Obsah METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ ...................................................... 5 Selektivní precipitace ..................................................................... 5 Chromatografické metody ............................................................. 6 Afinitní purifikace ....................................................................... 8 Iontově výměnná chromatografie ............................................. 9 Gelová filtrace .......................................................................... 10 Hydrofobní chromatografie ..................................................... 11 Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant ........ 13 Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu ........................ 15 Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou ............ 15 Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu ...................................................... 15 Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování ............ 16 Metody sušení produktů.............................................................. 20 Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů ........... 20 Krystaly makromolekul ............................................................ 20 Speciální část frakcionace biopolymerů HA ................................ 21 Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů – kyselou hydrolýzou ................................................................................ 21 Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením .................. 22 OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL .................... 23 Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC ..................................................................... 23 2
Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod ....................................................................................... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze ...................................... 23 Detekce peptidů a proteinů HPLC ........................................... 24 Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie) ....................................................................... 24 Gelová permeační chromatografie (SEC)................................. 25 Iontově výměnná chromatografie ........................................... 25 Hydrofobní interakční chromatografie – HIC .......................... 26 Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy... 26 Jednorozměrná denaturační elektroforéza ............................. 26 Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek ............ 28 Dvourozměrná gelová elektroforéza ....................................... 28 Izoelektrická fokusace (IEF) ...................................................... 28 Kapilární elektroforéza ............................................................. 29 Volná kapilární elektroforéza ................................................... 29 Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE ...................................................................................... 29 Flow field flow frakcionace (FFFF) ............................................... 30 Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering) ............................................................................ 33 Rozptyl světla ........................................................................... 34 Brownův pohyb ........................................................................ 35 Hydrodynamický poloměr proteinu (Rh) ................................. 36 3
Princip metody DLS .................................................................. 36 Vyjádření výsledků distribuce velikosti ................................... 40 Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic ............. 41 Přístroje pro měření pomocí DLS............................................. 42 Výhody a omezení DLS ............................................................. 43 Ukázka praktické aplikace ........................................................ 46 Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) ................................. 47 Doporučená literatura .................................................................. 50 Internetové zdroje ........................................................................ 51
4
METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ Selektivní precipitace Rozpustnost biomakromolekul ve vodném roztoku je ovlivněna jejich solvatací molekulami vody, která může být ovlivněna změnou hodnoty pH, teploty, iontové síly, přídavkem solí či organických látek rozpustných ve vodě. Kombinací různých srážecích činidel tak byly vytvořeny postupy pro srážení, precipitaci různých skupin makromolekul. Pro úspěšnost precipitace je důležité zvolit nejen vhodné činidlo, ale i vhodnou výslednou koncentraci činidla v precipitovaném vzorku. Změnou koncentrace precipitačního činidla v roztoku se totiž změní specifičnost procesu precipitace. Globulární proteiny, které jsou rozpustné ve vodných roztocích, jsou ve své nativní formě uspořádány tak, že rezidua polárních aminokyselin jsou orientována vně molekuly proteinu, zatímco nepolární vedlejší řetězce směřují do nitra molekuly, a tak nejsou ve styku s vysoce polárním vodným prostředím. Stabilita nativní konformace je dána jednak hydrofobními interakcemi uvnitř molekuly, jednak inter- i intramolekulárními vodíkovými vazbami vně molekuly. Dojde-li k narušení rovnováhy mezi jednotlivými interakcemi, je molekula proteinu denaturována a dochází k precipitaci tohoto proteinu. Tato precipitace může být jak vratná – reverzibilní, tak nevratná – ireverzibilní. Jedna z reverzibilních metod precipitace proteinů je založena na skutečnosti, že nejnižší rozpustnost vykazuje protein ve svém izoelektrickém bodu. Voda je vysoce polární rozpouštědlo, a tudíž se v ní velmi dobře rozpouští látky s elektrickým nábojem. V izoelektrickém bodu jsou kladné i záporné náboje vyrovnány, takže molekula jako celek je bez náboje, což snižuje její rozpustnost ve vodě. Opětovnou změnou pH lze protein opět denaturovat a převést tak zpět do roztoku. Patrně nejpoužívanější metoda srážení proteinů využívá síranu amonného. Velkou výhodou (NH4)2SO4 je možnost jej připravit v dostatečně velkých koncentracích pro srážení takřka všech proteinů, takřka nepatrná produkce tepla při přídavku jeho roztoku, nižší hustota jeho roztoku umožňující odstranění precipitátu centrifugací a v neposlední řadě i skutečnost, že jeho koncentrovaný roztok je bakteriostatický. Vzhledem ke skutečnosti, že je nutné jej použít pro srážení proteinů, které nejsou příliš zředěné, zařazuje se precipitace pomocí (NH4)2SO4 obvykle mezi počáteční kroky při izolaci proteinů. Precipitát lze od roztoku oddělit centrifugací, následně rozpustit ve vhodném pufru a poté oddělit (nh4)2so4 gelovou filtrací či ultrafiltrací. Specifičtější precipitace lze dosáhnou postupným zvyšováním koncentrace (NH4)2SO4, rozdílné proteiny jsou totiž precipitovány při rozdílných koncentracích (NH4)2SO4. Tepelná denaturace naproti tomu představuje ireverzibilní metodu precipitace. Tímto způsobem lze vysrážet poměrně širokou skupinu nežádoucích proteinů, které se
5
následně oddělí centrifugací. Obvykle spočívá zmíněná metoda v zahřívání míchaného roztoku proteinu na vodní lázni na teplotu 90°C. Nukleové kyseliny jsou vůči ireverzibilní precipitaci odolnější než proteiny. Stejně jako proteiny jsou i nukleové kyseliny polární makromolekuly, které tak lze vysrážet změnou pH či přídavkem méně polárních organických rozpouštědel. Nejpoužívanější precipitační metodou používanou pro srážení nukleových kyselin je precipitace alkoholem. Používá se zejména etanol či isopropanol v přítomnosti 0,1 až 0,5 m octanu sodného či draselného o hodnotě pH 5,0. Následkem konformačních změn nukleových kyselin dochází k jejich precipitaci. Při vyšších koncentracích probíhá precipitace kvantitativně i při 25 °c, zatímco při nižších koncentracích nukleových kyselin je pro jejich kvantitativní precipitaci nutná inkubace v mrazu. Pro velmi zředěné roztoky nukleových kyselin lze použít precipitaci pomocí 10% polyethylenglykolu 6000. Jedná se o časově náročnější metodu, která však podobně jako srážení proteinů síranem amonným umožňuje frakční precipitaci. Nukleové kyseliny vyšších molekulových hmotností se totiž sráží již při nižších koncentracích polyethylenglykolu, zatímco nukleové kyseliny s nižší molekulovou hmotností se stále nachází v roztoku.
Chromatografické metody Velmi účinnou separační metodou, která našla široké uplatnění jak při izolaci látek ze směsí, tak při stanovení rozličných látek v široké škále vzorků, je chromatografie. Ta je založena na rozdělení látky mezi dvě nemísitelná prostředí, stacionární fázi ukotvenou na pevném nosiči-matrici a mobilní fázi protékající kolem stacionární fáze. Bylo vyvinuto mnoho chromatografických metod, které se od sebe mnohdy výrazně liší. Mohou být vhodné pro separaci látek nízkomolekulárních i makromolekul. Separaci lze provádět podle rozdílné molekulové hmotnosti, polarity, izoelektrického bodu či dle přítomnosti funkční skupiny či značky, která specificky interaguje se stacionární fází. Podle prostorového uspořádání stacionární fáze dělíme chromatografii na plošnou a sloupcovou. Plošná chromatografie má stacionární fázi uspořádanou v ploše, jedná se buď o tenkovrstvou chromatografii (TLC), u níž je stacionární fáze umístěna na tenké vrstvě, např. Na hliníkové folii, nebo o papírovou chromatografii (PC), kde je stacionární fáze voda adsorbovaná v pórech papíru. Plošná chromatografie je nenáročná na laboratorní provedení, papírovou chromatografii lze provést i s obyčejným savým papírem, ovšem v současné době ztrácí na svém významu. Slouží zejména pro relativně rychlou detekci kontaminantů či drog, např. V moči, a některých reakčních produktů v organické chemii. U sloupcové chromatografie tvoří stacionární fáze náplň kolony nebo tenké kapiláry. Mobilní fáze protéká kolonou nebo kapilárou a unáší s sebou vzorek až na 6
konec kolony. Za kolonou či kapilárou se stacionární fází se nachází detektor, který zaznamená průchod vzorku. Svým významem sloupcová chromatografie výrazně převyšuje chromatografii plošnou. Mobilní fází může být u sloupcové chromatografie plyn, pak hovoříme o plynové chromatografii (GC), nebo kapalina v případě kapalinové chromatografie (LC). V případě plošné chromatografie je mobilní fází kapalina. GC má velký význam zejména v analytické chemii pro separaci plynných a těkavých nízkomolekulárních látek. Příkladem jejího využití je stanovení obsahu alkoholu v krvi. Pro GC se jako nosiče stacionární fáze využívají tenké kapiláry, jejichž délka dosahuje i několika desítek metrů. Naproti tomu LC lze použít pro separaci vysokomolekulárních i nízkomolekulárních látek. Stacionární fáze může být rovněž v tenké kapiláře, ale i v koloně, jejíž vnitřní průměr může dosáhnout i několika cm. Kapalina tvořící mobilní fázi se může pohybovat kolonou buď vlivem gravitace, nebo pomocí pumpy. Použitím pumpy se zvyšuje zpětný tlak stacionární fáze a rychlost průtoku mobilní fáze. Složení mobilní fáze může být při celé separaci konstantní, nebo se může v průběhu separace měnit. V závislosti na tom hovoříme o isokratické, krokové (jednorázová změna) či gradientové (postupná změna mobilní fáze) eluci. Po ukončení eluce je třeba promýt kolonu původní mobilní fází, aby byla připravena pro další použití. Kapalinovou chromatografii je možné rozdělit na mnoho rozmanitých metod.
Tabulka 5.1. Nejběžnější typy kapalinové chromatografie Typ LC
Princip
Adsorpční chromatografie
Adsorpce na povrchu pevné stacionární fáze
Afinitní chromatografie
Selektivní interakce protilátka)
Gelová chromatografie
Zadržování malých molekul jejich vstupem do pórů gelu
analytu se stacionární
fází (např. antigen –
Hydrofobní interakce makromolekul se stacionární fází ve vodném prostředí Iontově výměnná Interakce iontů s opačně nabitými skupinami stacionární fáze (zvlášť chromatografie pro anionty a kationty) Záchyt nepolárních látek nepolárními řetězci stacionární fáze v Reverzní chromatografie polárním organickém prostředí Hydrofobní chromatografie
Důležitou součástí sloupcové chromatografie je detektor. Ten se umisťuje za kolonu a umožňuje detekovat a stanovit látky opouštějící kolonu a určit čas potřebný k jejich průchodu kolonou – eluční čas. V chromatografii se používá mnoho typů detektorů. Nejčastěji se používá spektrofotometr, hmotnostní spektrometr, voltmetr, ampérmetr, vodivostní detektor, fluorescenční detektor a další. Volba správného 7
detektoru je takřka stejně důležitá jako volba správné chromatografické metody. K detektoru bývá připojeno záznamové zařízení, obvykle počítač nebo posuvný zapisovač, které ukládá naměřená data. Jejich grafickým vyjádřením je chromatogram zobrazující závislost signálu detektoru na čase.
Afinitní purifikace Afinitní chromatografie je nejefektivnější chromatografická metoda, přestože není možné ji aplikovat na všechny problémy. V praxi se při purifikacích obvykle jedná o poslední (ne-li jediný) purifikační krok. Využívá biochemicky specifickou interakci mezi dvěma druhy látek. Jedná se např. O dvojici antigen–protilátka, enzym–substrát, enzym– koenzym či protein–specifický ligand. Lze využít i tak vysoce specifickou interakci, jako je interakce komplementárních řetězců nukleových kyselin. Základním předpokladem afinitní chromatografie je schopnost matrice kovalentně navázat ligandy, které se specificky váží na purifikovanou látku. Při purifikaci polymerních produktů z geneticky modifikovaných organismů se často využívá specifická značka určená pouze pro usnadnění purifikace. Příkladem jsou proteiny obsahující na c-konci řetězce šestkrát his, které jsou specificky zachyceny kyselinou nitrilotrioctovou koordinačně spojenou s Ni2+ nebo Co2+. Mnoho postupů je natolik specifických, že lze z buněčného extraktu získat v jediném kroku pomocí afinitní chromatografie požadovanou látku. Některé ligandy a jimi zachycované molekuly jsou uvedeny v Tab. 5.2. Při afinitní chromatografii se využívají dvě mobilní fáze. Jedná se o ekvilibrační a eluční pufr. Ekvilibračním pufrem je kolona promývána před nanesením vzorku, který by měl být rozpuštěn ve stejném či podobném pufru. Po nanesení vzorku je dále na kolonu čerpán ekvilibrační pufr do doby, než dojde k eluci nezachycených látek. Po eluci nezachycených látek dojde k zapojení elučního pufru, slouží k vymytí látek specificky zachycených na koloně. Jeho eluční síla je oproti ekvilibračnímu pufru výrazně vyšší díky obsahu stejného ligandu, který zachycuje purifikovanu látku či jeho analogu. Tento volný ligand kompetuje (soutěží) s ligandem vázaným k matrici o vazbu do vazebného místa zachycené molekuly, a tak ji uvolňuje z vazby s ukotveným ligandem. Jinou možností zvýšení eluční síly bývá změna pH, použití chaotropních solí či organických látek narušujících vazbu ligandu s purifikovanou molekulou. Např. Proteiny s histidinovou značkou lze z kolony s obsahem Ni2+ či Co2+ vymýt pomocí pufru s imidazolem. Změna pH či použití chaotropních solí může vézt k poškození purifikovaných komponent. Existují i protokoly, v nichž se nepoužívá kroková, ale gradientová eluce.
8
Je-li purifikovaná látka vázána na kotvený ligand příliš pevně, bývá prospěšné po aplikaci elučního činidla na kolonu zastavit jeho tok a nechat je chvíli působit. Obvykle se tok zastavuje na 10 minut až 2 hodiny. Afinitní chromatografii lze rovněž použít pro selektivní odstranění vybraných kontaminantů. V tomto případě se vybírá stacionární fáze tak, aby zachytila tuto nečistotu, která je po získání frakce se vzorkem vymyta elučním pufrem dle výše zmíněného principu.
Tabulka 5.2. Některé ligandy používané při afinitní chromatografii Ligand
Zachycované molekuly
Arginin Prothrombin, plasminogen Kyselina nitriloctová v komplexu Co2+ Proteiny s histidinovou značkou či Ni2+ Polymyxin Endotoxin Heparin
Proteiny vázající nukleové kyseliny
Protein A, protein G
Imunoglobin G
5’-AMP
ATP dependentní kinasy, NADP+ dependentní enzymy
Nukleové kyseliny
Komplementární řetězce nukleových kyselin, histony
Lektin
Polysacharidy, glykoproteiny
2’,5’-ADP
NADP+ dependentní enzymy
Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie, nazývaná často též iontoměničovou chromatografií, je založena na interakci iontů vzorku a mobilní fáze s opačně nabitými skupinami ve stacionární fázi. Podle náboje zadržovaných iontů dělíme iontoměniče na anexy a katexy. Anexy zachycují anionty a jejich stacionární fáze tudíž obsahuje kladně nabité skupiny, zatímco katexy zachycují kationty. Díky skutečnosti, že mnoho biomakromolekul nese v nativním stavu náboj, jehož hodnota i znaménko se při změně pH postupně mění, je iontoměničová chromatografie významnou purifikační metodou pro separaci proteinů, polysacharidů a dalších biopolymerů. Tyto polymery totiž obsahují mnoho protonizovatelných skupin, přičemž jejich míra protonizace je závislá na hodnotě pH. Jako nosiče stacionární fáze se využívá mnoho rozličných polymerů. Z přírodních polymerů se jedná o celulosu, dextran či agarosu, mezi syntetické nosiče patří polystyren, polyakrylamid a mnoho dalších. Tyto nosiče jsou derivatizovány nabitými skupinami. Slabé anexy obsahují obvykle primární či sekundární aminoskupinu, silné anexy kvartérní aminoskupinu. Záporný náboj slabých katexů je tvořen karboxylovými 9
skupinami, zatímco u silných katexů se využívá síranová skupina. Slabé katexy potřebují mobilní fázi s pH kolem 4, zatímco slabé anexy s pH kolem 11. Přiblíží-li se pH k neutrální hodnotě, ztrácí tyto katexy i anexy svůj náboj. Naproti tomu silné katexy i anexy je možné použít při širším rozsahu pH. Dostupné jsou ionexy s pracovním rozsahem jedné jednotky i deseti jednotek pH. Před nanesením vzorku je nutno promýt kolonu mobilní fází, která bude použita pro nanášení vzorku a promývání kolony. Hodnota pH mobilní fáze vytékající z kolony musí odpovídat hodnotě mobilní fáze vstupující do kolony. V opačném případě nelze nanést vzorek na kolonu. Eluční síla mobilní fáze závisí na jejím pH a na její iontové síle. V případě změny pH je změna iontové síly způsobena změnou v ionizaci separovaných látek. Slabé kyseliny se v bazickém prostředí vyskytují ve formě aniontu a v kyselém ve formě neutrálních molekul. Podobně je tomu u slabých bází. Při zvýšení iontové síly mobilní fáze se k nabitým skupinám stacionární fáze dostává větší množství iontů, které vzájemně soutěží (kompetují) o možnost iontové vazby s touto skupinou. Mobilní fáze je u iontově výměnné chromatografie buď gradientová, či se skokovým zvýšením eluční síly, jak je tomu u afinitní chromatografie. Gradientová mobilní fáze s postupně rostoucí či klesající hodnotou pH je využívána při dělení látek dle izoelektrického bodu. Sbíráním frakcí mobilní fáze tak můžeme získat separované látky vzorku tak, jak postupně s měnícím se pH ztrácí svůj náboj díky vyrovnání počtu kladně a záporně nabitých skupin. Při volbě podmínek iontově výměnné chromatografie je nutné uvážit mnoho faktorů, které úží možný výběr experimentu. Jedná se o náboj separovaných molekul a jeho velikost. Molekula s jedním záporným nábojem je eluována při nižší koncentraci chloridů v mobilní fázi než molekula se dvěma či třemi náboji. Dále je nutno vzít v úvahu izoelektrický bod – hodnotu pH, při které je celkový náboj molekuly, obsahující kladně i záporně nabité skupiny, nulový. Kladně nabitá molekula s vyšší hodnotou isoelektrického bodu je tudíž eluována při vyšší hodnotě pH.
Gelová filtrace Gelová filtrace umožňuje separovat od sebe látky na základě jejich rozdílné molekulové hmotnosti a je založena na existenci přesně definovaných či různě velkých pórů v částicích gelu. Malé molekuly při průchodu kolem částic gelu vstupují difuzí do zmíněných pórů a jsou tak zadržovány, zatímco velké molekuly se do těchto pórů nedostanou a jsou vylučovány z kolony. Proto se pro gelovou filtraci používá i označení gelová permeační (zadržovací) či exlusní (vylučovací) chromatografie.
10
Gelová filtrace je použitelná zejména pro oddělení nízkomolekulárních látek od látek vysokomolekulárních, např. Pro odsolení roztoků proteinů, separaci makromolekul podle jejich molekulové hmotnosti a určení molekulové hmotnosti makromolekul. V poslední zmiňované funkci ji však stále častěji nahrazuje hmotnostní spektrometrie. Stacionární fází u gelové filtrace je kapalina uvnitř pórů gelu. Ideální nosič stacionární fáze, který vytváří gelové částice, by měl být hydrofilní polymer bez náboje, maximálně inertní a pevný. V praxi se používají především přírodní polymery na bázi agarosy či dextranu. Komerčně dostupné jsou gely s různým stupněm zesíťování polymeru, které zvyšuje jeho pevnost a rovněž určuje velikost pórů gelu. Velikost těchto pórů určuje rozsah velikosti částic, které lze daným gelem od sebe oddělit. Gely se prodávají pod různými komerčními názvy. Jedním z nejpopulárnějších materiálů je Sephadex, dextran zesíťovaný pomocí epichlorhydrinu. Sepharosa je vyráběna z agarosy, polymeru D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Oproti Sephadexu je Sepharosa vhodná i pro dělení větších makromolekul až do molekulové hmotnosti 40,000 kDa, u Sephadexu je to maximálně 750 kDa. Krom materiálu a velikosti pórů se dodávané nosiče liší i velikostí částic, která se pohybuje od 10 do 300 µm. Superdex a Superosa odpovídají svým materiálovým složením Sephadexu, resp. Sepharose. Oproti nim poskytují lepší výsledky, avšak jsou výrazně dražší. Používají se tedy jen v případech, kdy je kladen velký důraz na kvalitu separace. Vzhledem k tomu, že zde nedochází ke specifickým interakcím, ani není potřeba měnit náboj separovaných molekul, používá se isokratická mobilní fáze. Důležité však je, aby mobilní viskozita mobilní fáze nebyla výrazně nižší než viskozita vzorku; doporučuje se, aby byla minimálně poloviční. To vytváří problémy zejména při obsahu glycerolu ve vzorku, a nikoliv v mobilní fázi či při vysoké koncentraci biopolymerů. Gelová filtrace je často používaná analyticky, zejména pro stanovení molekulové hmotnosti nativních proteinů. V tomto případě se experiment provádí nejméně dvakrát. Jednou pro kalibraci, kdy se jako vzorek použije směs standardních proteinů známé molekulové hmotnosti, a minimálně jednou při samotném měření molekulové hmotnosti vzorku. Do grafu se pak zanáší dekadický logaritmus molekulové hmotnosti polymeru na osu x a poměr elučního objemu k mrtvému objemu na osu y. Z regresní přímky se pomocí rovnice Ve/V0 = - a.log Mr + b, ve které jsou a a b jsou empirické konstanty, vypočítá molekulová hmotnost polymeru.
Hydrofobní chromatografie Mnohé molekuly obsahují na svém povrchu nepolární hydrofobní oblasti. Rozdílů mezi nepolárním charakterem molekul se využívá i pro jejich separaci. Nízkomolekulární 11
látky jsou na základě toho separovány adsorpční chromatografií, zatímco pro makromolekuly se používá hydrofobní chromatografie (HIC). Tento typ chromatografie využívá jako nosiče stacionární fáze hydrofilní gely, na nichž jsou navázány nepolární alkylové či arylové skupiny. Jedná se často o methyl, oktyl, oktadecyl či fenyl. Tím je hydrofobní chromatografie shodná s chromatografií na reverzní fázi. Obě metody se však liší stupněm substituce hydrofilního gelu. V případě hydrofilní chromatografie je koncentrace substituovaných skupin v rozmezí od 10 do 50 µmol.ml-1 gelu, u chromatografie na reverzní fázi je substituce přibližně o řád vyšší. Rovněž eluční roztok se u obou chromatografií liší. Pro hydrofobní chromatografii je používán roztok nižší iontové síly a bez organických rozpouštědel typických pro chromatografii na reverzní fázi. Vazba proteinu k matrici závisí na mnoha faktorech. Z vlastností matrice se jedná především o její funkční skupiny a stupeň derivatizace, z vlastností polymerů pak zejména o velikost a charakter hydrofobní části povrchu. Proteiny s větší hydrofobní částí povrchu jsou vázány těsněji než proteiny s menším hydrofobním regionem. Těsnější vazbu k hydrofobním regionům vykazují alkylové substituenty, u kterých se těsnost vazby zvyšuje s délkou řetězce. Těsnější vazby se docílí i použitím matrice s vyšším stupněm derivatizace. Matrice pro hydrofobní chromatografii dosahují velké kapacity záchytu polymerů. Podle typu matrice, mobilní fáze a polymeru se může na 1 g gelu zachytit až 50 mg polymeru. Vznik a pevnost hydrofobních vazeb polymerů k matrici velmi závisí na použité mobilní fázi. Vyšší koncentrace soli zvyšuje pevnost vazby polymerů k matrici. Mimo koncentraci je důležitá i volba konkrétní soli v mobilní fázi. Pro kationty i anionty byla vypracována Hofmeisterova řada iontů:
NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ –
–
–
PO43– > F– ~ SO42– > HPO42– > CH3COO– > Cl– > Br– > NO3 > I > SCN .
Tato řada srovnává ionty podle jejich podpory vazby polymeru k matrici. Obě uvedené řady obsahují jen několik významnějších iontů, ačkoliv byl studován vliv mnoha jiných, které byly rovněž zařazeny do Hofmeisterovy řady. Ionty v levé části řady navíc zvyšují stabilitu proteinů. Obojí je dáno zvýšením organizovanosti molekul vody v okolí iontu, kdy voda obaluje jednotlivé ionty v několika vrstvách. Na průběh hydrofobní chromatografie má vliv i hodnota pH mobilní fáze, avšak vliv změny pH je často nepředvídatelný. Mobilní fází je obvykle pufr s obsahem vhodné soli, často se jedná o fosforečnanový pufr nastavený na pH 7,0 s 1M (NH4)2SO4. Eluce se zajišťuje
12
postupným snižováním koncentrace soli. Často je navíc usnadňována přídavkem organických látek, zejména glycerolu či neionogenních detergentů.
Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant Pro odstranění nízkomolekulárních komponentů, např. Síranu amonného z precipitace proteinů, se používají dvě podobné metody, dialýza a ultrafiltrace. Obě metody jsou založeny na stejném principu. Jedná se o průchod malých molekul přes membránu s póry s přesně definovanou velikostí. Ta určuje, jak velké molekuly jsou membránou zachyceny a jak velké molekuly jsou schopny projít přes membránu. Tato hranice je důležitou charakteristikou membrány, kterou je nutné vzít při volbě membrány v úvahu a je označována jako cut-off value. Její hodnota se udává v kDa a je míněna pro globulární proteiny, které při vyšší molekulové hmotnosti prochází přes membránu jen velmi pomalu, nebo neprochází vůbec. Základní rozdíl mezi oběma metodami spočívá v síle, která pohání transport molekul přes membránu. V případě dialýzy se jedná o prostou difuzi přes membránu, zatímco v případě ultrafiltrace je průchod roztoku přes membránu poháněn vnějším tlakem. Ultrafiltrace je proto rychlejší než dialýza.
Dialýza. Nejjednodušším provedením dialýzy je použití dialyzačního střívka naplněného dialyzovaným roztokem, které se vloží do nádoby s dialyzačním roztokem, do kterého se difuzí přesouvají nízkomolekulární komponenty. Vzhledem k vyšší koncentraci rozpuštěných látek v dialyzovaném roztoku uvnitř střívka může zároveň dojít ke vstupu rozpouštědla do střívka a následnému nárůstu jeho objemu. Proto je nutné plnit střívko jen částečně. Dialyzační roztok by měl obsahovat pufr, který stabilizuje jeho pH na požadované hodnotě. Rychlost difuze lze určit pomocí Fickova zákona. Podle něj záleží na ploše, přes kterou difuze probíhá, koncentračním gradientu a difuzní konstantě závislé na velikosti a tvaru částice. Dialýza je poměrně zdlouhavá metoda, která probíhá obvykle 12 až 24 hodin. Ukončení dialýzy lze detekovat měřením konduktivity dialyzačního roztoku. Dialýzu lze urychlit výměnou dialyzačního roztoku za čistý. Membrány a střívka pro dialýzu se obvykle vyrábí z celulosy a jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí 1 až 50 kDa. Pro dialýzu malých objemů do 1 ml lze použít buď komerčně vyráběné mikrodialyzační komůrky, nebo je možné je vyrobit přímo v laboratoři z ependorfových trubiček odstraněním víčka a překrytím jejich konců dialyzační membránou, kterou je nutné dobře upevnit.
13
Dialýzu lze použít i pro zakoncentrování roztoku makromolekul. V tomto případě se využije polyetylen glykol přidaný do dialyzačního pufru, který postupně nasává vodu a zvětšuje svůj objem. Pro odstranění nízkomolekulárních látek lze kromě dialýzy použít i obdobnou metodu, ultrafiltraci či gelovou filtraci. Ty jsou sice rychlejší, ale rovněž náročnější na laboratorní vybavení a zručnost.
Ultrafiltrace. Ultrafiltrace se ve svém principu podobá dialýze do té míry, že je možné pro ni použít dialyzační střívko umístěné v nádobě připojené k vakuové pumpě. Přesto je výhodnější použít membránu určenou přímo pro ultrafiltraci. Membrána pro ultrafiltraci se skládá ze dvou vrstev. První, obrácená směrem k ultrafiltrovanému roztoku, je tenká a obsahuje póry s přesně definovanou velikostí. Druhá vrstva je širší a obsahuje větší póry, jejichž velikost již nemusí být přesně určena. Při sestavování ultrafiltrační komůrky je důležité dbát na správnou orientaci membrány; strana přivrácená směrem k roztoku bývá obvykle hladší a při pohledu proti světlu se více leskne. V současnosti se vyrábí různé druhy membrán pro ultrafiltraci. Jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí od 0,5 kDa po 1000 kDa (membrána Millipore PCXK). Jednotlivé membrány se od sebe liší i materiálem, ze kterého jsou vyráběny. Je možné zakoupit membránu z acetátu celulosy, regenerované celulosy, hydrofilních polymerů, syntetických polymerů či inertních polymerů. Do pórů membrány jsou samozřejmě tlačeny i molekuly, jejichž hmotnost přesahuje hodnotu cut-off. Menší z nich mohou velmi pomalu projít přes membránu, jiné se však v pórech zapříčí a ucpou je. Aby k tomu nedocházelo, je při každé ultrafiltraci použito magnetické míchadlo. Jedná se o oblý tyčový magnet, který se vlivem otáčení magnetu v míchačce, na kterou je ultrafiltrační komůrka položena, otáčí a zajišťuje tak míchání kapaliny v ultrafiltrační komůrce. Elektromagnetické míchadlo se samozřejmě spolu s míchačkou nevyužívá jen při ultrafiltraci, ale všude tam, kde je třeba zajistit míchání roztoku. Na rozdíl od dialýzy je při ultrafiltraci pro urychlení procesu rozpouštědlo hnáno přes membránu tlakem. Tento tlak může být vytvořen přetlakem inertního plynu, nejčastěji dusíku, v ultrafiltrační komůrce, vakuem v nádobě pro zfiltrovaný roztok či centrifugací. Je-li makromolekulární látka, kterou chceme zahustit či odsolit, odolná vůči oxidaci vzdušným kyslíkem, je možné použít k vytvoření tlaku v komůrce namísto dusíku vzduch. Pro ultrafiltraci prováděnou při centrifugaci se vyrábí zvláštní kyvety pro použití v rotorech s fixním úhlem. Tyto kyvety umožňují v relativně krátké době zahuštění z několika ml i na méně než 100 µl.
14
Je-li účelem ultrafiltrace snížení koncentrace nízkomolekulárních látek v roztoku, přidává se k tomuto roztoku další roztok, který tyto kontaminanty neobsahuje, a tento roztok se zahustí na požadovaný objem. Tím dojde ke snížení koncentrace kontaminantu v koncentrátu. Je-li potřeba výrazné snížení koncentrace kontaminantů, je výhodnější použít opakovanou ultrafiltraci menším objemem než jednu ultrafiltraci menším objemem. Chceme-li například snížit koncentraci kontaminantu v 5 ml roztoku na 1 % původní koncentrace, potřebujeme při jedné ultrafiltraci přidat 495 ml čistého roztoku, zatímco při 2 ultrafiltracích použijeme vždy jen 45 ml čistého roztoku a při čtyřech ultrafiltracích jen po 11 ml roztoku. Spotřeba roztoku tak při dosažení stejného výsledku činí jen 18, resp. 9 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Výhodnost opakované ultrafiltrace stoupá s rostoucím poměrem mezi původní a požadovanou koncentrací ultrafiltrovaného roztoku. Bude-li třeba snížit koncentraci nízkomolekulárních kontaminant na setinu procenta, bude spotřeba promývacího roztoku při 2, resp. 4 ultrafiltracích činit jen 2, resp. 0,4 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci.
Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou Získání rekombinantního proteinu v aktivní a vysoce čisté formě je jedním ze základních metodik biotechnologického výzkumu. Při přípravě těchto proteinů se využívá fúzních proteinů, jejichž součástí je sekvence aminokyselin, která umožňuje jejich purifikaci. Tyto sekvence však mohou omezovat biologickou aktivitu sledovaného proteinu. Odštěpení těchto sekvencí pomocí specifických endoproteáz, enzymů štěpících určitou aminokyselinovou sekvenci, je často nezbytné pro další využití cílového proteinu. Specifické endoproteasy minimalizují nechtěné nespecifické štěpení, které se vyskytuje při štěpení fúzních proteinů chemickými látkami (bromkyan, hydroxylamin, pH). Příkladem specifických endoproteas je enterokinasa rozpoznávající aminosekvenci Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓X-, dále pak prolin, specifické endoproteasu hydrolyzující peptidy, endoproteáza AspN selektivně štěpící peptidové vazby mezi N-koncem a kyselinou aspartámovou, faktor Xa štěpící sekvenci Ile-Glu(nebo Asp)-Gly-Arg↓ nebo trombin štěpící sekvenci Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser.
Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu Purifikace fúzních a následně rekombinantních proteinů je proces zahrnující několik na sebe navazujících chromatografických purifikací, které musí být vždy optimalizovány. Pro zjednodušení tohoto procesu byla vyvinuta jednokroková afinitní purifikace fúzního proteinu, tedy cílového proteinu značeného afinitní koncovkou připojenou na n- nebo c- konec rekombinantního proteinu. Jako afinitní koncovka jsou 15
úspěšně používány malé peptidy, např. Poly-His, poly-Arg, c.myc, Flag, nebo velké peptidy, např. Glutation s transferasa, doména vážící chitin. Abychom zajistili biologickou aktivitu rekombinantního proteinu, musíme tuto koncovku odstranit před jeho samotným využitím. Z tohoto důvodu je mezi rekombinantní protein a koncovku umístěna krátká aminokyselinová sekvence, která je rozpoznávána specifickou endoproteázou. Tento způsob přípravy rekombinantního proteinu má několik omezení: 1. Odseparování proteinu od fúzní koncovky a použité endoproteasy vyžaduje další purifikační krok. 2. Použité proteasy nejsou zcela specifické a mohou částečně štěpit cílový protein. 3. Štěpené místo může být nepřístupné pro endoproteasu. 4. Štěpení vyžaduje dlouhý reakční čas a je drahé. K překonání uvedených omezení byl vyvinut samoštěpící systém, kdy je tzv. Self processing modul umístěn mezi cílový protein a afinitní kotvou. Po navázání fúzního proteinu na kolonu a odmytí všech kontaminujících nečistot je štěpící aktivita samoštěpícího modulu aktivována malou molekulou a vyúsťuje v uvolnění rekombinantního proteinu s tím, že afinitní koncovka včetně samoštěpící modulu zůstává na koloně. Vhodný samoštěpící modul splňuje následující podmínky: 1. Štěpí pouze vazbu mezi cílovým proteinem a tímto modulem. 2. Není aktivován in vivo, pouze po cílené indukci in vitro.
Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování Přirozeně produkované proteiny jsou v buňce bezprostředně po translaci skládány do své nativní struktury. Ta je však v mnoha případech heterologní exprese (například eukaryontní proteiny exprimované v mikroorganismech) či po denaturační purifikaci narušena. Nesprávně složené proteiny vytváří v bakterii (pro nás nejdůležitější je E. coli) nerozpustné agregáty, tzv. Inkluzní tělíska. Ve formě inkluzních tělísek se tak vyskytují až tři čtvrtiny proteinů biotechnologicky exprimovaných v E. coli. Za stabilitu nativní konformace i za vznik inkluzních tělísek z nesprávně složených proteinů a jejich agregátů jsou odpovědny stejné typy interakcí. Jedná se o hydrofobní interakce mezi nepolárními vedlejšími řetězci aminokyselin uvnitř proteinu či inkluzního tělíska, iontové interakce a kovalentní či vodíkové vazby. Důvod vzniku inkluzních tělísek dosud není plně objasněn, ale předpokládá se, že proteiny jsou exprimovány ve větším množství, než je kapacita bakteriální buňky pro jejich správné skládání. Z toho vyplývají možnosti, jak se tvorbě inkluzních tělísek vyhnout. Často je účinné snížení teploty pro kultivaci exprimujících buněk z 37ºC na pokojovou teplotu a patřičné prodloužení doby exprese či použití lowcopy expresního plasmidu. Náročnější metodou je koexprese chaperonů potřebných pro skládání proteinu do správné konformace (u E. coli hlavně molekuly GroEl a GroEs). V některých případech se osvědčil krátký tepelný šok (42°C), po kterém dochází v exprimujících buňkách k přechodnému zvýšení exprese proteinů tepelného šoku zvyšujících stabilitu nascentních proteinů. Příznivý vliv na rozpustnost proteinů může mít 16
také typ připojené značky (Tagu). Fúze s doménovými nebo proteinovými značkami (celulose binding domains, glutathione s-transferase tag (GST), maltose-binding protein (MBP), thioredoxin (TRXA), transcription termination anti-termination factor (NUSA), protein disulfide isomerase i) často zvyšuje rozpustnost a stabilitu rekombinantních proteinů. Navíc některé značky jsou s výhodou použitelné pro afinitní purifikaci. Kvůli své velikosti ale pro většinu aplikací musejí být z proteinu po purifikaci odstraněny. V současné době je také možno použít speciální kmeny E. coli geneticky upravené pro expresi eukaryotických proteinů jako je kmen RossetaTM nesoucí geny pro tRNA rozeznávající kodony vzácné v E. coli, kmen OrigamiTM mutovaný v genech pro thioredoxin reduktasu a glutathion reduktasu umožňující tak tvorbu disulfidických můstků v cytoplasmě nebo kmen Rrosseta-GamiTM kombinující obě tyto vlastnosti.
Obrázek 5.1. Inkluzní tělíska v elektronové mikroskopii
Inkluzní tělíska (označená šipkami) u kultury E. coli. (převzato z www stránek Working group downstream processing at the Department of biotechnology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Vienna, Austria).
Z inkluzních tělísek je možné získat funkční a správně složený protein a to často ve vyšší čistotě a koncentraci, než jakou můžeme dosáhnout při expresi proteinu za podmínek, kdy se inkluzní tělíska netvoří. Postup, který umožňuje převést protein
17
z inkluzních tělísek do nativní plně funkční podoby se nazývá refoldování. Jelikož není k dispozici univerzální refoldovací pufr a výsledek refoldování je poměrně nejistý, využívá se při produkci proteinů jen omezeně. Ačkoliv je refoldování poměrně levné a rychlé, mnoho pracovníků při expresi proteinu v nerozpustné formě volí změnu expresního systému. V současnosti je možno z inkluzních tělísek refoldovat více než polovinu proteinů. Pro ověření správné konformace získaného proteinu je třeba mít k dispozici nástroj potvrzující, že produkt je refoldování převeden do nativní formy. Je možno využít: - stanovení enzymové aktivity - ověření imunogenity experimentální vakcinací - stanovením reaktivity s protilátkami proti konformačním epitopům - ověření vazby na receptor nebo ligand - použití spektroskopických metod
Obrázek 5.2. Schéma purifikace proteinu z inkluzních tělísek
Inkluzní tělíska
Denaturace a solubilizace (8M Urea, 6M Guanidin hydrochlorid, Mercaptoethanol, Mercaptoethanol, detergenty) detergenty)
Purifikace za denaturačních podmínek (afinitní chromatografie)
Čistý denaturovaný Čistý denaturovaný solubilní solubilní protein protein
Renaturace
18
Čím více je o daném proteinu známo, tím větší je pravděpodobnost úspěchu. Postup pro refoldování některých proteinů lze nalézt v databázích refoldování, jako je např. Refold, který je k dispozici na internetových stránkách melbournské univerzity monash (http://clims.med.monash.edu.au/). Inkluzní tělíska lze získat z buněk jejich lyzováním, centrifugací a promytím pelety roztokem tritonu x-100 nebo deoxycholátu. Rozpuštění (solubilizace) inkluzních tělísek vyžaduje narušení interakcí, které se podílejí na jejich vzniku a stabilitě. Toho je možné dosáhnout přídavkem chaotropních činidel (8M močovina, 8M hydrochlorid guanidinu apod.) Či detergentů (sarkosyl, SDS apod.) A redukčních činidel (2merkatoethanol nebo dithiotreitol). Rychlejší a účinnější solubilizace se dosáhne použitím hydrochloridu guanidia, zatímco močovina je výhodnější při nanášení na gel pro SDSPAGE elektroforézu. Proto se v mnoha protokolech v průběhu purifikace přechází z hydrochloridu guanidinu na močovinu, což může být provedeno např. při chromatografické purifikaci, kdy je na kolonu nanesen vzorek v roztoku hydrochloridu guanidinu, ale eluční pufr obsahuje močovinu. Samotné renaturaci často předchází purifikace denaturovaného proteinu. Nejvýhodnější je použití afinitní chromatografie v případě, že obsahuje polyhistidinovou značku, naopak problematické může být použití hydrofobní či iontoměničové chromatografie. Při renaturaci jsou solubilizační činidla podporuje správné složení proteinu do aktivní proteinu, tj. Má pokud možno fyziologické pH správně složen, může být obvykle pro další použití
odstraněna a nahrazena pufrem, jenž formy a umožňuje následné použití a osmotický tlak. Je-li protein jednou rozpuštěn v různých pufrech.
Jedna z prvních metod refoldování v roztoku využívala dialýzu. Protein v dialyzačním střívku je ve více krocích dialyzován za použití pufrů, které se svým složením postupně přibližují finálnímu refoldovacímu pufru. Při průtokové metodě se složení pufru nemění skokově, ale plynulým gradientem. Tato metoda vyžaduje desítky hodin a řádově litry pufrů. Nejdynamičtěji se rozvíjející metodou refoldování je rychlá diluční metoda, která je při nulových či nízkých zkušenostech s refoldováním nejvýhodnější. Protein se postupně po malých dávkách přidává do nadbytku nativního pufru za stálého míchání.. Jsou-li podmínky ideální, protein se po zředění v průběhu několika sekund správně složí do nativní konformace. Odstranění solubilizačních činidel a jejich nahrazení nativním pufrem může být také provedeno přímo na koloně při afinitní purifikaci, kdy eluován je již refoldovaný protein.
19
Do renaturačních pufrů se často přidávají aditiva, snižující agregaci proteinů a/nebo usnadňující tvorbu disulfidických vazeb. Patři mezi ně hlavně arginin (0,5 – 1m), glycerol, oxidovaný a redukovaný glutathion, dithiotreitol, polyethylen glykol, detergenty, edta atd. Efektivita aditiv je jen obtížně predikovatelná a jejich účinnost je nutno ověřovat empiricky. Je také možno zakoupit komerční „refoldovací kity“ obsahující různé koncentrace a poměry aditiv, které mohou poskytnout za spotřeby minima vzorku cenné informace pro refolding ve větším měřítku.
Metody sušení produktů Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů Proteiny jsou amfifilní molekuly, tedy molekuly mající jak hydrofobní, tak hydrofilní skupiny. Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích úzce souvisí s jejich aminokyselinovým složením a jejich solvatačním obalem, tj. Vrstvou molekul vody a iontů, které obalují jejich molekuly. Příčinnou solvatačního obalu jsou elektrostatické síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem ionizovaných skupin biopolymeru – dochází ke snížení interakce nabitých skupin biopolymeru mezi sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším přídavkem neutrální soli se snižuje tloušťka solvatačního obalu a efektivní koncentrace vody, a tím se snižuje i rozpustnost proteinu. Charakter závislosti rozpustnosti na koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i typem soli a hodnotou pH, nejnižší je rozpustnost v izoelektrickém bodě. Při frakcionaci organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou (methanol, ethanol, aceton) se využívá rozdílná rozpustnost proteinu v těchto rozpouštědlech a ve vodě. Zvyšováním koncentrace organického rozpouštědla se zmenšuje i solvatační obal kolem molekul proteinu, což nakonec vede k jejich vysrážení. Frakcionace organickými rozpouštědly se může kombinovat se změnami koncentrace solí, pH a teploty. Proteiny i nukleové kyseliny jsou vysoce senzitivní, nepatrná změna některé z podmínek může způsobit jejich denaturaci, degradaci nebo změnu vlastností, které jsou nutné pro úspěšnou krystalizaci. Z tohoto důvodu musí být proteiny v hydratované formě udržovány při konstantním pH a teplotě.
Krystaly makromolekul Obsahují průměrně 50 % rozpouštědla, většinou mají charakter gelu s mnoha intersticiálními prostory, kterými může proudit rozpouštědlo nebo difundovat malé 20
molekuly. Mřížkové interakce (solné můstky, vodíkové vazby, hydrofobní interakce) udržují integritu krystalu a vysvětlují rozdíly mezi vlastnostmi a schopností krystalizace u malých molekul a biomakromolekul. Vysoká neuspořádanost, gelový charakter, vysoká senzitivita na změny teploty, pH, druh rozpouštědla či iontovou sílu jsou hlavní příčinou slabých difrakčních vlastností krystalů makromolekul. Krystaly jsou křehké, slabým tlakem se rozpadají, na vzduchu hydratují, vykazují slabé optické vlastnosti. V průběhu expozice radiačního záření dochází k silnému poškození krystalů, proto je nutné provádět měření na difraktometrech s plošným detektorem, resp. Na vysokofrekvenčných zdrojích rentegenového záření, tzv. synchrotronech. Krystaly biologických makromolekul jsou při laboratorní teplotě vysoce citlivé k rentgenovým paprskům a často podléhají radiačnímu poškození, zejména při použití synchrotronového záření s vysokou intenzitou. Většinou je toto poškození tak rychlé, že k nasnímání nezbytného množství difrakčních dat je potřeba několika různých krystalů a někdy dokonce není možné měření provést. V současné době se používá metoda kryokrystalografie, tedy měření difrakce za velmi nízkých teplot (100 °K).
Speciální část frakcionace biopolymerů HA Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů – kyselou hydrolýzou Biomakromolekuly jsou složeny z menších molekul, které se v organismech vyskytují i samostatně. Mezi těmito molekulami se odštěpením vytváří vazba, což umožňuje tvorbu dlouhých řetězců těchto molekul a tvorbu makromolekulárních látek. Jedná se např. O peptidovou vazbu mezi aminokyselinami v peptidech a proteinech či glykosidovou vazbu mezi monosacharidovými jednotkami v oligosacharidech a polysacharidech. Za určitých podmínek lze tuto vazbu dodáním molekuly vody opětovně rozštěpit. Tato hydrolytická reakce může být specifická, když dochází ke štěpení pouze konkrétních vazeb mezi podjednotkami např. za konkrétní aminokyselinou v proteinu, nebo nespecifická, když je štěpena vazba mezi libovolnými monomerními jednotkami. Polysacharidy je možné štěpit více metodami. Velmi často je využívána enzymatická hydrolýza. Ta je katalyzována enzymy označovanými glykosidasy (EC 3.2.x.x) ze třídy hydrolas. Patrně nejznámější glykosidasou je ptyalin ze slinných žláz – α-amylasa (EC 3.2.1.1), která štěpí škrob. Další možností štěpení polysacharidů je využití kyselé hydrolýzy. Její postup se pro různé polysacharidy liší, v závislosti na rozpustnosti polysacharidu může být heterogenní nebo homogenní. Základním principem je vazba protonu na kyslík glykosidové vazby. Ta je následována nukleofilním atakem molekuly vody na sousední uhlík a substitucí původního kyslíku. 21
Kyselinu hyaluronovou lze hydrolyzovat např. V 0,4 m HCl, ke které byl pro stabilizaci pH na hodnotě 1,44 přidán ekvimolární roztok KCl, KH2PO4, tetraboritanu sodného, tris-(hydroxyl-methyl)-aminoethanu a kyseliny citronové. Reakce probíhá při teplotě 60°C několik dní. Molekula obsahuje dva uhlíky náchylné k hydrolýze, jedná se o uhlíky C1 a C4. V případě uhlíku hydrolýzy u uhlíku C1 existují dva rozdílné mechanismy. Proton může atakovat nejen glykosidovou vazbu, ale i heterocyklický kyslík cukerné kostry. Kyselina alginová je podobně jako celulosa hydrolyzována v 85% H3PO4 v poměru 18,8 ml kyseliny na 1 g polysacharidu. Jedná se o heterogenní reakci, probíhající za laboratorní teploty po dobu několika dnů. Produkt se získá filtrací, přičemž polysacharidy o vyšší molekulové hmotnosti jsou zachyceny filtrem, produkty nižší molekulové hmotnosti je možné vysrážet vodou či methanolem a opět oddělit filtrací. Pro hydrolýzu síranových polysacharidů (karagenany, heparin, síranové estery dextranu) při teplotě 55 °c je možné použít pufr sestávající z 12 mM HCl a 8 mM LiCl o hodnotě pH 2,0.
Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením Výchozí složkou pro přípravu oligosacharidů jsou polysacharidy. Přípravu je možné provádět kyselou hydrolýzou (pH 4), kdy účinnost hydrolýzy je sledována pomocí metody SEC-MALS. Po skončení kyselé hydrolýzy roztok zneutralizujeme NaOH a následně zbavíme připravené oligosacharidy nízkomolekulárních nečistot pomocí ultrafiltrace. Tuto metodu lze modifikovat použitím enzymů endoglykosidas, které štěpí použitý polysacharid v kyselém prostředí. Příkladem endoglykosidasy je například Endoβ-N-acetylhexosaminidasa, která štěpí GalNAc-Glc vazby v polysacharidech. Dalším příkladem je Endo-β-glukuronidasa, která štěpí Glc–GalNAc vazby.
22
OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je nezbytný nástroj pro purifikaci a charakterizaci makromolekul. Výběr chromatografické metody je spojen s typem sledované molekuly a také s cílem výzkumu. Všechny uvedené chromatografické metody mohou být prováděny jako izokratická nebo gradientová eluce v kvalitativních nebo kvantitativních analýzách. V současné době je používáno 8 základních modelů HPLC pro analýzu a purifikaci peptidů a proteinů. Tyto metody zahrnují gelovou permeační chromatografii též nazývanou vylučovací chromatografie (HP-SEC), iontově výměnnou chromatografii (HP-IEX), chromatografii na normálních fázích (HP-NPC), chromatografii na reverzních fázích (RP-HPLC), hydrofobní interakční chromatografie (HP-HIC), hydrofilní interakční chromatografii (HP-HILIC), chelatační afinitní chromatografii (HP-IMAC), a bioafinitní chromatografii (HP-BAC).
Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod Chemická organizace a složená struktura aminokyselinového řetězce jsou základní vlastnosti, které určují způsob a typ chromatografické separace. Chromatografická separace úzce souvisí se strukturou a chemickými vlastnostmi postraních řetězců jednotlivých aminokyselin. Chemická diversita proteinů je navíc zvětšována posttranslačními modifikacemi s karbohydráty a lipidy. Polární postranní řetězce aminokyselin jsou rozděleny do tří skupin – bez náboje, s pozitivním nábojem nebo též bazické a s negativním nábojem neboli kyselé. Peptidy a proteiny obsahují různé množství ionizovatelných bazických a kyselých skupin. V závislosti na těchto vlastnostech má každý peptid a protein charakteristický izoelektrický bod, jehož hodnota se odvíjí od typu použitého rozpouštědla (jeho pH, složení a teploty). Zvláštní skupinu tvoří cyklické peptidy bez ionizovatelných postraních řetězců, které mají nulový náboj. Množství a rozložení nabitých skupin bude ovlivňovat polarizaci a ionizaci peptidů a proteinů. Tyto faktory určují výběr optimálních separačních podmínek pro rozdělení peptidů a proteinových směsí. Tyto informace jsou přímým vodítkem pro zvolení typu eluentu a uspořádání HPLC.
Parametry mobilní a stacionární fáze Parametry mobilní a stacionární fáze přímo ovlivňují vlastnosti polypeptidů nebo proteinů v průběhu kapalinových chromatografických separací. Ve vodných roztocích 23
dochází k internalizaci hydrofobních reziduí, a tím k stabilizaci struktury, což je základní předpoklad pro chromatografické separace. Určení proteinových struktur včetně autoagregací je nezbytné pro správnou interpretaci výsledků získaných HPLC. Kritickým faktorem pro selekci HPLC je výběr experimentálních podmínek, které ovlivní konformační stav biomakromolekul. Konformační stabilita proteinů může být ovlivněna mnoha způsoby (mobilní a stacionární fází, teplotou), v mnoha případech pak integrovanou experimentální a detekční strategií. Nejčastěji jsou používány: 1H 2dimensionální NMR, infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací (FTIR), hmotnostní spektrometrie s elektrosprejem (ESI-MS), cirkulární dischroismus, optická rotační disperze – které jsou nutné k určení nadstruktur polypeptidového řetězce v roztoku nebo v přítomnosti specifických ligandů.
Detekce peptidů a proteinů HPLC UV detekce je nejpoužívanější metodou pro detekci peptidů a proteinů v HPLC, jelikož peptidové vazby absorbují v ultrafialové (UV) oblasti spektra (205 to 215 nm). Aromatické aminokyseliny absorbují v daleké UV oblasti nad 250 nm. Znalost uv spektra a částečně extinkčních koeficientů nepřekrývajících se absorpčních minim těchto aminokyselin umožňuje UV -diodová detekce (DAD). Znalost relativní UV/VIS absorbance peptidů a proteinů je nezbytná pro výběr správné detekční vlnové délky v RPHPLC a v dalších HPLC módech. Společné použití 215 nm jako preferované vlnové délky pro většinu analytických reverzních fází s peptidy nebo proteiny je dobrým kompromisem mezi detekcí senzitivity a potenciální detekcí interference způsobené absorpcí pufru. Nicméně vlnové délky mezi 230 a 280 nm jsou často používané v preparativních aplikacích, kde použití více senzitivní detekce může vyústit v přehlcení detektoru.
Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie) Podstatou metod založených na afinitní interakci je tvorba stabilního, specifického komplexu mezi ligandem a bílkovinou (biologicky aktivní látkou a protilátkou). Ligandem může být látka vysokomolekulární i nízkomolekulární povahy. Afinitní interakci představuje soubor různých interakcí –polárních, elektrostatických, hydrofobních i Van der Waalsových. Intenzita afinitní interakce mezi bílkovinou a ligandem může být vyjádřena pomocí disociační konstanty KD. Hodnota disociační konstanty by se měla pohybovat zhruba v rozmezí 10-8 až 10-4 mol.L-1 . Nejčastěji využívané afinitní páry protein-ligand uvádí následující přehled: Enzym – substrát Enzym –inhibitor 24
Protilátka –antigen Lektin –sacharid Avidin –biotin Lecithin –glykoprotein Vazebný protein –hormon Afinitní chromatografie je založena na interakci mezi bílkovinou a ligandem imobilizovaným na chromatografickém sorbentu. Experimenty lze provádět v režimu HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Používaný sorbent bývá umístěn v chromatografické koloně nebo je přímo přidán do roztoku vzorku. Při chromatografické analýze se obvykle nejprve vymyjí balastní bílkoviny a následovně je eluována požadovaná purifikovaná bílkovina. Afinitní chromatografie je vysoce selektivní metodou, umožňuje separovat velice složité směsi bílkovin. Nevýhodou afinitní chromatografie bývá nízká kapacita a vysoká cena afinitních sorbentů
Gelová permeační chromatografie (SEC) Metoda je založena na nerovnovážném ději – na sítovém efektu. Separace je zde závislá na velikosti a tvaru částic analyzované látky a stacionární fáze. Mobilní fáze pouze unáší analyty kolonou, separačního procesu se přímo neúčastní. Velké molekuly (makromolekuly) nepronikají do pórů gelu a elují se jako první (tM). Malé molekuly pronikají do pórů gelu, jejich pohyb kolonou se zpomaluje. Experimenty lze provádět v režimu HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Vylučovací kolony mají omezenou kapacitu, používají se dlouhé kolony. Vylučovací limit = velikost částic, které již nebudou pronikat do pórů a nebudou separovány na vylučovací koloně. Agarosové a dextranové gely se nehodí pro HPLC, neboť nevydrží vysoké tlaky. Většinou se jako gel používají organické polymery (kopolymer styren + divinylbenzen). Vhodné je též použití porézních rigidních skel a silikagelu. Mobilní fáze musí rozpouštět analyty, nesmí reagovat se soluty ani se stacionární fází, musí smáčet povrch stacionární fáze a být kompatibilní s detektorem. Často používanou mobilní fází je voda a vodné roztoky pufrů.
Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie probíhá na iontoměničích. Je založena na silných elektrostatických silách mezi ionizovanými funkčními skupinami měniče a ionty v mobilní fázi. Při technice iontové výměny jde o separaci iontů, proto je vždy používána vodná mobilní fáze. Stacionární fáze (iontoměnič , ionex) je zpravidla makromolekulární matrice obsahující kyselou nebo bazickou funkční skupinu. Katexy jsou iontoměniče s 25
kyselou funkční skupinou (sulfo-kyselina, karboxylová kyselina) nesoucí záporný náboj, anex obsahuje bazickou funkční skupinu (aminoskupinu) a je nositelem kladného náboje. Ion obsažený v ionexu bývá vyměněn za ion obsažený v mobilní fázi nebo ve vzorku a na principu soutěžení ionexu o tyto ionty dochází k separaci. Podobně probíhá také ligandová výměna, kdy na iontoměniči, obvykle katexu, je zachycen iontovou výměnou vhodný kov. Na takto upravenou kolonu se přivádí mobilní fáze obsahující látku schopnou vytvářet s vázaným kovem iontovou vazbu.
Hydrofobní interakční chromatografie – HIC Na hydrofobní interakční chromatografii může být pohlíženo jako na nástavbu reverzní chromatografie s vodnými mobilními fázemi bez přídavků organických rozpouštědel. Retence solutů je ovlivňována přídavkem organických nebo anorganických solí do vody. Chromatografie HIC byla primárně použita pro separaci proteinů, protože v přítomnosti organických rozpouštědel v mobilní fázi vede často k denaturaci proteinů a navíc zůstává zachována biologická aktivita proteinů. K separaci proteinů se namísto isokratické eluce používá eluce gradientová, a to gradientová eluce se snižující se iontovou sílou mobilní fáze (opak iontové chromatografie). HIC se používá především k separaci proteinů a velkých peptidů. Kapacita HIC je srovnatelná s kapacitou chromatografie GPC, ale množství dávkovaného vzorku je příliš komplikované. Je to dáno tzv. vysolovacím efektem, kdy je rozpustnost proteinů ve vysoce koncentrovaných solích omezena. Objem nástřiku není příliš velký a vzorek se rozpouští přímo v primárním pufru, který se nastřikuje na kolonu. Je-li vzorek rozpustný ve vodě nebo slabém pufru, pak se mohou na kolonu dávkovat pouze velmi malé objemy vzorku, protože voda je v HIC velmi silnou mobilní fází. Na druhé straně však může mít přídavek soli do solventu vliv na rozpustnost proteinu a může docházet k jeho vysrážení. Koncentrace soli ve vzorku musí být proto optimalizována a má za následek omezení HIC k rozšíření v preparativní chromatografii. Dalším problémem aplikace HIC je použití právě vysoce koncentrovaných pufrovaných mobilních fází, což má za následek vysoké nároky na použitou instrumentaci HPLC (čerpadla, nástřiková zařízení).
Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy Jednorozměrná denaturační elektroforéza Je používána k separaci směsi proteinů (např. z buněk, subcelulárních extraktů, frakcí izolovaných na koloně, imunoprecipitátů), k výzkumu podjednotkových složení a k
26
verifikaci homogenity proteinových vzorků. V polyakrylamidové gelové elektroforéze (PAGE) migrují proteiny v elektrickém poli přes póry v matrici polyakrylamidového gelu. Velikost pórů gelového síta vzrůstá s klesající koncentrací akrylamidu. Kombinace velikosti pórů a proteinového náboje, velikosti a tvaru determinuje migraci daného proteinu. Za standardní elektroforézu je považována denaturační elektroforéza v přítomnosti lauryl síranu sodného (SDS). Tato elektroforéza je prováděna na vertikálních gelech o různých rozměrech. Nejčastěji jsou používány minigely (6x8 cm). Však díky své malé velikosti mají nízké rozlišení. Používání minigelů je však levnější a rychlejší. Jednorozměrová gelová elektroforéza nám poskytuje informace o proteinech, jejich molekulové velikosti a čistotě, taktéž o podjednotkovém složení glykozylaci. Separované proteiny mohou být z gelu získány pomocí elektroeluce a dále použity pro další studie. Dalším typem gelu jsou gely ultratenké nebo gradientové. Proteiny separované na gelech mohou být následně analyzovány imunoblotováním, přímým barvením proteinů atd.. Velikost proteinů je posuzována podle komerčně dostupných proteinových markerů. Typy elektroforéz závisí na typu vzorku. Protokol na separaci malých proteinů a peptidů požaduje modifikaci standardních pufrů: buď Tris-tricinový pufr, nebo Tris pufr bez urey. SDS-PAGE využívá negativního náboje SDS který obaluje proteiny. Proteiny se pak chovají jako negativně nabité molekuly, které putují k pozitivně nabité elektrodě. Výjimečně jsou proteiny separovány v kationtovém uspořádání elektroforéz, typickým příkladem je separace histonů v prostředí pufru kys. octové a urey. SDS-PAGE je obvykle prováděna za konstantního proudu. Odpor gelu vzrůstá v průběhu separace, a s tím vzrůstá i napětí. Pokud elektroforetická nádobka obsahuje více než jeden gel, pak stejný proud prochází oběma gely, ale napětí je aditivní. Tedy pokud jeden gel má konstantních 10 mA při 100 V, pak dva identické gely mají 200 V (100 v každý). Napětí tedy limituje množství gelů, které jsme schopni rozdělit na jednom nízkonapěťovém zdroji. Použitý proud též souvisí s tloušťkou gelu. 1.5 mm tlustý gel je obdobou dvou 0.75 mm tlustých gelů. Tím, že tlustší gely potřebují více proudu a tím se i více zahřívají. Po proběhnutí SDS-PAGE je třeba proteiny vizualizovat. Pro obarvení se používá barvivo Coomassie brilliant blue. Toto barvení je navíc kvantitativní a gel je možné použít pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Dalším způsobem je barvení stříbrem. Toto barvení je sice 10 - 100 x citlivější, ale jelikož se stříbrné ionty vážou jen na některé aminokyselinové zbytky (Asp, Glu, His, Cys, Met, Lys), nelze tuto metodu považovat za plně kvantitativní. Nejnovější metodou je fluorescenční barvení, které je kvantitativní a také slučitelné s hmotnostní spektroskopií jako Coomassie a svou citlivostí je
27
srovnatelné s barvením stříbrem, ale nevýhodou je jeho vysoká cena. Nezachycené barvivo se vymyje a výsledkem je tzv. Proteinová mapa.
Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek Nedenaturující nebo též nativní elektroforéza je elektroforézou, která neprobíhá v přítomnosti denaturačních činidel, jako např. Urey nebo SDS. Je technikou používanou pro určení velikosti a podjednotkového složení a optimálních separačních podmínek pro daný protein. Tato elektroforéza je vysoce flexibilní umožňující pracovat v celém rozsahu pH.
Dvourozměrná gelová elektroforéza Dvourozměrná gelová elektroforéza je kombinací dvou separačních technik, izoelektrické fokusace a SDS-PAGE. V prvním gelu dochází k separaci proteinů podle jejich isoelektrického bodu. Dále pak proteiny z prvního gelu migrují do druhého gelu, kde jsou rozděleny pomocí SDS elektroforézy v závislosti na jejich velikosti. Výsledné dvourozměrné gely obsahují množství bodů dobře od sebe rozpoznatelných. Při použití citlivé detekce, např. Barvení stříbrem nebo autoradiografie, obsahují tyto gely až 1500 bodů. Pro srovnání – jednorozměrná separace umožňuje rozlišení pouhých 100 proužků a každý tento proužek obsahuje několik proteinů. Proto je dvourozměrná elektroforéza metodou s maximálním rozlišením. V případě imunoprecipitátů nám tato metoda umožňuje monitorovat změny v náboji nebo molekulové hmotnosti cílových proteinů. Toto je velmi důležité při studiu rekombinantních proteinů, jejichž vlastnosti mohou být pouze mírně odlišné od přirozených intracelulárních proteinů. Nevýhodou dvourozměrné elektroforézy je časová a manuální náročnost. Dalším problémem je nedostatečné rozlišení v případě, že jsou si dva proteiny tak podobné, že se zobrazí pouze jako jedna skvrna v gelu. Tento problém však může vyřešit použití úzkého rozsahu pH při isoelektrické fokusaci, které zvýší rozlišení. Posledním krokem minipreparativní SDS-PAGE je vyřezání části gelu s cílovým proteinem a následná eluce. Složení elučního pufru úzce souvisí s typem SDS-PAGE, která byla použita k separaci proteinů.
Izoelektrická fokusace (IEF) Izoelektrická fokusace je další metoda, která se realizuje elektroforetickou technikou a lze ji řadit mezi preparativní elektromigrační techniky. Zatímco elektroforéza na nosičích se provádí za konstantního pH, k separaci při izoelektrické fokusaci dochází v 28
gradientu pH, který se ustaví mezi dvěma elektrodami. Separovaná látka se pohybuje vlivem el. proudu v gradientu pH až do okamžiku, kdy se dostane do oblasti pH shodné s jeho izoelektrickým bodem. Tam ztratí náboj, zastaví se a bude se v tomto bodě koncentrovat. IEF je tedy rovnovážná technika a současně elektroforetická technika s pravděpodobně nejvyšším stupněm rozlišení. Tímto způsobem je možno od sebe oddělit (a tak identifikovat) sloučeniny, jejichž izoelektrické body se od sebe liší o 0,001 pH jednotky.
Kapilární elektroforéza Zvláštním způsobem elektroforézy je tzv. Kapilární elektroforéza, která využívá elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř křemenné kapiláry. Tomuto způsobu elektroforézy se říká vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) a provádí se několika způsoby – jako volná elektroforéza, gelová elektroforéza, ale i jako izoelektrická fokusace.
Volná kapilární elektroforéza Provádí se v otevřené kapiláře naplněné elektrolytem. K separaci dochází kombinací vlivu elektroforetické migrace a elektroosmotického toku. Elektroforetickou migrací rozumíme pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Elektroosmotický tok je tok elektrolytu způsobený nábojem vnitřní stěny kapiláry a aplikovaným potenciálem. Ve styku s elektrolytem mají silanové skupiny podél vnitřní stěny kapiláry tendenci ionizovat a vytvářet tak na rozhraní stěny kapiláry a elektrolytu elektrickou dvojvrstvu. Když se do systému zavede stejnosměrný proud, kationty v elektrolytu v blízkosti stěny kapiláry se pohybují směrem ke katodě a strhávají elektrolyt s sebou. Tak se vytváří elektroosmotický tok směrem ke katodě. Různě nabité molekuly v separovaném vzorku se pohybují různými směry podle náboje, ale všechny jsou neseny ve směru katody díky elektroosmóze. Kladně nabité molekuly dosáhnou katody jako první, neboť elektroforetická migrace i elektroosmotický tok mají stejný směr. Jestliže se za podmínek volné kapilární elektroforézy separují anionty, pak elektroosmotický tok elektrolytu a elektroforetická migrace mají opačný směr. Směr elektroosmotického toku však může být změněn přidáním povrchově aktivních chemických aditiv do elektrolytu.
Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE Nejjednodušší způsob stanovení molekulové hmotnosti purifikovaných proteinů nebo peptidů je spojen s jednorozměrnou denaturační elektroforézou, provedenou na gradientovém gelu. Nabarvením tohoto gelu Coomassie brilliant blue modří a srovnáním velikosti sledovaného proteinu s použitým proteinovým standardem, který je komerčně 29
dostupný, určíme velikost sledovaného proteinu. Pro určení molekulové hmotnosti a izoelektrického bodu se používá dvourozměrná denaturační elektroforéza. Pokud chceme sledovat změny molekulových hmotností v souvislosti s posttranslačními modifikacemi (např. glykozylacemi), známe-li tedy hmotnost sledovaného proteinu, zvolíme hustotu polyakrylamidového gelu tak, aby umožňoval maximální rozlišení v oblasti sledovaných molekulových hmotností (pod 40 kDa na 12% gelech, 40–80 kDa na 10% gelech, 70–200 kDa na 8% gelech, nad 200 kDa na 6% gelech). Použijeme vhodný proteinový marker a hmotnost proteinu odečítáme od tohoto markeru. V současné době je dostupná celá řada proteinových markerů, která zahrnuje markery vhodné pro různé způsoby detekce, mající různou škálu hmotnostních markerů. Sledované proteiny můžeme detekovat buď barvením gelu bromfenolovou modří, nebo immunodetekcí. Zvolený způsob detekce zvolíme v závislosti na množství sledovaného proteinu a typu experimentu, který provádíme.
Flow field flow frakcionace (FFFF) Flow field flow frakcionace je velmi účinná metoda pro separaci makromolekul, proteinů, koloidů a nanočástic s obrovským dynamickým rozsahem (tj. všechny tyto analyty mohou být separovány společně v jednom separačním běhu a s vysokým rozlišením). V kombinaci s MALS detektorem (rozptyl světla) poskytuje FFFF spolehlivou a absolutní (tj. bez potřeby kalibrace pomocí standardních částic) velikostní charakterizaci vzorku, čímž nahrazuje mnohem dražší, pracnější a časově náročnější techniky, jako je analytická ultracentrifugace, elektronová mikroskopie a AFM (atomic force microscopy, mikroskopie atomárních sil). Field flow frakcionace (FFF) je založena na spolupůsobení laminárního toku a transverzálního (kolmého) silového pole. Separace probíhá v kanálu tvořeném dvěma plochými skleněnými, kovovými, nebo plastovými deskami oddělenými folií – spacerem. Tento spacer udává výšku separačního prostoru, která se pohybuje mezi 80 až 500 µm. Nejjednodušším a historicky prvním provedením FFF je gravitační FFF. Představme si, že do separačního kanálu nastříkneme směs částic a (o průměru 10 µm) a b (o průměru 0.5 µm). Zatímco všechny částice a pro svoji větší hmotnost sedimentují až na dno (akumulační stěnu) kanálu, menší částice b kromě sedimentace vykonávají i Brownův pohyb, a tudíž vytvoří rovnovážnou zónu o určité výšce nad akumulační stěnou kanálu. K vlastní separaci pak dojde spuštěním průtoku a vytvořením parabolického profilu toku: částice a jsou eluovány proudnicí, která je nejblíže ke dnu, a je tudíž nejpomalejší. Zóna částic b zasahuje do vyšších, a tudíž rychlejších proudnic, proto je eluována dříve. Záměnou gravitačního pole za jiné transverzální silové pole (např. termální gradient, elektrické pole, příčný tok) vznikla celá rodina FFF technik. Asymetrická flow field flow frakcionace (AF4) využívá síly příčného toku, který unáší vzorek k akumulační 30
stěně kanálu (Obr. 6.1). Zatímco horní stěna kanálu pro AF4 je nepropustná, akumulační stěna je vyrobena z porézní frity, takže je propustná a při vhodném tlaku uvnitř kanálu umožňuje příčný tok. Frita je pokryta ultrafiltrační membránou o velikosti pórů 10 kDa, aby nedocházelo k úniku vzorku akumulační stěnou. Aby byl zajištěn konstantní tlak po celé délce kanálu, profil kanálu se zužuje. Jak už bylo zmíněno výše, menší analyty jsou eluovány rychleji, protože vytvářejí rovnovážné Brownovské zóny v oblasti vyšších (rychlejších) proudnic, takže na výstupu z kanálu jsou analyty separovány podle velikosti. Závislost elučního objemu na molekulové hmotnosti nebo velikosti částic je u FFF opačná ve srovnání s gelovou permeační chromatografií (GPC), kde jsou větší molekuly eluovány dříve než molekuly s menší velikostí (Obr. 6.2).
Obrázek 6.1: separační princip AF4
Kromě velkého dynamického rozsahu nabízí AF4 další velkou výhodu – uvnitř kanálu není žádné medium, které by mohlo se vzorkem nějak reagovat, takže ani v případě velkých polymerů se nemusíme obávat střižných sil. Střižné síly působí např. U GPC, kdy se větší komplexy, např. Viry nebo nekovalentně vázané proteinové komplexy, mohou rozpadat vlivem střižných sil při penetraci porézní chromatografickou matricí. Celá separace je velmi jemná, rychlá, není destruktivní a nehrozí zde interakce se stacionární fází, která by mohla vést ke změně elučního chování (opět případ GPC, kdy se některé proteiny mohou kvůli interakci s matricí eluovat anomálně), k degradaci nebo ke změně vzorku.
Obrázek 6.2. AF4 kanály
31
AF4 má své nezastupitelné místo v molekulární biologii, v nanotechnologiích, environmentálních analýzách, při separacích a charakterizacích proteinů a jejich agregátů, při separaci liposomů, emulzí, virových částic, polysacharidů, nanočástic, polymerních latexů, koloidů, huminových kyselin atd. ve spojení s moderními detektory (UV-VIS, fluorescenční detektor, mikroviskozimetrický detektor, refraktometrický detektor, MALS - multi-angle light stattering detektor) a případně GPC umožňuje tento systém jedinečnou separaci polydispersních vzorků s vysokým dynamickým rozsahem velikostí částic a jejich fyzikálně-chemickou charakterizaci, zahrnující i absolutní molekulovou hmotnost a případně tvar molekuly (např. Větvení polymerů).
Obrázek 6.3. Charakteristika solubilizovaných pšeničných gluteninů AF4 MALS
Červená - odezva MALS detektoru (rozptyl světla) při 90°; modrá - odezva UV detektoru; černá - průběh velikosti molekulární hmotnosti ve frakcích. 32
Obr. 6.3 ukazuje využití AF4 ve spojení s MALS detektorem pro identifikaci rozdílů ve velikostní distribuci a konformaci nízkomolekulárních a vysokomolekulárních podjednotek gluteninu z pšeničné mouky. Komerční usopořádání FFF je zobrazeno na Obr. 6.4.
Obrázek 6.4. Přístroj Eclipsea FFF od firmy Wyatt
Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering) Metoda DLS je známa také pod názvy „kvazielastický rozptyl světla“ (QELS quasi elastic light scattering) a „foton korelační spektroskopie“ (PCS photon correlation spectroscopy). Je vhodná zejména pro stanovení hydrodynamického poloměru nanočástic a také jeho změn v důsledku různých interakcí nanočástic. Lze ji také použít k charakterizaci vzorků s bimodální nebo oligomodální distribucí částic v roztoku. Základem metody DLS je měření fluktuace intenzity rozptýleného světla z laserového zdroje okolo její průměrné hodnoty. Tyto fluktuace souvisí s interferenčním zeslabováním a zesilováním světla rozptýleného na nestacionárních částicích dispersní fáze, podléhajících Brownovu pohybu.
33
Rozptyl světla Rozptyl je obecný fyzikální proces, v němž jsou některé druhy záření, jako je světlo, zvuk nebo pohybující se částice, přinuceny se odchýlit od přímé trajektorie. Když paprsek světla prochází koloidní dispersí částic, jeho paprsek se rozptyluje ve všech směrech. V případě, že částice jsou velmi malé ve srovnání s vlnovou délkou světla, je intenzita rozptýleného světla izotropní, tj. stejná ve všech směrech (Rayleighův rozptyl). Pro větší částice (nad průměr přibližně 250 nm) existuje úhlová závislost intenzity rozptýleného světla (Mieho rozptyl). Tuto úhlovou závislost popisuje teorie, kterou vytvořil Mie. DLS využívá Reyleighův rozptyl světla (Rayleigh scattering). V případě proteinů se jedná o částice, které jsou výrazně menší (do 30 nm), než je použitá vlnová délka světla laseru (obvykle he-ne laser s λ 633 nm). V případě, že velikost částice je daleko menší než vlnová délka použitého světla d ≤ λ / 10, dochází k izotropickému rozptylu, což znamená, že intenzita rozptýleného světla vertikálně polarizovaného laserového paprsku je stejná ve všech směrech. Tím, že úhlové rozložení intenzity rozptýleného světla je konstantní, lze v případě proteinů částic provádět měření při jednom úhlu pro stanovení jejich hmotnosti (jak uvidíme níže). Obvykle se používá snímání světla v úhlu 90° a nebo nověji při zpětném úhlu 173° (back scattering). Toto uspořádání umožňuje měření i koncentrovaných vzorků, neboť je potlačen vliv vícenásobného rozptylu světla. Rayleighova aproximace udává, že intenzita rozptýleného světla je úměrná šesté mocnině průměru částice a nepřímo úměrná čtvrté mocnině vlnové délky světla použitého laseru.
Ι ≈ d6 ; ι ≈ 1 / λ4 Ι = intenzita rozptýleného světla; D = průměr částice; λ = vlnová délka světla laseru
Přítomnost velkých částic (např. Agregáty proteinů, fragmenty buněk, prach a nečistoty) překrývá signál malých částic. Např. Intenzita rozptýleného světla na částicích s průměrem 50 nm je milionkrát větší než intenzita světla rozptýlená na částicích s průměrem 5 nm. Jinými slovy, intenzita rozptýleného světla jednou takovou částicí je ekvivalentní intenzitě světla rozptýleného milionem částic s desetkrát menším poloměrem. Inverzní vtah mezi intenzitou rozptýleného světla a vlnovou délkou laseru nám napovídá, že pro měření malých částic v nízké koncentraci může být výhodné použití laserů s kratší vlnovou délkou. Prakticky je však He-Ne laser 633 výkonem 10 mW dostačující pro většinu měření.
34
Brownův pohyb Brownův pohyb je náhodný pohyb malých částic, který je způsobován nárazy molekul rozpouštědla (voda, ionty solí). Čím větší je částice, tím menší je vliv nárazů molekul rozpouštědla a tím pomalejší Brownův pohyb tato částice vykonává. Naproti tomu na malé částice, které mají také menší hmotnost, má náraz molekul rozpouštědla daleko silnější účinek a změna rychlosti a směru pohybu je výraznější. Technika DLS měří Brownův pohyb částic a dává jej do vztahu s jejich hmotností. Velikost Brownova pohybu je určena parametrem zvaným difuzní koeficient a je označována jako D (m2/s).
n = viskozita rozpouštědla (voda = 8,94 x 10-4 kg/ms); T = teplota (°K); D = difuzní koeficient (m2/s); kB = boltzmannova konstanta (1,3807 x 10-23 J/K); d = průměr koule (m).
Z rovnice je patrné, že difuzní koeficient D pro danou částici je nepřímo úměrný jejímu průměru a je závislý na teplotě (kinetická energie částic rozpouštědla) a viskozitě (odpor kladený pohybu částice v rozpouštědle). Je tedy jasné, že pro měření pomocí DLS je nezbytná přesná znalost teploty a viskozity rozpouštědla. Je vhodné připomenout, že hodnota viskozity je závislá na teplotě. Jakýkoliv ne-Brownovský pohyb (např. Sedimentace částic, konvexní proudění kapaliny vlivem nehomogenity teploty v cele, koncentrační nehomogenita vzorku) vnáší velikou chybu do stanovení d, a tím i hydrodynamického poloměru částic Rh.
Na základě Stokes-Eeinsteinovy rovnice můžeme vyjádřit hydrodynamický poloměr částice Rh jako: R(h) = kt / 3πηd
Pro proteiny pak můžeme vypočítat molekulovou hmotnost na základě znalosti R(h) ze vztahu: mw = (d x α)β d = průměr koule v nm 35
α = korekční faktor = 1,68 korekční faktor = 2,3398 hmotnost v kDa
Hydrodynamický poloměr proteinu (Rh) Skutečný tvar molekuly většiny proteinů se liší od kulového tvaru (např. Elipsoid, tyčka, disk). Hydrodynamický poloměr je tedy aproximací skutečného tvaru proteinu na tvar koule o takovém poloměru, pro který by tato koule vykazovala stejný difuzní koeficient d jako daný protein.
Obrázek 6.5. Srovnání pohybu malé a velké částice vlivem Brownova pohybu
Princip metody DLS Použijeme-li koherentní a monochromatický paprsek laseru, je možné s pomocí vhodného detektoru, jako např. Fotonásobiče, stanovit v krátkých časových intervalech množství rozptýlených fotonů, a tak přesně měřit intenzitu světla rozptýleného částicemi ve vzorku. Vzhledem k Brownovu pohybu částic fluktuuje hodnota intenzity rozptýleného světla kolem střední hodnoty, dané velikostí a koncentrací částic ve vzorku. Fluktuace intenzity rozptýleného světla jsou způsobeny Brownovým pohybem částic, který způsobuje, že vzdálenost mezi částicemi se neustále mění, což ovlivňuje konstruktivní a destruktivní interferenci světelných vln emitovaných sousedními částicemi rozptýlenými v osvětlené oblasti vzorku. Kolísání intenzity rozptýleného 36
světla, které je zaznamenáno detektorem, obsahuje informaci o pohybu částic, tedy o jejich difuzním koeficientu, a tedy o jejich hydrodynamickém poloměru.
Obrázek 6.6. Fluktuace signálu intenzity rozptýleného světla
Časová závislost intenzity fluktuace je nejčastěji analyzována pomocí digitálního korelátoru, který provádí srovnání okamžité hodnoty intenzity světla v čase t a srovnává ji s hodnotou naměřenou v čase t + δt; t + 2δt; t + 3δt; t + nδt. Řešením vztahu závislosti změny intenzity rozptýleného světla na čase je autokorelační funkce, která má tvar exponenciálního poklesu korelačního koeficientu. Čím větší je pohyb částic, tím rychleji klesá korelační koeficient. Analýza autokorelační funkce vede k získání translačního difuzního koeficientu d a výpočtu hydrodynamického poloměru R(h).
Autokorelační funkce
g
ItIt It q
A
2
4 n
sin
I = intenzita rozptýleného světla v čase t Konstanty přístroje: A = základní hladina B = faktor související s optikou přístroje q = vektor rozptylu
37
2
∑ Be
2q2 D
D = translační difuzní koeficient τ = časová změna, n = index lomu vzorku λ = vlnová délka světla laseru, α = úhel rozptylu Získání informace o velikosti částic z autokorelační funkce Pro tento účel byla vyvinuta řada algoritmů, které lze rozdělit do dvou skupin. První skupinu tvoří algoritmy, které autokorelační funkci vyjádří jako jednoduchou exponenciální funkci a výsledkem je průměrná velikost označovaná jako ζ-průměr (zetaaverage diameter) a šíře distribuce velikosti, která je označována jako index polydispersity (PDI, polydispersity index). Druhý přístup je založen na vyjádření autokorelační funkce multiexponenciální funkcí, která umožní charakterizovat distribuci velikosti částic v heterogenních vzorcích s bimodální nebo polymodální distribucí velikosti částic. Nejčastěji se setkáme s algoritmy označovanými zkratkou NNLS (nonnegative least squares) nebo CONTIN. Pro monodispersní systémy má autokorelační funkce jednoduchý tvar, zobrazený na Obr. 6.7.
Obrázek 6.7a. Průběh jednoduché autokorelační funkce pro standardní 96 nm polystyrenové částice
38
Obrázek 6.7b. Srovnání tvaru autokorelační funkce (rychlost poklesu korelačního koeficientu) pro malé částice (ovalbumin) a velké částice (nanočástice oxidu křemičitého)
V případě polydispersních vzorků je tvar autokorelační funkce vlivem příspěvků od různě velikých částic podstatně komplikovanější, ale rovněž řešitelný. Tvar autokorelační funkce pro bimodální distribuci je Obr. 6.8.
Obrázek 6.8. Tvar korelační křivky pro bimodální distribuci
39
Analýza autokorelační křivky v monomodálním modu poskytne kumulativní velikost 12,4 nm (z-average diameter), zatímco použití analýzy multimodální distribuce ukazuje na existenci částic o velikosti 3,5 nm a 388 nm.
Vyjádření výsledků distribuce velikosti Distribuci velikosti částic lze vyjádřit jako 1) distribuci podle intenzity rozptýleného světla; 2) distribuci podle objemu částic; 3) distribuci podle počtu částic. 1. Distribuce velikosti je vynesení relativní intenzity světla rozptýleného částicemi v určité velikostní škále (třídě). Toto vynesení je nazýváno distribuce podle intenzity. Pro monodispersní vzorky s nízkou polydispersitou není třeba převádět distribuci podle intenzity na distribuci podle objemu částic. V případě polydispersního vzorku nebo vzorku s multimodálním rozdělením velikosti je nezbytné provést převedení výsledků na distribuce podle objemu částic, které dává daleko realističtější pohled na takový vzorek. Ze vztahu velikosti částice a intenzity rozptýleného světla (viz odstavec rozptyl světla) vyplývá, že veliké částice v důsledku větší intenzity rozptylu světla silně nadhodnocují svůj příspěvek k celkové distribuci, která je vyjádřena jako distribuce podle intenzity. 2. Příspěvek částic z hlediska jejich objemu je vyjádřen distribucí podle objemu částic. Prakticky to znamená, že příspěvek jedné velké částice je zhruba ekvivalentní příspěvku tisíce částic s desetkrát menším průměrem.
40
3. Distribuce podle počtu částic pak charakterizuje systém z hlediska počtu částic v jednotlivých velikostních třídách. Obecně lze říci, že příspěvek větších částic je zvýrazněn v následujícím pořadí vynesení distribuce d: d (intenzita) > d (objem) > d (počet). Názorně pochopíme příspěvek jednotlivých vynesení z Obr. 6.9, kde je ukázán vliv velikosti částic na jednotlivá vynesení podle intenzity, objemu a počtu částic. Pokud analyzujeme vzorek připravený ze stejného počtu částic s průměrem 5 a 50 nm, pak vynesení podle počtu částic ukazuje poměr 1 : 1. Pokud převedeme data na distribuci podle objemu, pak poměr malých a velkých částic bude v poměru 1 : 1 000 (objem kulovitých částic je roven to 4 / 3π(d / 2)3, a tedy je v poměru třetích mocnin průměru). Další konverze dat na vyjádření podle intenzity pak dává poměr 1 : 1 000 000 (intenzita rozptylu světla je podle rayleighovy aproximace úměrná šesté mocnině průměru částice).
Obrázek 6.9. Srovnání vyjádření distribuce částic podle množství, objemu a intenzity pro vzorek 5 a 50 nm částic smíchaných v poměru 1 : 1
Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic V případě velmi malých částic, jako jsou proteiny, má na jejich difuzní koeficient vliv několik faktorů. Mezi hlavní můžeme zařadit změnu tvaru vlivem pH, iontové síly prostředí, teploty a interakce s dalšími molekulami (např. Dimerizace, interakce s lidgandy, deglykozylace ap.). Ionty v mediu a jejich koncentrace mohou ovlivnit difuzní koeficient ovlivněním tloušťky elektrické dvojvrstvy (debyeova dvojvrstva) a tím i ζ-potenciálu. Tato dvojvrstva je větší v mediu s nižší vodivostí. Také povrchové struktury nanočástic jsou ovlivněny vlastnostmi media a tyto struktury mohou výrazně měnit jak tvar, tak difuzní koeficient částic. Zejména jsou tyto efekty silné u částic 41
s povrchem modifikovaným polymery (v případě proteinů se jedná o glykoproteiny nebo proteiny modifikované syntetickými polymery jako polyethylen glykol, které zvyšují jejich stabilitu v séru). Díky své citlivosti je DLS je velmi vhodnou metodou pro sledování těchto jemných změn makromolekul a nanočástic v jejich přirozeném vodném prostředí.
Přístroje pro měření pomocí DLS Existuje celá řada renomovaných firem, které nabízejí přístroje pro DLS. Jsou to např. Malvern, Nicomb, Coulter, Wyatt, Horiba, Brookhaeven. Zde se zmíníme o principu přístroje Nanosizer ZS od firmy Malvern, který patří k absolutní špičce. Tento přístroj se vyznačuje měřením signálu rozptýleného světla při zpětném úhlu 173° (backscattering angle). Toto uspořádání umožňuje měření velmi hustých vzorků (až 40%), neboť eliminuje vliv vícenásobného rozptylu, který nastává při vysoké koncentraci částic v roztoku. Tento přístroj také umožňuje měření ζ-potenciálu nanočástic, lze měřit v teplotním rozsahu 2 90°C, a tak studovat např. denaturační křivky proteinů, DNA a teplotně závislé strukturální změny nanočástic. Unikátní je také rozsah měření v rozmezí 0,6 nm až 6 µ m. Tato citlivost je co do velikosti a koncentrace jedinečná a důležitá pro studium proteinů, jejichž velikost se pohybuje v jednotkách až desítkách nanometrů, a koncentrace lze použít již v desítkách mikrogramů proteinu na mililitr. Zejména u vzácných vzorků je významná možnost použití mikrocely s objemem 12 µ l.
Obrázek 6.10. Optické uspořádání přístroje Nanosizer ZS
42
Některé aplikace DLS při studiu proteinů: -
-
Stanovení hydrodynamického poloměru Rh. Stanovení absolutní molekulové hmotnosti a interakce s rozpouštědlem (optimalizace podmínek pro krystalizaci proteinů). Studium čistoty preparátů a agregace proteinů. Studium teplotní stability proteinů a proteinových preparátů. Studium interakce proteinů (dimerizace, oligomerizace, interakce s ligandy, štěpení a degradace proteinů – např. Účinek proteáz, glykozyláz, kináz, štěpení disulfidových S-S vazeb). Vazba proteinů na nanočástice – liposomy. Solubilizace membránových proteinů a jejich rekonstituce do lipidních membrán. Studium změny konformace proteinu na základě změny Rh a stanovení tvaru proteinu na základě vztahu mezi Rh a Rg.
Pohyblivá zaostřovací čočka umožňuje snímání signálů z různé hloubky kyvety, a tak eliminuje u koncentrovaných vzorků vícenásobný rozptyl (viz Obr. 6.10b).
Výhody a omezení DLS Výhody DLS: -
Měření nativního stavu biopolymerů a nanočástic ve vodném prostředí, stanovení jejich Rh, ζ potenciálu, molekulové hmotnosti.
-
Nedestruktivní a rychlá metoda.
-
Cenová dostupnost (přístroje v cenové relaci kolem 1,5–2 milionů korun).
-
Malá spotřeba vzorku (12 µ l komůrka, koncentrace v desítkách až stovkách µ g/ml).
-
Studium vlivu prostředí a interakcí na biopolymery a nanočástice.
-
Velký rozsah velikosti (přes tři řády) částic (od 0,6 nm do 6 µ m).
-
Možnost spojení se separačními technikami (GPC, FFF)
-
Stanovení malého množství agregátů s využitím distribuce podle intenzity.
Omezení DLS: Obtížná analýza polydispersních vzorků. -
Překrývání signálu malých částic signálem z velkých částic.
-
Obtížná analýza sedimentujících nebo velmi viskózních vzorků.
43
Využití statického rozptylu světla pro měření absolutní molekulové hmotnosti proteinů na přístroji Nanosizer ZS. Vztah mezi molekulovou hmotností a intenzitou rozptýleného světla popisuje Zimmova rovnice, která platí pro částice pod 200 nm, kde výraz určuje úhlovou závislost intenzity rozptýleného světla.
44
K = optická konstanta přístroje Rθ = Rayleighův poměr intenzit rozptýleného světla a intenzitou paprsku laseru c = koncentrace proteinu A = viriální koeficient n-tého řádu Rg = poloměr gyrace M = molekulová hmotnost proteinu λo = vlnová délka použitého laseru no = refraktivní index rozpouštědla P (θ) = úhlová závislost intenzity rozptýleného světla θ = úhel měření rozptýleného světla
Pro částice s gyračním poloměrem Rg ≤ 15 nm (což splňují proteiny) je hodnota 1 / P (θ) rovna přibližně 1a. Zimmovu rovnici lze zjednodušit na tvar:
Kc / Rθ = (1 / M + 2A2c) Grafickým vynesením Kc / Rθ proti koncentraci proteinu c získáme hodnotu molekulové hmotnosti M a také směrnici A2, která je hodnotou druhého viriálního koeficientu a udává sílu interakce mezi povrchem částice a daným rozpouštědlem. Pro A2 > 0 platí, že částice má tendenci zůstat v roztoku. Pro A2 = 0 jsou interakční síly vyrovnány a solvent je charakterizován jako theta solvent. Pro A2 < 0 platí, že částice má tendenci agregovat.
Určení druhého viriálního koeficientu je vhodné pro nalezení správných podmínek pro krystalizaci proteinu a přípravu pro jeho studii struktury pomocí rentgenové difrakce.
Obrázek 6.11. Graf pro určení molekulové hmotnosti proteinu a druhého viriálního koeficientu
45
Ukázka praktické aplikace Rekombinantní protein OspC byl navázán na povrch liposomů metalochelatační vazbou (Obr. 6.12). Z elektronového transmisního mikroskopu ukazuje strukturu liposomů a šipky označují molekuly proteinu vázané na povrchu liposomu. Identita proteinu byla prokázána imunoznačením částicemi koloidního zlata s navázanými specifickými protilátkami proti OspC (černé šipky označují 10 nm částice koloidního zlata). Preciznost přístroje Nanosizer ZS (Malvern) umožňuje rozlišit i malé změny velikosti liposomů, způsobené navázáním proteinů s relativně malou molekulovou hmotností na jejich povrch (Obr. 6.13).
Obrázek 6.12. Elektron mikroskopický průkaz vazby OspC na liposomy
129
Obrázek 6.13. Distribuce velikosti a hydrodynamický poloměr rekombinantního proteinu OspC, liposomů a liposomů s povrchově vázaným OspC
Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) je nenahraditelná metoda pro studium stability biologických systémů. Stabilita biologických makromolekul a jejich vyšších seskupení je kvantifikována standardní volnou energií, ∆G°, což je rozdíl v Gibbsově energii mezi různými stavy (např. nativní a denaturovanou strukturou v případě proteinů a nukleových kyselin). V rovnováze (když ∆G = 0) platí pro vztah ∆G° a rovnovážné konstanty (K) mezi těmito dvěma stavy následující rovnice: ∆G° (T) = ‒RT lnK(T), kde R je univerzální plynová konstanta a T je absolutní teplota v kelvinech. ∆G° je součtem dvou příspěvků, entalpického a entropického: ∆G° (T) = ∆H° (T) ‒ T ∆S° (T), kde ∆H° (T) a ∆S° (T) jsou změny entalpie a entropie při teplotě, při které vyhodnocujeme ∆G°. Když makromolekula změní svůj termodynamický stav (např. rozvine svoji sekundární strukturu), změní i svoji tepelnou kapacitu ∆cp. Teplo vyžadované pro ohřev 47
roztoku rozvinutého proteinu je o 1 °C vyšší než v případě roztoku svinutého proteinu (s nativní sekundární strukturou). K těmto změnám tepelné kapacity dochází především v důsledku přeskupení molekul rozpouštědla kolem nepolárních vedlejších řetězců, které byly v rámci nativní sekundární struktury orientovány dovnitř biomolekuly a v důsledku „rozbalení“ sekundární struktury jsou nyní vystaveny do volného roztoku a solvatovány. „Rozbalení“ obecně tranzice nastává při charakteristické teplotě nazvané teplota tání (transition midpoint, Tm). Je to teplota, při které se protein vyskytuje z 50 % v nativním a z 50 % v rozbaleném stavu. Čím stabilnější je biopolymer, tím vyšší je Tm. Charakterizovat termodynamiku tranzice znamená určit ∆G°, ∆H° a ∆S° při dané teplotě a získat ∆cp, abychom určili, jak se mění tyto tři parametry s teplotou. Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) je technika pro studium termálně indukované tranzice a zejména konformační tranzice biologických makromolekul (např. rozvinutí sekundární struktury proteinu nebo rozvolnění dvoušroubovice DNA). DSC měří množství tepla absorbovaného nebo uvolněného roztokem molekuly (cp) jako funkci teploty. Tranzice se projeví ostrým endotermním píkem s maximem cp při teplotě tání (Tm). Integrací kalorimetrické křivky (cp oproti teplotě) získáme tranziční entalpii ∆H° a posun baseliny udává ∆cp (Obr. 6.14). DSC je jediná metoda, kterou lze přímo získat tranziční entalpií. Hodnota ∆H°, vypočítaná z plochy pod tranzičním píkem, koreluje s obsahem uspořádané struktury, kterou měl protein před tranzicí. Hodnota ∆H° je vlastně kombinací endotermních příspěvků, jako je rozštěpení vodíkových můstků, a exotermních příspěvků, jako je zrušení hydrofobních interakcí. Šířka píku podává informaci o tom, jestli tranzice proběhla jako „two-state“ proces (tj. přímo z nativního do denaturovaného stavu), nebo jako „multi-state“ proces, tedy přes jeden nebo více intermediátů. Pokud tranzice proběhne v úzkém teplotním rozmezí, je hodnocena jako vysoce kooperativní, tj. bez jakýchkoliv tranzičních intermediátů.
Obrázek 6.14. DSC experiment pro „two-state“ rozvinutí globulárního proteinu
48
DSC poskytuje vhled do mechanismu rozbalování a svinování biomolekul a dává informace o reverzibilitě termálních procesů. Umožňuje měření v roztocích, které nejsou vhodné pro optické metody, jako např. Zakalené nebo barevné roztoky nebo suspenze částic. Poskytuje informaci o konformační energetice proteinů a biopolymerů. Může objasnit faktory, které přispívají k udržení konformace a stability nativních biomolekul, což zahrnuje hydrofobní interakce, vodíkové můstky, konformační entropii a fyzikální prostředí.
Obrázek 6.15. Termální tranzice α-amylasy sledovaná pomocí DSC
49
AHA: psychrofilní α-amylasa z P. haloplanktis; PPA: prasečí pankreatická αamylasa; BBA: α-amylasa z Bacillus amyloliquefaciens. Tvar tranziční křivky PPA a BAA naznačuje, že tyto tranzice neprobíhají jako „two-state“, ale přes tranziční intermediáty. Dekonvoluce prozrazuje dvě kalorimetrické domény v případě ppa a tři domény v případě BAA.
Doporučená literatura Abelson J.N., Simon M.I. (editors) (2009) Guide to protein Purification, 2nd Edition. Methods in Enzymology 463, Elsevier, London, UK. Coligan J.E., Dunn B.M., Speicher D.W., Wingfield P.T. (editors) (2003) Short Protocols in Protein Science. A Compendium of Methods from Current Protocols in Protein Science. John Wiley et sons, USA. Kreuzer H., Massey A. (2005) Biology and Biotechnology, Science, Applications and Issues. ASM Press, Washington, USA. Kerese I. (editor) (1984) Methods of Protein Analysis. Akadémiai Kiado Budapest. Králová B., Fukal L., Rauch P., Ruml T. (1993) Bioanalytické metody. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. Anonymous (2002) Gel Filtration, Principes and Methods. Amersham Biosceinces. Anonymous (2004) Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing. Amersham Biosceinces. Westermeier R. (1997) Electrophoresis in Practice. VCH Seinheim.
50
Internetové zdroje http://wolfson.huji.ac.il/purification/Purification_Protocols.html http://www.proteincrystallography.org/protein-purification/developmentof-purification-protocol.php http://www.millipore.com/immunodetection/id3/igg http://www.aesculab.cz/Pages/Default.aspx
51
