Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Vliv vybraných látek na koloidní stabilitu piva a možnosti jejího stanovení Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing. Tomáš Gregor, PhD.
Vypracoval: Bc. David Petráň
Brno 2012
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv vybraných látek na koloidní stabilitu piva a možnosti jejího stanovení vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne…………………………………
podpis ………………………...........
3
Rád bych vyjádřil svou vděčnost a poděkování vedoucímu mé bakalářské práce, panu Ing. Tomáši Gregorovi, Ph.D., za čas, úsilí a trpělivost, které mi věnoval v průběhu sestavování této práce a především za rady a připomínky, týkající se této práce. Děkuji.
4
SOUHRN Tato bakalářská práce se zabývá tvorbou koloidního zákalu piva a jeho příčinami. Práce obsahuje vybrané kapitoly z chemie koloidů a fyzikální chemie. Součástí této práce je také seznámení s chemickým složením jednotlivých surovin používaných pro výrobu piva. V dalších kapitolách je pojednáno o polyfenolických látkách a bílkovinách, jejich vlivu na koloidní stabilitu piva a možnostech stanovení těchto látek. V závěru se práce také zabývá možnostmi předpovědi koloidní stability piva.
Klíčová slova: polyfenoly, koloidní stabilita, pivo, zákal, stabilizace
SUMMARY This bachelor thesis deals with the formation of colloidal haze of beer and its causes. The work contains selected chapters from colloidal and physical chemistry. This work is also familiar with the chemical composition of the raw materials used for making beer. Next chapters deals with polyphenolic substances and proteins , their effect on the colloidal stability of beer and determination of these substances. At the end of the work is also discussed possibilities of predictions of colloidal stability of beer.
Key words: polyphenols, colloidal stability, beer, haze, stabilisation
5
OBSAH 1 ÚVOD ......................................................................................................................................8 2 CÍL PRÁCE .............................................................................................................................9 3 LITERÁRNÍ ČÁST ...............................................................................................................10 3.1 Úvod do chemie koloidů ....................................................................................... 10 3.1.1 Definice ....................................................................................................................10 3.1.2 Vlastnosti koloidních soustav ..................................................................................10 3.1.2.1 Velikost a tvar disperzních částic .....................................................................10 3.1.2.2 Kinetické vlastnosti odvozené z tepelného pohybu ...........................................11 3.1.2.3 Viskozita disperzních soustav ...........................................................................12 3.1.2.4 Optické vlastnosti disperzních soustav .............................................................13 3.1.3 Dělení disperzních soustav ......................................................................................13 3.1.4 Heterogenní disperze, stabilita.................................................................................14 3.2 Suroviny pro výrobu piva ..................................................................................... 15 3.2.1 Voda .........................................................................................................................15 3.2.2 Chmel .......................................................................................................................16 3.2.3 Slad ..........................................................................................................................16 3.3 Polyfenoly piva ..................................................................................................... 17 3.3.1 Charakteristika, rozdělení ........................................................................................18 3.3.2 Sladové polyfenoly ..................................................................................................22 3.3.3 Chmelové polyfenoly...............................................................................................23 3.3.4 Metody stanovení polyfenolů ..................................................................................25 3.3.4.1 Stanovení celkových polyfenolů ........................................................................25 3.3.4.2 Skupinová stanovení .........................................................................................25 3.3.4.3 Specifická stanovení ..........................................................................................26
6
3.4 Bílkoviny piva....................................................................................................... 30 3.4.1 Bílkoviny ječmenu ...................................................................................................31 3.4.2 Metody stanovení bílkovin ......................................................................................31 3.4.2.1 Stanovení celkových bílkovin ............................................................................31 3.4.2.2 Specifická stanovení ..........................................................................................33 3.5 Koloidní stabilita piva ........................................................................................... 34 3.5.1 Reakce polyfenolů a bílkovin ..................................................................................34 3.5.2 Metody předpovědi koloidní stability ......................................................................36 3.5.2.1 Kvantifikace koloidního zákalu .........................................................................36 3.5.2.2 Testy šokové ......................................................................................................37 3.5.2.3 Testy přítomnosti zákalotvorných prekurzorů ..................................................37 3.5.3 Stabilizace piva ........................................................................................................38 4 ZÁVĚR ..................................................................................................................................40 5 POUŽITÁ LITERATURA ....................................................................................................41 6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ....................................................................................45 7 SEZNAM OBRÁZKŮ ...........................................................................................................46
7
1 ÚVOD Pivo je nápoj, který lidstvo doprovází už od pradávna. Jeho obliba u nás i ve světě stále narůstá a proto je potřeba aby se ke spotřebiteli dostal produkt požadované kvality. Tedy produkt s charakteristickou čerstvou vůní a chutí, který má odpovídající barvu, pěnivost a je čirý. V dnešní době jsou kladeny vysoké nároky na trvanlivost, která u piva může představovat až jeden rok. Po celou tuto dobu přitom musí být zachovány jeho vlastnosti a jakostní parametry. Pivo představuje velmi složitý disperzní systém, skládající se až z několika tisíc látek, proto i nepatrné změny v tomto systému mohou způsobit, že by výsledný produkt měl odlišné vlastnosti či byl odlišný od předešlé šarže. Jedním z hlavních senzorických rysů piva je jeho čirost. Když pivo jako produkt opouští pivovar, je čiré. Přesto se v něm v průběhu skladování může z různých příčin objevit zákal, což ho činí spotřebitelsky nepřijatelným. Proto se většina výrobců soustředí na takové technologické
zákroky,
které
by
zabránily
nežádoucím
senzorickým
změnám.
(Dienstbier 2010) Výjimkou jsou piva nefiltrovaná, pro které je zákal charakteristický a senzoricky žádoucí. Trvanlivost takových piv je ale zkrácena na dny až týdny.
8
2 CÍL PRÁCE Cílem práce je seznámení s polyfenolyckými látkami a bílkovinami piva, jejich vlastnostmi, strukturou, vzájemnými interakcemi a možnostmi stanovení. Dále seznámení se surovinami pro výrobu piva a jejich chemickým složením. Dále seznámení se základy chemie koloidů, koloidní stabilitou piva, jejím vlivem na senzorickou hodnotu, seznámení s možnostmi předpovědi trvanlivosti piva a metodami stabilizace.
9
3 LITERÁRNÍ ČÁST 3.1 Úvod do chemie koloidů 3.1.1 Definice Disperzní systém (zkráceně disperze) je soustava obsahující disperzní podíl, rozptýlený ve formě částic v disperzním prostředí. Až na výjimky představují disperzní podíl a disperzní prostředí dvě chemicky odlišné složky nebo směsi složek. Názvem koloid byly původně označovány látky podobného chování jako klíh (řecky kolla). Koloidní chemie je věda zabývající se vlastnostmi, přípravou a možnostmi využití soustav, ve kterých je jedna látka koloidně rozptýlena v látce druhé. Tyto směsi nejsou homogenní ani netvoří řádně se chovající vícefázové soustavy. (Bartovská 2005, Novák 2011, Pouchlý 2008) 3.1.2 Vlastnosti koloidních soustav 3.1.2.1 Velikost a tvar disperzních částic Jemnost s jakou jsou disperzní částice rozptýleny je charakterizována velikostí částic (převrácená hodnota tohoto rozměru se nazývá stupeň disperzity). Na základě stupně disperzity pak lze disperzní soustavy klasifikovat: (Bartovská 2005, Novák 2011, Pouchlý 2008) a) analytické disperze (pravé roztoky): disperzní fáze je v disperzním prostředí rozptýlena na úrovni molekul - d < 1 nm, b) koloidně disperzní soustavy: disperzní fáze je v disperzním prostředí rozptýlena v podobě
částic
(pozorovatelné
v
elektronovém
mikroskopu,
nikoliv
v
optickém) - 1 nm < d < 1 µm, c) hrubě disperzní soustavy: disperzní fáze je v disperzním prostředí rozptýlena v podobě částic o velikosti kolem 1 µm (pozorovatelné v optickém mikroskopu) - d > 1 µm. Pokud je disperze tvořena stejně velkými částicemi, pak hovoříme o systému uniformním, pakliže je tvořena částicemi různé velikosti, jedná se o systém neuniformní. K úplné charakterizaci neuniformní soustavy je nutno dodat statisticky distribuční funkci rozměrů, která udává zastoupení částic té které velikosti. (Novák 2011)
10
Dělení dle tvaru částic: a) soustavy s izometrickými částicemi: neboli globulárně disperzní soustavy, které mají všechny rozměry alespoň přibližně stejné. Tyto částice sice nejsou kulovité, ale jsou natolik symetrické, že je lze aproximovat koulí. Velikost izometrických částic lze vyjádřit poloměrem, který lze vypočítat z naměřených fyzikálních vlastností disperze: difúzní koeficient, rychlost sedimentace. b) s anizometrickými částicemi: mohou být laminárně disperzní, jejichž jeden rozměr je řádově menší než ostatní nebo fibrilárně disperzní: s částicemi, jejichž jeden rozměr je řádově vyšší než ostatní. Velikost anizometrických (nepravidelných částic) lze vyjádřit několika způsoby. Martinův průměr (dM) je dán délkou úsečky půlící obsah průmětu částice. Feretův průměr (dF) je vyjádřen vzdáleností protilehlých tečen k průmětu částice. Další možností je Heywoodův průměr (neboli plošný, dH), který je dán průměrem kruhu o stejném obsahu jako průmět částice. (Bartovská 2005) c) zvláštní třídu potom představují lineární nebo větvené makromolekuly, které účinkem intramolekulárního tepelného pohybu neustále mění svůj tvar. V tomto případě jde o otáčivý pohyb části molekuly kolem valenčního spoje při současném zachování délky vazby a úhlu vazby. (Novák 2011) 3.1.2.2 Kinetické vlastnosti odvozené z tepelného pohybu Kinetické vlastnosti disperzních soustav jsou dány tepelným pohybem částic, který je ovlivněn teplotou, velikostí a tvarem částic. Částice disperzního podílu se chovají stejně jako částice disperzního prostředí: vykonávají chaotický termický pohyb, vlivem srážek mění neustále svůj směr, i směr částic se kterými se srážejí. Množství nárazů nebývá ze všech stran stejné, takže částice se pohybuje nepředvídatelně po velmi složité dráze. S rostoucí velikostí a hmotností se zvyšuje i pravděpodobnost kompenzace nárazu, proto větší částice (kolem 4 µm) pouze vibrují kolem určitého centra. V důsledku pohybu částic dochází v systémech s koncentračním gradientem k samovolnému vyrovnávání koncentrací difuzí, která je charakterizována Fickovými zákony. Rychlost difuze se zvyšuje se stoupající teplotou a rostoucím tlakem a klesá se zvyšující se viskozitou a velikostí částic.
11
Částice o dostatečné hmotnosti se působením gravitačního pole usazují - sedimentují. Pokud je rychlost sedimentace menší než rychlost difuze, pak se usazování neprojeví. V opačném případě probíhá pouze sedimentace; jsou - li rychlosti obou jevů srovnatelné, uplatňují se oba děje a ustanoví se tzv. sedimentační rovnováha. (Novák 2011, Pouchlý 2008) 3.1.2.3 Viskozita disperzních soustav Viskozita je míra vnitřního odporu tekutiny vůči toku, ke kterému dochází účinkem vnějšího působení sil. Vnitřní síly vznikají jako důsledek vnitřního tepelného pohybu a mezimolekulárních sil. Při proudění tekutiny vzniká v důsledku mezimolekulárních sil ve stykové ploše dvou rozdílně se pohybujících vrstev tečné napětí, kterým se rychlejší vrstva snaží urychlovat vrstvu pomalejší a naopak. Viskozitu lze dle Newtona vypočítat jako podíl tečného napětí a gradientu rychlostí. U většiny kapalin a u všech plynů je takto vypočítaná viskozita konstantní, jedná se tedy o newtonské tekutiny. Existuje však i početná skupina nenewtonských tekutin, do které patří většina disperzích soustav. Hlavním důvodem nenewtonského toku je vytváření struktur v disperzním systému a orientace anizometrických částic způsobená rychlostním gradientem. (Bartovská 2005) Nenewtonské kapaliny lze rozdělit takto (Novák 2011): •
pseudoplastické: koncentrované makromolekulární roztoky a některé lyofobní soly s anizometrickými částicemi. V takovém systému se mohou tvořit nesourodé asociační struktury, které se se zvyšujícím střižným napětím rozbíjejí. Dochází tak k poklesu viskozity.
•
plastické: u těchto systémů se předpokládá trvalé vytvoření asociační struktury v celém objemu, která se rozrušuje až při vysokém napětí, kdy se vysoce viskózní kapalina začne chovat jako dobře tekutá.
•
dilatantní: takové chování vykazují koncentrované suspenze, ve kterých jsou částice rovnoměrně obaleny disperzním prostředím. Působením malé síly dochází k rozrušení této struktury, ale vlivem tepelného pohybu se stačí obnovovat původní uspořádání a suspenze zůstává v tekutém stavu. Působením velké síly dochází k deformaci uspořádání, systém se nestačí vracet do původního stavu a tak dochází ke kontaktu obnažených částic. Suspenze působí suše a odpor vůči toku prudce stoupá.
12
3.1.2.4 Optické vlastnosti disperzních soustav Ke zvláštnostem disperzních soustav patří i jejich optické vlastnosti, jejichž měřením lze stanovit některé parametry systému (koncentrace, velikost částic, molární hmotnosti, interakce mezi částicemi). Intenzita světelných paprsků se při prostupu disperzním systémem zmenšuje v důsledku dvou jevů (Novák 2011, Pouchlý 2008): a) pravá absorbce - pohlcené světelné záření zvýší energii systému a přeměňuje se v teplo. b) rozptyl světla - při kterém je pohlcené záření emitováno ve formě světla. Tento jev je pozorovatelný pouze u soustav, kde mají disperzní podíl a disperzní prostředí odlišný index lomu. Intenzita rozptýleného světla je měřitelná fotometricky a roste s velikostí dispergovaných částic. U hrubých disperzí dochází k odrazu a lomu paprsků na povrchu částic pod různými úhly, světlo se polarizuje a difuzně rozptyluje. Toto se projevuje jako zákal pozorovatelný v libovolném směru. U koloidních disperzí s velikostí částic srovnatelnou s vlnovou délkou je intenzita rozptýleného světla nižší, proto se jeví jako čiré. 3.1.3 Dělení disperzních soustav Podle velikosti a tvaru částic Viz kapitola 3.1.2.1. Podle fází - homogenní systém: disperzní prostředí a disperzní podíl tvoří jednu fázi, - heterogenní systém: disperzní prostředí je od disperzního podílu odděleno fázovým rozhraním (Tabulka I). Tabulka I: dělení heterogenních systémů podle přítomných fází. (Kvítek 2006) Disperzní fáze Disperzní prostředí plynné
kapalné
pevné
plynné
-
aerosol
aerosol
kapalné
pěny
emulze
lyosoly
pevné
tuhé pěny
tuhé emulze
tuhé soly
13
Podle struktury disperzního podílu - systémy s disperzním podílem ve formě částic, - systémy s disperzním podílem vytvářejícím souvislou prostorovou síť prostoupenou disperzním prostředím (gely). Podle interakcí mezi disperzními částicemi - volné (soly, koloidní roztoky), - vázané (gely, koncentrované suspenze, pasty). (Novák 2011) 3.1.4 Heterogenní disperze, stabilita Disperzní podíl a disperzní prostředí jsou odděleny fázovým rozhraním. Jejich vznik je umožněn pouze vynaložením určité práce, takto vzniklé soustavy jsou proto termodynamicky nestabilní a pokud nejsou stabilizovány, dochází k postupnému snižování stupně disperzity, až nakonec dojde k destrukci disperzní soustavy, tedy k rozdělení na dvě původní fáze. Pojem stabilita disperzních soustav vyjadřuje způsob, jakým se lze bránit proti procesům, které vedou ke změnám jejich struktury. Tato schopnost je ovlivněna skupenstvím a složením disperzního prostředí i disperzního podílu, stupněm disperzity nebo koncentrací dispergovaných částic. Stabilita může být posuzována z různých hledisek, zpravidla se posuzuje následovně: •
agregátní stabilita: stálost, s jakou systém zachovává svůj stupeň disperzity. U koloidních systémů je disperzní podíl rozptýlen na velmi malé částice, proto má fázové rozhraní velkou plochu a tedy i velkou mezifázovou energii, které roste se stupněm disperzity. Neexistuje-li energetická bariéra, dochází ke spontánnímu přechodu na nižší stupeň disperzity shlukováním, koagulací, koalescencí či slinováním. Nejčastějším jevem vedoucím k zániku soustavy je agregace disperzních částic, při které se, vlivem tepelného pohybu částic a přitažlivých sil, částice spojují v místě dotyku. Postupným napojováním dalších a dalších částic dosáhne agregát kritické hmotnosti, čímž dojde k narušení sedimentační rovnováhy (viz kapitola 3.1.2.2) a následnému vzniku dvousložkové soustavy sediment - čisté disperzní prostředí. Agregátní stabilitu lze podpořit stabilizací elektrickou dvojvrstvou, která spočívá v dvojvrstvě, vytvořené kolem částic s nabitým povrchem. Takto nabitý povrch
14
přitahuje ionty s opačným znaménkem. Všechny stejné částice v disperzním prostředí tedy mají stejný náboj a pokud dojde vlivem tepelného pohybu ke srážce, uplatní se místo adheze odpudivé síly a ke spojení nedojde. •
kinetická stabilita: neboli schopnost systému zachovat si koncentrační rozdělení v gravitačním poli. Rychlost sedimentace se zvyšuje s rostoucí velikostí a hmotností částic, zatímco protichůdná rychlost difuze roste s teplotou a klesá s poloměrem částic. (Novák 2011)
3.2 Suroviny pro výrobu piva 3.2.1 Voda Kvalita vody používané při výrobě piva hraje významnou roly ovlivňující konečný produkt. Přírodní vodu využívanou v pivovarech lze rozdělit do dvou skupin. Spodní voda (studniční,
pramenitá)
je
charakteristická
nízkým
obsahem
organických
látek,
mikroorganismů a vyšším obsahem iontů, zatímco voda povrchová (říční, jezerní) má vyšší obsah organických i anorganických látek, mikroorganismů a znečišťujících látek. Obsah iontů v přírodních vodách závisí zejména na geologickém složení podloží, v jejichž blízkosti se zdroj nachází. Získanou pitnou vodu je tedy potřeba upravit na požadované parametry. V případě podzemních vod je nutné odstranit rozpuštěný oxid uhličitý (odplyněním, přídavkem hydroxidu vápenatého) a Fe2+ a Mn2+ ionty (převodem na vyšší oxidační stupeň a následné vyloučení nerozpustných sloučenin hydroxidu železitého a oxidu manganičitého). Čištění povrchových vod je vzhledem ke stávajícímu znečištění náročnější a skládá se z několika kroků. Prvním je odstranění hrubých nečistot použitím sít, následuje koagulace koloidně rozptýlených složek (křemičitany, jíl) pomocí Fe3+ a Al3+ iontů, čímž vznikne zákal, který se nechá sedimentovat. Posledním krokem je filtrace zbývajících částic, které zůstaly v suspenzi. Mezi jakostní ukazatele vody
patří její tvrdost, způsobená přítomností iontů
alkalických zemin (Ca2+, Mg2+, Sr2+ a Mg2+). V současnosti se tvrdost vody vyjadřuje v milimolech na litr. Z hlediska obsahu zmiňovaných iontů se pak voda dělí na měkkou (<1,3 mmol.l-1), středně tvrdou (1,3 - 2,5 mmol.l-1), tvrdou (2,5 - 3,8 mmol.l-1) a velmi tvrdou (>3,8 mmol.l-1). (Kosař 2000, Melzoch 2002)
15
3.2.2 Chmel Je jednou ze základních surovin pro výrobu piva, jedná se v podstatě o usušenou chmelovou hlávku samičích rostlin chmele evropského (Humulus lupulus var. europeus). Chmel poskytuje pivu typické aroma, hořkost a další technologické vlastnosti, proto jsou velmi podstatné znalosti o jeho chemickém složení. Nejvýznamnější složkou chmele, představující až 20 % hmotnosti, jsou pryskyřice (obrázek 1), které pivu dodávají charakteristickou hořkost. Jedná se především o α-hořké kyseliny (humulon, kohumulon, adhumulon) a β-hořké kyseliny (lupulon, kolupulon, adlupulon). Tyto látky velmi snadno oxidují či podléhají změnám, proto je potřeba skladovat chmel v chladu, temnu a suchu.
Obrázek 1: α-hořké kyseliny (vlevo) a β-hořké kyseliny (vpravo). (Kosař 2000) Chmelové silice jsou směsí několika set organických látek zejména terpenického charakteru. Představují 0,2 až 2,5 % hmotnosti chmelu a jsou původcem aroma. Silice rozlišujeme na několik frakcí, u čerstvého chmelu je to frakce uhlovodíková, v průběhu skladování a zpracování vzniká frakce kyslíkatá a nakonec frakce sirných silic, která je zastoupena pouze nepatrně. (Kosař 2000) O vlivu dalších významných složek chmele jako jsou polyfenoly, jejich problematičnosti a významu bude pojednáno v jiné kapitole této práce. 3.2.3 Slad V našem, ale i světovém, pivovarnictví se pro výrobu sladu používá především ječmene, mnohem méně potom pšenice či jiných obilovin. Proto velký vliv na výslednou kvalitu má kromě technologie i chemické složení obilky. Ječmen obsahuje 80 až 88 % sušiny
16
a 12 až 20 % vody. Sušina je tvořena organickými dusíkatými a bezdusíkatými sloučeninami a anorganickými látkami. Obilka ječmene obsahuje zhruba 2 až 3 % popelovin, jejichž množství a zastoupení je ovlivněno podmínkami pěstování a zásobením živin. Anorganické látky (např. zinek, mangan, měď a bor) významně ovlivňují biosyntézu vysokomolekulárních látek (škrob, bílkoviny, nukleové kyseliny) a činnost řady enzymů. Nejvíce zastoupenou skupinou látek v obilce jsou sacharidy. Škrob představuje 65 % hmotnosti obilky a je tvořen větveným amylopektinem (~80 %) a lineární amylosou (~20 %). Škrob je lokalizován v endospermu ve formě škrobových zrn typického tvaru a velikosti. Větší, eliptická zrna o velikosti 40 µm představují asi 90 % hmotnosti škrobu a jsou snáze štěpitelná. Menší, sférická zrna jsou velká 1 až 10 µm, jsou hůře štěpitelná a tvoří zbývajících 10 % hmotnosti škrobu. Kromě škrobu obilka obsahuje také 10 % neškrobových sacharidů a to především celulosu, hemicelulosu, pentosany a lignin, které se podílejí zejména na stavbě a pevnosti buněčných stěn. Další významnou složkou jsou dusíkaté látky, jejichž obsah má podstatný vliv na sladařskou a pivovarnickou technologii, ale i na kvalitu samotného piva. Jejich obsah je velmi variabilní, závisí především na odrůdě, složení půdy, hnojení, předplodině a klimatických podmínkách. Obsah N-látek do jisté míry určuje vhodnost zrna pro sladovnické účely, optimální zastoupení hrubých bílkovin by se mělo pohybovat mezi 10 až 11,5 %. Bílkoviny mají společně s polyfenoly rozhodující vliv na koloidní stabilitu piva, proto jim bude věnována pozornost v následujících kapitolách. Lipidy jsou v zrnu zastoupeny pouze v množství 2 až 3 %. Jsou obsaženy především v klíčku, aleuronové vrstvě a pluchách. Jsou tvořeny triacylglyceroly (pravými tuky), volnými mastnými kyselinami (linolová, palmitová, olejová) a tak zvanými lipoidy (nepravé tuky - tuk vázaný na bílkoviny, sacharidy apod.). V průběhu sladování se částečně spotřebují během dýchání, většina však zůstává ve sladovém mlátu. Nepatrné množství pak při rmutování přechází i do mladiny a může tak ovlivnit senzorické vlastnosti piva a jeho pěnivost. (Kosař 2000, Melzoch 2002)
3.3 Polyfenoly piva Jsou jednou z nejdůležitějších kvalitativních složek významně ovlivňujících jakost a trvanlivost piva. Jelikož se jedná především o sekundární metabolity rostlin, je zřejmé, že
17
hlavním zdrojem polyfenolů jsou použité suroviny, tedy ječmen, slad, chmel a chmelové výrobky. 3.3.1 Charakteristika, rozdělení Z chemického hlediska se jedná o rozsáhlý soubor látek fenolické povahy. Právě kvůli jejich různorodosti nebyl dosud vypracován jednotný systém, který by byl všeobecně uznáván pivovarskými odborníky (Kellner 2002): 1) Flavonoidy: jsou jednou z charakteristických sloučenin obsažených ve vyšších rostlinách. Jedná se o polyfenoly skládající se z 15 atomů uhlíku (2 benzenová jádra spojená tříuhlíkovým řetězcem (obrázek 2). Ve většině případů je C3 řetězec součástí heterocyklického kruhu a většina flavonoidů je odvozena od této struktury, tedy od flavanu (obrázek 3). Flavonoidy podle stupně oxidace dělíme do šesti skupin (Kellner 2002, Manach 2004):
Obrázek 2: strukturní schéma flavonoidu - řetězec C6 - C3 - C6. (Friedli 1997)
Obrázek 3: strukturní schéma flavanu. (Velíšek 2002) •
Flavonoly: akumulují se především ve vnějších částech rostlin, protože jejich syntéza je vázána na sluneční světlo (obrázek 4). Výskyt: listová zelenina, čaj. (Manach 2004)
18
Obrázek 4: strukturní schéma flavonolů. (Anouar 2012) •
Flavony: společně s flavonoly jsou žlutými pigmenty rostlin (obrázek 5). Výskyt: petržel, červená paprika, pšenice. (Manach 2004)
Obrázek 5: strukturní schéma flavonů. (Dixon 1999) •
Izoflavony: bezbarvé sloučeniny patřící mezi fytoestrogeny. Mimo schopnost vázat se na estrogenové receptory mají také antikarcinogenní a antibakteriální účinky (obrázek 6). Výskyt: luštěniny. (Manach 2004)
Obrázek 6: strukturní schéma izoflavonů. (Dixon 1999) •
Anthokyanidiny: jedná se o glykosidy rostlinných barviv (anthokyanů), které jsou v závislosti na pH nositeli růžové, červené, modré a fialové barvy (obrázek 7). Výskyt: listová a kořenová zelenina, cereálie, vinná réva. (Manach 2004)
19
Obrázek 7: strukturní schéma anthokyanidinů. (Takasawa 2010) •
Chalkony: významné sloučeniny mající antibakteriální a antimykotické účinky (obrázek 8). Výskyt: rostlinná barviva. (Manach 2004)
Obrázek 9: obecné schéma chalkonů. (Anouar 2012) •
Flavanony: ve vysokých koncentracích se nacházejí pouze v citrusovém ovoci, kde přispívají k typické chuti. Obecně jsou glykosylovány disacharidy v pozici 7 (obrázek 10). Výskyt: citrusové ovoce, máta, lékořice. (Manach 2004)
Obrázek 10: obecné schéma flavanonů.(Anouar 2012)
20
2. Kumarinové
deriváty:
laktony
o-hydroxykyselin,
zejména
pak
kyseliny
o-hydrosyskořicové, respektive kumarinu (obrázek 11). Tyto látky jsou rozpustné ve vodě. Některé deriváty kumarinu (4-hydroxykumarin a deriváty substituované v pozici 3-) vykazují antikoagulační aktivitu. V organismu pak působí jako kompetitivní inhibitor při biosyntéze prothrombinu. (Desai 2000)
Obrázek 11: kyselina o-hydroxyskořicová (vlevo) a kumarin (vpravo). (Kellner 2002) 3. Deriváty kyseliny chlorgenové: Kyselina chlorgenová je ester kyseliny kávové a chinové (obrázek 12). Antioxidační a antikarcinogenní vlastnosti těchto látek byly prokázány i v živých organismech, zatímco metabolismus a absorpce ve střevech dosud nebyla dostatečně prostudována. Tyto látky tvoří spojovací můstek se saponiny. (Gonthier 2003)
Obrázek 12: kyselina chlorgenová. (Zare 2011)
4. Chinony a ubichinony: chinony jsou pigmenty obsažené převážně v bakteriích, plísních a některých vyšších rostlinách. Mohou se vyskytovat i u živočichů, ale pouze v důsledku konzumace daných rostlin (obrázek 13). (Aguilar 2004)
21
Obrázek 13: chinon. (Aguilar 2004) Ubichinon (nebo-li koenzym Q) je látka přítomná ve všech živých organismech (kromě grampozitivních eubakterií a archebakterií), jelikož hraje významnou roli v metabolismu (obrázek 14). (Kawamukai 2002)
Obrázek 14: ubichinony. (Kodíček 2004) 3.3.2 Sladové polyfenoly Polyfenoly ječmenu se nacházejí především v obalových částech zrna, včetně aleuronové vrstvy. Zrno ječmene obsahuje 100 až 400 mg/kg polyfenolických látek, z toho přibližně 80 % tvoří flavanoly, 13 % flavonoly, 5 % fenolické kyseliny a 2 % nepolární sloučeniny. Mezi hlavní představitele ječných, respektive sladových polyfenolů patří následující skupiny látek: 1. Deriváty 5, 7-dyhydroxyflavanu •
Leukoanthokyanidiny: látky příbuzné delfinidinu a kyanidinu, které se mohou vyskytovat ve formě monomerního glykosidu (anthokyaniny) nebo aglykony (anthokyanidiny),
biflavonoidní
proanthokyanidiny
(anthokyanogeny,
polymerní anthokyaniny nebo oxidované a polymerní formy flavonoidů) (obrázek 15). •
Katechiny: látky odvozené od flavanu, které nejsou narozdíl od první skupiny již dále hydrolyticky štěpitelné. Mezi hlavní zástupce patří katechin a gallokatechin (a jejich stereoisomery epikatechin a epigallokatechin).
22
Významnou vlastností katechinů je schopnost kondenzovat v nerozpustné produkty srážející bílkoviny (tříslovinná síla). (Kellner 2002, Vanaman 2011)
Obrázek 15: Nejvýznamnější zástupci flavonoidů v ječmeni; pelargonidin (R1=R2=H); kyanidin (R1=OH, R2=H); delfinidin (R1=R2=OH). (Hidgon 2005) 2. Tanoidy: jsou definovány jako frakce polyfenolů. Jde v podstatě o prekurzory nízkomolekulárních až středněmolekulárních polyfenolů. I když je jejich koncentrace nízká, přesto hrají významnou roli v koloidní stabilitě piva. V průběhu zrání piva kondenzují v taniny, které jsou přímo schopné vytvářet špatně rozpustné komplexy s bílkovinami. (Pfeuffer 2010) 3. Deriváty kyseliny chlorgenové, p-hydroxybenzoové a skořicové: tyto látky často podléhají kondenzaci a oxidaci za vzniku chinonů. (Kellner 2002)
3.3.3 Chmelové polyfenoly Chmel je bohatým zdrojem polyfenolů, u aromatičtějších odrůd se obsah může pohybovat v rozmezí 3,5 až 4,5 %. I přestože je v chmelovaru umožněna extrakce polyfenolů až z 90 %, je jejich obsah v pivě pouze v malých koncentracích. V chmelu lze identifikovat více než 100 různých polyfenolových složek. Majoritní složkami jsou obvykle katechiny, epikatechiny a jejich polymery proanthokyanidiny, rutin, kvercetin a kempferol. Kellner 2002, Kosař 2000) 1. Katechin a epikatechin: látky vyskytující se v čaji, čokoládě, červeném víně a ovoci, známé především pro své zdraví prospěšné účinky (obrázek 16). (Vanaman 2011)
23
Obrázek 16: katechin (R4 = OH). (Anouar 2012) 2. Proanthokyanidiny: jsou polymery katechinu a epikatechinu. V chmelu jsou přítomny dva
monomery
a
to
proanthokyanidin
B1
(katechin-epikatechin)
a
proanthokyanidin B3 (katechin-katechin). Hlavním zástupcem trimerů chmelu je proanthokyanidin C2 (katechin-katechin-katechin). (Kellner 2002) 3. Rutin: Molekula rutinu se skládá z aglykosidu kercetinu a disacharidu rutinózy (obrázek 17). (Manach 2004))
Obrázek 17: molekula rutinu. (Tsuchiya 2010) 4. Kempferol: běžně se vyskytující polyfenol, přítomný v ovoci, zelenině, víně apod. (obrázek 18). (Tsuchiya 2010)
24
Obrázek 18: molekula kempferolu. (Tsuchiya 2010) 5. Prenylované chalkony: vznikají adicí chalkonu prenylem či geranylem. Tuto skupinu látek je schopno syntetizovat pouze několik druhů vyšších rostlin. Asi 5 % známých prenylovaných flavonoidů pochází z chmele, kde jsou sekretovány společně s chmelovými pryskyřicemi a silicemi. Nejvýznamějším zástupcem této skupiny je xanthohumol (obrázek 19), který se do piva dostává ve své izomerované formě jako izoxanthohumol. Vzhledem k povaze a vlastnostem této látky je možné xanthohumol zařadit jak mezi polyfenoly, tak mezi pryskyřice. Dále se zde vyskytují desmethylxanthohumol a xanthohumol C. Ostatní prenylované flavonoidy jsou v pivě pouze ve stopovém množství. (Hofta 2004)
Obrázek 19: xanthohumol. (Stevens 2004) 6. Obdobně jako u sladu se v chmelu nacházejí deriváty kyseliny chlorgenové, phydroxybenzoové a skořicové. (Kellner 2002) 3.3.4 Metody stanovení polyfenolů Většinou se v praxi používají skupinová stanovení, proto jsou výsledky těchto měření zkresleny interferujícími látkami, které vykazují podobné vlastnosti jako měřená látka. 3.3.4.1 Stanovení celkových polyfenolů V pivovarnictví se celkové fenoly stanovují zpravidla metodou využívající činidlo Folin-Ciocalteu. Toto barvivo se během oxidace fenolů redukuje za vzniku modrého zbarvení oxidů wolframu a molybdenu. Koncentrace celkových fenolických látek je pak přímo úměrná modrému zbarvení s maximem absorbance při 750 nm. (Kellner 2003, Úřední věstník EU 2010) 3.3.4.2 Skupinová stanovení •
metoda dle Harrise a Rickettse - kolorimetrické stanovení anthokyanogenů
25
(leukoanthokyanidinů). Anthokyanogeny jsou absorbovány na polyamidový prášek a následně jsou vyextrahovány butanol-HCl. Koncentrace přítomných anthokyanogenů je stanovena na základě absorbance červeného zbarvení při vlnové délce 550 nm. •
metoda s použitím p-dimethyl-aminocinnemaldehydu - kolorimetrické stanovení flavonoidů. Reakcí p-dimethyl-aminocinnemaldehydu s flavonoidem dochází k tvorbě barevného komplexu. Absorbance je měřena při vlnové délce 640 nm.
•
metoda dle Chapona - metoda stanovení tanoidů, vzhledem k jejich schopnosti tvořit komplex s PVPP (polyvinylpyrrolidon o maximální molekulové hmotnosti 700 000). Na základě afinity k bílkovinám rozdělil Chapon polyfenoly do tří skupin. Do první skupiny patří polyfenoly, které netvoří zákal, mají tedy velmi nízkou afinitu k bílkovinám. Do druhé skupiny zařadit tanoidy, tedy látky se střední afinitou, které za určitých podmínek mohou tvořit zákal. Třetí skupinu představují taniny, které mají vysokou afinitu k bílkovinám a zákal vytvářejí již při nízkých koncentracích. (Kellner 2003)
3.3.4.3 Specifická stanovení Předchozí skupiny metod jsou v pivovarnictví sice oblíbené, ale výsledky z těchto metod nejsou dostačující. Proto se v dnešní době usiluje o rozvoj metod ke stanovení konkrétních zástupců polyfenolů. (Kellner 2003) •
Plynová chromatografie (GC) - separační metoda vhodná k analýze látek, které lze převést do plynného stavu. První součástí zařízení je nádoba s nosným plynem, nejčastěji vodíkem, heliem, dusíkem či argonem. Ještě než je do nosného plynu (mobilní fáze) dávkován vzorek, je nutné plyn vysušit a vyčistit (především od kyslíku). Vzorek je dávkován injekční stříkačkou do konstantního (regulovatelného) proudu mobilní fáze v dávkovači. Dávkovač vzorku musí přesahovat teplotu varu nejméně těkavé složky alespoň o 50° C, aby došlo k okamžitému odpaření. Při nedostatečné teplotě by u kapalných vzorků hrozila kondenzace. Vzorek je dále unášen skrze stacionární fázi umístěnou v koloně. V GC se používají dva typy kolon. Náplňové kolony jsou tvořeny skleněnou spirálou o průměru 2 - 4 mm a délce 2 - 6 m, ve které je nanesena stacionární fáze. Stacionární fáze kapilární kolony, (nejčastěji křemenné) o průměru 50 - 350 µm a délce až 100 m, je narozdíl od kolony náplňové tvořena netěkavou kapalinou, nanesenou či chemicky vázanou na povrch kolony. Dle
26
afinity jednotlivých složek vzorku ke stacionární fázi jsou pak jednotlivé složky zdržovány v koloně a postupně detekovány zvoleným detektorem (obrázek 20). (Jelínek 2002)
Obrázek 20: schéma GC. (jelínek 2002) Detekce se většinou provádí pomocí: 1. Plamenoionizační detektor (FID - flame ionization detector): miniaturní hořák, do kterého vedou tři vstupy. Dva vstupy tvoří vodík a kyslík jakožto hořlavá směs a třetí vstup vychází z chromatografické kolony. Proti ústí hořáku je umístěna kovová elektroda o napětí zhruba 300 V. Pakliže do hořáku přichází pouze nosný plyn, nejsou v prostoru hořáku žádné nabité částice, proto se procházející proud nemění. Pokud do hořáku vstoupí látka vzorku, v důsledku jejího spálení vzroste náboj v prostředí hořáku a tedy procházející proud. Velikost změny je závislá jak na typu látky, tak na její koncentraci (obrázek 21). 2. Detektor elektronového záchytu (ECD - electron capture detector): čistý nosný plyn je ionizován β-zářičem za vzniku termálních elektronů, které zvyšují vodivost v cele detektoru. Prostorem prochází elektrický proud. Pokud do tohoto prostoru vstoupí látka vzorku, jsou termální elektrony pohlceny a dojde ke snížení vodivosti prostoru, tedy ke snížení procházejícího náboje (obrázek 21). 3. Hmotnostní detektor (MSD - mass spectrometry detector): molekula vzorku je v první části detektoru ionizována. Vznikají tak ionizované fragmenty, které jsou urychleny v elektrickém poli. Rychlost takto urychlených fragmentů
27
závisí na hmotnosti (m) a náboji (z), respektive poměru m/z. K sestaveni hmotnostního spektra je potřeba znát jaké fragmenty v průběhu ionizace vznikly a jejich zastoupení. K tomu dochází ve druhé části detektoru, kde je magnetické pole, na které dopadají fragmenty. Vzdálenost jakou fragmenty v poli překonají závisí na rychlosti, to znamená, že fragmenty se shodným m/z dopadají na stejné místo. Alternativní možností je použití kvadropólového filtru o konstantním napětí. To způsobí zachycení fragmentů o požadovaném m/z. Procesy v obou částech detektoru probíhají za vysokého vakua, aby nedošlo ke zkreslení výsledků s přítomnými částicemi. (Jelínek 2002)
Obrázek 21: schéma FID (vlevo) a ECD (vpravo). Jelínek 2002) Využití GC v pivovarnictví je omezeno pouze na oblast nízkomolekulárních fenolických látek. Není možné stanovit středně a vysokomolekulární polyfenoly či jejich kondenzáty. K derivatizaci vzorku se nejčastěji používají činidla alkyl, acetyl nebo alkoxy na karboxy-, hydroxy- nebo aminoskupinu na benzenovém jádře. (Kellner 2003) •
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) - pokročilá a instruméntálně náročná separační technika. Narozdíl od GC, separace složek závisí nejen na interakci se stacionární fází, ale také na rozpustnosti, iontové výměně a absorpci. Zařízení se skládá ze zásobníku mobilní fáze (kapaliny), dávkovacího ventilu, kolony, vysokotlakého čerpadla a detektoru (obrázek 22). Vzorek je dávkován do mobilní fáze, dále je unášen do kolony, která je tvořena velmi malými částicemi stacionární fáze, což vede k dlouhému průchodu vzorku kolonou. Proto je aparatura doplněna o
28
vysokotlaké čerpadlo, které postup mobilní fáze skrze kolonu usnadní/umožní. Veškeré zařízení musí byt dostatečně odolné vůči vysokému tlaku. Kritickým krokem je dávkování vzorku do proudu mobilní fáze o vysokém tlaku. K tomuto účelu se dnes používá šesticestný ventil (obrázek 23).
Obrázek 22: schéma HPLC. (Jelínek 2002)
Obrázek 23: šesticestný ventil. (Jelínek 2002) K detekci dochází: 1. UV/VIS detektorem: měření je založeno na absorpci elektromagnetického záření molekulami analytu v ultrafialové a viditelné oblasti (200 až 800 nm). Látky absorbující záření o vlnové délce 200 - 380 nm se jeví jako bezbarvé, zatímco látky absorbující záření o vlnové délce 380 - 700 nm vidíme jako barevné. Zdrojem záření pro UV oblast bývá vodíková či deuteriová výbojka, pro viditelnou oblast potom wolframová nebo halogenová zářivka. Záření o konkrétní a požadované vlnové délce
29
je získáno díky monochromátoru a filtrům Detekčním zařízením je potom fotonka či fotonásobič, kde je vyhodnocen a zaznamenán úbytek záření. 2. detektor s diodovým polem (DAD - diode - array detector): měření probíhá stejně jako u předchozí metody, ale monochromátor je zde uložen až za kyvetou. Dalším rozdílem je nahrazení detektoru polem obsahujícím miniaturní polovodičové detektory. V důsledku těchto dvou odlišností je možné stanovit celé absorpční spektrum. Tedy je možné okamžitě určit množství absorbovaného záření všech vlnových délek procházejícího paprsku. (Jelínek 2002) Přetrvávajícím problémem použití HPLC - UV/VIS a HPLC - DAD je nízká mez detekce. Kapalinovou chromatografií je možné stanovit obsah fenolů v mg (malé rozdíly ve struktuře a variabilita reakčních skupin). HPLC je však možné efektivně používat také pro frakcionaci jednotlivých skupin polyfenolů. Solidní výsledky poskytuje kombinace HPLC MSD, ale kromě vysokých provozních nákladů je potřebná i náročná příprava vzorku. (Kellner 2003) Posledním
pokrokem
v
analytických
metodách
je
HPLC
s
použitím
elektrochemických detektorů. Tyto detektory lze rozdělit na ampérometrické a coulomotrické. U ampérometrických detektorů obtéká analyt povrch elektrody, kde dochází k oxidaci či redukci, což lze měřit jako změnu protékajícího proudu. Tento typ detektoru však nezajišťuje dostatečný kontakt s analytem, proto dochází k redoxním změnám pouze u 5 až 15 % elektroaktivní látky. Elektroda u coulometrického detektoru je tvořena porézním grafitovým materiálem a umožňuje průběh redoxních procesů ze 100 %, což z něj tvoří ideální detektor pro měření nízkých koncentrací některých polyfenolických látek. (Kellner 2003)
3.4 Bílkoviny piva Litr piva obsahuje 300 - 800 mg bílkovin, které jsou tvořeny především polypeptidy a proteiny o velikosti 5 - 100 kDa (proteiny > 17 kDa). Většina bílkovin se do piva dostává z ječmene, zbytek pak pochází z cereálních přídavků a chmele. V průběhu sladování dochází působením proteolytických enzymů k rozkladu proteinů až na volné aminokyseliny či aminodusík. Je pravděpodobné, že k proteolýze dochází i v průběhu rmutování při kterém jsou enzymy extrahovány, ale teplota je příliš vysoká na to aby probíhala intenzivně. (Bamforth 2008)
30
3.4.1 Bílkoviny ječmenu Obsah a zastoupení bílkovin je jedním z hlavních parametrů kvality ječmene a sladu. Bílkoviny se v zrně nacházejí především v aleuronové vrstvě a/nebo endospermu. Obecně lze bílkoviny zrna rozdělit do několika frakcí, přičemž na koloidní stabilitu mají vliv první dvě: (Bamforth 2008, Kumar 2011, Qi 2006) •
Albuminová - hlavním zástupcem této frakce je protein Z (PROZ), který se významně podílí na pěnivosti a koloidní stabilitě piva. V průběhu výroby u něj prakticky nedochází ke změnám (nižší obsah lysinu, ale stejná molekulová hmotnost v důsledku glykosylace).
•
Hordeinová (prolamin) - hlavní zástupce bílkovin ječmenu (tvoří 30 - 50 % celkového množství bílkovin). Skládá se ze čtyř subfrakcí, které jsou bohaté na prolin, tedy významné z hlediska koloidní stability: 1. B hordein (Hor2) - představuje 70 - 90 % hordeinové frakce, vysoký obsah síry, molekulová hmotnost 35 - 46 kDa, 2. C hordein (Hor1) - představuje 10 - 30 % hordeinové frakce, nízký obsah síry, molekulová hmotnost 55 - 75 kDa, 3. γ hordein (Hor5) - představuje 1 - 2 % hordeinové frakce, vysoký obsah síry, molekulová hmotnost < 20 kDa, 4. D hordein (Hor3) - představuje 2 - 4 % hordeinové frakce, vysoká molekulová hmotnost (>100 kDa).
•
Globulinová
• Glutenová 3.4.2 Metody stanovení bílkovin 3.4.2.1 Stanovení celkových bílkovin Existuje mnoho metod na stanovení bílkovin, nicméně mnoho z nich není pro stanovení bílkovin v pivě vhodná: •
Kjeldahlova metoda - běžně se používá jako nepřímé stanovení bílkovin. Organický vzorek obsahující dusík je mineralizován varem s kyselinou sírovou, čímž dojde k převedení aminových a jiných dusíkatých funkčních skupin na amoniak, který je
31
vázán ve formě síranu amonného. Alkalizací vzniklé směsi dojde k vytěsnění amoniaku, který je následně kvantitativně předestilován vodní parou a titračně stanoven. Pro naše potřeby tato metoda není zcela vhodná, protože nám udává obsah celkového dusíku obsaženého ve vzorku, tedy bílkovinný, nebílkovinný a dusík volných aminokyselin. Pro přesnější analýzu by bylo potřeba stanovit nebílkovinný podíl ve filtrátu po deproteinaci kyselinou trichloroctovou (eventuelně taninem či hydroxidem měďnatým) a i nadále by byl výsledek ovlivněn přítomností volných aminokyselin, které nejsou rizikové z hlediska koloidní stability. (Jelínek 2002, Bamforth 2008, Káš 2005) •
Reakce s biuretem - kolorimetrická metoda stanovující přítomnost peptidických vazeb. Metoda je založená na měření intenzity fialového zbarvení (maximální absorbance při 550 nm) komplexů mědi s bílkovinou. Pracovní rozsah je v rozmezí 0,1 - 10 mg bílkoviny (výsledek rušen NH3 a peptidy). Tato metoda je časově náročná, reakce bílkoviny s biuretovým činidlem (CuSO4 + KNaC4H4O6 + NaOH) probíhá 30 - 40 minut. (Bamforth 2008, Káš 2005)
•
Lowryho metoda - jde v podstatě o vylepšenou biuretovou reakci.
Modifikace
původní metody spočívá v použití druhého činidla Folin - Ciocalteu (směs kyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové), které v přítomnosti Cu2+ v alkalickém prostředí poskytuje modré zbarvení s maximem absorbance při 750 nm. I přes zvýšení citlivosti (pracovní rozsah 10 - 200 µg) není tato metoda jednoznačně použitelná, protože je značně citlivá na pH (optimum 10 - 10,5), závislá na aminokyselinovém složení a dochází při ní ke stanovení nebílkovinných látek (lipidy, cukry, soli, pufry, thiolové sloučeniny a další). (Bamforth 2008, Káš 2005, Walker 2002) •
Spektrofotometrické stanovení - bílkoviny absorbují UV záření s maximem v oblasti kolem 280 nm (Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan). Vliv interferentů (nukleových kyselin) se koriguje při 260 nm. Citlivější metodou (lze stanovit až ng/ml) je měření absorbance peptidových
při 205 - 235 nm. Mezi interferující látky patří například sukcináty, ftaláty,
citráty
vazeb a
barbituáty. (Káš 2005) •
Metoda podle Bradfordové: velmi rychlá a přesná metoda, která neinterferuje s většinou reagentů a neproteinových složek vzorku. metoda je založena na vazbě
32
proteinu s barvivem Coomasie Brilliant Blue G250. Toto barvivo existuje v několika formách v závislosti na hodnotě pKa. Při pKa 12,4 má červenou barvu a maximum absorbance při 470 nm. Pokud je hodnota pKa 1,82, pak má barvu zelenou a maximum absorbance při 650 nm. Zatímco modrá forma, která se používá při kvantifikaci bílkovin má hodnotu pKa 1,15 a maximum absorbance při 590nm. Nicméně toto barvivo nereaguje s peptidy bohatými na prolin a kyselinu glutamovou, které mají vliv na koloidní stabilitu piva, takže výsledky nejsou zcela přesné. (Bamforth 2008, Káš 2005, Walker 2002) 3.4.2.2 Specifická stanovení Abychom se mohli věnovat studiu proteinů v pivě, je nutné je napřed izolovat (srážením ethanolem, síranem amonným, izolací pomocí SDS). Vlastní studium proteinů se pak skládá ze čtyř kroků (Bamforth 2008): 1. SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis): jde o plošné provedení zónové elektroforézy, tedy metodu, při níž se měří rychlost pohybu v elektrickém poli. Jako separační prostředí se volí polyakrylamidový gel. SDS se přidává za účelem rozrušení terciální struktury bílkoviny a tím rozvinutí řetězce
v
důsledku
změny
náboje.
Rychlost
a
vzdálenost
migrace
polyakrylamidovým gelem závisí na molekulové hmotnosti. Vyhodnocení probíhá srovnáním migračních vzdáleností bílkovin vzorku se standardy bílkovin o známé molekulové hmotnosti. (Jelínek 2002, USM 2001) 2. Hydrolýza a HPLC: hydrolýzou izolované bílkoviny a následnou HPLC lze stanovit zastoupení konkrétních aminokyselin. (Bamforth 2008) 3. Sepharosa (trademark): gel sloužící náplň chromatografických kolon. V pivovarnictví se používá k měření hydrofobicity proteinů tvořících pěnu. (Bamforth 2008) 4. ELISA (enzyme-like immunosorbet assay). Test umožňující detekci antigenů či protilátek na principu imunoenzymatické reakce. Součástí reakce jsou antigen, konjugát (protilátka proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu konjugovaná s enzymem), substrát (reagující s enzymem). Průkazem přítomnosti dokazované látky je barevná změna. (Toman 2009)
33
3.5 Koloidní stabilita piva Pivo je složitý koloidní systém skládající se z několika tisíc látek. Proto i malé změny v jeho chemické složení mohou způsobit, že se produkt stane spotřebitelsky nepřijatelný. Díky moderním postupům se biologická rizika stala víceméně ojedinělá, nicméně tvorbě koloidních zákalů v důsledku stárnutí zcela zabránit nelze. Koloidní stabilitu piva zatím nelze přesně definovat, ale jde o časové období od stočení piva po okamžik, kdy jsou změny v pivě jako koloidním systému detekovatelné (ztráta původní čirosti) - nejčastěji je tato hranice při 1 - 2 jednotkách EBC (Europian Brewery Convention) trvalého zákalu. Hodnocení zákalu není vždy jednoznačné, neexistuje přímá úměra mezi naměřenými daty a vizuálním hodnocením čirosti. Vliv na subjektivní hodnocení má koncentrace, velikost zákalotvorných částic, ale také barva piva. (Dienstbier 2010) 3.5.1 Reakce polyfenolů a bílkovin Rekcí bílkovin s polyfenoly vznikají tříslo-bílkovinné komplexy. V důsledku těchto kondenzačních a polymeračních reakcí dochází až ke vzniku částic koloidních rozměrů, což vede k nevratnému koloidnímu zákalu piva, případně až k sedimentaci. Tento jev je způsoben reakcí bílkovinných frakcí (ječmenným hordeinem), s polyfenoly, a to především proanthokyanidiny a taniny. V praxi existují dvě formy zákalu, způsobené reakcí bílkovin s polyfenoly. První forma je tvořena rozpustnými, nekovalentně vázanými tříslo-bílkovinnými komplexy. V tomto případě, je zákal pozorovatelný pouze při nízkých teplotách (0° C), kdy dochází ke vzniku částic o rozměru 0,1 až 1 µm. Takto vzniklý zákal je možné odfiltrovat ještě před plněním do obalu nebo ho lze velmi rychle rozpustit zvýšením teploty. Druhá, nerozpustná, forma vzniká stejným způsobem jako rozpustná, nicméně vlivem doby dochází ke vzniku kovalentní struktury, kterou nelze rozpustit ani po záhřevu. Velikost těchto částic je závislá na obsahu zákalotvorných látek a může v průměru dosahovat až 10 µm. Tato reakce je katalyzována kyslíkem a přítomností kovových iontů. Teoreticky ke vzniku zákalu může docházet dvěma způsoby. První je vznik taninů polymerizací jednoduchých flavonoidů, které následně mohou reagovat s bílkovinami a vytvářet zákal. Jednoduché fenoly nemohou produkovat zákal i když jsou schopny reagovat s bílkovinami. Druhou možností je oxidace již komplexních flavonoidů. Takto aktivované fenoly společně s bílkovinami vytvářejí zákal. Experimentálně bylo zjištěno, že označený
34
kyslík lze nalézt v zákalu, což potvrzuje druhou teorii. (Bamforth 2008) Siebert et al. (1996) vytvořili model tvorby zákalu s ohledem na koncentraci polyfenolů a bílkovin. Předpokládali fixní počet vazebných míst jak u bílkoviny (3), tak u polyfenolu (2). Ukázalo se, že v nadbytku proteinu či polyfenolu, dochází k tvorbě méně výrazného zákalu. V obou případech dochází sice k tvorbě tříslo-bílkovinného komplexu, ale v důsledku nedostatku polyfenolu či bílkovin nedochází k vytvoření jednotné struktury, nýbrž pouze menších shluků. Čím blíže je počet vazebných míst bílkovin roven počtu vazebných míst polyfenolu, tím rozsáhlejší vzniká struktura, tedy zákal. (obrázek 24). (Siebert 1996) Odizolováním
a
prozkoumáním
zákalu
bylo
zjištěno,
že
součástí
vazby
bílkovina - polyfenol je aminokyselina prolin. Současně také bylo vypozorováno, že separovaný zákal obsahuje velké množství sacharidů (až 80 %). Nicméně sacharidy se přímo nepodílejí na tvorbě zákalu, nýbrž jsou pouze zachyceny do vznikající zesíťované struktury. (Bamforth 2008)
Obrázek 24: model tvorby zákalu s ohledem na koncentraci polyfenolů a bílkovin. (Siebert 1996)
35
3.5.2 Metody předpovědi koloidní stability 3.5.2.1 Kvantifikace koloidního zákalu Zákal, jakožto optický jev, je měřen nejčastěji turbidimetrem či nefelometrem. Měřenou veličinou je rozptyl světla (kapitola 3.1.2.4) pod daným úhlem (obrázek 25). •
Turbidimetrie: optická metoda, založená na úbytku intenzity procházejícího paprsku světla v důsledku rozptylu. Turbiditu lze měřit na všech fotometrech nebo spektrofotometrech.
•
Nefelometrie: optická metoda, při níž se měří světlo rozptýlené disperzním podílem. Narozdíl od turbidimetru se ale světlo měří v úhlu 90° vůči zdroji paprsku. (Jelínek 2002)
Obrázek 25: rozdíl mezi turbidimterií a nefelometrií. (train-srv.manipalu.com) Naměřené hodnoty se porovnávají s hodnotami příslušného zákalového standardu. Dnes se jako nominální zákalová hodnota považuje suspenze N,N'-dimethylhydrazinu ve vodě, připravená za daných laboratorních podmínek. V pivovarnictví jsou užívané jednotky EBC (Europian Brewery Convention), ASBC (American Society of Brewing Chemists) či jednotky dle Helma (1 j. EBC = 40 j. Helma = 69 j. ASBC). Mimo pivovarnictví se používají jednotky NTU (Nephelometric Turvidity Unit) a FTU (Formazine Turbidity Unit), přičemž 1 NTU = 1 FTU = 0,25 EBC. (Dienstbier 2010) Veškeré testy sestavené za účelem předpovědi koloidní stability piva se dělí do dvou hlavních skupin.
36
3.5.2.2 Testy šokové Jsou založeny na uměle zrychleném stárnutí piva, a to fyzikálními či chemickými postupy, které doprovází dílčí měření zákalu. Tepelným cyklováním (fyzikální postup) lze urychlit chemické děje, které probíhají rychleji se zvyšující se teplotou. Pivo je při těchto testech ohříváno na 40 - 60° C a následně chlazeno na teplotu 0° C. V praxi je tento test nejběžnější a proto vzniklo mnoho adaptací lišících se zvolenými teplotami či dobou ohřevu. (tabulka) Mezi chemické postupy urychlující stárnutí piva patří například přídavek persíranu draselného nebo amonného jako oxidačního činidla. Výhodou šokových testů je instrumentální nenáročnost. Nevýhodou naopak zůstává relativně dlouhá doba průběhu testů a nutná korelace s dlouhodobými (nezrychlenými) testy, které probíhají za přirozených podmínek. (Dienstbier 2010) Tabulka II: přehled metod teplotního šokování. (Dienstbier 2010) Metoda
Provedení
současný EBC test
1 den 0° C, 2 dny 60° C, 1 den 0° C
Shildův test
7 dní 60° C, 1 den 0° C
test Basařové a Kahlera
6 h 0° C, 16 h 66° C, 6 h 0° C 1 den 0° C - měření zákalu, 6 dní 55° C, 1 den 0° C -
test Šavla a Prokopové
měření zákalu; cyklus se opakuje dokud zákal > 2 j. EBC
3.5.2.3 Testy přítomnosti zákalotvorných prekurzorů Cílem těchto testů je stanovit přítomnost látek podílejících se na tvorbě zákalu. Do této skupiny patří: •
Testy precipitační: cílem je přidat činidlo vyvolávající precipitaci zákalotvorných složek (bílkovin, polyfenolů, tříslo-bílkovinných komplexů). Výsledky těchto testů se vyjadřují v hodnotě zákalu, či spotřebě činidla vyvolávajícího danou hodnotu zákalu. o Síranový test: jedná se o srážení bílkovinných složek piva síranem amonným.
37
Ke vzorku piva se přidává precipitační činidlo, zatímco je nefelometricky měřen zákal. Z grafu lze objektivně určit prahovou hodnotu, kdy se začne vytvářet zákal. o precipitace síranem hořečnatým, kyselinou trichloroctovou: princip obdobný předchozí metodě, opět se jedná o precipitaci zákalotvorných bílkovin. Z hlediska předpovědi stability piva tyto testy neposkytují zcela odpovídající informace. o Eshbarův index: Eshbarovo činidlo (směs kyseliny pikrové a octové) precipituje především vysokomolekulární bílkoviny. Množství vzniklého precipitátu se stanovuje nefelometricky. Tato metoda se používala především u piv stabilizovaných bentoninem. o stanovení citlivých proteinů: ne všechny proteiny v pivě jsou schopné vytvářet zákal. Ke srážení bílkovin dochází přídavkem polyfenolu taninu. o stanovení tanoidů: metodou dle Chapona, přičemž zákal je měřen nefelometricky. •
Alkoholový chladový test: tvorba zákalu se vyvolává přídavkem 5 až 8 % alkoholu za současného zchlazení na teplotu mezi -5 až -8° C. Zákal je měřen na počátku při pokojové teplotě a následně po 40 až 60 minutách v termostatu po vychlazení, přičemž alkoholový chladový zákal je dán rozdílem těchto dvou hodnot. (Dienstbier 2010)
3.5.3 Stabilizace piva V dnešní době, kdy je mnoho piv určeno k exportu, může trvat dlouhou dobu, než se produkt dostane ke spotřebiteli. Aby byly zachovány všechny požadované vlastnosti, je potřeba pivo chránit před teplem, světlem, kyslíkem či ho stabilizovat odstraněním prekurzorů koloidního zákalu. Mezi běžně dostupné stabilizační prostředky patří proteolytické enzymy, taniny, antioxidanty a adsorbenty dusíkatých či polyfenolových látek. •
proteolytické enzymy: nejčastěji používané jsou papain, bromelain a ficin. Tyto enzymy štěpí vysokomolekulární látky (proteiny), takže dochází ke snižování obsahu látek schopných vytvářet koloidní zákal. Nevýhodou zůstává schopnost štěpit bílkoviny podílející se na tvorbě pěny. Pokud se tedy pivovar rozhodne použití proteolytického enzymu, je nutné zvolit proteázu specifickou na prolin.
38
•
taniny: jsou látky fenolycké povahy (kapitola 3.3.2), které společně s bílkovinami tvoří zákal. Přídavkem taninu vznikají vodíkové můstky mezi karbonylovou skupinou taninu a nukleofilní skupinou bílkoviny, čímž dojde ke vzniku tříslo-bílkovinného komplexu, který je odstraněn ještě pře stočením. Tato metoda vede k eliminaci bílkovinných prekurzorů.
•
antioxidanty: se používají při zjištění vyššího obsahu kyslíku, který jsou schopny na sebe navázat a tak snížit jeho vliv na stabilitu piva (kapitola 3.5.1). Běžně se používá kyselina askorbová a oxid siřičitý. Kyselina askorbová sice navíc prodlužuje chuťovou stabilitu piva, ale v některých státech je použití antioxidantů zakázáno (zákon o čistotě piva). Oxid siřičitý je přirozený antioxidant, který v pivu vzniká v průběhu kvašení.
•
silikonové gely: jsou látky schopné adsorbovat bílkoviny. V adsorbovaných bílkovinných frakcích byl analýzou zjištěn vysoký obsah prolinu a glutaminu. Právě kvůli schopnosti adsorbovat bílkoviny bohaté na prolin, tedy zákalotvorné bílkoviny se silikonové gely úspěšně používají už od roku 1961. Použití silikonových gelů ale není jednoduché. Kvalita a schopnost gelu vázat požadovanou bílkovinu závisí na obsahu oxidu křemičitého a vody, dostatečné poréznosti a parametrech pórů. Póry o nevhodných parametrech nemusejí být schopny adsorbovat požadovanou bílkovinou frakci.
•
polyvynilpolypyrrolidon (PVPP): je ve vodě nerozpustný polyamid, schopný vázat všechny specifické proteiny mající vhodné molekulové uspořádání vhodné pro reakci s proteiny. Prostředek disponuje extrémním poměrem plochy ku hmotnosti, což umožňuje použití nižších dávek. PVPP je absolutně inertní, proto jeho použití nezanechává žádné nežádoucí stopy. Další výhodou je možnost recyklace, neboť PVPP má specifickou funkční oblast pH a přechodem z kyselé do zásadité oblasti dochází k uvolnění navázaných polyfenolů.
•
agarosový sorbent (iontoměnič): neboli systém, který funguje na principu kombinace silikonových gelů a PVPP. Je tedy schopný vázat jak bílkoviny, tak polyfenoly. Systém disponuje vyšší selektivitou než předchozí metody a dochází tak k odstranění pouze zákalotvorných sloučenin, tedy menšího množství bílkovin a polyfenolů, při současném zachování stejného stabilizačního efektu. (Dostálek 2011)
39
4 ZÁVĚR Stabilitu piva nelze zajistit pouhým zákrokem na výsledný produkt. K dosažení žádané stability je potřeba přizpůsobit celý výrobní proces. Kvalita každého produktu závisí na kvalitě použité suroviny. Stabilitu piva lze zvýšit použitím surovin s nízkým obsahem proanthokyanidinů a taninů, bílkovin a přídavkem neječmenných cereálií. Nežádoucí je pak obsah pentosanů, který může způsobovat problémy při filtraci, nízká aktivita amyláz, či vysoký obsah hordeinových bílkovin. Z pohledu procesu výroby piva je důležité složení použité varní vody, doba a teplota hlavního kvašení a ležení, rmutovací postup zvolený dle surovin a je také dobré eliminovat přístup kyslíku. (Bamforth 2008, Niemsch 2006) Význam koloidní stability piva z pohledu spotřebitele nelze popřít. Aby si pivo zachovalo požadované vlastnosti, je rozhodujícím faktorem nejen volba suroviny a přizpůsobení procesu výroby, ale především metoda stabilizace, kterou si pivovar zvolí, protože bez stabilizace nelze dosáhnout dlouhodobé stability. Na každou ze zmíněných metod lze pohlížet jak pozitivně, tak negativně. Použitím prolin-specifických enzymů lze dosáhnout požadovaného efektu při nízkých nákladech, nicméně je nutná inaktivace těchto enzymů působením dostatečně vysoké teploty. Částečně, nikoliv však zcela, k tomu dochází v průběhu pasterace. Antioxidanty sice lze použít, ale jejich použití je v některých zemích zakázáno, protože je v rozporu se zákonem o čistotě piva. Nesprávnou aplikací (vysokou dávkou) či nedostatečným odstraněním taninů lze naopak stabilizační efekt obrátit ve svůj neprospěch. Metody založené na přídavku adsorbentu, které v pivu nezanechávají žádné stopy jsou sice nákladnější, ale současně efektivnější. Na principu těchto metod se zakládají i budoucí metody stabilizace (např. polyamidový sorbent na bázi křemeliny - BEERPAP®). (Dostálek 2011)
40
5 POUŽITÁ LITERATURA Aguilar A. R. a kol., 2004: Thermochemistry of benzoquinones. Journal of Chem. Thermodynamics č. 36, str. 453 - 463. Anouar El H., Gierschner J., Duroux J., Trouillas P., 2012: UV/Visible spectra of natural polyphenols: A time-dependent density functional theory study. Food Chemistry č. 131, str. 79 - 89. Bamforth Ch. W., 2008: Beer: A Quality Perspective (Handbook of Alcoholic Beverages). Academic Press. ISBN 978-0-12-669201-3 Bartovská L., Šišková M., 2005: Fyzikální chemie povrchů a koloidních soustav 5th ed. Vydavatelství VŠCHT Praha. ISBN 80-8070-579-X Desai
U.
R.,
2000:
Coumarins.
VCU
School
of
Farmacy.
[online]
Dienstbier M,, Janková L., Sladký P. a Dostálek P., 2010: Metody předpovědi koloidní stability piva. Chemické Listy č. 104, str. 86 - 92. Dixon R. A. a Steele Ch. L., 1999: Flavonoids and isoflavonoids - a gold mine for metabolic engeneering. Trends in plant science č. 10, str. 394 - 400. Dostálek P., Kotlíková B., Fiala J., Jelínek L., Černý z., Čásenský B., Mikulka J., 2011: Stabilizační prostředky pro zvýšení koloidní stability piva. Kvasný průmysl č. 57, str. 290 295. Friedli
G.,
1997:
Phytochemistry
tutorials
-
Flavonoids.
[online]
Gonthier M. P., Verny M. A., Besson C., Rémésy Ch., Scalbert A., 2003: Chlorogenic Acid Bioavailability Largely Depends on Its Metabolism by the Gut Microflora in Rats. The Journal of Nutrition. American Society for Nutritional Sciences. Higdon J., Drake V. J.,Dashwood R. H., 2005: Flavonoids. Linus Pauling Institute - Oregon State
University.
[online]
Hofta P., Dostálek P., Basařová G., 2004: Xanthohumol - chmelová pryskyřice nebo polyfenol? Chemické Listy č. 98, str. 825 - 830.
41
Jelínek I., Opekar F., Rychlovský P. a Plzák Z., 2002: Základní analytická chemie - pro studenty, pro něž analytická chemie není hlavním studijním oborem. Praha. Kawamukai M., 2002: Biosynthesis, bioproduction and novel roles of ubiquinone. Journal of Biochemistry and Bioengeneering č. 6, str. 511 - 517. Káš J., Kodíček M., Valentová O., 2005: Laboratorní techniky biochemie. Vydavatelství VŠCHT Praha. ISBN ISBN 80-7080-586-2 Kellner V. a kol., 2002: Charakterizace rozdílů senzorických profilů mezi skupinami tuzemských a zahraničních piv. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s. Praha. Kellner V., Mikyška A., Prokeš J. a kol., 2003: Studium vlivu jednotlivých polyfenolových složek na kvalitu, koloidní a senzorickou stabilitu piva. Výzkumná zpráva. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s. Praha. Kodíček M., 2004: Biochemické pojmy - výkladový slovník. Vydavatelství VŠCHT Praha. ISBN 80-7080-551-X Kosař K., Procházka, S., 2000: Technologie výroby sladu a piva 1st ed. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a. s. Praha. ISBN 80-902658-6-3 Kumar Y. a Kumar Matta N., 2011: Changing protein profiles in developing and germinating barley seeds. Annals of Biological Research č.2 (6), str. 318 - 329. Kvítek L., 2006: Metody studia koloidních soustav. Katedra fyzikální chemie PřF UP Olomouc. [online] Manach C., Scalbert A., Morand CH., Remesy CH., Jimenez L., 2004: Polyphenols: food sources and bioavailability. The American Journal of Clinical Nutrition roč. 79, č. 5, str. 727 - 747. Melzoch K. a kol., 2002: Modelování bioprocesů a jednotkových operací, analýza rizik 2nd ed.
Elektronický
výukový
materiál
VŠCHT
Praha.
[online]
Niemsch K., Heinrich T., 2006: Current problem of colloidal haze of beer. Kvasný průmysl č. 1, str. 7 - 8. Novák J. a kol., 2011: Fyzikální chemie bakalářský a magisterský kurz. Vydavatelství VŠCHT Praha
42
Pfeuffer L., 2010: Analysis with the tannometer - Example: Analysis of beer. [online] Pouchlý J., 2008: Fyzikální chemie makromolekulárních a koloidních soustav 3rd ed. Vydavatelství VŠCHT Praha. ISBN 978-80-7080-674-6 Qi J.-C., Zhang G.-P., Zhou M.-X., 2006: Protein and hordein content in barley seeds as affected by nitrogen level and their relationship to beta-amylase activity. Journal of Cereal Science č. 43, str. 102 – 107. USM - Universiti sains malaysia, 2001. School of Health Science.: GTB 204 Molecular Biology
Protocols:
SDS-PAGE..
[online]
Siebert K. J., Troukhanova N. V. a Lynn P. Y., 1996: Nature of Polyphenol-Protein Interactions. Journal of Agricultural and Food Chemistry č. 44, str. 80-85. Stevens J. F., Page J. E., 2004: Xanthohumol and related prenylflavonoids from hops and beer: to your good health. Phytochemistry č. 65, str. 1317 - 1330. Takasawa R., Saeki K., Tao A., Yoshimori A., Uchiro H., Fujiwara M., Tanuma S., 2010: Delphinidin, a dietary anthocyanidin in berry fruits, inhibits human glyoxalase I. Bioorganic & Medicinal Chemistry č. 18, str. 7029 - 7033. train-srv.manipalu.com. Unit-08-Spectroscopy I. WordPress 2012. [online] Tsuchiya H., 2010: Structure-dependent membrane interaction of flavonoids associated with their bioactiviry. Food Chemistry č. 120, str. 1089 - 1096. Úřední věstník Evropské unie. 2010. Seznam a popis metod rozboru podle čl. 120g prvního pododstavce nařízení Rady (ES) č. 1234/2007. Vanaman B., 2011: Foods high in catechins. LiveSTRONG - The limitless potential of you. [online] Velíšek J., 2002: Chemie potravin III. díl. OSSIS Tábor. ISBN 80-86659-02-X Walker J. M., 2002: The Protein Handbook 2nd ed. Humana press. ISBN 0-89603-940-4 (hb), 0-89603-941-2 (pb)
43
Zare H. R., Nasirizadeh N., Ajamain H., Sahragard A., 2011: Preparation, electochemical behavior and electrocatalytic activiry of chlorogenic acid milti-wall carbon nanotubes as a hydroxylamine sensor. Material Science and Engeneering C č. 31, str. 975 - 982.
44
6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ASBC - Americas Society of Brewing Chemists DAD - detektor s diodovým polem (diode-array detector) EBC - Europian Brewery Convention ECD - detektor elektronového záchytu (electron capture detector) FID - plamenoinizační detektor (flame ionization detector) FTU - formazine turbidity unit GC - plynová chromatografie (gas chromatography) HPLC - vysokoúčinná kapalinotvá chromatografie (high performance liquid chromatography) MSD - hmotnostní detektor (mass spectrometry detector) NTU - nephelometric turbidity unit PAGE - elektroforéza v polyakrylamidovém gelu PVPP - polyvinylpyrrolidon SDS - dodecylsíran sodný
45
7 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1: α-hořké kyseliny (vlevo) a β-hořké kyseliny (v pravo). .........................................16 Obrázek 2: strukturní schéma flavonoidu - řetězec C6 - C3 - C6.............................................18 Obrázek 3: strukturní schéma flavanu. .....................................................................................18 Obrázek 4: strukturní schéma flavonolů ...................................................................................19 Obrázek 5: strukturní schéma flavonů. .....................................................................................19 Obrázek 6: strukturní schéma izoflavonů. ................................................................................19 Obrázek 7: strukturní schéma anthokyanidinů. ........................................................................20 Obrázek 9: obecné schéma chalkonů. .......................................................................................20 Obrázek 10: obecné schéma flavanonů.....................................................................................20 Obrázek 11: kyselina o-hydroxyskořicová a kumarin. .............................................................21 Obrázek 12: kyselina chlorgenová. ...........................................................................................21 Obrázek 13: chinon. ..................................................................................................................22 Obrázek 14: ubichinony. ...........................................................................................................22 Obrázek 15: Nejvýznamnější zástupci flavonoidů v ječmeni ...................................................23 Obrázek 16: katechin ................................................................................................................24 Obrázek 17: molekula rutinu. ...................................................................................................24 Obrázek 18: molekula kempferolu. ..........................................................................................25 Obrázek 19: xanthohumol. ........................................................................................................25 Obrázek 20: schéma GC. ..........................................................................................................27 Obrázek 21: schéma FID a ECD...............................................................................................28 Obrázek 22: schéma HPLC.......................................................................................................29 Obrázek 23: šesticestný ventil. .................................................................................................29 Obrázek 24: model tvorby zákalu s ohledem na koncentraci polyfenolů a bílkovin. ...............35 Obrázek 25: rozdíl mezi turbidimterií a nefelometrií. ..............................................................36
46
