VLIV VYBRANÝCH TĚŽKÝCH KOVŮ NA RŮZNÉ

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

VLIV VYBRANÝCH TĚŽKÝCH KOVŮ NA RŮZNÉ GENOTYPY LNU SETÉHO

Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Prof. RNDr. Ladislav Havel, CSc.

Bc. Martina Čížková

Brno 2009

Zde bude ZADÁNÍ PRÁCE

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv vybraných těžkých kovů na různé genotypy lnu setého vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

dne………………………………… podpis diplomanta………………....

PODĚKOVÁNÍ

Tímto bych chtěla poděkovat prof. RNDr. Ladislavu Havlovi, CSc., vedoucímu mé diplomové práce, dále paní Elišce Jaškové, Mgr. Václavu Diopanovi a Bc. Ondřeji Zítkovi.

ABSTRAKT Len jako plodina s komplexním technickým využitím je perspektivní rostlinou vhodnou pro fytoremediace kontaminovaných půd. Práce byla zaměřena na charakterizaci a

srovnání

hydroponicky

pěstovaných

klíčních

rostlin

lnu

setého

(Linum

usitatissimum L.) z hlediska vlivu těžkého kovu - kadmia. Zaznamenali jsme toxický efekt kadmia na růst rostlin, průkazný byl inhibiční vliv kadmia na růst hlavního kořene a vývoj bočních kořenů. Cílem bylo na základě morfometrických měření vybrat z devatenácti testovaných odrůd čtyři citlivé a naopak čtyři tolerantní, u kterých jsme dále systémem HPLC s elektrochemickou detekcí analyzovali obsahy obranných thiolových látek v jednotlivých částech rostlin. Cysteinu a redukovaného glutathionu jsme naměřili více v kořenové části, zatímco fytochelatiny se vyskytovaly více v nadzemní části. Vztah obsahu thiolových látek s tolerancí/senzitivitou odrůd je stále nejasný, i když mezi nejcitlivější odrůdou Agatha a nejvíce tolerantní odrůdou Bonet byl výrazný rozdíl v celkovém obsahu PC, přičemž více jej akumulovala odrůda tolerantní. Klíčová slova: toxické kovy, kadmium, Linum usitatissimum L., fytoremediace, thiolové látky, glutathion, fytochelatiny

ABSTRACT The prevalence of industrial exploitation of flax (Linum usitatissimum L.) predeterminates this crop for the phytoremediation of soils polluted by heavy metals. In this paper, the aim was to describe the variability of flax and linseed in relation to heavy metal tolerance. The effect of cadmium on flax growth was studied. Cadmium inhibited primarily the root growth rate. On the base of morfometrical data, four sensitive and four tolerant cultivars were chosen for the detection of thiol compounds. The chosen technique was high performance liquid chromatography with electrochemical detection. However the relationship between thiol content and tolerance or sensitivity of cultivars to heavy metals is still unclear, we show clear difference between most sensitive cultivar Agatha with lowest phytochelatins (PCs) content and most tolerant cultivar Bonet with highest PCs content. Keywords: heavy metals, cadmium, Linum usitatissimum L., phytoremedation, thiols, glutathion, phytochelatins

1 OBSAH 1

Obsah ........................................................................................................................ 6

2

Seznam zkratek ......................................................................................................... 8

3

Úvod.......................................................................................................................... 9

4

Cíl práce.................................................................................................................. 10

5

Teoretická část ........................................................................................................ 11 5.1

Pojem těžké kovy, vlastnosti............................................................................ 11

5.2

Zdroje těžkých kovů......................................................................................... 11

5.3

Příjem těžkých kovů rostlinou ......................................................................... 12

5.3.1

Příjem těžkých kovů kořeny ..................................................................... 12

5.3.2

Příjem těžkých kovů z atmosféry.............................................................. 13

5.4

Fytotoxicita kademnatých iontů....................................................................... 14

5.4.1

Vliv kadmia na růst a znaky rostlin, symptomy ....................................... 14

5.4.2

Molekulární podstata negativního vlivu těžkých kovů............................. 14

5.4.3

Akumulace a distribuce kadmia v rostlině................................................ 16

5.5

Obranné mechanismy rostlin proti těžkým kovům .......................................... 18

5.5.1 5.6

Fytoremediace .................................................................................................. 24

5.6.1 5.7

6

7

Buněčný mechanismus detoxikace těžkých kovů..................................... 18

Techniky fytoremediace ........................................................................... 25

Využití lnu setého ke studiu fytoremediace ..................................................... 27

5.7.1

Pěstování a sklizeň lnu.............................................................................. 27

5.7.2

Technické využití lnu................................................................................ 27

5.7.3

Vliv těžkých kovů na rostliny lnu setého.................................................. 28

5.7.4

Faktory chování kadmia v půdě a rostlině ................................................ 28

5.7.5

Akumulace kadmia u lnu setého ............................................................... 29

5.7.6

Možnosti zvýšení účinnosti fytoremediace u lnu ..................................... 30

Materiál a metody zpracování................................................................................. 32 6.1

Rostlinný materiál ............................................................................................ 32

6.2

Postup kultivace ............................................................................................... 32

6.3

Odběr vzorků pro analýzu a kvantitativní měření............................................ 33

6.4

Příprava vzorků ................................................................................................ 33

6.5

Analýza thiolových látek systémem HPLC-ED............................................... 33

Výsledky práce ....................................................................................................... 35

7.1

Vliv iontů kadmia na růst klíčních rostlin lnu setého, morfologická

charakteristika............................................................................................................. 35 7.2

Vliv iontů kadmia na růst kořenových a nadzemních částí klíčních rostlin lnu

setého .......................................................................................................................... 38 7.3

Výsledky kvalitativních měření – vliv iontů kadmia na obsah thiolových látek

klíčních rostlin lnu ...................................................................................................... 44 8

Diskuse.................................................................................................................... 53 8.1

Vliv iontů kadmia na růst jednotlivých částí klíčních rostlin .......................... 53

8.2

Vliv iontů kadmia na množství thiolových látek ............................................. 54

9

Závěr ....................................................................................................................... 57

10

Seznam použité literatury ....................................................................................... 58

11

Seznam obrázků...................................................................................................... 65

12

Seznam tabulek ....................................................................................................... 66

2 SEZNAM ZKRATEK Cys

cystein

DW

z angl. dry weight, sušina, také suchá hmotnost

EDTA

kyselina ethylendiaminotetraoctová

FW

z angl. fresh weight, hmotnost svěží hmoty

Glu

kyselina glutamová

Gly

glycin

GSH

redukovaný glutathion

GSSG

oxidovaný glutathion

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

IC50

ihnibiční koncentrace mající za následek 50% úhyn testovaných rostlin

PC, PC2, PC3 a PC4

fytochelatiny, číslo odpovídá opakování jednotky (Glu-Cys)

TK

těžké kovy

M

jednotka molární koncentrace, ekvivalentem, v této práci také užívaným, je mol.l-1

[8]

3 ÚVOD Těžké kovy představují skupinu rizikových prvků pro naše životní prostředí. Některé z těžkých kovů jsou pro organismy esenciální, ale v nadměrných koncentracích se projevuje jejich toxicita. Další těžké kovy působí toxicky již v nepatrném množství a biologickou funkci nemají. Díky své elementární povaze se těžké kovy v prostředí nerozloží, ale akumulují. Jejich toxické působení nás (resp. odborníky) podněcuje ke snaze omezit antropogenní zdroje těchto látek a snížit koncentrace těžkých kovů v půdách, atmosféře a vodním prostředí. Hledají se nejen možnosti, jak omezit vstup těžkých kovů do hospodářských plodin a potravního řetězce, ale také možnosti jak efektivně odstranit tyto kontaminace a revitalizovat znečištěnou půdu. Jednou z možností je fytoremediace, která vede ke zmíněnému cíli za pomocí rostlin. Aby byla fytoremediace co nejúčinnější, je nutné poznat mechanismy odezvy a obrany rostlin proti vyšším koncentracím těchto kovů. Pro různé aplikace se hledají nejvhodnější druhy rostlin či genotypy určitých druhů. Výběr vhodné rostliny je poměrně náročný, protože musí zohledňovat velké množství hledisek. Poté co vybereme rostlinu s ohledem na její vlastnosti, například množství biomasy a schopnosti akumulace, musíme dále zohledňovat podmínky stanoviště, dostupnost a efektivnost agronomických technik i možnosti dalšího zpracování po sklizni. Vhodnými rostlinami pro fytoremediace mohou být např. technické plodiny, tj. u nás v Evropě len a konopí. Jsou to plodiny s komplexním technickým využitím téměř celé rostliny a zvládnutou agrotechnikou, což významně snižuje celkové finanční náklady na fytoremediaci. V této diplomové práci jsme se zabývali vlivem těžkého kovu – kadmia – na klíční rostliny lnu setého, a to právě z důvodu výběru nejvhodnějších odrůd pro účely fytoremediace či dalších studií.

Práce na tomto projektu byla podpořena výzkumným centrem „Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin“ 1M06030.

[9]

4 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo zjistit vliv iontů kadmia u vybraných genotypů lnu setého:


na kvalitativní i kvantitativní znaky vyvíjejících se rostlin




na obsah thiolových látek, jejichž syntéza je přítomností těžko kovu indukována.

[10]

5 TEORETICKÁ ČÁST 5.1 Pojem těžké kovy, vlastnosti Definice pojmu těžké kovy není u různých autorů zcela jednotná. Někteří autoři definují těžké kovy jako prvky s hustotou vyšší než 5 g.cm-3 (Cibulka 1991, Pierzynski, 2000, Schulze, 2005, Adriano, 2001 aj.). Další autoři je definují jako skupinu, do které spadá většina přechodných kovů, cín, olovo a některé polokovy (As, Se), lanthanoidy a aktinoidy či lehký kov hliník (Alloway,1990; Kalač a Tříska, 1998). Adriano (2001) pokládá za tzv. těžké kovy tyto: As, Ag, B, Ba, Be, Cd, Co, Cr, Cu, F, Hg, Mn, Mo, Ni, Pb, Sb, S, Tl, v a Zn. Podle Schulze (2005) se do této skupiny nehodí bor a fluor (F ani není kov, ale halogen). Schulze (2005) a další autoři rozšiřují definici o prvky Ti, Ag, Fe, Pt, Zr. Nejznámější prvky těžkých kovů patří mezi prvky přechodné. Mnohé přechodné prvky jsou v nižších koncentracích esenciální pro organismy. Tyto prvky mohou být donory i akceptory elektronů, mohou fungovat jako oxidační i redukční činidla. Mezi těžké kovy ale nepatří jen nenahraditelné esenciální mikroprvky, ale také prvky bez biologické funkce, působící toxicky. Avšak i esenciální kovy se při určité koncentraci mohou stát toxickými (Borovik, 1990). Právě z hlediska esenciality řadí White (1997) těžké kovy takto:  esenciální mikroprvky důležité pro rostliny, např. Cu, Mn, Mo, Zn, Co pokud překročí adekvátní koncentraci, stávají se škodlivými  prvky esenciální pro živočichy, nikoliv pro rostliny, např. Cr  prvky neesenciální, nejsou potřebné pro život rostlin ani živočichů, toxické jsou již v nízkých koncentracích, přibližně nad několik mg na kg hmotnosti organismu, nejvýznamnější je Pb, Cd, Ni, Hg, As, V.

5.2 Zdroje těžkých kovů Kontaminace životního prostředí anorganickými i organickými xenobiotiky je závažným dlouhodobým a komplexním problémem. Jednou ze skupin xenobiotik jsou právě těžké kovy. Ty se přirozeně vyskytují v přírodě v horninách a nerostech (White, 1997), a tak je v malém množství můžeme najít ve všech půdách (Pierzynski, 2000). Zdroje kontaminace atmosféry mohou být přirozeného původu – sopečná činnost, větrná eroze, lesní požáry. Koncentrace těžkých kovů se však začaly zvyšovat nad [11]

přirozenou

neškodnou

mez

v souvislosti

s průmyslovou

činností

člověka.

Kontaminované jsou odpadní vody, atmosféra i půda. Znečištění i relativně nízkými koncentracemi způsobuje všem organismům včetně člověka vážné problémy. Problematika těžkých kovů je dlouhodobou záležitostí, protože jde o prvky, které nelze žádným způsobem degradovat a přeměnit, a které mají navíc schopnost biosorpce a bioakumulace v potravním řetězci (Gloser a Prášil, 1998; Sanitta di Toppi a Gabbrielli, 1999). Ke znečištění nejvýznamněji přispívají tepelné elektrárny, energetický průmysl (výroba baterií), metalurgie (těžba a tavení rud, pokovování), doprava, chemický průmysl, mikroelektronika, zemědělská činnost (pesticidy, fosforečná hnojiva, používání čistírenských kalů), skládkování (Seward a Richardson, 1990; Raven a Loeppert, 1997; Gloser, Prášil, 1998; Adriano, 2001; Larcher, 2003; Tlustoš a kol., 2005). Obzvláště v půdě je odstranění kontaminace zdlouhavá práce na mnoho desítek let. Je nutné omezovat další vstupy těžkých kovů do životního prostředí. Naštěstí koncentrace rizikových prvků v atmosférických zdrojích postupně klesají. Potvrzuje to například monitoring atmosférických depozic prováděný ÚKZÚZ Brno od roku 1993 v rámci celé ČR. Nejvyšší pokles byl zaznamenán u niklu, chrómu i arsenu. Relativně nejméně poklesla depozice kadmia (Tlustoš a kol., 2005), proto považujeme tento prvek v současné době za stálé nebezpečí pro životní prostředí.

5.3 Příjem těžkých kovů rostlinou 5.3.1 Příjem těžkých kovů kořeny Těžké kovy se nejčastěji vyskytují jako kationty (tedy kromě metalloidů tj. As, Sb a Se a kovů Mo a V), adsorpce kationtů v půdě tak závisí na hustotě negativních nábojů na povrchu půdních částic či na kationové výměně (Alloway, 1990). Rostlina přijímá jen ty kovy, které jsou pro ni dostupné. Řada iontů může být přijímána přímo kořeny rostlin z půdního roztoku (ionty se nachází ve volné iontové či chelatované formě), dále výměnnou absorpcí adsorbovaných iontů (výměna iontů z částic pomocí H+) a zpřístupňováním iontů vázaných v půdní zásobě (mobilizace exudáty - okyselením H+ ionty a organickými kyselinami či jinými chelatotvornými látkami – např. fytosiderofory, syntetické EDTA). Zpřístupňování vázaných iontů se neúčastní jen procesy vlastní rostlině, ale také i činnost hub a mikroorganismů v okolí kořenů (Alloway, 1990; Clemens a kol., 2002). Uvolňování prvku do půdního roztoku může

[12]

být ovlivněno celou řadou faktorů prostředí. Tedy celkovým obsahem prvků v půdě, jejich formami, ale i dalšími faktory, jako jsou půdní druh, kationtová výměnná kapacita (KVK), kvalita a kvantita organické hmoty, pH, redoxní potenciál půdy a teplota či stupeň provzdušnění (Alloway, 1990; Adriano, 2001; Seregin a Ivanov, 2000; Kabata Pendias, 2001). Je například známo, že těžké kovy se snadněji uvolňují v kyselých půdách (Nátr, 1998; Adriano, 2001). Tlustoš a kol. (2006) uvádějí, že při změně hodnoty pH kontaminované půdy z 5,7 na 7,3 poklesl mobilní podíl zinku v půdě o 70 %, kadmia o 50 % a olova o 20 %. Kovy jsou také méně přístupné po vazbě na dostatečné množství organického materiálu (Cibulka a kol., 1991), tedy přesněji - huminové kyseliny fungují imobilizačně, zatímco fulvokyseliny a ostatní nízkomolekulární organické látky mohou s kovy tvořit rozpustné komplexy (Prasad a Hagemeyer, 1999). Obecně vyšší sorpční kapacita jílovitých půd má za následek nižší příjem prvků rostlinami ve srovnání s půdami písčitými. Prvky v půdě se vzájemně ovlivňují, a to jak synergisticky tak antagonisticky. Alloway (1990) uvádí, že vztah Cu, Se, Mn a Ca v půdě je kompetitivní k Cd, a zmíněné prvky tak snižují příjem Cd rostlinami. Například dvojmocné ionty Ca2+ a Zn2+ přítomné v půdním roztoku mohou lépe obsazovat sorpční místa než Cd2+, a tak kadmium z půdního roztoku vytěsnit (Adriano, 2001). Vztah kadmia a zinku - též viz kapitola „Faktory chování kadmia v půdě a rostlině“. 5.3.2 Příjem těžkých kovů z atmosféry Přestože největší podíl příjmu těžkých kovů probíhá kořenovým systémem, rostlina je schopná přijímat prvky i ze vzduchu. Tento potenciál je znám a využíván ve výživě rostlin pro aplikaci foliárních hnojiv. Tato schopnost má však podíl i na kontaminaci rostliny. Hlavní cestou příjmu těžkých kovů listy je neaktivní kutikulární penetrace, další možností je metabolický mechanismus, kdy ionty prochází proti koncentračnímu gradientu (Kabata-Pendias, 2001). Podíl příjmu TK listy ovlivňuje především morfologie listu, tj. nejvyšší mírou propustnost kutikuly. Význam foliárního příjmu se uplatňuje u různých prvků velmi rozdílně. u toxických kovů olova a rtuti je příjem z atmosféry významný, protože jsou to prvky málo pohyblivé a v půdě se málo uplatňují (Tlustoš a kol., 1996). Olovo však zároveň proniká z povrchů listů do pletiv méně než další kovy, protože bývá již na povrchu adsorbováno lipidy kutikuly (Prasad a Hagemeyer, 1999), Zn, Cd a Cu naproti domu do listů proniká dobře (Kabata-Pendias, [13]

2001). Greger a kolektiv (1993) pozorovali vstup kadmia listy u hrachu a řepy a zjistili, že jej negativně ovlivňuje nízké pH a naopak zvýšený příjem kadmia pozorovali po delší době expozice, protože samotný příjem rizikových kovů mění permeabilitu kutikuly.

5.4 Fytotoxicita kademnatých iontů Mnoho studií zaměřených na těžké kovy se zabývá kadmiem, které je považováno za jeden z nejtoxičtějších kovů pro rostliny. Proto i já jsem si vybrala pro své teoretické studium i praktickou část práce tento prvek. 5.4.1 Vliv kadmia na růst a znaky rostlin, symptomy Častými symptomy toxického působení Cd je především redukce prodlužovacího růstu, celkově nižší produkce biomasy. Kadmium za většiny podmínek vstupuje do rostliny kořeny. Ty jsou tedy jako první exponované toxickému působení kadmia (Sanita di Toppi a Gabbrielli, 1999; Tlustoš a kol., 2006). Hnědnou kořenové vlásky a špičky, tvorba bočních kořenů je snížena. Na listech se objevují chlorózy, nekrózy a červenohnědé zabarvení žilnatiny. Cd ovlivňuje fotosyntézu, transpiraci, příjem živin a vody. Jeho toxické působení může vést až k vadnutí a uhynutí rostliny. (Cibulka a kol.,1991; Prasad, 1995; Sanita di Toppi a Gabbrielli; 1999; Adriano, 2001; KabataPendias, 2001; Seregin a Ivanov, 2001). Účinek kadmia může být přímý či nepřímý vlivem poškození kořenů dochází ke snížení nebo zastavení příjmu důležitých živin (Walker a kol., 1977; Prasad, 1995). 5.4.2 Molekulární podstata negativního vlivu těžkých kovů Podstatou toxicity TK, včetně kadmia je ovlivnění aktivity enzymů a poškození membrán (Prasad, 1995). Tabulka 1 uvádí kadmiem ovlivněné enzymy a odpovídající metabolické procesy, které jsou následně příčinou dalších projevů, které pozorujeme na úrovni buňky či celé rostliny. Toxické těžké kovy jsou typické svou vysokou afinitou k sulfhydrylovým (-SH) skupinám. Ovlivňují aktivitu enzymů přímou vazbou na funkční skupiny biomolekul nebo odtud vytěsňují esenciální ionty či modifikují aktivní konformace biomolekul a nebo narušují integritu biomolekul (Shaw, 1990; Kabata Pendias, 2001). u některých enzymů se projevuje snížení aktivity, u některých i zvýšení, což ovlivňuje také použitá koncentrace kovu (Van Assche a Clijsters, 1988 a 1990; Nátr, 1998; Clemens, 2001).

[14]

Kadmium je původce oxidativního stresu a vzniku aktivních forem kyslíku. Kromě změn ve složení membrán tak v buňkách dochází ke zvýšení peroxidace lipidů membrán (Shaw, 1995).

Aidid a Okamoto (1993) se zabývali vlivem kadmia na

buněčnou stěnu a vysvětlují inhibici růstu stresovaných rostlin inhibicí činnosti protonové pumpy a vlivem na roztažnost buněčné stěny. Jedním z významných procesů v rostlině, který kadmium inhibuje je fotosyntéza (Prasad, 1995). Experimenty Krupy a kol. (1988) prokázaly změny fotosyntetických pigmentů (inhibice syntézy chlorofylu) vyvolané kadmiem. Vliv kadmia na syntézu je údajně z větší části nepřímý, spíše ovlivňuje enzymy a procesy Calvinova cyklu (Krupa, 1993). Barcelò and Poschenrieder (1990) vysvětlují, že jeden z hlavních důvodů vadnutí, jakož i celkové fytotoxicity kadmia je negativní vliv na vodní režim rostlin. Tj. uzavírání průduchů, inhibice transpirace a omezení xylémového transportu. Kadmium však ovlivňuje nejen příjem vody, ale i živin. Není to způsobeno ovšem jen fyziologickými změnami kořenů, ale také vlivem kadmia na aktivitu enzymů. Přehled ovlivněných enzymů a souvisejících procesů uvádím v tabulce 1. Kadmium například snižuje příjem nitrátů a jejich transport do nadzemní části inhibicí aktivity nitrátreduktázy, přičemž dochází k hromadění amonného dusíku v pletivech rostlin (Hernandez a kol., 1996). Boussama a kol. (1999) tuto skutečnost potvrdili a zjistili snížení aktivity dalších enzymů, tj. nitritreduktasy, glutaminsyntetasy, ferredoxinglutaminsyntetasy a NADH-glutamátsyntetázy. Cd naopak zvyšuje aktivitu glutamát dehydrogenázy. To souvisí s vyšším obsahem glutamátu, který pak pravděpodobně slouží k syntéze glutathionu (Gouia a kol. 2000, 2003). Khan a Frankland (1983) konstatovali, že viditelné toxické působení Cd je spojeno s nedostatkem zinku v rostlině, protože konkrétně tyto dva prvky se vzájemně ovlivňují nejvíce (viz kapitola „Faktory chování kadmia v půdě a rostlině“) Chlorózy na listech jsou však spíše způsobeny inhibicí biosyntézy chlorofylu, fyziologickou deficiencí železa (inhibice FeIII reduktázy) nebo poklesem obsahu hořčíku indukovaným kadmiem (Larbi a kol., 2002).

[15]

Tab. 1 Metabolické procesy ovlivněné kadmiem a některé odpovídající enzymy (upraveno dle Van Assche a Clijsters, 1988 a 1990; Shaw, 1995; Sanita di Toppi a Gabbrielli, 1999; Seregin a Ivanov, 2001) ↓…snížení aktivity ↑…zvýšení aktivity ↑(↓) …podle koncentrace kadmia či autora metabolické procesy

odpovídající enzymy

syntéza chlorofylu ↓ fixace CO2 a Calvinův cyklus ↓

protochlorofylid reduktáza ribulóza-1,5-bisfosfát karboxyláza

pentosový cyklus ↓ glykolýza ↓ dýchací řetězec, Krebsův cyklus ↓ elektronový transport ↓ asimilace N2 ↓

nukleolytické procesy ↑ (↓) hydrolýza ↑ energetický metabolismus ↓ antioxidativní procesy ↑ (↓)

fosfoenol pyruvát karboxyláza ribulóza-5-fosfát kináza glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza glukosa-6-fosfát dehydrogenáza Hexokináza sukcinát dehydrogenáza ferredoxin NADP oxidoreduktáza nitrátreduktáza nitritreduktáza Glutaminsyntetáza Glutamátsyntetáza ribonukleáza deoxyribonukleáza proteáza alkalická a kyselá fosfatáza ATPáza kataláza askorbát peroxidáza superoxid dismutáza

5.4.3 Akumulace a distribuce kadmia v rostlině Rostliny mají schopnost akumulovat těžké kovy v určitých pletivech podzemní i nadzemní části. Místem uložení mohou být mimo jiné i trichomy listů (Salt, 1995), ve kterých Brassica juncea dokáže údajně akumulovat 40× větší množství Cd, než v listu. Převážný podíl Cd však zůstává v kořenech (Gussarsson 1994 atd., LozanoRodriguez a kol., 1997), některé literární údaje se shodují na 50 – 80 % akumulace v kořenech z celkového obsahu (Mench a kol., 1989; Lubben a Sauerbech, 1991).

[16]

Charakter ukládání se mění s prvkem i rostlinou. Vzorovou ukázkou genetické variability je například práce, kde bylo sledováno 19 inbredních linií kukuřice - některé mnohonásobně více akumulovaly Cd v kořenech než ve stonku, jiné měly obsah Cd v kořeni i stonku obdobný (Florijn a Van Beusichem, 1993). Běžné a limitní koncentrace těžkých kovů v rostlinách a potravinách uvádí tabulka č. 2 a tabulka č. 3. . Tab. 2 Běžné a nadlimitní koncentrace těžkých kovů v rostlinách (upraveno dle Kabata-Pendias, 2001, převedeno z ppm DW na jednotky SI) prvek Cu Mn Mo Zn Pb Cd Ni

běžná přípustná koncentrace [mg . kg -1 DW] 5–20 30–300 0,2–5 30–100 5–10 0,05-0,5 1–10

nadměrná toxická koncentrace [mg . kg -1 DW] 20–100 400–1000 10–5 100–400 30–300 5–30 10–100

hyperakumulační hodnoty [mg . kg -1 DW] >1000 >10 000 >10 000 >1000 >100 >1000

Tab. 3 Maximální limity kadmia v potravinách dle Nařízení Komise ES č. 1881/2006 potraviny

maximální limity kadmia (mg .kg -1 FW)

obiloviny kromě otrub, klíčků, pšenice a rýže

0,1

otruby, klíčky, pšenice a rýže

0,2

sójové boby zelenina a ovoce kromě listové zeleniny, čerstvých bylinek, hub, řapíkaté a stonkové zeleniny, piniových oříšků, kořenové zeleniny a brambor

0,2

listová zelenina, čerstvé bylinky, pěstované houby a celer bulvový řapíkatá a stonková zelenina, kořenová zelenina a brambory (loupané) kromě celeru bulvového

0,05 0,2

0,1

Maximální limit se vztahuje na ovoce nebo zeleninu po umytí a po oddělení jedlé části.

[17]

5.5 Obranné mechanismy rostlin proti těžkým kovům V odpovědi na stres vyvolaný kadmiem, rostlinná buňka vyvinula několik systémů obrany (Sanita di Toppi a Gabbrielli, 1999), kterými jsou: • imobilizace • vyloučení kovu • syntéza fytochelatinů • komplexace • syntéza stresových proteinů • syntéza etylenu. Tyto reakce, mobilizaci, příjem, transport a detoxikaci těžkých kovů shrnuje obrázek č. 1. Těžké kovy jsou v půdě mobilizovány (např. organickými kyselinami) a ve formě volných iontů či komplexů pronikají z půdy do kořenů rostlin přes rhizodermis a dále apoplastickou cestou. Část TK je pevně vázána do buněčné stěny (Clemens a kol. 2002; Larcher, 2003) a zbylá část TK se dostává až k endodermis, kde se akumuluje v blízkosti apoplastické bariéry - Casparyho proužků. Membránové přenašeče však ionty těžkých kovů mohou dále transportovat symplasticky. Rostliny sice disponují specifickým mechanismem pro příjem mikroprvků, selektivita transportních proteinů je však zřejmě nedostatečná (Gloser, Prášil, 1998; Lasat, 2000; Larcher, 2003). Tímto způsobem se dostává určitá část iontů dále do vodivých elementů xylému, které je transportují do nadzemních částí rostliny. Další možností je i přechod do floému (Tester a Leigh, 2001; Clemens a kol., 2002). 5.5.1 Buněčný mechanismus detoxikace těžkých kovů Jak již bylo zmíněno v předchozím odstavci, první selektivní překážku pro vstup těžkých kovů do rostlin představuje buněčná stěna. Její schopnost vázat do své struktury těžké kovy souvisí s vazbou na karboxylové skupiny pektinových látek (Clemens a kol., 2002; Larcher, 2003). Ionty těžkých kovů při svém průchodu do buňky překonávají další bariéru - cytoplazmatickou membránu. Hlavní roli při tomto transportu a jeho regulaci hrají membránové přenašeče, ať již za spotřeby energie, nebo za využití přesně regulovaného gradientového přesunu iontů. Hall a Williams (2003) a Krämer a kol. (2007) shrnují důležitou funkci těchto membránových proteinů a shrnují seznam specifických transportérů, které již byly nalezeny pro všechny esenciální [18]

mikroprvky kromě molybdenu. Pro ionty kadmia jsou známy konkrétně membránové přenašeče typu Nramp 1/3/4, IRT1, ZIP 1-4 a LCT1. Významnost těchto transportérů konkrétně u rostlin může prezentovat i fakt, že ve srovnání s ostatními eukaryonty mají rostliny pro kódování těchto proteinů větší počet genů (Vacek a kol. 2003; Hall a Williams 2003). Rostliny disponují řadou buněčných mechanismů, které se mohou účastnit detoxikace těžkých kovů v cytoplazmě. TK jsou v cytoplazmě vázány ligandy, tj. aminokyselinami (histidinem), dále především organickými kyselinami (citrát, malát, oxalát) při nízkých koncentracích těžkých kovů a peptidy bohatými na síru (thiolové látky) při vyšších koncentracích TK. Vzniklé komplexy těžkého kovu s peptidy jsou transportovány do vakuoly, v mnohem menší míře pak do dalších organel (VögeliLange a Wagner, 1990; Gloser a Prášil, 1998; Rauser, 1999; Clemens, 2001, Larcher, 2003; Hall, 2002)

[19]

Obr. 1 Mechanismus příjmu, transportu a detoxikace kovů u vyšších rostlin (upraveno dle Clemens, 2002). Jednotlivé části obrázku představují: a) zvýšení mobilizace org.kyselinami, b) příjem membránovými transportéry a tvorba komplexů, c) symplastický průchod, transport xylemém, přechod do floému, d) distribuce pletivy apoplastem i symplastem, ukládání TK do buněčné stěny, trichomů e) ukládání komplexů TK do vakuoly, organel

[20]

5.5.1.1 Thiolové sloučeniny Jsou chemické sloučeniny bohaté na sulfhydrylové -SH skupiny, které představují specifickou obranu rostlin proti TK - mají schopnost TK vázat a ukládat ve vakuole. Jejich množství závisí na době expozice, koncentraci kovu a pletivu. (Grill a kol., 1985; Zenk, 1996; Sanita di Toppi a Gabbrielli, 1999; Cobbett, 2000; Rauser, 2003). Glutathion Jednou z významných a přitom jednoduchých thiolových sloučenin je glutathion. Glutathion (GSH) byl objeven roku 1921 F.G. Hopkinsem a od té doby byl výskyt této molekuly prokázán u většiny živých organismů, od kvasinek přes rostliny až po člověka. Je to tripeptid se základní strukturou γ-Glu-Cys-Gly (obr. 3). GSH je dvou krocích syntetizován z glutamátu, cysteinu a glycinu za postupné katalýzy γ-glutamylcysteinsyntetázou (GCS) a glutationsyntetázou(GS) s využitím ATP. Cystein (obr. 2) je obvykle hlavním a limitujícím substrátem. Biosyntéza je zpětnovazebným mechanismem regulována samotným GSH, které negativně reguluje GCS (Anderson, 1998; Vacek a Havel, 2005 ) – viz obr. 4.

Obr. 2 Struktura cysteinu

Obr. 3 Struktura redukovaného (vlevo) a oxidovaného (vpravo) glutathionu

Jeho role spočívá v antioxidačních a detoxikačních vlastnostech chránících buňku před oxidačním stresem a abiotickými vlivy a v udržování homeostázy těžkých kovů v organismu. Mezi další nepříliš probádané funkce GSH patří účast při buněčné signalizaci, regulaci buněčného cyklu a možný je i význam při reakci na patogeny (Vacek a Havel, 2005). Glutathion je především prekurzorem fytochelatinů, které váží těžké kovy efektivněji.

[21]

Fytochelatiny Několik molekul je schopno vytvářet s ionty těžkých kovů kovalentněkoordinační

komplexy,

vedoucí

k imobilizaci

a detoxikaci

kovů.

Jedná

se

o nízkomolekulární peptidy, thiolové sloučeniny bohaté na molekuly -SH (Grill a kol., 1985 a 1989). Schéma detoxikace TK fytochelatiny naznačuje obrázek 4. PC mají nejen detoxikační roli, ale také funkci homeostatickou, důležitou pro hladinu esenciálních kovů (Zenk, 1996; Rauser, 1999). Howden a kol. (1995) studoval PC deficientní mutanty Arabidopsis, které byly vysoce senzitivní ke kadmiu i při velmi nízkých koncentracích (pod 0,6 µM). Dokázal, že PC mají význam pro ochranu rostlin nejen proti toxickým, ale i proti přirozeným koncentracím TK. Diskutované jsou i jiné funkce, např. antioxidační funkce a role v metabolismu síry (Hall, 2002) a železa (Zenk, 1996). V pokusech in vitro zjistili Kneer a Zenk (1992), že fytochelatiny chrání enzymy citlivé na obsah rizikových prvků před jejich toxickým působením. Komplex Cd2+-fytochelatin inhiboval deset až tisíckrát méně enzymy

Rubisco,

nitrátreduktázu,

alkoholdehydrogenázu,

glyceraldehyd-3-

fosfátdehydrogenázu a ureázu v porovnání s volnými ionty kadmia.

Obr. 4 Schéma detoxikace kadmia fytochelatiny v buňce rostlin. Upraveno dle Cobbett (2000), Vacek a kol. (2003), Hall a Williams (2003). GCS: γ-Glu-Cys-syntetáza, GS: glutathionsyntetáza, PCS: PC-syntáza, fytochelatinsyntáza [22]

Základním vzorcem PC je [(γ-Glu-Cys) -Gly] (Grill a kol., 1985), dipeptidická n

repetice glutamové kyseliny a cysteinu se přitom může opakovat 2 až 11krát (obr. 5). Dle počtu opakování této repetice jsou indexovány jednotlivé fytochelatiny. Např. PC2 lze vyjádřit vzorcem: ( γ -Glu-Cys)2-Gly.

Obr. 5 Struktura fytochelatinů

Terminální

aminokyselinou

bývá

obvykle

Gly

(Zenk,

1996;

Cobbett

a Goldsbrough, 2002). Kromě této základní formy bylo poznáno ještě několik dalších forem, které obsahují místo terminální molekuly glycinu jinou aminokyselinu (Vacek a kol., 2003), viz tabulka 4.

Tab. 4 Známé formy fytochelatinů (dle Vacek a kol., 2003) Název fytochelatin PC homofytochelatin (β-alanin) hydroxymethyl fytochelatin (serin) iso-fytochelatin (glutamová kyselina) desglycin fytochelatin

Zkratka PC iso-PC (β-Ala), PC2 iso-PC (Ser)

Vzorec (γ-Glu-Cys)n-Gly (γ-Glu-Cys)n-β-Ala (γ-Glu-Cys)n-Ser

iso-PC (Glu) DesGly-PC

(γ-Glu-Cys)n-Glu (γ-Glu-Cys)n

Syntéza PC transpeptidizační reakcí GSH je katalyzována a regulována enzymem s triviálním názvem fytochelatinsyntáza (PC-syntáza, PCS). Existují dva typy syntéz: a) kondenzace molekul GSH, kde jedna poskytuje γ-Glu-Cys část, dochází ke ztrátě glycinu, který může být opět zapojen do syntézy GSH b) reakcí kyseliny glutamové a cysteinu za vzniku γ-Glu-Cys a následné připojování tohoto dipeptidu adicí na akceptorovou molekulu GSH, jenž musí být aktivována ionty kovů v cytoplazmě (Grill a kol., 1989). PC-syntáza vyžaduje aktivaci těžkým kovem. Nejsilnějším induktorem je kadmium, dalšími potvrzenými aktivačními kovy jsou Ag, Pb, Fe, Cu, Hg, Zn, Sn, As, Au a cis-Pt (Grill a kol., 1989; Maitani a kol. 1996; Rauser, 1999). Jen některé kovy,

[23]

které PC indukují, jsou však také vázány s produkovaným PC do komplexu. Maitani a kolektiv (1996) zjistili vazbu na PC pouze v případě Ag, Cd a Cu. Reakcí iontů těžkého kovu a fytochelatinů vzniká v cytoplazmě nízkomolekulární LMW M-PC komplex (Kneer a Zenk, 1992), který přechází přes tonoplast do vakuoly. Vakuola hraje významnou úlohu pro snížení toxického vlivu těžkých kovů. Uvnitř vakuoly je inkorporací se sulfidy tento komplex přeměněn na vysokomolekulární HMW M-PC komplex (Reese a kol., 1992), který se nemůže vrátit zpět do cytoplazmy, a tak rostlinný organismus svou toxicitou neohrožuje (Vacek a kol., 2003; Cobbett 2000). Transport komplexů Cd-PC přes tonoplast je umožněn HMT1, tj. ABC-typem kazetového transportéru. Tento protein je schopný transportovat komplex, ale ne samotné kadmium. To přechází do vakuoly antiportním systémem Cd2+/H+ (Salt a Wagner, 1993; Ortiz a kol., 1995).

5.6 Fytoremediace S rozvojem průmyslu, vědy a techniky se do našeho životního prostředí bohužel dostávají cizorodé toxické látky, tzv. xenobiotika. Buď jsou to látky přírodě přirozené, ale ve větší koncentraci toxické, nebo látky nové, uměle syntetizované člověkem. Tyto látky se hromadí v životním prostředí a mohou pronikat i do potravního řetězce. Této problematice se naštěstí dnes věnuje pozornost, a tak byly vyvinuty metody, které mohou naše prostředí těchto toxických látek zbavit. Existují fyzikálně-chemické metody, které jsou účinné, ale ekonomicky velice nákladné. Ekonomičtější a přirozenější cestou je biologická dekontaminace, tzv. bioremediace. Pojem fytoremediace, spadající pod pojem bioremediace, označuje technologie využívající zelené rostliny k přesunu, fixaci, akumulaci nebo rozkladu nebezpečných kontaminantů. Technologie tedy využívá přirozených procesů, které probíhají u rostlin (případně v návaznosti na ně procesů v mikroorganismech v okolí kořenů). Ponechává půdě funkci a předpokládá možnost jejího dalšího využití. Půda nemusí být nikam odvážena, metoda probíhá přímo na znečištěné lokalitě. Nedochází tak k devastaci krajiny, ale naopak k estetickému ozelenění. Předpokladem je využití běžných agrotechnických postupů. Výhodou této metody jsou nízké finanční vstupy a náklady. Fytoremediace má jako každá metoda svá „pro“ i „proti“. Fytoremediace jsou limitovány

vlastnostmi

dekontaminovaného

média

(pH,

teplota…)

i druhem

kontaminantu (některé mohou být fytotoxické, nebo škodlivé pro určité typy použitých rostlin). Metoda je použitelná jen do určité hloubky kontaminované půdy - v dosahu [24]

kořenů rostlin. Nevýhodou je vždy zdlouhavost metody. Bývá také problematické nalézt vhodné druhy rostlin. Rizikem je také možnost postupu kontaminantu do potravního řetězce býložravými živočichy. Fytoremediace lze podle metodického postupu rozdělit na několik různých technik. (Cunningham a kol., 1995; Zehnálek a kol., 2004; Ghosh a Singh, 2005; Soudek, 2008; Soudek a kol., 2008) 5.6.1 Techniky fytoremediace 5.6.1.1 Aplikace pro půdní prostředí Fytoextrakce je metoda kdy jsou rostliny vysety na kontaminovanou půdu a po určité době sklizeny. Metoda je využitelná pro odstranění toxických těžkých kovů a také polokovů a radionuklidů. Rostliny tyto látky přijímají kořeny z půdy a akumulují je ve svých pletivech. Samozřejmě je nejvhodnější využívat ty rostliny, které jsou vůči danému kovu či radionuklidu tolerantní a jsou schopné kontaminant co nejvíce akumulovat. Dnes již známe takové druhy rostlin, nazýváme je hyperakumulátory. Příkladem jsou rostliny z čeledi brukvovitých, např. Thlaspi caerulescens a Brassica juncea. Častým problémem bohužel bývá nedostatečná akumulace kontaminantu v nadzemní části. Po sklizni musíme s materiálem i nadále zacházet opatrně jako s odpadem, protože kovový prvek rostlinou přeměněn být nemohl a je v ní akumulován. Sklizená biomasa je dále zpracovávána chemicky, mikrobiálně či nejčastěji tepelně. Při vysokých teplotách je spalována a se vzniklým popelem se nakládá jako s odpadem, tj. je dále skládkován. Fytostabilizace využívá rostlin k imobilizaci půdních kontaminantů. Cílem je znemožnit nebo alespoň omezit pohyb kontaminantu do okolí znečištěné plochy. Metoda se využívá i jako závěrečný krok úpravy ploch sanovaných jinými technologiemi.

Kořenový

systém díky adsorpci, absorpci, komplexaci a precipitaci snižuje možnost vymývání kontaminantu z půdy, sedimentů a kalů. Porost rostlin také zabraňuje vodní a větrné erozi a rozptylu kontaminace. Fytovolatilizace je zvláštní metoda, při které rostlina přijímá kontaminant kořeny, transportuje jej do nadzemní části, jíž většinou předchází transformace látky. Pak proběhne transpirace

[25]

těkavé formy látky. Původní látkou jsou tedy organické látky, např. složky benzínu či ionty rtuti. v případě této metody však dochází pouze k převodu kontaminantu z půdy do ovzduší, tento proces tedy musí být přísně kontrolovaný. Fytotransformace či fytodegradace je

proces,

při

němž

dochází

k přeměně

a odbourávání

kontaminantu

metabolickými drahami rostliny či za velmi účinné spolupráce mikroflóry v okolí kořenů rostliny. Za fytodegradaci lze považovat i proces, kdy není látka zcela odbourána, ale její koncentrace je snížena. Tato metoda se týká jen organických polutantů (PAH, PCB, výbušné látky, detergenty, ropné látky atd.). Dále se občas používá pojem fytostimulace. Rozumíme tím stimulaci činnosti mikroorganismů v rhizosféře pomocí exudátů rostlin, které úspěšně napomáhají biodegradaci kontaminantu. 5.6.1.2 Aplikace pro vodní prostředí Rhizofiltrace je metoda, která využívá kořeny živých rostlin pro příjem, akumulaci či odbourání xenobiotik ze znečištěné vody. Je to úspěšná technika, které se často účastní mikroorganismy vázané na kořeny rostlin. Metoda se ukázala vhodná pro zachycení nízkých koncentrací kovů a radionuklidů a odbourání organických látek. Aplikace této metody se provádí často v uměle vystavěných mokřadech, ve kterých jsou vysázeny bahenní rostliny (orobince, rákos), ale je také možné využít hydroponicky pěstované terestrické rostliny jako slunečnice a brukvovité rostliny.

[26]

5.7 Využití lnu setého ke studiu fytoremediace Některé druhy rostlin tolerují zvýšené koncentrace těžkých kovů a jsou zároveň schopny je akumulovat ve vyšších koncentracích. Nazýváme je hyperakumulátory. Bohužel, tyto rostliny zahrnují převážně druhy s velmi malou produkcí biomasy. Navíc je jejich další hospodářské využití prakticky nulové a není pro ně vyvinuta vhodná agrotechnika. Proto se hledají rostliny z řad hospodářsky využitelných. Jako slibné rostliny pro fytoremediace se jeví len, přadná rostlina s komplexním technickým využitím téměř celé rostliny, které významně snižuje celkové náklady na fytoremediaci. 5.7.1 Pěstování a sklizeň lnu Len setý je technická plodina, jejíž pěstování má význam především pro vyšší nadmořské výšky, na lokalitách, kde hlavní plodiny neposkytují dostatečné výnosy a ekonomické výsledky. Existují různé genotypy lnu, hlavními dvěma skupinami je len stonkový, tj. přadný a len olejný. Z hlediska světové produkce tvoří olejný len 75 %, přadný len zbylých 25 % ploch produkce. Technologický postup sklizně přadného lnu zahrnuje trhání celých rostlin. Takový postup je velmi vhodný pro fytoremediace, jelikož z půdy jsou odstraněny z větší části i kořeny, ve kterých se těžké kovy většinou akumulují mnohonásobně více než v nadzemních částech. (Štaud a kol., 1997; Griga a kol., 2003a). 5.7.2 Technické využití lnu Využití lnu je primárně technické, tedy s minimálním zdravotním rizikem a nebezpečím kontaminace potravního řetězce (výjimkou jsou výrobky pro oděvní průmysl). Stonek je zdrojem pazdeří, dlouhého vlákna a koudele. Z dlouhého vlákna jsou vyráběny čisté přírodní textilie, v kombinaci s dalšími materiály různé technické tkaniny a materiály pro filtraci a izolaci. Pazdeří a koudel se využívá v nábytkářském průmyslu (čalounění, pazderodesky) a stavebnictví (vláknocementové desky, izolace, kompozity, těsnění, výplň dveří) či papírenství, a také v automobilovém a leteckém průmyslu (brzdové obložení, obložení dveří). Olej semen je komponentou fermeží, barev a laků. Energetické využití je také možné. (Štaud a kol., 1997, Griga a kol., 2000; Griga a kol., 2003a, Griga a kol., 2003b).

[27]

5.7.3 Vliv těžkých kovů na rostliny lnu setého Většina studií prováděných na rostlinách lnu se zabývala vlivem kadmia, který je v podstatě „modelovým“ těžkým kovem. v případě tohoto kovu tak existuje dostatek literatury a výsledků pro další práce a závěry. Tento kov je pro rostliny jedním z nejtoxičtějších (tab. 5). Tab. 5 Inhibiční koncentrace jednotlivých těžkých kovů v mmol.l-1 na růst kořenů, průměr z měření 20 odrůd lnu (Bjelková, Blažek a Griga, 2007a).

5.7.3.1 Projevy toxicity kadmia u lnu Kadmium u lnu vyvolává obdobné reakce jako u jiných rostlin. Vliv kadmia na rostliny lnu pozoroval například Douchiche (2007). Na stres již při nejnižší použité koncentraci 0,1 mM reagovaly rostliny celkovou redukcí biomasy, oproti kontrole měly rostliny kratší hypokotyl i kořeny, kořeny (převážně laterální) navíc hnědly. Kadmium se projevilo vlivem na vodní režim rostlin, ty byly dehydratovány. Rostliny se bránily zesílením kutikuly a buněčné stěny a změnou struktury pektinů. Koncentrace 0,6 mM byla letální téměř pro všechny rostliny. 5.7.4 Faktory chování kadmia v půdě a rostlině Nejdůležitějším klíčovým faktorem pro příjem Cd je koncentrace pro rostlinu skutečně dostupného Cd v poměru k celkovému obsahu Cd (Moraghan, 1993). Ve srovnání s ostatními rizikovými prvky je mobilita Cd v půdě ale obecně vysoká (Alloway, 1990). Grant, Bailey a Dribnenki (2000) poukazují na význam lokality (půdní vlastnosti), ale též roku (např. srážky jsou schopné zvýšit mobilitu Cd v půdě, tím pádem zvýšit příjem Cd rostlinou). Vliv hnojení fosforem a dusíkem či inokulace půdními houbami je údajně minoritní. Rozdíly v příjmu, translokaci a akumulaci však ovlivňuje také faktor genotypu. Mnohé studie prokázaly vysokou genotypovou variabilitu lnu v příjmu a akumulaci kadmia in vivo (Cieslinski, 1996; Becher a kol., 1997; Li a kol., 1997; Hocking a McLaughlin, 2000), a také in vitro (Chakravarty a Srivastava, 1997a, 1997b). Tuto skutečnosti prokázaly i další práce Agritec s.r.o. Šumperk (Bjelková a kol., 2001; Bjelková a Griga, 2003; Bjelková a kol. 2007a, 2007b). Odrůdové rozdíly v akumulaci Cd v kořeni jsou pravděpodobně zapříčiněny [28]

odlišnou translokací Cd floémem.

Cílem současných prací je právě nalezení

nejvhodnějších odrůd lnu z tohoto variabilního poolu pro další využití, šlechtění a případné transformace (Griga a kol., 2000; Griga a kol., 2003). Chování kadmia ovlivňují také ostatní přítomné ionty. Práce soustředěné na vliv kadmia a zinku zjistily kompetitivní vztah těchto iontů (Moraghan, 1993; Grant a Bailey, 1997). Grant, Bailey a Dribnenki (2000) by však nedávali Zn a Cd do kompetitivního vztahu příliš striktně. Chakravarty a Srivastava (1997b) interakci Zn a Cd potvrdili. Sledovali vliv Cd společně se Zn v koncentraci 0,1 mM pro každý iont. Kadmium se oproti zinku akumulovalo více v kořeni, zinek byl více translokován do stonků. Kultury rostoucí na médiu s přídavkem Cd i Zn zároveň však akumulovaly méně kadmia, než ty ovlivněné stejnou koncentrací Cd bez přídavku Zn. Samotné kadmium vyvolalo stresovou odpověď, zvýšilo aktivitu peroxidázy, přídavek zinku však tuto aktivitu snížil. Zinek je tedy schopen snižovat množství Cd v rostlině a stres způsobený kadmiem ( Chakravarty a Srivastava, 1997b). Zužitkovat kompetitivního vztahu Cd a Zn a najít odrůdy se zvýšenou akumulací Zn a paralelně sublimitní koncentrací Cd a Pb představuje potenciální specifické potravinářské využití lnu (Bjelková, Větrovcová a Griga, 1997b). 5.7.5 Akumulace kadmia u lnu setého Mnoho prací se zabývalo potenciálním nebezpečím akumulace kadmia v semenech lnu. Bylo zjištěno, že len má oproti ostatním plodinám pravděpodobně málo efektivní bariéru translokace kadmia do semen než ostatní plodiny (Hocking a McLaughlin, 2000). Akumuluje totiž kadmium v koncentracích nad kritickou hodnotu 0,3 mg Cd kg-1 FW. Již od konce osmdesátých let minulého století se vědecké skupiny zabývaly hledáním odrůd lnu, které vykazovaly translokace kadmia do semen nejnižší (Griga a kol., 2003b), což bylo nutné pro potravinářské a farmaceutické a krmivářské účely (Moraghan, 1993; Cieslinski, 1996; Becher a kol., 1997; Li a kol., 1997). Do popředí se však postupně od počátku devadesátých let dostaly i opačné snahy, totiž nalézt odrůdy s nejvyšší akumulací kadmia v rostlině lnu, a to pro účely fytoremediace. Bjelková a kol. (1997b) v maloparcelovém pokusu sledovali akumulace kadmia, olova a zinku u 50 genotypů lnu setého. Testované genotypy vykázaly rozdílnou schopnost akumulovat testované TK do svých orgánů. v případě kadmia byl zjištěn tento trend akumulace: kořen > stonek > semeno, po pracování pak vlákno > pazdeří > stěny tobolek. Diference však u kořene, stonku a semene nebyla zcela průkazná. Na [29]

půdě s naměřeným obsahem 0,9–1,1 mg kg-1 Cd se v kořenech akumulovalo dle odrůdy od 0,99 do 3,16 mg Cd kg-1 sušiny, ve vláknu od 0,67 do 2,89 mg kg-1, ve stonku od 0,56 do 1,77 mg kg-1, v semeni od 0,40 do 2,22 mg kg-1, pazdeří od 0,24 do 1,53 mg kg-1 a stěnách tobolek od 0,26 do 0,88 mg kg-1. Angelova kolektiv (2004) sledovali na kontaminované půdě u bulharského města Plovdiv akumulace kadmia konopím, lnem a bavlníkem. Nejlepší akumulační schopnosti měl len. Potvrdila se orgánová distribuce v tomto pořadí: kořen > stonek > semeno (Bjelková a kol., 2001; Bjelková a Griga, 2003; Griga a kol. 2003), tj. největší koncentrace vykazují pletiva kořene. Bjelková a kol. (2001) vypočítali celkovou distribuci Cd s přihlédnutím k produkované biomase u tří olejných odrůd lnu a sedmi přadných odrůd. U vyšších koncentrací Cd v půdě (30–40 mg Cd kg-1) bylo nejvíce tohoto kovu akumulováno v kořeni (průměrně kolem 60 % u přadného typu, 53 % u typu olejného), poté stonku (přadný i olejný průměrně 24–26 %) a následně v semeni (přadný typ 12 %, olejný typ průměrně 16 %). Největší podíl Cd při půdní koncentraci 10 mg Cd kg-1 se však nacházel ve stonku (průměrně 68 % pro přadný typ a 47 % pro olejný typ), olejné odrůdy akumulovaly semenech poměrně vysoký podíl Cd (31 %), zatímco přadné odrůdy jen kolem 11 %, v kořeni se pří této koncentraci akumulovalo průměrně 18 % Cd. 5.7.6 Možnosti zvýšení účinnosti fytoremediace u lnu S cílem zlepšit účinnost fytoremediace se provádí výzkumy, které se snaží objasnit mechanismy působení těžkých kovů a mechanismy obrany rostlin proti jejich působení. Další snahou je nalézt nejvhodnější odrůdy. Tabulka 6 shrnuje vlastnosti vybraných odrůd lnu z hlediska tolerance a akumulace, získaných právě na základě takových prací. Některá pracoviště u nás v České republice se zaměřuje i na moderní techniky transformací lnu. Cílem je například posílit toleranci k TK transformací lnu klonováním kvasinkových genů pro syntézu glutathionu či metallothioneinu. (Najmanová a kol., 2008; Nováková a kol., 2008).

[30]

5.7.6.1 Vlastnosti vybraných odrůd lnu z hlediska tolerance a akumulace Tab. 6 Charakteristiky některých odrůd lnu, dle literatury (uvedena pod tabulkou) a dle nepublikovaných výsledků nádobových a in vitro pokusů Agritec Šumperk s.r.o. odrůd a

hospodářs in vivo akumulace Cd v orgánech lnu (mg ký typ

Cd kg-1)

in vitro charakteristika vysoká tolerance k CdD, vysoká

Jitka

přadný

vysoký příjem Cd, nejvyšší akumulace

akumulace CdD,

CdAB, dobrý transport do nadzemní části

explantáty zůstávají zelené, tvoří pupeny, prýty, kořeny Cd v médiu

Merkur

přadný

podobně vysoká akumulace Cd jako

způsobuje

u Jitky - druhá v pořadíAB, dobrý transport

nekrotizaci, nízká

do nadzemních částí, ale méně než

tolerance k CdD, nižší

u Jitky, oproti Jitce větší retardace růstu

schopnost akumulace Cd

Marina

Escalin a

Raisa

Atalan te

přadný

většina Cd zůstává v kořenech

nejnižší akumulaceB, většina Cd zůstává přadný

v kořenech, oproti Marině větší retardace růstu

přadný

celkově nízký příjem Cd, ale snadný přesun do celé rostliny

průměrná tolerance k Cd C podobně jako Merkur, menší organogeneze, menší tolerance k Cd C nízká nekrotizace, organogeneze ještě lepší než u Jitky C vysoká tolerance

olejný

nízká akumulace CdA

k CdD C, nízká akumulace CdD vysoká tolerance

Bonet

přadný

velmi dobrý růst kořene při klíčení E

k Cd C, nejvyšší počet prýtů C malý počet pupenů

Tábor

přadný

průměrný růst kořene při klíčení E

C,

citlivá odrůda k CdD

[31]

Viking

přadný

nízká akumulace CdB

Elektra

přadný

nejlepší růst kořene při klíčení semen E

olejný

nejnižší příjem a akumulace CdA

olejný

vysoká akumulace CdB

Flande rs Biltstar

průměrná tolerance k Cd C vysoká tolerance k Cd C velmi dobrá tvorba pupenů C vysoká akumulace

A

Bjelková a kol., 2001, B Bjelková a kol., 2007c, C Blažek a kol., 2004, D Tejklová a kol., 2007,

E

Bjelková a kol., 2007a

CdD

6 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 6.1 Rostlinný materiál Jako experimentální materiál byly použity rostliny lnu setého (Linum usitatissimum L.), celkem 19 odrůd poskytnutých firmou Agritec s.r.o Šumperk. Odrůdy přadného typu: Agatha, Bonet, Elektra, Escalina, Hermes, Ilona, Jordán, Laura, Marilin, Marina, Merkur, Super, Tábor, Viking Odrůdy olejného typu: Atalante, Biltstar, Flanders, Lola, Recital

6.2 Postup kultivace Semena lnu byla vyseta na vlhkém filtračním papíru ve skleněných Petriho miskách. Po třech dnech kultivace při teplotě 22°C byly klíční rostliny na různé koncentrace dusičnanu kademnatého Cd(NO3)2 .4H2O. Na základě dřívějších pokusů (Konečná, 2008) jsme použili tyto koncentrace roztoku Cd(NO3)2. 4H2O: 5µM, 10µM, 17,5µM a 25µM. Kontrolní variantou byla destilovaná voda. Kultivace probíhala v plastových dózách o objemu 600 ml a rozměrech 9 cm × 8cm × 14 cm (obr. 6). Klíční rostlinky lnu byly uchyceny v otvorech ve víčku dózy. Pro každou variantu včetně kontrolní jsme založili vždy po dvou nádobkách, v každé po 24 klíčních rostlin. Kultivační podmínky byly řízené. v klimaboxu byla udržována teplota 22°C/ 18°C. Vlhkost 40—60% a světelná fotoperioda byla 16 hodin.

[32]

Obr. 6 Kultivační dózy s klíčními rostlinami lnu

6.3 Odběr vzorků pro analýzu a kvantitativní měření Vzorky pro analýzy byly odebrány po 10 dnech kultivace. Rostliny byly poté rozděleny na kořenovou a nadzemní část a následně délka každé části změřena, v případě kořenové části se měřila pouze délka hlavního kořene. Takto rozdělené rostliny byly zváženy (Sartorius 2024 MP, Sartorius, Německo), uchovány v plastových mikrozkumavkách a dále lyofilizovány po dobu 24 h. Poté byly vzorky opět zváženy a připravovány pro analýzy.

6.4 Příprava vzorků Segmenty stonků nebo kořenů lnu byly zmraženy kapalným dusíkem a následně částečně homogenizovány v plastových mikrozkumavkách ručně. Poté bylo přidáno 1000 µl 0,2M fosfátového, pufru pH 7,2, a vzorky byly homogenizovány homogenizátorem s nejvyšším parametrem 3000 ot./min. (Schütt Labortechnik, Německo) po dobu přibližně 3 minut. Eluace probíhala po dobu 45 minut při teplotě 4 °C na vortexu (Vortex-2 Genie, Scientific Industries, USA). Homogenát byl centrifugován (15 000 ot./min) 30 min při 4 °C ( Universal 32 R, Hettich-Zentrifugen GmbH, Německo) Supernatant byl před analýzou filtrován přes membránový filtr (0,45 µm, Millipore).

6.5 Analýza thiolových látek systémem HPLC-ED Existují rozličné metody pro analýzu thiolových sloučenin. k analytickým metodám thiolových sloučenin lze využít vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) s různými typy následné detekce.

[33]

Elektrochemická detekce (ED), kterou jsme použili v mojí práci, je atraktivní způsob detekce pro jednoduchost, možnost miniaturizace, vysokou citlivost a relativně nízkou finanční nákladnost. Konkrétně pro analýzu thiolových sloučenin byl systém HPLC-ED již s úspěchem využit (Potěšil a kol., 2005; Petrlová a kol., 2006). HPLC-ED systém byl složen ze dvou chromatografických pump Model 582 ESA (USA) (pracovní rozsah 0.001–9.999 ml.min-1), degaséru DGU-20As (Shimadzu, Japonsko) chromatografické kolony s reverzní fází Polaris C18A (150,0 × 4,6; 3 µm velikost částic, Varian Inc., USA) a dvanácti-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru Model 5600A ESA (USA). Detektor byl složen ze tří průtočných analytických komůrek Model 6210 ESA (USA), každá komůrka obsahovala osm referentních (hydrogen paládiových), osm pomocných a čtyři porézních grafitové pracovní elektrody. v řídícím modulu byl uložen mísič gradientu, odstraňovač pulzů, chromatografická kolona, elektrochemický detektor, prostor byl termostatován na 30 °C. Jednotlivé vzorky byly injektovány autosamplerem Model 542 ESA (USA) při teplotě 4°C. Injektovaný objem byl 20 µl. Kolona byla termostatována na 40 °C.

[34]

7 VÝSLEDKY PRÁCE 7.1 Vliv iontů kadmia na růst klíčních rostlin lnu setého, morfologická charakteristika Rostliny kultivované v destilované vodě s přídavkem kademnatých iontů byly odebírány 10 dnů po začátku kultivace. Obrázek 7 dokumentuje některé klíční rostliny odrůdy Viking. V rámci stresovaných variant nejsou rozdíly příliš zřetelné, snadno však můžeme pozorovat rozdíly mezi stresovanými rostlinami obecně a kontrolní variantou. Stresované varianty byly celkově inhibovány v růstu. Růstová deprese se projevila velice výrazně v případě kořenové části. V případě nadzemní části je reakce na kademnaté ionty méně citlivá. Na první pohled je zřejmá inhibice růstu hlavního kořene a především vývoje laterálních kořenů. Růst nadzemní část byl také inhibován, pokud u kontrolní varianty vyrůstaly pravé listy, stresované rostliny jej neměly vyvinuty vůbec. Obrázky 7 a 8 znázorňují klíční rostliny některých dalších odrůd lnu. U jednotlivých odrůd se projevuje vysoká variabilita růstu u kontroly i stresovaných variant. Zatímco u odrůdy Viking, případně Hermes a Recital je zřejmá výrazná inhibice růstu hlavního kořene, u odrůdy Tábor a především Bonet je reakce na kademnaté ionty výrazně méně citlivá, a to i v případě části nadzemní. U všech odrůd se jasně projevilo hnědnutí a poškození hlavního kořene a represe růstu laterálních kořenů. Nemohli jsme pozorovat vliv kadmia na kořenové vlásky, ty se totiž v hydroponické kultuře nevytváří. Chlorózy a nekrózy na listech jsme pozorovali spíše výjimečně. Především nejvyšší koncentrace kadmia projevovala toxický vliv takový, že některé rostliny odumíraly.

[35]

Obr. 7 Klíční rostliny odrůdy Viking ovlivněné různými koncentracemi kademnatých iontů odebírané 10.den kultivace

[36]

Odrůda Bonet, zleva c(Cd2+) [µM]: 0; 5; 10 a 25 Odrůda Recital, zleva c(Cd2+) [µM]: 0; 5; 10; 17,5 a 25

Odrůda Tábor, zleva c(Cd2+) [µM]:

Odrůda Hermes, zleva c(Cd2+)[µM]:

0; 5; 10 a 25

0; 5; 10; 17,5 a 25

Obr. 8 Klíční rostliny odrůd Recital, Bonet, Tábor a Hermes, ovlivněné různými koncentracemi kademnatých iontů, odebíraných 10.den kultivace.

[37]

7.2 Vliv iontů kadmia na růst kořenových a nadzemních částí klíčních rostlin lnu setého V den odběru vzorků jsme měřili délky kořenové a nadzemní části u 19 odrůd lnu setého. Kořen byl hodnocen pouze měřením délky kořene hlavního. Naměřené hodnoty shrnuje tabulka 7.

Tab. 7 Průměrná hodnota délek jednotlivých částí testovaných odrůd lnu koncentrace roztoku Cd(NO3)2 .4H20 [µM] 0 5 10 17,5 25 odrůda délka nadzemní části [mm] ESCALINA 19,29 16,00 16,24 16,06 18,79 ±0,63 ±0,48 ±0,54 ±1,40 ±0,82 AGATHA 18,17 12,26 11,67 13,89 10,31 ±0,51 ±0,37 ±0,62 ±0,24 ±0,38 ATALANTE 24,36 20,84 20,72 22,88 19,12 ±0,72 ±0,38 ±0,38 ±0,80 ±0,41 BILTSTAR 48,71 44,92 38,12 41,00 44,05 ±1,75 ±1,80 ±1,52 ±1,80 ±2,08 BONET 16,21 15,86 17,78 16,91 13,63 ±0,51 ±0,54 ±0,53 ±0,54 ±0,63 ELEKTRA 18,15 12,83 15,38 16,85 18,33 ±0,54 ±0,60 ±0,63 ±0,66 ±1,03 FLANDERS 24,08 23,29 22,13 18,23 19,92 ±0,61 ±0,62 ±0,56 ±0,57 ±0,48 HERMES 20,52 15,66 16,58 15,52 12,52 ±0,62 ±0,55 ±0,56 ±0,60 ±0,41 ILONA 17,42 15,57 15,15 17,12 16,00 ±0,39 ±0,69 ±0,67 ±0,46 ±0,40 JORDAN 21,24 20,00 20,52 20,32 17,11 ±0,50 ±0,61 ±0,46 ±0,42 ±0,77 LAURA 20,17 16,45 17,87 20,65 18,87 ±0,73 ±0,58 ±0,71 ±0,64 ±0,63 LOLA 28,81 24,29 24,33 24,17 19,94 ±1,29 ±1,13 ±0,69 ±0,94 ±0,72 MARILIN 14,50 14,96 14,55 15,27 15,55 ±0,43 ±0,59 ±0,60 ±0,49 ±0,56 MARINA 24,08 19,95 18,00 19,71 16,89 ±0,79 ±0,80 ±0,56 ±0,80 ±0,86 MERKUR 13,32 13,54 14,87 13,25 9,81± ±0,41 ±0,59 ±0,49 ±0,54 0,68 RECITAL 19,36 17,61 18,82 17,78 18,00 ±0,49 ±0,50 ±0,51 ±0,70 ±0,60 SUPER 18,08 18,50 16,57 16,68 14,41 ±0,47 ±0,66 ±0,49 ±0,52 ±0,41 TÁBOR 16,92 20,37 18,03 18,49 19,09 ±0,32 ±0,50 ±0,40 ±0,50 ±0,55 VIKING 18,34 14,07 13,76 14,86 14,38 ±0,15 ±0,41 ±0,30 ±0,47 ±0,51

0 5 10 17,5 25 délka hlavního kořene [mm] 30,74 16,90 17,35 14,94 16,44 ±2,01 ±0,67 ±0,97 ±0,64 ±0,62 61,74 15,31 16,82 19,43 18,50 ±3,32 ±0,54 ±0,46 ±0,52 ±0,94 43,12 20,76 20,28 20,96 20,28 ±1,60 ±0,52 ±0,49 ±0,29 ±0,23 37,70 17,24 15,60 15,57 17,70 ±2,70 ±2,00 ±0,90 ±1,28 ±0,97 26,15 26,42 27,38 27,18 26,61 ±0,76 ±1,20 ±1,54 ±0,92 ±0,89 35,92 20,94 20,85 22,91 24,25 ±1,33 ±0,71 ±0,83 ±0,88 ±1,82 26,42 17,76 17,72 15,50 15,83 ±1,35 ±0,87 ±1,30 ±1,51 ±1,06 53,88 27,30 26,05 25,39 24,40 ±2,49 ±0,79 ±1,60 ±1,06 ±1,57 39,97 21,89 21,17 21,55 23,59 ±1,43 ±0,80 ±1,19 ±0,93 ±0,74 45,40 25,24 25,00 24,17 25,00 ±1,49 ±0,63 ±0,70 ±0,61 ±1,28 49,92 24,23 29,65 32,75 34,57 ±1,78 ±0,98 ±1,46 ±1,30 ±1,29 36,52 22,88 21,33 24,33 18,33 ±1,79 ±1,24 ±1,25 ±1,27 ±0,98 50,57 23,35 25,15 24,96 25,93 ±2,02 ±1,11 ±1,58 ±1,17 ±1,19 52,50 26,81 25,43 27,05 28,28 ±2,90 ±0,98 ±0,80 ±0,88 ±0,96 39,76 18,42 18,85 20,25 17,84 ±1,65 ±1,00 ±0,27 ±1,22 ±1,24 42,19 23,57 25,80 23,11 23,38 ±1,19 ±0,74 ±0,97 ±0,81 ±0,86 44,29 20,25 20,83 19,29 21,63 ±1,79 ±0,83 ±0,84 ±0,60 ±0,98 31,32 24,39 20,39 23,53 22,45 ±0,97 ±0,73 ±0,88 ±0,57 ±0,82 77,03 27,66 24,39 23,56 25,93 ±3,79 ±0,85 ±0,96 ±0,88 ±0,78

Pozn: Jsou uvedeny střední chyby průměru.

[38]

Obrázek 9 s grafy níže (obr. 9a, 9b, 9c) zobrazují data tabulky 7, tj. závislost délek nadzemních a kořenových částí klíčních rostlin lnu (pro každou z 19 odrůd zvlášť) na použité koncentraci kadmia. 80

Agatha, 25.3.

70

nadzemní

délka [mm]

60

kořen

50 40 30 20 10 0 0

5

10 2+

17,5

25

-1

c (Cd ) [µmol.l ] 80

80

Atalante, 7.4.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

Elektra 28.4.

0

0

5

80

10

17,5

25

0

5

80

Biltstar 14.4.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

10

17,5

25

17,5

25

17,5

25

Escalina, 17.3.

0

0

5

80

10

17,5

25

0

5

80

Bonet, 21.4.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

10 Flanders 5.5.

0

0

5

10

17,5

25

0

5

10

Obr. 9a Závislost částí klíčních rostlin na koncentraci kademnatých iontů. Pozn: Pro všech 19 grafů platí stejné popisy os a legenda jako u grafu Agatha. Chybové úsečky představují střední chybu průměru.

[39]

80

80

Ilona 26.5.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

Marilin 15.9.

0

0 0

5

80

10

17,5

0

25

5

80

Jordán 2.6.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

10

17,5

25

17,5

25

17,5

25

17,5

25

17,5

25

Marina 22.9.

0 0

5

80

10

17,5

25

0

5

80

Hermes 19.5.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

10 Merkur 6.10.

0

0

5

80

10

17,5

25

0

5

80

Laura 9.5.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

10 Recital 20.10.

0

0

5

80

10

17,5

25

0

5

80

Lola 19.6.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

10 Super 27.10.

0

0

5

10

17,5

25

0

5

10

Obr. 9b Závislost částí klíčních rostlin na koncentraci kademnatých iontů.

[40]

80

80

Tábor 3.11.

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

Viking 1.12.

0

0 0

5

10

17,5

0

25

5

10

17,5

25

Obr. 9c Závislost délky částí klíčních rostlin na koncentraci kademnatých iontů. Pozn: Pro všech 19 grafů platí stejné popisy os a legenda jako u grafu Agatha. Chybové úsečky představují střední chybu průměru.

Naše měření prokázala širokou variabilitu růstu různých odrůd lnu při shodných podmínkách kultivace. Ukázalo se, že kademnaté ionty inhibují růst nadzemní části i hlavního kořene. V případě nadzemní části však nebyly rozdíly vždy u všech koncentrací a odrůd průkazné. Při koncentraci 5 µM kademnatých iontů nebyl průkazný rozdíl oproti kontrolní variantě u odrůdy Super, Bonet, Jordán, Merkur, Marilin, při koncentraci 10 µM u odrůdy Recital, Jordán, Marilin, při koncentraci 17,5 µM u odrůdy Atalante, Bonet, Jordá, Ilona a Laura, Merkur a Marilin, při koncentraci 25 µM u odrůdy Escalina a Elektra. Zajímavé bylo zjištění, že u odrůdy Bonet byl rozdíl průkazný, ale hodnota byla vyšší než u kontroly, přičemž u odrůdy Tábor byly hodnoty průkazně vyšší u všech stresovaných variant. V případě délky hlavního kořene byly rozdíly délek stresovaných variant oproti kontrole průkazné ve všech případech s jednou výjimkou – tou byla odrůda Bonet, která u všech stresovaných variant měla průměrnou délku hlavního kořene dokonce vyšší než u kontroly, ale rozdíl nebyl průkazný. Co se týče výsledků pouze v rámci stresovaných variant: Rozdíly mezi délkami části u jednotlivých koncentrací kademnatých iontů nebyly většinou průkazné, a to jak v případě nadzemní části a tak i kořenové. Rostliny tedy reagovaly růstem do délky velice podobně na všechny námi použité koncentrace kadmia a průkazný rozdíl jsme nemohli potvrdit ani mezi krajními koncentracemi, tj. 5 a 25 µM . Jediná odrůda Biltstar měla nadzemní část delší než kořeny a délka nadzemní části převyšovala ostatní odrůdy, velkou část z nich přibližně o 50 %. Délkou nadzemní části

[41]

vynikaly také odrůdy Lola, dále Flanders a Atalante. Naopak nízká výška nadzemní části rostlin byla pozorována například u odrůd Merkur, Agatha, Hermes (obr. 10 a 11). Délky nadzemní části klíčních rostlin lnu 90 80

délka[mm]

70 60 50 40 30 20 10 0 0

5

10

17,5

25

c Cd(II) [µM] Escalina Merkur

Agatha Recital

Atalante Super

Biltstar Tábor

Elektra Bonet

Flanders Jordán

Hermes Laura

Ilona Lola

Marilin viking

Marina

Obr. 10 Závislost délek nadzemních částí klíčních rostlin lnu na použité koncentraci kademnatých iontů.

Jinak tomu bylo v případě hodnot délek hlavního kořene klíčních rostlin lnu setého. Zde je variabilita mezi odrůdami i koncentracemi vyšší a rozdíly průkazné ve více případech. Kademnaté ionty u rostlin více inhibují růst kořene než nadzemní části (obr. 11). Nejdelšími hodnotami hlavního kořene vynikala v případě kontroly odrůda Viking a Agatha, u stresovaných variant u většiny koncentrací Laura. Naopak nejkratší kořeny u kontroly měly odrůdy Bonet a Flanders, u odrůdy Bonet se tato délka téměř nezměnila, a tak v případě stresovaných variant měl kořen naopak jeden z nejdelších. Jedny z nejkratších kořenů u stresovaných variant měla odrůda Biltstar, která naopak pozitivně vynikala délkou své nadzemní části (obr. 10 a 11). Délky kořenových částí klíčních rostlin lnu 90 80

délka[mm]

70 60 50 40 30 20 10 0 0

5

10

17,5

25

c Cd(II) [µM] Escalina Merkur

Agatha Recital

Atalante Super

Biltstar Tábor

Elektra Bonet

Flanders Jordán

Hermes Laura

Ilona Lola

Marilin viking

Marina

Obr. 11 Závislost délek nadzemních částí klíčních rostlin lnu na použité koncentraci kademnatých iontů. [42]

Jak už jsem zmínila, v rámci stresovaných variant se u délek částí klíčních rostlin nepodařilo prokázat rozdíly, a to ani mezi krajními koncentracemi, tj. 5 a 25 µM. Proto jsme v další části práce pro zjednodušení pracovali s daty pouze jedné z koncentrací kadmia. Vybrali jsme vyšší koncentraci kademnatých iontů 17,5 µM, nejvyšší koncentraci, tedy 25 µM jsme vyloučili pro menší množství dat z důvodu odumření některých rostlin. Cílem bylo najít odrůdy s nejvýraznější reakcí na kademnaté ionty. U každé odrůdy jsme proto procentuálně vyjádřili poměr mezi naměřenou délkou a délkou kontrolní varianty. Obrázek 12 graficky zobrazuje tyto výsledné hodnoty a ukazuje, nakolik byly rostliny stresované 17,5µM koncentrací kademnatých iontů inhibovány v růstu. Nadzemní části nereagovaly tak citlivě jako kořeny, vždy dosahovala minimálně 75 % kontroly. Zato hlavní kořen byl kadmiem inhibován až na pouhých 30 % délky kontroly (odrůda Viking, Agatha). Průměr z těchto procentuálních poměrů kořenové i nadzemní části sloužil k seřazení odrůd grafu obrázku 12 - od nejméně po nejvíce tolerantní k 17,5µM koncentraci kadmia. Z toho čtyři nejcitlivější a čtyři nejtolerantnější vybrané odrůdy zobrazuje tabulka 8: Nejméně tolerantními odrůdami jsou Agatha, Viking, Hermes a Biltstar. Nejvíce tolerantními odrůdami jsou pak Bonet, Tábor, Laura, Elektra. délka 17,5 17,5µM varianty / délka kontrolní varianty [%]

110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

nadzemní část

kořeny

Obr. 12 Poměr naměřených délek nadzemní i kořenové části rostlin stresovaných 17,5µM koncentrací kadmia v poměru k délce dosažené u kontrolní varianty, vyjádření v procentech. Pozn.: Odrůdy jsou v grafu seřazeny za sebou dle celkového průměru zobrazených hodnot pro nadzemní a kořenovou část.

[43]

Tab. 8 Procentuálně vyjádřený poměr průměrných délek osmi vybraných odrůd lnu stresovaných 17,5µM koncentrací kadmia v poměru k průměrné délce dosažené u kontrolní varianty. nejvíce Cd-tolerantní odrůdy BONET

%

nejméně Cd-tolerantní odrůdy AGATHA

TÁBOR

10 4 92

LAURA

84

HERMES

ELEKTRA

78

BILTSTAR

VIKING

% 5 4 5 6 6 1 6 3

7.3 Výsledky kvalitativních měření – vliv iontů kadmia na obsah thiolových látek klíčních rostlin lnu Byly studovány vybrané thiolové sloučeniny systémem vysokoúčinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí HPLC-ED. V této práci jsme pomocí této metody detekovali konkrétně cystein, GSH, GSSG a PC2, PC3 a PC4 (obr. 13).

Obr. 13 Ukázka výsledného chromatogramu analýzy thiolových látek systémem HPLC-ED jednoho z reálných vzorků.

Analyzováno bylo osm odrůd lnu setého, které jsme vybrali na základě morfometrických hodnot (tab. 8). Thiolové látky byly tedy sledovány u nejméně tolerantních odrůd Agatha, Viking, Hermes a Biltstar (v následujících grafech jejich [44]

hodnoty zobrazeny v levých sloupcích) a u nejvíce tolerantních odrůd Elektra, Laura, Tábor a Bonet (v následujících grafech jejich hodnoty zobrazeny v pravých sloupcích).

Nejjednodušší analyzovanou sloučeninou byl cystein. V nadzemní části rostlin ovlivněných kadmiem jsme zaznamenali u některých odrůd nárůst obsahu cysteinu ve srovnání s kontrolou (obr. 14). Velmi vysoké hodnoty byly naměřeny u odrůdy Hermes, zde se obsah zvyšoval se zvyšující se koncentrací kadmia (s výjimkou 17,5 µM koncentrace). Obsah cysteinu byl u 10µM koncentrace kadmia více jak 2× vyšší, u 25µM téměř 4×. Nárůst obsahu cysteinu v nadzemní části byl pozorován, i když v menším rozsahu, u odrůd Agatha, Elektra a Laura. U odrůd Viking, Biltstar, Tábor a Bonet se obsah mírně snížil či výrazně neměnil. Nezaznamenali jsme prokazatelnou korelaci mezi vyšším obsahem cysteinu a vyšší koncentrací kadmia. Cystein - nadzemní část 250

Cys [µmol.g-1]

200 150 100 50 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Viking

Hermes

Biltstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 14 Závislost obsahu cysteinu v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

V kořenové části (obr. 15) jsme opět pozorovali nárůst obsahu cysteinu u stresovaných variant u odrůdy Hermes a dále tentokrát Bonet a Tábor. S výjimkou 17,5µM koncentrace kadmia nárůst Cys koreloval přibližně s koncentrací kadmia. Vyšší hodnoty oproti kontrole prokázala také odrůda Biltstar. U odrůdy Agatha byl naměřen nejvyšší obsah ze všech odrůd u nejvyšší koncentrace kadmia, ale u koncentrací 5 a 17,5µM kadmia byl přitom oproti kontrole pozorován pokles cysteinu. U odrůd Elektra a Laura můžeme alespoň u dvou nejvyšších koncentrací Cd prokázat také nárůst Cys. U odrůdy Viking se ovšem obsah Cys vlivem kadmia snížil.

[45]

Cystein - kořenová část

250

Cys [µmol.g-1] ]

200 150 100 50 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Viking

Hermes

Biltstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 15 Závislost obsahu cysteinu v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

Další thiolovou látkou, kterou jsme analyzovali byl redukovaný glutathion. Jeho obsah u různých odrůd a koncentrací různým způsobem kolísal (obr. 16 a 17). U odrůdy Agatha byl obsah GSH pozitivně ovlivněn nejnižší koncentrací kadmia, u ostatních koncentrací jsme naměřili stejné množství jako u kontroly, velmi podobně tomu bylo u odrůdy Viking (citlivé odrůdy). U odrůdy Hermes jsme pozorovali vyšší obsah GSH u variant ovlivněných kadmiem, nejvíce jej bylo u 10µM koncentrace kadmia. U odrůdy Biltstar se obsah GSH v nadzemní části zvyšuje s koncentrací kadmia, u nejvyšší koncentrace však klesá. U tolerantních odrůd tomu pak bylo jinak: U Elektry se také s koncentrací kadmia GSH zvyšuje, neplatí to ale u nejnižší koncentrace. U Laury je dokonce obsah u stresovaných variant 5 a 10 µM nižší než u kontroly, ale u dvou nejvyšších koncentrací jsme naopak naměřili obsahy vyšší. U odrůdy Tábor je tomu naopak - u nižších koncentrací jsme zjistili obsah GSH vyšší, u nejvyšších koncentrací pak mírně nižší než u kontroly. Ve všech případech nižší obsah GSH u stresovaných variant vykazuje odrůda Bonet.

[46]

GSH - nadzemní část

140 120 GSH [µmol.g-1]

100 80 60 40 20 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l-1] Agatha

Viking

Hermes

Bilstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 16 Závislost obsahu redukovaného glutathionu v nadzemní části na použité koncentraci dusičnanu kademnatého. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

V rostlině je obsah GSH dle našich měření přirozeně vyšší v kořenové části (obr. 17). Vliv kadmia se u odrůdy Agatha projevil nižšími hodnotami GSH v kořeni (celkově nejnižší- citlivá odrůda), stejně tomu bylo i u odrůdy Hermes, Biltstar a Laura. U odrůdy Viking se obsah GSH příliš nezměnil. Zvýšení GSH vlivem Cd se projevilo u odrůdy Elektra (kromě 17,5µM koncentrace), Tábor (kromě 10µM koncentrace) a Bonet (kromě 25µM koncentrace), tj. tolerantních odrůd. GSH - kořenová část

600

GSH [µmol.g-1]

500 400 300 200 100 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Viking

Hermes

Bilstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 17 Závislost obsahu redukovaného glutathionu v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

Obsahy oxidovaného glutationu (GSSG) v nadzemní části se u kontroly i stresovaných variant výrazně neliší (obr. 18 a 19). Nejvyšší hodnoty vykazují u kontroly

[47]

odrůdy Tábor a Bonet (tolerantní odrůdy). Celkově nejnižší hodnoty u odrůdy Agatha (nejcitlivější odrůda). Lze vysledovat inhibiční tendence kadmia na obsah GSSG v nadzemní části u odrůdy Agatha, obdobně pak též u odrůd Elektra, Laura a Bonet a Tábor. Zvýšení GSSG vlivem kadmia jsme zaznamenali u odrůdy Biltstar a nepatrně také u odrůdy Viking (kromě 5µM koncentrace). U odrůdy Hermes byly naměřené hodnoty bez větších rozdílů. GSSG - nadzemní část 50

GSSG [µmol.g-1]

40 30 20 10 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Viking

Hermes

Biltstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 18 Závislost obsahu oxidovaného glutathionu v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

Analýzy kořenových části ukázaly na výraznější změny obsahu GSSG (obr. 19). Nárůst a nejvyšší hodnoty vůbec pozorujeme nejvýrazněji u odrůdy Agatha (nejcitlivější odrůda), nárůst pak pravidelně u odrůdy Tábor. U koncentrace 5 a 17,5µM nárůst i u Biltstar. U ostatních odrůd je obsah GSSG u stresovaných variant velmi nízký. GSSG - kořenová část 50

GSSG [µmol.g-1]

40 30 20 10 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l-1] Agatha

Viking

Hermes

Biltstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 19 Závislost obsahu oxidovaného glutationu v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

[48]

Prováděli jsme analýzu více typů PC, a to PC2, PC3 a PC4. Dle naměřených dat je celkově obsah PC2 vyšší v nadzemní části (obr. 20). Odrůda Agatha má obsah PC2 výrazně nejnižší, a tak tomu je i u stresovaných variant. U některých odrůd pozorujeme u vzorků ovlivněných 17,5 µM (příp. 25 µM) koncentrací kadmia vyšší koncentrace PC2, a to u Viking, Hermes a Bonet. U jiných koncentrací jejich hodnoty kolísají. U odrůd Laura a Tábor se dokonce projevuje u stresovaných variant snížení hodnot PC2.

PC2 - nadzemní část 4

PC2 [µmol.g-1]

3

2

1

0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Obr.

20

Viking

Hermes

Závislost

Biltstar

obsahu

Elektra

PC2

Laura

Tábor

v nadzemní

Bonet

části

na

použité

koncentraci

kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

V kořenové části jsme naměřili celkově méně PC2 než v nadzemní části rostlin (obr. 21). U odrůdy Agatha, Hermes, Elektra a Bonet se koncentrace PC2 se zvyšující se koncentrací kadmia snižují, jedinou výjimkou je pak odrůda Viking. PC2 - kořenová část 4

PC2 [µmol.g-1]

3

2

1

0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Viking

Hermes

Biltstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 21 Závislost obsahu PC2 v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

[49]

Analýzy PC3 (obr. 22 a 23) ukázaly na větší podíl v kořenové části ve srovnání s nadzemní. U nadzemní jsme pozorovali zvýšení koncentrace PC3 vlivem kadmia u odrůdy Bonet (kdy byla koncentrace PC3 nejvyšší i u kontroly), Biltstar, Tábor a mírně také u Hermes. Nejnižší koncentraci vykazuje odrůda Agatha, ale vlivem Cd se mírně zvýšila. U odrůdy Viking byly u stresovaných variant naměřeny nižší koncentrace než u kontroly.

PC3 - nadzemní část

PC3 [µmol.g-1]

3

2

1

0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Obr.

22

Viking

Hermes

Závislost

Biltstar

obsahu

Elektra

PC3

Laura

Tábor

Bonet

v nadzemní

části

na

použité

koncentraci

kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

V kořenové části (obr. 23) byly koncentrace PC3 velmi nízké a kadmiem nebyly téměř ovlivněny. U stresovaných variant byly nejvyšší u Bonet a Tábor. PC3 - kořenová část

PC3 [µmol.g-1]

3

2

1

0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l -1] Agatha

Viking

Hermes

Biltstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 23 Závislost obsahu PC3 v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

[50]

Obsah PC4 byl u některých odrůd oproti ostatním fytochelatinům vyšší v kořenové části (obr. 25). V případě nadzemní části jsme zjistili vyšší hodnoty u stresovaných variant u odrůd Elektra a Bonet (obr. 24). Nárůst nastal také u Biltstar. Agatha společně s odrůdou Tábor měly hodnoty PC4 nejnižší. PC4 - nadzemní část

PC4 [µmol.g-1]

3

2

1

0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l-1] Agatha

Viking

Hermes

Biltstar

Elektra

Laura

Tábor

Bonet

Obr. 24 Grafické vyjádření závislosti obsahu PC4 v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

Vyšší koncentrace se v kořenové části (obr. 25) opět projevily u odrůd Elektra a Bonet a také jsme u stresovaných variant zjistili nárůst PC4 u Elektry, Laury a Hermes, ale to platí u dvou nejnižších koncentrací, u dvou resp. jedné nejvyšší koncentrace se hodnoty snižují přibližně na úroveň kontroly). Agatha společně s odrůdou Tábor měly hodnoty PC4 opět i v kořenové části nejnižší. Odrůda Viking měla nejvyšší koncentraci PC4 u kontrolní varianty, u stresovaných variant byl obsah minimálně poloviční.

PC4 - kořenová část

PC4 [µmol.g-1]

3

2

1

0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l-1] Agatha

Obr.

25

Viking

Závislost

Hermes

Biltstar

obsahu

Elektra

PC4

Laura

Tábor

Bonet

v kořenové

kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %).

[51]

části

na

použité

koncentraci

Pro lepší orientaci ve výsledcích jsme obsah fytochelatinů PC2, PC3 a PC4 sečetli (obr. 26 a 27). Nadzemní část (obr. 26) vykazuje ve srovnání s kořenovou částí celkově vyšší obsah fytochelatinů. V případě nadzemní části vyniká nejvyššími hodnotami odrůda Bonet (nejtolerantnější odrůda) a Hermes. Nejmenší obsah jsme naměřili u odrůdy Agatha (nejcitlivější odrůda). U citlivých odrůd došlo s vyšší koncentrací kadmia spíše k mírnému nárůstu PC, u tolerantních odrůd Elektry a Laury a Tábor spíše k poklesu, u tolerantní odrůdy Bonet zprvu k poklesu, u dvou nejvyšších koncentrací k vzestupu. V případě kořenové části (obr. 27) byly nejvyšší hodnoty naměřeny opět u vzorků odrůdy Bonet a dále Viking a Hermes. Nejnižší opět u odrůdy Agatha (nejcitlivější odrůda). PC v kořenové části má u všech odrůd s nárůstem koncentrace kadmia spíše klesající tendenci, ovšem u odrůd Bonet, Tábor, Elektra a Laura (tj. odrůdy tolerantní) s maximem ne u kontroly, ale u varianty 5 µM. PC- nadzemní část 6

suma PC [µmol.g-1]

5 4 3 2 1 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l-1] Agatha

Obr.

26

Viking

Hermes

Závislost

Biltstar

obsahu

Elektra

PC4

Laura

Tábor

Bonet

v kořenové

části

na

použité

koncentraci

kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %). PC - kořenová část 6

suma PC[µmol.g-1]

5 4 3 2 1 0 0

5

10

17,5

25

c (Cd2+) [µmol.l-1] Agatha

Obr.

27

Viking

Hermes

Závislost

Biltstar

obsahu

Elektra

PC4

Laura

Tábor

Bonet

v kořenové

části

na

použité

kademnatých iontů. Pozn.: Chybová úsečka představuje chybu měření (5 %). [52]

koncentraci

8 DISKUSE 8.1 Vliv iontů kadmia na růst jednotlivých částí klíčních rostlin Fytoremediace těžkých kovů technickými plodinami se jeví jako slibná levná metoda ozdravování a využití kontaminovaných půd. V této diplomové práci jsme se zabývali objasněním vlivu kadmia ve formě vodného roztoku několika koncentrací (5, 10, 17,5 a 25 µM) na klíční rostliny devatenácti odrůd lnu setého. Cílem byl výběr vhodných odrůd pro fytoremediační účely a další studie (např. akumulace a transport kovů v jednotlivých částech). Častými symptomy toxického působení Cd je především redukce prodlužovacího růstu a celkově nižší produkce biomasy. Hnědnou kořenové vlásky a špičky, tvorba bočních kořenů je snížena. Na listech se objevují chlorózy, nekrózy a červenohnědé zabarvení žilnatiny. Toxické působení kadmia může vést až k vadnutí a uhynutí rostliny (Prasad, 1995; Sanita di Toppi a Gabbrielli; 1999; Adriano, 2001; Kabata-Pendias, 2001; Seregin a Ivanov, 2001;). Konkrétně u lnu tyto symptomy pozoroval například Douchiche (2007). Testy toxicity s klíčícími rostlinami lnu prováděl např. kolektiv Bjelková a kol. (2007a). Ti prokázali inhibiční vliv těžkých kovů na růst kořínku s lineární závislostí dle použité koncentrace těžkého kovu a variabilitu odezvy mezi jednotlivými odrůdami. Tato diplomová práce potvrdila ve shodě s citovanou literaturou inhibiční vliv kadmia oproti kontrole na prodlužovací růst klíčních rostlin lnu setého, statisticky průkazný ovšem jen v případě hlavního kořene. Podle literatury bývá toxický kov detoxikován v kořeni a do nadzemní části jej proniká menší množství kovu. Tento jev odpovídá našim výsledkům morfometrických měření, kdy právě na rozdíl od kořene nadzemní část není kovem prokazatelně ovlivněna. Kademnaté ionty výrazně inhibovaly tvorbu bočních kořenů a v důsledku jejich působení došlo i k poškození a hnědnutí hlavního kořene. Nemohli jsme pozorovat vliv kadmia na kořenové vlásky, ty se totiž v hydroponické kultuře nevytváří. Chlorózy a nekrózy na listech jsme pozorovali spíše výjimečně. Vlivem nejvyšší použité koncentrace kadmia některé rostliny vadly. Potvrdili jsme prokazatelné rozdíly v růstu testovaných odrůd i v jejich reakci na kadmium. Evidentní byly rozdíly mezi růstem kontroly a rostlin ovlivněných kadmiem,

[53]

zajímavé však bylo, že statisticky průkazný rozdíl nebyl potvrzen mezi jednotlivými koncentracemi kadmia. Zvolili jsme proto druhou nejvyšší koncentraci kadmia (17,5 µM) a na základě morfometrických dat pro tuto koncentraci vybrali čtyři nejcitlivější (Agatha, Viking, Hermes a Biltstar) a čtyři tolerantní odrůdy lnu (Elektra, Laura, Tábor a Bonet). Odrůda Viking, odrůda námi vyhodnocena jako citlivá,byla jinými autory popsána typicky nízkou akumulací Cd a průměrnou tolerancí, dále jsou k dispozici data k odrůdě Biltstar – ta je údajně typická vysokou akumulací Cd, odrůdy Bonet a Elektra byly shodně s našimi výsledky charakterizovány jako tolerantní i (viz tab.6). Tyto vnímavé a naopak tolerantní odrůdy jsme použili v druhé části práce pro zjištění obsahu thiolových látek. Pro přesnější zjištění rozdílů mezi odrůdami a koncentracemi by bylo zřejmě vhodnější, ovšem časově náročnější, nechat rostliny delší dobu kultivovat a společně s tím také měřit celkovou délku všech kořenů včetně bočních a měřit čerstvé hmotnosti jednotlivých rostlin.

8.2 Vliv iontů kadmia na množství thiolových látek K analýze

thiolových

sloučenin

byla

použita

vysokoúčinná

kapalinová

chromatografie s elektrochemickou detekcí HPLC-ED. Zjišťovali jsme množství cysteinu, GSH, GSSH a fytochelatinů PC2, PC3 a PC4. Cystein (Cys) základním prekurzorem pro syntézu složitějších thiolových sloučenin, které slouží k účinnější obraně před toxickými kovy. U všech odrůd kromě odrůdy Hermes jsme pozorovali vyšší obsah Cys v kořenové části nežli v nadzemní. Ke shodnému závěru došel také Stejskal (2008) při pokusech s rostlinami slunečnice ovlivněných ionty olova. Jelikož kořen je hlavním vstupem toxických iontů z roztoku do rostliny a buňky kořene jsou v rostlině intoxikovány jako první, je tento jev předpokladatelný. Rostlina je v kořenové části nucena syntetizovat obranné látky ve větším množství. Nepodařilo se vysledovat korelaci mezi obsahem Cys odrůd a zjištěnou citlivostí či tolerancí odrůd dle morfometrických dat. Jedna z citlivých odrůd, Hermes, v nadzemní části vyniká oproti dalším odrůdám obsahem Cys. Tento jev by mohl spíše ukazovat na odlišný metabolismus cysteinu. Vzhledem k poměrně nízké koncentraci GSH v nadzemní části má tato odrůda možná horší schopnost syntézy GSH, a proto je nevyužitý cystein akumulován. Baloun a kol., 2008 vysledovali, že převážná část Cys, GSH, a GSSG se nachází v kořenové části, zatímco fytochelatiny jsou zastoupeny především v části nadzemní. [54]

I přes velkou variabilitu testovaných odrůd jsme pozorovali shodné tendence. Obsah Cys a GSH byl u většiny odrůd vyšší v kořenové než nadzemní části, v případě GSH byl tento rozdíl velmi výrazný. Naopak celkový obsah fytochelatinů byl o něco vyšší v části nadzemní. Při první reakci buněk s toxickým kovem v kořenech se pravděpodobně lépe uplatňují spíše nízkomolekulární thiolové sloučeniny jako Cys a GSH a jejich syntéza je zde více indukována. V nadzemní části možná více dochází k uplatnění složitějších molekul fytochelatinů ve srovnání s Cys a GSH, nebo jsme možná v nadzemní části neměřili mírně vyšší obsah fytochelatinů jen z důvodu většího přebytku volného nenavázaného PC. Některé práce, zabývající se vlivem kadmia na rostliny shodně uvádí vzrůstající tendence obsahu Cys, GSH, GSSG a PC s délkou expozice a aplikovaným množstvím kadmia (Zehnálek a kol. 2004; Svoboda a kol. 2006; Zítka a kol., 2007). Tento průběh nemůžeme jednoznačně potvrdit. Variabilita obsahu thiolů u různých odrůd i koncentrací je vysoká. Snahou

bylo

sledovat

obsah

thiolových

látek

především

v souvislostí

s tolerancí/citlivostí odrůd. Zjistili jsme, že u nejcitlivější odrůdy Agatha můžeme najít zajímavé souvislosti. V nadzemní části byly koncentrace GSH přibližně stálé, ovšem s vysokým vzestupem u 5 µM koncentrace kadmia V kořenové části byl u této odrůdy obsah GSH ze všech odrůd nejnižší a vlivem kadmia se dále snižoval, zároveň se projevil výrazným nárůst oxidovaného glutationu GSSG. Právě tento jev ukazuje na vzestup oxidačního stresu v kořenové části, na který tato odrůda zřejmě citlivě reaguje a oproti ostatním odrůdám má pravděpodobně horší schopnost obranné reakce. V nadzemní části vzestup GSH při nejnižší koncentraci kadmia může signalizovat snahu o obrannou reakci, která však při vyšší toxické dávce kadmia byla utlumena. Pokud jsme se zaměřili na výsledky u tolerantních odrůd (Elektra, Bonet, Tábor), ty např. v případě koncentrace GSH nevykazovaly nejvyšší hodnoty, ale bylo zřejmé, že kadmium má v jejich případě stimulační efekt na obsah GSH a zároveň se nezvyšuje množství GSSG. U nich je tedy obranná reakce a vypořádání se s oxidačním stresem pravděpodobně velmi účinné. Toxický kov, který pronikne do rostlinné buňky, indukuje dle literatury v buňce syntézu fytochelatinů, látek majících schopnost velmi efektivně a specificky zabránit toxicitě těžkých kovů v buňce. Pro lepší orientaci ve výsledcích jsme obsahy PC2, PC3 a PC4 sečetly. U nejcitlivější odrůdy Agatha jsme tak mohli vysledovat, že je typická nejnižším obsahem PC v nadzemní i kořenové části. Naopak nejvíce tolerantní odrůda [55]

Bonet prokázala obsahy PC především v nadzemní části zcela nejvyšší. Nabízí se proto domněnka, že vyšší obsah PC pozitivně koreluje s tolerancí odrůdy. Někteří autoři se však na základě svých prací domnívají, že akumulace PC naopak není pro toleranci a hypertoleranci rostlin zcela podstatná. De Knecht a kol. (2004, 2005) a Schat a kol. (2002) sledovali citlivé a hypertolerantní populace Silene vulgaris a zjistili překvapivě opačné tendence. U hypertolerantních populací potvrdily i vyšší akumulace kadmia, ovšem vyšší obsahy PC vykazovaly populace citlivé. Je například možné, že u hypertolerantních rostlin jsou mechanismy obrany a metabolismus souvisejících látek oproti běžným rostlinám odlišné. Bohužel obsahy thiolových látek vykazují u dalších námi testovaných odrůd kromě Agatha a Bonet pouze určité tendence, variabilita výsledků nedovoluje další závěry. Vztah mezi citlivostí a obsahem fytochelatinů je proto i vzhledem k různým názorům dalších autorů zatím diskutabilní. Mnoho mechanismů tolerance u rostlin jsme zatím neobjasnily. Předpokládáme, že koncentrace thiolových látek bude více souviset s transportem a akumulací těžkého kovu v rostlině. Tyto analýzy jsou v plánu a v současné době se již rozpracovávají.

[56]

9 ZÁVĚR Len jako plodina s komplexním technickým využitím je perspektivní rostlinou vhodnou pro fytoremediace kontaminovaných půd. Práce byla zaměřena na charakterizaci a srovnání hydroponicky pěstovaných klíčních rostlin lnu setého Linum usitatissimum L. z hlediska vlivu těžkého kovu (kadmia). Devatenáct odrůd přadného i olejného lnu bylo vystaveno účinkům roztoku Cd(NO3)2. 4H2O v koncentracích 5µM, 10µM, 17,5µM a 25µM. Kultivace probíhala po dobu deseti dnů. Cílem bylo na základě morfometrických měření vybrat několik odrůd citlivých a naopak tolerantních, u kterých jsme dále systémem vysokoúčinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí analyzovali obsahy obranných thiolových látek v jednotlivých částech rostlin. Zaznamenali jsme toxický efekt kadmia na růst rostlin, průkazný byl inhibiční vliv kadmia na růst hlavního kořene a vývoj bočních kořenů. Cysteinu a redukovaného glutationu jsme naměřili více v kořenové části, zatímco fytochelatiny se vyskytovaly více v nadzemní části. Vztah obsahu thiolových látek s tolerancí/senzitivitou odrůd je stále nejasný, i když mezi nejcitlivější odrůdou Agatha a nejvíce tolerantní odrůdou Bonet byl výrazný rozdíl v celkovém obsahu PC, přičemž více jej akumulovala odrůda tolerantní. Cílem dalších prací výzkumného centra bude pracovat dále s vybranými odrůdami na objasnění akumulace a transportu kadmia a nalezení vztahu mezi obsahem thiolových látek a tolerancí či citlivostí odrůd.

[57]

10 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY • ADRIANO, D.C. Trace elements in terrestrial environments. 2001. SpringerVerlag, New York. 866 s. • AIDID, S.B., OKAMOTO, H. Responses of elongation rate, turgor pressure and cell wall extensibility of stem cells of Impatiens balsamina to lead, cadmium and zinc. BioMetals, 199, č. 36, s. 245–249. • ALLOWAY, B.J. Heavy metals in soil. J. Wiley & Sons, New York, 1990. 331 s. • ANDERSON, M.E. Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chemico-Biological Interactions, 1998, č. 112, s.1–14. • ANGELOVA, V., IVANOVA, R., DELIBALTOVA, V., IVANOV, K. Bioaccumulation and distribution of heavy metals in fibre crops (flax, cotton and hemp). Industrial Crops & Products, 2004, č. 19, s. 197–205. • BALOUN, J. Studium interakce těžkých kovů s glutathionem. Význam pro in vitro kultivace rostlin. Diplomová práce. Brno: MZLU Brno, Agronomická fakulta, 2008. • BALOUN, J., HÚSKA, D., DIOPAN, V., ADAM, V., KRYŠTOFOVÁ, O., MACEK, T., HAVEL, L., KIZEK, R. Sledování thiolových sloučenin u rostlin vystavených environmentálnímu stresu, monitorování transportu a distribuce iontů těžkých kovů, sledování efektů těžkých kovů na vybrané fytohormony. In Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin, Sborník příspěvků, Křtiny: MZLU Brno, 2008, s. 54–58. ISBN 978-80-7375-234-7. • BARCELÒ, J, POSCHENRIEDER, C. Plant water relations as affected by heavy metal stress: a review. Journal of Plant Nutrition, 1990, č. 13, s.1–37. • BECHER, N., WORNER, A., SCHUBERT, S. Cd translocation into generative organs of linseed (Linum usitatissmum L.). Zeitschrift für Pflanzenernährung und Bodenkunde, 1997, č. 160, s. 505–510. • BJELKOVÁ, M., TEJKLOVÁ, E., GRIGA, M, GENČUROVÁ, V. Uptake and accumulation of cadmium and lead by flax and hemp. In: Proc. First European Bioremediation Conference, Chania, Greece, 2001, 492-496. • BJELKOVÁ, M., GRIGA, M. Genetic differences of flax and linseed varieties in phytoectraction of Cd from contaminated soil: field-simulated study. In: VANĚK, T., SWITZGUÉBEL, J.P. (Eds.): Phytoremediation Inventory – COST Action 837 View. UOCHB AVČR Praha, 2003, s. 64. • BJELKOVÁ, M., BLAŽEK, O.,GRIGA, M. Vliv těžkých kovů na dynamiku klíční semen lnu. In: Bláha L. (ed.). Vliv biotických a abiotických stresorů na vlastnosti rostlin. VÚRV Praha, 2007a, s. 566–572. ISBN 978-80-87011-00-3 • BJELKOVÁ, M., VĚTROVCOVÁ, M., GRIGA, M. Akumulace kadmia, olova a zinku přadným a olejným lnem: screening genových zdrojů Linum usitatissimum L. In: Mikroelementy 2007 – Sborník přednášek XLI. Semináře o metodice stanovení a významu stopových prvků v biologickém materiálu a v životním prostředí. Český Těšín, 2007b, s. 106-110. ISBN 978-80-86380-40-7. • BJELKOVÁ, M., VĚTROVCOVÁ, M., GRIGA, M. The effect of sewage sludgeamended soil on Cd, Pb and Zn accumulation by flax/linseed plants (Linum usitatissimum L.) In: Abstract Book Cost 859, Workshop, Vilnius, Lithuania, 2007c, s. 131-134. [58]

• BLAŽEK, O., TEJKLOVÁ, E., GRIGA, M., ZIMOLKA, J. Vliv Cd a Zn na růst lnu (Linum usitatissimum L.) v podmínkách in vitro. In Sborník příspěvků: MendelNet 2004. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2004. ISBN 80-7302-088-2. • BOROVIK, A. S. Characterizations of metal ions in biological systems. In Heavy Metal Tolerance in Plants: Evolutionary Aspects. 1990. Edited by Shaw, A. J. Boca Raton. CRC Press. • BOUSSAMA, N., OURITI, O., SUZUKI, A., GHORBAL, M.H. Cd-stress on nitrogen assimilation. Journal of Plant Physiology, 1999, č.155, s. 310–317. • CIBULKA, J., a kol. Pohyb olova, kadmia a rtuti v biosféře. 1.vyd. Praha: Academia, 1991. s. 62–104. • CIESLINSKI, G., VAN REES, K.C.J., HUANG, P.M., KOZAK, L.M., ROSTAD, H.P.W., KNOTT, D.R., Cadmium uptake and bioaccumulation in selected cultivars of durum wheat and flax as affected by soil type. Plant and Soil, 1996, č. 182, s. 115–124. • CLEMENS, S. Molecular mechanisms of plant metal homeostasis and tolerance. Planta, 2001, č. 212, s.475–486 • CLEMENS, S., PALMGREN, M. G., KRÄMER, U. a long way ahead: understanding and engineering plant metal accumulation. Trends in Plant Science, 2002, roč. 7, č. 7, s. 309–315. • COBBETT, S. CH. Phytochelatins and Their Roles in Heavy Metal Detoxification. Plant Physiology, 2000, č. 123, s. 825–832. • CUNNINGHAM, S.D., BERTI, W.R., HUANG, J.W. Phytoremediation of contaminated soils. Trends in Biotechnology, 1995 roč. 13, č. 9, s. 393–397. • DE KNECHT, J.A., VAN DILLEN, M., KOEVOETS, P.L.M., SCHAT, H., VERKLEIJ, J.A.C. Phytochelatins in Cadmium-Sensitive and CadmiumTolerant Silene vulgaris (Chain Length Distribution and Sulfide Incorporation). Plant Physiology, 1994, roč. 104, č. 1, 255–261. • DE KNECHT, J.A., VAN BAREN, N., TEN BOOKUM, W.M., WONG FONG • SANG, H.W., KOEVOETS, P.L.M., SCHAT, H., VERKLEIJ, J.A.C. Synthesis and degradation of phytochelatins in cadmiumsensitive and cadmium-tolerant Silene vulgaris. Plant Science, 1995, roč. 106, č. 1, s. 9–18. • DOUCHICHE, O., RIHOUEY, C., SCHAUMANN, A., DRIOUICH, A., MORVAN, C. Cadmium-induced alterations of the structural features of pectins in flax hypocotyl. Planta, 2007, roč. 225, č. 5, s. 1301-1312. • FLORIJN, P. J. AND VAN BEUSICHEM, M. L. Uptake and dristribution of cadmium in maize inbred lines. Plant and Soil, 1993, č. 150, s. 25-32. • GHOSH, M., SINGH, S.P. a review on phytoremediation of heavy metals and utilization of its byproducts. Applied Ecology and Environmental research, 2005, roč. 3, č. 1, s. 1–18. • GLOSER, J., PRÁŠIL, I. Fyziologie stresu. In PROCHÁZKA, MACHÁČKOVÁ, KREKULE, ŠEBÁNEK a KOL. Fyziologie rostlin. Praha: Academia, 1998. s. 412–430. • GOUIA, H., GHORBAL, M.H., MEYER, C. Effects of cadmium on activity of nitrate reductaseand on other enzymes of the nitrate assimilation pathway in bean. Plant Physiology Biochem., 2000, č. 38, s. 629–638. • GOUIA H., SUZUKI, A., BRULFERT, J., GHORBAL, M.H. Effects of cadmium on the coordination of nitrogen and carbon metabolism in bean seedlings. Journal of Plant Physiology, 2003, č. 160, s. 367–376. [59]

• GRANT, C.A., BAILEY, L.D. Effects of phosphorus and zinc fertilizers on cadmium uptake and distribution in flax and durum wheat. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1997, č. 73, s. 307–314. • GRANT C.A., DRIBNENKI P., BAILEY, L.D. Cadmium and zinc concentrations and ratios in seed and tissue of solin (cv LinolaTM 947) and flax (cvs McGregor and Vimy) as affected by nitrogen and phosphorus fertiliser and Provide (Penicillium bilaji). Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, č. 80, s. 1735–1743. • GREGER M., JOHANSSON M., STIHL A., HAMZA K. Foliar uptake of Cd by pea (Pisum sativum) and sugar beet (Beta vulgaris). Physiol. Plant., 1993, roč.88, s. 563-570. • GRIGA, M., BJELKOVÁ, M., TEJKLOVÁ, E. Flax and hemp – industrial crops for phytoremediation of contaminated soils. In First Scientific Workshop COST Action 837: Phytoremediation 2000 – State of the Art in Europe (An Intercontinental Comparsion). Hersonissos, Greece, 2000, s. 45-46 • GRIGA, M., BJELKOVÁ, M., TEJKLOVÁ, E. Potential of flax (Linum usitatissimum L.) for heavy metal phytoextraction and industrial processing of contaminated biomass - a review. In: MENCH M. AND MOQUOT B. (Eds.): Risk assessment and sustainable land management using plants in trace element-contaminated soils, Centre INRA Bordeaux - Aquitaine, Villenave d´Ornon, France, 2003a, s. 174–180. • GRIGA, M., BJELKOVÁ, M., TEJKLOVÁ, E. Phytoextraction of heavy metals by fibre crops: Linum usitatisimum L. case study. In: Proc. Second Europ. Bioremediation Conf., Chania, Crete, 2003b, s. 337–340. • GRILL, E., WINNACKER, E.L., ZENK, M.H. Phytochelatins: The principal heavy-metal complexing peptides of higher plants. Science, 1985, č. 230, s. 674– 676. • GRILL E, WINNACKER EL AND ZENK MH. Occurence of heavy metal binding phytochelatins in plants growing in a mining refuse area. Experientia, 1988, č 44, s. 539–540. • GRILL E, LOFFLER S, WINNACKER EL AND ZENK MH. Phytochelatins, the heavy-metal-binding peptides of plants, are synthesized from glutathione by a specific glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase (phytochelatin synthase). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, č. 86,s. 6838-6842. • GUSSARSSON, M. Cadmium-induced alterations in nutrient composition and growth of Betula pendula seedlings: the significance of fine root as a primary target for cadmium toxicity. Journal of Plant Nutrition, 1994, č. 17, s. 2151– 2163. • HALL, J. L., Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of Experimental Botany, 2002, roč. 53, č. 366, s. 1–11. • HALL, J.L., WILLIAMS, L.E. Transition metal transporters in plants. Journal of Experimental Botany, 2003, roč. 54, s. 2601–2613. • HERNANDEZ, L.E., CARPENA-RUIZ, R., GARATE, A. Alterations in the mineral nutrition of pea seedlings exposed to cadmium. Journal of Plant Nutrition, 1996, č. 19, s. 1581–1598. • HOCKING, P. J., MCLAUGHLIN, M. J. Genotypic variation in cadmium accumulation by seed of linseed, and comparison with seeds of some other crop species. Australian Journal of Agricultural Research, 2000, č. 51, s. 427–433. [60]

• HOWDEN, R., GOLDSBROUGH, P.B., ANDERSEN, C.R., COBBETT, C.S. Cadmium-sensitive, cad1, mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient. Plant Physiology, 1995, č. 107, s. 1059–1066. • CHAKRAVARTY, B., SRIVASTAVA, S. Effects of genotype and explant during in vitro response to cadmium stress and variation in protein and proline contents in linseed. Annals of Botany, 1997a, č. 79, s. 487-491. • CHAKRAVARTY, B., & SRIVASTAVA, S. Effect of cadmium and zinc interaction on metal uptake and regeneration of tolerant plants in linseed. Agriculture, Ecosystems and Environment, 1997b, č. 61, s. 45–50. • KABATA-PENDIAS, A. Trace Elements in Soils and Plants. 3. vyd. Boca Raton: CRC Press 2001. s. 73–98, 208–220. ISBN 0-8493-1575-1. • KALAČ, P., TŘÍSKA, J. Chemie životního prostředí. Jihočeská Univerzita, České Budějovice: 1998. • KHAN, D.H., FRANKLAND, B. Effects of cadmium and lead on radish plants with particular reference to movement of metals through soil profile and plant. Plant and Soil, 1983, roč. 70, č. 3, s. 335–345. • KNEER R., ZENK M.H. Phytochelatins protect plant enzymes from heavy metal poisoning. Phytochemistry, 1992, č. 31, s. 2663–2667. • KONEČNÁ, E. Vliv těžkých kovů na produkci cytokininů. Bakalářská práce. Brno: MZLU Brno, Agronomická fakulta, 2008. • KRÄMER, U.,; TALKE, I. N.,; HANIKENNE, M. Transition metal transport. FEBS Letter, 2007, č. 581, s. 2263–2272. • KRUPA, Z, OQUIST, G., HUNER, N. P. A. The effects of cadmium on photosynthesis of Phaseolus vulgaris - a fluorescence analysis. Physiologia Plantarum, 1993, č. 88, s. 626–630. • LARBI, A., MORALES, F., ABADIA, A., GOGORCENA, Y., LUCENA, J.J., ABADIA, J. Effect of Cd and Pb in sugar beet plants grown in nutrient solution: induced Fe deficiency and growth inhibition. Functional Plant Biology, 2002, č. 29, 1453–1464. • LARCHER, W. Physiological Plant Ecology, Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. 4. vyd., Springer, 2003. s. 428–437. • LASAT, M. M., Phytoextraction of metals from contaminated soil: a review of plant/soil/metal interactons and assesment of pertinent agronomic issues. Journal of Hazardous Substances Research, 2000, č. 2, s. 5–25. • LI, Y.M., CHANEY, R.L., SCHNEITER, A.A., MILLER, J.F., ELIAS, E.M., HAMMOND, J.J. Screening for low grain cadmium phenotypes in sunflower, durum wheat and flax. Euphytica, 1997, č. 94, s. 23–30. • LOZANO-RODRIGUEZ, E.; HERNANDEZ, L. E.; BONAY, P.; CARPENARUIZ, R. O. Distribution of cadmium in shoot and root tissues of maize and pea plants: physiological disturbances. Journal of Experimental Botany, 1997, roč. 48, č. 306, s.123–128. • MENCH, M., TANCOGNE, J., GOMEZ, A., JUSTE, C. Cadmium bioavailability to Nicotiana tabacum L., Nicotiana rusticana L., and Zea mays L. grown in soil amended or not amended with cadmium nitrate. Biology and fertility of Soils, 1989, roč. 8, str. 48–53. • MORAGHAN, J.T.,. Accumulation of cadmium and selected elements in flax seed grown on a calcerous soil. Plant and Soil, 1993, č. 150, s.61–68. • NAJMANOVÁ, J., KOTRBA, P., MACKOVÁ, M., MACEK, T. Příprava transgenního lnu s geny pro syntézu glutathionu. In Funkční genomika [61]

• •

• •

• •

• • • •

• • • • • •

a proteomika ve šlechtění rostlin, Sborník příspěvků, Křtiny, MZLU Brno, 2008, s. 46-47. ISBN 978-80-7375-234-7 NÁTR, L. Minerální výživa. In PROCHÁZKA, MACHÁČKOVÁ, KREKULE, ŠEBÁNEK a KOL. Fyziologie rostlin. Praha: Academia, 1998. s. 114–116. NOVÁKOVÁ, M., FIŠER, J., MACKOVÁ, M., MACEK, T. Změny v přístupu klonování genů CUP a TODC1C2 pro přípravu transgenních lnů. In Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin, Sborník příspěvků, Křtiny, MZLU Brno, 2008, s. 44–45. ISBN 978-80-7375-234-7 ORTIZ, D.F., RUSCITTI, T., McCUE, K.F., OW, D.W. Transport of Metalbinding Peptides by HMT1, a Fission Yeast ABC-type Vacuolar Membrane Protein. Journal of Biological Chemistry, 1995, roč. 9, č.270, s. 4721–4728. PETRLOVA, J.; MIKELOVA, R.; STEJSKAL, K.; KLECKEROVA, A.; ZITKA, O.; PETREK, J.; HAVEL, L.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution-liquid chromatography with Coul-Array detection. Journal of separation science, 2006, č. 29, s. 1166–1173. PIERZYNSKI, G., SIMS, T., VANCE G. Soils and environmental quality. 2. vyd. CRC Press 2000. s.245–272. POTESIL, D.; PETRLOVA, J.; ADAM, V.; VACEK, J.; KLEJDUS, B.; ZEHNALEK, J.; TRNKOVA, L.; HAVEL, L.; KIZEK, R. Simultaneous femtomole determination of cysteine, reduced and oxidized glutathione, and phytochelatin in maize (Zea mays L.) kernels using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography A, 2005, č. 1084, s. 134–144. PRASAD M.N.V. Cadmium toxicity and tolerance in vascular plants. Environmental and Experinmental Botany, 1995, roč. 35, č. 4, s. 525–545. PRASAD M.N.V., HAGEMEYER J. Heavy metal stress in plants: from molecules to ecosystem. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1999. 401 s. RAUSER, W.E. Structure and function of metal chelators produced by plants. Cell biochemistry and biophysics, 1999, č. 31, s. 19–48. RAUSER, W.E. Phytochelatin-based complexes bind various amounts of cadmium in maize seedlings depending on the time of exposure, the concentration of cadmium and the tissue. New Phytologist, 2003, roč. 158, č. 2, s. 269–278. RAVEN, K. P., LOEPPERT, R. H. Trace Element Composition of Fertilizers and Soil Amendments. Journal of Environmental Quality, 1997, č.26, s. 551–557. REESE, R.N., WHITE, C.A., WINGE, D.R. Cadmium sulfide crystallites in Cd-(γEC)nG peptide complexes from tomato. Plant Physiology, 1992, č. 98, s. 225–229. SALT, D.E., WAGNER, G.J. Cadmium transport across tonoplast of vesicles from oat roots. Journal of Biological Chemistry, 1993, č. 268, s.12297-12302. SALT, D.E., PRINCE, R.C., PICKERING, I.J, RASKIN, I. Mechanisms of cadmium mobility and accumulation in indian mustard. Plant Physiology, 1995, roč. 109, str. 1427–1433. SANITA DI TOPPI, L., GABBRIELLI, R. Response to cadmium in higher plants. Environmental and Experimental Botany, 1999, roč. 41, s. 105–130. SCHAT, H., LLUGANY, M., VOOIJS, R., HARTLEY-WHITAKER, J., BLEEKER, P. M. The role of phytochelatins in constitutive and adaptive heavy

[62]

• • •

• • • •

• • • • •

• •

•

metal tolerances in hyperaccumulator and non-hyperaccumulator metallophytes. Journal of Experimental Botany, 2002, roč. 53, č. 379, s. 2381–2392. SCHULZE , E. D., BECK E. , MÜLLER-HOHENSTEIN, K. Plant Ecology. Springer, 2005. s. 174−193. SEREGIN, I. V., IVANOV , V. B. Physiological Aspects of Cadmium and Lead Toxic Effects on Higher Plants, Russian Journal of Plant Physiology, 2001, roč. 48, č. 4, s. 523–544. SEREGIN, I. V., VOOIJS, R., KOZHEVNIKOVA, A. D., IVANOV, V. B., SCHAT, H. Effects of Cadmium and Lead on Phytochelatin Accumulation in Maize Shoots and Different Root Parts. Doklady Biological Sciences, 2007, č. 415, s. 304–306. SEWARD, M. R., RICHARDSON D. H. Atmospheric sources od metal pollution and effect on vegetation. In Heavy Metal Tolerance in Plants: Evolutionary Aspects. 1990. Edited by Shaw, A. J. Boca Raton. CRC Press. SHAW, A. J., Heavy metal tolerance in plants: evolutionary aspects. CRC Press. 1990. s. 355. ISBN 0-8493-6852-9 SHAW, B.P. Effects of mercury and cadmium on the activities of antioxidative enzymes in the seedlings of Phaseolus aureus. Biologia Plantarum, 1995 č. 37, s. 587–596. SOUDEK, P. Fytoremediace [online]. Laboratoř rostlinných biotechnologií v Praze: učební materiály pro studenty. [cit. 10.10. 2008]. Dostupné na internetu: SOUDEK, P., PETROVÁ, Š, BENEŠOVÁ, D., KOTYZA, J., VANĚK, T. Fytoremediace a možnosti zvýšení jejich účinnosti. Chemické listy, 2008, č. 102, s. 346–352. STEJSKAL, K. Syntéza thiolových sloučenin u modelových rostlin exponovaných toxickým těžkým kovům. Bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, 2008. SVOBODA, M., ADAM, V., BEKLOVÁ, M., HAVEL, L., ZEHNÁLEK, J., KIZEK, R. Vliv kadmia na změny obsahu thiolových sloučenin u klíčních rostlin cukrové řepy. Listy cukrovarnické a řepařské, 2006, roč. 122, č. 5–6. ŠTAUD, J., VAŠÁK, J. a kolektiv. Základy pěstování přadného a olejného lnu. Institut výchovy a vzdělávání MZe ČR v Praze. 1997. ISBN 80-7105130-6 TEJKLOVÁ, E., BLAŽEK, O., SMÝKALOVÁ, I., VRBOVÁ, M., VĚTROVCOVÁ, M., GRIGA, M. In vitro screening of Linum usitatissimum L. varieties for Cd-tolerance and Cd-accumulation. In: COST 859 WG1 and WG3 Workshop „Nutrient biofortification and exclusion of pollutants in food plants“, Sede Boqer, Israel, 2007, s.32. TESTER, M., LEIGH, R.A. Partitioning of nutrient transport processes in roots. Journal of Experimental Botany, 2001, č. 52, s. 445–457. TLUSTOŠ, P., PAVLÍKOVÁ, D., BALÍK, J. Mechanismus příjmu rizikových prvků rostlinami a jejich hromadění v biomase. [online] Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha, 2005. [cit. 14. 1. 2009] Dostupné na: http://www.phytosanitary.org/project.php?idp=59/ TLUSTOŠ, P., SZÁKOVÁ, J., KOŘÍNEK, K., PAVLÍKOVÁ, D., HANČ, A., BALÍK, J. The effect of liming on cadmium, lead, and zinc uptake reduction by

[63]

• • •

•

•

• • • • • •

spring wheat grown in contaminated soil. Plant, Soil and Environment, 2006, č. 52, s. 16–24. VACEK, J., KIZEK, R., KLJEDUS, B., HAVEL, L. Fytochelatiny a jejich role pro detoxikaci těžkých kovů: biosyntéza, regulace a transport. Biologické listy, 2003, roč. 68, č. 2, s. 133–153. VAN ASSCHE, F., CLIJSTERS, H. Effects of metals on enzyme activity in plants. Plant Cell Environ, 1990, č. 13, s. 195–206. VAN ASSCHE, F., CLIJSTERS, H. Induction of enzyme capacity in plants as a result of heavy metal toxicity: Dose-response relations in Phaseolus vulgaris L., treated with zinc and cadmium. Environmental Pollution, 1988, roč. 52, č. 2, s. 103-115. VÖGELI-LANGE, R. AND WAGNER, G.J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Implication of a transport function for cadmium-binding peptides. Plant Physiology, 1990, č. 92, s. 1086–1093. VRBOVÁ, M., FOJTA, M., HAVRAN, L., FOJTOVÁ, M., GRIGA, M., PODLIPNÁ, R. Phytochelatin levels in cell suspension cultures of two flax (Linum usitatissimum L.) varieties under cadmium stress. In Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin, Sborník příspěvků, Křtiny, MZLU Brno, 2008, s. 54-58. ISBN 978-80-7375-234-7. WALKER, W.R., MILLER, J.E., HASSETT, J.J. Effect of lead and cadmium upon the calcium, magnesium, potassium and phosphorous concentration in young corn plants. Soil Science, 1977, č. 124, s. 145–151. WHITE, R. E., Practice of soil science. Blackwell Science Publishing 1997. s. 193–221. ZEHNÁLEK, J., VACEK, A., KÍZEK, R. Využití rostlin ve fytoremediační technologii těžkých kovů. Listy cukrovarnické a řepařské, 2004. č. 120, s. 220–221. ZEHNÁLEK, J., ADAM, V., KIZEK, R. Vliv těžkých kovů na produkci obranných sloučenin u zemědělských kulturních rostlin. Listy cukrovarnické a řepařské, 2004b, roč. 120, č. 7–8, s. 222–224. ZENK, M.H., Heavy metal detoxification in higher plants - a review. Gene, 1996, č. 179, s. 21–30. ZÍTKA, O., STEJSKAL, K., KLECKEROVÁ, A., ADAM, V., BEKLOVÁ, M, HORNA, A., ŠUPÁLKOVÁ, V., HAVEL, L., KIZEK, R. Využití elektrochemických technik pro analýzu biologických vzorků. Chemické Listy, č. 101, 2007, s. 225−231.

[64]

11 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Mechanismus příjmu, transportu a detoxikace kovů u vyšších rostlin ........................................... 20 Obr. 2 Struktura cysteinu ........................................................................................................................... 21 Obr. 3 Struktura redukovaného (vlevo) a oxidovaného (vpravo) glutathionu ......................................... 21 Obr. 4 Schéma detoxikace kadmia fytochelatiny v buňce rostlin. ............................................................. 22 Obr. 5 Struktura fytochelatinů ................................................................................................................... 23 Obr. 6 Kultivační dózy s klíčními rostlinami lnu....................................................................................... 33 Obr. 7 Klíční rostliny odrůdy Viking ovlivněné různými koncentracemi kademnatých iontů .................. 36 Obr. 8 Klíční rostliny odrůd Recital, Bonet, Tábor a Hermes, ovlivněné různými koncentracemi kademnatých iontů ......................................................................................................................... 37 Obr. 9a, 9b, 9c Závislost délky částí klíčních rostlin na koncentraci kademnatých iontů. ........................ 41 Obr. 10 Závislost délek nadzemních částí klíčních rostlin lnu na použité koncentraci kademnatých iontů. ................................................................................................................................................................... 42 Obr. 11 Závislost délek nadzemních částí klíčních rostlin lnu na použité koncentraci kademnatých iontů. ................................................................................................................................................................... 42 Obr. 12 Poměr naměřených délek nadzemní i kořenové části rostlin stresovaných 17,5µM koncentrací kadmia v poměru k délce dosažené u kontrolní varianty, vyjádření v procentech. ..................... 43 Obr. 13 Ukázka výsledného chromatogramu analýzy thiolových látek systémem HPLC-ED jednoho z reálných vzorků. ....................................................................................................................... 44 Obr. 14 Závislost obsahu cysteinu v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů ............. 45 Obr. 15 Závislost obsahu cysteinu v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů.............. 46 Obr. 16 Závislost obsahu redukovaného glutathionu v nadzemní části ..................................................... 47 Obr. 17 Závislost obsahu redukovaného glutathionu v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů............................................................................................................................................. 47 Obr. 18 Závislost obsahu oxidovaného glutathionu v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů. .............................................................................................................................................. 48 Obr. 19 Závislost obsahu oxidovaného glutationu v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů.. ............................................................................................................................................. 48 Obr. 20 Závislost obsahu PC2 v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů.................... 49 Obr. 21 Závislost obsahu PC2 v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. ................... 49 Obr. 22 Závislost obsahu PC3 v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů.................... 50 Obr. 23 Závislost obsahu PC3 v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. ................... 50 Obr. 24 Grafické vyjádření závislosti obsahu PC4 v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů. .............................................................................................................................................. 51 Obr. 25 Závislost obsahu PC4 v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů. ................... 51 Obr. 26 Závislost celkového obsahu PC v nadzemní části na použité koncentraci kademnatých iontů .... 52 Obr. 27 Závislost celkvého obsahu PC v kořenové části na použité koncentraci kademnatých iontů....... 52

[65]

12 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Metabolické procesy ovlivněné kadmiem a některé odpovídající enzymy..................................... 16 Tab. 2 Běžné a nadlimitní koncentrace těžkých kovů v rostlinách ............................................................ 17 Tab. 3 Maximální limity kadmia v potravinách dle Nařízení Komise ES č. 1881/2006............................ 17 Tab. 4 Známé formy fytochelatinů ............................................................................................................ 23 Tab. 5 Inhibiční koncetrace jednotlivých těžkých kovů ............................................................................ 28 Tab. 6 Charakteristiky některých odrůd lnu............................................................................................... 31 Tab. 7 Průměrná hodnota délek jednotlivých částí testovaných odrůd lnu................................................ 38 Tab. 8 Procentuálně vyjádřený poměr průměrných délek osmi vybraných odrůd lnu stresovaných 17,5µM koncentrací kadmia v poměru k průměrné délce dosažené u kontrolní varianty.............................. 44

[66]