UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE
FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ
Katedra farmaceutické technologie
VLASTNOSTI VĚTVENÝCH OLIGOESTERŮ PLASTIFIKOVANÝCH 20 % TRIETHYLCITRÁTU
Diplomová práce
Hradec Králové 2009
Irena Jiráková
Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Velice děkuji PharmDr. Evě Šnejdrové, Ph.D. za odborné vedení a poskytnuté rady při vypracování diplomové práce.
Irena Jiráková
Abstrakt Cílem diplomové práce je studium adhezivních a reologických vlastností větvených oligoesterů a liberace acikloviru z těchto nosičů. V teoretické části jsou uvedeny substráty pro mukoadhezi, přírodní a syntetická bioadheziva, jejich funkce a vlastnosti. Dále problematika mukoadheze v gastrointestinálním traktu a v dutině ústní s příklady pouţívaných polymerů. Praktická část je zaměřena na testování dynamické viskozity
a
adheze
oligoesterů
kyseliny
mléčné
a
glykolové,
větvených
dipentaerythritolem (0,5D, 1D, 2D, 3D, 5D, 8D). Pro porovnání byl testován lineární oligoester kyseliny mléčné a glykolové (PLGA). Oligoestery byly plastifikovány 20% triethylcitrátu. Liberace acikloviru byla testováná za pouţití nosičů 0,5D, 1D a 2D. Dynamická viskozita byla nejvyšší u nosičů 3D a 0,5D. Nejvyšší adhezivní síla byla naměřena u nosičů 0,5D a PLGA. Nejdelší doba liberace acikloviru byla u nosiče 2D, 21 dní. Nejrychleji se uvolnil aciklovir z nosiče 0,5 D, za 3 dny, pak z nosiče 1 D, za 7 dní. Klíčová slova: bioadheze, adhezivní polymery, viskozita, liberace acikloviru
Abstract The aim of this graduation theses objective was the study of adhesions and rheologic properties of branched oligoesters and acyclovir
release from these
carriers. The experimental part introduces main targets for the mucoadhesion, natural and synthetic bioadhesives, their functions and properties. And further more there is the mucoadhesion in gastrointestinal tract and oral cavity with some examples of polymers and dosage forms. The practical part is regarded to the testing of dynamic viscosity and adhesion of the oligoesters of lactic and glycolic acid branched using dipentaerythrotol (0,5D, 1D, 2D, 3D, 5D, 8D) and linear PLGA. These oligoesters were plasticized by 20% of triethylcitrate. The acyclovir release from carriers 0,5D, 1D and 2D was studed. The dynamic viscosity was the highest by carriers 3D and 0,5D. The highest adhesion power was measured out by carriers 0,5D and PLGA. The longest period time of release was by carrier 2D, twenty-one days. The most fast aciclovir release was measured regarding to carrier 0,5 D, two days. Then 1D, seven days. Keywords: bioadhesion, adhesive polymers, viscosity, acyclovir release
Obsah 1 2 3 4
5
6
7
8 9
ÚVOD ....................................................................................................................... 5 CÍL PRÁCE .............................................................................................................. 6 SEZNAM ZKRATEK .............................................................................................. 7 TEORETICKÁ ČÁST .............................................................................................. 8 4.1 SUBSTRÁTY PRO MUKOADHEZI .............................................................. 8 4.1.1 HLEN (MUKUS) ...................................................................................... 8 4.1.2 EPITELIÁLNÍ MEMBRÁNA .................................................................. 9 4.2 MUKOADHEZIVA.......................................................................................... 9 4.3 FUNKCE MUKOADHEZIVNÍCH POLYMERŮ ......................................... 10 4.4 VLASTNOSTI MUKOADHEZIVNÍCH POLYMERŮ ................................ 11 4.5 MUKOADHEZE V GASTROINTESTINÁLNÍM TRAKTU ....................... 12 4.5.1 NESPECIFICKÉ MUKOADHEZIVNÍ ČÁSTICOVÉ SYSTÉMY ...... 13 4.5.2 SPECIFICKÉ MUKOADHEZIVNÍ ČÁSTICOVÉ SYSTÉMY ............ 16 4.6 MUKOADHEZE V DUTINĚ ÚSTNÍ ............................................................ 18 4.6.1 CHARAKTERISTIKY ÚSTNÍ DUTINY .............................................. 18 4.6.2 MUKÓZA ÚSTNÍ DUTINY JAKO MÍSTO PODÁNÍ LÉČIVA ......... 19 4.6.3 STRATEGIE PODÁNÍ LÉČIV PŘES MUKÓZU DUTINY ÚSTNÍ.... 20 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................. 26 5.1 POUŢITÉ PŘÍSTROJE .................................................................................. 26 5.2 POUŢITÉ SUROVINY .................................................................................. 26 5.3 PŘÍPRAVA VZORKŮ ................................................................................... 27 5.4 POSTUP MĚŘENÍ ......................................................................................... 28 5.4.1 VISKOZITA ........................................................................................... 28 5.4.2 ADHEZE ................................................................................................ 28 5.4.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU ................................................................... 29 VÝSLEDKY ........................................................................................................... 33 6.1 TABULKY ..................................................................................................... 33 6.1.1 DYNAMICKÁ VISKOZITA ................................................................. 33 6.1.2 MĚŘENÍ ADHEZE ................................................................................ 34 6.1.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU ................................................................... 39 6.2 GRAFY ........................................................................................................... 42 6.2.1 DYNAMICKÁ VISKOZITA ................................................................. 42 6.2.2 MĚŘENÍ ADHEZE ................................................................................ 44 6.2.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU ................................................................... 46 DISKUSE................................................................................................................ 51 7.1 DYNAMICKÁ VISKOZITA ......................................................................... 51 7.2 ADHEZE ........................................................................................................ 52 7.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU ........................................................................... 52 ZÁVĚRY ................................................................................................................ 54 LITERATURA ....................................................................................................... 55
4
1 ÚVOD Bioadheze je jev, při kterém dvě fáze, adhezivum a substrát, k sobě přilnou na delší dobu na základě mezipovrchových sil. Zároveň platí, ţe alespoň jedna ze zúčastněných fází je součástí ţivého organismu.1 Bioadhezivní látky jsou takové látky, které jsou schopny přilnout k biologickému povrchu po určitý časový interval. Tento proces se koná vţdy v přítomnosti vlhkosti. Pokud je adhezivní plochou slizniční tkáň pokrytá vrstvou hlenu, označují se tyto látky přesněji jako mukoadheziva. Mukoadheziva musí splňovat řadu podmínek, aby mohla být pouţita ve vývoji nových lékových forem. Musí být hlavně netoxická a nedráţdivá, přednostně biodegradabilní a neměla by bránit vstřebávání léčiva.2 Myšlenka vyuţítí bioadheze pro farmaceutické účely se objevila jiţ na začátku osmdesátých let.1 Vzniklo mnoţství publikací, které propagovaly představu, ţe různé lékové formy se budou moci na dané místo aplikace takzvaně „přilepit“. Podle cesty aplikace je substrátem pro takové bioadhezivní lékové formy sliznice úst, oka, nosu, gastrointestinálního traktu,3 děloţního čípku a respiračního traktu.1 Protoţe u všech těchto tkání se jedná o mukózní epitely, které jsou pokryté více nebo méně silnou hlenovou vrstvou (mukus), označuje se tento specifický způsob bioadheze jako mukoadheze.3 Ve většině případů se adhezivní interakce uskutečňují nejprve mezi bioadhezivem a hlenovou vrstvou. Substrátem můţe být také epiteliální povrch.
5
2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je studium reologických a adhezivních vlastností oligoesterů kyseliny D,L-mléčné a glykolové větvených dipentaerythritolem a studium liberace acikloviru z těchto systémů. Úkol diplomové práce je moţno rozdělit do těchto dílčích kroků: 1. Připravit vzorky pro měření viskozity a adheze: pro plastifikaci oligoesterů pouţít triethylcitrát v koncentraci 20%. 2. Na viskozimetru Brookfield DV-E s adaptérem pro malé mnoţství vzorku změřit viskozitu plastifikovaných oligoesterů při 50°C teplotě vřetenem 14. 3. Na materiálovém zkušebním stroji T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell měřit adhezivní vlastnosti plastifikovaných oligoesterů jako maximální sílu Fmax v jednotkách Newton, potřebnou pro odtrţení vzorku od podkladu, a to za těchto testovacích podmínek: doba kontaktu 60 s, kontaktní síla 5 N a rychlost odtrţení 300 mm/min. 4. Za
stejných
podmínek
změřit
dynamickou
viskozitu
a
adhezivní
sílu
plastifikovaného lineárního oligoesteru, tvořeného ekvimolárním mnoţstvím kyseliny mléčné a glykolové. 5. Zjistit průběh liberace acikloviru z oligoesterů 0,5D, 1D a 2D za statických podmínek do fosfát citrátového pufru s pH 7,0.
6
3 SEZNAM ZKRATEK 0,5D – oligoester kyseliny D,L – mléčné, glykolové a 0,5% dipentaerythritolu 1D – oligoester kyseliny D,L – mléčné, glykolové a 1% dipentaerythritolu 2D – oligoester kyseliny D,L – mléčné, glykolové a 2% dipentaerythritolu 3D – oligoester kyseliny D,L – mléčné, glykolové a 3% dipentaerythritolu 5D – oligoester kyseliny D,L – mléčné, glykolové a 5% dipentaerythritolu 8D - oligoester kyseliny D,L – mléčné, glykolové a 8% dipentaerythritolu ACV – aciklovir BDDS – bioadhesion drug delivery system: bioadhezivní terapeutický systém léčiv F/S – síla Fmax vztaţená k povrchu kontaktní plochy [mN/mm2] Fmax – maximální síla potřebná pro odtrţení vzorku od podkladu [N] GALT - gut-associated lymphoid tissue: střevní asociovaná lymfoidní tkáň GIT – gastrointestinal tract: gastrointestinální trakt Mn - číselně střední molární hmotnost [g/mol] Mw. – hmotnostně střední molární hmotnost [g/mol] Mw/Mn - stupeň polydisperzity PAAc – polyakrylová kyselina PLGA - oligoester kyseliny D,L - mléčné a glykolové RPM – počet otáček vřetena viskozimetru za minutu TEC – triethylcitrát Tg - teplota skelného přechodu [°C] s – směrodatná odchylka [N] s/S – směrodatná odchylka veličiny F/S [mN/mm2] η – dynamická viskozita [Pa.s]
7
4 TEORETICKÁ ČÁST Bioadhezivní látky jsou přírodní nebo syntetické polymery, které mohou přilnout k biologickým povrchům a mohou se zde udrţet po delší čas. 4 Pro některé polymery, jako chitosany
a karbomery, je mechanismus bio/mukoadheze výsledkem mnoha
rozdílných fyzikálně-chemických interakcí. Biologická bio/mukoadheziva, jako rostlinné lektiny, jsou specifická interakcemi s buněčnou stěnou a mucinem a jsou pokládána za druhou generaci bioadhezivních látek. Představa o vyuţití mukoadheze v aplikaci léčiv je taková: Adhezivní léková forma je zadrţena na mukózním povrchu a léčivo je tak uvolňováno blízko místa absorpce, z čehoţ vyplývá zvýšená biologická dostupnost.5
4.1 SUBSTRÁTY PRO MUKOADHEZI 4.1.1 HLEN (MUKUS) Mukózní povrchy jsou pokryté vrstvou hlenu, coţ je komplex hydratovaného gelového materiálu obsahujícího mucin.5 Základní komponentou mucinu je skupina vysokomolekulárních glykoproteinů, které dávají hlenu jeho viskoelastické a ochranné vlastnosti. Většina glykoproteinů hlenu nese záporný náboj. Ten má výrazný podíl na mukoadhezi.6 Hlen obsahuje ještě tzv. nemucinové sloţky. Jsou to protilátky, enzymy, surfaktanty, volné lipidy4 a nukleové kyseliny.1 Sloţení hlenu se velmi mění, závisí na ţivočišném druhu, anatomické lokalizaci a na tom, zda je tkáň v normálním nebo patologickém stavu. Hlen je schopen pojmout vodu v takovém mnoţství, ţe můţe dosáhnout aţ čtyřicetinásobku své váhy. Tloušťka vrstvy hlenu se pohybuje v rozsahu od 1 do 400 µm se střední hodnotou 200 µm u člověka.4 Přibliţný čas obměny této vrstvy je několik málo hodin.7 Krátký čas obměny můţe být limitujícím pro mukoadhezivní lékové formy. Hlavní funkce hlenu jsou: chránit epiteliální buňky před mechanickým a chemickým poškozením, poskytovat lubrikaci, slouţit jako zvlhčující činitel a upravovat obsah vody pod nimi leţících tkání. 8
8
4.1.2 EPITELIÁLNÍ MEMBRÁNA K popisu struktury buněčné membrány se stále pouţívá fluidní mozaikový model. Je to lipidová dvojvrstva se zakotvenými proteiny a polysacharidy, které se v ní mohou volně pohybovat. Hlavní komponenty membrány jsou lipidy (cholesterol, fosfolipidy, sfingolipidy), proteiny a sacharidy. Sacharidy jsou napojené na proteiny nebo lipidy a tvoří tak glykoproteiny a glykolipidy. Struktury obsahující polysacharidy na vnějším povrchu buňky se nazývají glykokalyx. Proteinové receptory buněčné membrány zvané lektiny jsou schopny se specificky vázat na glykokalyx nebo polysacharidy glykoproteinů.4
4.2 MUKOADHEZIVA Mukoadheziva a obecně také bioadhezivní materiály lze rozdělit do dvou skupin, a to podle typu adheze. Ta můţe být nespecifická nebo specifická. Nespecifická mukoadheziva
adherují
k jakémukoliv
slizničnímu
povrchu,
nespecifickými
fyzikálně-chemickými interakcemi (účinky mezifázové energie, vodíkovými můstky, interpenetrací).3 To limituje jejich pouţití při výrobě bioadhezivních terapeutických systémů léčiv pro specifickou tkáň. Naproti tomu je řada biologických molekul, které rozpoznají a adherují k chemicky specifickým cílovým strukturám na povrchu buněk nebo v hlenu. Jedná se o specifická mukoadheziva. Dobrým příkladem takových molekul jsou lektiny. Jsou to hlavně rostlinné proteiny, rozpoznávající a váţící se na specifické části sacharidů. Různé druhy lektinů rozpoznají různé kombinace sacharidů. Stěny buněk jsou pokryté velkým mnoţstvím sacharidů (glykokalyx), tyto lektiny se velmi dobře váţou na buněčné stěně, a jsou tudíţ mukoadhezivní. Dalším specifickým mukoadhezivem jsou bakteriální fimbriální proteiny. Tyto bakteriální adheziny přilnou na hostitelské buňky pomocí specifických interakcí, zprostředkovaných receptory.5 Bakterie jsou schopné adherovat k epiteliálním povrchům pomocí fimbrií (řas).9 Fimbrie jsou podobné lektinům. Jsou to dlouhé glykoproteinové komplexy na površích mnoha bakteriálních kmenů. Ukázalo se, ţe takové mechanismy mohou být nejen mimořádně účinné, ale i velmi selektivní pro určitou tkáň, druh nebo dokonce určité fenotypy některých druhů.3 Další specifická adheziva jsou také protilátky. Mají vysokou specifitu a mohou být vyuţity klasicky jako polymerní ligandy pro získávání místně specifických 9
mukoadheziv. Coţ by mohlo být uţitečné pro targeting (cílení) do nádorových tkání. 10 Ke specifickým adhezivům patří také aminokyselinové sekvence. Většina mukoadhezivních polymerů jsou deriváty kyseliny akrylové (syntetické) nebo deriváty celulosy (přírodní polymery).9 Příklady polymerů odvozených od kyseliny akrylové:
Karbomery: síťované polymery kyseliny akrylové
Polykarbophil: polyakrylová kyselina větvená pomocí divinyl glykolu
Polymetakryláty
Polyakrylová kyselina
Poly(isobutylkyanoakrylát)
Deriváty celulosy: 4
Karmelosa sodná sůl
Hyetelosa
Hydroxypropylcelulosa
Hypromelosa
Metylcelulosa
Methylhydroxyethylcelulosa
4.3 FUNKCE MUKOADHEZIVNÍCH POLYMERŮ Vedle základní funkce mukoadhezivních polymerů, tedy schopnosti přilnout na mukózní povrchy, se mohou projevit i další biologické účinky. Různé mukoadhezivní polymery jsou zřejmě schopny krátkodobě a reverzibilně otevřít úzké průchody (angl. tight junctions) mezi sousedními epitelovými buňkami, které jsou běţně pro peptidy neprostupné.3 Rozšíření tight junctions také vede ke zvýšení absorpce paracelulární cestou. Polymer schopný bobtnat, aplikovaný jako suchý prášek, absorbuje vodu z epiteliálního substrátu, coţ vede k dehydrataci buněk a k jejich následnému svraštění.11 Kromě sliznice tenkého sřeva byl tento efekt pozorován i po vaginální nebo nazální aplikaci mukoadhezivních léčiv s obsahem peptidových hormonů se systémovým účinkem.3 Převáţně mukoadhezivní deriváty kyseliny polyakrylové jsou současně účinné inhibitory celé řady proteolytických enzymů. Tvoří komplexy s kovovými ionty ve funkci kofaktorů enzymů, coţ je podmíněno chelatotvornými schopnostmi těchto polymerů.3 10
4.4 VLASTNOSTI MUKOADHEZIVNÍCH POLYMERŮ Mezi důleţité vlastnosti mukoadhezivních polymerů patří zejména hydrofilita, elektrický náboj, hustota zesítění, molekulová hmotnost a konformace polymeru. HYDROFILITA Funkční skupiny se váţí ke sliznici nebo biomembráně pomocí různých interakcí, jako jsou vodíkové vazby a hydrofobní nebo elektrostatické interakce. Díky hydrofilním funkčním skupinám jsou polymery schopné také bobtnat, a zvýšit tím počet adhezivních míst. NÁBOJ Aniontové polymery se pojí s hlenem pomocí vodíkových vazeb. Síla adheze roste, jsou-li karboxylové skupiny převedeny na kyselou formu. Kationtové polymery se mohou vázat na záporně nabitý povrch hlenu při pH 7,4 pomocí elektrostatických interakcí. Kationtové polymery jsou toxičtější neţ aniontové polymery, způsobují agregaci buněk.4 Hodnota pH prostředí ovlivňuje náboj na povrchu hlenu a polymeru, tudíţ má vliv na mukoadhezi. HUSTOTA ZESÍTĚNÍ Zvýšením hustoty zesítění se sníţí flexibilita polymerních řetězců a jejich pohyblivost. Tím se také sníţí rozsah interpenetrace a síla adheze. 6 MOLEKULOVÁ HMOTNOST A KONFORMACE POLYMERU Pro optimální adhezi kaţdého polymeru existuje rozmezí molekulové hmotnosti, které je závislé na konformaci. Např. adhezivní síla dextranu se s rostoucí molekulovou hmotností příliš nemění od hodnoty 200 000. Je to dáno jeho spirálovitou konformací. Mnoho aktivních skupin adheziva je chráněno uvnitř spirály a tyto skupiny jsou nedostupné pro proces adheze. Naproti tomu síla adheze polyethylenoxidu roste do molekulové hmotnosti 4 000 000, jelikoţ polyethylenoxid obsahuje molekuly s lineární konfigurací, která přispívá k interpenetraci.6
11
4.5 MUKOADHEZE V GASTROINTESTINÁLNÍM TRAKTU Cílem je vyuţítí mukoadhezivních systémů pro perorální podání, které by zajistily značné prodlouţení doby působení léčiva v místě svého účinku a umoţnily by méně časté podání léčiva.9 Jiţ v 80. letech minulého století popsal Robinson a kol.12 bioadhezivní vlastnosti širokého spektra polymerů. Rovněţ zjistil v testech in vitro a in vivo na krysách,13 ţe albuminové částice s chlorthiazidem, podané perorálně ve formě tobolek, mají dobrou adhezi a zajišťují řízené uvolňování léčiva po dobu osmi hodin. Výsledky u lidí však byly zklamáním9, a to kvůli dvěma problémům. Zaprvé, léčivo se musí „přilepit“ k mukózní vrstvě, která se ale sama neustále obměňuje. Zadruhé, BDDS (bioadhezivní terapeutický systém léčiv) musí odolat peristaltice GIT (gastrointestinální trakt). Výhody mukoadheze v GIT: 14
prodlouţení doby působení v místě účinku nebo absorpci,
lokalizace BDDS v cílovém místě,
zvýšení koncentračního gradientu díky intenzivnímu kontaktu částic s mukózním povrchem,
přímý kontakt se střevnímí buňkami, coţ je prvním krokem před absorpcí částic Dnes se vyuţívá několik aplikačních forem pro perorální podání:
Tablety: Vícevrstvá tableta dovoluje různorodost geometrického uspořádání. Takové systémy, které se skládají z polymerů polyakrylové kyseliny nebo celulosy poskytují okamţitou a vysokou sílu adheze.15 Mikročástice a nanočástice: Přes omezenou kapacitu byly adhezivní mikročástice a nanočástice široce zkoumány pro tři hlavní rysy: 1. adheze částic na mukózním povrchu, 2. zvětšení kontaktní plochy mezi částicemi a mukózním porchem, 3. prodlouţené uvolňování a zvýšení absorpce.16 Tobolky: Obvykle ţelatinové tobolky obsahující suspenzi s adhezivními polymery jako polykarbophil nebo karbomery. Multičásticové systémy jako např. mikročástice jsou výhodnější neţ jednotkové soustavy, tj. tablety a kapsle.17 Existuje shoda v tom, ţe se absorpce neuskutečňuje jen přes M-buňky v Peyerových plátech a izolovaných lymfatických folikulech, ale také přes střevní enterocyty.18 Střevo nejen dovoluje vstřebávání ţivin, elektrolytů a tekutiny, ale také má funkci bariéry, která brání volnému pronikání toxického luminálního obsahu do spodních 12
vrstev a jeho mísení s intersticiální a cévní tekutinou. Tím se předchází absorpci potenciálních škodlivých substancí nebo vstupu patogenů. Přestoţe GIT má velmi odlišné oblasti, je třeba povaţovat střevní mukózu za komplexní srukturu. Za fyziologických podmínek vykazují různé úseky GIT různé dynamické jevy, včetně peristaltiky, absorpce tekutin a rovnováhy sekrece, které mají značný vliv na BDDS a absorpci léčiva. Existují minimálně dva hlavní cíle pro ukotvení BDDS v gastrointestinálním traktu: mukózní tkáň a mukózní gelová vrstva. Střevní hlen tvořený vysokomolekulárními glykoproteiny zajišťuje hydrataci a souvisle pokrývá povrch sliznice. Tloušťka gelové vrstvy hlenu se v průběhu GIT mění, klesá směrem k distálním partiím od 50–500 μm v ţaludku do 15–150 μm v tračníku. Adheze na mukózní povrch se můţe uskutečnit více způsoby. A to buď nespecifickými (van der Waalsovy, hydrofobní síly), nebo specifickými interakcemi mezi komplementárními strukturami. Pro neustálou obměnu slizničního povrchu je kaţdopádně doba mukoadheze omezená. A tomuto časovému limitu by měly být délka uvolňování a absorpce léčiva přizpůsobeny.14
4.5.1 NESPECIFICKÉ MUKOADHEZIVNÍ ČÁSTICOVÉ SYSTÉMY V případě bobtnajících hydrofilních polymerů je adheze optimální tehdy, kdyţ dochází ke kontaktu mukózy se suchým polymerem. Hydratace polymeru vede k tvorbě hydrogelu, který je odpovědný za vývoj značné síly adheze. Tento koncept je zcela efektivní v dutinách těla s vlhkou sliznicí, jako je např. nosní nebo ústní dutina. V gastrointestinálním traktu jsou částice okamţitě promíseny s ţaludečními tekutinami, coţ pravděpodobně výrazně sníţí jejich adhezivitu z důvodu předčasné hydratace. Proto různé přístupy pro dosaţení gastrointestinální mukoadheze koloidních částic byly zaloţené na pouţití nebobtnajících a hydrofobních polymerů, jako polyalkylkyanoakrylátu nebo polymléčné kyseliny.14 ZVÝŠENÁ BIODOSTUPNOST S VYUŽITÍM NANOČÁSTIC Inkorporací do nanočástic se zlepšila farmakokinetika mnoha léčiv po perorálním podání. Např. biodostupnost vinkaminu při podání králíkům ve formě vodného roztoku se pohybovala kolem 25%. Po perorálním podání vinkaminu adsorbovaného na polyhexylkyanoakrylátové
nanočástice
se
zvýšila 19
pravděpodobně díky prodlouţenému kontaktu s mukózou. 13
biodostupnost
o
40%,
U indometacinu byly sníţeny vedlejší účinky (ţaludeční ulcerace) právě s pouţitím nanočástic oproti volnému léčivu.20 Inzulin jako oligopeptidové léčivo je po perorálním podání degradován enzymy GIT. Pokud se ale inzulin začlenil do nanočástic polyizobutylkyanoakrylátu, byl chráněn a glykémie diabetických krys klesla na 50%. Tím se ukázalo, ţe nanočástice chrání oligopeptid před enzymy trávicího traktu.21 Podobně plazmatická koncentrace oktreotidu, analogu somatostatinu, se zvýšila 2,7krát
pouţitím
téhoţ
systému.22
Cyklosporin,
zavedený
do
nanočástic
polyizohexylkyanoakrylátu, měl zlepšenou biodostupnost ve srovnání s jeho emulzí.23 Tyto studie dokazují velký potenciál nanočástic pro perorální podání léčiv. Byly popsány čtyři možné mechanismy pro absorpci a přestup částic přes gastrointestinální sliznici: 1.
intracelulární absorpce - Částice do 200 nm, ideálně ale menší neţ 50 nm, mohou být střevními buňkami absorbovány endocytózou.24
2.
paracelulární absorpce - Tento průchod mezi buňkami se zdá být méně pravděpodobný, jestliţe bariéra tight junction není narušena. Těsnost slizniční membrány by mohla být ovlivněna zvýšením absorpce např. anionaktivními tenzidy.14
3.
lymfatická absorpce M-buňkami Peyerových plátů je pravděpodobně hlavním místem přestupu.25 Pozdější přechod částic do mezenterických lymfatických uzlů se přisuzuje absorpci makrofágy.14
DYNAMICKÝ POPIS MUKOADHEZE NANOČÁSTIC V GIT Perorální podání vede k mukoadhezi významného podílu částic. Samozřejmě část je
zachycena
hlenovou
vrstvou
a
část
podstoupí
nemodifikovaný
tranzit
gastrointestinálním traktem. Dynamický popis je ilustrován na obr.1. Nejprve dojde ke kontaktu suspenze částic s mukózou (krok 1.). Ty se absorbují na hlenovou vrstvu (krok 2.) a postupně se tak pokrývá celá sliznice adherujícími částicemi (krok 3). Nakonec dojde k odloučení určitého podílu částic koloidní suspenze a eliminaci do distální části střeva (krok 4).
14
Obr.1 Mukoadheze koloidních částicových systémů pro perorální podání 14 Krok 1., podání koloidního systému. Krok 2., absorpce částic. Krok 3., mukoadheze a luminální průchod GIT koloidní suspenze. Krok 4., odloučení určitého podílu částic koloidní suspenze, eliminace.
15
Tento mechanismus je jen hrubým popisem skutečnosti, protoţe nezahrnuje mnoho fyziologických proměnných, včetně variability ve vyprazdňování ţaludku, střevního průchodu, efektu ředění suspenze částic tekutinami v GIT, nebo mísení s přijatými jídlem.
Kaţdopádně terapeutický potenciál nespecifických koloidních
nosičů léčiv pro perorální podání je zvýšit biodostupnost léčiva ochranou před denaturací v GIT, nebo zvýšit koncentraci léčiva na mukózní membráně a prodlouţit čas působení.
4.5.2 SPECIFICKÉ MUKOADHEZIVNÍ ČÁSTICOVÉ SYSTÉMY Přes zajímavé výsledky in vivo má nespecifická mukoadheze částicových systémů na střevní sliznici dvě nevýhody. Zaprvé, absorpce se obecně týká jen zlomku částic a zbytek podléhá přímé eliminaci. Zadruhé, kvůli nespecifickým interakcím je cílení částic na určité oblasti mukózy nereálné. Tyto
nevýhody
mohou
být
částečně
odstraněny
vyuţitím
interakcí
zprostředkovaných receptory. Takováto adheze zahrnuje interakce typu ligand–receptor mezi komplementárními strukturami. Ligand, který vykazuje afinitu k receptoru lokalizovanému v GIT, můţe na povrchu koloidních částic (tj. lipozómy nebo nanočástice) zprostředkovat adhezivní interakci mezi částicí a biologickým povrchem. 14 Cíle pro specifické mukoadhezivní systémy zahrnují (obr. 2): 1. mukózní glykoproteiny (mucin), 2. epiteliální buňky, 3. M buňky, Peyerovo pláty nebo střevní asociovaná lymfoidní tkáň (GALT) 4. abnormální glykoproteiny tvořené rakovinovými buňkami (lokální nádory). Mukoadhezivní částice, specificky interagující s mukózními glykoproteiny nebo epiteliálními
buněčnými
komponentami,
mohou
obecně
zvýšit
mukoadhezi
oproti nespecifickým systémům. V tomto případě by se jednalo o receptory interagující s ligandy přítomné na velkých plochách střeva (např. cukerné zbytky mukózních glykoproteinů). Specificky interagující částice mohou být také určeny pro cílení na oblast patologicky změněnou. Je nezbytné identifikovat
pár ligand-receptor, který je
specifický pro dané místo.14 Jako příklad lze uvést cílení pomocí lektinů na patologicky změněné tkáně v tračníku (kolon). Jedná se o zánětlivé nemoci a rakovinu tračníku.26
16
Abnormální glykoprotein, syntetizovaný rakovinnými buňkami, se vyznačuje specifickým glykosidickými zbytky.27 Vitamin B12 byl navrhován pro aplikaci v kyčelníku (ileum),28 kde je pro něj specifický receptor.
Obr. 2 Hlavní možnosti interakcí zprostředkovaných páry ligand–receptor 14 1. vazba konjugátů (spojený s mikročásticí nebo nanočásticí) na mukózní glykproteiny, nebo glykoproteiny buněčné membrány, nebo glykolipidy (černá šipka); 2. vazba konjugátů na ligandy přítomné specificky na povrchu určitých buněk (např. M buněk); 3. rozpoznání glykoproteinů mucinu vylučovaných ve specifických oblastech (např. rakovinové buňky). V ideálním případě by konjugáty (ligand spojený s mikročásticí nebo nanočásticí) pro specifickou bioadhezi měly splňovat několik kritérií. Předně jsou na částice kladeny tyto poţadavky: 1. nerozpustnost ve vodě, 2. biodegradebilita a biokompatibilita (včetně nízké toxicity a imunogenity), 3. ochranná funkce léčiva a řízené uvolňování, 4. dostupnost vhodných funkčních skupin pro stabilní spojení s vybraným ligandem. Také je ţádoucí, aby ligand specificky interagoval s přitomným receptorem v určité oblasti. Teoreticky musí dojít k adhezi tehdy, kdyţ je aplikační forma na poţadovaném místě.14
17
4.6 MUKOADHEZE V DUTINĚ ÚSTNÍ Malý povrch a krátký rezidenční čas jsou povaţovány za nevýhody pro aplikaci léčiva v dutině ústní. Přesto má bukální a sublingvální cesta aplikace také značné výhody. Nabízí moţnost obejít first-pass efekt a vyhnout se metabolismu v gastrointestinálním traktu. Epitel v ústní dutině je permeabilní více neţ kůţe, povrch je hladký a relativně nehybný. Proto je tento způsob podání vhodný pro léčiva s nízkou permeabilitou, krátkým biologickým poločasem, vyţadující prodlouţené uvolňování a dále léčiva citlivá na enzymatickou degradaci, nebo špatně rozpustná.
4.6.1 CHARAKTERISTIKY ÚSTNÍ DUTINY Dutina ústní má relativně malou plochu povrchu (přibliţně 50 cm2). Mukóza ústní dutiny je sloţená z dlaţdicového epitelu. Doba obměny bukálního epitelu je odhadována na 5 aţ 6 dní. Tloušťka mukózy se mění v závislosti na dané oblasti: bukální sliznice má tloušťku asi 500 aţ 800 μm, zatímco síla sliznice tvrdého a měkkého
patra,
spodní
části
úst,
dásně
a
ventrální
části
jazyka
činí
okolo 100 aţ 200 μm. Sloţení epitelu se také mění v závislosti na místě v ústní dutině. Můţe být keratinizovaný, nebo nekeratizovaný. Oblasti mukózy vystavované mechanickému namáhání (dásně a tvrdé patro) jsou keratinizované odobně jako epidermis. Mukóza měkkého patra, podjazykové a bukální regiony jsou nekeratinizované. Keratinizované epitely obsahují lipidy jako ceramidy a acylceramidy, které mají funkci bariéry. Tyto epitely jsou relativně nepropustné pro vodu. Naproti tomu nekeratinizované epitely, jako bukální epitel, obsahují jen malé mnoţství ceramidů a malé mnoţství neutrálních, ale
polárních
lipidů,
hlavně
sulfát
cholesterolu
a
glukosylceramidy.
Tyto
nekeratinizované epitely jsou mnohem víc propustné pro vodu neţ keratinizované. Pojivová tkáň ústní mukózy omezuje propustnost polárních substancí. Ačkoli byla rychlá absorpce léčiva z dutiny ústní přisuzována bohatému prokrvení mukózy v ústech, zdá se, ţe cévní zásobení, pokud není dramaticky sníţeno, obvykle není významným faktorem. Mukóza dutiny ústní poskytuje ochranu pro spodní tkáně a má tudíţ funkci bariéry proti mikroorganismům a toxinům. Ústní mukóza má obecně poněkud méně těsný epitel a je prostředníkem mezi pokoţkou (epidermis) a střevní sliznicí. Její permeabilita je 4 aţ 4000 krát větší
18
neţ permeabilita kůţe. Obecně se propustnost ústní mukózy sniţuje v pořadí: podjazyková, bukální, předopatrová mukóza. Léčivo můţe prostupovat mukózou mezibuněčnými prostory, endocytózou, nebo aktivním transportem. Jinde v těle je mukus produkován specializovanými buňkami, jako jsou pohárkové buňky, zatímco v dutině ústní je hlen vylučován velkými a malými slinnými ţlázami. Aţ 70% celkového mnoţství mucinu je produkováno malými slinnými ţlázami. Při fyziologickém pH má mukus záporný náboj, který hraje svou roli při mukoadhezi.29
4.6.2 MUKÓZA ÚSTNÍ DUTINY JAKO MÍSTO PODÁNÍ LÉČIVA Jsou tři moţné způsoby podání léčiva v ústní dutině: 1. sublingvální podání (obvykle systémové) 2. bukální podání (většinou také systémové) 3. lokální podání léčiva do dutiny ústní.30 Sublingvální mukóza je relativně permeabilní, umoţňuje rychlou absorpci a přijatelnou biodostupnost mnoha léčiv a je obecně velmi vhodná. Bukální mukóza je podstatně méně permeabilní neţ podjazyková oblast, absorpce není tak rychlá a biodostupnost je sníţena ve srovnání se sublingválním podáním.31 Lokální podání na tkáně ústní dutiny zahrnuje řadu různých aplikací, včetně ošetření při bolesti zubů, bakteriální a plísňové infekce, afty a dentální stomatitidy. Periodontitis (zánět ozubice) je zánětlivé a infekční onemocnění, mající za následek destrukci nosných struktur zubů (periodontální ligamenta a kost). Důsledkem je tvoření dutin mezi měkkou tkání dásně a zubem, coţ můţe nakonec způsobit jeho ztrátu. Adhezivní polymery by se mohly uplatnit při léčbě tohoto zánětlivého onemocnění. Jako léčivo je moţno pouţít bakteriostatikum, které by se vhodnou formou vpravilo do příslušné periodontální dutiny.29
19
4.6.3 STRATEGIE PODÁNÍ LÉČIV PŘES MUKÓZU DUTINY ÚSTNÍ Nové aplikační formy pro mukózu dutiny ústní zahrnují systémy prodlouţeného uvolňování a jsou vyvinuty tak, aby se léčivo uvolňovalo v průběhu určitého časového intervalu. Ţádoucími atributy adhezivního systému s prodlouţeným uvolňováním jsou: dostatečná kapacita pro léčivo, optimální mukoadheze, nedráţdivost, komfortnost v ústech. V posledních letech, byly navrhované různé adhezivní aplikační formy pro podání ústní cestou. Jedná se o tuhé adhezivní systémy (tablety, náplasti) a polotuhé adhezivní systémy (gely). 29 Mukooadhezivní aplikační formy pro dutinu ústní: 9 Tablety: Adhezivní tablety umoţňují zůstat na jazyku nebo jiné tkáni ústní dutiny nejméně 30 minut. To vede ke zvýšení koncentrace léčivé látky v místě podání. Náplasti: Jsou to flexibilní, adhezivní folie, které mohou být uţity jako jednosměrné nebo vícesměrné systémy. Třívrstvé bukální náplasti (obr. 3) jsou sloţené z vrchní nepropustné vrstvy, střední vrstvy limitující rychlost uvolňování léčiva a bazální membrány obsahující polykarbophil. Mohou setrvat na místě aţ 15 hodin, a to bez ohledu na přijímané tekutiny nebo potravu.4 Gely: Pouţívání gelů tvořených polymery, jako jsou deriváty polyakrylové kyseliny, umoţňuje prodlouţené uvolňování a zlepšení biodostupnosti ve srovnání s roztoky. Masti: Zatím nemají takový význam jako tablety nebo náplasti.
Obr. 3 Třívrstvá bukální náplast, jednosměrný systém pro mukoadhezi 6
20
ADHEZIVNÍ TABLETY Bukální adhezivní tablety mohou být aplikované na různá místa v ústní dutině, např. na patro, mukózu tváře, nebo mezi horní ret a dáseň. Umístění tablety v ústech má vliv na dobu zdrţení, která činí v případě dásně 7 aţ 12 hodin a v případě patra 4 aţ 6 hodin.32 Je důleţité, aby sloţky tablet nestimulovaly zvýšenou produkci slin, jinak by léčivo bylo spíše polykáno neţli absorbováno. Některé adhezivní systémy byly vyvinuté a jsou dostupné na trhu zahraničním i českém, jako např Nicorette (nikotin), Suscard (glyceryltrinitrát) a Striant (testosteron). Jiné systémy jsou ještě ve vývoji. Příklady polymerů a léčiv pouţívaných pro výrobu adhezivních tablet jsou uvedeny v tabulce 1. Tab. 1 Příklady léčiv a materiálů používaných pro výrobu bukálních mukooadhezivních tablet 29 Materiál
Léčivo
Kyselina polyakrylová, tepelně upravený kukuřičný škrob, benzoan
Miconazol
sodný, oxid křemičitý Hypromelosa, kyselina stearová, silikagel (gel kyseliny křemičité),
Glyceryltrinitrát
bezvodá laktosa Polyoxyethylen, polyisobutylen, polyethylenglykol
Vitamin B12
Alginát sodný, hypromelosa, karbomer, polykarbophil
Omeprazol
Pektin, hypromelosa
Diltiazem
Hydroxypropylcelulosa, karbomer, mannitol, laktosa, povidon,
Nicotin
stearát hořečnatý Karbomer, hydroxypropylcelulosa
Ergotamin
Karmelosa, karbomery, povidon,
Nifedipin
polyvinylalkohol, hypromelosa V současné době je věnována velká pozornost absorpci sloučenin o vysoké molekulové hmotnosti. Jedná se zejména o peptidy a proteiny, jejichţ biodostupnost v ústní dutině je velmi malá. Oxytocin, chymotripsin a insulin jsou některé z léčiv studované v souvislosti s podáním bukální cestou.33 Určitým problémem adhezivních tablet je moţné oddělení od mukózy s následným polknutím nebo adhezí na stěnu jícnu. 21
ADHEZIVNÍ NÁPLASTI Mukoadhezivní
náplasti
zahrnují
jednoduché
systémy,
jako
erodibilní
a neerodibilní adhezivní folie, dále sloţitější systémy, poskytující jednosměrné nebo vícesměrné uvolňování léčiv. Náplasti lze pouţít pro systémovou terapii, nebo lokální léčbu mukózy ústní dutiny. Výhodou adhezivních náplastí je, ţe mohou být aplikovány na příslušnou mukózní oblast a v místě účinku mohou díky prodlouţenému uvolňování udrţet koncentraci léčiva na určíté úrovni po delší časový interval. Prvním krokem při vývoji adhezivní nálasti je výběr a charakterizace polymeru nebo kombinace polymerů s vhodnými bioadhezivními vlastnostmi a průběhem uvolňování léčiva. Sloţitější náplasti jsou obvykle vyrobeny z několika materiálů a jsou sloţeny z více vrstev. Například vnější nepropustná vrstva můţe slouţit k tomu, aby se předešlo ztrátě léčiva. Vícevrstvé systémy lze vyrobit opětovnou kompresí dvou navrstvených náplastí, nebo je lze také nanášet formou spreje nástřikem.34 Vedle adhezivních náplastí bylo také zkoumáno pouţití polymerních filmů pro aplikaci v ústní dutině. Mukoadhezivní filmy mohou být upřednostňovány oproti adhezivním náplastem nebo tabletám pro jejich flexibilitu, pohodlí a snadnou aplikaci k periodontální dutině. Navíc polymerní adhezivní film můţe být schopen chránit poškozený povrch sliznice a sníţit tak bolest a zefektivnit léčbu.35 Některé příklady polymerů a léčiv pouţívaných pro výrobu těchto druhů náplastí jsou uvedeny v tabulce 2. Tab. 2 Příklady materiálu a léčiv používaných u bioadhezivních náplastí 29 Materiál
Léčivo
Polyuretan
Lignokain
Polyisobutylen, polyisopren
Buprenorphin
Silikonové polymery
Peptidy
Hypromelosa, sodná sůl kamelosy, karbopol
Metoprolol tartrát
Sodná sůl karmelosy, chitosan, polyvinylalkohol, hyetelosa,
Miconazol nitrát
hypromelosa Vhodný bioadhezivní terapeutický systém léčiv pro aplikaci přes mukózu dutiny ústní by měl být pruţný, měkký, adekvátně pevný, aby odolal mechanickým tlakům způsobených pohybem úst. A dále by měl mít dobré mukoadhezivní vlastnosti pro udrţení v ústní dutině po určitou dobu. 22
POLOTUHÉ ADHEZIVNÍ SYSTÉMY Polotuhé adhezivní systémy zaloţené na hydogelech jsou atraktivní aplikační formy. Léčivo tak můţe být aplikováno přes bukální mukózu nebo vpraveno do periodontální
dutiny
s
moţností
prodlouţení
doby
retence
a
zlepšení
biodostupnosti.29 Hydrogely vznikají hydratací polymerů ve vodném prostředí bez jejich rozpouštění. Po hydrataci mají funkci BDDS, pomalu uvolňujícího molekuly léčiva.36 Polotuhé systémy lze s výhodou aplikovat na povrch mukózy také pomocí injekce, z čehoţ vyplývá snadnost umístění např. do periodontální dutiny. Doba retence v místě aplikace souvisí s mukoadhezivitou, rychlost a rozsah uvolňování závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech léčiva a aplikační formě. Systémy zaloţené na hyetylose, povidonu a polykarbophilu (jako adhezivních polymerech) a tetracyklinu (model léčiva), byly vyrobeny v různých poměrech hyetylosy a povidonu. Zvýšením koncentrace hyetylosy se sníţila rychlost uvolňování tetracyklinu z důvodu vyšší viskozity a tím niţší rychlosti difúze. Naopak, zvýšením koncentrace povidonu se zvýšila rychlost uvolňování tetracyklinu díky větší porozitě, která vedla k rozpouštění tohoto polymeru. Zvýšením koncentrací obou polymerů se zvýšila tvrdost, viskozita. Produkt se vyznačoval sníţenou elasticitou a kohezí. Všechny formy měly pomalé uvolňování s hodnotami mezi 1,59 a 15,80 mg/h. Podobné formy, obsahující flurbiprofen nebo hydrochlorid tetracyklinu, byly studované na lidech a prokázaly dobrou klinickou účinnost.29 Také bylo zkoumáno pouţití sublingválních systémů s chlorhexidinem u nemocí periodontu. Zjistilo se, ţe gel obsahující 1% chlorhexidinu lze s výhodou pouţít u zánětu ozubice. U testovaných skupin došlo ke zmírnění atrofie dásní a sníţení krvácení.37 Vlastnosti gelů jsou výhodné jak pro topické pouţití na ústní mukózu, tak pro aplikaci pomocí injekce do periodontální dutiny. Gely chitosanu se zdají být s jejich bioadhezivními a antimikrobními vlastnostmi jako slibné systémy pro lokální léčbu periodontálních nemocí.38 POŽADAVKY NA ADHEZIVNÍ POLYMERY V ÚSTNÍ DUTINĚ 29 Ideální polymer pro BDDS v ústní dutině by měl mít následující charakteristické rysy:
23
1. Polymer a jeho rozkladné produkty by neměly být toxické a absorbovány přes mukózní membránu. 2. Neměl by dráţdit. 3. Přednostně by měl tvořit nekovalentní vazby s povrchem epitelových buněk. 4. Měl by rychle adherovat k vlhké tkáni a interagovat se specifickým místem. 5. Začlenění léčiva by mělo být snadné a mělo by se uvolňovat poţadovaným způsobem. 6. Polymer by měl zajišťovat flexibilitu a pohodlí aplikační formy. Aktuálně pouţívané adhezivní polymery pro aplikaci v ústní dutině jsou uvedeny v tabulkách 1, 2 a 3. Tab. 3 Adhezivní polymery pro aplikaci v dutině ústní 29 Polymer Modifikovaný kukuřičný škrob a Xanthanová klovatina d Kolagen d ţelatina a, c Chitosan c, d Chitosan hydrochlorid c Polyethylenglykol 400 c Povidon b, d Poloxamer 407 d Karbopol b, c, d Polykarbophil d Polyakrylová kyselina a, c, d Ethylcellulosa c Hyetelosa d Hypromelosa a, c Acetát celulosy b Sodná sůl karmelosy c, d Polyoxyethylen a Polyethylenoxid d a – tablety, b – náplasti, c – filmy, d – polotuhé systémy 24
Bioadhezivní aplikační formy pro podání do ústní dutiny mají mnoho výhod oproti tradičním aplikačním formám. Adhezivní tablety, narozdíl od konvenčních tablet, dovolují pití a mluvení bez významnějšího nepohodlí. Adhezivní polotuhé systémy lze pouţít pro podání léčiva přes ústní mukózu s moţností prodlouţení doby retence a zlepšení biodostupnosti. Navíc tyto polotuhé systémy umoţňují snadnou aplikaci do periodontální dutiny na delší dobu. Adhezivní náplasti je moţno navrhnout tak, aby poskytovaly jednosměrné i vícesměrné uvolnění léčiva. Mukooadhezivní polymerní filmy lze preferovat pro jejich flexibilitu, pohodlí a snadnou aplikaci k periodontální dutině. Volba lepších bioadhezivních aplikačních forem závisí na charakteristických rysech léčiva a na místě účinku (periodontální dutina, dáseň, zuby, mukóza tváře, systémové působení).
25
5 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.1 POUŽITÉ PŘÍSTROJE Analytické digitální váhy KERN ABS 220-4, max. 220g, d = 0,0001g Biologický termostat BT 120 Brookfieldův digitální viskozimetr model DV – E Digitální pH-metr HANNA pH 221 Digitální váhy KERN 440-33, max. 200g, d = 0,01g Digitální váhy KERN 440-35, max. 400g, d = 0,01g Horkovzdušná sušárna ULE 400, memmert Materiálový zkušební stroj T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell Spektrofotometr HELIOS GAMA (UV/VIS), Unicam
5.2 POUŽITÉ SUROVINY 0,5D … Oligoester kys. D,L – mléčné a glykolové s 0,5 % dipentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící sloţky (FaF UK HK) 1D … Oligoester kys. D,L – mléčné a glykolové s 1 % dipentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící sloţky (FaF UK HK) 2D … Oligoester kys. D,L – mléčné a glykolové s 2 % dipentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící sloţky (FaF UK HK) 3D … Oligoester kys. D,L – mléčné a glykolové s 3 % dipentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící sloţky (FaF UK HK) 5D … Oligoester kys. D,L – mléčné a glykolové s 5 % dipentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící sloţky (FaF UK HK) 8D … Oligoester kys. D,L – mléčné a glykolové s 8 % dipentaerythritolu v reakční směsi ve funkci větvící sloţky (FaF UK HK) Aceton čistý (Penta, výrobní divize Chrudim) Aciklovir (Pliva Lachema) Azid sodný (Fluka) Čištěná voda (FaF UK HK) Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát (Lach-Ner Neratovice) Kyselina citronová monohydrát, ČL 2002 (Penta, výrobní divize Praha) PLGA … lineární oligoester kyseliny D,L - mléčné a glykolové v poměru 1:1 Triethylcitrát (Merck Mnichov) 26
5.3 PŘÍPRAVA VZORKŮ Testované nosiče jsou kopolymery kyseliny mléčné a glykolové v poměru 1:1, obsahující dipenthaerythritol jako větvící sloţku, jehoţ koncentrace v reakční směsi byla 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5% a 8% (0,5D, 1D, 2D, 5D a 8D). Syntéza oligoesterů byla provedena na katedře farmaceutické technologie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Tab.č. 4 : Charakteristika nosičů Označení polymeru PLGA
Poměr LA/GA/D Mn Mw Tg Stupeň větvení Mw/Mn [%] [g/mol] [g/mol] [°C] Mw(sec)/Mw 50/50/0 1833 4086 2,23 17,0 1,50
0,5D
49,75/49,75/0,5
2200
4000
1,8
17,7
0,70
1D
49,5/49,5/1,0
2500
5700
2,28
16,1
0,58
2D
49,0/49,0/2,0
4300
6600
1,53
17,9
0,52
3D
48,5/48,5/3,0
3600
5300
1,5
27,3
1,04
5D
47,5/47,5/5,0
1900
2300
1,2
16,3
1,38
8D
46,0/46,0/8,0
1400
1700
1,2
12,5
0,94
Mn……………………….číselně střední molární hmotnost [g/mol] Mw………………………hmotnostně střední molární hmotnost [g/mol] Mw/Mn…………………...stupeň polydisperzity Tg………………………..teplota skelného přechodu [°C] Mw(sec)/Mw ………………stupeň větvení Byly připraveny vzorky tvořené daným oligoesterem a triethylcitrátem (TEC) ve funkci plastifikátoru, který byl ve vzorcích obsaţen v koncentraci 20%. Do malé 25 ml kádinky se nejprve naváţilo 8,0 g oligoesteru a zahřívalo se v horkovzdušné sušárně při teplotě 70-80°C do změknutí. Poté byly přidány 2,0 g TEC a směs se homogenizovala kovovou kopistkou. V případě, ţe vzorek ztuhl ještě neţ byl zhomogenizován, byl vloţen zpět do horkovzdušné sušárny, aby bylo moţno homogenizaci dokončit. Hotový vzorek byl zakryt alobalem a označen názvem nosiče a koncentrací plastifikátoru a poté umístěn do exsikátoru.
27
5.4 POSTUP MĚŘENÍ 5.4.1 VISKOZITA Na Brookfieldově digitálním viskozimetru DV-E s adaptérem pro malé mnoţství vzorku byla měřena dynamická viskozita plastifikovaných oligoesterů. Je to rotační viskozimetr, měřící viskozitu záznamem kroutícího momentu, který je potřebný k tomu, aby vřeteno ponořené do vzoku rotovalo konstantní rychlostí. Kroutící moment je úměrný viskóznímu tahu ponořeného vřetena a tím viskozitě kapaliny. Pro měření viskozity bylo pouţito vřeteno č.14 a termostat vodní lázně s cirkulací byl nastaven na teplotu 50°C. Po zapnutí se nechala vodní lázeň temperovat na 50°C. Do viskozimetru bylo našroubováno vřeteno č.14. Měřený vzorek byl roztaven v horkovzdušné sušárně při teplotě 70-80°C a vpraven do válce, který je součástí adaptéru pro malé objemy vzorků a dále upevněn do dvouplášťového obalu. Vzorek se pak nechal temperovat 20 minut. Potom se zapnul viskozimetr a na displeji se navolila velikost vřetena. Hodnota RPM (rychlost rotace – počet otáček za minutu) byla nastavena na nejniţší hodnotu (0,3) a spustil se motor. Kdyţ se hřídel ve vzorku otočila pětkrát, odečetl se údaj hodnoty dynamické viskozity v Pa.s. Nezaznamenávaly se údaje pod 10% kroutícího momentu (pro přesnost měření). Pak se zvýšila rychlost otáčení hřídele a postup se opakoval. Po proměření v celém rozsahu RPM (0,3 – 100) byl vzorek odstraněn a válec i vřeteno vyčištěny acetonem. Stejný postup byl pouţit u všech vzorků.
5.4.2 ADHEZE Měření adheze bylo provedeno na materiálovém zkušebním stroji firmy Zwick/Roell. Tento zkušební stroj umoţňuje tlakové, tahové a ohybové zkoušky materiálu. Stroj obsahuje horní vertikálně pohyblivou a dolní nepohyblivou část, do nichţ byly vloţeny nástavce válcového tvaru tak, aby po přiblíţení došlo ke kontaktu jejich kruhových ploch. Plocha nástavce horní čelisti byla menší, a tedy udávala kontaktní plochu o průměru d=28,04 mm a ploše S=617,51 mm2. Adhezivita plastifikovaných oligoesterů byla měřena jako maximální síla Fmax potřebná k odtrţení horní plochy se vzorkem od plochy dolní.
28
Po zapnutí zkušebního stroje a k němu připojeného počítače byly nejprve zkontrolovány předdefinované parametry měření a nastaveny testovací parametry dle zadání experimentu: kontaktní síla 5 N, kontaktní doba 60 s, rychlost odtrţení vzorku od podkladu 300 mm/min. Na horní kontaktní plochu byl kopistkou nanesen vzorek v tenké kompaktní vrstvě. Ovládáním pomocí počítače byla nastavena výchozí vzdálenost horní plochy od dolní plochy (výchozí pozice LE 25 mm), vynulována síla a spuštěna vlastní zkouška. Horní plocha se pohybovala směrem k dolní rychlostí 25 mm/min. V momentu, kdy byly kontaktní plochy od sebe ve vzdálenosti 5 mm, sníţila se rychlost horní čelisti na 10 mm/min, aţ došlo ke kontaktu obou ploch. Následovala doba kontaktu 60 s při zatíţení 5 N. Poté se horní čelist odtrhla rychlostí 300 mm/min. Byla zaznamenána maximální síla, nutná k odtrţení a poté automaticky nastavena původní výchozí pozice LE 25 mm (tedy vzdálenost horní a dolní plochy). Mezi kaţdým měřením byl odstraněn vzorek z obou nástavců kopistkou a nástavce se očistily acetonem. Bylo provedeno vţdy deset měření pro stejný vzorek za stejných podmínek. Průměrná adhezivní síla ØFmax kaţdého vzorku byla dále přepočtena na velikost kontaktní plochy horní čelisti pro srovnání výsledků.
5.4.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU
Příprava pufru: Disolučním médiem při liberaci acikloviru z matric byl zvolen fosfát citrátový pufr o hodnotě pH 7,0. Dle chemických tabulek se 1000 ml pufru připraví smícháním x dílů roztoku A a (100–x) dílů roztoku B. Pro pH 7,0 bylo třeba 19 dílů 0,1 M roztoku monohydrátu kyseliny citrónové (21,014 g/l) a 81 dílů 0,2 M roztoku dihydrátu hydrogenfosforečnanu disodného (35,60 g/l). Roztok A byl připraven naváţením 3,99 g monohydrátu kyseliny citrónové a dolitím vody na 190 ml. Roztok B měl být připraven naváţením 28,84 g dihydrátu hydrogenfosforečnanu disodného a dolitím vody na 810 ml. K přípravě roztoku B byl ale pouţit dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného. Jeho hmotnost potřebná k přípravě roztoku B byla vypočtena z hmotnosti dihydrátu hydrogenfosforečnanu disodného (28,84 g) a molárních hmotností dihydrátu hydrogenfosforečnanu disodného (178,14 g/mol) a dodekahydrátu hydrogenfosforečnanu disodného (358,14 g/mol).
29
Roztok
B
byl
pak
připraven
naváţením
57,97
g
dodekahydrátu
hydrogenfosforečnanu disodného a dolitím vody na 810 ml. Po rozpuštění byly roztoky smíchány a pro dosaţení protimikrobní stability bylo přidáno 0,02% azidu sodného. Po důkladném rozpuštění všech sloţek byla hodnota pH zkontrolována digitálním pH metrem. Byla naměřena hodnota pH pufru 7,0 a dále nebyly nutné další úpravy, jako přidávání kyseliny citrónové, nebo hydrogenfosforečnanu disodného pro sníţení nebo zvýšení hodnoty pH pufru.
Příprava matric: Matrice o hmotnosti 150 mg byly tvořeny předem připravenými plastifikovanými oligoestery a mikronizovaným aciklovirem o koncentraci 4%. Od kaţdého oligoesteru byly připraveny tři vzorky. Do malé kádinky bylo naváţeno asi 1,35 g plastifikovaného oligoesteru, předem roztaveného v horkovzdušné sušárně při 70-80°C. Ke vzorku bylo přidáno vypočtené mnoţství acikloviru (0,0563 g). Matrice se pak homogenizovala kopistkou a do scintilačních lahviček z ní bylo odváţeno po 150 mg tak, aby na dně lahviček vznikl kompaktní disk. Pokud vzorek ztuhl neţ došlo k úplné homogenizaci, byl vloţen na krátký čas opět do horkovzdušné sušárny o teplotě 60°C a homogenizace byla dokončena. Potom byl kaţdý vzorek zalit 15,0 g fosfát citrátového pufru o hodnotě pH 7,0. Lahvičky byly uzavřeny a vloţeny do termostatu o teplotě 37°C. Ve stanovených časových intervalech byly odebírány vzorky disoluční tekutiny a mnoţství uvolněného acikloviru stanoveno spektrofotometricky. Po kaţdém odebrání pufru byly matrice opět zality 15,0 g čistého pufru a vloţeny do termostatu. Disoluční test probíhal, dokud se z bobtnajících a fragmentijících matric neuvolnil všechen aciklovir, nebo dokud se aciklovir nepřestal uvoňovat.
Kalibrační přímka: Ve fosfát citrátovém pufru o pH 7,0 je absorpční maximum ACV při vlnové délce 256 nm a při této vlnové délce byla také měřena absorbance. Bylo připraveno šest roztoků o rostoucí koncentraci acikloviru a změřena absorbance. Z naměřených hodnot byla sestrojena kalibrační přímka, zjištěna její rovnice a hodnota korelačního koeficientu. 30
Tab.č. 5: Absorbance roztoků ACV Koncentrace acikloviru Absorbance c [mg/l] A 1 0,059 5 0,284 10 0,551 15 0,851 20 1,131 25 1,377 Obr.č. 4: Kalibrační přímka 1,6 y = 0,0555x + 0,0062 R2 = 0,9994
1,4 1,2 1 A 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
5
10
15
20
25
30
c[mg/l]
Rovnice kalibrační přímky: y = a·x + b y……..absorbance x……..koncentace ACV [mg/l] a……..směrnice kalibrační přímky b……..absolutní člen R……..korelační koeficient
Stanovení uvolněného acikloviru: Dle vzorce odvozeného z kalibrační přímky byla vypočtena koncentrace uvolněného acikloviru v mg/l (x) . Vypočtená koncentrace (x) byla poté převedena na koncentraci ACV v 15 ml disolučního média (x1). Dále byl vypočten podíl
31
uvolněného ACV v procentech (x%) z celkového mnoţství ACV v matrici a z těchto hodnot byla v průběhu celé liberace počítána kumulativní procenta uvolněného ACV. Rovnice kalibrační přímky: y = 0,0555x + 0,0062 Výpočet uvolněného acikloviru: x=
y 0,0062 0,0555
x1 = x 0,015 D x% =
x2 100 0,04 mn
x…….koncentrace uvolněného acikloviru [mg/l] x1……koncentrace acikloviru v 15 ml disolučního média [mg/l] x%……podíl liberovaného acikloviru [%] D…….ředění vzorku mn…...naváţka matrice [mg] y……..absorbance
32
6 VÝSLEDKY 6.1 TABULKY 6.1.1 DYNAMICKÁ VISKOZITA Tab.č. 6: Dynamická viskozita η při teplotě 50°C
oligoesterů plastifikovaných 20% TEC
RPM 0,5D ot./min η [Pa.s] 0,6 146,00 1 146,00 1,5 146,70 2 147,50 2,5 147,50 3 147,50 4 146,90 5 146,30 6 146,00 10 12 20 30 50 60 průměr 146,71
3D η [Pa.s]
1D η [Pa.s] 131,00 132,50 134,40 134,00 133,80 133,40 133,30 132,50
133,11
2D η [Pa.s]
55,60 56,00 55,80 55,30 55,50 55,40 55,50 55,40 55,13
55,51
161,00 163,30 161,90 161,50 161,70 161,90 161,50 161,00
161,73
33
5D η [Pa.s]
20,60 20,80 20,80 20,81 20,92 20,80 20,63 20,77
8D η [Pa.s]
14,80 14,90 14,80 14,75 14,88 14,75 14,63 14,79
PLGA η [Pa.s] 133,00 133,30 133,80 134,00 133,30 132,80 131,50 130,20
132,73
6.1.2 MĚŘENÍ ADHEZE Tab.č. 7: Adhezivita oligoesteru 0,5D plastifikovaného 20% TEC Měřění č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F max[N] 158,94 186,72 180,72 159,84 167,66 174,27 185,34 161,12 164,36 168,54
ØF max[N]
s[N]
170,75
10,47
F/S[mN/mm2] s/S[mN/mm2]
276,51
16,96
Tab.č. 8: Adhezivita oligoesteru 1D plastifikovaného 20% TEC Měřění č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F max[N] 137,82 143,21 118,30 128,60 140,68 136,34 127,96 127,87 113,91 134,77
ØF max[N]
s[N]
130,95
9,49
34
F/S[mN/mm2] s/S[mN/mm2]
212,05
15,37
Tab.č. 9: Adhezivita oligoesteru 2D plastifikovaného 20% TEC Měřění č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F max[N] 130,74 140,42 131,40 117,05 140,48 112,02 140,95 130,32 140,23 120,52
ØF max[N]
s[N]
130,41
10,67
F/S[mN/mm2] s/S[mN/mm2]
211,19
17,28
Tab.č. 10: Adhezivita oligoesteru 3D plastifikovaného 20% TEC Měřění č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F max[N] 136,73 137,44 139,71 150,46 157,44 150,26 140,93 134,23 135,95 140,54
ØF max[N]
s[N]
142,37
7,68
35
F/S[mN/mm2] s/S[mN/mm2]
230,55
12,44
Tab.č. 11: Adhezivita oligoesteru 5D plastifikovaného 20% TEC Měřění č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F max[N] 119,07 119,25 106,94 100,21 110,02 116,53 106,54 108,05 100,71 106,75
ØF max[N]
s[N]
109,41
6,87
F/S[mN/mm2] s/S[mN/mm2]
177,17
11,13
Tab.č. 12: Adhezivita oligoesteru 8D plastifikovaného 20% TEC Měřění č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F max[N] 95,98 94,84 84,11 71,26 86,26 67,25 79,51 72,11 71,07 79,57
ØF max[N]
s[N]
80,20
10,07
36
F/S[mN/mm2] s/S[mN/mm2]
129,87
16,31
Tab.č. 13: Adhezivita oligoesteru PLGA plastifikovaného 20% TEC Měřění č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
F max[N] 192,61 185,80 189,33 190,67 177,25 181,90 164,96 175,39 162,32 176,95
ØF max[N]
s[N]
179,72
10,40
37
F/S[mN/mm2] s/S[mN/mm2]
291,04
16,84
Obr. 5: Vzor protokolu testu adheze
38
6.1.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU Tab.č. 14: Mnoţství ACV uvolněného z nosiče 0,5D plastifikovaného 20% TEC čas [dny] 0,125
0,25
1
2
3
A
ředění
0,591 0,663 0,664 0,906 0,992 0,925 0,796 0,803 0,805 0,316 0,280 0,279 0,499 0,562 0,397
10 10 10 5 5 5 10 10 10 10 10 10 1 1 1
ACV [mg] 1,581 1,775 1,778 1,216 1,332 1,242 2,135 2,154 2,159 0,837 0,740 0,737 0,133 0,150 0,106
ACV [%] 26,84 29,68 29,14 20,65 22,28 20,35 36,25 36,01 35,39 13,73 12,13 12,09 2,18 2,46 1,73
39
průměr
kumulativní %
28,56
28,56
21,09
49,65
35,89
85,54
12,65
98,19
2,13
100,31
Tab.č. 15: Mnoţství ACV uvolněného z nosiče 1D plastifikovaného 20% TEC čas 0,125 0,25 1 2 3 4 7 10
A
ředění
0,623 0,483 0,511 0,281 0,384 0,555 0,407 0,540 0,539 1,065 0,651 0,852 0,678 0,648 0,519 0,794
10 10 5 5 10 10 5 5 1 1 1 1 10 10 1 1
ACV [mg] 1,667 1,289 0,682 0,371 1,021 1,483 0,542 0,721 0,144 0,286 0,174 0,229 1,816 1,735 0,139 0,213
ACV [%] 28,54 20,93 11,68 6,03 17,48 24,09 8,80 11,72 2,34 4,65 2,83 3,71 29,49 28,18 2,25 3,46
40
průměr
kumulativní %
24,74
24,74
8,86
33,60
20,79
54,38
10,26
64,64
3,49
68,14
3,27
71,41
28,84
100,24
2,86
103,10
Tab.č. 16: Mnoţství ACV uvolněného z nosiče 2D plastifikovaného 20% TEC čas [dny] 0,125
0,25
1
2
3
4
7
10
14
17
21
A
ředění
0,727 0,734 0,648 0,914 0,863 0,828 0,265 0,282 0,342 0,597 0,607 0,561 0,459 0,567 0,391 0,531 0,500 0,640 1,265 0,785 0,743 0,767 0,871 1,151 0,752 1,261 0,902 0,994 0,717 1,110 0,462 0,608 0,662
10 10 10 5 5 5 10 10 10 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1
ACV [mg] 1,948 1,967 1,735 1,227 1,158 1,111 0,699 0,745 0,908 0,319 0,325 0,300 0,122 0,152 0,104 0,142 0,133 0,171 0,340 0,421 0,398 0,206 0,234 0,309 0,403 0,339 0,484 0,267 0,384 0,298 0,123 0,163 0,177
ACV [%] 32,69 32,81 29,08 20,58 19,31 18,62 11,74 12,43 15,22 5,35 5,45 5,03 2,05 2,54 1,74 2,38 2,24 2,87 5,70 7,06 6,68 3,45 3,92 5,19 6,76 5,69 8,12 4,48 6,44 5,00 2,07 2,73 2,97
41
průměr
kumulativní %
31,53
31,53
19,50
51,03
13,82
64,85
5,28
70,13
2,11
72,24
2,50
74,74
6,48
81,22
4,18
85,40
6,85
92,26
5,31
97,57
2,59
100,15
6.2 GRAFY 6.2.1 DYNAMICKÁ VISKOZITA Obr.č. 6: Dynamická viskozita oligoesterů plastifikovaných 20% TEC 180 161,73 160
146,71 133,11
140
132,74
120
η 100 [Pa.s] 80 55,51
60 40
20,77 20
14,79
0 3D
0,5D
1D
PLGA
2D
5D
8D
oligoester
Obr.č.7: Porovnání a 20% TEC
dynamické
viskozity
oligoesterů
oligoester+10%TEC
plastifikovaných
10%39
oligoester+20%TEC
3500,0
3000,0
2896,0 2423,5
2500,0
2000,0
η [Pa.s]
1633,0
1500,0 1137,5 1000,0 419,5
500,0 161,73
146,71
133,11
132,74
55,51
123,9 20,77 75,9 14,79
0,0 3D
0,5D
1D
PLGA
oligoester
42
2D
5D
8D
Obr.č.8: Dynamická viskozita oligoesterů plastifikovaných 20 % TEC v závislosti na stupni větvení 180 3D
160
0,5D
140
1D
PLGA
120 100
η [Pa.s] 80 60
2D
40 5D
20
8D
0 1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
stupeň větvení
Obr.č.9: Dynamická viskozita nosičů plastifikovaných 20 % TEC v závislosti na molární hmotnosti 180 3D
160 0,5D
140
PLGA
1D
120 η 100 [Pa.s] 80 60
2D
40 8D
20
5D
0 0
1000
2000
3000
4000
Mw [g/mol]
43
5000
6000
7000
6.2.2 MĚŘENÍ ADHEZE Obr.č. 10: Porovnání adheze oligoesterů plastifikovaných 20% TEC 350 276,51
300
250
F/S [mN/mm2]
212,05
2D
1D
230,55
177,17
200
150
211,19
291,04
129,87
100
50 0 8D
5D
3D
0,5D
PLGA
oligoester
Obr.č.11: Porovnání adheze oligoesterů plastifikovaných 10% 39 a 20% TEC 10%TEC
20%TEC
400 349,9 350 300
291,04
276,51
250
257,65 212,05
211,19
230,55
F/S 200 [mN/mm 2]
177,17 129,87
150 100
73,21
50 24,26
14,22
0 0,5D
1D
2D
3D oligoester
44
5D
8D
PLGA
Obr.č. 12: Adhezivní síla oligoesterů plastifikovaných 20 % TEC v závislosti na stupni větvení 350 0,5D
300 PLGA
3D
250
2D 200
F/S
1D
2
[mN/mm ]
150
5D
100
8D
50
0 1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
stupeň větvení
Obr.č.13: Adhezivní síla oligoesterů plastifikovaných 20 % TEC v závislosti na molární hmotnosti 350 300 0,5D
PLGA
250 3D 200
F/S
1D 5D
2
[mN/mm ]
2D
150 8D 100 50 0 0
1000
2000
3000
4000
Mw [g/mol]
45
5000
6000
7000
6.2.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU Obr.č. 14: Liberace ACV z nosiče 0,5D plastifikovaného 20% TEC 120
aciklovir [%]
100
80
60
40
20
0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
čas [dny]
Obr.č. 15: Liberace ACV z nosiče 1D plastifikovaného 20% TEC 120
100
aciklovir [%]
80
60
40
20
0 0
2
4
6
čas [dny]
46
8
10
12
Obr.č. 16: Liberace ACV z nosiče 2D plastifikovaného 20% TEC 120
aciklovir [%]
100
80
60
40
20
0 0
5
10
15
20
25
čas [dny]
Obr.č. 17: Porovnání liberace ACV z nosičů 0,5D, 1D, 2D plastifikovaných 20% TEC 0,5D
1D
2D
120
100
aciklovir[%]
80
60
40
20
0 0
5
10
15 čas [dny]
47
20
25
30
Obr.č.18: Lineární fáze liberace acikloviru z nosiče 1D plastifikovaného 20% TEC 120
100
aciklovir [%]
80
60
y = 3,385x + 57,908
40
2
R = 0,9996 20
0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
čas [dny]
Obr.č.19: Lineární fáze liberace acikloviru z nosiče 2D plastifikovaného 20% TEC 120 y = 1,8023x + 67,262 R2 = 0,9957
100
aciklovir [%]
80
60
40
20
0 0
2
4
6
8
10
čas [dny]
48
12
14
16
18
Obr.č.20: Porovnání liberace ACV u nosičů 0,5D plastifikovaných s 10%39 a 20% TEC 0,5D+10%TEC
0,5D+20%TEC
120
100
aciklovir [%]
80
60
40
20
0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
čas [dny]
Obr.č.21: Porovnání liberace ACV u nosičů 1D plastifikovaných s 10%39 a 20% TEC 1D+10%TEC
1D+20%TEC
120
100
aciklovir [%]
80
60
40
20
0 0
2
4
6
8 čas [dny]
49
10
12
14
16
Obr.č. 22: Porovnání liberace ACV u nosičů 2D plastifikovaných s 10%39 a 20% TEC 2D+10%TEC
2D+20%TEC
120
100
aciklovir [%]
80
60
40
20
0 0
5
10
15 čas [dny]
50
20
25
30
7 DISKUSE 7.1 DYNAMICKÁ VISKOZITA Na Brookfieldově digitálním viskozimetru DV-E s adaptérem pro malé mnoţství vzorku byla měřena dynamická viskozita oligoesterů plastifikovaných 20% TEC při teplotě 50°C. Pro měření bylo pouţito vřeteno č.14. Všechny vzorky byly proměřeny při více rychlostech otáčení (hodnoty RPM). S rostoucími rychlostí otáček se dynamická viskozita neměnila (tab.č. 6), proto lze tyto vzorky povaţovat za newtonské systémy, jejichţ dynamická viskozita je konstantní. Nejvyšší dynamická viskozita byla naměřena u oligoesteru 3D a 0,5D. Oligoestery 1D a PLGA mají dynamickou viskozitu shodnou. Dynamická viskozita oligoesteru 2D je asi poloviční a u oligoesterů 5D a 8D je dynamická viskozita niţší o jeden řád (obr.č. 6). Zjištěné hodnoty dynamické viskozity oligoesterů plastifikovaných 20% TEC byly porovnány s hodnotami oligoestrů plastifikovaných 10% TEC.39 Bylo zjištěno, ţe při zvýšení koncentrace plastifikátoru z 10 % na 20 % nastává výrazný pokles dynamické viskozity. Zatímco se hodnoty dynamické viskozity u oligosterů s 10% TEC pohybovaly v rozsahu 76 Pa.s u oligoesteru 8D aţ po 2896 Pa.s u oligoesteru 3D, viskozita oligoesterů při 20 % plastifikaci byla pouze v rozmezí 15 Pa.s aţ 162 Pa.s (obr.č. 7). Testované oligoestery mají odlišný stupeň větvení a molární hmotnost. Mezi stupněm větvení a molární hmotností není lineární závislost, i kdyţ nejvyšší stupeň větvení mají oligoestery 2D a 1D s nejvyšší hodnotou Mw (tab.č.4).40 Nejniţší dynamická viskozita byla zjištěna u oligoesterů s nejniţší molární hmotností a relativně niţším stupněm větvení (obr č. 8 a 9). Stejné korelace byly zjištěny i u oligoesterů plastifikokovaných 10 % TEC. 39
51
7.2 ADHEZE Byla měřena adhezivita oligoesterů plastifikovaných 20% TEC jako síla Fmax potřebná k odtrţení vzorku od substrátu. Tato síla byla přepočtena na velikost adhezivní plochy F/S v mN/mm2. Nejvyšší adhezivita byla naměřena u lineárního oligoesteru PLGA a nejniţší u oligoesteru 8D (obr.č.10). Největší vliv na adhezivitu má koncentrace plastifikátoru. K tomuto zjištění vede porovnání s výsledky diplomové práce Jitky Třešňákové,39 kde byla měřena adheze stejných nosičů palstifikovaných 10 % TEC (obr.č.11). Oligoestery plastifikované 20 % TEC měly adhezivní sílu v rozsahu přibliţně 130 – 290 mN/mm2, nebyly zjištěny ani extrémně nízké, ani extrémně vysoké hodnoty adhezivní síly jako při 10 % plastifikaci. Koncentrace plastifikátoru významně ovlivňuje viskozitu oligoesteru. Koncentrace TEC 10 % je nedostačující pro potřebné sníţení viskozity, a tím zlepšení zpracovatelnosti. Proto např. s oligoestery PLGA a 3D při plastifikaci pouze 10 % TEC nebylo moţno provést test adheze. Zvýšení koncentrace TEC z 10 % na 20 % vedlo k podstatnému sníţení viskozity oligoesterů a vzorky se mohly lépe rozprostřít po modelovém podkladu. Vyšší adhezivní sílu lze tedy vysvětlit na základě teorie smáčení.41 Vliv stupně větvení a molární hmotnosti oligoesterů na adhezivitu nelze jednoznačně konstatovat. Nejvyšší adhezivita byla zjištěna u lineárního oligoesteru PLGA a u
oligoesteru 0,5D (obr.č.12). Molární hmotnosti Mw oligoesterů PLGA
a 0,5D jsou uprostřed hodnot testovaných oligoesterů.
7.3 DISOLUCE ACIKLOVIRU Disoluce acikloviru byla studována u oligoesterů 0,5D, 1D a 2D. Nejrychleji se aciklovir uvolnil z oligoesteru 0,5D, a to za 3 dny. Liberační křivka má vysoký burst efekt. Prvních 50% léčiva se uvolnilo jiţ za 6 hodin (obr.č. 14). Z oligoesteru 1D se aciklovir uvolňoval pomaleji. Za 6 hodin od počátku liberace se uvolnilo 34 % léčiva. Následovalo zpomalení liberace, od 2. dne do 4. dne probíhala lineární fáze liberace, (obr.č. 18). Do 4. dne se uvolnilo 71 % léčiva. Poté došlo ke zrychlení liberace a zbylé mnoţství acikloviru se uvolnilo za 3 dny. Celková doba liberace acikloviru z oligoesteru 1D byla tedy 7 dní. Tomuto průběhu liberace odpovídá liberační křivka esovitého tvaru (obr.č.15). Nejpomaleji se uvolňoval aciklovir z nosiče 2D, a to 21 dní. Počáteční fáze 52
liberace byla rychlá podobně jako u nosiče 0,5D; za 6 hodin se uvolnilo 51 % acikloviru. Odlišný byl další průběh. Liberace se zpomalila a od 2. dne do 17. dne probíhala kinetikou 0. řádu (obr.č.19). Rozdílnou rychlost liberace acikloviru z testovaných oligoesterů shrnuje obr. č.17. Pro porovnání vlivu koncentrace plastifikátoru na liberaci acikloviru byly pouţity výsledky pararelní diplomové práce Jitky Třešňákové.39 Uvolnění léčiva proběhlo velmi podobně, kromě esovité liberační křivky u oligoesteru 1D, coţ by znamenalo, ţe odlišná koncentrace triethylcitrátu nemá na liberaci acikloviru vliv (obr.20-22). Oligoestery 0,5D, 1D a 2D, testované jako nosiče acikloviru, se liší molární hmotností a stupněm větvení (tab.č.4). V pořadí 0,5D - 1D - 2D roste molární hmotnost a stupeň větvení. Oba tyto parametry ovlivňují rychlost liberace acikloviru z matric (obr.č.17). Rychlost liberace klesá s rostoucí molární hmotností nosiče a s rostoucím stupněm větvení.
53
8 ZÁVĚRY Z výsledků experimentální části diplomové práce vyplývají tyto závěry: 1. Testované oligoestery plastifikované 20 % triethylcitrátu jsou newtonské systémy s konstantní hodnotou dynamické viskozity. Pouţitý typ a koncentrace plastifikátoru dostatečně sniţují viskozitu pro to, aby systémy byly dobře zpracovatelné a mohla být měřena jejich adhezivita. 2. Všechny testované oligoestery plastifikované 20 % triethylcitrátu vykazují dobré adhezivní vlastnosti. V rozsahu hodnot molární hmotnosti a stupně větvení testovaných oligoesterů nebyl prokázán jednoznačný vliv těchto parametrů na velikost adhezivní síly. Nejvyšší adhezivita byla zjištěna u lineárního oligoesteru PLGA a větveného oligoesteru 0,5D. 3. Molární hmotnost a stupeň větvení oligoesterových nosičů ovlivňují rychlost liberace acikloviru z matric. Rychlost liberace klesá s rostoucí molární hmotností nosiče a s rostoucím stupněm větvení.
54
9 LITERATURA 1
Haas J., Lehr C. M.: Development in the area of bioadhesive drug elivery systems, Expert Opin. Biol. Ther. 2 (3), 2002, 287-298. 2
Dostálová M., Rabišková M.: Uţívání léků u geriatrických pacientů – nové lékové formy, SPISY LÉKAŘSKÉ FAKULTY MASARYKOVY UNIVERZITY V BRNĚ, Doplňková řada edice Supplement, 1999, 36-38. 3
Ţabka M., Miller R. H., Heldebrand G. E.: Moderní lékové formy ve farmaceutické technologii, SAP – Slovak Academic Press, s. r. o., Bratislava, 2001, 35-46. 4
Yang X., Robinson J. R.: Bioadhesion in Mucosal Drug Delivery, in Biorelated Polymers and Gels, Academic Press, Wisconsin, 1998, 135-159. 5
Woodley J.: Bioadhesion, New posibilities drug administration?, Clin Pharmacokinet, 40 (2), 2001, 77-84. 6
Gandhi R. B., Robinson J. R.: Oral cavity as a site for bioadhesive drug delivery, Advanced drug delivery rewievs, 13, 1994, 43-74. 7
Lehr C. M.: An estimate of turnover time of intestina mucus gel layer in the rat in situ loop, Int. J. Pharm., 70, 1991, 235-240. 8
Marriott C, Gregory N. P.: Mucus physiology and patology, In: Lanaerts V., Gurny, R.: Bioadhesive Drug Delivery Systems. CRC. Press., Florida, 1990, 1-24. 9
Lee J. W., Park J. H., Robinson J. R.: Bioadhesive-based dosage forms: The next generation, Mini-review, J. Pharm. Sci., 89, 2000, 850-861. 10
Vasir J. K., Tambwekar K., Garg S.: Bioadhesive micropheres as a controlled drug delivery systems, Int. J. Pharm., 255, 2003, 13-32. 11
Bjork E., Issakson U., Eman P., Artursson P.: Starch micropheres induce pulsatile delivery of druha and peptides across the epithelial barier by reverzíble separation of the tight junctions, J. Drug Target. 2 (6), 1995, 501-507. 12
Park K., Robinson J. R.: Bioadhesive polymers as platforms for controlled drug delivery: Metod to study bioadhesion, Int. J. Pharm., 19, 1984, 107-127. 13
Langer M. A., Ch'ng H. S., Robinson J. R.: Bioadhesive polymers as platforms for oral controlled drug delivery III: Oral delivery of chlorothiazide using a bioadhesive polymer, J. Pharm. Sci., 74, 1985, 406-411. 14
Ponchel G., Irache J. M.: Specific and non-specific bioadhesive particulate systems
for oral delivery to the gastrointestinal tract, Adv. Drug Del. Rev.,, 34, 1998, 191–219. 15
Duchene D., Ponchel G.: Principle and investigation of the bioadhesion mechanism of solid dosage forms, Biomaterials, 13, 1992, 709-714. 55
16
Pimienta C., Lenaerts V., Cadieux C., Raymond P., Juhasz J., Simard M. A, Jolicoeur C.: Mucoadhesion of hydroxypropylmethacrylate nanoparticles to rat intestinal ileal segments in vitro, Pharm. Res., 7, 1990, 49-53. 17
Chavanpatil M. D., Chaudhari S.: Novel sustained release, swellable and bioadhesive gastroretentive drug delivery system for ofloxacin, Int. J. Pharm., 316, 2006, 86–92. 18
Florence, A. T.: The oral absorption of micro and nanoparticulates: neither exceptional nor unusual, Pharm. Res., 14(3), 1997, 259–266. 19
Maincent P., Sado P., Couvreur P., Devissaguet J. P.: Deposition kinetics and oral bioavailability of vincamine-loaded polyalkyl cyanoacrylate nanoparticles, J. Pharm. Sci., 75, 1986, 955–958. 20
Ammoury N., Fessi H., Devissaguet J. P., Dubrasquet M., Benita S.: Jejunal absorption, pharmacological activity, and pharmacokinetic evaluation of indomethacinloaded poly(D,L-lactide) and poly(isobutyl-cyanoacrylate) nanocapsules in rats, Pharm. Res., 8, 1991, 101–105. 21
Damge C., Michel C., Aprahamian M., Couvreur P., Devissaguet J. P.: Nanocapsules as carriers for oral peptide delivery, J. Control. Release, 13, 1990, 233–239. 22
Damge C., Vonderscher J., Marbach P., Pinget M.: Poly(alkylcyanoacrylate) nanocapsules as a delivery system in the rat for octreotide, a long-acting somatostatin analogue, J. Pharm. Pharmacol., 49, 1997, 949–954. 23
Bonduelle S., Carrier M., Pimienta C., Benoit J. P., Lenaerts V.: Tissue concentration of nanoencapsulated radio labelled cyclosporin following peroral delivery in mice or ophthalmic applications in rabbits, Eur. J. Pharm. Biopharm, 42, 1996, 313–319. 24
Kreuter J.: Peroral administration of nanoparticles, Adv.Drug Del. Rev., 7, 1991, 71-86. 25
O’Hagan D. T.: Intestinal translocation of particulates - implications for drug and antigen delivery, Adv. Drug Del. Rev., 5, 1990, 265–285. 26
Biesa C., Lehra C.-M., Woodleyb J. F.: Lectin-mediated drug targeting: history and applications, Adv. Drug Del. Rev., 56, 2004, 425-435 27
Capon C., Laboisse C. L., Wieruszeski J.-M., Maoret J.-J., Augeron C., Fournet B.: Oligosaccharide structures of mucins secreted by the human colonic cancer line CL.16E, J. Biol. Chem., 267(27), 1992, 19248–19257. 28
Russell-Jones G.J.: Oral drug delivery via the vitamin B12 uptake system, Pharm. Manuf. Int., 1994, 81–82. 29
Bruschi M. L., Osvaldo F.: Oral Bioadhesive Drug Delivery Systems, Drug Dev. Ind. Pharm., 31, 2005, 293–310. 56
30
Shojaei, A. H.: Buccal mucosa as a route for systemic drug delivery: a review, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 1(1), 1998, 15–30. 31
Harris D. H., Robinson J. R.: Drug delivery via the mucous membranes of the oral cavity, J. Pharm. Sci., 81, 1992, 1–10. 32
Vivien-Castioni N., Gurny R., Baehni P., Kaltsatos V.: Solivary fluoride concentrations following applications of bioadhesive tablets and mouth rinses, Eur. J. Pharm. Biopharm., 49, 2000, 27– 33. 33
Langoth N., Kalbe J., Bernkop-Schnürch A.: Development of buccal drug delivery systems based on a thiolated polymer, Int. J. Pharm., 252, 2003, 141–148. 34
Guo J. H., Cooklock K. M.: The effects of backing materials and multilayered systems on the characteristics of bioadhesive buccal patches, J. Pharm. Pharmacol., 48, 1996, 255–257. 35
Peh K. K., Wong C. F.: Polymerics films as vehicle for buccal delivery: swelling, mechanical, and bioadhesive properties, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 2(2), 1999), 53–61. 36
Martin L., Wilson C. G., Koosha F., Uchegbu I. F.: Sustained buccal delivery of the hydrophobic drug denbufylline using physically cross-linked palmitoyl glycol chitosan hydrogels, Eur. J. Pharm. Biopharm., 55, 2003, 35– 45. 37
Vinholis A. H. C., Figueiredo L. C., Marcantonio E., Marcantonio R. A. C., Salvador S. L. S., Goissis G.: Subgingival utilization of a 1% chlorhexidine collagen gel for the treatment of periodontal pockets, A clinical and microbiological study, Brazilian Dental Journal, 12(3), 2001, 209–213. 38
Ikinci G., Senel S., Akincibay H., Kas S., Ercis S., Wilson C. G., Hincal A. A.: Effect of chitosan on a periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis, Int. J. Pharm., 235, 2002, 121– 127. 39
Třešňáková J.: Vlastnosti větvených oligoesterů plastifikovaných 10% triethylcitrátu, Diplomová práce, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, 2009. 40
Podzimek Š.: Charakterizace větvených oligoesterů gelovou permeační chromatografií s on-line rozptylovým fotometrem a viskozimetrem, Synpo Pardubice, 2006, 3. 41
Smart J.D.: The basics and underlying mechanisms of mucoadhesion, Adv. Drug Del. Rev., 57, 2005, 1556-1568
57
