formy kyslíku (ROS), jejichž produkce je skrze luminofor převedena do formy světelných kvant (chemiluminiscence). V laboratorních podmínkách je chemiluminiscence fagocytů vyvolána přidáním aktivátoru fagocytózy, který napodobuje stav, ke kterému v organismu dochází po vniknutí cizorodé částice. Jako aktivátory jsou běžně využívány následující druhy stimulů: -
bakteriální suspenze
-
zymosan (složka buněčných stěn kvasinek)
-
škrobové částice
-
forbol-12-myristát-13-acetát (PMA)
-
(aktivuje přímo proteinkinázu C, následně pak NADPH oxidázu) N-formyl-methionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP) (bakteriální peptid)
Mezi nejčastěji používané luminofory patří luminol, jehož reakce s ROS vede k produkci aminoftalátového aniontu, který při přechodu do základního stavu emituje detekovatelné světlo (Freitas a kol. 2009). Druhým, nově objeveným typem luminoforu, je Pholasin. Ten je v porovnání s luminolem několikanásobně citlivější a obdržený signál je tak 50 - 100 násobně vyšší (Sild a Hõrak 2010). Jak již bylo zmíněno hladina ROS je u ptáků především díky absenci myeloperoxidázy v porovnání se savci znatelně nižší, použití Pholasinu je tak v této oblasti imunologie nezbytnou záležitostí. Pholasin je 34 kD fotoprotein extrahovaný z mořských bioluminiscenčních měkkýšů rodu Pholas dactylus. K emisi záření zprostředkované Pholasinem dochází v přítomnosti následujících reaktivních forem kyslíku: - volné radikály: superoxidový aniont, singletový kyslík, hydroxylový radikál a/nebo železitý radikál - Oxidanty: kyselina chlorná, kyselina bromná, chloraminy, bromaminy a peroxynitrity - Enzymy: peroxidáza a některé oxidázy
52
K měření signálu chemiluminiscence, přesněji řečeno k měření intenzity reakce v čase (kinetika), se používají citlivé přístroje označované jako luminometry. Výsledkem měření je CL křivka, jejíž tvar je charakteristický jak pro použitý vzorek (plná krev, izolované fagocyty), tak pro příslušný typ aktivátoru. Chemiluminiscence je přitom vyjádřena v jednotkách RLU (relative luminiscence units). Při hodnocení aktivity fagocytů jsou vyhodnocovány následující parametry křivky: - integrál - hodnota píku Vyhodnocování se uvádí dvěma způsoby – grafické znázornění intenzity CL v závislosti na čase, či tabulkové porovnávání výše zmíněných parametrů.
9.1.1. Použitý materiál a přístroje Ø Zkoumaný vzorek plné krve, plazma pro blank Ø Aktivátory fagocytózy: - Bakteriální suspenze: -
LPS Escherichia coli 055:B5 (1:1 s DPBS) (Sigma-Aldrich, Praha)
-
LPS Salmonella enterica sérotyp Enteritidis (1:1 s DPBS) (Sigma-Aldrich, Praha)
- PMA, fMLP (Knight Scientific Ltd), ZP Ø Pholasin kit ABEL® Cell Activation Test Kit for Whole Blood or Isolated Cells with Pholasin and Adjuvant-KTM firmy KSL (Knight Scientific Ltd) Ø Fosfátový pufr typu DPBS (Dulbecco phosphate buffered saline), pH = 7,4 -
0,2 g KCl (Lachema, Brno)
-
8,0 g NaCl (Penta, Chrudim)
-
0,2 g KH2PO4 (Lachema, Brno)
-
1,15 g Na2HPO4 (Penta, Chrudim)
-
1000 ml destilované vody
-
pH upraveno pomocí koncentrované HCl (Merci, Brno)
Ø Mikrotitrační destičky, automatické pipety a další standardní laboratorní vybavení Ø Luminometr (Immunotech LM – 01T; Hidex Chameleon V.) Použitý kit firmy KSL je vyvinut pro stanovení respiračního vzplanutí vzorků lidské krve. Na vzorcích jiného živočišného taxonu byl použit pouze ve čtyřech nám známých 53
studiích, přičemž jedna se týkala rybích leukocytů (Rider a kol. 2009), zbylé tři leukocytů ptáků (Slid a Hõrak 2010; Slid a kol. 2011a,b).
9.1.2. Postup Jednoduchý postup metody, který je založen na postupném přidávání jednotlivých reagencií kitu, byl z výše uvedeného důvodu nepatrně pozměněn (Obr. 26). Konkrétně se jednalo o pozměnění objemů reagencií při zachování vzájemných poměrů. Částečně se přitom vycházelo ze studie Slid a Hõrak (2010), ve které k podobné změně taktéž došlo. Postup metody je vyobrazen na následujícím diagramu. K měření blanku byla použita plazma jedinců, ke které byly následně přidány stejné reagencie, jako v případě plné krve.
Obr. 26: Postup stanovení fagocytární aktivity leukocytů za použití Pholasin kitu (upraveno dle příbalové informace kitu). Po přidání aktivátoru, který musí být vždy poslední reagencií kitu dochází k aktivaci respiračního vzplanutí fagocytů, která je v případě námi preferovaného aktivátoru (LPS) takřka okamžitá, probíhající během 2 – 5 vteřin. Čas následného měření odpovídal v případě klíčové studie této diplomové práce, tedy stanovení respiračního vzplanutí mláďat sýkory koňadry, délce tří minut. Během optimalizací byla doba stanovení proměnlivá, stejně tak jako reakce s různými typy aktivátorů.
9.1.3. Problematika měření Z výše uvedených důvodů je nezbytné, aby prostoj mezi dávkováním aktivátoru a počátkem měření byl co možná nejkratší. To v našem případě znamenalo značný problém, 54
jehož důvodem byl luminometr bez injektoru. Aktivátor byl tak dávkován ručně, což v mnoha případech zapříčinilo opoždění měření a s tím spojené zachycení pouze druhé poloviny píku reakce.
9.2. Stanovení koncentrace lysozymu metodou ELISA ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) známá také jako EIA (Enzyme ImmunoAssay) je jednou z nejcitlivějších a bezesporu nejpoužívanějších metod aplikovaných při kvantitativní či kvalitativní analýze antigenů/protilátek ve vyšetřovaném vzorku. Ten je v našem případě zastoupen spermatem vlaštovky obecné. Princip metody, která je různými způsoby modifikována, je založen na vysoce specifické interakci antigen-protilátka. Jeden z těchto vazebných partnerů je přitom značen enzymem katalyzujícím chemickou přeměnu substrátu, jejímž výsledkem je barevný produkt s pozměněnou absorbancí měřitelnou pomocí spektrofotometru. Hodnota absorbance je přitom přímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu či protilátky. Z několika možných modifikací této metody byla použita tzv. sendvičová ELISA pro antigeny, kterým se v rámci EIA stává námi stanovovaný lysozym. Tento typ metody využívá, podobně jako mnohé další modifikace, schopnosti protilátek vázat se k pevným nosičům, které v tomto případě představují dna jamek mikrotitrační destičky. K námi požadovanému stanovení byl použit komerčně dodávaný kit určený speciálně pro kvantifikaci ptačího lysozymu.
9.2.1. Použitý materiál a přístroje Ø Zkoumaný vzorek Ø ELISA kit for Lysozyme od firmy USCNK Life Science Inc. Ø PBS, pH=7,4 Ø PBS (fosfátový pufr), pH = 7,3: -
0,876 g NaH2PO4 . 2H2O (Lachema, Brno)
-
2,56 g Na2HPO4 . 12H2O (Lachema, Brno)
-
8,77 g NaCl
-
1000 ml destilované H2O
-
pH upraveno pomocí koncentrované HCl
Ø Automatické pipety a další standardní laboratorní vybavení Ø Elisa microplate reader (Tecan Sunrise) 55
9.2.2. Postup 1. K výrobcem navázané protilátce přidáme do jedné jamky blank, do dalších sedmi standard v různých koncentracích (40 ng/ml; 13,33 ng/ml; 4,44 ng/ml; 1,48 ng/ml; 0,49 ng/ml; 0,16 ng/ml; 0,05 ng/ml) a nakonec ředěný vzorek spermatu či plazmy. 1. Po dvouhodinové inkubaci při 37 °C odstraníme obsah jamek a přidáváme první z reagencií – detekční protilátku. 2. Po další hodině inkubace a důsledném promytí jamek přidáváme avidin asociovaný s křenovou peroxidázou (HRP). 3. Po půlhodinové inkubaci a několikrát opakovaném promytí přidáváme poslední z reagencií - TMB substrát (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin) a 15 - 25 minut inkubujeme. 4. Posledním krokem je přidání 1 mol/l H2SO4, označované jako „stop solution“, která ukončí probíhající reakci, což se projeví změnou barvy z modré na žlutou. 5. Následuje spektrofotometrické stanovení při 450 nm.
Obr. 27: Sendvičová ELISA a její průběh (URL 14).
9.3. Metodika vedlejších pokusů V rámci vedlejších metod, jejichž úkolem nebylo získat statisticky či datově výpovědné hodnoty, nýbrž pouze vyzkoušet, zda daná metoda funguje s ptačími vzorky či ne, byly zahrnuty následující metody:
56
9.3.1. Stanovení komplementové aktivity pomocí bioluminiscenčních bakterií E. coli ·
Princip
metody:
měření
kinetiky
úbytku
luminiscence
v závislosti
na
baktericidních účincích komplementového systému, přičemž míra luminiscence je úměrná viabilitě bakterií. ·
Vyhodnocení: z kinety reakce odečítáme čas potřebný pro usmrcení 50% bakterií
·
Postup metody dle Buchtíková a kol. (2011)
9.3.2. Stanovení koncentrace lysozymu metodou radiální difúze v agaróze ·
Princip metody: interakce v gelu obsažené, k lysozymu vysoce citlivé bakterie (Micrococcus luteus) se stanovovaným lysozymem difundujícím z jamek, do kterých se vyšetřovaný vzorek nanáší.
·
Vyhodnocení: odečet průměrů difúzních zón
·
Postup metody dle Lie (1986), modifikovaná dle Sotirov a kol. (2000)
9.3.3. Metody stanovující aktivitu antioxidačních enzymů Principem metod je reakce, která skrze aktivitu enzymů vede k tvorbě barevného komplexu a vizuální změně absorbance měřitelné pomocí spektrofotometru. Získaná hodnota přepočtena dle příslušného vzorce vyjadřuje aktivitu enzymu.
9.3.3.1. Stanovení GST ·
GST (Glutation S-transferáza) slouží k detoxikaci xenobiotik a ochraně buňky před účinkem ROS.
·
Komponenta klíčové reakce s GST: GSH (γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-glycin) a CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzen)
·
Stanovení: spektrofotometricky
·
Absorbance měřena při: 340 nm
·
Postup metody dle Habig a kol. (1974) a Ahmad a Pardini (1990)
9.3.3.2. Stanovení SOD ·
SOD (superoxid dismutáza) je přirozený antioxidant, který účinně zháší superoxidový radikál a přeměňuje ho na méně toxický peroxid vodíku. 57
·
Komponenta klíčové reakce se SOD: Pyrogallol
·
Stanovení: spektrofotometricky
·
Absorbance měřena při: 440 nm
·
Postup metody dle Marklund a Marklund (1974)
9.3.4. Stanovení celkové antioxidační kapacity – TRAP ·
Metoda je založena na vychytávání peroxylových radikálů, jež jsou produkovány látkou ABAP [2,2-azobis(2-aminopropan hydrochlorid)]
·
Jako standard je používán tzv. Trolox, který peroxylové radikály vychytává
·
Stanovení: přepočet dle luminiscenční reakce peroxylových radikálů s luminolem
·
Postup metody dle Slavíková a kol. (1998)
9.3.5. Stanovení míry oxidačního stresu na základě přítomnosti MDA ·
MDA (malondyaldehyd) představuje reaktivní ukazatel oxidačního stresu
·
Metoda založena na stejném principu jako metodika stanovující aktivitu enzymů
·
Komponenta klíčové reakce s MDA: Thiobarbitulová kyselina
·
Stanovení: spektrofotometricky
·
Absorbance měřena při: 532 nm
·
Postup metody dle Jain a Levine (1995)
58
10. Výsledky 10.1. Vyhodnocení aktivity respiračního vzplanutí 10.1.1. Porovnání intenzity respiračního vzplanutí po aktivaci různými typy stimulantů za použití luminoforů luminolu a Pholasinu Pro porovnání intenzity respiračního vzplanutí s použitím dvou typů luminoforů luminol a Pholasin jsme použili následující typy aktivátorů: PMA (0,5µg/ml), fMLP (1μmol/l), LPS (1mg/ml) a ZP. Jako vzorek jsme zvolili plnou krev křepelky japonské. Měření probíhalo při následujících podmínkách: - stáří krve: 40 hodin - ředění krve: 50x pro měření s luminolem, 1000x pro měření s Pholasinem - délka měření: 45 minut
Luminiscence (RLU)
Respirační vzplanutí při použití luminolu 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Blank ZP PMA fMLP LPS
0
4
7
11
14
17 21 24 Čas (min)
28
31
35
38
Graf 1: Stanovení respiračního vzplanutí fagocytů křepelky japonské v přítomnosti luminolu.
Z grafu je patrné, že použití luminolu je v případě krve ptáků zcela nevhodné. Všechny hodnoty jsou nejen velmi nízké, ale také na stejné úrovni jako blank. Data tak nemají žádnou výpovědní hodnotu. Kromě toho nepozorujeme rozdíly mezi jednotlivými typy aktivátorů.
59
Respirační vzplanutí při použití Pholasinu 180
Luminiscence (RLU)
160 140
Blank
120
ZP
100
PMA
80
fLMP
60
LPS
40 20 0 0
3
6
9
12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 Čas (min)
Graf 2: Stanovení respiračního vzplanutí fagocytů křepelky japonské v přítomnosti Pholasinu Z výše uvedeného grafu vyplývá, že reakce v přítomnosti Pholasinu je i přes několikanásobně vyšší ředění krve znatelně výraznější než v přítomnosti luminolu. Co se aktivátorů týká, mezi jednotlivými typy pozorujeme více či méně patrné rozdíly. Nejintenzivnější reakce byla přitom zaznamenána v případě LPS a PMA, jejichž charakter křivky se však značně liší. Zatímco reakce s LPS dosahuje maxima během několika málo sekund, v případě PMA jde o několik desítek minut. Žádnou reakci naopak nepozorujeme v případě ZP a fMLP, jejichž hodnota nepřekročila úroveň blanku. Nejvhodnějším aktivátorem pro následující pokusy je tedy LPS. Reakce s ním nám umožňuje nejen rychlé měření, ale i obdržení dostatečně vysokého signálu.
10.1.2. Porovnání intenzity respiračního vzplanutí za různých podmínek (optimalizace Pholasinu) V rámci našich pokusů, především pak pro rozsáhlou studii na sýkorkách, bylo důležité ověřit faktory, které by snižováním či zvyšováním míry respiračního vzplanutí mohly negativně ovlivňovat výsledky a kterým je tak v průběhu pokusu nutno se vyhnout. Pro tato stanovení byla použita čerstvě odebraná krev kura domácího. Jako aktivátor byl použit LPS (S. enterica). Ověřovány byly následující faktory:
60
1) Vliv stáří krve skladované při 4 °C Ø Integral x105
Ø pík (RLU)
Ø po 3min (RLU)
2,5305 5,395 3,1205 2,836
8027 12735 6715 8371
801 2088 1225 1105
0 hodin 2 hodiny 4 hodiny 6 hodin
Tab. 3: Porovnání hodnot (integrál, pík, hodnota měření po 3 min) vykazujících míru respiračního vzplanutí u vzorků krve různého stáří.
Naměřené hodnoty ať už integrálu či luminiscence vykazují prvotní nárůst s maximem dosaženým přibližně po dvou hodinách. Následuje pokles (s výjimkou píku při 6 hodinách), který odpovídá trendu, čím starší krev, tím nižší aktivita respiračního vzplanutí. Pro obdržení průkazných hodnot by tak k měření mělo docházet během prvních dvou hodin po odběru. 2) Vliv délky preinkubace krve v pufru pro její ředění (BDB – blood dilution buffer)
0 min 5 min 10 min
Ø Integral x105 1,895375 2,7782 4,6165
Ø pík (RLU) 4272,25 6971,5 10227,5
Ø po 3min (RLU) 735,5 1131 1878
Tab. 4: Porovnání hodnot (integrál, pík, hodnota měření po 3 min) vykazujících míru respiračního vzplanutí u vzorků krve s různou dobou preinkubace v BDB.
Z dvakrát opakovaného měření je patrné, že preinkubace krve v BDB značně ovlivňuje hodnotu výsledků tím, že ji zvyšuje. Je proto nezbytné, aby k přidání dalších reagencií kitu a následnému měření došlo co možná nejdříve po smíchání vzorku krve s BDB.
10.1.3. Variabilita v imunitní odpovědi na LPS u sýkory koňadry Také v rámci této rozsáhlá studie, během níž se pracovalo se vzorky 170 mláďat pocházejících celkem ze 41 hnízd byl jako aktivátor fagocytózy zvolen LPS dvou typů: LPS pocházející z buněčné stěny gramnegativní bakterie Salmonella enterica a Escherichia coli. Následující vyhodnocení nejprve porovnává variabilitu v imunitní odpovědi mezi jedinci v rámci hnízda a poté se ze statistického hlediska zabývá porovnáním mezi jednotlivými hnízdy navzájem. Tato studie probíhala ve spolupráci s Karlovou univerzitou, která na základě výsledků dále ověřuje, zda vnitrodruhová variabilita v imunitní odpovědi na LPS má vztah ke kondici 61
daného jedince. V rámci kondičních faktorů jsou přitom zohledňovány následující parametry: hmotnost, rychlost růstu, zbarvení a hematologie jedince. Prováděny jsou také genetické analýzy, které zároveň prověřují souvislost s variabilitou v TLR4, na který se LPS specificky váže.
10.1.3.1.
Porovnání variability v imunitní odpovědi na LPS mezi jedinci v rámci hnízda
V následujícím porovnání jsou získané hodnoty pro oba typy aktivátorů a pro každé hnízdo uvedeny vždy oběma způsoby vyhodnocení, tedy jako grafické znázornění CL v závislosti na čase, stejně jako tabulkové zpracování. V rámci tabulky je přitom ke každému jedinci (S 01 – S 170) uvedena hodnota píku reakce (1. sloupec tabulky) a hodnota integrálu, tedy plochy pod křivkou (2. sloupec tabulky). Zpravidla byla v rámci jednoho hnízda měřena reakce 4 mláďat. U dvou z nich byly přitom použity oba typy aktivátorů, zbývající dva vzorky byly z různých důvodů (krev použita pro stočení na plazmu, či pro účely jiných metodik) stanovovány pouze s jedním aktivátorem. Díky značnému množství dat je v této kapitole uvedeno grafické zpracování pouze poloviny hnízd, druhá polovina je součástí příloh této diplomové práce.
6000
S 01
4000
S 02
2000
S 03 Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 1 S. enterica
Čas (s)
Jedinec S 01 S 02 S 03
Pík 1 426 4 866 4 925
Integrál 183 452 374 895 448 899
Jedinec S 01 S 02 S 04
Pík 630 1 505 1 555
Integrál 38 092 76 952 85 727
2000
S 01
1500
S 02
1000
S 04
500
Blank
Čas (s)
62
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 1 E. coli
S 05
15000
S 06
10000
S 07
5000
S 08 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 2 S. enterica
Blank
Čas (s)
S 05 S 06 S 07 S 08
4 509 6 081 7 466 10 761
57 1231 47 1741 60 9570 75 8127
S 05 S 06 S 07 S 08
316 622 921 944
44 049 59 187 66 663 75 576
S 09 S 10 S 11
1 277 2 669 4 576
218 143 394 103 642 802
S 09 S 10 S 12
627 1 351 1 152
35 619 62 116 50 033
S 05
1000 800 600 400 200 0
S 06 S 07
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
S 08 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 2 E. coli
Blank
Čas (s)
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 09 S 10 S 11 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 3 S. enterica
Čas (s)
1500 1250 1000 750 500 250 0
S 09 S 10 S 12
Čas (s)
63
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 3 E. coli
4000
S 13
3000
S 14
2000
S 15
1000
Blank 187
172
157
141
126
110
95
79
64
48
33
17
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 4 S. enterica
Čas (s)
S 13 S 14 S 15
1 188 2 557 3 360
17 5376 37 1931 35 7394
S 13 S 14 S 16
473 506 447
36 570 35 839 49 598
S 17 S 18 S 19
1 707 1 141 1 830
29 1492 18 3402 28 0328
S 17 S 18 S 20
1 059 593 757
47 296 31 198 32 118
600
S 13
400
S 14
200
S 16 Blank 187
172
157
141
126
110
95
79
64
48
33
17
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 4 E. coli
Čas (s)
2000
S 17
1500
S 18
1000
S 19
500
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 5 S. enterica
Čas (s)
1500
S 17
1000
S 18
500
S 20 Blank
Čas (s)
64
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (LRU)
Hnízdo 5 E. coli
4000
S 21
3000
S 22
2000
S 23
1000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 6 S. enterica
S 21 S 22 S 23
Čas (s)
3 011 35 7437 3 177 42 5454 2 330 37 0644
800
S 21
600
S 22
400
S 24
200
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 6 E. coli
S 21 S 22 S 24
Čas (s)
445 642 615
51 558 62 708 47 891
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 25 S 26 S 27 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 7 S. enterica
S 25 3 843 39 4766 S 26 2 581 39 5118 S 27 2 898 42 8411
Čas (s)
1000 800 600 400 200 0
S 25 S 26 S 28
Čas (s)
65
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 7 E. coli
S 25 S 26 S 28
526 677 799
45 596 46 912 52 024
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 29 S 30 S 31 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 8 S. enterica
S 29 S 30 S 31
Čas (s)
597 99 468 1 314 198 327 4 017 358 001
1000 800 600 400 200 0
S 29 S 30 S 32 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 8 E. coli
S 29 S 30 S 32
Čas (s)
435 846 851
31 335 45 338 48 182
3000
S 33
2000
S 34
1000
S 35 Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 9 S. enterica
S 33 2 062 19 4707 S 34 2 435 37 2191 S 35 1 615 23 3154
Čas (s)
1500 1250 1000 750 500 250 0
S 33 S 34 S 36
Čas (s)
66
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 9 E. coli
S 33 687 S 34 924 S 36 1 459
46 863 52 517 71 617
4000
S 37
3000
S 38
2000
S 39
1000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 10 S. enterica
Čas (s)
S 37 S 38 S 39
2 746 36 4539 1 095 15 6845 2 878 33 3390
S 37 S 38 S 40
577 452 1 421
S 41 S 42 S 43
623 90 138 2 244 362 965 2 054 308 730
1500 1250 1000 750 500 250 0
S 37 S 38 S 40 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 10 E. coli
Čas (s)
31 154 28 746 70 488
2500 2000 1500 1000 500 0
S 41 S 42 S 43 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 11 S. enterica
Čas (s)
1500 1250 1000 750 500 250 0
S 41 S 42 S 44
Čas (s)
67
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 11 E. coli
S 41 406 S 42 1 408 S 44 1 049
21 095 68 445 49 632
15000
S 45
10000
S 46
5000
S 47 Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 12 S. enterica
Čas (s)
S 45 S 46 S 47
974 12 194 5 525
157 245 749 335 363 024
S 45 S 46 S 48
266 430 586
35 898 42 277 47 713
S 49 S 50 S 51
972 2 897 4 624
169 767 442 348 645 172
S 49 S 50 S 52
466 1 222 910
25 159 59 686 46 928
800
S 45
600
S 46
400
S 48
200
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 12 E. coli
Čas (s)
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 49 S 50 S 51 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 13 S. enterica
Čas (s)
1500
S 49
1000
S 50
500
S 52 Blank
Čas (s)
68
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 13 E. coli
15000 S 53
10000
S 54
5000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 14 S. enterica
S 53 S 54
Čas (s)
2 490 246 988 10 788 911 944
400
S 53
300
S 54
200
S 55
100
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 14 E. coli
Čas (s)
S 53 S 54 S 55
286 346 362
33 139 55 627 51 416
S 56 S 57 S 58
2 750 7 464 6 803
273 628 594 634 544 376
S 56 S 57 S 59
246 228 375
31 445 35 657 54 742
8000
S 56
6000
S 57
4000
S 58
2000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 15 S. enterica
Čas (s)
400 300
S 56
200
S 57
100
S 59
Čas (s)
69
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 15 E. coli
Blank
4000 3000
S 60
2000
S 61
1000
S 62 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 16 S. enterica
Blank
Čas (s)
S 60 S 61 S 62
714 2 345 3 187
117 403 274 374 324 646
S 60 S 61 S 63
442 1 371 1 191
23 645 54 355 51 720
S 64 S 65 S 66
1 545 3 077 6 981
208 775 351 562 535 870
S 64 S 65 S 67
672 1 417 1 745
54 410 76 464 95 667
1500 S 60
1000
S 61
500
S 63 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 16 E. coli
Blank
Čas (s)
8000 6000
S 64
4000
S 65
2000
S 66 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 17 S. enterica
Blank
Čas (s)
2000 1500
S 64
1000
S 65
500
S 67
Čas (s)
70
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 17 E. coli
Blank
8000
S 68
6000
S 69
4000
S 70
2000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 18 S. enterica
Čas (s)
S 68 S 69 S 70
2 740 233 265 7 541 487 120 4 916 420 679
S 68 S 69 S 71
371 728 277
800
S 68
600
S 69
400
S 71
200
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 18 E. coli
Čas (s)
29 810 45 113 42 234
8000
S 72
6000
S 73
4000
S 74
2000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 19 S. enterica
S 72 S 73 S 74
Čas (s)
5 807 407 771 2 050 286 737 4 920 532 337
1000 800 600 400 200 0
S 72 S 73 S 75
Čas (s)
71
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 19 E. coli
S 72 S 73 S 75
395 602 934
27 550 50 729 65 183
10000 8000 6000 4000 2000 0
S 76 S 77 S 78 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 20 S. enterica
S 76 S 77 S 78
Čas (s)
2 061 22 3475 5 332 35 1206 7 863 46 3305
1000 800 600 400 200 0
S 76 S 77 S 79 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 20 E. coli
Čas (s)
S 76 S 77 S 79
236 928 752
30 419 64 562 56 357
Již z první poloviny grafů je jasně patrný rozdíl týkající se hodnot reakc mezi jednotlivými aktivátory. Zatímco reakce s LPS S. ent. dosahuje obecně velmi vysokých hodnot nabývajících mnohdy i několik tisíc RLU, reakce s LPS E. coli se běžně pohybuje pouze ve stovkových hodnotách překračujících ojediněle hodnotu jednoho a půl tisíce RLU. Všimnout si také můžeme, že rozdíly mezi jednotlivci v rámci hnízda jsou zcela běžnou záležitostí, která nezřídka nabývá významných rozdílových hodnot představujících pak v případě S. ent. i několikatisícové rozdíly RLU. Co se charakteru křivek týká, i zde můžeme pozorovat více či méně patrné rozdíly, které by pro dané aktivátory měly být typické a zpravidla neměnné. Trend stálého charakteru křivky však pozorujeme pouze v případě E. coli, kdy reakce dosahuje svého maxima okamžitě po přidání aktivátoru a poté, během několika málo vteřin, prudce klesá až k úrovni blanku. Popsaný průběh můžeme pozorovat přibližně u 90 % hnízd, kdy jsme však pro rychlost reakce byli schopni zaznamenat vždy jen druhou polovinu píku bez zachycení jeho nástupu. Zbývající hnízda vykazují odchylky pozorovatelné například u hnízda 14 a 15, kdy reakce neklesá a drží si poměrně vysokou hladinu produkce ROS po celou délku měření či dokonce tuto produkci zvyšuje.
72
Co se reakce se S. ent. týká, zde je charakter křivek poměrně dosti variabilní, přičemž běžně pozorujeme dva typické průběhy: první průběh reakce se shoduje s reakcí s E. coli, tedy okamžité dosažení píku a následný prudký pokles na hladinu blanku. Tento charakter pozorujeme u více než 60 % hnízd. Druhý typ reakce umožňuje celé zachycení píku, jelikož k jeho dosažení dochází až po několika sekundách, častěji desítkách sekund. Pozorovat přitom můžeme různé časové odstupy, nejen mezi hnízdy, ale dokonce i mezi jedinci navzájem. Ti, jak je patrné například z hnízda 27, dosahují maxima reakce v mnohdy i dosti odlišných časech, což jsme v případě E. coli nepozorovali. Pro znázornění celé reakce, tedy i se samotným nástupem píku, byl pro ověření kinetiky použit luminometr typu Hidex Chameleon V. s automatickým injektorem aktivátoru. Reakce je zde na rozdíl od běžně používaného luminometru, měřena ještě před přidáním aktivátoru. Tento typ luminometru byl však naší laboratoří zakoupen až po provedení studie na sýkorkách, tudíž jeho výsledek je zde pouze pro ukázku. Na rozdíl od původně používaného luminometru neměří v jednotkách RLU, ale CPS (counts per second).
Přidání aktivátoru
Graf 3: Reakce krevního vzorku kura domácí s LPS S. enterica zaznamenána pomocí luminometru typu Hidex Chameleon V. (blank – růžová, aktivátor v duplikátu modrá a černá).
10.1.3.2.
Porovnání variability v imunitní odpovědi na LPS mezi hnízdy navzájem
K porovnání jednotlivých hnízd navzájem byl použit vyhodnocovací statistický program STATISTICA 10, v rámci něhož byl použit Fisherův test se zadanou hladinou významnosti 5 %. Samostatně byly srovnávány píky reakce a její integrály. Výsledky jsou opět vyhodnoceny dvojím způsobem - grafickým a pro statistickou analýzu tabulkovým zpracováním. V rámci tabulek je ke každému hnízdu přiřazen kód, složený z písmen A – G
73
pro S. ent. a A – H pro E.coli. Čím více písmen přitom daný kód obsahuje, tím více se hodnota píků či integrálu hnízda blíží hodnotě průměru a tím nižší statistickou významnost dané hnízdo má. Naopak statisticky významně odlišná (p<0,05) jsou hnízda, která nemají společné ani jedno z uvedených písmen. Čím méně písmen tedy daný kód obsahuje, tím více je odlišné od ostatních hnízd a hodnoty průměru a nabývá tak vyšší statistickou významnost, jejíž četnost je v tabulce taktéž uvedena.
10.1.3.2.1.
Variability v imunitní odpovědi na LPS S. enterica
Hodnoty píků pro reakci se S. ent. 12000
Luminiscence (RLU)
10000 8000 6000 4000 2000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
0 Hnízdo
Graf 4: Hodnoty píků jednotlivých hnízd pro reakci se S. enterica (průměr + S.D.).
Hodnoty integrálů pro reakci se S. ent. 1000000 900000
Integrál reakce
800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
0 Hnízdo
Graf 5: Hodnoty integrálů jednotlivých hnízd pro reakci se S. enterica (průměr + S.D.). 74
Statistická analýza jednotlivých hnízd v rámci hodnot píků a integrálů reakce se S. ent.
Hnízdo
Pík
Rel. četnost významnosti (%)
Inegrál
Rel. četnost významnosti (%) 5 56 0 7 15 0 0 17 10 7 15 0 0 34 10 15 5 0 0 5 0 17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
ABCDE ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ FG ABCD ̶ ̶ ̶ ABCD ̶ ̶ ̶ AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ABCD ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ ABC ̶ ̶ ̶ ̶ ABC ̶ ̶ ̶ ̶ ABC ̶ ̶ ̶ ̶ AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ EFG ABCD ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ EFG ̶ ̶ ̶ DEFG ABC ̶ ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ ̶ ̶ CDEFG ABCDEFG ̶ ̶ CDEFG ABCD ̶ ̶ ̶ ABC ̶ ̶ ̶ ̶
5 76 10 10 20 10 5 12 12 12 20 54 10 49 27 12 5 12 0 12 10 12
ABCDEF ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ G ABCDEFG ABCDE ̶ ̶ AB ̶ D ̶ ̶ ̶ ABCDEFG ABCDEFG AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ABCD ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ AB–D ̶ ̶ ̶ ABCDEFG ABCDEFG ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ FG ̶ ̶ CDEFG AB–D ̶ ̶ ̶ ABCDEF– ABCDEFG ABCDEFG ABCDEF– ABCDEFG AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
ABCDE ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ –G ABCD ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ ̶ ̶ CDEFG ABCD ̶ ̶ ̶ ABC ̶ ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ A ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ –
5
–BCDEFG
2
76 10 5 20 5 12 10 12 5 24
̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ G ABCDE ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ EFG AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ ̶ ̶ C–EFG ABCDEFG ABCDE ̶ ̶ ABCDEF– A ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
56 7 22 17 7 20 0 7 5 20
34 35 36 37 38 39 40
– BCDEFG
2
5
ABCDE ̶ ̶ AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ABCD ̶ ̶ ̶ ABCDE ̶ ̶ ABCD ̶ ̶ ̶ ABCDEF–
5 20 10 5 10 2
ABCDEF– ABCDEF– AB–D ̶ ̶ ̶ ABCDEF– ABCDEF– ABCDEF– ABCDEFG
5 15 5 5 5 0
41
–BCD ̶ ̶ ̶
7
̶ ̶ C–EFG
17
Tab. 5: Statistická analýza hodnot píků a integrálů reakce se S. ent. mezi jednotlivými hnízdy. 75
Z grafů i tabulky je patrné, že nejvyšší a zároveň statisticky nejvýznamnější reakci vykazovala hnízda 2, 12, a 24, která se tak nejvíce lišila od hodnot průměru. Nejnižší reakce byla naopak pozorována u hnízda číslo 5, 27 a 33. Díky značným rozdílům hodnot píků, které se řádově pohybují v rámci tisíců RLU je navíc možné pozorovat statistickou významnost také u integrálů reakce, která je nejvyšší v případě hnízd 2, 14 a 24. Častá korelace hodnot integrálů a píků je patrná především z výše uvedených grafů.
10.1.3.2.2.
Variability v imunitní odpovědi na LPS E. coli
Hodnoty píků pro reakci s E. coli 2500
Luminiscence (RLU)
2000 1500 1000 500
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
0 Hnízda
Graf 6: Hodnoty integrálů jednotlivých hnízd pro reakci s Escherichia coli (průměr + S.D.).
Hodnoty integrálů pro reakci s E. coli 200000 180000
Integrál reakce
160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
0 Hnízda
Graf 7: Hodnoty integrálů jednotlivých hnízd pro reakci s Escherichia coli (průměr + S.D.). 76
Statistická analýza jednotlivých hnízd v rámci hodnot píků a integrálů reakce s E. coli Hnízdo
Pík
Rel. četnost významnosti (%)
Inegrál
Rel. četnost významnosti (%)
1
̶ ̶ ̶ ̶ ̶ FGH
37
ABC
0
2
ABCDEFG ̶
2
AB–
2
3
7
AB–
2
4
ABCD ̶ ̶ ̶ ̶
̶ ̶ CDEFGH
15
AB–
2
5
ABCDEFGH
0
AB–
2
6
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
AB–
2
7
ABCDEFGH
0
AB–
2
8
ABCDEFGH
0
AB–
2
9
̶ ̶ CDEFGH
7
AB–
2
10
ABCDEFGH
0
AB–
2
11
̶ BCDEFGH
5
AB–
2
12
ABC ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
17
AB–
2
13
ABCDEFGH
0
AB–
2
14
A ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
27
AB–
2
15
A ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
27
AB–
2
16
̶ ̶ CDEFGH
7
AB–
2
17
̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ GH
44
–BC
2
18
ABC ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
17
AB–
2
19
ABCDEF ̶ ̶
7
AB–
2
20
ABCDEF ̶ ̶
7
AB–
2
21
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
AB–
2
22
̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ GH
44
̶ ̶ C
93
23
ABCDEFGH
0
AB–
2
24
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
AB–
2
25
ABCDEFGH
0
AB–
2
26
̶ ̶ ̶ ̶ EFGH
17
AB–
2
27
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
AB–
2
28
ABCDEFGH
0
AB–
2
29
ABCDEFGH
0
AB–
2
30
̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ H
46
AB–
2
31
ABCDEFGH
0
AB–
2
32
̶ ̶ ̶ DEFGH
15
AB–
2
33
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
A ̶
5
34
ABCDEFGH
0
AB–
2
35
̶ ̶ ̶ ̶ ̶ FGH
37
AB–
2
36
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
AB–
2
37
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
AB–
2
38
ABCDE ̶ ̶ ̶
12
AB–
2
39
AB ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
0
AB–
2
40
ABC ̶ ̶ ̶ ̶ ̶
17
AB–
2
41
ABCDEF ̶ ̶
7
AB–
2
Tab. 6: Statistická analýza hodnot píků a integrálů reakce s E.coli mezi jednotlivými hnízdy. 77
Výsledky týkající se imunitní reakce s E. coli nám říkají, že nejvyšší a statisticky nejvýznamnější reakci jsme zaznamenali u hnízda číslo 17, 22 a 30. Reakci nejnižší naopak vykazovala hnízda 14, 15 a 39. Na rozdíl od reakce se S. ent. tentokrát nepozorujeme významné rozdíly týkající se integrálů. Důvodem je jednak téměř neměnný průběh reakce a také hodnoty píků, které si byly mnohdy velmi blízké (rozdíly pouze v desítkách či stovkách RLU). V důsledku toho si jsou blízké také hodnoty integrálů, které tak nevykazují téměř žádnou statistickou významnost. Také korelace mezi oběma grafy je v porovnání se S. ent. výrazně méně patrná.
10.2. Stanovení koncentrace lysozymu metodou ELISA Stanovení koncentrace lysozymu metodou ELISA bylo provedeno ve spermatu vlaštovek obecných za účelem ověření, zda existuje korelace mezi tímto imunologickým parametrem a délkou ocasu daných jedinců.
Koncentrace lysozym (ng/ml)
Stanovení koncentrace lysozymu ve spermatu vlaštovek obecných 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Ø Číslo vlaštovky
Graf 8: Koncentrace lysozymu ve spermatu vlaštovek obecných.
Délka ocasu vlaštovek obecných Délka ocasu (mm)
50 40 N e z n á m á
30 20 10 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Číslo vlaštovky
Graf 9: Porovnání délky ocasů vlaštovek obecných. 78
Získané hodnoty bohužel nepotvrdily hypotézu týkající se délky ocasu a kvality spermií daného jedince, což je patrné při porovnání výše uvedených grafů. Vzah mezi těmito dvěma faktory sice v některých případech pozorovat můžeme, ale ve vztahu k celému pokusu byla tato korelace vyhodnocena Ústavem Biologie obratlovců AV ČR jako negativní. Z grafu 8 je však patrné, že mezi jednotlivci můžeme pozorovat mnohdy i významné rozdíly koncentrací, jež by mohly být vysvětleny spojitostí s jinými kondičními parametry. Ověřili jsme si také, že stanovení koncentrace lysozymu pomocí ELISA kitu je metodou vysoce citlivou, schopnou zaznamenat i nepatné množství tohoto antibakteriálního enzymu. Dle získaných hodnot poměrně vysokého počtu jedinců volně žijící populace vlaštovek jsme také mohli stanovit průměrnou koncentraci spermálního lysozymu se značnou výpovědní hodnotou. Tato koncentrace činní 33,2 ng/ml spermatu (S.D.: ± 8,02; n = 28). Z námi testovaných vlaštovek tak nejvyšší koncentraci lysozymu vykazovaly vlaštovky číslo 18, 25 a 26, nejnižší aktivitu pak vlaštovky číslo 15, 17 a 21.
10.3. Vyhodnocení výsledků vedlejších metodik 10.3.1. Stanovení komplementové aktivity pomocí bioluminiscenčních bakterií E. coli
1) Porovnání celkové baktericidní aktivity komplementu proti aktivitě alternativní dráhy. -
měření probíhalo na vzorcích plazmy křepelky japonské a kura domácího
Z třikrát opakovaného měření, které vykazovalo nevysvětlitelné hodnoty (aktivita alternativní dráhy stejná či dokonce vyšší, než aktivita celková; aktivita kontroly vyšší, než aktivita stanovovaného vzorku) lze usuzovat, že tato metoda je pro stanovení alternativní dráhy komplementu ptáků metodou nevhodnou.
2) Vliv teplotního faktoru na aktivitu komplementu -
měření probíhalo na vzorcích plazmy kura domácího
79
Luminiscence (RLU)
Vliv laboratorní teploty na aktivitu komplementu 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0
Blank 26 hod při RT 22,5 hod při RT 9 hod při RT 6 hod při RT 1,5 hod při RT
0
3
6
9 Čas (min)
12
15
18
Graf 10: Vliv laboratorní teploty na aktivitu komplementu. Z grafu je patrné, že nejnižší luminiscenci, tedy nejvyšší aktivitu komplementu vykazuje vzorek ponechaný při laboratorní teplotě po nejkratší dobu (1,5 hod). U ostatních vzorků pozorujeme zpravidla taktéž závislost na čase, přičemž platí, čím déle ponecháme vzorek při laboratorní teplotě, tím nižší aktivitu komplementu obdržíme. Pro konkrétnější stanovení byl vypočítán čas potřebný k usmrcení 50 % bakterií. 26 hodin při RT 22,5 hodin při RT 9 hodin při RT 6 hodin při RT 1,5 hodin při RT 7 min 32s 7 min 7s 6min 52s 6min 28s 6min 3s Tab. 7: Čas potřebný k usmrcení 50 % bakterií u vzorků plazmy kura domácího ponechaných po různě dlouhou dobu při laboratorní teplotě.
Na základě dvakrát opakovaného měření, poskytující grafické i tabulkové vyhodnocení, se laboratorní teplota ukázala jakožto faktor ovlivňující aktivitu komplementu. Tyto rozdíly však nejsou tak vysoké, jak by se dalo očekávat.
10.3.2. Stanovení koncentrace lysozymu metodou radiální difúze -
stanovení koncentrace lysozymu probíhalo v 50 μl neředěné plazmy kura domácího.
Obr. 28: Stanovení koncentrace lysozymu v plazmě kura domácího. Obvodové jamky: lysozym o známé koncentraci pro kalibraci. Vnitřní jamky: vzorek. 80
Hodnoty druhé mocniny průměru prstenců okolo jamek se slepičí plazmou odpovídají hodnotě, která přísluší lysozymu o koncentraci 0,1 mg/ml. Není tak nutné sestavovat jinak nezbytnou kalibrační křivku a zjišťovat hodnotu regrese. Koncentrace lysozymu ve slepičí plazmě je tedy 0,1 mg/ml. Ačkoliv je metoda poměrně jednoduchá a finančně nenáročná, nutnost použít velký objem neředěného vzorku ji řadí k méně praktickým metodám stanovení.
10.3.3. Stanovení aktivity GST -
stanovování aktivity GST probíhalo pro porovnání reakcí na vzorcích různých druhů živočichů.
GST aktivita různých živočišných druhů GST aktivita (nmol/mg/min)
25 20 Zavíječ voskový 15
Včela medonosná Kur domácí
10
Křepelka japonská 5 0
Graf 11: Průměrná hodnota aktivity GST v plazmě kura domácího v porovnání s jinými živočišnými druhy (průměr + S.D., n=2). Z výsledků grafu vyplývá, že aktivita GST je u ptáků v porovnání s hmyzem nižší, což je patrné především v případě kura domácího. Pozorovatelné jsou u ptáků také mezidruhové rozdíly.
10.3.4. Stanovení aktivity SOD Dvakrát opakované měření přineslo na ptačích vzorcích vždy jen záporné hodnoty.
81
10.3.5. Stanovení antioxidační kapacity
CL (mV)
Stanovení celkové antioxidaní kapacity plazmy kura domácího ABAP
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
trolox 1,497 µmol/ml trolox 0,998 µmol/ml trolox 0,499 µmol/ml 10x ředěná plazma 7x ředěná plazma 5x ředěná plazma 2x ředěná plazma 0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
neředěná plazma
Čas (s)
Graf 12: Stanovení antioxidační kapacity v plazmě kura domácího při různých ředěních.
Z grafu je patrné, že nejvyšší antioxidační kapacitu vykazuje dle očekávání vzorek neředěné plazmy. Ten téměř hodinu drží hladinu peroxylových radikálů produkovaných látkou ABAP při nízkých hodnotách. Ostatní vzorky plazmy reagují taktéž v závislosti na svém ředění, přičemž platí, čím více ředěný vzorek je, tím kratší dobu drží nízkou hladinu peroxylových radikálů a tím dříve dosahuje píku reakce. ředění 10x ředění 7x 3,36 μmol/ml 3,36 μmol/ml
ředění 5x ředění 2x žádné ředění průměr 3,6 μmol/ml 3,45 μmol/ml 3,46 μmol/ml 3,45 μmol/ml
Tab. 8: Výsledné hodnoty antioxidační kapacity plazmy kura domácího při různých ředěních. Průměrná hodnota celkové antioxidační kapacity plazmy kura domácího je 3,45 μmol/ml. Porovnání s ostatními živočišnými druhy znázorňuje následující graf.
82
Antioxidační kapacita vybraných živočišných druhů Koncentrace antioxidantů (μmol/ml)
20 18 16 14
Zavíječ voskový
12
Kur domácí
10
Kapr obecný
8
Karas stříbřitý
6 4 2 0
Graf 13: Porovnání antioxidační kapacity vybraných živočišných druhů.
10.3.6. Stanovení MDA
Množství MDA (nmol/mg proteinů)
Stanovení míry oxidačního stresu u různých živočišných druhů 8 7
Karas stříbřitý
6 Drosophila melanogaster
5 4
Včela medonosná
3
Zavíječ voskový
2
Kur domácí
1 0
Graf 14: Průměrná hodnota hladiny MDA v plazmě kura domácího v porovnání s jinými živočišnými druhy (průměr + S.D., n = 2). Z grafu je patrné, že nejvyšší míru oxidačního stresu, ačkoliv s vysokou směrodatnou odchylkou vykazuje vzorek plazmy kura domácího.
83
11. Diskuze Hlavním cílem této diplomové práce bylo zavést luminofor Pholasin pro stanovení míry respiračního vzplanutí ptačích heterofilů s následnou studií na sýkorkách. V rámci prvních pokusů s Pholasinem bylo úkolem zvolit nejvhodnější aktivátor fagocytózy čili respiračního vzplanutí. Jako aktivátory byly zvoleny LPS, PMA, fMLP a ZP. Nejvyšší hodnoty přitom vykazovala reakce s LPS a PMA, což svědčí o senzitivitě heterofilů k těmto dvěma typům aktivátorů (Graf 2). Stejné výsledky vykazují také studie Kogut a kol. (1998) či Farnell a kol. (2003). Naopak k žádné reakci nedošlo v přítomnosti fLMP či ZP. Situace v případě fMLP byla očekávaná a její příčina u kura domácího, který byl v tomto pokusu modelovým organismem, spočívá v absenci receptorů pro tento typ aktivátoru (Kogut a kol. 1998). Co se týká ZP, zde se naše výsledky s výsledky dalších studií značně rozcházejí (Colon a kol. 1991; Kogut a kol. 1998). Důvodem může být, že ve zmíněných studiích byl použit opsonizovaný zymosan, kdežto v našem pokusu nikoliv. Opsonizace, jak již víme, urychluje proces fagocytózy, dá se tak předpokládat, že důvodem nezaznamenání reakce bylo zvolení krátkého časového úseku, během kterého k aktivaci fagocytózy skrze ZP nestihlo dojít. Z výše uvedených aktivátorů se tak pro následující měření stal vzhledem k průběhu své reakce nejvýhodnější LPS vykazující vysokou hodnotu respiračního vzplanutí, kterou je možné na rozdíl od PMA zaznamenat v krátkém časovém intervalu, což značně zvýhodňuje proces měření. Stejných závěrů bylo dosaženo také ve studii Sild a Hõrak (2010). V rámci optimalizací, které byly konzultovány s firmou Knight Scientific produkující Pholasin, byly ověřovány dva faktory potencionálně ovlivňující míru respiračního vzplanutí. Pokusy přitom probíhaly taktéž na vzorcích plné krve kura domácího. První z faktorů, tedy stáří krve, přinesl výsledky popisující nárůst aktivity heterofilů během prvních dvou hodin a následný pokles odpovídající trendu, čím starší krev, tím nižší aktivita fagocytózy (Tab. 3). Stejné výsledky přineslo měření také na lidských neutrofilech provedené Biofyzikálním ústavem v Brně. Zřejmé tedy je, že ať už lidské neutrofily, či ptačí heterofily zvyšuji svoji aktivitu vždy v průběhu prvních dvou hodin. Příčina tohoto jevu však nebyla dosud objasněna. Vysvětlení by mohlo být založeno na tom, že fagocyty zprvu změnou své senzitivity reagují na změněné podmínky, kterým jsou po odběru vystaveny. Po delší době, konkrétně po avizovaných dvou hodinách, jsou již adaptovány novým podmínkám a svoji senzitivitu tak ztrácejí. Druhým z faktorů řešených během optimalizace byl vliv délky preinkubace krve v pufru pro její ředění. Výsledky prokázaly, že čím delší je preinkubace krve, tím vyšší aktivitu respiračního vzplanutí heterofily vykazují (Tab. 4). Zřejmě tak daný pufr způsobuje 84
aktivaci heterofilů. To může být výsledkem toho, že Pholasin kit je, jak už bylo řečeno, určen pro stanovení respiračního vzplanutí lidských neutrofilů a veškeré optimalizace jsou tak provedeny právě na nich. Jedinou možností, jak se zvýšení aktivity vyhnout je tak započít měření co možná nejrychleji po naředění krve s tímto pufrem. Rozsáhlá studie na sýkorkách, jejíž data byla hlavní vyhodnocovací kapitolou této práce, přinesla spoustu diskutabilních dat. Bohužel, jak již bylo předesláno, studie provedené s Pholasinem pro účely ptačí imunologie jsou pouze tři. Porovnání získaných výsledků je tak značně omezené. Prvotním výsledkem naší studie je zjištění, že heterofily mláďat s výraznou odlišností reagují na jednotlivé typy aktivátorů, což vykazuje specifičnost každého z nich. Vyhodnocené reakce přitom vykazují mnohdy i mnohonásobně vyšší aktivitu v přítomnosti LPS Salmonella enterica. Tento závěr se však neshoduje se studií Sild a Hõrak (2010), jejíž výsledky jsou zcela opačné. Modelovým organismem se v rámci této studie stali dospělci zvonka zeleného (Carduelis chloris), jako aktivátory byly zvoleny stejně jako v našem případě LPS E. coli O55:B5 a S. enterica, avšak nikoliv sérotyp Enteritidis, ale Typhimurium. Právě tento rozdíl je s největší pravděpodobností zodpovědný za odlišnost obdržených výsledků. Značnou roli, zde také mohou hrát mezidruhové rozdíly, které mnohdy nabývají více než značný význam. Rozdíl mezi studiemi byl také v tom, že v našem případě byla použita mláďata, kdežto ve studii Sild a Hõrak, dospělí jedinci. Toto odůvodnění odlišných výsledků je však z důvodu neměnnosti vrozené imunity značně nepravděpodobné. V rámci výsledků porovnávajících intenzitu reakce mezi jedinci daného hnízda si u obou typů aktivátorů můžeme všimnout mnohdy i značných rozdílů. Ty, jelikož se jedná o sourozence, nelze vysvětlovat výrazně odlišným genetickým vkladem, nýbrž pouhou individuální variabilitou. Ta může být výsledkem kondičních parametrů jedince, na které má vliv nejen genetika, ale i podmínky, kterým je mládě vystaveno po svém vylíhnutí. Výraznou roli zde přitom může hrát sourozenecká kompetice. Možným vysvětlením je také skutečnost, že se mláďata v hnízdě nelíhnout ve stejnou chvíli, nýbrž v průběhu několika málo hodin. Každá hodina má však v případě dvoutýdenního mláděte svůj význam, který by také mohl přispět k objasněním těchto rozdílů. Co se týká porovnání reakcí mezi hnízdy navzájem, pozorovat jsme zde mohli více či méně patrné rozdíly (Graf 4, 5, 6, 7), jež jsou výsledkem dvou hlavních faktorů: 1) Odlišná genetická výbava jedinců -
v rámci té může dojít k ovlivnění imunitních reakcí skrze kondiční faktory jedinců, jež jsou z velké části výsledkem jejich genetických predispozic, či skrze variabilitu samotných molekul nespecifické složky imunitního systému. 85
2) Stáří jedinců -
stejně tak jako nacházíme věkové rozdíly v rámci hnízda, pozorovat je můžeme i mezi hnízdy navzájem. V tomto případě však nabývají delších časových intervalů a věk mláďat se tak může lišit i několika málo dny. Jelikož naším úkolem bylo pouze vyhodnotit průběh reakcí, nikoliv spojitost výsledků
s kondičními či genetickými faktory jedinců, nemáme tak tato data k dispozici, což brání hlubší a detailnější polemice zabývající se vysvětlením mezihnízdních rozdílů. Zaměříme-li se na výsledné hodnoty reakcí detailněji, můžeme si všimnout, že v reakci na LPS S. enterica vykazovalo nejvyšší hodnotu RLU hnízdo 2, 12 a 24 (Graf 4), nejsilnější reakci na základě dosaženého píku a doby trvání reakce potom hnízdo 2, 14 a 24 (Graf 5). Tato hnízda navíc disponují největší statistickou významností, jak je patrné z tabulky číslo 5. Očekávat by se tak dalo, že imunitní systém jedinců těchto hnízd bude v rámci mezihnízdního porovnání vykazovat silnou reakci také v přítomnosti LPS E.coli. Opak je však pravdou a tato hnízda v reakci s LPS E. coli nabývají pouze průměrných či dokonce podprůměrných hodnot. Stejnou situaci můžeme pozorovat i obráceně, tedy v případě hnízd vykazujících nejvyšší reakci s LPS E. coli, konkrétně hnízda 7, 22 a 30 (Graf 6) vykazují v reakci s LPS S. enterica opět středních či nízkých hodnot. Tento trend – vysoká/nízká reakce pro jeden z aktivátorů → nízká/vysoká reakce pro druhý z aktivátorů můžeme pozorovat u většiny hnízd. Tyto výsledky tak naznačují, že zvýšená senzitivity pro jeden typ aktivátoru vede ke snížení senzitivitu pro typ druhý. Vzhledem k ojedinělosti této studie však porovnání s výsledky podobných studií chybí. V rámci jednotlivých hnízd byly také pozorovány odlišné charaktery křivek, což bylo patrné především v případě LPS S. enterica, kdy jsme pozorovali dva typické průběhy reakce. První – okamžité dosažení maxima s prudkým poklesem, druhý – postupný nárůst reakce s maximem dosaženým až po několika desítkách sekund, poté pozvolný pokles. Jedinci tak na LPS S. ent. mohou reagovat dvojím způsobem. Zajímavé je přitom to, že jsme zpravidla nepozorovali oba tyto průběhy v rámci jednoho hnízda. Naopak jedinci vykazovali mezi sebou vždy stejný průběh reakce ať už prvního či druhého typu. To stejné jsme mohli pozorovat také v případě LPS E. coli, kde jsme však odlišný charakter křivky pozorovali velmi zřídka. Nejpravděpodobnějším vysvětlením tohoto jevu je genetická výbava jedinců odrážející se ve variabilitě některé složky či složek imunitního systému. Ta se přitom může týkat zmiňovaného TLR4, který je v rámci této studie vyšetřován. V případě S. ent. jsme tak díky těmto odlišným průběhům a značným rozdílům hodnot píků mohli pozorovat významné rozdíly nejen v případě maximálních hodnot reakce, ale také v rámci jejích integrálů. Tyto 86
hodnoty spolu navíc značně korelují, což je patrné z obou porovnávacích grafů (Graf 4 a 5). Tuto korelaci můžeme pozorovat také v případě reakce s E. coli. Zde však není tolik patrná jako v předešlém případě. Důvodem jsou nejen nízké hodnoty píků reakce, ale i její takřka neměnný průběh. Další z metod použitých v rámci této diplomové práce byla ELISA, pomocí níž byla vyšetřována koncentrace spermálního lysozymu vlaštovek obecných. Získané hodnoty (Graf 8) pak v rámci ekoimunologických studii zabývajících se korelací mezi kvalitou spermií a kondičními parametry ptáků byly porovnávány s délkou ocasů daných jedinců (Graf 9). Obdržený výsledek byl však stanoven jako negativní. To ale neznamená, že tato studie, na které se spolupracovalo s Ústavem Biologie obratlovců AV ČR, nemůže potvrdit korelaci kvality spermií s jiným kondičním faktorem jako je například intenzita zbarvení daného jedince. Výsledky tohoto porovnávání však ještě nejsou k dispozici. V závěru jsme mohli stanovit také průměrnou koncentraci lysozymu, která činní 33,2 ng/ml sperma. Z výsledků je patrné, že nadprůměrnou hodnotu vykazovaly vlaštovky 7, 12, 18, 25 a 26 (Graf 8). Právě tito jedinci by tak podle hypotéz (Rowe a kol. 2011) měli oproti ostatním vykazovat výraznější intenzitu zbarvení. Naopak barva vlaštovek s číslem 15, 17 a 21, by z důvodu nejnižší naměřené koncentrace měla být o něco světlejší. V rámci vedlejších pokusů bylo hlavním úkolem na vzorcích ptačí krve otestovat vhodnost použití metodik běžně určených pro stanovení imunologických parametrů hmyzu a ryb. Na základě těchto dat však nelze stanovovat žádné závěry, či porovnání, nýbrž pouze říci, zda tato metoda v případě ptáků funguje a zda je tak přínosné se jí nadále věnovat. První metodou bylo stanovení komplementové aktivity pomocí bioluminiscenčních bakterií E. coli. Bohužel tato metoda přinesla ne vždy očekávané a vysvětlitelné výsledky. Výsledky pokusů zaměřené na porovnání celkové aktivity komplementu s aktivitou alternativní dráhy říkají, že aktivita alternativní dráhy je stejná, mnohdy i vyšší, než aktivita celková. Pro objasnění podobných hodnot by se příčina dala hledat v protilátkách, na kterých je klasická cesta aktivace komplementu závislá. Je tak pravděpodobné, že vzorky vykazovaly nižší obsah protilátek, což by tak zprostředkovaně vedlo k opoždění dráhy celkové. Možný je také vliv snížené teploty, jelikož aktivita komplementu byla měřena při 37 °C, které představují maximální teplotu nastavitelnou na námi používaném luminometru. Tělesná teplota ptáků je však o 3 - 4 °C vyšší, tedy optimum pro průběh jejích imunitních reakcí je kolem 40 °C. Obecně známým jevem, který můžeme pozorovat u všech skupin živočichů, je imunosuprese mechanismů imunitního systému při překročení či nedosažení jejich optimálních teplot. Ovlivněna je přitom složka buněčná i humorální (Bly a Clam 1992). Je tedy možné, že protilátky byly pod vlivem imunosuprese a k jimi zprostředkované aktivaci 87
tak došlo o něco déle, než v případě alternativní dráhy, která se aktivuje pouhou přítomností patogenu. Když opomeneme porovnávání celkové a alternativní aktivity a měříme pouze aktivitu celkovou, výsledky jsou nyní více obstojné. Nic to však nemění na tom, že tato metoda vyžaduje pro následující měření proces optimalizace a především teplotní podmínky odpovídající optimu ptáků. To je však teď díky nově zakoupenému luminometru prakticky možné. Další z metod, konkrétně stanovení koncentrace lysozmy metodou radiální difúze, byla použita pro vzorek plazmy kura domácího. Výsledná hodnota, tedy 0,1 mg/ml, se v porovnání se studií Sotirov a Koinarski 2003, kteří naměřili hladinu sérového lysozymu v hodnotě 0,000873 mg/ml, zdá být poměrně vysoká. Rozdíly v koncentraci lysozymu jsou však obecně individuálně variabilní záležitostí, na kterou má vliv řada faktorů. Následující pokusy týkající se aktivity enzymů, konkrétně GST a SOD, přinesly pozitivní data pouze v případě GST. GST v rámci porovnání s ostatními modelovými organismy vykazovalo nejnižší aktivitu právě v případě ptáků, což bylo patrné především na vzorku slepičí plazmy (Graf 11).
Co se týká SOD, která je členem přirozených
antioxidantů, v rámci našeho pokusu k její detekci nedošlo, ačkoliv kuřata touto aktivitou disponují (Wang a kol. 2008). Důvodem by mohla být její nízká hladina v námi vyšetřovaném vzorku, který pocházel pouze z jedné slepice. Dělat závěry by tak bylo předčasné a vzhledem k pozitivním výsledkům u jiných druhů živočichů možná i mylné. V rámci vedlejších pokusů byla také zahrnuta metoda stanovující celkovou antioxidační kapacitu plazmy kura domácího v porovnání s hemolymfou zavíječe voskového a plazmou ryb. Tato hladina je velice úzce spojena s kvalitou potravy, kterou daný jedinec přijímá a jež je zdrojem mnohých tělu nepřirozených antioxidantů. Takovými antioxidanty jsou kromě zmiňovaných karotenoidů také vitamin E, C, glutation, selen, zinek a mnoho dalších. Stanovení rozmezí, ve kterém se tyto hodnoty pohybují je tak díky výše uvedeným důvodům značně individuální a rozdíly mezi jednotlivými živočišnými druhy by tak mohly odrážet skladbu potravy daných jedinců. Námi obdržené výsledky v případě kura domácího vykazují hodnotu 3,45 μmol/ml. Jedinec však pocházel z domácího chovu, kde na antioxidanty bohatou stravu není dbáno tolik jako v případě velkochovů, kde se tak antioxidační kapacita může znatelně zvyšovat. Každopádně metoda se pro testování ptačích vzorků osvědčila jakožto velmi citlivá, průkazná a v budoucnu tak použitelná. Poslední metodou použitou v rámci této diplomové práce bylo stanovení hladiny malondyaldehydu. MDA slouží jako indikátor oxidativního stresu, který může být vyvolán nadměrnou produkcí ROS či RNS, nedostatečnou funkcí antioxidačního obranného systému či kombinací obou těchto faktorů. V porovnání s ostatními živočišnými druhy, byla nejvyšší 88
hladina MDA naměřena právě v případě plazmy kura domácího. V rámci možných vysvětlení se tak opět jeví spojitost s potravou jedince, která v porovnání s ostatními modelovými organismy vykazovala nejnižší zdroj antioxidačních enzymů. Stejně tak pravděpodobné je také to, že vysoká hladina ROS může být výsledkem stresové situace, kterou byl odchyt slepice a následný odběr vzorků. Ten je zajisté stresovou situací také pro ostatní, námi stanovované druhy. Zde je však nutné přihlédnou k evolučnímu vývoji a rozvoji nervové soustavy, z čehož je zřejmé, že ptáci budou k tomuto stresu vnímaví nejvíce. Možným vysvětlením je také to, že imunitní systém slepice mohl v době odběru bojovat s nepatrnou infekcí či parazitem, což by taktéž zvýšilo hladinu volných radikálů.
89
12. Závěr V první polovině této diplomové práce byla formou rešerše zpracována problematika vrozené imunity ptáků a jejích buněčných a humorálních mechanismů, stejně jako role imunitního systému v rámci reprodukce a signální ornamentace. Druhá polovina práce byla zaměřena na výzkum týkající se zejména rozsáhlé studie stanovení respiračního vzplanutí heterofilů mláďat sýkory koňadry. Během tohoto výzkumu byla chemiluminiscenční metodou v přítomnosti Pholasinu změřena v reakci na dva typy stimulantů aktivita respiračního vzplanutí 170 mláďat pocházejících ze 41 hnízd. Mnohonásobně vyšší reakce byla přitom pozorována v případě LPS Salmonella enterica, kterou vykazovalo každé z hnízd. Pro tento typ aktivátoru byly navíc pozorovány dvě různé kinetiky reakce. Odlišné hodnoty pro oba typy aktivátorů nabývající mnohdy značných rozdílů byly pozorovány jak mezi jedinci daného hnízda, tak mezi hnízdy navzájem. Průběhy reakcí jedinců každého z hnízd byly graficky zpracovány pro oba typy aktivátorů, tabulkově byly navíc vyhodnoceny píky a integrály reakcí. V rámci porovnávání mezihnízdních rozdílů byla data opět zpracována nejprve graficky, následně také statisticky. V menším rozsahu se diplomová práce zabývala stanovením koncentrace lysozymu ve spermatu vlaštovek obecných. Metodou ELISA bylo tentokrát vyšetřeno 28 jedinců. Výsledky však nepodporují očekávanou korelaci mezi koncentrací lysozymu a délkou ocasu vlaštovek. Pravděpodobná je však korelace s jiným kondičním faktorem jako je intenzita zbarvení. Data však poskytla vhodný podklad pro stanovení průměrné koncentrace spermálního lysozymu, která činí 33, 2 ng/ml. V rámci vedlejších pokusů byla provedena měření aktivity komplementu, koncentrace lysozymu metodou radiální difúze, aktivity enzymů GST a SOD, celkové antioxidační kapacity či stanovení míry oxidačního stresu. Všechna zmíněná stanovení, až na jedno, přitom přinesla pozitivní výsledky, dávající podnět k optimalizacím těchto metod na vzorcích ptačí krve či plazmy a následnému běžně prováděnému stanovení. Přínosy této diplomové práce: Ø Zavedení chemiluminiscenční analýzy oxidačního vzplanutí ptačích heterofilů v přítomnosti Pholasinu, včetně některých optimalizací. Ø Stanovení respiračního vzplanutí mláďat sýkory koňadry sloužící jako výchozí data grantového projektu spolupracující Karlovy univerzity.
90
Ø Stanovení koncentrace lysozymu ve spermiích vlaštovek obecných poskytující data grantovému projektu spolupracujícího Ústavu Biologie obratlovců AV ČR. Ø Odzkoušení metodik běžně používaných laboratoří srovnávací imunologie na vzorcích ptačí krve/plazmy a jejich vyhodnocení jakožto metodik použitelných pro ptačí vzorky tělních tekutin a využitelných pro další výzkum.
Výsledky této diplomové práce byly prezentovány na vědecké konferenci Zoologické dny 2013 v Brně formou posteru, který je součástí příloh diplomové práce.
91
13. Seznam zkratek AvBD
- ptačí beta defensin (avian beta defensin)
ABAP
- [2,2-azobis(2-aminopropan hydrochlorid)]
BALT
- bronchiální lymfatická tkáň (bronchial-associated lymphoid tissue)
CR 1
- komplementový receptor 1 (complement receptor 1)
DAF
- rozpadový akcelerační faktor (decay-accelerating factor)
DES
- diaylstilboestrol
ELISA
- enzyme-linked immunosorbent assay
fMLP
- N-formyl-methionyl-leucyl-fenylalanin
GALT
- lymfatická tkáň gastrointestinálního traktu (gut-associated-lymphoid-tissue)
GST
- Glutation S-transferáza
HALT
- lymfatická tká v oblasti hlavy (head-associated lymphoid tissue)
HRP
- křenová peroxidáza (horseradish peroxidase)
LPS
- lipopolysacharid
MAC
- membranolytický komplex (membrane attack complex)
MALT
- slizniční lymfatická tkán (mucosa-associated lymfoid tissue)
MASP 1, 2
- serinové proteázy asociované s lektinem vázajícím manózu (MBL-associated serine protease)
MBL
- manózu vázající lektin (mannose binding lectin)
MCP
- membránový kofaktorový protein (membrane cofactor protein)
MDA
- malondyaldehyd
NK buňky
- přirození zabíječi (natural killers)
NFκB
- jaderný faktor kappa B (Nuclear factor kappa B)
PAMP
- molukuly asociované s patogenem (pathogen associated molecular patterns)
PMA
- forbol-12-myristát-13-acetát
PRR
- receptory rozpoznávající znaky (pathogen recognition receptors)
SOD
- superoxid dismutáza
RLU
- relativní luminiscenční jednotky (relative luminiscence units)
ROS
- reaktivní kyslíkové intermediáty (reactive oxygen species)
Tc buňky
- cytotoxický T lymfocyt (T cytotoxic lymphocyte)
Th buňky
- pomocný T lymfocyt (T helper lymphocyte)
TLR
- Toll-like receptor
TRAP
- celková antioxidační kapacita (total reactive antioxidant potential)
ZP
- zymosanové partikule
92
14. Použitá literatura Články v odborných časopisech: Agrawal A.: CRP after 2004. Molecullar Immunology, 42(8), 927–930, 2005. Ahmad S., Pardini R.S.: Mechanisms for regulating oxygen toxicity in phytophagous insects. Free Radical Biology and Medicine, 8(4), 401-413, 1990. Alonso-Alvarez C., Bertrand S., Devevey G., Gaillard M., Prost J., Faivre B., Sorci G.: An experimental test of dose-dependent effect of carotenoids and immune activation on sexual signals and antioxidant activity. The American Naturalist, 164(5), 651-659, 2004. Amara U., Rittirsch D., Flierl M., Bruckner U., Klos A., Gebhard F., Lambris J.D., Huber-Lang M.: Interaction between the coagulation and complement system. Advances in Experimental Medicine and Biology, 632, 71-79, 2008. Andreasen C.B., Latimer K.S.: Cytochemical characteristics of chicken heterophils and eosinophils. Veterinary Clinical Pathology/American Society for Veterinary Clinical Pathology, 19(2), 51-54, 1990. Arnheim N.: The evolution of regulatory mechanisms studies on the multiple genes for lysozyme. Lysozymes: Genetics and evolution, 4, 623-632, 1975. Barua A., Yoshimura Y., Tamura T.: The effects of age and sex steroids on the macrophage population in the ovary of the chicken, Gallus domesticus. Journal of Reproduction and Fertility, 114(2), 253–258, 1998a. Barua A., Yoshimura Y. , Tamura T.: Effects of ageing and oestrogen on the localization of immunoglobulin-containing cells in the chicken ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 114(1), 11–16, 1998b. Barua A., Yoshimura Y.: Effects of aging and sex steroids on the localization of T cell subsets in the ovary of chicken, Gallus domesticus. General and Comparative Endocrinology, 114(1), 28–35, 1999. Befus A.D., Johnston N., Leslie G.A., Bienenstock J.: Gut-associated lymphoid tissue in the chicken. I. Morphology, ontogeny and some functional characteristics of Peyer’s patches. Journal of Immunology, 125(6), 2626–2632, 1980. Bertrand S., Faivre B., Sorci G.: Do carotenoid-based sexual traits signal the availability of nonpigmentary antioxidants? Journal of Experimental Biology, 209(22), 4414-4419, 2006.
Bienenstock J., Johnston N., Perey D.Y.: Bronchial lymphoid tissue. I. Morphologic characteristics. Laboratory Investigation; A Journal Of Technical Methods and Pathology, 28(6), 686–692, 1973. Biswal G.: Additional histological findings in the chicken reproductive tract. Poultry Science, 33(4), 843–851, 1954. Blount J. D., Metcalfe N. B., Birkhead T. R., Surai, P. F.: Carotenoid modulation of immune function and sexual attractiveness in zebra finches. Science, 300(5616), 125 -127, 2003.
93
Brune K., Spitznagel J.K.: Peroxidaseless chicken leukocytes: Isolation and characterization of antibacterial granules. Journal of Infectious Diseases, 127(1), 84–94, 1973. Buchtíková S., Šimková A. Rohlenová K., Flajšhans M., Lojek A., Liliuse E., Hyršl P.: The seasonal changes in innate immunity of the common carp (Cyprinus carpio). Aquaculture, 318(1-2), 169–175, 2011. Burns R.B.: Histology and immunology of Peyer’s patches in the domestic fowl (Gallus domesticus). Research in Veterinary Science, 32(3), 359–367, 1982. Carroll M.C.: The complement system in regulation of adaptive immunity. Nature Immunology, 5(10), 981–986, 2004. Ciriaco E., Pinera P.P., Diaz-Esnal B., Laura R.: Age-related changes in the avian primary lymphoid organs (thymus and bursa of Fabricius). Microscopy Research and Technique, 62(6), 482–487, 2003. Claver J.A., Quaglia I.E.: Comparative Morphology, Development, and Function of Blood Cells in Nonmammalian Vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine, 18(2), 87-97, 2009. Conner E.M, Grisham M.B.: Inflammation, free radicals and antioxidants. Nutrition, 12(4), 274–7, 1996. Cook, D. N., Pisetsky, D. S., Schwartz, D. A.: Toll-like receptors in the pathogenesis of human disease. Nature Immunology, 5(10), 975–979, 2004. Crippen T.L., Sheffield C.L., He H., Lowry V.K., Kogut M.H.: Differential nitric oxide production by chicken immune cells. Developmental and Comparative Immunology, 27(6-7), 603-610, 2003. Daimon T., Claxton-Martins A.: Electron microscopic and enzyme cytochemical studies on granules of mature chicken granular leucocytes. Journal of Anatomy, 123(3), 553–562, 1977. Das S.C., Isobe N., Nishibori M., Yoshimura Y.: Expression of transforming growth factorbeta isoforms and their receptors in utero-vaginal junction of hen oviduct in presence or absence of resident sperm with reference to sperm storage. Reproduction, 132(5), 781-790, 2006 Das S.C., Isobe N., Yoshimura Y.: Expression of Toll-like receptors and avian β-defensins and their changes in response to bacterial components in chicken sperm. Poultry Science, 90, 417-425, 2011. De Buck J., Van Immerseel F., Haesebrouck F., Ducatelle R.: Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of Applied Microbiology, 97(2), 233–245, 2004. Faivre B., Grégoire A., Préault M., Cézilly F., Sorci, G.: Immune activation rapidly mirrored in a carotenoid-based secondary sexual trait. Science, 300(5616), 103, 2003. Farnell B.M., Crippen T.L., He H., Swaggerty CH.L., Kogut M.H.: Oxidative burst mediated by toll like receptors (TLR) and CD14 on avian heterophils stimulated with bacterial toll agonists. Developmental and Comparative Immunology, 27(5), 423–429, 2003. Freitas M., Lima J.L.F.C., Fernandes E.: Optical probes for detection and quantification of neutrophils’ oxidative burst. A review. Analytiva Chemica Acta, 649(1), 8–23, 2009.
94
Fujita T., Matsushita M., Endo Y.: The lectin-complement pathway – its role in innate immunity and evolution. Immunological Reviews, 198(1), 185–202, 2004. Ganz T.: Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nature Reviews. Immunology, 3(9), 710–720, 2003. Göbel T.W., Chen C.L., Shrimpf J., Grossi C.E., Bernot A., Bucy R.P., Auffray C., Cooper M.D.: Characterization of avian natural killer cells and their intracellular CD3 protein complex. European Journal of Immunology, 24(7), 1685-1691, 1994. Habig W. H., Pabst M. J., Jakoby W. B.: Glutathione S-transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry, 249(22), 7130–7139, 1974. Hale-McWilliams L.L, Cooksey A.M, Thaxton J.P, Pinchuk L.M, Pharr G.T.: Proteomic Evaluation of Avian Peripheral Blood Monocytes for Functional Proteins. International Journal of Poultry Science, 9(11), 1015-1022, 2010. Hamilton W.D., Zuk M.: Heritable true fitness and bright birds: a role for parasites? Science, 218(4570), 384-387, 1982. Harmon B.: Avian Heterophils in Inflammation and Disease Resistance, Poutry Science, 77, 972-977, 1998. Hancock R.E.W.: Peptide antibiotics. Lancet, 349(9049), 418–422, 1997. Hancock R.E.W., Chapple D.S.: Peptide antibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, 43(6), 1317–1323, 1999. Harwing S.S., Swiderek K.M., Kokryakov V.N.: Galinacins: Cysteine-rich antimikrobial peptides of chicken leukocytes. FEBS Letters, 342(3), 281-285, 1994. Helfenstein F., Losdat S., Møller A.P., Blount J.D., Richner H.: Sperm of colourful male are better protected against oxidative stress. Ecology Letters, 13(2), 213-222, 2010. Holmskov U., Thiel S., Jensenius J.C.: Collections and ficolins: humoral lectins of the innate immune defense. Annual Review of Immunology, 21, 547–578, 2003. Hõrak P., Saks L., Zilmer M., Karu U., Zilmer K.: Do dietary antioxidants alleviate the cost of immune activation? An experiment with greenfinches. The American Naturalist, 170(4), 625-635, 2007. Huber-Lang M., Sarma J.V., Zetoune F.S., Rittirsch D., Neff T.A., McGuire S.R., Lambris J.D., Warner R.L., Flierl M.A., Hoesel L.M., Gebhard F., Younger J.G., Drouin S.M.,Wetsel R.A., Ward P.A.: Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway. Nature Medicine, 12(6), 682-687, 2006 Hulbert A.J., Pamplona R., Buffenstein R., Buttemer W.A.: Life and death: metabolic rate, membrane composition and life span of animals. Physiological Reviews, 87(4), 1175213, 2007. Chew B. P., Park J. S.: Carotenoid action on the immune response. Journal of Nutrition, 134(1), 257-261, 2004. Inoue N., Fukui A., Nomura M., Matsumoto M., Nishizawa Y., Toyoshima K., Seya T.: A novel chicken membrane-associated complement regulatory protein: molecular cloning and functional characterization. Journal of Immunology, 166(1), 424–431, 2001. 95
Jain S.K., Levine S.N.: Elevated lipid peroxidation and vitamin E-quinone levels in heart ventricles of streptozotocin-treated diabetic rats. Free Radical Biology and Medicine, 18(2), 337–341, 1995. Jankovič B.D., Isakovič K., Lukič M.L., Vujanovič N.L., Petrovič S., Markovič B.M.: Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology, 29(3), 497-508, 1975. Jensen L.B., Koch C.: An assay for complement factor B in species at different levels of evolution. Developmental and Comparative Immunology, 15(3), 173–179, 1991. Jeurissen S.H.M., Janse E.M., Koch G., De Boer G.F.: Postnatal development of mucosaassociated lymphoid tissues in the chicken. Cell and Tissue Research, 258(1), 119–124, 1989. Keller L.H., Benson C.E., Krotec K., Eckroade R.J.: Salmonella enteritidis colonization of the reproductive tract and forming and freshly laid eggs of chickens. Infection and Immunity, 63(7), 2443–2449, 1995. Kendall M.D. : Avian thymus glands: a review. Developmental and Comparative Immunology, 4(2), 191–210, 1980. Kimijima T., Hashimoto Y., Kitagawa H., Kon Y., Sugimura M.: Localization of immunoglobulins in the chicken oviduct. Nippon Juigaku Zasshi, The Japanese Journal of Veterinary Science, 52(2), 299–305, 1990. Kitagawa H., Shiraishi S., Imagawa T., Uehara M.: Ultrastructural characteristics and lectinbinding properties of M cells in the follicle-associated epithelium of chicken caecal tonsils. Journal of Anatomy, 197, 607–616, 2000. Kjalke M., Welinder K.G., Koch C.: Structural analysis of chicken factor B-like protease and comparison with mammalian complement proteins factor B and C2. Journal of Immunology, 151(8), 4147–4152, 1993. Kogut M.H., Holtzapple C., Lowry V.K., Genovese K., Stanker L.H.: Functional responses of neonatal chicken and turkey heterophils following stimulation by inflammatory agonists. American Journal of Veterinary Research, 59(11), 1404-1408, 1998. Koch C.: A genetic polymorphism of the complement component factor B in chickens not linked to the major histocompatibility complex (MHC). Immunogenetics, 23(6), 364–367, 1986. Krinsky N. I.: Carotenoids as antioxidants. Nutrition,17(10), 815-817, 2001. Lachmann P.J., Hughes-Jones N.C.: Initiation of complement activation. Springer Seminars in Immunopathology, 7(2-3), 143–162, 1984. Laursen I., Koch C.: Purification of chicken C3 and a structural and functional characterization. Scandinavian Journal of Immunology, 30(5), 529–538, 1989. Lehrer R.I., Lichtenstein A.K., Ganz T.: Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells. Annual Review of Immunology, 11, 105–128, 1993. Lie O., Syed M., Solbu H.: Improved agar plate assays of bovine lysozyme and haemolytic complement activity. Acta Veterinaria Scandinavica, 27(1), 23-32, 1986.
96
Lind P.J., Wolff P.L., Petrini K.R., Keyler, C.W., Olson D.E., Redig, P.T.: Morphology of the eosinophil in raptors. Journal of the American Association of Veterinarians, 4, 33–39, 1990. Losdat S., Helfenstein F., Gaude B., Richner H.: Reproductive effort transiently reduces antioxidant capacity in a wild bird, Behavioral Ecology, 22(6), 1218-1226, 2011. Lozano G. A.: Carotenoids, parasites, and sexual selection. Oikos, 70(2), 309-311, 1994. Lynch N.J., Khan S.U., Stover C.M., Sandrini S.M., Marston D., Presanis J.S., Schwaeble, W.J.: Composition of the lectin pathway of complement in Gallus gallus: absence of mannan-binding lectin-associated serine protease-1 in birds. Journal of Immunology, 174(8), 4998–5006, 2005. Marklund S., Marklund G.: Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. European Journal of Biochemistry, 47(3), 469-547, 1974. Martínez-Padilla J., Mougeot F., Pérez-Rodríguez L., Bortolotti G.R.: Nematode parasites reduce carotenoid-based signalling in male red grouse. Biology Letters, 3(2), 161164, 2007. Masteller E.L., Thompson C.B.: B cell development in the chicken. Poultry Science, 73(7), 998–1011, 1994. Matsushita M., Fujita T.: Ficolins and the lectin complement pathway. Immunological Reviews, 180(1), 78–85, 2001. Matsushita M., Fujita T.: The role of ficolins in innate immunity. Immunobiology, 205(4-5), 490–497, 2002. Mavroidis M., Sunyer J.O., Lambris J.D.: Isolation, primary structure, and evolution of the third component of chicken complement and evidence for a new member of the alpha 2-macroglobulin family. Journal of Immunology, 154(5), 2164–2174, 1995. Maxwell M.H., Siller W.G.: The ultrastructural characteristics of the eosinophil granules in six species of domestic bird. Journal of Anatomy, 112(2), 289–303, 1972. Maxwell M.H.: An ultrastructural comparison of the mononuclear leucocytes and thrombocytes in six species of domestic bird. Journal of Anatomy, 117(1), 69–80, 1974. Maxwell M.H., Robertson G.W.: The avian basophilic leukocyte: a review. World's Poultry Science Journal, 51(3), 307-325, 1995. Maxwell M.H., Robertson G.W.: The avian heterophil leucocyte: A review . Worlds Poultry Science Journal, 54(2), 155-178, 1998. McGraw K. J., Ardia D. R.: Carotenoids, immunocompetence, and the information content of sexual colors: an experimental test. The American Naturalist, 162(6), 704 -712, 2003. Meyer R.K., Rao M.A., Aspinall R.L.: Inhibition of the development of the bursa of Fabricius in the embryos of the common fowl by 19-nortestosterone. Endocrinology, 64(6), 890-897, 1959
97
Montgomery R.D., Maslin W.R.: The effect of Harderian adenectomy on the antibody response in chickens. Avian Diseases, 33(3), 392–400, 1989. Moretti E., Capitani S., Figura N., Pammolli A., Federico M.G., Giammerini V., Collodel G.: The presence of bacteria species in semen and sperm quality. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 26(1), 47-56, 2009. Muir W.I., Bryden W.L., Husband A.J.: Investigation of the site of precursors for IgAproducing cells in the chicken intestine. Immunology and Cell Biology, 78(3), 294–296, 2000. Myers R.K., Arp L.H.: Pulmonary clearance and lesions of lung and air sac in passively immunized and unimmunized turkeys following exposure to aerosolized Escherichia coli. Avian Diseases, 31(3), 622–628, 1987. Nagy N., Oláh I.: Pyloric tonsil as a novel gut-associated lymphoepithelial organ of the chicken. Journal of Anatomy, 211(3), 407–411, 2007. Oláh I., Glick B.: Meckel’s Diverticulum. I. Extramedullary myelopoiesis in the yolk sac of hatched chickens (Gallus domesticus). The Anatomical Record, 208(2), 243–252, 1984. Oláh I., Nagy N., Magyar A., Palya V.: Esophageal tonsil: a novel gut-associated lymphoid organ. Poultry Science, 82, 767–770, 2002. Olson V. A., Owens I. P. F.: Costly sexual signals: are carotenoids rare, risky or required. Trends in Ecology and Evolution, 13(12), 510-514, 1998. Pamplona R., Barja G., Portero-Otín M.: Membrane fatty acid unsaturation, protection against oxidative stress, and maximum life span: a homeoviscous-longevity adaptation? Annals of the New York Academy of Sciences, 959, 475-490, 2002. Pizzari T., Worley K., Burke T., Froman D.: Sperm competition dynamics: ejaculate fertilising efficiency changes differentially with time. BMC Evoluonary Biology, 8(332), 2008. Poiani A.: Complexy of seminal fluid: a review. Behavioral Ecology and Sociology, 60, 289310, 2006. Rausch P. G., Moore T.G: Granule enzymes of polymorphonuclear neutrophils: A phylogenetic comparison. Blood, 46(6), 913–919, 1975. Recheis B., Rumpler H., Schneider W.J., Nimpf J.: Receptor-mediated transport and deposition of complement component C3 into developing chicken oocytes. Cellular and Molecular Life Sciences, 62(16), 1871–1880, 2005. Rider S.A., Davies S.J., Jha A.N., Fisher A.A., Knight J., Sweetman J.W.: Supranutritional dietary intake of selenite and selenium yeast in normal and stressed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): implications on selenium status and health responses. Aquaculture, 295, 282–291, 2009. Rowe M., Czirják G.Á., McGraw K.J., Giraudeau M.: Sexual ornamentation reflects antibacterial aktivity of ejaculates in mallards, Biology Letters, 7(5), 740-742, 2011. Shimizu M., Watanabe Y., Isobe N., Yoshimura Y.: Expression of avian β-defensin 3, an antimicrobial peptide, by sperm in the male reproductive organs and oviduct in chickens: an immunohistochemical study. Poultry Science, 87(12), 2653-2659, 2008.
98
Schaffner T., Mueller J., Hess M.W., Cottier H., Sordat B., Ropke C.: The bursa of Fabricius: a central organ providing for contact between the lymphoid system and intestinal content. Cellular Immunology, 13(2), 304–312, 1974. Sies H.: Oxidative stres: oxidants and antioxidants. Experimental Physilogy, 82, 291-295, 1997. Sild E., Hõrak P.: Assessment of oxidative burst in avian whole blood samples: validation and application of a chemiluminescence method based on Pholasin. Behaviorla Ecology and Sociobiology, 64(12), 2065–2076, 2010. Sild E., Sepp T., Männiste M., Hõrak P.: Carotenoid intake does not affect immunestimulated oxidative burst in greenfinches. Journal of Experimental Biology, 214(20), 346773, 2011a. Sild E., Sepp T., Hõrak P.: Behavioural trait covaries with immune responsiveness in a wild passerine. Brain, Behaviour and Immunity, 25(7), 1349-1354, 2011b. Slavíková H., Lojek A., Hamar J., Duškova M., Kubala L., Vondráček J., Číž M.: Total antioxidant capacity of serum increased in early but not late period after intestinal ischemia in rats. Free Radical Biology and Medicine, 25(1), 9–18, 1998. Snook R.R.: Sperm in competition: not playing by the numbers. Trends in Ecology and Evolution, 20(1), 46-53, 2005. Song W.C., Sarrias M.R., Lambris J.D.: Complement Ummunopharmacology, 49(1-2), 187-198, 2000.
and
innate immunity.
Sotirov L., Dimitrov S., Jeliazkov E.: Semen lysozyme levels and semen quality in Turkeys (Meleagris gallopavo) fed with various dietary protein levels. Revue de Medicine Veterinaire, 153(12), 815-818, 2002. Stabler J.G., McCormick T.W., Powell K.C., Kogut M.H.: Avian heterophils and monocytes: phagocytic and bactericidal activities against Salmonella enteritidis. Veterinary Microbiology, 38(4), 293-305, 1994. Styrt B.: Species variation in neutrophil biochemistry and function. Journal of Leukocyte Biology, 46(1), 63–74, 1989. Sturkie P.D.: The reputed reservoir function of the spleen of the domestic fowl. American Journal of Physiology, 138(4), 599–602, 1943. Tang Y.-Q., Yuan J., Ösapay G., Ösapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., Selsted M.E.: A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated a-defensins. Science, 286(5439), 498–502, 1999. Temperley, N. D., Berlin, S., Paton, I. R., Griffin, D. K., Burt, D. W.: Evolution of the chicken Toll-like receptor gene family: A story of gene gain and gene loss. BMC Genomics, 9(62), 2008. Tremellen K.: Oxidative stress and male infertility – a clinical perspective. Human Reproduction Update, 14(13), 243-258, 2008. Van Alstine W.G., Arp L.H.: Histologic evaluation of lung and bronchus-associated lymphoid tissue in young turkeys infected with Bordetella avium. American Journal of Veterinary Research, 49(6), 835–839, 1988. 99
van Dijk A., Veldhuizen E.J.A., Haagsman H.P.: Avian defensins. Veterinary Immunology and Immunopathology, 124(1-2), 1-18, 2008. von Schantz T. V., Bensch S., Grahn M., Hasselquist D., Wittzell H.: Good genes oxidative stress and condition-dependent sexual signals. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 266(1414),1 -12, 1999. Wathen L.K., LeBlanc D., Warner C.M., Lamont S.J., Nordskog A.W.: A chicken sexlimited protein that crossreacts with the fourth component of complement. Poultry Science, 66(1), 162–165, 1987. Westneat D.F., Rambo T.B.: Copulation exposes female red-winged blackbirds to backteria in male semen. Journal of Avian Biology, 31(1), 1-7, 2000. White J., Mirleau P., Danchin E., Mulard H., Hatch S.A., Heeb P., Wagner R.H.: Sexually transmitted bacteria affect female cloacal assemblages in a wild bird. Ecology Letters, 13(12), 1515-1524, 2010. Withanage G.S.K., Baba E., Sasai K., Fukata T., Kuwamura M., Miyamoto T., Arakawa A.: Localization and enumeration of T and B lymphocytes in the reproductive tract of laying hens. Poultry Science, 76(5), 671–676, 1997. Yudin A.I., Generao S.E., Tollner T.L., Treece C.A., Overstreet J.W., Cherr G.N.: Betadefensin 126 on the cell surface protects sperm from immunorecognition and binding of antisperm antibodies. Biology of Reproduction, 73(6), 1243-1252, 2005. Zarkadis I.K., Mastellos D., Lambris J.D.: Phylogenetic aspects of the complement system. Developmental and Comparative Immunology, 25(8-9), 745-762, 2001. Zasloff M.: Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature, 415(6870), 389–395, 2002. Zheng W.M., Yoshimura Y.: Localization of macrophages in the chicken oviduct: effects of age and gonadal steroids. Poultry Science, 78(7), 1014–1018, 1999. Zheng W.M., Nishibori M., Isobe N., Yoshimura Y.: An in situ hybridization study of the effects of artificial insemination on the localization of cells expressing MHC class II mRNA in the chicken oviduct. Reproduction, 122(4), 581-586, 2001. Knížky: Clark P., Boardman W., Raidal S.: Atlas of Clinical Avian Hematology, Wiley-Blackwell, United Kingdom, 1st edition, pp. 1-183, 2009. Červený Č.: Veterinární anatomie, základy anatomie domácích ptáků, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Fakulta veterinárního lékařství, pp. 1-189, 2000. Day M.J., Schultz R.D.: Veterinary imunology Principles and practise, Manson Publishing Ltd, London, 1st edition, pp. 1-256, 2011. Davison F., Kaspers B., Schat K.A.: Avian Immunology, Elsevier Ltd., London, pp. 1-248, 2008. Hořejší V., Bartůňková J.: Základy imunologie, TRITON, Praha, 4th edition, pp. 1-316, 2009. 100
Lanza R., Gearhart J., Hogan B., Melton D., Pedersen R., Thomas E.D., Thomson J., Wilmut I.: Essentials of Stem Cell Biology, Academic Press in an imprint of Elsevier, USA, 2nd edition, pp. 1-600, 2009. Lucas A.M., Jamroz C.: Atlas of Avian Hematology, United States Department of Agriculture, Washington, pp. 1-271, 1961. Toman M. a kol.: Veterinární imunologie, Grada Publishing, a.s., Praha, 2nd edition, pp. 1-377, 2009. Turner R.J.: Immunology – A Comparative Approach, Johe Wiley and sons, Ltd., New York, pp. 1-236, 1994.
15. Internetové zdroje URL 1 URL 2 URL 3 URL 4 URL 5 URL 6 URL 7 URL 8 URL 9 URL 10 URL 11 URL 12 URL 13
http://www.birdlife.cz/index.php?ID=51 http://www.calier.es/cgibin/html/en/wview_n.pl?p_file=20080407104636_id&p_cat=id&top_inf=.. http://partnersah.vet.cornell.edu/avian-atlas/search/lesion/440 http://www.poultrydisease.ir/Atlases/avian-atlas/search/lesion/446.html http://people.eku.edu/ritchisong/birdcirculatory.html http://ocw.tufts.edu/Content/60/lecturenotes/799016 http://mad-physio.blogspot.cz/2010/07/what-is-infection-physical-barriers-and.html http://www.tutorvista.com/content/biology/biology-iv/immune-system/immunity.php http://www.1egg1world.org/1egg1world/1egg1world_-_Eleventh_Trade.html http://www.sojourneyfarm.com/freerangechickenseggs.htm http://www.ireceptar.cz/zvirata/ptaci/ptaci-na-krmitku-i-sykora-konadra/ http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id180738/?taxonid=21394&type=1 http://toshuo.com/2006/whats-the-airspeed-velocity-of-an-unladen-chinese-swallow/
101
16. Příloha Str. P1-P11 Grafické znázornění průběhu respiračního vzplanutí hnízd 21-41. Pokračování kapitoly 16.1.1.1. Porovnávání variability v imunitní odpovědi na LPS mezi jedinci v rámci hnízda.
Str. P12/P13 Prezentace výsledků z konference Zoologické dny 2013 (Brno).
102
4000
S 80
3000
S 81
2000
S 82
1000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 21 S.enterica
Čas (s)
Jedinec
Pík
Integrál
S 80
1 869
303 016
S 81
3 060
367 528
S 82
3 371
464 875
Jedinec S 80
Pík 413
Integrál 39 831
S 81
547
44 437
S 83
589
51 695
800
S 80
600
S 81
400
S 83
200
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 21 E.coli
Čas (s)
4000
S 84
3000
S 85
2000
S 86
1000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 22 S.enterica
Čas (s)
S 84 1 752 S 85 895 S 86 3 703
79 423 142 529 351 579
S 84 2 954 S 85 313 S 86 895 S 87 768
271 619 23 201 46 939 50 769
2000
S 84
1500
S 85
1000
S 86
500
S 87
Čas (s)
P1
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 22 E.coli
Blank
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 88 S 89 S 90 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 23 S.enterica
Čas (s)
S 88 2 545 S 89 3 802 S 90 4 495
271 127 435 289 587 048
S 88 374 S 89 1 216 S 91 551
36 469 89 463 48 941
S 92 4 746 S 93 12 199 S 94 5 415
468 236 776 962 589 953
S 92 S 93 S 95
74 632 39 963 40 258
1500
S 88
1000
S 89
500
S 91 Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
18
35
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 23 E.coli
Čas (s)
15000
S 92
10000
S 93
5000
S 94 Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 24 S.enterica
Čas (s)
800
S 92
600
S 93
400
S 95
200
Blank Čas (s)
P2
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 24 E.coli
650 497 574
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 96 S 97 S 98 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminisce (RLU)
Hnízdo 25 S.enterica
Čas (s)
S 96 709 S 97 1 844 S 98 4 485
124 665 277 725 515 499
S 96 S 97 S 99
17 294 30 858 56 088
1500
S 96
1000
S 97
500
S 99 Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 25 E.coli
Čas (s)
343 686 1295
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 100 S 101 S 102 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 26 S.enterica
Čas (s)
S 100 S 101 S 102
3 146 3 376 4 422
474 209 535 892 518 045
S 100 S 101 S 103
925 1 224 1 136
41 778 54 415 50 126
1500
S 100
1000
S 101
Čas (s)
P3
183
166
150
133
117
100
84
68
Blank 51
0 35
S 103 18
500 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 26 E.coli
2500 2000 1500 1000 500 0
S 104 S 105 S 106 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 27 S.enterica
Čas (s)
S 104 S 105 S 106
1 508 1 013 2 202
203 159 119 038 299 327
S 104 S 105 S 107
710 422 540
36 721 29 377 40 888
S 108 S 109 S 110
5 990 592 2 616
402 506 99 089 347 721
S 108 S 109 S 111
1 124 382 902
57 723 23 859 47 730
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 27 E.coli 800
S 104
600
S 105
400
S 107
200
Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
8000
S 108
6000
S 109
4000
S 110
2000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 28 S.enterica
Čas (s)
1500
S 108
Čas (s)
P4
183
166
150
133
117
100
Blank 84
0 68
S 111 51
500 35
S 109
18
1000
2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 28 E.coli
8000
S 112
6000
S 113
4000
S 114
2000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 29 S.enterica
Čas (s)
S 112 S 113 S 114
3 333 5 251 6 969
300 169 604 452 598 032
S 112 S 113 S 115
581 1 210 688
33 606 65 401 41 270
S 116 S 117
2 611 1 799
434 000 271 242
S 116 S 117 S 118
1 599 594 1 647
69 581 34 077 69 153
183
166
150
133
117
Blank 100
0 84
S 115 68
500 51
S 113
35
S 112
1000
18
1500
2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 29 E.coli
Čas (s)
3000 S 116
2000
S 117 1000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 30 S.enterica
Čas (s)
2000
S 116
1500
S 117
1000
S 118
500
Blank
Čas (s)
P5
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 30 E.coli
4000
S 119
3000
S 120
2000
S 121
1000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 31 S.enterica
Čas (s)
S 119 S 120 S 121
893 3 140 1 987
150 713 408 424 297 903
S 119 S 120 S 122
699 860 1 007
43 248 47 735 52 063
S 123 S 124 S 125
1 984 5 723 2 147
221 857 423 600 352 870
S 123 S 124 S 126
614 1 324 1 324
36 090 64 233 65 122
1500
S 119
183
166
150
133
117
100
Blank 84
0 68
S 122 51
500 35
S 120
18
1000
2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 31 E.coli
Čas (s)
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 32 S.enterica 8000
S 123
6000
S 124
4000
S 125
2000
Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 32 E.coli 1500
S 123
1000
S 124
500
S 126 Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
P6
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 33 S.enterica 2000
S 127
1500
S 128
1000
S 129
500
Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
S 127 S 128 S 129
986 817 1 659
171 999 137 445 250 068
S 127 S 128 S 130
498 535 616
29 388 29 668 34 719
S 131 S 132 S 133
3 864 8 186 1 817
289 584 546 384 210 335
S 131 S 132 S 134
571 822 955
34 028 44 142 48 768
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 33 E.coli 800
S 127
600
S 128
400
S 130
200
Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 34 S.enterica 10000 8000 6000 4000 2000 0
S 131 S 132 S 133 Blank 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 34 E.coli 1500
S 131
1000
S 132
500
S 134 Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
P7
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 35 S.enterica 8000
S 135
6000
S 136
4000
S 137
2000
Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
S 135 S 136 S 137
1 092 3 578 7 349
142 584 266 207 541 640
S 135 S 136 S 138
617 1 372 1 733
33 348 55 260 76 420
S 139 S 140 S 141 S 142 S 143 S 144
3 113 1 986 1 544 1 078 1 247 2 590
487 033 274 072 228 329 130 879 186 722 368 966
S 139 S 140 S 141 S 142 S 145 S 146
621 559 602 184 519 1 016
56 434 43 583 32 509 16 416 41 509 52 934
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 35 E.coli 2000
S 135
1500
S 136
1000
S 138
500
Blank
0 2 18 35 51 68 84 100 117 133 150 166 183 Čas (s)
4000 3000 2000 1000 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 36 S.enterica S 139 S 140 S 141 S 142 S 143 S 144 Blank
Čas (s)
1500 1000 500
Čas (s)
P8
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 36 E.coli S 139 S 140 S 141 S 142 S 145 S 146 Blank
4000
S 147
3000
S 148
2000
S 149
1000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 37 S.enterica
Čas (s)
S 147 S 148 S 149
2 044 2 353 3 511
259 121 358 819 318 302
S 147 S 148 S 150
411 640 699
46 484 53 115 65 637
S 151 S 152 S 153
2 193 3 894 4 445
206 329 418 949 356 972
S 151 S 152 S 154
301 692 553
31 527 49 940 50 665
800
S 147
600
S 148
400
S 150
200
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 37 E.coli
Čas (s)
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 151 S 152 S 153 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 38 S.enterica
Čas (s)
800
S 151
600
S 152
400
S 154
200
Blank
Čas (s)
P9
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 38 E.coli
5000 4000 3000 2000 1000 0
S 155 S 156 S 157 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 39 S.enterica
Čas (s)
S 155 S 156 S 157
1 853 2 341 4 103
242 041 361 024 449 515
S 155 S 156 S 158
309 380 460
34 395 39 743 49 428
S 159 S 160 S 161
2 609 5 743 3 895
298 809 456 839 497 810
S 159 S 160 S 162
339 549 427
36 299 46 572 40 771
500 400 300 200 100 0
S 155 S 156 S 158 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
Blank 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 39 E.coli
Čas (s)
8000
S 159
6000
S 160
4000
S 161
2000
Blank 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 40 S.enterica
Čas (s)
600 S 159
400
S 160 200
S 162
Čas (s)
P10
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 40 E.coli
Blank
8000 6000 4000 2000 183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 41 S.enterica
S 163 S 164 S 165 S 166 S 167 S 168 Blank
Čas (s)
S 163 S 164 S 165 S 166 S 167 S 168
2 117 4 644 5 758 3 991 2 455 5 465
304 678 409 817 702 499 524 220 327 754 530 627
S 163 S 164 S 165 S 166 S 169 S 170
502 745 915 925 281 920
56 571 88 262 55 759 57 640 34 961 66 051
Čas (s)
P11
183
166
150
133
117
100
84
68
51
35
18
1000 800 600 400 200 0 2
Luminiscence (RLU)
Hnízdo 41 E.coli S 163 S 164 S 165 S 166 S 169 S 170 Blank
Metodika sledování vrozené imunity ptáků PROKOPOVÁ L.(1),VINKLEROVÁ J.(2),VINKLER M.(2),HYRŠL P.(1) (1) Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno; (2) Katedra zoologie, PřF UK, Praha Imunitní systém ptáků jakožto jeden ze základních homeostatických mechanismů organismu zahrnuje stejně jako u ostatních živočichů imunitu nespecifickou a specifickou. Předmětem našeho zájmu se staly mechanismy imunity nespecifické, které dále dělíme na složku humorální a buněčnou. Humorální složku zde představuje především komplementový systém, jehož antibakteriální aktivitu měříme pomocí geneticky modifikované bakterie Escherichia coli K12 emitující světlo. Princip metody je založen na měření kinetiky úbytku luminiscence v závislosti na baktericidních účincích komplementového systému, přičemž míra bakteriální luminiscence je úměrná jejich viabilitě. Jako další součást humorální složky můžeme jmenovat lysozym, hydrolytický enzym, jehož inhibiční aktivita je nejsilnější proti G+ bakteriím a jehož koncentraci lze stanovit pomocí radiální difúze. V rámci složky buněčné se naše pozornost zaměřila především na proces fagocytózy, během níž jsou uplatňovány dva typy mechanismů – na kyslíku závislé a nezávislé. Zatímco u většiny obratlovců je preferován mechanismus oxidativní, u ptáků je v důsledku absence myeloperoxidázy a katalázy heterofilů přednostně využíván mechanismus neoxidativní. Naše metoda měření produkce volných kyslíkových radikálů je založena na reakci citlivého luminoforu, konkrétně Pholasinu, jejímž výsledkem je luminiscenční signál úměrně závislý na aktivitě fagocytózy. Jako aktivátory byly zvoleny lipopolysacharidy pocházející z buněčných stěn gramnegativních bakterií Escherichia coli a Salmonella enterica. Pozorované reakce vykazovaly znatelně odlišné vlastnosti. Ty se týkaly jak rychlosti reakce, tak i její velikosti a průběhu. Pro optimalizace metod jsme použili krevní vzorky kura domácího (Gallus gallus f. domestica) a pro porovnání produkce kyslíkových radikálů fagocyty jsme odebírali krev 15 dní starých mláďat sýkor koňader (Parus major). Tato práce byla podpořena granty GAČR P506/12/2472 a P505/10/1871.
P12
P13
