Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Vliv probiotických kultur Enterococcus faecium na střevní mikroflóru Diplomová práce
Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc
Brno 2013
Vypracoval: Bc. Pavel Hošík
ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv probiotických kultur Enterococcus faecium na střevní mikroflóru vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne …………………………………. podpis autora ………………….
Děkuji vedoucímu diplomové práce panu prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za věnovaný čas, ochotu, cenné rady a připomínky poskytované v průběhu zpracování mé diplomové práce. Také bych chtěl poděkovat Ing. Pavle Pospíškové, Ph.D. za poskytnuté rady a Výzkumnému ústavu veterinárního lékařství v Brně za pomoc při stanovení některých mikroorganizmů. Děkuji za možnost psát diplomovou práci v rámci výzkumu IGA: projekt č. TP 5/2012 „Vliv nutraceutik (polynenasycené mastné kyseliny, probiotika) na imunitní systém a fyziologické funkce prasat“. Dále bych rád poděkoval rodičům a přátelům za podporu během studia.
ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá střevní mikroflórou prasat a jejím ovlivněním za pomoci probiotického mikroorganizmu Enterococcus faecium SF68. Bližší pozornost je věnována patogenním druhům E. coli a Clostridium perfringens. Pro experiment jsme optimalizovali kultivační metody a biochemické testy za pomoci sbírkových kmenů České sbírky mikroorganizmů Masarykovy univerzity. Pokus byl uskutečněn na skupině osmdesáti prasat, která byla rozdělena do dvou skupin po čtyřiceti – skupiny kontrolní a pokusné. Obě skupiny byly sledovány od odstavu selat po dobu čtyřiceti dní. Pokusem bylo zjištěno, že použité probiotikum snižuje počty obou sledovaných patogenů. Zároveň se prokázalo, že pozitivně ovlivnilo růstovou schopnost a konverzi krmiva u pokusné skupiny prasat. Klíčová slova: Clostridium perfringens, E. coli O157:H7, střevní mikroflóra, výživa prasat
ABSTRACT Thesis focuses on intestina microflora of pigs and how probiotic microorganism Enterococcus faecium SF 68 impacts on it. We aimed our effort to pathogenic types like E. coli and Clostridium perfringens. We optimized our methods and biological tests for our experiment thanks to collected tribes from Czech Collection of Microorganizm Masaryk University. Eighty pigs divided into two groups – visitatorial and experimental – were tested. Both groups were studied for forty days, beginning with weaning. The experiment showed that the amount of pathogenic types was reduced by probiotics. At the same time we found out that it affects growth and conversion of feed. Key words: Clostridium perfringens, E. coli O157:H7, intestinal microflora, pigs‘ nutrition
OBSAH 1
ÚVOD ........................................................................................ 6
2
CÍL PRÁCE .............................................................................. 8
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................... 9
3.1 Střevní mikroflóra........................................................................ 9 3.1.1
Vývoj střevní mikroflóry ......................................................................9
3.1.2
Rozložení střevní mikroflóry .............................................................. 10
3.1.3
Modulace střevní mikroflóry............................................................... 12
3.2 Probiotika ................................................................................... 13 3.2.1
Podmínky působení probiotik ............................................................. 14
3.2.2
Charakteristika často užívaných probiotických mikroorganismů ......... 15
3.2.3
Rod Enterococcus ............................................................................... 18
3.2.3.1 Identifikace rodu Enterococcus..................................................... 21 3.2.4
Účinky probiotik ................................................................................. 23
3.2.4.1 Antimikrobiální aktivita probiotik ................................................ 24 3.2.4.2 Podpora a posílení bariérové funkce střevní sliznice ..................... 25 3.2.4.3 Imunomodulace ............................................................................ 26 3.2.4.4 Metabolické účinky probiotik ....................................................... 27
3.3 Probiotika ve výţivě selat........................................................... 29
4
3.3.1
Onemocnění prasat způsobené E. coli ................................................. 30
3.3.2
Onemocnění způsobená bakteriemi rodu Clostridium ......................... 32
MATERIÁL A METODY ...................................................... 36
4.1 Materiál ...................................................................................... 36 4.1.1
Chemikálie ......................................................................................... 36
4.1.2
Kultivační média ................................................................................ 36
4.1.3
Přístroje a pomůcky ............................................................................ 38
4.1.4
Vzorky exkrementů prasat .................................................................. 39
4.1.5
Složení použitých krmiv ..................................................................... 39
4.1.6
Probiotická směs CERNIVET LBC P35 ............................................. 40
4.2 Metody ........................................................................................ 41 4.2.1
Způsob odběrů vzorků ........................................................................ 41
4.2.2
Oživování kultur ze želatinových disků............................................... 41
4.2.3
Mikrobiologická analýza vzorků exkrementů ......................................42
4.2.4
Optimalizace kultivačních metod ........................................................ 43
4.2.5
Příprava preparátů buněk barvení podle Grama ................................... 44
4.2.6
Optická mikroskopie ...........................................................................44
4.2.7
EN-COCCUStest ................................................................................ 44
4.2.8
Test na tvorbu katalázy ....................................................................... 45
4.2.9
Vyjadřování výsledků ......................................................................... 45
5
VÝSLEDKY A DISKUZE ...................................................... 47
6
ZÁVĚR .................................................................................... 56
7
POUŢITÁ LITERATURA ..................................................... 58
8
SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ .......................................... 65
9
SEZNAM TABULEK ............................................................. 66
1
ÚVOD
Intestinální mikroflóra je důležitá pro správnou funkci trávicího ústrojí. Vhodné složení střevní mikroflóry podporuje nejen imunitní systém trávicího traktu, ale také napomáhá utilizaci živin, eliminaci toxických látek a snižuje účinnost alergenů. Dá se říci, že mikrobiální osídlení je u každého jedince po kvalitativní a kvantitativní stránce unikátní. V průběhu života se mikroflóra v závislosti na různých faktorech vyvíjí a značně mění. Aby se maximálně využily pozitivní vlastnosti střevní mikroflóry, začalo se cíleně mikrobiální osídlení modifikovat. Počátky modifikace střevní mikroflóry mají základ v lidské historii. Prvními probiotiky, i když ne z tohoto důvodu konzumované, byly fermentované potraviny především mléčného, ale i zeleninového původu. Prvním, kdo si v roce 1899 všimnul, že fermentované potraviny zlepšují zdravotní stav, byl ruský vědec I. I. Mečnikov. Ve své práci uvedl, že proces stárnutí je zpomalen při intoxikaci tlustého střeva bakteriemi mléčného kvašení. O pár let později upozornil Tissier na význam bifidobakterií. Probiotika byla definována Parkerem až v roce 1974 (Zbořil, 2005) a v roce 1991 byla tato definice revidována R. Fullerem do dnešní podoby (Fuller, 1991). Od té doby bylo objeveno mnoho nových bakterií s probiotickými účinky a upřesněny některé mechanizmy jejich působení. I když probiotika jsou známa už od osmdesátých let 20. století, v chovu zvířat se ve větší míře využívají až od roku 2006, kdy se začala legislativně omezovat některá antibiotika (Yuji a kol., 2004). V dnešní době se probiotika po celém světě hojně používají jako krmivářská aditiva v chovu drůbeže, prasat a telat. Probiotické preparáty se v chovu hospodářských zvířat aplikují podobně jako u lidí pro zlepšení zdravotního stavu a stimulaci imunitního systému. Dále můžeme kladně ovlivnit konverzi krmiva a rychlost růstu. Tyto faktory mají velký vliv na užitkovost zvířete a tím na ekonomický zisk, proto se podle užitkovosti hodnotí účinnost probiotických směsí (Lee a Salminen, 2009). Mezi nejčastěji užívané probiotické druhy řadíme především grampozitivní bakterie Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, ale i Bacillis subtilis,
6
který inhibuje růst patogenních mikroorganizmů (Campylobacte jejuni, Streptococccus pneumoniae, Clostridium perfingens) drůbeže. Diplomová práce je zaměřená na účinky bakterie Enterococcus faecium a to především na její vliv na patogenní bakterie rodu Clostridum a druhu E. coli. Druh E. faecium společně s E. faecalis patří mezi nejčastější a nejvíce prozkoumané enterokoky. Enterokoky jsou přirozenou součástí trávicího traktu lidí a zvířat. Využívají se jako probiotika a startovací kmeny v potravinářském průmyslu, ale můžou způsobovat i kažení některých potravin. E. faecium jako probiotická kultura se do popředí zájmu dostala poměrně nedávno, takže jeho účinky nejsou dosud zcela prozkoumány. Předpokládáme, že v diplomové práci se prokáže, že použitá probiotická směs CERNIVET LBC P35 bude kompetitivně inhibovat bakterie Clostridium perfingens, Escherichia coli O157:H7 a potlačovat tak průjmová onemocnění selat, která chovatelům způsobují velké ztráty. Dále se dá předpokládat, že Enterococcus faecium bude podporovat utilizaci živin z krmné směsi a podporovat tak růst selat.
7
2
CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo: •
Zpracovat literární rešerši ohledně probiotických kultur
•
Optimalizovat kultivační metody pro rod Enterococcus, včetně rozlišení druhu E. faecium pomocí biochemických testů.
•
Zjistit dopad probiotické kultury E. faecium SF68 na bakterie rodu Clostridium a E. coli v trávicím traktu selat
•
Zjistit vliv E. faecium na zdravotní stav selat
8
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1
Střevní mikroflóra
Z klinického hlediska dělíme střevní mikroflóru na normální fyziologickou, potenciálně patogenní a patogenní mikroflóru, tedy mikroorganismy, které působí negativně na hostitele a za normálních fyziologických okolností nesmí být přítomny. Mezi potenciálně patogenní řadíme takové mikroorganizmy, které se mohou stát zdrojem infekce, pokud se výrazně zvýší jejich počet. Normální fyziologická mikroflóra trávicího traktu je obtížně stanovitelná, protože má širokou kvantitativní i kvalitativní variabilitu. O střevní mikroflóře tedy mluvíme jako o dynamickém systému tvořeném 400 - 500 mikrobiálními druhy, jejichž metabolická aktivita se vyrovná metabolické aktivitě jater. Svojí činností významně ovlivňuje trávicí pochody, stimuluje imunitní systém, inhibuje proliferaci patogenních mikrobů a vyživuje sliznici trávicí trubice (Lukáš, 2003).
3.1.1
Vývoj střevní mikroflóry
Do okamžiku narození je trávicí trakt téměř sterilní. K jeho prvnímu osidlování dochází během porodu, kdy plod přichází do kontaktu s vaginální mikroflórou. Významnější osidlování intestinálního traktu probíhá orální cestou hned po té, co začne být novorozenec kojen. Díky mateřskému mléku a jeho složení je v prvních měsících kojenců střevní mikroflóra tvořena z 91 % bifidobakteriemi (Tannock, 2002) z celkového počtu 108-1010 buněk v jednom gramu stolice. Tento stav se nemění až do odstavení od mateřského mléka, kdy dochází k rychlému rozvoji gramnegativních anaerobních bakterií zejména rodu Bacteroides, Eubacterium, Fusobacterium, dále přibývají koliformní bakterie Enterococcus, E. coli a Clostridium. Tyto poměrně velké změny se postupně ustálí a zůstává téměř totožná i v dospělosti (Zbořil, 2005). Podíl bifidobakteriíí tedy klesá a u dospělých jedinců tvoří přibližně 10 % střevní mikroflóry (Tannock, 2002). Obdobně se vyvíjí střevní mikroflóra u selat, s tím rozdílem, že 9
u jedinců s již vyvinutou střevní mikroflórou je detekováno vyšší množství rodu Streptococcus (Metzler, mosenthin, 2008). Bylo prokázáno, že u lidí bifidobakterie bezesporu lépe prospívají u dětí kojených mateřským mlékem. Tyto jedinci mají obvykle lépe vyvinutý metabolismus tuků a lipofilních látek. U kojenců vyživovaných náhražkou mateřského mléka je jejich zastoupení nižší (Tannock, 2002), dříve dochází k rozvoji gramnegativních anaerobů a koliformních bakterií. Bylo pozorováno, že u nekojených dětí se častěji vyskytují enterální infekce, které mají podstatně horší průběh. Kvalitativní struktura mikroflóry ve vyšším věku zůstává zachována, avšak dochází ke změně kvantitativního zastoupení jednotlivých složek. Charakteristický je růst počtu grampozitivních anaerobů, sulfbakterií, methanogenů a bakterionů na úkor bifidobakterií. To vede ke snížení produkce volných mastných kyselin s krátkým řetězcem, které se významně podílejí na výživě střevní sliznice. Dále se zvyšuje tvorba sirovodíku, metanu a octanu (Zbořil, 2005). Tyto změny mohou výrazně ovlivnit prostředí v trávicí trubici, mění se pH, snižuje se bariérová funkce střevní sliznice, především v důsledku změny kvality střevní mukózy a dochází i k modifikaci metabolické aktivity gastrointestinální mikroflóry (Tannock, 2002, Zbořil, 2005).
3.1.2
Rozloţení střevní mikroflóry
Mikroflóra trávicího traktu je závislá na řadě endogenních a exogenních faktorů, i přes to je u dospělých zdravých jedinců poměrně stabilní. Její variabilita mezi jedinci je dána především etnicky, geograficky, stravovacími návyky, nebo vlivem onemocnění. K patologickému stavu může dojít v důsledku orálního užívání antibiotik, poruch imunitního systému, radioterapie, rakoviny, stresu a dalších onemocnění (Kvasničková, 2008). Z dietních zvyklostí je podstatná hygiena potravin, množství konzumovaných fermentovaných potravin a dalších látek podporujících rozvoj střevní mikroflóry. Dominantní úlohu má podíl vlákniny ve stravě. Vláknina zvyšuje podíl laktobacilů a bifidobakterií na úkor sulfbakterií, bakteroidů a metanogenů. Strukturální odlišnost v mikroflóře v jednotlivých geografických oblastech souvisí se stravovacími zvyklostmi a hygienou (Zbořil, 2005). Uvádí se, že celkový počet mikrobiálních elementů v trávicím traktu je 1016 (Tannock, 2002), z toho až 1014 mikroorganizmů osídlilo přímo 10
povrch sliznice. Mezi nejdůležitější faktory ovlivňující střevní mikroflóru patří zejména stravovací návyky, zdravotní stav a hygiena okolního prostředí (Konstantinos a kol., 2006). Normální fyziologická mikroflóra se v jednotlivých oddílech trávicí trubice značně liší a to co do počtu, tak i co do druhů mikroorganismů jak znázorňuje tabulka 1. Ústní dutina a hltan jsou osídleny zejména aerobními druhy (Streptococcus, Staphyloccocus, Candida a některými gramnegativními bakteriemi) v celkovém počtu 107 v 1 ml. Mikrobiální ekosystém v této části trávicí dutiny nemá velký význam na digestivní funkci, avšak může ovlivnit její zdravotní stav a tím i funkčnost (Tannock, 2002). Tab. 1: Schéma rozložení střevní mikroflóry střevního traktu (Zbořil, 2005) ţaludek celkové množství / ml
jejunum
ileum
kolon
10-103
0-105
103-109
1010-1012
koliformní bakterie
0-102
0-103
102-107
104-1010
streptokoky aerobní
0-103
0-104
102-106
105-1010
stafylokoky
0-102
0-103
102-105
104-109
laktobacily
0-103
0-104
102-105
106-1010
plísně a kvasinky
0-102
0-102
102-104
104-106
bakteriody
ojediněle
0-103
103-107
1010-1012
bifidobakterie
ojediněle
0-104
103-108
108-1011
streptokoky anaerobni
ojediněle
0-103
102-106
1010-1012
klostridie
ojediněle
ojediněle
102-104
106-1011
eubakterie
ojediněle
ojediněle
ojediněle
109-1012
aeroby a fakultativní anaeroby
anaeroby
Do rozmezí uvedených v tabulce 1 náleží i hodnoty pozorované autory Mountzouris a kol (2006), Xia a kol (2005) v trávicí trubici prasat (avšak tito autoři neuvádí množství stafylokoků, plísní, kvasinek a streptokoky). Z tabulky 1 je patrné, že počátek trávicí trubice je osídlen především aerobními druhy a že dochází k postupné proměně na anaerobní mikrobiální ekosystém. Zatímco v tenkém střevě je poměr aerobů a anaerobů 1:1, v aborální části kolonu je poměr aerobních a anaerobních 11
mikrobů 1:1 000 (Zbořil, 2005). Postupná přeměna z aerobního ekosystému na anaerobní je dána tím, že mikroorganizmy směrem aborálním spotřebovávají kyslík, tím vytvářejí vhodné prostředí pro růst anaerobních mikrobů. Za zmínku také stojí kvantitativní rozložení mikroorganizmů. Aborálním směrem se jejich počet zvyšuje, v tlustém střevě je o 104-106 více mikroorganizmů než ve střevě tenkém, je tedy zřejmé, že celková metabolická aktivita mikrobů je vyšší v tlustém střevě (Tannock, 2002).
3.1.3
Modulace střevní mikroflóry
Jak již bylo řečeno kvantitativní i kvalitativní složení střevní mikroflóry je závislé na řadě faktorů. Ovlivněním některých z těchto faktorů jsme schopni do jisté míry pozměnit složení mikroflóry střevního traktu (Tannock, 2002). Zásadním vlivem modulujícím střevní mikroflóru jsou dietní zvyklosti, které jsou dány především geografickou polohou, sociálními a hygienickými aspekty. Složení potravy zásadním způsobem ovlivňuje rozvoj mikroorganizmů. Dominantní vliv má podíl vlákniny ve stravě. Dlouhodobá konzumace vlákniny podporuje růst bifidobakterií a laktobacilů a naopak inhibuje rozvoj grampozitivních anaerobů (Lee a Salminen, 2009). Vláknina také podporuje prokrvení sliznice, motilitu trávicího ústrojí a tvorbu mastných kyselin s krátkým řetězcem. Dalším významným faktorem je konzumace antibiotik, které konzumujeme při léčbě infekcí. Antibiotika však můžou inhibovat normální fyziologickou mikroflóru, což v některých případech vede k pomnožení potenciálně patogenních mikrobů. Užívání antibiotik způsobuje prostý průjem, který obvykle spontánně ustoupí po ukončení terapie. V horším případě může užívání antibiotik způsobit kolitidu spojenou s řadou komplikací jako je perforace tračníku (Zbořil, 2005). Kolitida je spojena s rozvojem infekčních bakterií Clostridium difficile (Heredia a kol., 1994). Antibiotika můžou působit na mikrobiální ekosystém také pozitivně. Jednak ovlivňují imunologický systém – snižují chemotaxi (gentamicin, doxycyklin, amikacin, tobramycin a další), snižují transformaci lymfocytů a fagocytózu (tetracyklin, chloramfenikol, nitrofurany, cotrimoxazol) (Zbořil, 2005). Dalším pozitivním vlivem je vlastní antimikrobiální efekt
12
na patogenní mikroflóru. Dnes se cíleně intestinální mikroflóra modifikuje užíváním probiotik a prebiotyk.
3.2
Probiotika
Termín probiotika pochází z řeckého jazyka a znamená doslova „pro život“, je tedy pravým opakem slova „antibotika“ Probiotikem označujeme živé mikroorganizmy využívané jako aditivum k potravě nebo krmivu prospívající hostiteli pozměněním mikroflóry v gastrointestinálním traktu (Klaban, 2011). V Evropské unii neexistuje legislativní předpis, který by upravoval uvádění potravin s cíleně přidanými mikroorganismy na trh, a to ani v případě kojenecké a dětské výživy, kde jsou často probiotické bakterie výrobci náhradní výživy používány. Na probiotika částečně můžeme aplikovat Nařízení EP a Rady o nových potravinách a nových složkách potravin (č. 258/97/ES) (Špelina a Ettlerová, 2006). Probiotiky ve výživě zvířat se zabývá nařízení Evropské komise č. 1831/2003 o aditivech ve výživě zvířat (Lee a Salminen, 2009). Další často užívané pojmy v souvislosti s probiotiky jsou prebiotika a synbiotika. Prebiotikem rozumíme polysacharidy pro hostitelský organizmus nestravitelné, ale které jsou fermentovány střevní mikroflórou a selektivně podporují růst určitých druhů bakterií v gastrointestinálním traktu (Kvasničková, 2008). Mezi prebiotika řadíme inulin, oligofruktózu, laktulóza a mnoho dalších polysacharidů (Franz a kol., 2011). Prebiotika příznivě ovlivňují složení a metabolickou aktivitu střevní mikroflóry, zvětšují objem stolice, snižují riziko zácpy a snižují energetický příjem. Svým vlivem na některé mikroorganizmy v gastrointestinálním traktu přispívají k prevenci střevních průjmů, snižování krevního cholesterolu a snížení rizika některých onemocnění (Kondepudi a kol., 2012). Synbiotika jsou složena z probiotik a prebiotik, kde prebiotická složka cíleně podporuje růst, nebo zesiluje účinky probiotické složky (Franz a kol., 2011).
13
3.2.1
Podmínky působení probiotik
Aby konkrétní kmen mikroorganizmu mohl být využíván jako probiotická kultura, musí splňovat relativně přísné podmínky. Původně bylo navrženo přes dvacet kritérií, která by mikrobiologické kultury měly splňovat. Odborníci se však shodli na pěti z nich, které charakterizují probiotické mikroorganizmy: 1. Mikroorganizmy musí být jednoznačně definovány a musí mít původ v lidském trávicím traktu 2. Mikroby musí vykazovat klinicky ověřený, prokazatelně pozitivní účinek na zdraví konzumenta (Tannock, 2002). 3. Používané kmeny nesmějí vykazovat žádné známky patogenity, tedy nesmějí být enteroinvazivní, nesmějí produkovat toxiny a musí být bez hemolytických účinků (Singh a kol., 2011). 4. Dále mikroorganizmy musí být dostatečně stabilní a životaschopné v průběhu skladování, musí zůstávat živé během potravinářské výroby. Probiotika nesmí zhoršovat senzorické vlastnosti potraviny a musí být životaschopné do konce záruční doby výrobku. 5. Probiotika musí být dostatečně odolná vůči nepříznivému prostředí trávicího traktu. Musí tedy přežívat nízké pH v žaludku, být rezistentní vůči proteolytickým enzymům, žlučovým kyselinám a antimikrobiálním látkám jako je lysozym (Lee a Salminen, 2009). Probiotické
mikroorganizmy
nekolonizují trávicí ústrojí
natrvalo,
proto
pro zachování jejich účinku, musí být po celou dobu pravidelně konzumovány. Pro účinnost probiotických kultur je důležité jejich terapeutické množství, které se u různých autorů liší. Špelina a Ettlerová (2006) uvádí, že pro příznivé účinky probiotik musí být dosaženo množství 106 KTJ/g v tenkém střevě a 108 KTJ/g v tlustém střevě. K tomu je nutné, aby v konzumované potravině bylo minimálně 1010 KTJ/g těchto probiotických mikroorganizmů. Lee a Salminen uvedli, že účinky některých probiotických kultur se projeví již při konzumace 106 KTJ/g potraviny.
14
Charakteristika často uţívaných probiotických mikroorganizmů
3.2.2
Většinu probiotik řadíme do skupiny bakterií mléčného kvašení (Singh a kol., 2011). Tyto bakterie se vyznačují fermentací sacharidů na kyselinu mléčnou, která se využívá jako přírodní konzervant. Většina probiotik schopných metabolizovat sacharidy na kyselinu mléčnou se využívá jako startovací kultury v potravinářské technologii (Šilhánková, 2008). Nejčastěji používaná probiotika (Tab. 2) jsou z rodů bifidobakterie, lactobacillus,
leuconostoc,
streprococcus,
enterococcus,
pediococcus,
bacillus,
kvasinky saccharomices, ale i některé plísně (Singh a kol., 2011). Bifidobakteria jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující, striktně anaerobní tyčinky o velikosti 0,5 – 1,4 x 1,5 – 8 μm. Jejich buňky jsou pleomorfní a jsou charakteristické fermentací glukosy, ze které vzniká kyselina mléčná a kyselina máselná v poměru 2:3 (Šilhánková, 2008). Jejich optimální teplota růstu je mezi 37 a 40 °C při pH 6,5-7 (Mangin a kol., 1999). Nejčastěji užívané druhy bifidobakterií jsou uvedeny v tab. 2. Tab. 2: Nejčastěji využívané brobiotické kmeny podle Mombelli a Gismondo, (2000) Laktát produkující bakterie
Mikroby neprodukující laktát
Lactobacillus
Bifidobacterium
Enterococcus
Pediococcus
Bacillus
Saccharomyces
acidophilus
adolescentis
faecalis
acidilactici
cereus
boulardii
casei
animalis
faecium
subtilis
cerevisiae
crispatus
bifidum
gasseri
anifantis
johnsonii
lactis
reuteri rhamnosus
Bifidobakterie se vyskytují v ústech a střevech všech teplokrevných obratlovců. Poprvé byly izolovány v Německu ze stolice kojenců, kde se nacházejí převážně Bifidobacterium breve a Bifidobacterium infantis. U dospělých jedinců převládají Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, které tvoří asi 10 % střevní mikroflóry, přičemž jejich počet klesá s rostoucím věkem. Nepřítomnost bifidobakterií
15
v intestinálním traktu člověka značí abnormální stav střevní mikroflóry obvykle doprovázený zdravotními obtížemi (Tannock, 2002). I když většina druhů prakticky nepřežívá vystavení pH menšímu než 2 po dobu 10 minut, některé bifidobakterie (B. animalis, B. lactis) přežívají při tomto pH až 90 minut. Bylo pozorováno, že odolnost vůči kyselině chlorovodíkové je podporována přítomností pepsinu (Sanz, 2007). Bifidobakterie jsou schopny dekonjugace žlučových kyselin, mají tak anticholesterolemický účinek. Syntetizují některé vitamíny skupiny B, K (Mombelli a Gismondo, 2000), kyselinu listovou, snižují projevy laktózové intolerance (Lee a Salminen, 2009), modulují imunitní systém (Mombelli a Gismondo, 2000), působí antikarcinogenně a jsou schopny produkovat bakteriociny jako bifidin, bifidocin, termofilicin a bisin. Tyto antimikrobiální látky vyprodukované bifidobakteriemi se uplatňují nejen při inhibici patogenních mikroorganismů přímo v intestinálním traktu, ale i jako konzervanty ve vybraných potravinách. Bifidobakteriální bakteriociny jsou malé termostabilní sloučeniny bílkovinné povahy. Odolávají záhřevu až na 100 °C po dobu pěti minut a působí proti rozvoji bakterií rodu Streptococcus, Lactococcus, Clostridium, Salonella typhymurium, Listerie monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus cereus (Martinez a kol., 20013). Dalším hojně užívaným rodem je Laktobacillus. Jedná se o nesporogenní, grampozitivní, glukosu fermentující anaerobní tyčinky, které jsou však v laboratořích obvykle kultivovány za mikroaerofilních podmínek. V přírodě se vyskytují v mléce, kde jsou zodpovědné za přirozené kysání, dále se vyskytují v ústech a střevech savců, v půdě, na obilovinách a dalších rostlinách (Šilhánková, 2008). Jejich schopnost produkce kyseliny mléčné je také využívána pro konzervaci zeleniny (zelí, okurky), siláže a v mlékárenském průmyslu. Laktobacilli jsou jedny z nejvyužívanějších probiotik (tab.: 2) v humánní stravě, i přes to netvoří více jak jedno procento běžné střevní mikroflóry člověka (Mangin a kol., 1999). Optimální teplota pro růst většiny druhů je 30 - 45 °C při pH 5,4 – 6,4. Podle metabolismu rozdělujeme rod Lactobacillus na homofermentativní, které produkují pouze kyselinu mléčnou, a heterofermentativní mléčné bakterie, ty kromě laktátu produkují oxid uhličitý a etanol. Mezi homofermentativní řadíme L. delbrueckii, L. acidophilus, L. plantarum, L. salivarius a mezi heterofermentativní L. brevis, L. buchneri,
L.
fermentum
(Šilhánková,
2008).
Svojí
metabolickou
činností
Laktobacillus může snížit pH až na 4, čímž působí mikrobicidně (Martin a kol., 2008) 16
ve fermentovaných potravinách i gastrointestinálním traktu. Laktokoky inhibují růst a snižují adhezi na buňky střevní sliznice především gramnegativních bakterií jako E. coli, S. typhimurium a H. pylori (Maragkoudakis a kol., 2006). Také se podílejí na produkci některých vitamínů a jako bakterie mléčného kvašení snižují alergické projevy laktózové intolerance (Martin a kol., 2008). Lactococcus řadíme mezi grampozitivní, mikroaerofilní až anaerobní koky o velikosti 0,5-1,5 μm. Jejich optimální teplota růstu je 30°C. Řadíme je mezi homofermentativní čisté mlékařské kultury, využívané při výrobě másla, tvarohu, sýrů, zakysaného mléka a smetany. Některé druhy Lactoccocus lastis jsou schopny produkovat antibiotikum nisin inhibující grampozitivní bakterie. Mezi nejčastěji využívané druhy pro výrobu fermentovaných potravin řadíme Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus raffinolactis a Lactocossus plantarum. Pediococcus
jsou
grampozitivní
anaerobní
koky,
které
řadíme
mezi
homofermentativní bakterie mléčného kvašení, protože kyselina mléčná je téměř jediným produktem jejich metabolismu. Využívají se k výrobě másla, řady fermentovaných masných výrobků a kysaného zelí. Významné jsou i díky schopnosti produkovat diacetyl (Šilhánková, 2008). Do skupiny probiotik neprodukujících kyselinu mléčnou patří především bakteriální rod Bacillus a kvasinky z rodu Saccharomyces (Mombelli a Gismondo, 2000). Kvasinky Saccharomyces jsou v přírodě velmi rozšířené a našly široké uplatnění v potravinářském a chemickém průmyslu. Patří mezi heterofermentativní eukariotní mikroorganizmy, které řadíme mezi houby (Šilhánková, 2008). Kvasinky jsou schopny zkvašovat většinu jednodušších cukrů. Nikdy však nevyužívají laktózu. Jako probiotikum jsou obvykle využívány S. cerevisiae a S.boulardii, které našly využití především při léčbě akutních průjmů. Rod Bacillus je velmi rozsáhlý a rozšířený. Jedná se o velké bakterie o průměru 0,5-1,2 μm a délce 10 μm (Votava a kol., 2006). Bacillus je tvořen pohyblivými grampozitivními tyčinkami s bohatým enzymatickým vybavením, díky čemuž si našly široké uplatnění v chemickém, potravinářském a textilním průmyslu Některé z druhů produkují antibiotika polypeptidové povahy, avšak část druhů je schopna produkovat toxiny a tvořit spory (Šilhánková, 2008). Jejich využití jako probiotikum je tedy 17
komplikované. Podle Mombelli a Gismondo (2000) se jako probiotikum dají využít v prevenci průjmových onemocnění pouze některé poddruhy Bacilla cerea a Bacilla subtilis. Optimální teplota pro růst je 35 – 45 °C a pH nad 4,8.
3.2.3
Rod Enterococcus
Vědec Thiercelin poprvé v roce 1899 popsal morfologické a biologické vlastnosti nového rodu, který kvůli střevnímu původu nazval „entérocoque“. O čtyři roky později navrhli Thiercelin a Jouhaud rodové jméno Enterococcus (Kalina, 1970). Tento název je odvozen z řeckého enteron – střevo a coccos – kulaté jádro (Klaban, 2011). V pozdějších klasifikacích až do roku 1980 byly enterokoky spolu s dalšími mléčnými a ostatními streptokoky zahrnuty do rodu Streptococcus (Franz a kol., 2011). Bakterie rodu Enterococcus jsou grampozitivní, fakultativně anaerobní, nesporogenní koky, vyskytující se jednotlivě, v párech, nebo můžou tvořit řetízky. Řadíme je mezi homofermentativní, kataláza negativní bakterie mléčného kvašení, které se hojně vyskytují v trávicím traktu zvířat i lidí (Votava a kol., 2006). Jsou schopny fermentovat velké množství sacharidů (N-acetylglukosamin, arbutin, ribósa, amygdalin, celobiósa, D-fruktósa, laktósa, maltósa, galaktósa, D-mannosa, a další), jejich hlavním produktem je L-kyselina mléčná. Enterokoky získávají tedy energii především ze sacharidů, ale jsou schopny degradovat některé aminokyseliny (arginin, tyrosin, serin, fenylalanin a další). Většina enterokoků netvoří plyny (de Vos a kol., 2009), výjimkou jsou E. avium a E malodoratus, které tvoří sirovodík. Enterokoky jsou poměrně odolné vůči nepříznivým podmínkám okolního prostředí, mohou přežívat po 30 minut záhřev na 60°C (Votava a kol., 2006). Většina enterokoků odolává vyšším koncentracím solí, až 6,5% NaCl, přežívají i při pH 9,6 a prospívají v prostředí s nízkou aktivitou vody. Optimální teplota růstu je při 37°C, ačkoliv většina druhů roste v rozmezí od 10 do 45°C (Devriese a kol., 1993). Jejich přítomnost ve vodě obvykle naznačuje fekální znečištění, takže se mohou využívat jako indikátorové mikroorganizmy. Enterokoky jsou permanentní mikroflórou mléka, mléčných výrobků, fermentovaných masných výrobků a některých potravin rostlinného původu (Šilhánková, 2008). Běžně se vyskytují především ve výrobcích ze syrového mléka, kde hrají významnou roli při
18
zrání. Prostřednictvím lipolytických a proteolytických enzymů utvářejí jejich typické aroma a vůni. Enterokoky jsou schopny produkovat bakteriociny inhibující grampozitivní bakterie zodpovědné za kažení potravin a dokonce i některé patogenní bakterie jako Listerie. Na základě strukturálních, molekulárních a fyzikálněchemických vlastností můžeme bakteriociny enterokoků rozdělit do tří základních skupin. První skupinou jsou lantibiotika, malé kationtové hydrofobní termostabilní peptidy, pro něž jsou typické neobvyklé aminokyseliny jako thioéter aminokyseliny lanthioninové a 3-methyllanthionin. Do druhé skupiny patří bakteriociny vzniklé z prebakteriocinu při posttranslačních modifikacích, kdy dochází k rozštěpení této bílkoviny na tři malé, hydrofobní peptidy, které se liší svými účinky. Do poslední skupiny zařazujeme termolabilní, velké bílkoviny hydrofilní povahy (Moreno a kol., 2006).
Obr. 1: Enterococcus faecium (http:en.wikipedia.org/wiki/File:Staphylococcus_ aureus_VISA_2.jp)
19
Jako probiotické kultury jsou využívány pouze dva Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium (obr. 1), které jsou nejpočetnějšími zástupci enterokoků v gastrointestinálním traktu zvířat i lidí. U hospodářských zvířat, zejména drůbeže, prasat, ovcí a krav, jsou dále běžnou součástí střevní mikroflóry E. durans, E. hirae a E. cecorum (Franz a kol., 2011). Rod Enterococcus bývá spojován s řadou onemocnění zvířat i lidí. Je považován za původce enteritid, infekcí močových cest, meningitidy, sepse a choroby žlučníku (de Vos a kol, 2009). Zdrojem enterokokové infekce u člověka bývá asi z 90 % Enterococcus faecalis, ze 7 % Enterococcus faecium, ostatní druhy způsobují infekce jen vzácně. Tyto bakterie můžou způsobovat infekci otevřených ran, nitrobřišní záněty a především nosokominální infekce zejména u dlouho hospitalizovaných pacientů se zavedeným močovým a intravaskulárním katétrem (Votava a kol., 2006). Jejich význam jako původce těchto chorob roste hlavně v důsledku stále se zvyšující rezistence vůči antibiotikům (de Vos a kol, 2009). V současné době je Enterococcus třetím nejpočetnějším rodem ze skupiny bakterií mléčného kvašení. Z této skupiny rozeznáváme 37 druhů, které můžeme rozdělit do sedmi skupin na základě podobnosti 16S rRNA genu (viz tab. 3) (Franz a kol., 2011). Tab. 3: Rozdělení enterokoků podle podobnosti 16S rRNA genu Skupiny druhů rozdělené podle
Enterococcus
odlišnosti 16S rRNA genu E. avium
E. avium, E. devriesei, E. gilvus, E. malodoratus, E. pseudoavium, E. raffinosus
E. cecorum
E. cecorum, E. columbae
E. dispar
E. dispar, E. asini, E. canintestini, E. hermanniensis, E. pallens
E. faecalis
E. faecalis, E. caccae, E. haemoperoxidus, E. moraviensis, E.silesiacus, E. termitis, E. ureasiticus, E. quebecensis
E. faecium
E. faecium, E. canic, E. durans, E. hirae, E. mundtii, E. phoeniculicola, E. ratti, E. villorum, E. thailandicus
E. gallinarium
E. gallinarum, E. casseliflavus
E. saccharolyticus
E. sacharolyticus, E. acquimarinus, E. camelliae, E. italicus, E. sulfureus
20
Jak již bylo zmíněno, rod Enterococcus vykazuje vysokou rezistenci vůči antibiotikům. Již v roce 1988 ve Spojeném království a Francii byly od pacientů izolovány rezistentní kmeny na vancomycin. Od té doby se rezistentní kmeny rodu Enterococcus rozšířily po celém světě. Často se vyskytují i v mase hospodářských zvířat (Yean a kol., 2007). Uvádí se, že v roce 2003 podíl nozokominálních infekcí způsobených enterokoky u pacientů na jednotce intenzivní péče vzrostl o více než 12 % ve srovnání s léty 1998-2002. V Evropě nebezpečí této infekce není zdaleka tak velké. Vancomycin rezistentní enterokoky byly izolovány z různých hospodářských zvířat, kuřat, masných výrobků, odpadních vod aj (Fraser, 2011). Existuje šest fenotypů rezistence vůči vancomycinu VaA, VanB, VanD, VanC, VanE a VanG, z nichž některé jsou přenosné a jiné jsou nepřenosné (VanC). Fenotyp VanC je charakteristický pro E. gallinarum a E. casseliflavus. Fenotyp VanB je charakterizován mírnou odolností vůči vancomycinu a nejčastěji se vyskytuje u E. faecalis a E. faecium (De Vos a kol., 2009). Většina
enterokoků
je
také
odolná
vůči
β-laktamům,
linkosamidům,
fluorochinolonům a nižší koncentraci aminoglykosidů. Vysokou rezistenci také vykazují vůči antibiotikům a dalším látkám, jako je makrolid, glykopeptidy, chloramfenikol,
tetracyklin,
streptograminy,
aminoglykosidy,
betalaktamová
antibiotika, linkosamid a chinoliny. Rezistence k antibiotikům je zajištěna sekvencemi nukleové kyseliny v plasmidech a transpozonech. Rezistence k vancomycinu bakterií rodu Enterococcus je závažný problém. Odolnost vůči beta-laktamovým antibiotikům byla objevena u klinických kmenů E. faecalis a E. faecium. Produkce beta-laktamázy u těchto dvou druhů je velmi vzácná. Obecně E. faecium prokazuje vyšší výskyt rezistence než E. faecalis a jiné druhy enterokoků (De Vos a kol., 2009).
3.2.3.1
Bakterie
rodu
Identifikace rodu Enterococcus
Enterococcus
většinou
hojně
rostou
na
běžně
používaných
bakteriologických médiích. Potřebují několik aminokyselin, vitamíny B, purinové a pyrimidinové báze. Tvoří pravidelné a kruhové kolonie s hladkým povrchem. Mají až 5 mm v průměru. Pro izolaci enterokoků se využívá více jak 60 selektivních médií. Nevýhodou všech těchto médií je, že umožňují růst i některým jiným bakteriím a 21
částečně nebo zcela inhibují růst mnoha druhů enterokoků (De Vos a kol., 2009). Enterokoky vykazují dobrý růst na krevním agaru. Vytvářejí na něm šedobílé kolonie bez hemolýzy. V současné době pro identifikaci mikroorganizmů existuje celá řada metod. Jednou z nich je tzv. biotyping, kdy se detekují metabolické produkty a enzymy typické pro daného mikroba. Doming a kol. (2003) uvádí, že pro rozlišení enterokoků bylo ustanoveno 12 biochemických testů, jimiž lze stanovit 19 Enterococcus ssp. včetně E. faecium a E. faecalis. Nevýhodou této metody identifikace je potřeba provést více jak 1 600 izolací dané kultury a skutečnost, že komerční kyty zcela nepokryjí potřeby všech testů (Doming a kol., 2003). Pro stanovení některých druhů enterokoků (E. faecium, E. villorum, E. durans, E. hirae) se využívá stanovení bílkovinných profilů za pomoci SDS-PGA metody. Jedná se o spolehlivou, ale poměrně zdlouhavou metodu (Devriese a kol., 2002), kdy se elektroforeticky stanoví charakteristické bílkoviny jednotlivých druhů či poddruhů bakterií. Enterokoky se od ostatních kataláza negativních organizmů rostoucích za stejných podmínek odlišují také za pomoci D antigenu (Doming a kol., 2003). D antigen je tvořen polymerem kyseliny teichoové, která je navázana na glycerol-fosfátovou kostru polymeru esterovou vazbou. Lipidová složka je tvořena l-kojibiosyl diglyceridem (de Vos a kol., 2009). Jsou tak schopny reagovat s Lancefield group D antiserem. Tento test však není zcela spolehlivý, protože pozitivní reakci na Lancefield group D antiserum vykazuje několik streptokoků (Strep. bovis, Strep. suis). Pro identifikace rodu Enterococcus se tedy využívá pyrolidonylarylamidasa na niž reagují negativně, zatímco streptokoky, aerokoky a laktokoky reagují pozitivně (Devriese a kol., 1993). Pro rychlou a spolehlivou identifikaci se dnes často využívá metod PCR. Chromozomy enterokoků jsou různé délky, pro E. faecalis se pohybuje v rozmezí od 3 000 do 3 250 kb a pro E. faecium 2 550-2 995 kb. Při určování rodu Enterococcus bývá nejčastěji využívána sekvence genu 16S rRNA (Doming a kol., 2003). Určení jednotlivých druhů je však složitější. Dutka-Malen a kol. (1995) vyvinul primery a ustanovil postup pro PCR idetifikaci E. faecium a E. faecalis. Tyto primery jsou zaměřeny na gen kódující D-alanin ligázu. V dnešní době přibývají metody a postupy jak taxanomicky rozlišit jednotlivé druhy mikroorganizmů. K dostání jsou už i odlišné primery pro stanovení celé řady enterokoků (Doming a kol., 2003).
22
3.2.4
Účinky probiotik
Mikroorganizmy v trávicím traktu savce můžou významným způsobem ovlivňovat metabolizmus endogenních i exogenních látek a mohou pozměnit i etiologii a vývoj některých chorob jako například inzulínovou rezistenci, Crohnovu chorobu, potravinové alergie, žaludeční vředy, žaludeční záněty, kardiovaskulární onemocnění a další onemocnění (Martin a kol., 2008). Například Braat a kol. (2004) uvádí, že L. rhamnosus může při orálním podávání lidem postižených Crohnovu chorobu významě snížit přecitlivělost na některé potraviny. Velký význam probiotika mají i jako prevence především vůči průjmovým, ale i jiným onemocněním, hojně se využívají pro obnovu přirozené střevní mikroflóry po chirurgických zákrocích, či při dlouhodobém perorálním užívání antibiotik (Correia a kol., 2012). Účinky probiotik nemusí být vždy kladné. Ve výjimečných případech se projevil nežádoucí účinek v podobě infekčních střevních onemocnění. Tyto případy jsou vzácné, byly pozorovány výhradně u konzumentů s poškozenou imunitou v důsledku leukémie, nebo působením HIV viru. Probiotika nejsou nebezpečná ani pro malé děti, velmi staré lidi, ani pro těhotné ženy (Quillien, 2001). Různé probiotické kmeny mohou mít velmi rozdílné účinky. Dokonce, i když různé mikroorganizmy mají stejný vliv na hostitelský organismus, nelze předpokládat, že je dosažen stejným mechanizmem. Dnes je nám známo, že každá konkrétní probiotická kultura působí na hostitele celou řadou mechanizmů, které se vzájemně doplňují a nelze je striktně oddělit. Soubor těchto účinků je zpravidla charakteristický pro konkrétní druh (Tannock, 2002). Značná část mechanizmů účinků probiotické mikroflóry na hostitelský organizmus nebyla dosud objasněna, avšak hlavní mechanizmy působení jsou již známé a můžeme je rozdělit do čtyř základních skupin: 1) Antimikrobiální aktivita 2) Podpora a posílení bariérové funkce střevní sliznice 3) Imunomodulace 4) Metabolické účinky probiotik
23
3.2.4.1
Antimikrobiální aktivita probiotik
Pro inhibici patogenních a potenciálně patogenních mikroorganizmů se využívají zejména bakterie mléčného kvašení, které potlačují růst listérií, klostrídií, salmonell, kampylobaktérií, escherichia a dalších (Lee a Salminen, 2009). Antimikrobiální aktivita probiotických kultur vůči patogenům je zajištěna několika mechanizmy. Mezi ně patří produkce řady látek s bakteriostatickými či bakteriocidními účinky (diacetyl, acetaldehyd a etanolu). Například bakterie s flavoprotein oxidázou produkují za přítomnosti kyslíku peroxid kyslíku (Šilhánková, 2008). Antimikrobiálně na některé aerobní
mikroorganizmy
působí
i
oxid
uhličitý.
CO2
způsobuje
inhibici
dekarboxylačních enzymů, takže se CO2 akumuluje v buněčné membráně, kde negativně ovlivňuje její propustnost (Lee a Salminen, 2009). Významnou antimikrobiální aktivitou je schopnost produkovat řadu organických kyselin, a to především kyselinu octovou, propionovou, mléčnou, máselnou, ale i další kyseliny. Dochází tak ke snížení intraluminálního pH (Botrlík, 2009), to vede ke zhroucení elektorochemického gradientu jednobuněčných organizmů, což působí bakteriostaticky a vede až k usmrcení buňky. Dále některé kyseliny (kyselina mléčná) interagují s lipopolysacharidy v buněčných membránách gram-negativních bakterií, což způsobuje permeabilizaci membrány a následně k lyzi celé buňky (Lee, Salmine, 2009). Dalším významným antimikrobiálním působením probiotik je jejich schopnost tvořit bakteriociny a bakteriostatika jako mastné kyseliny s krátkým řetězcem a lysolecityn (Oelschlseger, 2010). Řada antibioticky aktivních látek je bílkovinné povahy, ty působí negativně na vybrané kmeny bakterií. Bakteriociny jsou definovány jako heterogenní skupina proteinů s úzkým spektrem působení a jsou produkovány především grampozitivními bakteriemi lišícími se spektrem účinnosti, způsobem účinku, molekulovou hmotností, genetickým původem a biochemickými vlastnostmi. Pravděpodobně kvůli specifickému působení bakterie obvykle produkují celou řadu různých bakteriocinů, čímž se rozšiřuje spektrum působení daného kmene na ostatní mikroby. Bakteriociny se dělí do tří hlavních skupin, které byly popsány v kapitole zabývající se enterokoky. Mezi nejlépe prozkoumaný bakteriocin patří nisin, který řadíme do první třídy bakteriocinů. Nisin je produkován laktokoky a působí proti grampozitivním bakteriím (Lee, Salmine, 2009) (bakterie mléčného kvašení, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, vegetativní buňky Bacillus spp. a 24
Clostridium spp.). Nisin je schopný rozkládat cytoplazmatickou membránu, a tak navodit lyzi buňky, popřípadě narušit metabolické procesy v buněčné membráně (Botrlík, 2009). Probiotika jsou také schopna stimulovat tvorbu defenzinů, což jsou endogenní antibiotika peptidické povahy. Jsou produkovaná leukocyty, buňkami sliznice a především Panethovými buňkami. Oproti baktriocinům nemají jen antibakteriální účinky, ale působí i antiviroticky a antimykoticky. Defenziny hrají také důležitou roli v potlačení idiopatických střevních zánětů, ulcerózní kolitidy a aktivují složky komplementu (Correia a kol., 2012). Adhezivní vlastnosti jsou jedny z faktorů ovlivňující výběr probiotických kmenů, protože jsou významné pro úspěšnou kolonizaci trávicí trubice. Zároveň se jedná o důležitou vlastnost patogenních mikrobů vyžadovanou pro kolonizaci a invazi gastrointestinálního traktu. Zamezení přilnavosti patogenů na sliznici trávicí trubice tedy značně redukuje negativní vliv těchto mikrobů na hostitelský organizmus (Lee a Salminen, 2009). Některé kmeny laktobacilů, E. coli, či bifidobakterií kompetetivně inhibují adhezi patogenních mikroorganizmů a jejich toxinů na sliznici trávicí trubice. In vitro byla dokonce prokázána schopnost vytlačit již přilnuté patogeny (Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacteroides vulgatus, Clostridium difficile, a Clostridium perfringens), což je významná vlastnost vedoucí k potlačení enteroinvazivních mikroorganizmů (Lukáš, 2003). Adhezivitu probiotik se podařilo prokázat in vitro, adheze na buňky střevní sliznice nebyla dosud in vivo prokázána (Oelschlaeger, 2010). Z toho vyplývá, že pokles fyziologické mikroflóry otevírá cestu patogenním bakteriím (Zbořil, 2005).
3.2.4.2
Podpora a posílení bariérové funkce střevní sliznice
Bariérová funkce sliznice trávicího traktu je zajišťována především změnou sekrece vody, hlenu, některých elektrolytů (Correia a kol., 2012) a zejména tzv. tight junction, které se podílejí na soudržnosti epiteliálních buněk. Tight junction tak snižuje prostupnost patogenů přes sliznici do tkání (Gratz a kol., 2010). Bakterie jako L. acidophilus, nebo E. coli Nissle 1917 jsou schopny stimulovat obnovu tight junction. Dochází tak k rychlejší reparaci buněčných spojů epiteliálních buněk sliznice po jejich 25
narušení. Schopnost probiotik posílit bariérovou funkci přímo závisí na typu probiotického mikroorganizmu a mechanizmu postižení střeva (Botrlík, 2009). Některé mikroorganizmy (E. coli Nissle 1917) ovlivňují expresi genů pro tvorbu mucinu, dochází tak ke zvýšené produkci hlenu (Lukáš, 2003). Mucin zabraňuje jednak adhezi mikrobů na povrch sliznice, chrání ji před mechanickým poškozením a také se podílí na výživě enterocytů (Lee, Salminen, 2009). Enteroinvazivní mikroorganizmy vyvolávají zvýšenou sekreci vody s elektrolyty, které využívají pro svoji výživu. Proti těmto patogenům působí probiotika jako Streptococcus thermophilus a L. acidophilus tím, že snižují uvolňování vody a elektrolytů z enterocytů do lumen střeva. To vede nejen ke snížení činnosti patogenů, ale i k potlačení příznaků, zejména průjmového charakteru (Singh a kol., 2011). Probiotika můžou ovlivňovat expresi genů buněk střevní sliznice, to má velký vliv na zrání a rozvoj enterocytů. Zejména včasná neonatální kolonizace trávicího traktu a její charakter má vliv na rozvoj bariérové funkce, ale i lymfatické tkáně (Lee a Salminen, 2009).
3.2.4.3
Imunomodulace
V gastrointestinálním traktu je rozsáhlý imunitní aparát, jehož funkcí je ochrana organizmu před patogeny, ale také udržení imunotolerance vůči symbiotickým mikroorganizmům a vlastním buňkám. Příznivě můžou dokonce působit i mrtvé buňky probiotických organizmů, nebo jejich části jako peptidoglykany, nebo fragmenty DNA (Oelschlaeger, 2010). Probiotika můžou buď posílením imunitní reakce zvýšit schopnost vypořádat se s patogenním agens, nebo naopak utlumením příznivě ovlivnit vznik a průběh alergické reakce a intestinálních zánětů (Botrlík, 2009). Utlumením nadměrné imunitní reakce se potlačují projevy některých alergií. Mechanizmus není dosud zcela objasněn, ale bylo pozorováno snížení projevů atopických dermatitid u kojenců po podání Lactobacillů (Mombelli a Gismondo, 2000). Střevní imunita je tvořena komplikovaným systémem složek specifické a nespecifické imunity. Probiotika tedy příznivě ovlivňují imunitní reakci na různých úrovních. Jednak probiotické mikroorganizmy působí na epiteliální buňky tak, že snižují produkci prozánětlivých interleukinů a inhibují tvorbu nukleárního faktoru κB, dále stimulují produkci některých protektivních cytokinů (IL-10) (Correia a kol., 2012). 26
Probiotika jsou také schopna působit na všechny hlavní skupiny lymfocytů. Například L. rhamnosus a L. casei svým působením na B-lymfocyty při podání rotavirové nebo salmonelové vakcinace zvyšuje účinnost podané vakcíny tím, že signifikantně zesilují protilátkovou odpověď. Probiotika jako L. rhamnosus jsou schopna působit na T-lymfocyty tak, že inhibují
tvorbu
prozánětlivých
interleukinů
(IL-2)
a
IFN-γ.
Kvasinky
(Saccharomyces boulardii) jsou podobně jako L. rhamnosus, ale odlišným mechanismem, schopny snížit množství prozánětlivých cytokynů ve sliznici střeva. Kvasinky nepůsobí přímo na T-lymfocyty, ale ovlivňují tkáň lymfatických uzlin, což vede k zadržování T-buněk v lymfatických uzlinách (Botrlík, 2009). U myší byla prokázána schopnost probiotik (Lactobacillu GG, Bifidobakterií) indukovat tvorbu imunoglobulinů, a to především IgM a IgA. Některé kmeny probiotik mají schopnost předkládat antigen T-lymfocytům, ale častěji tento proces podporují působením na antigen prezentující buňky, čímž se zrychlí a zvýší účinnost imunitní odpovědi (Mombelli a Gismondo, 2000). S probiotiky se v lumen střeva dostávají jako první do kontaktu dendritické buňky (Oelschlseger, 2010). Bylo pozorováno, že probiotika (Bifidobakterie) ovlivňují proliferaci, zrání a aktivitu dendritických buněk, které předkládají antigen T-buňkám, to má významný vliv na produkci cytokinů IL-2, IL-4, IL-10 a IL-12 (Lee a Salminen, 2009, Oelschlseger, 2010).
3.2.4.4
Metabolické účinky probiotik
Mikroorganizmy v gastrointestinálním traktu se vyznačují velkou metabolickou aktivitou, kterou přispívají k homeostaze organizmu. Jsou schopny metabolizovat látky, pro hostitelský organizmus nevyužitelné (především polysacharidy), na látky jednodušší. Zvyšují biologickou dostupnost některých proteinů a tuků (Ross a kol., 2010), produkují některé důležité sloučeniny pro výživu, správnou funkci a dělení buněk střevní sliznice. Významnými metabolity střevní mikroflóry jsou některé esenciální vitamíny (vitamín B12, K a folacin). Zanedbatelná není ani schopnost metabolizovat řadu toxických, alergenních látek, ale i léčiv (Botrlík, 2009). Xenobiotika v gastrointestinálním traktu jsou degradována především oxidačně-redukčními reakcemi a hydrolýzou díky bohatému enzymatickému vybavení střevní mikroflóry. Těmto 27
reakcím nepodléhají jen cizorodé látky, které jsou přijímány perorálně, ale i látky vyprodukované střevní mikroflórou a látky vzniklé v játrech prostřednictvím jaterních enzymů, které podléhají enterohepatálnímu oběhu. Probiotické mikroorganizmy jsou tak schopny podílet se na detoxikaci organizmu (Jeong a kol., 2013). Probiotika také prokazatelně působí preventivně proti vzniku karcinomu tračníku a močového měchýře degradací prokarcinogenních látek jako nitrososloučenin a syntézou butyrátu, folacinu a dalších látek. Předpokládají se protektivní účinky i vůči rakovině prsu a prostaty (Mombelli a Gismondo, 2000). Mikroflóra intestinálního traktu působí příznivě při potlačování projevů potravinových alergií nejen tím, že metabolizují alergenní látky a rozkládají je na jednodušší sloučeniny, ale i stimulací imunitního systému (Singh a kol., 2011). Saccharomycess cerevisiae a Lactobacilus helveticus jsou schopny syntetizovat tripeptidy s podobným účinkem jako má angiotenzin-I. Na krysích modelech bylo prokázáno, že tyto mikroorganizmy prostřednictvím zmíněných tripetidů působí jako anti-hypertenziva (Ramchandran a Shah, 2011). Dále se prokázalo, že bakterie mléčného kvašení jsou schopny rozložit kasein mléka na jednodušší peptidy až na aminokyseliny, což má příznivý vliv na projevy alergií u lidí citlivých na kasein. Podobně se bakterie mléčného kvašení využívají při výživě lidí s laktózovou intolerancí. Bakterie Laktobacillus produkuje laktázu, která je schopna hydrolyzovat disacharid laktózu. U pacientů, kteří užívají fermentované mléčné výrobky místo nefermentovaných, často příznaky alergie zcela vymizí (Mombelli a Gismondo, 2000). Některá probiotika (Laktobacillus) svojí schopností metabolizovat soli žlučových kyselin (Singh a kol., 2011) snižují emulgaci lipofilních látek a tím snižují jejich vstřebatelnost. Zároveň produkují řadu mastných kyselin s krátkým řetězcem, které pravděpodobně inhibují syntézu cholesterolu v játrech. Z tohoto důvodu se předpokládá, že jsou schopny snížit hladinu krevního cholesterolu (Lee a Salminen, 2009). Probiotika svojí metabolickou činností významným způsobem ovlivňují trávení živin, metabolismus a celkový zdravotní stav nejen hostitelského organizmu, ale i ostatních mikrobů tvořících střevní mikroflóru. Všechny mechanizmy a jejich působení nebyly dosud zcela objasněny, takže je nám známa jen část metabolického vlivu probiotik.
28
3.3
Probiotika ve výţivě selat
Trávicí trakt prasat stejně jako u ostatních savců je kolonizován během porodu a k hlavnímu utváření střevní mikroflóry dochází především během prvních týdnů života. Takže v tomto období je nejvyšší riziko rozvoje patogenních mikroorganizmů v digestivním ústrojí selat. Obdobně jako u lidí je u selat převaha bifidobakterií a laktobacilů (Lee a Salminen, 2009), takže se dá usuzovat, že i jejich vliv na zdraví a funkci organizmu bude velmi podobný. V 80. letech 20. století se začal zkoumat význam probiotik ve výživě hospodářských zvířat. Do popředí zájmu se probiotika a prebiotika dostala v roce 2006, když se legislativně začalo omezovat využívání antibiotik (Yuji a kol., 2004). Efekt probiotik je závislý na technologii chovu, druhu a věku zvířete, dále na metodě aplikace a druhu použitého mikroorganizmu (Lee a Salminen, 2009). Probiotické kultury jsou užitečné při obnově střevní mikroflóry a střevní propustnosti, které byly narušeny chorobou, či léčbou onemocnění. Symbiotika se dnes využívají především pro zlepšení zdravotního stavu zvířat (Apás a kol., 2010) a zvýšení jejich užitkovosti. Rozsáhlé studie prokázaly, že užíváním probiotik se dosáhlo zvýšení tempa růstu, využití krmiv nejen u prasat, ale i drůbeže a telat (Lee a Salminen, 2009). Právě podle užitkovosti většinou chovatelé hodnotí efektivnost probiotik, protože je důležitým faktorem udávajícím zisk (Yuji a kol., 2004). Například Lojanica a kol. 2010 ve své studii uvádějí, že užití probiotického organizmu Enterococcus faecium DSM 7134 vedlo u pokusných prasat ke zvýšení denního přírustku o 132g oproti kontrolní skupině zvířat. Zároveň autoři uvádějí zlepšení konverze krmiva, kdy pro jeden kilogram přírůstku u pokusných selat bylo zapotřebí o 600g krmiva méně. K největším ztrátám dochází během prvních třech měsíců života selat, protože v tomto věku jsou vystavena mnoha stresujícím faktorům. Trávicí trakt sajících selat a selat při odstavu od mateřského mléka může být ohrožen infekcemi virového a rotavirového původu, které doprovází vodnaté průjmy, gastroenteritida a dehydratace. Dalším běžným onemocněním kojených selat je salmonelóza, která se kromě průjmů projevuje septikémií a nervovými příznaky. Závažnější infekce způsobují Clostridie perfringens (Ross a kol., 2010) a enterotoxigení kmeny Escherichia coli, které narozdíl od předchozích infekcí doprovází vysoká mortalita (Jensen a kol., 2006).
29
Přechod z tekuté stravy na krmnou směs je pro selata velmi stresující. Jak bylo popsáno v předchozích kapitolách, odstavení selat má významný vliv na složení střevní mikroflóry. Dochází k rychlému pomnožení gramnegativních anaerobů a koliformních bakterií zejména rodu E. coli a Clostridium (Ross a kol., 2010).
3.3.1
Onemocnění prasat způsobené E. coli
Některé kmeny Escherichia coli jsou běžnou součástí střevní mikroflóry teplokrevných zvířat. Kmen E. coli Nissle 1917 se dokonce využívá jako probiotická kultura (Lukáš, 2003), avšak jiné kmeny jsou podmíněnými, ale i nepodmíněnými patogeny. V současné době rozlišujeme šest patogenních skupin, z nichž řadíme mezi nejrizikovější enterohemoragické kmeny E. coli (O157, O26, O45, O111). Nákaza je většinou způsobena fekálně orální cestou a je spojována s nedostatečnou hygienou, kontaminovanou potravinou nebo vodou (Votava a kol., 2006). Akutní průjmové onemocnění způsobené infekcí E. coli se ročně pohybuje kolem 3 000 hlášených výskytů (Garcia a kol, 1996). E. coli řadíme do čeledi Enterobacteriaceae, jedná se tedy o gramnegativní nesporulující, bez bičíků nebo peritrichní tyčinky o velikosti 2-6 x 1 µm. Na povrchu buněk se nachází celá řada filamentózních struktur, které se uplatňují jako adhezivní faktory (Votava a kol., 2006). Právě podle mechanismu jejich virulence můžeme patogenní E. coli rozdělit na enterotoxigenní (ETEC), enterohemoragické (EHEC), enteropatogenní (EPEC) a enteroinvazivní (EIEC) (Straw a kol., 2006). ETEC obvykle disponují fibriálními adheziny, dále jsou charakteristické produkcí dvou enterotoxinů – termolabilními a termostabilními. Tyto toxiny pronikají do enterocytů, kde zvyšují sekreci sodíků, chloridů a vody do lumen střeva. Následkem jsou vodnaté průjmy. U novorozenců a kojenců můžou být vodnaté průjmy a následovaná dehydratace způsobena i při infekci EPEC. Tato infekce má mírnější průběh (Lee a Salminen, 2009).
30
Obr. 2: E. coli O157: H7 (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/ 7/75/EColiCRIS051-Fig2.jpg)
Infekce způsobené EIEC mají význam v oblastech s nižší hygienou, kde jsou původci průjmových onemocnění. Způsobují horečnaté (Straw a kol., 2006), zpravidla fatální onemocnění. Faktory virulence u EIEC jsou zastoupeny především kapsulárními polysacharidy, fibriemi, O-antigenem, lipopolysacharidy a hemolyziny (Garcia a kol, 1996). Enterohemoragická E. coli většinou adheruje na střevní stěnu tlustého střeva, kde produkuje shigella-like toxin, také označován jako veratoxin poškozující sliznici. Následkem je hemoragická kolitida projevující se krvavými průjmy. (Lee a Salinnen, 2009) Do této skupiny řadíme i sérotyp E. coli O157:H7 (Chang a Fang, 2007). Onemocnění způsobené infekcí E. coli nazýváme kolibakterióza, kterou Straw a kol. (2006) rozděluje podle období života selat do tří základních jednotek: diarrhoea neonatální, diarrhoea sajících selat a diarrhoea selat po odstavu. Kolibakterióza bývá zpravidla u prasat doprovázena další infekcí, zejména virového a rotavirového původu (Lee a Salminen, 2009). U novorozených selat a selat ve věku do čtyř dnů jsou nejčastějšími původci kolibakterióz ETEC konkrétně sérotypy O9, 064 a O101. Výskyt je spojován s kontaminovaným porodním prostředím, prostředím na těle matky zejména struků, nedostatkem kolostra a mateřských protilátek (Straw a kol., 2006). Při infekci zůstávají 31
ETEC na povrchu sliznice, kde tvoří souvislý povlak. Kromě toho, že zvyšují sekreci látek z enterocytů, také inhibují resorpci vody a iontů v ní rozpuštěnýc (Garcia a kol, 1996). Onemocnění vede ke vzniku průjmů, dehydrataci, kachexií, dále se projevuje zvýšenou teplotou, zježením srsti a někdy i vomitem, často dochází k úhynu selat (Ross a kol., 2010). Enterotoxigenní E. coli u lidí způsobují tzv. cestovatelské průjmy. Koiliinfekce u odstavených selat jsou běžně doprovázeny edémy. Tyto infekce jsou spojovány s ETEC a EHEC. Podle autorů Drábek a Dubský (2001) může být mortalita selat až 26 %. Mezi příznaky koliinfekce řadíme především zapáchajících nažloutlé feces, dehydrataci a (Straw a kol., 2006) zapadlé oční bulvy. Při rozvoji enterohemoragické E. coli dochází prostřednictvím veratoxinu k poškození enterocytů. To vede k destrukci povrchu sliznice střeva, malabsorbci a v některých případech nacházíme přítomnost krve ve stolici (Garcia a kol, 1996). Prasata postižená koliinfekcí byla v padesátých letech dvacátého století léčena výhradně antibiotiky. Mezi hojně využívaná antibiotika na potlačení infekce patřily zejména tylosin, avilamycin, tetracyklin a penicilin. Tyto prostředky začaly být podávány preventivně zdravým jedincům. V následujících studiích se zjistilo, že některé z těchto přípravků zvyšují konverzi krmiva (Lee a Salminen, 2009) a zrychlují růst zvířat. U prasat se přídavkem antibiotik do krmné směsi může dosáhnout zvýšení denního přírůstku o 0,5 %, konverze krmiva se zvýší o 1,1 % a mortalita byla redukována o 22 %. Tato skutečnost vedla k neuvážené aplikaci antibiotik. Důsledkem byl rozvoj antimikrobiální rezistence patogenních mikrobů (Miller a kol., 2003). Z tohoto důvodu Evropská unie zakázala v roce 2006 používání antibiotik jako růstových stimulantů. Alternativou k regulaci koliinfekcí se stala acidifikace, imunizace a využití symbiotik (Lee a Salminen, 2009).
3.3.2
Onemocnění způsobená bakteriemi rodu Clostridium
Bakterie rodu Clostridium jsou grampozitivní, obligátně anaerobní peritrichní tyčinky, které tvoří spory. Většina druhů je působením kyslíku do 10 minut zahubena, avšak některé duhy se můžou rozmnožovat za mikroaerofilních podmínek. Rod Clostridium disponuje širokým enzymatickým vybavením. Některé druhy (Cl. sporogenes) mají proteolytické schopnosti, další disponují řadou sacharolytických enzymů, díky kterým 32
jsou schopny degradovat nejen oligosacharidy, ale můžou štěpit i složité polysacharidy jako je celulóza (Šilhánková, 2008). I když bakterie tohoto rodu jsou přirozenou součástí trávicího ústrojí zvířat i lidí, některé druhy jsou patogenní. Virulence patogenních klostrídií je spojována s produkcí toxinů. Mezi nejznámější toxigenní bakterie řadíme Clostridium botulinum (botulotoxin), Cl. tetani (tetanolysin, tetanospasmin), Cl. difficile (toxin A, toxin B) a Clostridium perfringens (α-toxin, βtoxin) (Šilhánková, 2008). Význam ve výživě a zdraví selat mají dva posledně jmenovaní zástupci, kteří se kvůli své averzi ke kyslíku výhradně pomnožují v tlustém střevě. Clostridium difficile je nejzávažnějším původcem průjmů spojených s antibiotiky, kterými trpí 20 - 30 % nemocných léčenými antibiotiky. Onemocnění je iniciováno antibiotiky, která inhibují fyziologickou mikroflóru trávicího traktu a umožňují tak pomnožení Clostridium difficile (Zbořil, 2005). Clostridia v trávicím traktu se můžou také pomnožit u selat, která nemají dokončený vývoj střevní mikroflóry, nebo jsou vystavena stresu. V některých případech může diarrhoea přejít
v antibiotiky
asociovanou kolitidu, z nichž nejzávažnější je pseudomembránozní kolitida. Pseudomembranozní kolitida téměř výhradně souvisí s bakterií Clostridium difficile (Anderson a Songer, 2008), ale v ojedinělých případech byla registrována infekce Pseudomonas aeruginosa (Zbořil, 2005). Podle Anderson a Songer (2008) je u mladých selat infikovaných bakterií Clostridium difficile až 16 % úmrtnost. Clostridium difficile produkuje dva toxiny. Toxin A je enterotoxinem, který způsobuje průjmy, často s příměsí krve. Toxin B je cytotoxický. Působením na cytoskelet enterocytů, především v tlustém střevě, vznikají nekrózy. Infekce se projevuje kašovitým, nažloutlým průjmem. Při neléčení může choroba vyústit ke vzniku peritonitidy nebo střevní perforaci (Lee a Salminen, 2009).
33
Obr.
3:
Clostridium
perfringens
(http://microbewiki.keny on.edu/index.php/
File:Clostridium_perfringens.jpg)
Při diagnostice pseudomembránozní kolitidy jsou v první řadě vysazena antibiotika, která pravděpodobně vedla k jejímu vzniku. K léčbě se využívají antibiotika (Anderson a Songer, 2008) metronidazol nebo vankomycin. I při úspěšné léčbě dochází asi ve 40 % případů k recidivě (Lee a Salminen, 2009). Doposud nebyl prokázán velký význam probiotik v léčbě pseudomembránozní kolitidy. Avšak probiotika jako Saccharomyces boulardi a laktobacily se úspěšně využívají jako prevence vzniku a jako prevence před recidivou choroby po úspěšné antibiotické léčbě (Zbořil, 2005). Clostridium perfringens se hojně vyskytuje v půdě a v prachu. Podle toho, jaké tvoří toxiny, je můžeme rozdělit do čtyř typů (A, B, C, D a E). Nejčastěji jsou intestinální infekce způsobeny klostridiemi typu B a C. Cl. perfringens je běžným obyvatelem zažívacího traktu většiny teplokrevných živočichů, včetně člověka. Patogenní se stávají pouze při vyšším počtu, jedná se tedy o podmíněně patogenní mikroorganizmy (Uzal, 2004). Při vniknutí do otevřené rány tvoří α-toxin, který perforuje plazmatickou membránu a způsobuje tak sněť plynnou, ta často vede ke smrti (Šilhánková, 2008). 34
Do zažívací trubice se bakterie Clostridium perfringens dostane většinou požitím jejích spor v kontaminovaném krmivu nebo prachu (Udompijitkul a kol., 2013). Při orálním požití bakterií jako virulenční faktor působí především jejich toxiny. Onemocnění způsobené Clostridium perfringens nazýváme enterotoxemie. Příznaky tohoto onemocnění se liší podle typu bakterie Clostridium perfringens. Obecně jsou za klinické příznaky enterotoxemie považovány anémie, neurologické příznaky jako je slepota a křeče. I když běžně infekce nezpůsobuje hemoragické průjmy, není výjimkou, že Cl. perfringens typu B způsobuje hemoragickou enteritidu (Uzal, 2004). β-toxin je produkován i během sporulace bakterií v nepříznivém prostředí trávicího traktu. Tento enterotoxin působí lokálně tak, že nasedá na proteinové receptory střevních buněk a mění tak propustnost a integritu membrán. Výsledkem je únik iontů vody a dalších látek z postižené tkáně do lumen střeva (Heredia a kol, 1994). Dochází tak ke vzniku nekrotické enteritidy doprovázené průjmy. Další toxiny můžou mít systematické účinky. Toxiny můžou být vstřebány do krevního řečiště a způsobovat angiopatii (Uzal, 2004). Enterotoxemie byla v tradiční veterinární medicíně léčena antibiotickými přípravky shodnými s léky užívanými pro léčbu pseudomembránozní kolitidy vyvolané Cl. difficile (Udompijitkul a kol., 2013). Symbiotika se využívají především jako preventivní opatření a pro urychlení rekonvalescence nemocných zvířat. V současné době se při léčbě využívají probiotika z řad bifidobaktérií a laktobacilů, která potlačují rozvoj klostrídií na základě kompetetivní inhibice. Dominatním mechanizmem inhibice klostridií je blokace vazebných míst na sliznici střeva (Lee a Salminen, 2009).
35
4
MATERIÁL A METODY
4.1
4.1.1
Materiál
Chemikálie
K přípravě kultivačních médií byly využity následující chemikálie: Fyziologický roztok Vancomycin Clindamycin
4.1.2
Kultivační média
Anaerobic Agar (Himedia, Itálie)
Peptone
5 g/l
Dextróza
10 g/l
Kvasniční extrakt
5 g/l
Enzymový hydrolyzát kaseinu
20 g/l
Chlorid sodný
5 g/l
Thioglikolát sodný
2 g/l
Sulfoxylát formaldehydu sodného
1 g/l
Metylenová modř
0,002 mg/l
Agar
20 g/l
pH
7,2
58 g přípravku rozpustíme v 1 000 ml destilované vody a zahřejeme do úplného rozpuštění. Sterilizujeme v autoklávu při 121°C 15 minut.
36
BSM-Agar (Fluka, Švýcarsko) Složení není výrobcem specifikováno pH
6,8
55,5 g přípravku rozpustíme v 1 000 ml destilované vody a zahřejeme do úplného rozpuštění. Sterilizujeme při 121°C 15 minut. Po té přidáme 0,116 g 83055 BSM supplementu na 1 000 ml média.
COMPASS Enterococcus agar (Biokar Diagnostics, Francie)
Pepton
27,5 g/l
Kvasniční extrakt
5 g/l
Chlorid sodný
5 g/l
Polysorbát 80
1 g/l
Inhibiční směs
0,3 g/l
x-glukosid
0,1 g/l
Bakteriální aga
14 g/l
pH
7,5 g/l
52,9 g přípravku rozpustíme v 1 000 ml destilované vody a zahřejeme do úplného rozpuštění. Sterilizujeme při 121°C 15 minut.
HICrome Enterococcus faecium Agar Base (Himedia, Italie)
Pepton sepicial
23 g/l
Kukuřičný škrob
1 g/l
NaCl
5 g/l
Arabinóza
10 g/l
Fenolová červeň
0,1 g/l
Chromogenní substrát
0,1 g/l
Agar
15 g/l
pH
7,8 37
Za aseptických podmínek rozpustíme 27,1 g přípravku v 500 ml destilované vody a zahříváme na teplotu 45 – 50 °C do úplného rozpuštění. Pro stanovení Enterococcus faeceum přidáme do 500 ml média 62,5 g Enterococcus faeceum selective supplementu (FD226).
Nutrient Broth with 1% Peptone (Himedia, Itálie) Hovězí extrakt
10 g/l
Bílkovinný výtažek z živoč. tkáně
10 g/l
Chlorid sodný
5 g/l
pH
7,4
25g přípravku rozpustíme v 1 000 ml destilované vody a zahřejeme do úplného rozpuštění. Sterilizujeme při 121°C 15 minut.
Tryptone bile X-glucuronide (TBX) medium (Biokar Diagnostics, Francie)
Tryptone
20 g/l
Soli žlučových kyselin
1,5 g/l
X-β-D-glucuronide
0,075 g/l
Bakteriální agar
9 g/l
pH
7,2
30,6g přípravku rozpustíme v 1 000 ml destilované vody a zahřejeme do úplného rozpuštění. Sterilizujeme při 121°C 15 minut.
4.1.3
Přístroje a pomůcky
Autokláv, Sanyo MLS-3750/370 (Schoeller instruments, Praha,ČR) Běžné laboratorní sklo, laboratorní materiál a pomůcky 38
Biohazard, ME-2880C (Schoeller instruments, Praha, ČR) Horkovzdušný sterilizátor, D-91126, Mennert (Germany) Laboratorní váhy, 220 A (Schoeller instruments, Praha, ČR) Lednice, Liebherr, 7082218-01, (Germany) Myčka, G 7883, Miele professional, (Labor, Brno) Termostat, Sanyo, (Schoeller instruments, Praha, ČR) Vodní lázeň, Julabo TW 20 (Schoeller instruments, Praha, ČR)
4.1.4
Vzorky exkrementů prasat
K hodnocení byla vybrána selata samičího pohlaví, hybridi Českého bílého ušlechtilého, Landrase a Durock. Zvířata byla ustájena ve čtyřech kotcích o velikosti 24 m2 pro 20 kusů. Průměrná relativní vlhkost vzduchu byla 70 % a teplota 18°C. Pro rozbor byly použity exkrementy 80 prasnic, které byly rozděleny po 40 kusech do skupiny pokusné a kontrolní. Obě skupiny byly první tři týdny krmeny standardní krmnou směsí A1, A3. Od čtvrtého týdne pokusná selata byla kromě standardní krmné směsi přikrmována probiotikem CERNIVET LBC P35 po dobu třiceti dnů.
4.1.5
Sloţení pouţitých krmiv
Prasnice byly krmeny formou Schauer mokré krmení – voda, syrovátka, krmná směs A1, A3 v poměru uvedeného v tabulce 4. Spotřeba krmné směsi činila 1,73 kg/ks/den. Tab. 4: Podíl krmných směsí Den
podíl směsi A1 podíl směsi A3
0
100%
0%
15
95%
5%
30
85%
15%
40
70%
30%
39
Složení krmné směsi A1 Pšenice, ječmen, soja extrahovaná, řepkové expelery, pšeničné otruby, uhličitan vápenatý, řepka olej, chlorid sodný, L-lyzin, monokalciumfosfát, L-threonin, methionin. Analytické složky: vlhkost 14 %, hrubý protein 16,4 %, hrubé tuky a oleje 2,3 %, hrubá vláknina 3,9 %, hrubý popel 4,8%, Lyzin 1,1 %, methionin 0,3 %, vápník 0,79 %, sodík 0,16 %, fosfor 0,55 %. Nutriční doplňkové látky E 4 Cu (síran měďnatý pentahydrát) 18 mg, E 672 Vitamín A 10800 mg, E 671 Vitamin D3 1332 mg, E 1 Fe (uhličitan železnatý) 94 mg, E 2 jod (jodid draselný) 1,59 mg, E 3 Co (síran kobaltnatý heptahydrát) 0,36 mg, E 5 Mn (oxid manganatý) 79 mg, E 6 Zn (oxid zinečnatý) 79 mg, E 8 Se (seleničitan sodný) 0,32 mg. Technologické doplňkové látky: E 321 Butylhydroxy-toulen 8,5 mg, E 324 Ethoxyquin 3,8 mg. Složení krmné směsi A3 Pšenice, ječmen, soja extrahovaná, šrot (GMO), řepkové expelery, pšeničné otruby, uhličitan vápenatý, řepka olej, chlorid sodný, L-lyzin, monokalciumfosfát, methionin, L-threonin. Analytické složky: vlhkost 14 %, hrubý protein 13,6 %, hrubé tuky a oleje 2,4 %, hrubá vláknina 3,9 %, hrubý popel 4,3 %, Lyzin 0,85 %, methionin 0,25 %, vápník 0,65 %, sodík 0,16 %, fosfor 0,55 %. Nutriční doplňkové látky E 4 Cu (síran měďnatý pentahydrát) 11 mg, E 672 Vitamín A 5616 mg, E 671 Vitamin D3 693 mg, E 1 Fe (uhličitan železnatý) 49 mg, E 2 jod (jodid draselný) 0,83 mg, E 3 Co (síran kobaltnatý heptahydrát) 0,18 mg, E 5 Mn (oxid manganatý) 41 mg, E 6 Zn (oxid zinečnatý) 41 mg, E 8 Se (seleničitan sodný) 0,16 mg. Technologické doplňkové látky: E 321 Butylhydroxy-toulen 4,42 mg, E 324 Ethoxyquin 1,9 mg.
4.1.6
Probiotická směs CERNIVET LBC P35
Pro pokus byla použita probiotická směs CERNIVET LBC P35. Účinným mikroorganizmem této směsi je probiotický kmen Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 40
10415), jehož koncentrace je 35 x 109 KTJ v 1 g přípravku. Na tunu krmiva a den bylo přidáno 35 g probiotika Enterococcus faecium SF68. Při mikrobilogickém stanovení počtu a zastoupení bakterií probiotické směsi jsme zjistili, že počet 109 i zastoupení bakterie Enterococcus faecium SF68 odpovídalo tvrzení výrobce.
4.2
4.2.1
Metody
Způsob odběrů vzorků
Odběry
byly
provedeny
proškoleným
veterinárním
technikem
v souladu
se
zásadami odběru. Veterinární technik při každém odběru odebral od každého jedince 2 x 10 g stolice. Exkrementy byly odebírány do sterilních vzorkovnic (Vitrum, Česká republika) Odběry byly provedeny nultý den, 15. den a 30. den (konec krmení probiotickou směsí). Poslední odběr byl proveden 10 den po ukončení podávání probiotik. Nultý den výkrmu byl definován jako den, kdy byla selata o průměrné hmotnosti 27kg odstavena od prasnice a dána do výkrmu.
4.2.2
Oţivování kultur ze ţelatinových disků
1) Byly připraveny šikmé agary se speciálními médii (viz níže) 2) Aby při otvírání lahvičky se želatinovými disky nedošlo ke kondenzaci vody, byla lahvička vyjmuta z chladničky a ponechána 10 minut při pokojové teplotě. 3) Vyžíhanou očkovací jehlou byl želatinový disk přenesen do kondenzační vody na dně šikmého agaru. 4) Inkubace probíhala 1-4 hodiny při optimální teplotě konkrétní bakterie. 5) Suspenzi buněk rozprostřeme po celém povrchu šikmého agaru nakloněním zkumavky. 6) Inkubace proběhla při optimální teplotě, zpravidla 24-48 hodin. 41
4.2.3
Mikrobiologická analýza vzorků exkrementů
Pro analýzu se použilo pomnožovací médium Nutrient Broth with 1% Peptone (Himedia, Itálie). Kultivace probíhala plotnovou metodou pomocí roztěru, při níž byly stanoveny tyto skupiny mikroorganismů: Bakterie mléčného kvašení (BMK) na MRS agaru (Biokar Diagnostics, Francie) při 37 °C za 72 h anaerobně
Enterococcus na COMPASS Enterococcus Agar (Biokar Diagnostics, Francie), při teplotě 37°C po dobu 48 h aerobně. Enterococcus faecium na médiu HICrome Enterococcus faecium Agar Base (M1580) s přídavkem Enterococcus faeceum selective supplementu (FD226). Kultivovalo se aerobně při 37°C po dobu 48 hodin. Clostridium na médiu Anaerobic Agar (Himedia, Itálie) při teplotě 37°C po dobu 48 hodin anaerobně Escherichia coli na TBX medium (Biokar Diagnostics, Francie) při teplotě 37°C po dobu 48 hodin.
Druhy Escherichia coli O157:H7 a Clostridium perfringens byly stanoveny ve spolupráci s Výzkumným ústavem veterinárního lékařství v Brně. Na jednotlivých Petriho miskách byly po ukončení kultivace odečteny narostlé kolonie a výsledek vyjádřen v log KTJ/g. Pro rodovou a druhovou identifikaci byly použity metody optické mikroskopie, Gramovoa barvení, test na tvorbu katalázy, EN-COCCUS testem a PCR metody. Pro amplifikaci specifických fragmentů DNA vybraných bakteriálních druhů byly použity primery uvedené v tabulce 5.
42
Tab. 5: Primery použité pro identifikaci sledovaných bakterií
Lactobacillus spp.
Bifidobacterium spp.
E. faecalis
E. faecium
C. perfringens
4.2.4
Názvy primerů
Sekvence primerů
LbLMA1-rev
CTCAAAACTAAACAAAGTTTC
R16-
PCR produkt [pb]
CTTGTACACACCGCCCGTCA
Pbi F1
CCGGAATAGCTCC
Pbi R2
GACCATGCACCACCTGTGAA
E1
ATCAAGTACAGTTAGTCT
E2
ACGATTCAAAGCTAACTG
F1
TAGAGACATTGAATATGCC
F2
TCGAATGTGCTACAATC
CPA 5L
AGTCTACGCTTGGGATGGAA
CPA 5R
TTTCCTGGGTTGTCCATTTC
250
914
733
550
900
Optimalizace kultivačních metod
Pro optimalizace metody byly využity sbírkové kmeny České sbírky mikroorganizmů Masarykovy univerzity uvedených v tabulce 6.
Tab. 6: Sbírkové kmeny České sbírky mikroorganizmů Masarikovy univerzity CCM 4833
Lactobacillus acidophilus
CCM 1828
Lactobacillus rhamnosus
CCM 7190
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
CCM 7826
Bifidobacterium longum subsp. longum
CCM 3762
Bifidobacterium bifidum
CCM 4990
Bifidobacterium longum
CCM 2308
Enterococcus faecium
CCM 2497
Enterococcus faecalis
CCM 4435
Clostridium perfringens
Kultivace kmenů bakterií byla provedena na selektivních půdách za specifických podmínek, viz výše. Po kultivaci byly mikroorganizmy přeočkovány přes jednu kolonii a použity pro mikroskopický preparát a optimalizaci metod.
43
4.2.5
Příprava preparátů buněk barvení podle Grama
1) Podložní sklíčko ožehneme nad plamenem kahanu a kápneme na něj kapku fyziologického roztoku. 2) Vyžíhanou a ochladlou očkovací kličkou za aseptických podmínek odebereme bakteriální kmen a přeneseme ho do kapky na podložním skle. 3) Fixaci provedeme plamenem tak, že podložní sklo několikrát protáhneme nad plamenem do úplného zaschnutí 4) Podložní sklíčko ponoříme do zkoumadla s roztokem krystalové violeti po dobu 20 vteřin. Po vyjmutí opláchneme pod proudem vody. 5) Podložní sklíčko ponoříme na 20 vteřin do zkoumadla s Lugolovým roztokem. Po vyjmutí opláchneme pod proudem vody. 6) Podložní sklíčko ponoříme do zkoumadla s roztokem acetonu po dobu 20 vteřin. Po vyjmutí opláchneme pod proudem vody. 7) Podložní sklíčko ponoříme na jednu minutu do zkoumadla s roztokem karbolfuchsinu. Po vyjmutí opláchneme pod proudem vody. 8) Sklíčko necháme na vzduchu volně oschnout. 9) Mikroskopujeme
4.2.6
Optická mikroskopie
Preparáty byly prohlíženy pod imerzním olejem. Při prohlížení preparátu byla věnována pozornost velikosti, tvaru jednotlivých buněk, jejich uspořádání, zastoupení typu buněk a výsledku Gramova barvení.
4.2.7
EN-COCCUStest
EN-COCCUStest je určen pro rutinní druhovou identifikaci klinicky významných zástupců rodu Enterococcus. Souprava obsahuje tři mikrotitrační destičky (každá pro identifikaci dvanácti kmenů) se sušidlem, tři PE sáčky pro inkubaci, 36 formulářů pro záznam výsledků a rámeček destičky s víčkem pro inkubaci.
44
Příprava vzorku: Izolované kolonie přeočkujeme na živnou půdu PCA (Noack, Rakousko) a kultivujeme při 37 °C 24 hodin. U 24 hodinové kultury byla provedena detekce aktivity pyrrolidonylarylamidazy (PYRAtest: Pliva-Lachema Diagnostika ,ČR) pro potvrzení příslušnosti k rodu Enterococcus. Druhová identifikace byla následně provedena na EN-COCCUStestu. Příprava destičky: Nachystáme prázdný rámeček s víčkem a poté otevřeme aluminiový sáček a vyjmeme destičku. Pomocí skalpelu oddělíme příslušný počet řad odpovídající počtu testovaných kmenů. U vybraných řad sejmeme ochrannou folii a řady umístíme do připraveného rámečku. Bakteriální suspenzi získanou z našich izolátů před použitím důkladně promícháme a inokulujeme 0,1 ml suspenze do všech jamek příslušného řádku destičky. Do jamek sloupce H po inokulaci přidáme dvě kapky parafinového oleje pro vytvoření anaerobního prostředí. Rámeček s naočkovanými řadami uzavřeme do inkubačního sáčku a EN-COCCUStest vložíme do termostatu, nastaveného na teplotu 37°C po dobu 24 hodin.
4.2.8
Test na tvorbu katalázy
Test je určen pro identifikaci mikroorganizmů schopných produkovat katalázu. Tento enzym rozkládá toxické metabolity aerobní respirace (peroxid vodíku, superoxid) na kyslík a vodu. Postup: Jednu kapku 3 % peroxidu vodíku naneseme na sterilní podložní sklíčko. Potom sterilní očkovací kličkou přeneseme několik bakterií z 24 hodin staré testovací kolonie. Stejným způsobem přeneseme kontrolní mikroorganizmus (E. coli). Je-li testovaný bakteriální kmen schopen produkovat katalázu, dojde k rozkladu peroxidu na kyslík a vodu, což se projeví unikáním plynu.
4.2.9
Vyjadřování výsledků
Ze tří stanovení počtu mikroorganizmů byl vypočítán aritmetický průměr a pokud to bylo nutné, byly zohledněny počty mikroorganizmů na kontrolních miskách. K výpočtu 45
byly použity ty naočkované půdy, kde vyrostlo 30 až 300 kolonií. V případě potřeby se počet kolonií zjišťoval pomocí lupy. Výsledky byly zpracovány a vyčísleny pro 1 ml vzorků. Mikrobiologické ukazatele byly zjištěny ve dvou měřeních u každého odebraného vzorku. Průměry z těchto dvou měření byly statisticky vyhodnoceny. Pro výpočet základních statistických charakteristik a regresí (testování kvadratické funkce), rozdílů mezi skupinami vzorků v počtu mikrobiálních kolonií (jednostupňové třídění analýzy rozptylu, včetně posthoc Duncanova testu) a pro výpočet korelací mezi jednotlivými znaky byl použit Program Statistica 8 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).
46
5
VÝSLEDKY A DISKUZE
Ze skupiny bakterií mléčného kvašení byla v exkrementech obou skupin selat sledována především přítomnost rodu Bifidobacterium a Lactobacillus. I když podle některých autorů (Lee a Salminen, 2009, Ross a kol., 2010, Angelis a kol., 2006) jsou bakterie rodu Bifidobacterium přirozenou součástí střevní mikroflóry prasat, přesto jejich přítomnost v exkrementech nebyla detekována. Dalo se předpokládat, že bifidobakterie budou zjištěny v hojném počtu zejména nultý den odběru, tedy v den kdy byla selat odstavena.
Graf 1: Celkový počet bakterií mléčného kvašení [logKTJ/g] v exkrementech v jednotlivých termínech odběru (0., 15., 30. a 40. den pokusu) u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny ( PF)
Z grafu 1 je patrné, že u kontrolní skupiny (K) došlo od 0. do 15. dne výkrmu k mírnému nárůstu počtu bakterií mléčného kvašení (BMK). Od patnáctého dne se 47
počty BMK u pokusné skupiny (PF) a kontrolní skupiny (K) ustálily na přibližně stejných hodnotách. Po ukončení podávání probiotik nebyl pozorován statisticky průkazný rozdíl (p<0,0001). Podávání probiotického kmene Enterococcus faecium SF68 nemá podle očekávání vliv na bakterie mléčného kvašení přítomných v trávicím traktu zvířete. Podle mnoha autorů pro zvýšení počtu těchto bakterií by bylo vhodnější použít probiotickou směs, jejímž základem jsou právě BMK. Například de Angelis a kol. (2006) uvádějí, že u prasat krmených probiotiky se zvýší množství bakterií mléčného kvašení, zejména při použití rody Lactobacillus sp. a druhu L. plantarum.
Graf. 2: Srovnání celkového počtu rodu Enterococcus [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny ( PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den) .
Z grafu 2 je patrné, že u skupiny PF, která byla krmena probiotickou směsí, již 15. dne odběru došlo k nárůstu celkového počtu enterokoků o 1 logaritmického řádu KTJ (p<0,0001). Jeho počty se zvyšovaly až do třicátého dne, kdy byla ukončena aplikace probiotik. 40. den byl oproti předchozímu odběru zaznamenán mírný pokles 48
(p<0,0001) celkového počtu rodu Enterococcus. I přesto bylo ve srovnání s kontrolní skupinyou (K), 10 dní po ukončení podávání probotik, detekováno u pokusné skupiny (PF) průkazně vyšší množství (p<0,0001) enterokoků (graf 2) v trávicím traktu prasat. U pokusné skupiny (K) nebyl zaznamenán významný rozdíl v počtu enterokoků. Jejich počet po celou dobu pokusu zůstával na přibližně stejných hodnotách (6,8 log KTJ/g) (p<0,0001).
Graf. 3: Srovnání celkového počtu druhu Enterococcus faecium [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny ( PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den).
Z grafu 3 můžeme vyčíst, že nultý den nebyl zaznamenán mezi skupinami PF a K průkazný rozdíl (p<0,0001). U kontrolní skupiny (K) byl během jednotlivých termínů odběrů pozorován nárůs o 0,1 log KTJ/g (p<0,001), tento trend přetrval do 30. dne, kdy se hodnoty ustálily. Naproti tomu u pokusné skupiny (PF), která byla přikrmována probitickým mikroorganizmem Enterococcus faecium NCIMB 10415, došlo 15. den (graf 3) k nárustu druhu E. faecium (p<0,0001). Počet této bakterie se od nultého do třicátého dne navýšil o 1,3 logaritmického řádu (p<0,0001). Zvýšení počtu těchto 49
bakterií uvádějí ve svých studiích autoři Taras a kol. (2007) a Apás a kol. (2010), kteří pozorovali příznivý vliv enterokoka na různé hostitele (myši, kozy, ovce). Nicméně do dnešní doby bylo uskutečněno pouze několik studií zabývající se účinky probiotického druhu E. faecium na patogenní bakterie (E. coli, Clostridium) u hospodářských zvířat (Szabó a kol., 2009). Od 30. do 40. dne (graf 3), kdy byl učiněn poslední odběr, poklesl počet druhů Enterococcus faecium o 0,1 log KTJ/g (p<0,0001). Z grafu 3 je rovněž patrné, že i přes zmíněný pokles druhu E. faecium, si tato bakterie udržela vysokou životaschopnost i deset dní po ukončení její suplementace.
Graf. 4: Srovnání celkového počtu rodu Clostridium [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny ( PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den).
Při srvonání PF skupiny se skupinou K (graf4) je patrný vliv probiotické směsi CERNIVET LBC P35 na snížení klostrídií. Z hodnot uvedených v grafu 4 vyplývá, že u pokusné skupiny PF došlo již 15 dní po začátku podávání probiotik ke snížení počtu klostrídií o více jak jeden logaritmický řád (p<0,0001). K redukci, i když mírnější, rodu Clostridium docházelo až do ukončení podávání probiotik (30. den). Od třicátého dne začal výrazně růst počet bakterií rodu Clostridium (p<0,0001) až na téměř stejnou 50
hodnotu, jaká byla naměřena nultý den odběru. Je tedy zřejmé, že použité probiotikum působilo především během suplementace. U kontrolní skupiny (graf 4) byl zaznamenán z 0. dne na 15. den mírný pokles (p<0,0001), avšak od patnáctého dne se množství klostrídií opět začalo navyšovat až na svoji původní hodnotu.
Graf. 5: Srovnání celkového počtu druhu Clostridium perfringens [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny ( PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den).
Při mikrobiologických rozborech nultý den odběru byl zaznamenán nejvyšší rozdíl (p<0,05) mezi kontrolní a pokusnou skupinou u druhu Clostridium perfringens (garf 5). U pokusné skupiny (PF) bylo zaregistrováno o 0,65 logaritmického řádu více KTJ bakterie Cl. perfringens (p<0,05) než u kontrolní skupiny (K). Vliv probiotik byl zjevný již 15. den (graf 5), kdy jsme zaznamenali u PF skupiny mírný pokles druhu
51
Cl. perfringens (p<0,05), zatímco u kontrolní skupiny (K) začal počet těchto bakterií vzrůstat (o 0,8 log KTJ). Tento trend (graf 5) u kontrolní skupiny (K) přetrvával až do třicátého dne, kdy se počet druhu Cl. perfringens ustálil přibližně na stejných hodnotách (p<0,05). U pokusné skupiny (PF) se snižoval počet druhu Cl. perfringens až do třicátého dne (graf 5), kdy byl zaznamenán nejvýraznější rozdíl (p<0,05). U kontrolní skupiny (K) bylo třicátý den zjištěno 3,01 log KTJ/g a u pokusné skupiny (PF) 1,53 log KTJ/g. Z toho vyplývá, že přídavkem probiotického kmenu Enterococcus faecium SF68 do krmiva můžeme redukovat množství patogenního druhu Cl. perfringens na polovinu. Od ukončení suplementace probiotické kultury Enterococcus faecium NCIMB 10415 byl pozorován mírný nárůst (p<0,05) asi o 0,24 log KTJ/g. Při srovnání pokusné (PF) a kontrolní (K) skupiny čtyřicátý den (graf 5) je patrné že vliv E. faecium na Cl. perfringens přetrvává i po ukončení jeho přidávání do krmiva (p<0,05). V grafu 6 jsou znázorněny logaritmické hodnoty z celkového počtu druhu Escherichia coli v průběhu celého měření. Z dat uvedených v grafu 6 je patrný mírný rozdíl v nultém dni mezi skupinami PF a K v množství rodu E. coli, který však není statisticky průkazný (p<0,0001). V kontrolní skupině (K) došlo od 0. do 15. dne k neprůkaznému (p<0,0001) navýšení počtu těchto bakterií o 0,1 log KTJ/g, od 15. dne až do konce studie zůstaly počty bakterií E. coli zachovány na stejné hodnotě (p<0,0001).
52
Graf.
6:
Srovnání
celkového
počtu
druhu
Escherichia
coli
[logKTJ/g]
v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den).
U pokusné skupiny (PF) byl zaznamenán (graf 6) od nultého do třicátého dne odběru pokles o 0,94 log KTJ/g v počtu bakterií E. coli (p<0,0001). Od ukončení podávání probiotik (40. den) bylo u PF skupiny zaregistrováno (graf 6) mírné navýšení této bakterie (p>0,05). Porovnáním pokusné (PF) a kontrolní (K) skupiny posledního dne odběru byl nalezen statisticky průkazný rozdíl (p>0,05).
53
Graf. 7: Srovnání celkového počtu druhu Escherichia coli O15:H7 [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny ( PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den).
V grafu 7 jsou znázorněny logaritmické hodnoty z celkového počtu druhu Escherichia coli O15:H7 coli ve vzorcích. Od nultého do patnáctého dne u kontrolní skupiny byl pozorován mírný nárůst (o 0,62 log KTJ/g) enterohemoragické E. coli (p<0,05). Počet tohoto patogena v kontrolní skupině vzrůstal (graf 7) až do čtyřicátého dne, kdy jsme naměřili 1, 47 log KTJ/g. Z grafu 7 je dále patrné, že u pokusné skupiny (PF) se množství druhu Escherichia coli O15:H7 mírně snižovalo (p<0,05) až do třicátého dne. Jakmile byla ukončena
suplementace
probiotického
kmene
Enterococcus
faecium,
nastal
prokazatelný nárůst enterohemoragické E. coli (p<0,05). Obdobné výsledky uvedli ve svých pracích i další autoři. Peterson a kol. (2007), Tabe a kol. (2008) prokázali ve svých
výzkumech
pozitivní
vliv
L.
acidophilus
na
potlačení
rozvoje
enterohemoragické E. coli. Srovnáme-li graf 2-7 je patrné, že u kontrolní skupiny (K) došlo za čtyřicet dní k nárůstu všech sledovaných bakterií. Avšak k významnému zvýšení počtu 54
došlo jen u patogenu Clostridium perfingens (graf 5), jehož množství se za sledované období více jak zdvojnásobilo (p<0,05). Je tedy zřejmé, že u prasniček z této skupiny (K) je větší riziko vzniku enterotoxémie. Při srovnání pokusné skupiny v nultém a čtyřicátém dni (graf 3 ) je zřejmé, že kromě zvýšení počtu druhu E. faecium (p<0,0001) došlo také k mírnému nárůstu (p<0,05) bakterie E. coli (graf 6), avšak u sledovaného enterohemoragického druhu E. coli (graf 7) jsme zaznamenali pokles (p<0,0001). Zvýšení počtu rodu E. coli nemusí nutně být rizikovým faktorem. Některé druhy nejsou patogenní, dokonce můžou mít pozitivní účinek na svého hostitele. Duncker a kol. (2006) uvádějí, že některé druhy se mohou využívat jako probiotické preparáty (E. coli Nissle 1917). Ve výzkumu jsme dále dosáhli obdobných výsledků u hmotnostního přírůstku a konverzi krmiva jako ve své práci zaznamenali autoři Veizaj-Delia a kol., (2010). Prostřednictvím kmene Enterococcus faecium SF68 se docílilo zvýšení přírůstku (tab. 7), takže průměrná hmotnost 40. den byla u pokusné skupiny prasniček o 2 100g vyšší než průměrná hmotnost u kontrolní skupiny. Dále bylo pozorováno zlepšení konverze krmiva, kdy u pokusné skupiny bylo zapotřebí pro jeden kilogram přírůstku o 56,7 g krmné směsi méně. Podobné pozorování také popisuje ve své práci zabývající se účinkem Enterococcus faecium DSM 7134 Lojanica a kol. (2010). Tab. 7: Průměrný přírůstek selat ve sledovaných dnech
Dny
Skupina K [kg]
Skupina PF [kg]
15
0,60
0,70
30
0,79
0,83
40
0,85
0,87
55
6
ZÁVĚR Studie ukázala, že podávání probiotické kultury Enterococcus faecium SF 68
do krmné směsi příznivě ovlivnilo růstovou schopnost prasat, vyšší denní přírůstky i konverzi živin. Statisticky průkazný rozdíl byl zaznamenán pouze ve 40. dni (p<0,05) oproti kontrole. U pokusné skupiny (PF) byla zaznamenána o 3,7 % vyšší hmotnost, než u skupiny kontrolní (K). Tato skutečnost má pozitivní vliv na užitkovost zvířat, tedy na významný ukazatel ekonomiky výkrmu a chovu prasat. Z rozboru exkrementů prasnic se nultý den odběru zjistila přítomnost všech sledovaných mikroorganizmů,
včetně
patogenních
bakterií
E.
coli
O157:H7
a Clostridium perfringens typu A. Mezi pokusnou (PF) a kontrolní (K) skupinou nebyly podle očekávání v počtu jednotlivých mikroorganizmů nultý den zaznamenány výrazné rozdíly, statisticky průkazný rozdíl byl prokázán pouze u druhu Clostridium perfringens (p<0,0001). Během výzkumu se potvrdily předpokládané účinky probiotické směsi CERNIVET LBC P35 na rozvoj potencionálně patogenního mikroba Cl. perfringens. I když nedošlo k významnému snížení celkového počtu klostrídí, prokázalo se, že při denní aplikaci E. faecium se docílilo snížení Cl. perfringens o téměř 53,5 %. Tento účinek přetrval i deset dní po ukončení aplikace. Dá se tedy usuzovat, že probiotický kmen Enterococcus faecium NCIMB 10415 lze využívat jako preventivní přípravek proti rozvoji druhu Cl. perfringens. Snižuje se tak riziko vzniku průjmových onemocnění a hemoragické kolitidy, tedy onemocnění, která snižují užitkovost zvířat a ne zřídka způsobují jejich úhyn. Jelikož se v naší studii ukázalo, že užitá probiotika neinhibují výrazným způsobem celkový počet klostrídií, mohlo by být zajímavé, jako předmět dalšího studia, zjistit vliv tohoto probiotika na další patogenní druh klostrídií a to Cl. difficile. Tento mikrob může podobně jako Cl. perfringens způsobovat významné ztráty v chovu hospodářských zvířat. Podobný efekt se nám podařilo prokázat i u druhého patogena - E. coli O157:H7. U tohoto mikroba jsme zaznamenali snížení (p<0,05) jeho počtu graf 7 o téměř 47 %. 56
Lze tedy usuzovat že CERNIVET LBC P35 je vhodnou prevencí vůči vzniku průjmových onemocnění a enterohemoragické kolitidy způsobené E. coli O157:H7 u prasat. Zároveň u pokusné skupiny (PF) během pokusu (graf 6) došlo k mírnému zvýšení (p>0,05) celkového počtu bakterií Escherichia coli, což vyvolává otázku, které druhy se v trávicím traktu pomnožily. Předpokládáme, že došlo k rozvoji především symbiotických druhů, ale stálo by za další průzkum zjistit vliv E. faecium na ostatní patogenní druhy především ETEC, které jsou původci závažných onemocnění. Dále by stálo za zamyšlení zvážit využití bakterie Enterococcus faecium v kombinaci s dalšími probiotiky, především bakteriemi mléčného kvašení. Kromě synergického efektu by mohlo být působení E. faecium doplněno. Lactobacilus působí antibikrobiálně odlišnými mechanizmy a produkuje látky podporující výživu a funkci střevní sliznice.
57
7
POUŢITÁ LITERATURA
ANDERSON, M. A., SONGER, J. G.. 2008, Evaluation of two enzyme immunoassays for detection of Clostridium difficile toxins A and B in swine, Veterinary Microbiology, ISSN 0378-1135, 10.1016/j.vetmic.2007.09.022. APÁS, A. L., DUPRAZ, J., ROSS, R., GONZÁLEZ, S. N., ARENA, M. E., 2010, Probiotic administration effect on fecal mutagenicity and microflora in the goat's gut, Journal
of
Bioscience
and
Bioengineering,
537-540,
ISSN
1389-1723,
10.1016/j.jbiosc.2010.06.005. BORTLÍK, M. 2009,Probiotika v gastroenterologii [online]. Remedia. LF UK, Praha, Dostupné z: http://www.remedia.cz/Okruhy-temat/Mikrobiologie-a-infekcni-choroby/ Probiotika-v-gastroenterologii/8-1c-yl.magarticle.aspx BRAAT, H., van den BRANDE, J., van TOL, E., HOMMESE, D., PEPPELENBOSCH, M., van DEVENTER, S., 2004. Lactobacillus rhamnosus induces peripheral hyporespon- siveness in stimulated CD4+Tcells via modulation of dentritic cell function. Am.J.Clin.Nutr.80,1618–1625. CORREIA, M. I. T.D., LIBOREDO, J. C., CONSOLI, M. L.D. 2012, The role of probiotics in gastrointestinal surgery. DOI: 10.1016/j.nut.2011.10.013. CHANG, FANG, T. J., 2007, Survival of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovars Typhimurium in iceberg lettuce and the antimicrobial effect of rice vinegar
against
E.
coli
O157:H7,
Food
Microbiology,
ISSN
0740-0020,
10.1016/j.fm.2007.03.005. de ANGELIS, M., SIRAGUSA, S., BERLOCO, M., CAPUTO, L., SETTANNI, L., ALFONSI, G., AMERIO, M., GRANDI, A., RAGNI, A., GOBBETTI, M.. 2006, Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted
feeding,
Research
in
Microbiology,
10.1016/j.resmic.2006.05.003.
58
ISSN
0923-2508,
de VOS, P., GARRITY, G. M., JONES, D., KRIEG, N. R., LUDWIG, W., RAINEY, F. A., SCHLEIFER, K. H., WHITMAN W. 2009: Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. Springer Dordrecht Heidelberg London, New York. 1450 s. DEVRIESE L.A., POT B., COLLINS M.D. 1993: Phenotypic identification of the genus Enterococcus and differentiation of phylogenetically distinct enterococcal species and species groups. J. Appl. Bacteriol. 75: 399-408. DEVRIESE, L.A., VANCANNEYT, M., DESCHEEMAEKER, P., BAELE, M., Van LANDUYT, H.W., GORDTS, B., BUTAYE, P., SWINGS, J., HAESEBROUCK, F., 2002. Differentiation and identification of Enterococcus durans, E. hirae and E. villorum. J. Appl. Microbiol. 92, 821– 827. DOMIG, K. J., MAYER, H. K., KNEIFEL, W., 2003, Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp.: 2. Pheno- and genotypic criteria, International Journal of Food Microbiology, ISSN 0168-1605, 10.1016/S0168-1605(03)00178-8. DRÁBEK J, DUBSKÝ V., 2001, Zdravotní problematika prasat II. Bakteriální choroby. VFU Brno, ISBN 80-305-423-X DUNCKER, S. C., LORENTNTZ, A., SCHROEDER, B., BREVES, G., BISCHOFF, S. C., 2006, Effect of orally administered probiotic E. coli strain Nissle 1917 on intestinal mucosal immune cells of healthy young pigs, Veterinary Immunology and Immunopathology, ISSN 0165-2427, 10.1016/j.vetimm.2006.01.017. DUTKA-MALEN, S., LECLERCQ, R., COUTANT, V., DUVAL, J., COURVALIN, P., 1990. Phenotypic and genotypic heterogeneity of glycopeptide resistance determinants in Gram-positive bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 1875– 1879. FRANZ, CHARLES, M. A. P., HUCH, M., ABRIOUEL, H., HOLZAPFEL, W., GÁLVEZ, A.: 2011, Enterococci as probiotics and their implications in food safety. International Journal of Food Mikrobiology. 141, S15–S28.
59
FRASER S. L.,: 2011, Enterococcal infections. Medscape reference. Dostupné na: http://emedicine.medscape.com/article/216993-overview. FULLER, R., 1991, Probiotics in human medicine. Gut, 439-442 GAGNON, M., KHEADR, E. E., BLAY, G., FLISS, I., 2003: In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7 by bifidobacterial strains of human origin. International, Journal of Food Microbiology 92, 69 – 78. GARCIA, M.-I., Le BOUGUÉNEC, C., 1996, Role of adhesion in pathogenicity of human uropathogenic and diarrhoeogenic Escherichia coli, Bulletin de l'Institut Pasteur, ISSN 0020-2452, 10.1016/S0020-2452(97)86017-4. GRATZ, S. W., MYKKANEN, H., EL-NEZAMI, H. S. 2010, Probiotics and gut health: A special focus on liver diseases. World Journal of Gastroenterology. roč. 16, č. 4, s. 403- [cit. 2013-02-12]. ISSN 1007-9327. DOI: 1007-9327. HEREDIA, N. L., GARCIA-ALVARADO, J. S., LABBÉ R. G., 1994, Improved rapid method for production and purification of Clostridium perfringens type A enterotoxin, Journal of Microbiological Methods, ISSN 0167-7012, 10.1016/0167-7012(94)900116. JENSEN, G. M., FRYDENDAHL, K., SVENDSEN, O., JORGENSEN, C. B., CIRERA, S., FREDHOLM, M., NIELSEN, J. P., MOLLER, K., 2006, Experimental infection with Escherichia coli O149:F4ac in weaned piglets, Veterinary Microbiology, ISSN 0378-1135, 10.1016/j.vetmic.2006.01.002. JEONG, H. G., KANG, M. J., KIM, H. G, OH, D. G., KIM, J. S., LEE, S. K., JEONG. T.C. 2013, Role of intestinal microflora in xenobiotic-induced toxicity. Molecular Nutrition. DOI: 10.1002/mnfr.201200461. KALINA A. P.: 1970, The taxonomy and nomenclature of Enterococci. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 20 (2): 185-189. KLABAN, V. 2011, Ekologie mikroorganismů: ilustrovaný lexikon biologie, ekologie a patogenity mikroorganismů. 1. vyd. Praha: Galén, ix, 549 s. ISBN 978-80-7262-770-7.
60
KONDEPUDI, K. K., AMBALAM, P., NILSSON, I., WADSTRÖM, T., LJUNGH, Å., 2012, Prebiotic-non-digestible oligosaccharides preference of probiotic bifidobacteria and antimicrobial activity against Clostridium difficile, Anaerobe, 489-497, ISSN 10759964, 10.1016/j.anaerobe. KVASNIČKOVÁ, A. 2000, Sacharidy pro funkční potraviny. 1. vyd. Praha: Ústav zemnědělských a potravinářských informací. ISBN 80-7271-001. LEE, Y., SALMINEN, S.: 2009, Handbook of probiotics and prebiotics. 2nd ed. Hoboken, N.J.: John Wiley, p. ISBN 978-047-0135-440. LOJANICA, M., M. MANOJLOVIC, D. JEREMIC a S. PETRONIJEVIC. 2010, The effects of probiotic Enterococcus faecium DSM 7134 in the weaned pigs nutrition. Biotechnology in Animal Husbandry. ISSN 1450-9156. DOI: 10.2298/BAH1002057L. LUKÁŠ, 2003, M. Escherichia coli (Escherichia coli kmen Nissle 1917, sérotyp O6:K5:H1) jako probiotikum v klinické praxi. Remedia. LF UK, Praha, 4/2003 [cit. 2013-02-13].
Dostupné
z:
http://www.remedia.cz/Archiv-rocniku/Rocnik-2003/4-
2003/Escherichia-coli-Escherichia-coli-kmen-Nissle-1917-serotyp-O6-K5-H1-jakoprobiotikum-v-klinicke-praxi/e-9l-9A-dF.magarticle.aspx MANGIN, I., BOUHNIK, Y., BISETTI, N., DECARIS B., 1999, Molecular monitoring of human intestinal Bifidobacterium strain diversity, Research in Microbiology, ISSN 0923-2508, MARAGKOUDAKIS,
P.
A.,
ZOUMPOPOULOU,
G.,
MIARIS,
C.,
KALANTZOPOULOS, G., POT, B., 2006, Effie Tsakalidou, Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products, International Dairy Journal, 189199, ISSN 0958-6946, 10.1016/j.idairyj.2005.02.009. MARTIN, F. P. J., WANG Y., SPRENGER, N., YAP I. K S, LUNDSTEDT, T., LEK, P., REZZI, S., RAMADAN, Z., VAN BLADEREN, P., FAY, B. L., KOCHHAR, S., LINDON, J. C., HOLMES E., NICHOLSON, J. K. 2008, Probiotic modulation of symbiotic gut microbial -host metabolic interactions in a humanized microbiome mouse model. Molecular Systems Biology. ISSN 1744-4292. DOI: 10.1038/msb4100190.
61
MARTINEZ, F. A. C., BALCIUNAS, E. M., CONVERTI, A., COTTER, P. D., de SOUZA OLIVEIRA, R. P.: 2013, Bacteriocin production by Bifidobacterium spp. A review,
Biotechnology
Advances,
ISSN
0734-9750,
10.1016/j.biotechadv.
2013.01.010. METZLER, B. U., MOSENTHIN, R., 2008: A Review of Interactions between Dietary Fiber and the Gastrointestinal Microbiota and Their Consequences on Intestinal Phosphorus Metabolism in Growing Pigs, Asian-Aust. J. Anim. Sci. 4 : 603 - 615 MILLER, G., ALGOZIN, K., McNAMARA. P., BUSH, E.. 2003; Productivity and economic effects of antibiotics used for growth promotion in U.S. pork production. J. Agric. Appl. Econ. 35: 469–482. MOMBELLI B., GISMONDO M. R., 2000, The use of probiotics in medical practice, International Journal of Antimicrobial Agents, S531-536, ISSN 0924-8579, 10.1016/S0924-8579(00)00322-8. MORENO F. M. R., SARANTINOPOLUS, P., TSAKALIDOU, E., DE VUYST, L.: 2006, The role and application of enterococci in food and health. Food Microbiol. 106, MOUNTZOURIS, K. C., BALASKAS, Ch., FAVA, F., TUOHY, K. M., GIBSON, G. FEGEROS, R., K. 2006: Profiling of composition and metabolic activities of the colonic microflora of growing pigs fed diets supplemented with prebiotic oligosaccharides, Anaerobe, ISSN 1075-9964, 10.1016/j.anaerobe.2006.04.001. PETERSON, R.E., KLOPFENSTEIN, T.J., ERICKSON, G.E., FOLMER, J., HINKLEY, S., MOXLEY, R.A., SMITH, D.R., 2007. Effect of Lactobacillus acidophilus strain NP51 on Escherichia coli O157:H7 fecal shedding and fi nishing performance in beef feedlot cattle. Journal of Food Protection 70, 287–291 QIULLIEN, G. 2001: Probiotics. Institut National de la Recherche Agronomiquie, France, databáze on-line, dostupné na: http://flairflow4.vscht.cz/syntCG1.doc OELSCHLAEGER, T.A. (2010): Mechanisms of probiotic actions – A review. International Journal of Medical Microbiology 300, 57 – 62.
62
RAMCHANDRAN L., SHAH N. P. 2011; Yogurt can beneficially affect blood contributors of cardiovascular health status in hypertensive rats. J Food Sci ROSS G. R., GUSILS C., OLISZEWSKI R., de HOLGADO S. C., GONZÁLEZ S. N., Effects of probiotic administration in swine, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, ISSN 1389-1723, 10.1016/j.jbiosc.2009.11.007. SANZ, Y.: 2007, Ecological and functional implications of the acid-adaptation ability of Bifidobacterium: A way of selecting improved probiotic strains, International Dairy Journal, Pages 1284-1289, ISSN 0958-6946, 10.1016/j.idairyj. SINGH K., KALLALI B., KUMAR, A., THAKER, V.: 2011. Probiotics: A review [online].
Asian
Pacific
Journal
of
Tropical
Biomedicine,
Dostupné
z:
www.elsevier.com/locate/apjtb SZABÓ, I. a kol.: 2009, Influence of a Probiotic Strain of Enterococcus faecium on Salmonella enterica Serovar Typhimurium DT104 Infection in a Porcine Animal Infection Model, Appl Environ Microbiol.; 75(9): 2621–2628 ŠILHÁNKOVÁ, L. 2008. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. vyd. Praha: Academia, 363 s. ISBN 80-200-1024-6. ŠPELINA, V., ETTLEROVÁ, K. 2006: Informace vědeckého výboru pro potraviny ve věci:
Probiotika
a
startovací
kultury,
databáze
on-line,
dostupné
na:
http://www.chpr.szu.cz/vedvybor/dokumenty/informace/Info_2006_16_deklas_Probio_ SK.pdf STRAW B. E., a kol., 2006, Diseases of swine. Blackwell Publishing, Iowa USA, 9. vydání, ISBN-13 978-0-8138-1703-3 TABE, E. S., OLOYA, J., DOETKOTT, D.K., BAUER, M.L., GIBBS, P.S., KHAITSA, M.L., 2008. Comparative effect of direct-fed microbials on fecal shedding of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella in naturally infected feedlot cattle. Journal of Food Protection 71, 539–544. TANNOCK, G. W. 2002. Probiotics and Prebiotics, Where Are We Going? 1.vyd. London, 333 s. ISBN: 0-9542464-1-1 63
TARAS D., VAHJEN W.,SIMON O.: 2007, Probiotics in pigs- modulation of their intestinal distribution and their impact on health and performance. Livestock Science, 108, 229-231. UDOMPIJITKUL, P., ALNOMAN, M., SARKER, M. R., 2013, Inactivation strategy for Clostridium perfringens spores adhered to food contact surfaces, Food Microbiology, ISSN 0740-0020, 10.1016/j.fm.2013.01.003. VEIZAJ-DELIA, E., PIU, T., LEKAJ, P., TAFAJ, M.,: 2011, Using combined probiotic to improve growth performance of weaned piglets on extensive farm conditions. Livestock Science, 134, 249-251 VOTAVA, M. a kol. 2006. Lékařská mikrobiologie speciální. 2. vyd. Brno: Neptun, 495 s. ISBN 80-902896-6-5 XIA, M.S., HU, C.H., XU, Z.R., 2005: Effects of copper bearing montmorillonite on the growth performance, intestinal microflora and morphology of weanling pigs, Animal Feed
Science
and
Technology,
Pages
307-317,
ISSN
0377-8401,
10.1016/j.anifeedsci.2004.11.008. YEAN CH. Y., YIN L. S., LALITHA P., RAVICHANDRAN M. 2007: A nanoplex PCR assay for the rapid detection of vancomycin and bifunctional aminoglycoside resistance genes in Enterococcus species. BMC Microbiology. YUJI O., YOSHINORI U., KAZUNARI U., 2004, Transition of the probiotic bacteria, Lactobacillus casei strain Shirota, in the gastrointestinal tract of a pig, International Journal of Food Microbiology, ISSN 0168-1605, 10.1016/j.ijfoodmicro.2004.04.001. ZBOŘIL, V. 2005, Mikroflóra trávicího traktu: klinické souvislosti. 1. vyd. Praha: Grada, 153 s. ISBN 80-247-0584-2.
64
8
Obr.
SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ
1:
Enterococcus
faecium
(http:en.wikipedia.org/wiki/File:Staphylococcus_
aureus_VISA_2.jp) Obr.
2:
E.
coli
O157:
H7
(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/
7/75/EColiCRIS051-Fig2.jpg) Obr.
3:
Clostridium
perfringens
(http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/
File:Clostridium_perfringens.jpg) Graf 1: Celkový počet bakterií mléčného kvašení [logKTJ/g] v exkrementech v jednotlivých termínech odběru (0., 15., 30. a 40. den pokusu) u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) Graf. 2: Srovnání celkového počtu rodu Enterococcus [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den). Graf. 3: Srovnání celkového počtu druhu Enterococcus faecium [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den). Graf. 4: Srovnání celkového počtu rodu Clostridium [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den). Graf. 5: Srovnání celkového počtu druhu Clostridium perfringens [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den). Graf. 6: Srovnání celkového počtu druhu Escherichia coli [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den). Graf. 7: Srovnání celkového počtu druhu Escherichia coli O15:H7 [logKTJ/g] v exkrementech u kontrolní skupiny (K) a pokusné skupiny (PF) v jednotlivých dnech odběru (0., 15., 30. a 40. den).
65
9
SEZNAM TABULEK
Tab. 1: Schéma rozložení mikroflóry střevního traktu (Zbořil, 2005) Tab. 2: Nejčastěji využívané probiotické kmeny podle autorů Mombelli a Gismondo, (2000) Tab. 3: Rozdělení enterokoků podle podobnosti genu pro 16S rRNA (Franz a kol., 2011) Tab. 4: Podíl krmných směsí Tab. 5: Primery použité pro identifikaci sledovaných bakterií Tab. 6: Sbírkové kmeny České sbírky mikroorganizmů Masarikovy univerzity Tab. 7: Průměrný přírůstek selat ve sledovaných dnech
66
