Úvodní přednáška k PCR Doc. RNDr. J: Pazlarová, CSc
Deoxyribonukleová kyselina Deoxyribonucleic acid DNA
Úvod Studie na jednobuněčných organismech vedly k poznání, že genetické informace, podle kterých se tvoří jednotlivé proteiny těchto organismů, jsou obsaženy v genech, tvořených deoxyribonukleovými kyselinami (DNA). Teprve určení struktury DNA umožnilo pochopit, jakým způsobem je zakodována instrukce pro tvorbu
bílkovin.
DNA a její struktura Molekula DNA se skládá ze dvou komplementár-ních řetězců nukleotidů. Dlouhá polynukleotidová vlákna DNA jsou složeny ze čtyř typů podjednotek (monomérů).
Nukleotidy jsou propojeny pomocí kovalentních vazeb deoxyribosy a fosfátové skupiny, čímž se tvoří t.zv."skelet", ve kterém se střídají cukr-fosfát-cukr-fosfát atd. Na deoxyribosu jsou navázány dané báze, a to adenin (značený A),cytosin (C), guanin (G) nebo thymin (T).
Složky DNA CH2OH OH
O
2-deoxy-D-ribosa H
NH2 N
H
O H
OH
N
Guanin
N
N
H
N N
NH2
H O
N H2
H3C
N
NH
Thymin
N
Cytosin
H
N
Adenin N
H
H
N
O
O
H
H
Ve vláknech DNA jsou umístněny nukleosidy s anti-konformací NH2
příklad : deoxyadenosin
N
H
N
O CH2 O H
H
HH
OH
H
N N
Dvojšroubovnice DNA Oba polynukleotidové řetězce vytváří dvojšroubovnici pomocí vodíkových můstků mezi nukleotidovými bázemi, a to mezi bází purinového a bází pyrimidonového typu (adenin -thymin nebo guanin - cytosin a naopak). Toto párování se ukázalo z hlediska energetického jako nejvýhodnější. O
O H
N
N
O
N H NH
CH3
Thymin Adenin
N
H
NH
H
N
N N
N
N N
N
NH H
O
N
Cytosin Guanin
Vzhledem na způsob vytváření polymeru je zřejmé, že řetězec polynukleotidů je polarizován. Je-li zakončení -OH skupinou sacharidu, je označován jako 3´, končí-li fosfátovou skupinou, pak 5´. Všechny báze jsou uvnitř dvojšroubovnice, cukrofosfátový skelet je pak vně.
Transkripce DNA v prokaryotní buňce Biologická informace je zakódována pomocí čtyřpísmenkové abecedy, a to : G-C
A-T
T-A C-G
DNA neřídí přímo syntézu bílkovin, nýbrž je zkopíro-vána transkribována - do jiné nukleové kyseliny - do ribo-nukleové kyseliny (RNA). Teprve podle RNA jsou tvořeny bílkoviny.
Transkripce DNA do RNA enzymem RNApolymerasou RNA-transkript
RNA-polymerasa
-faktor místo rozepnutí
dvojšroubovnice DNA
místo opětného spojení
Buňka uskutečňuje své genetické informace teprve
transkripcí a translací DNA do RNA a pak do bílkovin. Nejprve dojde k rozvolnění určitého úseku dvojšroubovnice DNA, pak jeden z uvolněného úseku slouží jako matice (templát) pro tvorbu RNA.
Replikace DNA
semikonzervativní způsob replikace DNA
in vivo složitý komplex interakcí mezi proteiny a DNA počátek oriC , rozvolnění dvoušroubovice DNA polymerasa - klíčová úloha
Bakteriální RNA-polymerasa Bakteriální RNA-polymerasa se váže slabě na molekulu DNA. Jakmile RNA-polymerasa náhodně narazí na DNA, začne po ní rychle skluzem „lézt“.
Když RNA-polymerasa nalezne v sekvenci DNA promotor, který má informaci o začátku transkripce, pevně se naváže,
rozvolní v krátkém úseku dvojšroubovnici DNA a začne vytvářet jednořetězcový úsek RNA.
mRNA Zdrojem výstavby RNA jsou ribonukleosidtrifosfáty (ATP, UTP, CTP a GTP). V RNA je thymin nahražen uracilem, takže, kde je v DNA thymin, je v RNA uracil. Takže pro RNA je čtyřpísmenkový kód A-U G-C C-G U-A
Polymerázová řetězová reakce • Autor – Kary Mullis – Nobelova cena za chemii, 1993 • Molekulárně genetická metoda • Selektivní zmnožení určité oblasti DNA způsobem podobným in vivo replikaci
Polymerázová řetězová reakce Princip PCR je založen na využití DNA polymerázy pro opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly DNA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy (primery), které nasedají na templátovou DNA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA.
PCR je velice citlivá metoda umožňující detekci až jediné buňky. Mnohonásobné amplifikace je dosaženo opakováním tří základních kroků - denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken
Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů • templát – DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců. Pro reakci PCR se používá genomová DNA o koncentraci přibližně 10 ug/ml. • DNA polymeráza – termostabilní enzym používaný k syntéze nové DNA ve směru 5´-3´ podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru až po jeho konec. Enzym Taq DNA, který se nejčastěji používá pro PCR, je izolován z bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 °C. Enzym zůstává při této teplotě aktivní až 40 minut. • dNTP - nukleotidtrifosfáty (adenin, guanin, cytosin a thymin)
annealing temperature
extending temperature
Teploty řídící PCR • Denaturace DNA – 94 – 95 °C • Prodlužování , extense 72 °C • Nasednutí, annealing velká variabilita teplot. Hlavní faktor - GC% primerů. • Primery bohaté na GC - 63 °C, 62 % • Primery s nízkým obsahem GC - 45 °C 33 %
Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů • primery – jsou oligonukleotidy (obvykle 20-25 bazí) , které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a které vymezují úsek templátu, který bude amplifikován master mix – reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce. Je složena z koncentrovaného pracovního pufru obsahujícího hořečnaté ionty zajišťujícího vhodné podmínky pro aktivitu polymerázy, směsi dNTP, polymerázy, specifických primerů a vody. • termocykler (teplotní cyklátor) - je zařízení, ve kterém za optimálních teplotních podmínek probíhá PCR reakce. • marker – velikostní standard, používá se k odhadu velikostí DNA produktů na základě pohyblivosti v agarózovém gelu
1) primer (oligonucleotide) sequence random primers will amplify anything (usually a mixture of short oligonucleotides (6-10 nt) degenerate primers, contain a few “wobbly” nucleotides (mixture of oligos with a different nucleotide in the wobbly positions), can bind multiple related templates eg. TGYGCNGGRCCAT (N-any base; Y-either pyrimidine, R-either purine) specific primers, designed to amplify exactly matching template
2) annealing temperature
Computer programs and web-sites exist that can calculate Tm for primers in various salt concentrations, as well as predict possible secondary structure (hairpins) or primer-dimer formation. Custom “oligo” synthesis fully automated, commercially available, relatively cheap. Many primer modifications available (fluorescence, DIG, end-group tagging, etc)
2) annealing temperature
Computer programs and web-sites exist that can calculate Tm for primers in various salt concentrations, as well as predict possible secondary structure (hairpins) or primer-dimer formation. Custom “oligo” synthesis fully automated, commercially available, relatively cheap. Many primer modifications available (fluorescence, DIG, end-group tagging, etc)
Amplifikace DNA – tři opakující se kroky: 1. denaturace
2. annealing 3. polymerace Enzym DNA polymerase používá primery jako startovací body pro syntézu nového řetězce
Při teplotě 94°C se oddělují řetězce DNA
50-60°C – nasedají primery
1.
2.
3.
Polymeráza pokračuje v syntéze nového řetězce komplementárně k cílové DNA sekvenci
Cílová DNA sekvence, ohraničená primery, je zdvojená a proces může znovu začít
PCR PCR se používá převážně pro amplifikaci úseků DNA do 2000 bazí. S větší délkou roste pravděpodobnost chyb polymerasy. Používané oligonukleotidové primery mají mezi 18 - 25 nukleotidy, důležitá je rovnoměrná distribuce oblastí bohatých na G/C a A/T páry, specifický annealing a pevnost vazby při 65-75 °C. Pro PCR je důležitá “čistá práce”, tj. vyhýbat se kontaminacím v laboratoři (rukavice, nekontaminované chemikálie atd.).
Produkty PCR se analyzují elekroforézou (velikost), jinou možností je hybridizace se značenými oligonukleotidy, detekce značenou protilátkou Real-time termocykléry - amplifikovaná DNA je detekována v exponenciální fázi citlivými on-line metodami (fluorescence -proby, barviva).
Neúspěšná PCR • Špatně izolovaná genomová DNA • Kontaminace externí DNA, dochází k tvorbě nežádoucích sekvencí. • Jaká je prevence? Rozdělení pracovního prostoru do oblastí, ve kterých se provádí jednotlivé kroky. • Odstranění inhibitorů PCR(cerebrospinální tekutina, hemoglobin, laktoferin, faeces)
Facilitátory - usnadňovače PCR
• BSA , hovězí serum albumin • Betain • Zlepšují specifitu a přesnost syntézy DNA
Interní kontrola PCR • Interní kontrola ( IC) je tvořena molekulami nukleové kyseliny, které (i) obsahují vazebná místa pro dané primery, • (ii) jsou odlišitelné od aktuální cílové molekuly přítomností specifické oblasti – probe binding region. • Při úspěšné amplifikaci vzorku s cílovou NK a IC, vznikají dva typy produktů. • Správný poměr IC a primerů nutno vyzkoušet.
Závěr : 1) Reakci PCR je nutné empiricky optimalizovat 2) Existují protokoly,které budou funkční pro většinu aplikací (“rutinní PCR”) t.zn. Byly již někým optimalisovány
Detekce Campylobacter jejuni, C. coli a C. laridis pomocí PCR • Složení PCR reakční směsi: Primery – specifické pro 16S RNA genu – 0,44 μM Nukleotidy – 200 μM Tth DNA polymeráza – 1U Pufr pro Tth DNA polymerázu – 1x Templát DNA – 2 μl
Voda do objemu 50 μl
• Teplotní režim PCR: Proces
Teplota [°C]
Čas
Počáteční denaturace
94
2 min
35x cyklus denaturace
94
30 sec
annealing
58
15 sec
syntéza
72
30 sec
Závěrečná syntéza
72
4 min
Způsoby detekce PCR produktu po ukončení amplifikační reakce • pomocí barviv integrující s DNA (Ethidium bromid) • radioaktivní značka – přímo v PCR produktu nebo hybridizační sondě (radioaktivní izotopy) • neradioaktivní značka – digoxigenín, biotín (protilátky konjugované s enzymem), fluorescenční barviva a enyzmy
Elektroforetická detekce produktu PCR
• Nejčastěji – agarosová gelová elektroforéza • Fragmenty DNA –elektrické pole – podle velikosti • Může být detekován až 1 ng DNA • Gel – barven ethidium bromidem • Ethidium bromid – interkalační činidlo vážící se mezi vlákna DNA a floreskuje po ozářením UV o λ 260360 nm
Způsoby detekce PCR produktu po ukončení amplifikační reakce • pomocí barviv integrující s DNA (Ethidium bromid) • radioaktivní značka – přímo v PCR produktu nebo hybridizační sondě (radioaktivní izotopy) • neradioaktivní značka – digoxigenín, biotín (protilátky konjugované s enzymem), fluorescenční barviva a enyzmy
Výsledky PCR Mr
1.
2.
3.
4.
Mr – marker 100bp
1500 bp
1. Pozitivní kontrola
2. Negativní kontrola 500 bp
3. DNA C. jejuni 4. DNA C. coli 287 bp
100 bp
PCR Salmonella profile II, cycler Biometra - T gradient Mr A1 2 3 4 5 B1 2 3 4 5 C1 2 3 4 5 D1 2 3 4 5 Mr
372 bp
A concentration 1.4*108 cells of Samonella in 1ml, added 1.4*105 in each PCR reaction B concentration 1.4*107 cells of Samonella in 1ml, added 1.4*104 in each PCR reaction C concentration 1.4*106cells of Samonella in 1ml, added 1.4*103 in each PCR reaction D concentration 1.4*105 cells of Samonella in 1ml, added 1.4*102 in each PCR reaction incubation:37ºC, 24 hours, BHA plates
Analýzy po elektroforetickém rozdělení • hybridizační analýza – PCR produkt přenést na membránu – Southern blot – hybridizace s označenou specifickou DNA sondou • štěpení restrikčními enzymy – specifický produkt PCR – fragmenty DNA o známé délce
Detekce PCR produktu během amplifikační reakce = Real Time PCR • Systém TaqMan • 5´exonukleázová aktivita Taq DNA polymerazy a dvojitě značená fluorescenční oligonukleotidová sonda • sonda – 5´konec – fluorescenční značka - 3´konec – zhášecí značka
Reversní transkriptasa
• Reversní transkriptasa,
• RNA-dependentní DNA polymerasa, je enzym typu DNA polymerasy který přepisuje jednořetězcovou RNA na jednořetězcovou DNA. • Normální transkripce – přepis, znamená syntézu RNA z DNA; takže, reversní transkripce je opak- reverse – tohoto procesu. • Reversní transkriptasa byla objevena Howardem Teminem na Universitě Wisconsin-Madison, a nezávisle také Davidem Baltimorem v roce 1970. Oba dva získali v roce 1975 Nobelovu Cenu za fysiologii a lékařství
Příklady reversní transkriptasy Běžné příklady reversní transkriptasy zahrnují: HIV-1 reversní transkriptasu z virusu lidské imunodeficience (human immunodeficiency virus) typ 1 (PDB 1HMV) M-MLV reversní transkriptasa z leukemického viru myší (Moloney murine leukemia virus) AMV reversní transkriptasa z ptačího viru (avian myeloblastosis virus) Telomerasa reversní transkriptasa , která reprodukuje telomery eukaryotických chromosomes
Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů • Klasický přístup (sledování fyziologických vlastností) - morfologie - nutriční požadavky - chemie buněčné stěny - struktura zásobních látek - obsah a složení pigmentů - schopnost využívat různé zdroje energie - patogenita - nároky na vodu, teplo, kyslík, tolerance k pH - citlivost k antibiotikům
Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů • Moderní metody identifikace (teorie) - klasické metody nedokáží dostatečně přesně mapovat fylogenezi jednotlivých druhů - nutnost najít spolehlivé fylogenetické markery 1965 (Zuckerkandl a Pauling) naznačili, že jediný kdo se přímo účastní evolučního procesu jsou molekuly, resp. molekulární sekvence molekuly RNA úzce spojené s translací (transférové a ribozomální RNA) (fylogeneze = proces, ve kterém se řadí organismy do linie, která se vyvinula oddělením od společných předků)
Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů • Moderní metody identifikace (teorie) - molekuly rRNA (16S a 23S rRNA) mají všechny předpoklady fylogenetických markerů (univerzální distribuci, strukturální i funkční zachovalost a dostatečnou velikost)
Model struktury 16S rRNA E. coli Organizace ribozomální DNA (rDNA) u různých druhů
Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů • Moderní metody identifikace (praxe) - významné vědecké objevy RESTRIKČNÍ ENDONUKLEÁZY (1978 Nobelova cena za medicínu: Daniel Nathans, Hamilton Smith) Revoluci v práci s nukleovými kyselinami přinesl objev tzv. restrikčních endonukleáz II. typu, které rozpoznávají v molekule DNA krátké specifické sekvence a v místě výskytu této sekvence molekulu štěpí. Jako příklad můžeme uvést nejznámější restrikční endonukleázu EcoRI (podle zdroje - bakterie Escherichia coli, RI = restriktáza č. 1), která rozpoznává sekvenci 5'-GAATTC-3' a štěpí fosfodiesterovou vazbu v řetězci mezi prvním guanosinem (G) a druhým adenosinem (A).
Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů •
Moderní metody identifikace (jednotlivé metody) - PCR (varianty a modifikace) a) náhodná PCR neboli náhodná amplifikace polymorfní DNA (RAPD) b) interrepetitivni PCR (REP-PCR) c) amplifikace vnitřních přepisovaných mezerníků (ITS-PCR) - detekce polymorfismů
a) polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) b) polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) c) polymorfismus délky fragmentů DNA vytvořených cleavasou (CFLP)
- sekvenování a) chemická metoda Maxamo-Gilbertova b) enzymová Sangerova metoda
