Ústav organické chemie a technologie Fakulta chemicko-technologická Univerzita Pardubice
2013
Zajímavosti z našich laboratoří Miloš Sedlák
Příběh první:
Biomimetická mineralizace
Některé přírodní biominerály CaCO3
Coccolith
Perleť Ušeně mořské
Perleťový korál
(kalcit – trigonální systém)
(aragonit – ortorombický systém)
(vaterit – hexagonální systém)
Sedlák M., Kašparová P.: Vesmír, 2003, 82,616.
Princip funkce molekulárního nástroje při mineralizačním experimentu
“rukojeť“
“čelo”
= hydrofilní, vysoká afinita k minerálu = hydrofilní, zanedbatelná afinita k minerálu
Amfifilní chování při kontaktu s povrchem minerálu umožňuje - řídit velikost a tvar částic - stabilizovat koloidní systém +
minerální superstruktura
kontrola modifikace krystalu = minerál
bez šablony
se šablonou
Syntéza série modifikovaných hydrofilních blokových kopolymerů Polymerní templáty pro biomimetický růst minerálních krystalů m - PEG O CH2 (5000 g mol–1)
Cl
m-PEG O
O
O
Polyethyleneimine (700, 2000 g mol–1)
OH
OH m - PEG
O
H N
H x N
BrCH2COOH
m - PEG
N y
NH2
O
SO 2
O
R(H) N
R(H)
PO 3H2 CH3N =C=S
N
xN
y
NH PEG-b-PEI-R
PEG-b-PEI R: –CH2COOH, –(CH2)2PO3H2, –(CH2)3SO3H, CH3N=C(SH)–
Sedlák M., Cölfen H., Antonietti M.: Macromol. Chem. Phys. 1998, 199, 247.
R(H)
Provedení mineralizačního experimentu
Sedlák M., Cölfen H., Antonietti M.: Macromol. Chem. Phys. 1998, 199, 247.
Vliv přítomnosti polymerního templátu s různými funkčními skupinami na morfologii krystalů síranu barnatého 2m
0.5 m
PEG-b-PMAA-Asp
PEG-b-PEI-SO3H 0.5m
2m
bez aditiva 2 m
PEG-b-PEI-COOH
PEG-b-PEI-PO3H2
Sedlák M., Cölfen H.: Macromol. Chem. Phys. 2001, 202, 587 -597.
Vliv polymerního templátu modifikovaného chirálními ligandy na morfologii a resoluci krystalů tartrátů OH O O
O
R(H)
R(H)
N x
n
OH H
HO
H
y
NH PEG-b-PEI-R
H
N
N
NH2
R(H) N
CO H
H
OH
N
H
OH
H
PEG-b-PEI-L-Histidin.
PEG-b-PEI-L-Glukonát.
H CO N H
PEG-b-PEI-L-Prolin.
H
O
HO
Samotný CaT
HO
O
OH
PEG-b-PEI-L-Askorbát.
Mastai Y., Sedlák M., Cölfen H., Antonietti M.: Chem. Eur. J. 2002, 8, 2429-2437.
Další možnosti využití templátů Příprava a charakterizace „nanorobotu“ určeného k vychytávání cholesterolu z vodného prostředí Chol HN
H3C CH 3 H3C O Cl
CH 3 CH 3
H H
CH 3
H3C
O
~112
mPEG-b-PLL
H
O
TEA
O
O
H N O
N H n
NH 2
mPEG-b-PLL-Chol NH
Chol
– sledováno zvyšování velikosti micel - zachytávání molekul cholesterolu prostřednictvím nekovalentních interakcí Počet zachycených molekul cholesterolu na molekulu polymeru
Polymer
Velikost micel (nm) polymer
Velikost micel (nm) polymer + zachycený chol.
mPEG-b-PLL8.5-Chol3
6.5
28
257
PLL3-b-PEG-b-PLL4-Chol6
21
51
274
mPEG-NH-Chol1
6.7
16
202
Drabinová E.; Cölfen.; Sedlák, M.: připraveno k publikování.
Příběh druhý: Nanosystémy pro transport léčiv
Prednisolon – příprava konjugátů Steroidní léčivo s vysokým terapeutickým potenciálem: Protizánětlivé léčivo (revmatoidní artritida, roztroušená skleróza) Imunosupresivní léčivo po transplantaci of orgánů.
Vedlejší efekty: soubor endokrinologických poruch (Cushigův syndrom) nárůst tělesné hmotnosti, ukládání tuku; Další rizika: diabetes, zvýšení krevního tlaku, osteoporóza Bílková E., Sedlák M., Dvořák B.,Ventura K., Knotek P., Beneš L.: Org. Biomol. Chem. 2010, 8. 5423. Bílková E., Sedlák M., Imramovský A., Chárová P., Knotek P., Beneš L. Int. J. Pharm. 2011, 414, 42-47. Bílková, E.; Imramovský, A.; Sedlák M.: Curr. Pharm. Design 2011, 17, 3577-3595. 2
Perorální konjugát s časově zpožděnou pH senzitivní vazbou (polypseudorotaxan)
+
α-cyklodextrin
Charakterizace polypseudorotaxanu Řádková skenovaní tunelová mikroskopie (STM)
VOLNÝ PREDNISOLON
Studium kysele-katalyzované hydrolýzy
konjugátu a polypseudorotaxanu
Rychlost kysele-katalyzovaného uvolňování prednisolonu z nosiče je řízena:
1) pH-hodnotou prostředí, 2) Molekulární ochranou -cyklodextrinem 3.5 zpomalené uvolňování prednisolonu
Po 1h stání polypseudorotaxanu v modelovím prostředí žaludečního obsahu (HCl, pH = 2): 85% of prednisolonu zůstává navázáno na nosiči
Onemocnění tuberkulózou (TBC) TBC – nejrozšířenější a nejnebezpečnější infekční onemocnění Podle WHO – ročně nově diagnostikováno 9 mil. lidí a 1,5 mil. zemře Nejohroženější skupiny lidí – HIV infekční, – maligně nemocní – diabetici – závislí na alkoholu a tabáku – postižení silikózou – geneticky predisponovaní
Původce – Mycobacterium tuberculosis popř. Mtb - komplex
Formy TBC – plicní (nejčastější : Mtb nejlépe roste ve tkáních bohatých na kyslík) – mimoplicní WHO report 2012; http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/75938/1/9789241564502_eng.pdf 2
Prevence a léčba TBC – Vakcinace: aplikace oslabeného kmenu M. bovis (BCG vakcína) – Léčba: užívání antituberkulotik (5 skupin)
1. Perorální antituberkulotika první volby
WHO report 2008; http://whqlibdoc.who.int/publications/2008/9789241547581_eng.pdf
17
Využití nanočástic magnetitu Biokompatibilní, medicinálně využívané
Nanočástice Fe3O4@SiO2 Snadno připravitelné, jednoduché zavedení funkčních skupin
Možnost cíleného transportu aplikací externího magnetického pole
Marszall, M.P. :The Development of Magnetic Drug Delivery and Disposition, The Delivery of Nanoparticles, 18 Abbass A. Hashim (Ed.), INTECH, Shangai 2012.
Příprava nanočástic Fe3O4@SiO2-NH2 1. Hydrofilní nanočástice Fe3O4 (FeSO4/NaOH, NaNO3, citronan sodný, 100 °C) Fe2+ + 2OH–
Fe(OH)2
3Fe(OH)2 + ½ O2 Fe(OH)2 + 2FeOOH + H2O Fe(OH)2 + 2FeOOH Fe3O4 + 2H2O 2. „Core-shell“ nanočástice Fe3O4@ SiO2 (sol-gel metoda)
3. Nanočástice Fe3O4@ SiO2 –NH2
McCarhy S.A.; Davies G-L., Gunko Y.K.: Nature Protocols 2012, 7, 1677–1693.
Příprava konjugátu Fe3O4@SiO2-INH 4. Aktivace isoniazidu
5. Příprava nanočástic konjugátu Fe3O4@ SiO2 –INH
Charakterizace konjugátu Fe3O4@SiO2-INH
(440) (422) (511)
(400)
(220)
(222)
(b)
(111)
Intensity (a.u.)
(311)
RTG difrakce práškového vzorku
(a)
10
20
30
40
50
60
70
2 (degree)
Difrakční píky Fe3O4@SiO2–INH podobné samotným nanočásticím Fe3O4@SiO2–NH2; odpovídají klastrům kubických spinelových nanokrystalů Fe3O4 . Průměrná velikost krystalů Fe3O4 v klastrech a činí 13 nm (Sherrer). 21
Charakterizace konjugátu Fe3O4@SiO2-INH Histogram distribuce hydrodynamické velikosti částic (DLS)
115 ± 60 nm
Morfologie částic Fe3O4@SiO2–INH (SEM)
Nanočástice mají sférický charakter, vysycháním roztoku nanočástic vznikají aglomeráty
Studium uvolňovaní isoniazidu z Fe3O4@SiO2-INH za podmínek in vitro
Roztok 1·10–2 mol·l–1 HCl; t1/2 = 65 s (kobs = 1.07·10–2 s–1) Fosfátový pufr pH = 5.3 (2·10–2 mol·l–1) t1/2 = 116 s (kobs = 5.98·10–2 s–1). Fosfátový pufr pH = 7.4 (1·10–1mol·l–1) konjugát stabilní
Studium toxicity Fe3O4@SiO2-INH na buněčných kulturách Testováno na buňkách lidského prsního adenokarcinomu SK-BR-3, sledována adheze a proliferace buněk pomocí xCELLigence systému
Časová závislost normalizovaných CI hodnot pro INH A pro Fe3O4@SiO2-INH má podobný charakter
Buněčná toxicita konjugátu je srovnatelná se samotným isoniazidem.
Aplikační možnosti Kromě případné intravenózní aplikace lze uvažovat i o použití nasálním (vhodné pro plicní formy TBC)
Sedlák, M.; Bhosale D.S.; L.; Beneš, L.; Palarčík, J.; V.; Kalendová, A.; Královec, K.; Imramovský, A.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23, 4692.
Příběh třetí : výrobní omyl v tunovém měřítku Versalová červeň BRN (C.I. Pigment Red 144) Cl
Cl N N OH CH3 HN O O N H Cl HO N N
Synthesia a.s. Pardubice producent organických pigmentů Cl
Cl
2-Chlor-5-methyl-1,4-fenylendiamin
CH3
CH3
NHAc
NHAc
Cl
NH2
1) redukce
HNO3/H2SO4 5 – 10 °C
CH3
2) hydrolýza
O2N
H2N Cl
Cl
„středový amin“ klíčový meziprodukt syntézy versalové červeně BRN
Kenner J, Tod CW, Witham EJ. Chem. Soc. 1925, 127, 2343; Terč J. Chem Prům 1976, 26, 641, Chem Abstr 1977, 86, 155286.
Pro syntézu versalové červeně byla dodána 1 t neznámé dosud nepopsané sloučeniny Fyzikálně-chemické parametry neodpovídají požadovanému 2-chlor-5-methyl-1,4-fenylendiaminu !
1H
NMR: 2 × CH3 (2,41; 2,65 )ppm, kyselé atomy vodíku v oblasti 5,6 – 6,4 ppm jeden signál aromatický Ar-H 6,71 ppm. 13C
NMR: 2 × CH3 (13,0; 16,4)ppm. aromatická oblast (Cq: 97, 122, 125, 132, 141, 150) ppm; CH: 114 ppm.
Elementární analýza a hmotnostní spektrum neznámé látky
empirický vzorec (C18H22Cl2N6O4S)n reakce s Ba(OH)2 poskytuje BaSO4
empirický vzorec - H2SO4 : (C18H20Cl2N6)n
GC-MS molekulový pík M = 195 sumární vzorec C9H10ClN3 (n = ½) 2-chlor-5-methyl-1,4-fenylendiamin: C7H9ClN2
diference s neznámou látkou: 1 atom dusíku v molekule
Předpoklad: zavedení jednoho atomu dusíku navíc – pravděpodobně nitrace do druhého stupně, při následné redukci dochází k cyklizaci
CH3
CH3 NHAc
NHAc
O2N Cl
N
redukce
HNO3/H2SO4 O2N
CH3
NO2 Cl
CH3 N H
H2N Cl
Neznámá dosud nepopsaná látka: 5-amino-4-chlor-2,7-dimethyl-1H-benzimidazol souhlasí s elementární analýzou, NMR, MS.
Rtg-difrakce neznámého vzorku po krystalizaci z dimethylformamidu CH3
ORTEP – potvrzena struktura 5-amino-4-chlor-2,7-dimethyl-1H-benzimidazolu (2 C9H10ClN3 · H2SO4 · 8 H2O).
N CH3 N H
H2N Cl
Intermolekulární vodíkové vazby v krystalu
Nezávislá syntéza 5-amino-4-chlor-2,7-dimethyl-1H-benzimidazolu
CH3
CH3
NHAc
NHAc HNO3/H2SO4
89%
5 – 10 °C O2N Cl
Cl HNO3/H2SO4
Klíčový proces – nitrace do druhého stupně – za běžných podmínek neprobíhá
Nezávislá syntéza 5-amino-4-chlor-2,7-dimethyl-1H-benzimidazolu CH3
CH3
NHAc
NHAc HNO3/H2SO4
89%
5 – 10 °C O2N Cl
Cl
bez katalýzy Fe3+
HNO3/H2SO4
neprobíhá !
5 – 10 °C
CH3
CH3 NHAc
H2N
NHAc
redukce
NH2
O2N
Cl cyklizace
NO2 Cl
5-amino-4-chlor-2,7-dimethyl-1H(3H)-benzimidazol
Klíčový proces – nitrace do druhého stupně –vyžaduje Fe3+katalýzu výrobce: znečištěné výchozí suroviny, nebo poškozený smalt reaktoru.
Studium vlivu železitých iontů na rychlost nitrace N-(5-chlor-2-methyl-4-nitrofenyl)acetamidu CH3
CH3 NHAc
NHAc
HNO3/H2SO4 5 – 10 °C
O2N
katalýza Fe3+ Cl 2
O2N
NO2 Cl 3
10 mol % Fe 3+ : 90 % konverze 2 3 za 5 h
50 mol % Fe 3+ : 90 % konverze 2 3 za 1 h
12
Nitrace katalyzována komplexem NO2[Fe(NO3)4] 2 HNO3 +
SO3
N2O5 + Fe(NO3)3
H2SO4 + N2O5
NO2+[Fe(NO3)4]–
Komplex je znám a byl připraven v krystalické formě a ověřen rtg-difrakcí G. Tikhomirov, I. Morozov, K. Znamenkov, E. Kemnitz, S. Troyanov: Z. Anorg. Allg. Chem. 2002, 628, 872–876.
Redukce N-(5-chlor-2-methyl-4,6-dinitrofenyl)acetamidu CH3 NHAc
H2N
NH2
Pd-C/H2/methanol Cl
CH3 NHAc
H2SO4/H2O O2N
NO2 CH3
Cl Fe/HCl/H2O
N CH3 N H
H2N Cl
Byl připraven vzorek identický s dodaným 5-amino-4-chlor-2,7-dimethyl-1H-benzimidazolem
Možné využití 5-amino-4-chlor-2,7-dimethyl-1H-benzimidazolu CH3 N CH3 N
N H
N H
Cl
O H O
O
Benzimidazol lze diazotovat, bylo připraveno barvivo s charakterem organického pigmentu hnědé barvy. Sedlák M., Drabina P., Panov I., Kopřivová R., Růžička A., Ventura K., Dyes & Pigments 2009, 81, 113 – 118.
Děkuji za pozornost
