21.10.2014
ABSORPČNÍ A LUMINISCENČNÍ SPEKTROMETRIE V UV/Vis OBLASTI SPEKTRA
© David MILDE, 2004-2014
ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE
ACH/IM
1
21.10.2014
Absorpce záření ve Vis oblasti Při dopadu bílého světla na vzorek může být záření zcela odraženo látku vidíme jako bílou; nebo zcela pohlceno látku vidíme jako černou. Pokud vzorek část záření pohltí a část odrazí barva látky viditelná pro lidské oko odpovídá barvě odraženého záření (tzv. doplňková barva). (nm)
Pohlcená barva
Doplňková barva
400-435
fialová
žlutozelená
435-480
modrá
žlutá
500-560
zelená
červeno-purpurová
560-580
žlutozelená
fialová
580-595
žlutá
zelená
595-610
oranžová
zelenomodrá
620-760
červená
modrozelená
David MILDE, 2004
Molekulové orbitaly (MO) MO–LCAO (Molecular Orbital – Linear Combination of Atomic Orbitals) popisuje vznik MO pomocí lineární kombinace atomových orbitalů (AO). K tomu dojde prostorovým překryvem AO atomů. Ze dvou AO se vytvoří 2 MO: vazebný a protivazebný:
2 typy vazebných orbitalů (σ, π) 2 typy protivazebných orbitalů (σ*, π*) 1 nevazebný orbital (n); n* neexistuje, protože n orbitaly se nepodílí na vazbě!
HOMO a LUMO: nejvyšší obsazený molekulový orbital (Highest Occupied Molecular Orbital) a nejnižší neobsazený molekulový orbital (Lowest Unoccupied Molecular Orbital).
Energetický rozdíl mezi těmito orbitaly charakterizuje schopnost excitace molekuly, čím je nižší, tím je jednodušší molekulu excitovat. David MILDE, 2014
ACH/IM
2
21.10.2014
Teoretický základ Za normálních podmínek se molekula nachází v základním elektronovém stavu E0 = Ee + Ev + Er. Pohlcením fotonu záření z UV/Vis oblasti se změní elektronová konfigurace nebo spin e- a molekula přejde do excitovaného stavu. Zde setrvá cca 10-15 s a přechází do základního stavu deaktivačními procesy. ΔE = E1 - E0 = hν = ΔEe + ΔEv + ΔEr. ΔEe ~ 150-600 kJ.mol-1, ΔEv ~ 2-60 kJ.mol-1, ΔEr ~ 3 kJ.mol-1 E
David MILDE, 2014
Teoretický základ
Povolené přechody Symetricky zakázané přechody David MILDE, 2014
ACH/IM
3
21.10.2014
Teoretický základ Intenzita pásů (dle kvantové mechaniky): 1.
Přechody dovolené – ze základní singletové do excitované singletové hladiny; max 104 – 105 l.mol-1.cm-1 Přechody spinově zakázané – málo pravděpodobné přechody ze základní singletové do excitované tripletové hladiny; max 100 l.mol-1.cm-1 Přechody symetricky zakázané max 102 l.mol-1.cm-1; vibrace jader molekuly vede k diferenci v rozdělení e- a tím ke změně dipólového momentu molekuly a přechodu e-.
2. 3.
Elektronové přechody v organických molekulách:
David MILDE, 2004
Elektronové přechody v organických molekulách n uvedeme společně, chemické skupiny často obsahují jak tak n e-, oba typy přechodů přispívají k tvorbě absorpčních pásů.
Přechody jsou relativně nezávislé na atomech spojených s dvojnou vazbou, jsou dovolené a intenzivní: 103-105 l.mol-1.cm-1. Přechody n jsou symetricky zakázané a nejsou příliš intenzivní ( 10-102 l.mol-1.cm-1), jejich absorpční maximum je silně závislé na druhu atomu (poloha n e- je silně závislá ne elektronegativitě heteroatomu).
vytvářejí jednoduché vazby – alifatické uhlovodíky. Prakticky nepoužívané vzhledem ke krátkým (nutno pracovat ve vakuu). n poskytují substituenty s nevazebnými e- – nasycené sloučeniny se S, N, Br, I, které absorbují do 200 nm a O a Cl, které absorbují nad 200 nm. David MILDE, 2004
ACH/IM
4
21.10.2014
Elektronové přechody v organických molekulách Chromofor – funkční skupina v molekule odpovědná za absorpci záření v UV a Vis oblasti. Obecně lze říci, že skupiny s e- jsou chromofory pro UV a Vis oblast a skupiny se epro dalekou UV oblast. Auxochrom – funkční skupina, která není chromoforem, ale zvyšuje (mění) účinek chromoforů. |působuje posun absorpčních maxim chromoforů a zvyšují intenzitu pásů, př.: OH, NH2, halogenidy.
Bathochromní (červený) posun – k delším . Hypsochromní (modrý) posun – ke kratším Hyperchromický efekt – zvýšení intenzity absorpce. Hypochromní efekt – snížení intenzity absorpce.
David MILDE, 2004
Vliv prostředí na absorpční spektrum Vliv rozpouštědla – při rozpouštění se může měnit elektronová struktura rozpouštěné látky, což se projeví posunem λmax nebo ε. Podstatný je vliv polarity rozpouštědla a tvorba vodíkových vazeb.
Polarita minimálně ovlivňuje absorpci chromoforů CC a CC. Polarita výrazně ovlivňuje λmax u přechodů nπ* a nσ* (polární chromofory CO, -NO2, -COOH, -NH2). Měřením spekter vzorku v různých rozpouštědlech lze rozlišit pásy nπ* a nσ* od π π*, protože v polárnějším rozpouštědle se posouvají maxima prvních dvou ke kratší vlnové délce. Nepolární rozpouštědla – spektra s ostrými maximy.
Vliv pH – posun λmax se projeví, když se se změnou pH mění charakter chromoforu, např. -NH2, -COOH, -OH. Může docházet i ke změně intenzity pásu. David MILDE, 2014
ACH/IM
5
21.10.2014
UV-Vis spektrometrie koordinačních sloučenin a anorganických iontů Přenos náboje: dvojice anorganických látek, či organické + anorganické látky, kde jedna se chová jako donor a druhá jako akceptor elektronů. Vzájemně reagují s výměnou elektronů a vzniku komplexu D-A. Absorpce záření komplexem D-A se projeví novým absorpčním pásem ( , n ) D-A + h D+-AIntenzivní přechody v UV: 103 - 104 l.mol-1.cm-1 Př: Fe3+ s fenantrolinem, Fe3+Fe(SCN)2+, komplexy fenolů s Cu2+ či Fe3+.
Spektrum Fe3+ s o-fenantrolinem David MILDE, 2014
UV-Vis spektrometrie koordinačních sloučenin přechodných kovů Přenos v ligandovém poli: Méně intenzivní přechody zejména ve Vis oblasti 10-1 - 102 l.mol-1.cm-1. Volný ion přechodového kovu = všechny d orbitaly mají stejnou E (jsou degenrovány); působením ligandu dochází k rozštěpení na 2 nebo více hladin s rozdílnou E, což umožňuje absorpci fotonu. Rozdíl vzniklých energetických hladin závisí na síle elektrostatického pole ligandu. Př.:[Cu(H2O)6]2+ absorbuje při 790 nm, či [Fe(CN)6]3-.
David MILDE, 2014
ACH/IM
6
21.10.2014
INSTRUMENTACE KOLORIMETR(ie) – vizuální porovnávání intenzity zbarvení vzorku a standardu nebo řady standardů. FOTOMETR(ie) – objektivní měření prošlého toku záření:
FOTOMETR – barevný filtr k vymezení . SPEKTROFOTOMETR – obsahuje monochromátor.
David MILDE, 2004
INSTRUMENTACE Zdroje záření: D2 výbojka s W žárovkou; Xe vysokotlaká výbojka Detektory: fotonásobič, CCD Materiál kyvet: sklo, křemen, plast
David MILDE, 2004
ACH/IM
7
21.10.2014
Aplikace UV-Vis spektrometrie Kvalitativní analýza Kvantitativní analýza:
Analýza anorganických solí – např. kyanidy, amonné ionty, fluoridy. Př.: fosforečnany – reakce s (NH4)2MoO4 a SnCl2 – vzniká molybdenová modř a měří se absorbance při 690 nm. Analýza nízkých koncentrací kovů – Cu, Hg, Al, Zn, … Př.: stanovení Fe po reakci s o-fenanthrolinem v kyselém prostředí. Stanovení organických látek – př. fenoly. Aplikace v klinické analýze: cholesterol v séru, kyselina močová, glukóza, celkové proteiny v séru, …
Průmyslové aplikace: farmaceutický, potravinářský, sklářský, výroba barev. Další vybrané aplikace: stanovení látek ve směsi, titrace, studium komplexů. David MILDE, 2014
Stanovení 2 látek ve směsi Je možné provést díky aditivním vlastnostem LambertBeerova zákona. Proměřením čistých látek získáme jejich ε při dvou zvolených vlnových délkách. Proměříme směsný vzorek, př: stanovení Fe3+ a Cu2+ ve směsi po reakci s Ru(CN6)4-
David MILDE, 2014
ACH/IM
Pavel Šiman, FAF UK
8
21.10.2014
Studium komplexů – Jobova metoda (metoda kontinuálních variací) Slouží k určení stechiometrického složení a podmíněné konstanty stability komplexu: M + yL MLy Měří se série roztoku s konstantním ntot a proměnným nM a nL (ekvimolární roztoky): ntot = nM + (nL)i (X L )i
(n L )i n to t
X M 1 (X L )i Maximum Abs je dosaženo pro stechiometrické složení komplexu. Je-li to možné měříme při , kde absorbuje pouze komplex.
y
XL XL XM 1 XL
David MILDE, 2004
XL = 0,75 y = 3 ML3 XL = 0,5 y=1 ML XL = 0,67 y=2 ML2
Spektrofotometrické titrace Určování BE na základě změny absorbance s přídavkem titračního činidla. Tento způsob titrace je experimentálně jednoduchý a má uspokojivou přesnost. Titrační křivky: A. B. C.
Absorbuje pouze titrační činidlo (titrace s uvolňováním Br2, I2). Absorbuje produkt titrační reakce. Absorbuje pouze titrovaná látka (stanovení Pb titrací chelatonem uvolňování xylenové oranže z komplexu s Pb).
David MILDE, 2004
ACH/IM
9
21.10.2014
(FOTO)LUMINISCENČNÍ SPEKTROMETRIE (Emisní spektrometrie)
Teorie fotoluminiscence Jde o emisi záření látkou, které bylo před tím absorbováno. Dělení: FLUORESCENCE, FOSFORESCENCE. Návrat látky z excitovaného (doba života excitovaného stavu 10-5 – 10-9 s) do základního stavu – relaxace:
Vibrační (nezářivá) deaktivace – nadbytek E uvolněn ve formě tepla Emise – nadbytek E uvolněn jako foton (zářivá deaktivace) Relaxace pomocí fotochemické reakce: A* X + Y
Elektronové stavy organických molekul se dělí na:
singletový – základní i excitovaný, opačné spiny obou e-, tripletový – pouze excitovaný, stejné spiny dvou e-, dubletový – lichý e- u volného radikálu, který může zaujmout 2 orientace.
David MILDE, 2014
ACH/IM
10
21.10.2014
Teorie fotoluminiscence FLUORESCENCE: emise fotonu při přechodu z S1 (ojediněle z S2) do základního stavu S0. Doba života excitovaného stavu (za jakou dobu dojde k emisi) závisí na při absorpci záření: pro 104 – 105 l.mol-1.cm-1 je doba 10-7 – 10-9 s, pro 101 – 102 l.mol-1.cm-1 je doba 10-5 – 10-6 s.
Fluorescence odeznívá velmi rychle po ukončení excitace (vypnutí zdroje excitačního záření).
FOSFORESCENCE: emise fotonu při přechodu z T1 na S0. Doba života excitovaného T stavu je 10-4 – 102 s fosforescenční záření sledujeme delší dobu po ukončení excitace.
Elektron po absorpci záření nejprve přejde z S1 na T1 (přechod z S0 na T1 je zakázaný)! David MILDE, 2004
Teorie fotoluminiscence Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram)
VR … vibrační relaxace (vibrational relaxation) IC … vnitřní konverze (internal conversion) ISC … mezisystémový přechod (intersystem crossing)
David MILDE, 2014
ACH/IM
11
21.10.2014
Deaktivační procesy v molekulách Preferovaný přechod do základního stavu je ten, který minimalizuje dobu života excitovaného stavu! Nezářivá deaktivace Vibrační relaxace – rychlý proces (10-12 s), molekula ve vyšším vibračním stavu snižuje svou E přechodem na nejnižší vibrační podhladinu excitovaného (i základního) stavu. Vnitřní konverze – molekula na nejnižší vibrační podhladině excitovaného stavu přechází do vyšší vibrační podhladiny nižšího energetického stavu. Kombinací těchto dvou přechodů může molekula přejít z excitovaného do základního stavu bez emise fotonu! Vnější konverze – nadbytek E je předán rozpouštědlu či jiné složce matrice. Mezisystémový přechod – molekula na nejnižší vibrační podhladině excitovaného stavu přechází na vysokou energetickou podhladinu stavu s nižší E a jiným spinem.
Zářivé deaktivace: fluorescence a fosforescence David MILDE, 2004
Frank-Condonův princip Elektronové přechody jsou velmi rychlé (10-15 s). FrankCondonův princip umožňuje pochopit podstatu elektronových přechodů. Hmotnost atomových jader je několik řádů větší než hmotnost elektronu a vzájemný pohyb jader atomů v molekule (vibrace molekuly) je pomalejší (10-12 s). Přechody elektronů z jednoho stavu do druhého jsou rychlejší než rychlost změny délky vazby mezi atomy absorbující molekuly. Tzn., že vzdálenost jader atomů je konstantní po dobu excitace elektronu. Vzhledem k tomu, že molekuly stále vibrují a nacházejí se v různých vibračních stavech, výsledné spektrum bude superpozicí všech přechodů a bude mít pásový charakter. David MILDE, 2014
ACH/IM
12
21.10.2014
Frank-Condonův princip
Potenciálové jámy s vibračními podstavy. Minimum křivky potenciální energie odpovídá rovnovážné vzdálenosti mezi oběma atomy. Vysvětlení vibronických přechodů z hlediska kvantové chemie, nejpravděpodobnější na ten vibrační podstav, kde je největší překryv se základním.. David MILDE, 2014
Fluorescence Lze ji pozorovat pouze pokud je účinnějším prostředkem deaktivace než nezářivé přechody. Intenzita fluorescence IF: (F = NF/N … flourescenční výtěžek)
I F k F (P0 PT )
I F 2,303 k F P0 bc
Z Lambertova Beerova zákona PT P0 10 bc
IF roste s F, P0, a koncentrací.
Vliv teploty a viskozity rozpouštědla na F.
Fluorescenční přechod může skončit na různých vibračních podhladinách S0 pásové spektrum. Ke fluorescenci dochází z nejnižší podhladiny S1, nezáleží na tom, zda byla molekula excitována do S1 nebo do vyšších singletových hladin (např. S2). David MILDE, 2004
ACH/IM
13
21.10.2014
Excitační a emisní spektra VLIV STRUKTURY NA LUMINISCENCI 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Luminiscenci neposkytují nasycené uhlovodíky a zřídka nenasycené alifatické uhlovodíky. Intenzivní F: aromatické uhlovodíky s nízkoležícími S stavy *. P vykazují aromatické sloučeniny s C=O nebo heteroatomy. Vliv substituce aromatického jádra na F: -NO2, -OH, … Aromáty s halogen substituenty zvyšují P a snižují F. Luminiskují zejména velké a pevné rovinné molekuly s rigidní strukturou.
David MILDE, 2004
Souvislost absorpčních a emisních spekter Luminiscence začíná na nejnižší vibrační podhladině S1 (T1) Eemit je menší než Eabs. Luminiscence se objevuje u vyšších než absorpce. Luminiscenční spektrum bývá zrcadlovým obrazem absorpčního. Mohou se protínat v 0. 0 odpovídá nejmenší E pro absorpci a je v absorpčním spektru nejintenzivnější.
David MILDE, 2004
ACH/IM
14
21.10.2014
Instrumentace - fluorescence 2 typy fluorescenčních spekter: 1.
2.
Excitační: IF v závislosti na budícího záření při konstantní emitovaného záření – slouží k určení účinné pro vyvolání fluorescence. Emisní: IF v závislosti na emitovaného záření při konstantní excitačního záření.
Fluorimetr: k vymezení slouží filtry; zdroj: Hg výbojka. Spektrofluorimetr: mřížkové monochromátory; zdroj nejčastěji Xe vysokotlaká výbojka (spojité spektrum). Optická dráha mezi zdrojem a detektorem svírá 90°. Kyvety: 1 cm, křemen Rozpouštědla: nesmí fluoreskovat.
David MILDE, 2004
Instrumentace - fosforescence Nutné rozlišit fluorescenci a fosforescenci!
PŘÍPRAVA VZORKŮ Kapalné: zmrazení v kapalném N2 vytvoří opticky čistou pevnou látku (vzorek v rozpouštědle). Pevné: nanesení vzorku na pevný substrát (desky tenkovrstvé chromatografie) – možno měřit za laboratorní teploty. David MILDE, 2004
ACH/IM
15
21.10.2014
Analytické využití KVALITATIVNÍ ANALÝZA: menší využití – zejména pro polycyklické aromáty; molekuly s jemnými strukturními rozdíly mají velmi podobná spektra. KVANTITATIVNÍ ANALÝZA:
Přímé stanovení polyaromatických uhlovodíků, vitamínů či steroidů. Stanovení aniontů na principu zhášení fluosrescence. Stanovení kovů – vytvoření komplexu, př. Al s alizarinovou červení. Fluorescenční detektor pro HPLC. David MILDE, 2014
Analytické využití • Chemiluminiscence: chemická reakce produkuje molekuly v excitovaném stavu, které emitují fotony. [A] + [B] → [excitovaný meziprodukt] → [produkty] + h Př.: reakce luminolu s peroxidem vodíku luminol + H2O2 → 3-aminoftalát* → 3-aminoftalát + h • Bioluminiscence: k reakcím produkujícím molekuly v excitovaném stavu dochází v biologických systémech, např. světlušky, meduzy, některé ryby.
luminol
Základní princip je oxidace luciferinu (biologický pigment), při níž se 96 % energie emituje ve formě záření a 4 % ve formě tepla. luciferin + O2 → oxyluciferin + h David MILDE, 2014
ACH/IM
16
