Uracil a DNS-ben: hiba vagy jel? A dutpáz szabályozása és egy újonnan azonosított U-DNS nukleáz a Drosophila melanogaster fejlődésében

Uracil a DNS-ben: hiba vagy jel? A dUTPáz szabályozása és egy újonnan azonosított U-DNS nukleáz a Drosophila melanogaster fejlődésében.

Beke Angéla (A publikációkon a leánykori név, Békési Angéla szerepel)

Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta A biológia tudományok doktora, tudományos tanácsadó

A doktori iskola vezetője: Prof. Erdei Anna CMHAS, tanszékvezető egyetemi tanár Programvezető: Prof. Gráf László MHAS, tanszékvezető egyetemi tanár Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológia Doktori Iskola Szerkezeti Biokémia Program

Készült: a Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Központ, Enzimológiai Intézetében

1

Köszönetnyilvánítás Elsőként köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Vértessy Beátának, amiért lehetővé tette számomra, hogy ilyen érdekes, fontos és sok újdonságot rejtegető témában, innovatív és inspiráló közegben dolgozhatok, hogy tanácsaival, bátorításával, az egyéni kreativitás ösztönzésével és nem utolsó sorban őszinte barátságával mindvégig támogatott. Továbbá köszönettel tartozom, a munkában résztvevő valamennyi kollegámnak és kollaboráló partnerünknek: Zagyva Imrének az elsőrangú muslicaboncolásokért és festésekért, Dr. Hunyadi-Gulyás Évának a töménytelen sok minta kitartó és precíz tömegspektrometriás azonosításáért, az UDE fehérje klónozásáért Dr. Felföldi Ferencnek, a rekombináns UDE fehérje előállításában és jellemzésében nyújtott elengedhetetlen segítségért Muha Villőnek, Pukáncsik Máriának és Leveles Ibolyának. Hlavanda Emmának és Dr. Farkas Attilának köszönöm a sok-sok tanácsot, technikai segítséget és kölcsönkért eszközt, vegyszert. Az antiszérumok előállításáért Prof. Erdei Anna csoportjának tartozom hálás köszönettel. A témában további résztvevő kutatóknak: Németh (Pongrácz) Veronikának, Kovári Júliának, Nagy Ágnesnek, Kónya Emesének, Dr. Kele Zoltánnak, Klement Évának, Dr. Haracska Lajosnak és Burkovics Péternek köszönöm a szíves együttműködést. Köszönöm Dr. Homolya Lászlónak és Dr. Jankovics Ferencnek a konfokális

felvételekhez

nyújtott

lehetőséget

és

segítséget.

Lengyel

kollaboráló

partnerünknek, Janusz Bujnicki-nek és Jan Kosinski-nek köszönettel tartozom az UDE fehérje szerkezetmodellezéséért. A csoport minden tagjának köszönöm, hogy barátságukkal, és őszinte érdeklődéssel, hasznos tanácsokkal segítették munkámat: Dr. Barabás Orsolyának, Takács Enikőnek, Dubrovay Zsófiának, Varga Balázsnak, Dr. Tóth Juditnak, Merényi Gábornak. Köszönöm az Intézet volt és jelenlegi igazgatójának, Dr. Friedrich Péternek és Dr. Závodszky Péternek, hogy lehetővé tették számomra az Intézetben való munkát. Köszönettel tartozom továbbá az egész intézeti kollektívának azért a baráti légkörért, amiben a kutatómunka igazán örömteli lehet. Köszönet illeti családomat: szüleimet, akik őszinte szeretettel mindig mellettem álltak, és akiktől az első motivációkat kaptam a világ dolgainak kikutatásához; férjemet, aki kitartó türelemmel és segítséggel állt mellettem a munka dandárjában is; két kisfiamat, akik gyermekkorukat meghazudtoló türelemmel és nagy-nagy megértéssel támogatták a laborban és otthon végzett munkámat; és nem utolsó sorban férjem szüleit és Ildikót is, akiknek nagylelkű segítsége szintén megsokszorozta a munkára fordítható időmet. 2

Tartalomjegyzék

Köszönetnyilvánítás

2

Tartalomjegyzék

3

Egyéni szerepem a disszertáció eredményeiben

6

1. Bevezetés

6

2. Rövidítések jegyzéke és jelmagyarázat

8

3. Irodalmi áttekintés

11

3.1. Uracil a DNS-ben, mint a leggyakoribb hiba

11

3.1.1 Uracil megjelenése a DNS-ben

12

3.1.2. A dUTPáz enzim katalitikus funkciója és élettani szerepe

15

3.1.3. Báziskivágásos javító mechanizmus az uracilhibára

22

3.1.4. Az U-DNS glikoziláz (UDG) családok jellemzése

26

3.1.5. Timinmentes sejthalál jelensége és terápiás alkalmazása

32

3.2. Uracil a DNS-ben, amikor nem csupán hiba

35

3.2.1. Uraciltartalmú genomok

36

3.2.2. U-DNS feltételezett szerepe bizonyos fiziológiás folyamatokban

39

3.2.3. U-DNS feltételezett szerepe a Drosophila melanogaster fejlődésében

40

3.2.3.1. Egy vitatott hipotézis fel- és eltűnése

40

3.2.3.2. Programozott sejthalál a Drosophila fejlődésében

44

3.2.3.3. DNS-degradáció programozott sejthalál folyamán

47

3.3. Célkitűzések és a kísérletek racionális tervezése 4. Módszerek és módszertani eredmények

49 50

4.1. Anyagok

50

4.2. Fehérjék termelése, tisztítása

50

4.2.1. Kétféle rekombináns dUTPáz forma előállítása

50

4.2.2. A rekombináns CG18410 géntermék (UDE) előállítása

51

4.2.3. Fehérjekoncentráció meghatározása

53

4.3. Ecetmuslica minták készítése különböző fejlődési állapotokból

54

4.3.1. Ecetmuslica tenyésztése, ill. S2 sejtek fenntartása

54

4.3.2. Fejlődési stádiumok gyűjtése

55

4.3.3. Fehérjekivonatok készítése a különböző fejlődési stádiumokból

57

4.3.4. Mitokondriumizolálás Drosophila embriókból

58

3

4.4. Gél-elektroforézis

58

4.4.1. DNS minták natív gél-elektroforézise agaróz gélen

59

4.4.2. Fehérje minták gél-elektroforézise (SDS-PAGE)

59

4.5. RNS kimutatás

60

4.5.1. RNS-izolálás

60

4.5.2. Félkvantitatív RT-PCR

60

4.5.3. In situ RNS-hibridizálás

61

4.6. Felszíni Plazmon Rezonancia (SPR)

63

4.7. Fehérjék immunodetektálása

64

4.7.1. Antiszérumok

64

4.7.2. Western blot

65

4.7.3. far Western blot

66

4.7.4. Immuno-hisztokémia

67

4.7.5. Immunoprecipitálás

67

4.7.6. Immunoaffinitás kromatográfia

69

4.8. Affinitás kromatográfia

69

4.8.1. dUTPáz konjugált szefaróz gyanta készítése

69

4.8.2. U-DNS konjugált szefaróz gyanta készítése

70

4.8.3. dUTPáz affinitás kromatográfia

71

4.8.4. U-DNS affinitás kromatográfia

73

4.9. Fehérjék tömegspektrometriás azonosítása

74

4.10. A dUTPáz enzimaktivitás követésére használt folyamatos módszer

74

4.11. A genomi DNS uraciltartalmának kimutatása

75

4.12. Az UDE aktivitásának, szerkezetének jellemzésére alkalmazott módszerek

76

4.12.1. U-DNS előállítása

76

4.12.2. Elektroforetikus mobilitás teszt (EMSA)

78

4.12.3. Az UDE enzimaktivitása uracil tartalmú plazmid DNS-en

78

4.12.4. Limitált emésztés

79

4.13. In silico eljárások

80

5. Eredmények és kifejtésük

81

5.1. A dUTPáz szabályozása ecetmuslicában 5.1.1. A dUTPáz két izoformája

81 81

5.1.2. A dUTPáz mRNS-einek kimutatása az ecetmuslica egyedfejlődése során 84 5.1.3. A dUTPáz fehérje hiánya a lárvális szövetekben 4

86

5.1.4. A dUTPáz sejtciklushoz kötött szabályozása

90

5.1.5. A dUTPáz aktivitást befolyásoló makromolekuláris tényezők

91

5.1.6. A dUTPázzal kölcsönható makromolekuláris partnerek kimutatása

92

5.1.7. Potenciális dUTPáz partnerek izolálása és azonosítása

93

5.1.8. Hipotézis a DNS-javításban szereplő potenciális dUTPáz partnerekről

96

5.2. U-DNS-re specifikus nukleáz (UDE) izolálása, azonosítása és jellemzése

98

5.2.1. A lárvális DNS uraciltartalmának kimutatása

99

5.2.2. U-DNS specifikus nukleáz aktivitás kimutatása lárva extraktumban

100

5.2.3. U-DNS kötő fehérjék izolálása és azonosítása lárva extraktumból

101

5.2.4. A CG18410 géntermék in silico jellemzése

103

5.2.5. A rekombináns UDE fehérje funkciójának jellemzése

107

5.2.5.1. DNS-kötő tulajdonsága

107

5.2.5.2. U-DNS-re specifikus nukleáz aktivitása

108

5.2.6. A rekombináns UDE fehérje szerkezetének jellemzése

112

5.2.6.1. A fehérje doménanalízise

112

5.2.6.2. Az 1A és 1B fragmensek de novo szerkezetmodellezése

115

5.2.7. Az UDE fehérje fejlődésbiológiai szerepének jellemzése

118

5.2.7.1. Az UDE fehérje kifejeződése a különböző szövetekben, az egyedfejlődés során

118

5.2.7.2. Az UDE kifejeződésének szabályozása a Drosophila-ban

120

5.2.7.3. Az UDE aktivitás lehetséges szerepe a metamorfózis során zajló sejthalál folyamatokban.

121

5.2.8. Az UDE lehetséges alkalmazási területei

122

6. Összefoglalás, konklúzió

124

7. Irodalomjegyzék

127

8. Közlemények listája

142

9. Magyar nyelvű összefoglaló

145

10. Angol nyelvű összefoglaló

146

5

Egyéni szerepem a disszertáció eredményeiben Napjainkban megfelelő hatékonyságú molekuláris biológiai kutatómunka szinte kizárólag kutatócsoportokban, több kutató együttműködésével és további csoportok bevonásával képzelhető el. Ennek megfelelően a jelen dolgozatban foglalt eredmények is több kutató közös munkáját tükrözik. Az egyértelműség kedvéért egyes szám első személyben fogalmaztam a saját önálló eredményeimre vonatkozó részeknél, míg a többes szám első személyben fogalmazott eredmények olyan közös munkából származnak, amiben kreatívan és fizikailag aktív módon részvettem. Továbbá minden esetben megnevezem a kísérletet végző, vagy abban segítő kollegáimat.

1. Bevezetés A DNS-ben az uracil a hagyományos értelmezés szerint hibaként jelenik meg. Azonban ismerünk néhány példát életképes, uraciltartalmú genomi DNS-t hordozó szervezetekre (PBS2 bakteriofág [1] dut-/ung- E. coli [2]), ill. átmenetileg uracilt tartalmazó DNS (továbbiakban U-DNS) fiziológiás folyamatokban betöltött feltételezett szerepére. Egyrészt az AID fehérje a DNS-ben lévő citozint uracillá képes alakítani, ezzel kulcs szerepet játszik a szomatikus hipermutáció és az osztályváltó („class switch”) rekombináció folyamatában [3]; másrészt a lárvákban feltehetőleg felhalmozódó U-DNS részt vehet a Drosophila metamorfózisa során zajló sejthalál folyamatok indukálásában [4]. Míg az előbbi hipotézis egyre inkább jól körülírt, az utóbbit - az U-DNS metamorfózisban betöltött, sejthalált indukáló szerepét - egyetlen csoport vetette fel, de eredményeik [4-7] az irodalomban vitatottakká váltak [8], majd a további kutatás abbamaradt. A jelen dolgozatban foglalt eredmények megoldani látszanak a polémiát, s egyben új utat nyitnak a DNS-ben megjelenő uracil fejlődési jelként való értelmezéséhez. Emellett a vizsgált két enzim rák- ill. vírusellenes terápiák célpontja ill. kiindulópontja lehet, ami különösen indokolttá teszi beható, alapkutatás szintjén történő vizsgálatukat is. Egyrészt vizsgáltam az uracil DNS-ből való kizárásában kulcs szerepet játszó dezoxiuridin-trifoszfát-nukleotidohidrolázt (dUTPázt) ill. annak sejtbeli és egyedfejlődésbeli szabályozását a Drosophila esetében; másrészt azonosítottam és jellemeztem egy mind szerkezetileg, mind funkciójában teljesen újszerű nukleázt, mely az U-DNS-t képes felismerni és specifikusan hasítani. 6

Jellemeztem a Drosophila dUTPáz fejlődés során történő sokrétű szabályozását. Izoláltam és azonosítottuk az enzim két izoformáját. Kimutattam, hogy a fehérje kifejeződése a lárvaállapotokban drasztikusan lecsökken: csupán az imaginális diszkuszokban detektálható. Ez valószínűsíti a lárvaállapotok során a lárvális szövetek DNS-ében uracil felhalmozódását, tekintettel arra, hogy a Drosophila genomból hiányzik a fő U-DNS glikoziláz génje, az ung gén, mely a DNS-ben lévő uracil felismeréséért és kivágásáért felelős. Az uracil jelenlétét a lárvális genomban kvalitatív módon sikerült megerősítenem. Kimutattam, hogy a dUTPáz fehérje kifejeződésének drasztikus csökkenése hátterében poszt-transzkripciós szabályozás áll - mivel a két izoformának megfelelő mRNS egyaránt konstitutívnak tekinthető a fejlődés alatt. Megerősítettem a dUTPáz sejtciklus-függő szabályozását Drosophila S2 sejtvonalban. Detektáltam továbbá egy dUTPázt aktiváló aktivitást is. A sokrétű szabályozás alapján feltételeztük, hogy a dUTPáznak számos kölcsönható fehérje partnere lehet a különböző Drosophila szövetekben, amit felszíni plazmon rezonancia és far Western blot kísérletekkel meg is erősítettünk. Affinitás kromatográfiával izoláltam és azonosítottunk számos lehetséges kölcsönható partnert, melyek között több kapcsolatba hozható DNS-javítással és/vagy apoptózissal. A lárvaállapotok során megtűrt uracilt minden valószínűség szerint az általam izolált és azonosított, közvetlenül a bebábozódás előtt kifejeződő U-DNS specifikus nukleáz (UDE) ismeri fel. Az U-DNS-be az UDE által bevitt száltörések feltehetőleg erős apoptotikus jelként jelentkeznek a lárvális szövetekben. A fehérje így a metamorfózis alatt zajló sejthalál folyamatok indukálásában játszhat szerepet. Jellemeztük a rekombináns UDE aktivitását: szigorúan U-DNS-re specifikus, a DNS-t egyszálon hasító, relatíve fémfüggetlen nukleáz. Ezzel együtt az UDE egy teljesen új fehérjecsalád első leírt tagja: homológjait egyelőre csak teljes átalakulással fejlődő rovar genomokban találtam meg. A homológok összerendezéséből kitűnt öt konzervált régió, melyből az első kettő egymással is homológ, kiterjedtebb szakasz, ezek limitált proteolízis kísérletek szerint a fehérje önálló doménjei lehetnek. Az összerendezést is alapul véve kollaborációban végzett szerkezetmodellezés szerint nincs olyan ismert feltekeredési mintázat (gomboly, angolul: „fold”) mely az UDE-nek megfelelne. A konzervált motívumok sem mutatnak hasonlóságot eddig ismert U-DNS-t felismerő fehérjékhez (U-DNS glikoziláz családok, UDG-k), sem más nukleázokhoz. Az UDE aktivitás fiziológiás relevanciájára utal, hogy kifejeződése szigorúan a bábállapotokhoz köthető; továbbá, hogy az UDE expressziója ung- E. coli sejtekben toxikusnak bizonyult. 7

E két enzimnek – a dolgozatban részben megvalósított - proteomikai szemléletű vizsgálata elengedhetetlen az U-DNS, metamorfózissal fejlődő rovarok egyedfejlődésében betöltött szerepének vizsgálatához. A munka korántsem befejezett; épp ellenkezőleg: az új nukleáz azonosításával tág teret nyit a további kutatások számára, nem csupán a Drosophila ill. a teljes átalakulással fejlődő rovarok esetén, de szélesebb horizonton is felveti a DNS-ben megjelenő uracil esetleges jelszerepét.

2. Rövidítések jegyzéke és jelmagyarázat

5hmeU: 5’-hidroximetil-uridin 5meCpG: 5-metil-citidinből és guanozinból álló dinukleotid szegmens β-FTZ F1: Fushi Tarazu faktor 1, ekdizon által regulált transzkripciós faktor εC: 3,N4-eteno-dezoxicitidin AID: Aktiválás Indukált citidin Dezamináz APE: AP endonukleáz (APE1: a fő humán APE, másik neve Redox faktor 1 (Ref1)) AP hely: bázismentes hely a DNS-en (apurin/apirimidin hely) AUDG: archeákban kifejeződő UDG család BCIP: 6-bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát BER: báziskivágásos javító mechanizmus (Base Excision Repair) BR-C: (BRoad-Complex) ekdizon indukálta korai gén által kódolt fehérje BSA: marha szérum albumin (Bovine Serum Albumin) C-terminális: karboxi terminális CAD: kaszpáz aktiválta DNáz (Caspase Activated DNAse) cDNS: kódoló DNS, az mRNS reverz-transzkripciójával előállított DNS CG18410: a jelen munkában azonosított UDE-t kódoló gén kódja CpG: citidinből és guanozinból álló dinukleotid szegmens dN: dezoxinukleozid (N lehet U: uridin, T: timidin, C:citidin, A: adenozin, G: guanozin) DNáz: DNS-t hidrolizáló enzim dNDP: dezoxinukleozid-5’-difoszfát (N lehet, mint fent) dNMP: dezoxinukleozid-5’-monofoszfát (N lehet, mint fent) DNS: dezoxiribonukleinsav dNTP: dezoxinukleozid-5’-trifoszfát (N lehet, mint fent) dsDNS: kettős szálú DNS DTT: ditio-treitol 8

dug: az E. coli MUG fehérjét kódoló gén dut: a dUTPáz gén E. coli-ban dUTPáz: dezoxiuridin-trifoszfát-nukleotidohidroláz E93: ekdizon indukálta korai gén által kódolt fehérje E. coli: Escherichia coli ECL-reagens: HRP-vel kemilumineszcenciát adó reagens (Enhanced ChemiLuminescent reagent) EDTA: etiléndiamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav EMSA: elektroforetikus mobilitás teszt (Electrophoretic Mobility Shift Assay) FEN1: „flaping” endonukleáz GAPDH: glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz GGR: globális genom javítás (Global Genome Repair) HEPES: N-(2-hidroxietil)piperazin-N’-etánszulfonsav His-UDE: rekombináns 6 hisztidinből álló címkével ellátott UDE HRP: torma peroxidáz (Horse Radish Peroxidase) IPTG: izopropil-β-D-tiogalaktozid kcat: katalitikus sebességi állandó KM: Michaelis-Menten állandó, a szubsztrát kötődéserősségét jellemzi LB: Luria-Bertani (tápoldat) LD dUTPáz: teljes hosszúságú rekombináns Drosophila dUTPáz MBD4: hibáspár specifikus UDG, (Metil Binding Domain) mRNS: hírvivő RNS (messenger RNA) MUG: hibáspár specifikus UDG (Mismatch Uracil-DNA Glycosylase) N-terminális: amino-terminális NBT: Nitro Blue Tetrazolium NER: nukleotidkivágó javító mechanizmus (nucleotide excision repair) NLS: magi lokalizációs szignál nt: a DNS hosszának kifejezésére szolgáló mértékegység (nukleotidszám) S2: Drosophila Schneider-line 2 sejtvonal SD dUTPáz: a 28 aminosavas C-terminálist nélkülöző rekombináns Drosophila dUTPáz p53: 53 kD-os tumorszupresszor fehérje PARP: poli(ADP-ribóz) polimeráz PBS: fiziológiás sót tartalmazó foszfát puffer (Phosphate Buffer Saline) PBS2: Bacillus subtilis fág 2 PCNA: szaporodó sejt nukleáris antigén (proliferating cell nuclear antigene) 9

PCR: polimeráz láncreakció PMSF: fenilmetánszulfonil-fluorid PPi: anorganikus pirofoszfát RNáz: RNS-t hidrolizáló enzim RNS: ribonukleinsav RT-PCR: reverz transzkripcióval kapcsolt PCR s-fázis: a sejtciklus DNS-szintézis fázisa CJ236: dut-, ung- mutáns E. coli törzs SDS: nátrium-dodecil-szulfát SDS-PAGE: SDS-t tartalmazó poliakrilamid gél SMUG1: egyes szál specifikus UDG (Single-strand selective Monofunctional UDG) ssDNS: egyes szálú DNS ssU: ssDNS-ben levő uracil TBS: fiziológiás sót tartalmazó Tris puffer (Tris Buffer Saline) TCR: transzkripcióhoz csatolt DNS-javítás TDG: timin-DNS glikoziláz, az E. coli MUG emlős homológja TES: 2-{[trisz(hidroximetil)metil]amino}etánszulfonsav Tris/HCl: (aminometántriil)trimetanol U-DNS: uracil tartalmú DNS UDE: U-DNS degradáló faktor, U-DNS specifikus nukleáz UDG: U-DNS glikoziláz (több fehérje család összefoglaló neve) UDG-2: a ciklinszerű UDG család UGI: U-DNS glikoziláz inhibitor fehérje UNG: a fő U-DNS glikoziláz, ung: E. coli-ban az UNG génje, UNG1: UNG mitokondriális izoformája UNG2: UNG nukleáris izoformája XRCC1: DNS-javító fehérje (XeRoderma Cross Complementing 1) Továbbá az aminosavakat mindig a standard egybetűs kódokkal adom meg.

10

3. Irodalmi áttekintés 3.1. Uracil a DNS-ben, mint a leggyakoribb hiba A genetikai információ megőrzése és változatlan továbbadása minden élőlény számára elengedhetetlen feladat. Ezt az információt a DNS hordozza az őt felépítő nukleotidok négyféle bázisának (adenin (A), timin (T), guanin (G), citozin (C)) változatos sorrendjében, szekvenciájában. A DNS szerkezete lehetővé teszi az információ megfelelően stabil tárolását, valamint annak mobilizálását a transzkripció révén ill. másolását a replikációval. A stabil tárolás lehetősége a kettősspirál szerkezetben rejlik, ahol az antiparalell futó két cukor-foszfát gerincet a befelé néző – és a szekvenciát hordozó – bázisok közti hidrogénkötések tartják össze. A másolás és az átírás alapja a bázispárosodás: a timin és az adenin között kettő, ill. a citozin és a guanin között három hidrogén-híd teremt kapcsolatot (1. ábra). Megjegyzendő, hogy a genetikai információ mobilis hordozóiban, az RNS-ekben a timint a bázispárképzés tekintetében vele teljesen analóg uracil (U) (1. ábra) helyettesíti. A genetikai információ azonban a bázisok kémiai változékonysága révén – még a stabilnak mondható DNS-ben is - könnyen károsodhat, megváltozhat, akár különösebb mutagén környezeti hatások nélkül is. Ezek a változások a sejt normális funkciójának elvesztéséhez és többek között rákos elfajuláshoz vezethetnek. Humán sejtekben a leggyakoribb ilyen változás a C→T(U) átmenet (tranzíció), amely hátterében az 5-metilcitozin, vagy a citozin oxidatív dezaminálása áll [9, 10](ld. 1. ábra). Amennyiben mutációk keletkeznek a sejt működéséhez vagy az osztódás szabályozásához elengedhetetlen génekben, tönkretéve a génekben kódolt fehérjék megfelelő aktivitását, akkor a folyamat könnyen vezet rákos elváltozáshoz. A fentiek fényében érthető, hogy miért elengedhetetlen a bázisok kémiai változásainak javítása az élő szervezet számára. A DNS-javító rendszerek kiemelkedő fontosságát mutatja az is, hogy számos örökletes, rákos elfajuláshoz vezető betegség hátterében gyakran DNSjavító fehérjék génjében keletkezett mutációk állnak [11-13]. Emellett nyilvánvaló a DNSjavítás és a programozott sejthalál szoros kapcsolata is: számos olyan DNS-javító fehérjét ismerünk, mely túl sok DNS-hiba esetén apoptózis indukcióban is szerepet játszik [14-16]

11

3.1.1 Uracil megjelenése a DNS-ben

Uracil a DNS-be alapvetően két úton kerülhet. Egyrészt a DNS-ben előforduló egyik leggyakoribb mutagén változás - a spontán depurinálódás mellett - a citozin oxidatív dezaminálása [10] (1. ábra), ami uracilt eredményez. Az uracil bázispárképzési hajlamát tekintve timin-analóg, így a következő replikáció során az új DNS-szálba, az uracillal szembe, guanin helyett adenin épül, így stabil pontmutációt jön létre. A folyamat mutagenezishez való hozzájárulását baktériumban [17] és humán sejtekben [18] egyaránt bizonyították. A citozin dezaminálását a nagy mennyiségben jelenlevő vízmolekulák okozzák, így fiziológiás körülmények között is naponta több százszor fordul elő egy közepes méretű emlős genomban [10, 19, 20]. Érdekes megjegyezni, hogy az adenin hasonló spontán dezaminálásának gyakorisága a citozinéhoz viszonyítva csupán 2-3 % [10]. A kettős szálú DNS-szerkezet szignifikáns védelmet nyújt a citozin dezaminálással szemben, ehhez képest a transzkripció során szükségszerűen jelenlévő egyes szálú DNS-ben (ssDNS) kb. 200-szor gyorsabb a folyamat [10, 21]. Ezen kívül a CpG kontextusban előforduló, DNS 12

metiltranszferáz által katalizált citozin metiláció során megjelenő dihidropirimidin köztitermék is kedvez a spontán dezaminálásnak [10]. Bizonyos külső mutagén hatások nagymértékben növelhetik a citozin dezaminálás gyakoriságát, pl. UV sugárzás hatására kialakuló ciklobután dimerekben a folyamat mintegy 7-8 nagyságrenddel gyorsabb, mint nem károsodott kettősszálú DNS-ben [21]. Továbbá ismert olyan enzimaktivitás is, mely a DNS-ben lévő citozin dezaminálását katalizálja [21, 22]. Meglehetősen bő irodalmi adat áll rendelkezésre az ún. aktiválás-indukált dezamináznak (activation induced deaminase, AID) az immunoglobulin gének diverzifikációjában betöltött szerepét illetően [3, 23, 24]. Mindazonáltal, az enzimatikus dezaminálás jelentősége részletekbe menően még nem tisztázott (ld. 3.2.2. fej.). A másik úton uracil hibásan timin helyett is beépülhet a DNS-szintézis során. Ugyanis a DNS polimerázok (az archeák B típusú DNS polimeráza kivételével [25]) nem képesek különbséget tenni az azonos bázispárképzési hajlammal bíró, egymástól csupán egyetlen metil csoportban különböző uracil és timin között [9, 26]. Az uracil kizárása azáltal valósul meg, hogy a DNS polimerázok által dUMP ill. dTMP beépítésére felhasználható magas energiájú nukleotid trifoszfátok szintje szigorúan szabályozott: amennyiben a dUTP/dTTP arány megfelelően alacsony, jó eséllyel timin kerül a DNS-be és nem uracil. A megfelelően alacsony dUTP/dTTP arány biztosításáért nagy specificitásuk és specifikus aktivitásuk révén két kulcsenzim, a dUTPáz és a timidilát szintáz a felelős (2. ábra). Mivel a dNMP-dNDPdNTP átalakulásokban szintén szereplő nukleotid kinázok a bázisra nézve alacsony specificitásúak, továbbá reverzibilis módon katalizálnak, így azok nem biztosíthatják a megfelelő szabályozást (2. ábra). Az sejtbeli dUTP/dTTP arány meghatározásában jelentős különbségek adódhatnak a sejttípustól ill. a sejtciklus különböző fázisaitól függően, a DNSszintézis szempontjából releváns adatok csak aktívan osztódó sejtekből mérhetők. Ennek megfelelően az irodalomban is különböző értékeket találhatunk: átlagolt mérések alapján a dUTP/dTTP arány 10-2-10-3 értékűnek adódik [27]. Ezzel szemben aktívan osztódó humán limfoblast sejtvonalban extrém alacsony, 10-5 nagyságrendű értéket mértek, ami azonban a timidilát szintáz enzim gátlásával 0,2-ig emelkedet [28]. Ugyanakkor vadtípusú E. coli törzsek genomi DNS-ének uracil tartalmát 1 / 106 bázis alattinak mérték [29], ami arra is utal, hogy az alacsony dUTP/dTTP arány mellett, az uracilt javító mechanizmus is szerepet játszik a DNS-replikáció során a kis mértékben hibásan beépült uracil hatékony eliminálásában (ld. 3.1.4. fej). Ezt megerősíti, hogy a mindkét UDG génben mutáns (dug-/ung-) E. coli-ban a DNS-ben található uracil mennyisége 23-33 / 106 bázis (~10-4 U/T) értékre nőtt [29], ami – így a replikációhoz kötött uraciljavítás hozzájárulása nélkül - a sejtbeli 10-4 nagyságrendű dUTP/dTTP arányt tükrözi. Azt, hogy ehhez az extrém alacsony arányhoz mennyiben járul 13

hozzá a dUTPáz ill. a timidilát szintáz, jól demonstrálja, hogy a (dug-/ung-) E. coli-ban a timidilát szintázt 5-fluoro-2’-dezoxiuridinnel gátolva a DNS uraciltartalmában mintegy 4szeres, ugyanakkor ugyanitt dUTPáz mutáció esetén 100-250-szeres növekedést tapasztaltak [29]. Ez a hangsúlyeltolódás a dUTPáz szerepe felé azzal is magyarázható, hogy az enzim két szempontból is segíti dUTP/dTTP arány alacsonyan tartását: egyrészt csökkenti a dUTP koncentrációját, másrészt termeli a dTMP szintézis előanyagát a dUMP-t [30] (2. Ábra).

Megjegyzendő azonban, hogy míg enterobaktériumokban – így az E. coli-ban is – a dUTPáz reakció a dUMP elsődleges forrását jelenti (ld. 2. ábra, dCTP dezamináz a dCMP dezamináz helyett) [31], eukariótákban dUMP a dCMP dezamináz által katalizált reakcióban 14

is keletkezik, ezért eukariótákban feltehetőleg a timidilát szintáz és a dUTPáz enzimeknek kiegyenlítettebb szerepe lehet a megfelelő dUTP/dTTP arány biztosításában. A DNS-be kétféleképpen bekerült uracilt csupán az különbözteti meg, hogy adeninnel vagy guaninnal szemben áll-e. Tulajdonképpen csak a guaninnal szemben álló, citozinból keletkezett uracil tekinthető mutagén módosulásnak abban az értelemben, hogy az, javítás nélkül, a következő DNS megkettőződéskor stabil pontmutációhoz vezetne. A citozinnak fent vázolt instabilitása lehet a felelős azért, hogy az evolúció során az uracil helyett a nála ugyan bonyolultabb, de vele megegyező bázispárképzési hajlammal rendelkező timin szelektálódott, mint a genetikai információt stabilan hordozó DNS egyik építőköve [9]. Így ugyanis lehetőség nyílt a citozinból átalakult uracil szelektív és hatékony javítására, ami a genetikai információ stabilabb tárolása és továbbadása révén jelenthetett szelekciós előnyt. Ha szemügyre vesszük a rendszert, nem mondhatjuk nyugodt szívvel, hogy a legegyszerűbb, vagy akár a leghatékonyabb megoldást „választotta” volna az evolúció, de nagyon valószínű, hogy a véletlenek által adott lehetőségek közül a leginkább megfelelőt. Mindazonáltal a jelen timin-DNS világunkban a timint helyettesítő uracil sem hatástalan a sejt életében, ugyanis a különböző DNS-kötő fehérjék többnyire a normál timint tartalmazó DNS-hez való viszonyukban evolválódtak, így például egyes transzkripciós faktorok DNS felé mutatott affinitása megváltozik, ha timin helyett uracilt tartalmaz a felismerőhely [32, 33]. Így nagy mennyiségű timint helyettesítő uracil – ami ugyan a mutáció gyakoriságot nem növeli jelentős torzulást okozhat a sejt expressziós mintázatában. Amennyiben a genom csaknem teljes mértékben uracilos, a sejt növekedése és osztódása gyakorlatilag ellehetetlenül [34] (ld. 3.2.1. fej.).

3.1.2. A dUTPáz enzim katalitikus funkciója és élettani szerepe A dUTPáz enzim a dUTP-t dUMP-vé és anorganikus pirofoszfáttá hidrolizálja (3. ábra). A termék dUMP egyben a dTTP bioszintézisének előanyaga: a timidilát szintáz enzim dTMP-vé konvertálja, ami foszforilációs lépést követően dTTP-vé alakul (ld. 2. ábra). Ezzel a dUTPáz közvetve két oldalról is segíti a sejtbeli dUTP/dTTP arány megfelelően alacsony szinten tartását, így hatékonyan képes biztosítani az uracil kizárását az újonnan szintetizálódó DNS-ből. A Drosophila enzim katalitikus hatékonysága dUTP szubsztráttal kcat = 12 s-1, KM = 0,4 μM, kcat/KM = 3x107 s-1M-1 értékekkel jellemezhető [35], hasonlóan más eukarióta és 15

bakteriális dUTPázok katalitikus paramétereihez. A katalízis sebességét a Mg2+ kofaktor maximalizálja [36]. A dUTPázok rendkívül szigorú szubsztrátspecificitással rendelkeznek, mind a bázis, a cukorrész és a foszfátlánc tekintetében [37], ami kétségkívül elengedhetetlen más, a szervezet számára szükséges nukleotidok energiapazarló hidrolízisének elkerülése érdekében. A nagyfokú szubsztrátspecificitást továbbá jól tükrözi, hogy a Drosophila enzim esetén a kcat/KM értékek mind dTTP-re, mind dCTP-re mintegy öt nagyságrenddel alacsonyabbak [35] (3. ábra).

A dUTPáz enzimcsalád egységes abban a tekintetben, hogy - a viszonylag alacsony szekvencia-azonosság mellett - minden tagját ugyanaz az öt konzervált szekvencia-motívum jellemzi (4. ábra) [38-40]. Az N-terminális szakaszok nagyobb változatosságot mutatnak, itt találhatók a különböző lokalizációs szignálok. Ugyanakkor két kivételtől eltekintve az összes ismert trimer dUTPáz C-terminálisa az 5. motívum után pár aminosavval véget ér, aminek a hátterében az 5. motívumot tartalmazó, glicingazdag, flexibilis P-hurok motívumnak a dUTPáz aktivitásában betöltött szerepe [41] állhat. A Drosophila enzim a C-terminálison mintegy 28 aminosavval [39], ill. egy adenovirális enzim 18 aminosavval [42] hosszabb. Ebből a szempontból továbbá a feltehetőleg kovalens trimerként kifejeződő C. elegans dUTPáz is kivételt jelent [43]. A jelen munkában még kitérünk a Drosophila fehérjére jellemző extra C-terminális régió feltételezett szerepére (ld. alább és 5.1.5. fej.). 16

Szerkezeti szempontból a legtöbb dUTPáz homotrimer. Kivételt képeznek az emlős Herpes

vírusok

monomer

enzimei,

amelyek 17

valószínűleg

egy

ősi

dUTPáz-gén

duplikációjával keletkeztek, és szekvenciájukban az öt motívum más elrendezésben található [44]. A dolgozat a továbbiakban csak a homotrimer dUTPázokkal foglalkozik, amely családhoz a Drosophila enzim is tartozik. A homotrimer enzimnek több fajból is ismert a háromdimenziós térszerkezete; általános feltekeredése ("folding”) különösen konzervált, retrovírusoktól az emberig [37, 40, 45]. Az alegységek β-szálai ún. "lekváros tekercs" (jelly roll) módon tekerednek fel antiparalell β-lemezzé, melynek integráns eleme a szomszédos alegység egyik β-szála, így a trimer rendkívül stabil (5. ábra) [37, 45]. A három aktív centrumot a három alegység együttesen hozza létre oly módon, hogy minden egyes aktív hely felépítésében mindhárom alegység részt vesz: az egyik adja az 1., 2., 4., a másik a 3. és a harmadik pedig az 5. motívumot [37, 45]. Ez az 5. motívum az alegységet adó polipeptid szál flexibilis C-terminálisán helyezkedik el, mely régió csak a dUTP megkötése után rendeződik az aktív helyen, és elengedhetetlen az enzim aktivitásához [41]. Az alegységek között létrejövő ilyen magas fokú kooperáció eddigi ismereteink szerint egyedülálló a homooligomer fehérjék körében.

Míg a szubsztrát kötésben résztvevő oldalláncok már az első háromdimenziós térszerkezetekben is jól azonosíthatók voltak, a támadó vízmolekulát koordináló III. motívumbeli aszpartát azonosítását, a szubsztrát megfelelő orientációjának, valamint a fémion kofaktor helyének meghatározását már csoportunkban Barabás Orsolya végezte [46]. Amellett, hogy a dUTPáz család szerkezetéről és katalitikus funkciójáról meglehetősen részletes ismereteink vannak, jócskán akadnak még megválaszolatlan kérdések. Például érdekes megfigyelés, hogy a prokarióta ill. eukarióta/virális enzimek eltérő kooperativitással jellemezhetők, ill. a központi csatornában eltérő az alegységek közti kölcsönhatásokat

18

megvalósító oldalláncok polarizáltsága [35, 39]. A prokarióta enzimeknél szorosabb pakoltság jellemző, amit hidrofób oldalláncok valósítanak meg, és az alegységek közt nem tapasztalható kooperativitás. Az eukarióta enzimekre azonban egyfajta allosztérikus viselkedés jellemző, aminek pontos feltárása a csoportban jelenleg is folyik. Szintén érdekes kérdéseket vet fel a különösen bensőséges kapcsolatban lévő monomerek homotrimer szerveződésbe való feltekeredésének mechanizmusa [47]). Amellett, hogy a dUTPáz szerkezetét és a katalízis mechanizmusát beható vizsgálat tárgyává tesszük, elengedhetetlen, hogy az enzim sejtbeli összefüggéseit is feltárjuk ahhoz, hogy a valódi funkciójáról részletes képet kapjunk. Ezért szükséges áttekinteni, mit tudunk az enzim élettani jelentőségéről, fiziológiás izoformáiról, kifejeződésének szabályozásáról, esetleges kölcsönható partnereiről, az aktivitás poszt-transzlációs módosítások, vagy fehérjepartnerek által történő szabályozhatóságáról. A dUTPáz enzim aktivitása esszenciálisnak tűnik minden aktívan osztódó sejt számára. Hiányában felborul a dUTP/dTTP egyébként szigorúan szabályozott aránya, ami az újonnan szintetizálódó DNS-be uracil beépülését eredményezi [9, 29]. Az emelkedett uraciltartalom feltehetőleg túlaktiválja az uracilt kivágó javító mechanizmust, ami végül a sejt programozott halálához vezet, ez az ún. timinmentes sejthalál jelensége (ld. 3.1.5. fej.). Az enzim esszenciális voltát igazolja az is, hogy null-mutációja több fajban letális [48, 49], továbbá az, hogy számos vírus limitált méretű genomjában kódolja saját dUTPázát [38, 50]. A dUTPáz génben mutáns (dut-) E. coli törzs esetén - amellett, hogy kizárták a dut génen kívüli változásoknak a letalitásban játszott esetleges szerepét - megfigyelték, hogy a letalitás fennmarad több, elvileg dUTPáz-funkcióvesztést kompenzáló mutáció létrehozása mellett is [49]. Ugyanakkor a csupán egyetlen kodonban mutáns, inaktív dUTPáz fehérjét kifejező törzs ung- háttéren életképes, bár DNS-e jellemzően emelkedett uracil mennyiséget tartalmaz (ld. CJ236 sejtvonal, [29, 49]). Az előbbiekből arra következtetnek, hogy a dut génnek a dUTPáz aktivitáson túl egyéb esszenciális funkciója is lehet E. coli-ban [49]. Amellett, hogy a dut gén szekvencia esetleg létfontosságú szabályozó elemeket, vagy esetleg egy másik létfontosságú gént hordozhat, elképzelhető az is, hogy magának a dUTPáz fehérjének van alternatív esszenciális funkciója, amiről mostanáig nem áll rendelkezésre egyéb kísérletes adat. Humán sejtvonalakban a dUTPáz két izoformáját azonosították, melyek alternatív promóterhasználat révén keletkeznek [51, 52]. A rövidebb izoforma magi lokalizációt mutat, amit az N-terminálison azonosított nukleáris lokalizációs szignál (NLS) is megerősít [53]. A hosszabb izoforma mitokondriális lokalizációjáért egy hosszú (mintegy 60 aminosavas) Nterminális szignál szekvencia felelős [52, 54]. A nukleáris izoforma N-terminálisa tartalmaz 19

egy ciklinfüggő kináz konszenzus foszforilációs helyet, ami in vitro a cdc2 kinázzal foszforilálható is [55]. Ez a foszforiláció ugyanakkor, úgy tűnik, nincs hatással sem a lokalizációra, sem az enzimaktivitásra [51], annak ellenére sem, hogy korábban Herpes simplex vírus fertőzés során a gazdaszervezet dUTPázának defoszforilálódásával összefüggésben az aktivitás csökkenését mutatták ki [56]. Bár a foszforiláció szerepe nem világos, elképzelhető, hogy fehérje-fehérje kölcsönhatásokat vagy a fehérje élettartamát befolyásolja. A mitokondriális izoforma szerepe ill. élettani jelentősége sem tisztázott teljes mértékben, azonban a mitokondriális DNS károsodás öregedéssel való kapcsolatának kiterjedt irodalma van (ld. a köv. összefoglaló cikkek: [57-59]). Pusztán az a tény, hogy legalábbis humán sejtvonalakban, mind a fő UDG-nek (ld. 3.1.4. fej.), mind a dUTPáznak konstitutívan kifejeződik mitokondriális izoformája, megerősíti a sejtciklustól függetlenül folyamatosan osztódó mitokondriális DNS-ben fellépő uracilhibák javítására evolválódott mechanizmus létét [51]. Az enzim expressziója többnyire a sejciklustól függ: közvetlenül S-fázis előtt és alatt jelentős a kifejeződése [54, 60, 61], ami összecseng azzal, hogy elsősorban DNSreplikációnál fontos a megfelelően alacsony dUTP/dTTP arány. Ettől eltérő expressziós szabályozásra is találunk példát. Egyrészt éretlen immunsejtekben a dUTPáz foszforilált és foszforilálatlan formája egyaránt magas konstitutív expressziós szintet mutat, ami az enzimnek a sejtciklustól független funkciójára is utal egyben [62]. Ez a konstitutív kifejeződés feltehetőleg kapcsolatban lehet az immunoglobulin gének diverzifikációjában szerepet játszó enzimatikus citozin dezaminálás folyamatával (ld. 3.2.2. fej.). Másrészt Drosophila lárvákból az enzim aktivitásának hiányát mutatták ki [63], ami ellentmondani látszik az enzim esszenciális funkciójának. Nem világos továbbá az sem, hogy a DNSjavításkor történő DNS-szintézis során - ami nemcsak S-fázisban és előtte zajlik, ld. transzkripció kapcsolt javítás (TCR) [64] - miképp biztosítódik a megfelelő dUTP/dTTP arány. Lehetséges, hogy ez a javító szintézis olyan rövid szakaszokat és relatíve keveset érint csupán, hogy magasabb dUTP koncentráció mellett is biztosítható az új szakasz uracilmentessége? A hosszú szakaszos báziskivágásos javító mechanizmus (BER) során 6-15 nukleotidnyi szakaszok [65, 66], a nukleotidkivágó javító mechanizmus (NER) során 30nt hosszú szakaszok [67] újraszintézise történik. Az is feltételezhető, hogy alacsonyabb koncentrációban jelenlevő dUTPáz is elegendő, amennyiben az a javítás helyén lokalizálódik feltételezett specifikus fehérje-fehérje kölcsönhatások révén. Ez esetben indokolt a dUTPáz sejtbeli kölcsönható partnereinek módszeres vizsgálata. Eddig néhány egyedi esetben azonosítottak feltételezett dUTPáz partnereket (dUTPázzal kölcsönható patkány PPARα (peroxiszóma proliferátor aktiválta receptor α) 20

[68], továbbá egy virális nukleokapszid-dUTPáz fúziós fehérje partnerei [69]), de a kölcsönhatások fiziológiás jelentősége messze nem tisztázott. Két dUTPáz-gátló aktivitásról szóló beszámoló (Drosophila-ban [5] ill. PBS2 fágban [70]) azt sugallja, hogy a dUTPáz aktivitás esetleg bizonyos faktorok által regulálható, azonban az inhibitor fehérjék mindkét esetben azonosítatlanok maradtak. A PBS2 fág dUTPáz inhibitora 83 kD látszólagos molekulatömeggel bíró homodimer, hőérzékeny, a dUTPázhoz monomer formában, reverzibilisen kötődő fehérje, mely kovalensen nem módosítja a dUTPázt, pH-optimuma 6,5 körül van, gátló aktivitása pH = 8,5-9,0 tartományban drasztikusan lecsökken [70]. Az előbbivel szemben a Drosophila-ban leírt inhibitor fehérje léte és aktivitása sokkal kevésbé alátámasztott: 61 kD látszólagos molekulatömegű, hőstabil fehérje, de a dUTPázzal alkotott komplexét nem mutatták ki, sőt meghagyták a lehetőségét annak, hogy a dUTPáz esetleg elszenved valamiféle módosulást, akár degradációt is a gátlás során [5]. A jelen dolgozatban vizsgált Drosophila dUTPáz a homotrimer dUTPázokhoz tartozik, hiánytalanul tartalmazza a dUTPázokra jellemző öt konzervált szekvencia motívumot. A humán enzimmel nagyfokú homológiát mutat. Ennek megfelelően a központi csatornában koordinál egy kétértékű fémiont, ami valamiképp összefüggésben lehet az enzim alegységeinek allosztérikus működésével [35, 39]. A Drosophila enzim egyedi a mintegy 28 aminosavnyi extra C-terminális régióját tekintve, melynek funkciója egyelőre ismeretlen [35]. Mivel a feltételezett NLS (ld. 5.1.1. fej.), mely a humán enzimben kísérletesen is azonosított szignállal [53] közeli homológiát mutat, a fehérje N-terminálisán található, ennek az extra C-terminális régiónak valószínűleg egyéb szerepe lehet. Feltételezésünk szerint ez az extra régió kölcsönható partnereknek kínálhat felszínt, ill. az enzim egyéb regulációs mechanizmusaiban játszhat fontos szerepet. Korábban az irodalomban az enzim aktivitásának hiányát [63], valamint egy inhibitor fehérje kifejeződését [5] (vö. 3.2.3.1. fej.) írták le a Drosophila lárvaállapotok során, mely ellentmondani látszik az enzim esszenciális voltának. Többek között e jelenség hátterében húzódó okokat, ill. következményeinek feltárását tűztük ki célul, amikor az enzim regulációs mechanizmusait kezdtük vizsgálni a Drosophila egyedfejlődése során.

21

3.1.3. Báziskivágásos javító mechanizmus az uracilhibára Az uracilhiba javítására a báziskivágásos javító mechanizmus (BER / Base Excision Repair (6. ábra)) szolgál [71]. A BER a DNS-ben előforduló báziskárosodások nagy többségét javítja [72, 73]. Az uracil mellett a sejt anyagcsere folyamataiban keletkező és/vagy külső környezeti tényezők hatására megjelenő reaktív oxigéngyökök (ROS / reactive oxygen species) által indukált oxidatív bázismódosulásokat is a BER javítja, mint a leggyakoribb 8-oxoguanint, továbbá timinglikolt, 5-hidroxicitozint, formamidopirimidint [73]. Továbbá szintén a BER felelős az alkiláló ágensek hatására bekövetkező léziók többségének javításáért is, ilyen a 3-metiladenin, 7-metilguanin [74]. Valamint annak ellenére, hogy az UV-indukált pirimidin dimerek javításában a nukleotidkivágó javító mechanizmusnak (NER) van fő szerepe, a ciklobután timin dimerek javítását a BER is végezheti [75].

A BER-ben az első lépés mindig a DNS-glikozilázoké, amelyek a hibás bázis glikozidos kötését elhasítják, és bázismentes helyet hagynak maguk után. A glikozilázok ismert hatékonyságának hátterében feltehetőleg az áll, hogy a DNS-en egy dimenzióban 22

haladva mintegy pásztázzák azt, ami jelentősen növeli a hiba megtalálásának valószínűségét. A nem hélix-destabilizáló hatású hibák felismeréséhez feltehetőleg a glikoziláz sorban minden egyes bázist kifordít a hélixből, hogy lehetővé váljon a hibás bázis felismerése ill. kivágása [76], ilyen hibák közé tartozhat az adeninnel szemben álló uracil is. Azok a glikozilázok, melyek hélix-destabilizáló hibákat javítanak, ennél lényegesen egyszerűbben: a deformálható hely erősebb kötésével találhatják meg a javítandó helyet [73]. A nagyszámú és változatos hibás bázisokat különböző specifikus DNS glikozilázok tehát uniformizálva bázismentes (AP: apurin/apirimidin) helyekké alakítják, így ezután a közös BER enzimek végezhetik a javítást. Így az uracil hiba esetén az első lépést az UDG enzimcsaládok tagjai végzik [77], melyekből legalább ötféle létezik (ld. 3.1.4. fejezet). A DNS glikozilázok katalitikus szempontból két osztályba sorolhatók [73]. A monofunkciós DNS glikozilázok csupán a glikozidos kötést hasítják. Ezzel szemben a bifunkciós fehérjében a nukleofil támadásért meghatározott amin csoport a felelős, ezáltal kovalens intermedier alakul ki, ami további átalakulásokat katalizál [78]. Így a cukor-foszfát gerinc is elhasad, ami β-elimináció (egy bevágás a hibás bázistól 3’ irányban) [79] ill. β,δ-elimináció (két bevágás 3’ és 5’ irányban is, szabad 3’ foszfát véggel) [80] révén történik aszerint, hogy a támadó amin primer ill. szekunder volt-e. Ezért a glikozilázok után keletkező AP helyek (bázismentes helyek) sem teljesen ekvivalensek, de a bázismentesség és az 5’ irányban lévő foszfát csoport érintetlensége tekintetében azonosak. Az eddig ismert UDG-k kivétel nélkül a monofunkciós DNS glikozilázokhoz tartoznak, melyek egyetlen doménből állnak és az uracilt ill. a hibás G:T párban lévő timint vágják ki [81, 82]. A G:T hibás pár a legvalószínűbb módon az 5metil-citozin dezaminálása révén keletkezik A DNS glikozilázok katalízise nyomán ill. a spontán depurinálódás útján keletkező AP helyek jelentős citotoxicitással bírnak, nem csupán az elveszett információ tartalom miatt, de a replikációs villa [83], ill. a transzkripciós buborék [84] összeomlásához is vezethetnek, ezért további javításuk elengedhetetlen. Ezt támasztja alá az is, hogy élesztőben az AP helyeket tovább javító AP endonukleáz (APE) nullmutációja letális [85]. Ez a letalitás az ung kiütésével elnyomható, más glikozilázok kiütésével azonban nem, ami egyben azt is jelzi, hogy rendes körülmények közt a hibás bázisok közt valóban az uracil jelenti a meghatározó többséget [20]. A bázismentes helyen az APE-k hasítják el 5’ irányban a foszfodiészter kötést szabad 3’ OH véget, ill. bázismentes 5’-dezoxiribóz-foszfátot hagyva maguk után (6. ábra). Az APE-k mind a 3’ irányba bevágott szálon lévő AP helyet, mind az egyes bifunkciós glikozilázok által hagyott 3’ foszfátot le tudják hasítani [73]. APE-ból két szerkezeti család ismeretes, melyek különböző módon ugyanazt a reakciót katalizálják. A két család első képviselőit egyaránt E. coli-ban azonosították: az exonukleáz III, ami a humán 23

APE1-gyel homológ és az endonukleáz IV, amelynek élesztőben létezik homológja, az APN1 [86]. Mindkét esetben ismert az enzim-DNS komplex szerkezete. Az APE1 [87] ill. az endo IV [88] egyaránt kifordítja az AP helyet a hélixből – hasonlóan a glikozilázokhoz – ill. egyaránt fémionokat használ a foszfátészter-hidrolízis katalizálásához. Említést érdemel, hogy a két ismert szerkezetű APE-n kívül újabban más – főként Drosophila riboszómális – fehérjékről is kimutattak APE aktivitást [89, 90]. Az APE aktivitást követően a javító DNS polimeráz β, liáz aktivitása révén, lehasítja 5’-dRP-ot, majd polimeráz aktivitása révén beépíti a hiányzó bázist [91]. Végül a ligáz III/XRCC1 komplex összevarrja a DNS-szálat [92], ill. emellett a ligáz I-ről is kimutatták, hogy képes a DNS polimeráz β-val kölcsönhatásba lépni [93], és a BER-t lezárni in vitro [94], ami valószínűsíti a BER-ben játszott alternatív szerepét. A BER-en belül megkülönböztetünk ún. hosszú szakaszos („long patch”) ill. rövid szakaszos („short patch”) mechanizmust, melyekben részben a szereplők is eltérnek, de fő különbség az újraszintetizált DNS részt alkotó nukleotidok számában van: a rövid szakaszosban csupán a hibás bázis cserélődik le, míg a hosszú szakaszosban 2-15 nukleotidnyi DNS-szakasz újraszintézise történik [65, 66]. Utóbbi esetben általában a DNS polimeráz δ/ε kezdi a polimerizációt, aminek nincs 5’-dRP-liáz aktivitása [95]. Így a beépített nukleotidok következtében az 5’-dRP-t tartalmazó helyettesített, leváló (flap) szál kimetszéséhez szükség van az ún. „flaping” endonukleázra (FEN1) [96]. Ez utóbbi alternatív út létét megerősítették in vitro rekonstitúciójával is, mellyel a szaporodó sejt nukleáris antigén (PCNA) fehérje szükségességét is kimutatták [97]. A hosszú szakaszos BER-ben is lehet a DNS polimeráz β a javítás kulcsszereplője, ekkor azonban maximum 6 nukleotidnyi szakasz cserélődik le [98, 99], továbbá kimutatták, hogy a poli(ADP-ribóz) polimeráz-1 (PARP-1) stimulálja a DNS polimeráz β hosszú szakaszos aktivitását [100]. Hogy melyik út milyen fiziológiás környezetben játszik szerepet, és miért, még nem teljesen tisztázott. Az uracilhiba feltehetőleg mind a hosszú szakaszos, mind a rövid szakaszos mechanizmussal javítódik attól függően, hogy melyik UDG kezdeményezi, és a sejtciklus mely fázisában történik a javítás [101]. Magasabb rendű eukarióta szervezetekben a BER folyamatában további fontos fehérjék is részt vesznek, mint a PARP, az XRCC1, vagy a p53 [73]. Ezek funkciója a DNSkárosodás helyén történő fehérjetoborzástól az egész javítás szabályozásáig terjedően meglehetősen sokrétű, és kevésbé egyszerűen megfogható, mint a javítás alaplépéseit végző enzimek szerepe. A PARP a BER-ben mégis kulcsszerepet játszik, amit az is alátámaszt, hogy PARP-1 deficiens egér sejtextraktumban az AP helyek nem javítódnak megfelelően [102]. A PARP-1-ről tudjuk, hogy az egyes száltörésekhez köt [103], szerepe abban lehet, 24

hogy a DNS-szálon haladva felismeri az APE által elvágott helyeket, és ott további DNSjavító fehérjéket toboroz (direkt kölcsönhatásba lép például a DNS polimeráz β-val és az XRCC1 fehérjével) [73]. A PARP által katalizált poszt-transzlációs módosításnak sokrétű szabályozó szerepe van attól függően, hogy mi a célfehérje, ill. milyen fiziológiás folyamatban történik a módosítás. A hisztonok poli(ADP-ribozil)-álása révén például fellazul a kromatin szerveződés, ami az esetleges javítás számára hozzáférhetőbbé teszi a DNS-t [104]. Az XRCC1 (X-ray Repair Cross Complementing protein 1) mindenekelőtt fehérjetoborzásban játszik szerepet, nagyobb fehérjekomplex összeszerelődéséhez kínálva felszínt („scaffold”): közvetlen kölcsönhatásban van a fő APE-vel, a DNS polimeráz β-val, a DNS ligáz III-mal, valamint glikozilázok közül a hOGG1-gyel, aminek aktivitását ez a kölcsönhatás stimulálja is [73]. A p53 transzkripciós faktor szerepén túl közvetlenül stimulálja a BER-t: kölcsönhat a DNS polimeráz β-val és stabilizálja az AP helyet tartalmazó DNS-sel alkotott komplexét [73]. A fenti kölcsönhatások továbbá arra utalnak, hogy a javításban nagyméretű komplexek szerelődhetnek össze – ugyan eddig még nem izoláltak és jellemeztek ilyen nagyméretű, stabil BER komplexet. Továbbá ismeretes, hogy a BER enzimei egymásra stimuláló hatással vannak, így például a humán fő APE stimulál több glikozilázt is, köztük két UDG-t [105, 106], bár direkt kölcsönhatást ezekkel a glikozilázokkal még nem sikerült kimutatni. A humán APE1 stimulálja a FEN1 és a DNS ligáz I aktivitását is [107]. Megjegyzem, hogy az irodalomban mutatkozik egyfajta hiátus: eukarióta szervezetek közül csupán emlősökben és élesztőben vizsgálták részletesen a DNS-javító rendszereket és e kettő között helyet foglaló fajok meglehetősen alulreprezentáltak a területen. Így nem tudhatjuk pontosan, hogy például a Drosophila ilyen esetben a magasabb rendű eukariótákhoz (emlősök), vagy a jórészt élesztő képviselte alacsonyabb rendű eukariótákhoz áll-e közelebb. Főként bioinformatikai eredményekre alapozva feltehető, hogy Drosophilaban a DNS-javító fehérjék terén meglehetősen nagy eltérések mutatkoznak mindkét fent említett csoporthoz viszonyítva [108, 109]. A DNS-javítást hagyományosan a sejtciklus ellenőrzési pontjaihoz kötött folyamatnak tartották, de mára egyértelművé vált, hogy a genetikai információ védelme a transzkripcióhoz kötődve (transzkripció-kapcsolt javítás: TCR [64]) éppúgy, mint a sejtciklus során folyamatosan (globális genom javítás: GGR) [110, 111] fontos megoldandó feladat a legtöbb élő sejt számára. Így az uracilt kivágó BER működése is a sejtciklus során változó intenzitású lehet, de feltehetőleg nem szorítkozik csupán a sejtciklus ellenőrzési pontjaira. Egyrészt a fő UDG (UNG2, ld. köv. fej.) S-fázishoz kötött expressziója [112] arra utal, hogy ennek az enzimnek a DNS replikáció során a visszaolvasó hibajavításban van elsődleges szerepe. 25

Ugyanakkor más UDG-k nem mutatnak ilyen sejtciklus-függő kifejeződést (ld. köv. fej.). Továbbá az UNG és az APE aktív nukleoszómális pakoltságú DNS-en is [113], ami azt sugallja, hogy nemcsak a replikációhoz, ill. a transzkripcióhoz kötődve működhet az uracilt kivágó javítás. Számos további érdekes kérdés vetődik fel a BER szabályozását ill. más sejtbiológiai folyamatokhoz való kapcsolatát illetően, amire itt most nem tudok részletesen kitérni. Mindenképpen említést érdemel azonban, hogy egy-egy BER enzimre gyakran nagyfokú multifunkcionalitás jellemző. Így például a fő APE – ahogy azt másik neve (redox factor 1, Ref1) is tükrözi - redox-függő transzkripciós aktivátor szereppel is bír [114]. Továbbá egyes UDG-kről is ismert transzkripciós szabályozó szerep (ld. köv. fej.), míg a PARP enzimnek az apoptózis indukcióval kapcsolatos szerepe egyértelmű [115]. Egyes BER fehérjékben mutáns egyedek megnövekedett mutációs gyakorisága, súlyos rákos elfajulásai vagy esetleg letalitása a DNS-javítás lényeges szerepét igazolják. Ugyanakkor a legtöbb glikoziláz hiánya egérben nem okoz azonnal szembetűnő fenotípusos változást. Ennek hátterében egyrészt egyes glikozilázok szélesebb szubsztrátspecificitása révén lehetővé váló redundancia állhat. Másrészt a glikoziláz kiesése folytán esetleg megnövekedett mutációs gyakoriság nem feltétlenül okoz azonnal szembeötlő változást. A BER fehérjék szintjének zavarai rákképződéshez is vezethetnek, ami továbbá megerősíti a javító mechanizmus bonyolult szabályozásának élettani fontosságát is. Így több rosszindulatú daganat esetében megfigyelték az APE1 túltermelődését [116-118], ami egyes transzkripciós faktorok redox aktiválása révén a sejthalál kikerülését segítheti a kontrollálatlanul osztódó daganatban. A relatíve kis pontosságú DNS polimeráz β túltermelése szintén növelheti a rákképződés gyakoriságát [119, 120], ahogy a túlexpresszált glikozilázok nyomán feltehetőleg felhalmozódó AP helyek is hasonló hatást eredményezhetnek [121, 122].

3.1.4. Az U-DNS glikoziláz (UDG) családok jellemzése Az uracil felismerésében kritikus szerepet játszó UDG-knek több családját is ismerjük, melyek meglehetősen különböznek egymástól mind a szubsztrátspecificitásukat, mind pedig a fiziológiás szerepüket illetően. A rendkívül kiterjedt irodalom áttekintését nehezíti, hogy a használt rövidítések nem csak sokfélék, de olykor-olykor egymásnak ellentmondók is, különös tekintettel az adatbázisokra. Emlősökben legalább öt UDG család ismert, úgy mint 26

az UNG, a SMUG, a MUG/TDG, az MBD4 és az UDG2 (nevek eredetét ld. a továbbiakban) [123]. Ezek közül az első három család egymással távoli evolúciós rokonságban lévő, közös α/β feltekeredési mintázattal jellemezhető [81]. Ehhez a csoporthoz tartozik az archeákban található hatodik UDG család is (AUDG), valamint további két in silico azonosított bakteriális család is [81, 124]. A 7. ábra megkísérli áttekinthető rendszerben bemutatni az eddig ismert főbb UDG enzimcsaládokat, és azok eltérő specificitását, sejtbeli szabályozását, feltételezett fiziológiás szerepét, habár ezen a ponton meglehetősen hiányosak még az ismeretek. Továbbá nagy eltérések mutatkoznak abban a tekintetben is, hogy mely család képviselői találhatók az élővilág különböző csoportjaiban. Azonban minden önálló életre képes élőlény, sőt még számos vírus is, legalább egyféle UDG-t kódol genomjában, ami arra utal, hogy legalább a citozin dezaminálásával keletkező uracillal szembeni védelem esszenciális minden szervezet számára. Magasabb rendű organizmusokban a rendszer minden bizonnyal redundáns, ami azt is jelenti, hogy többé-kevésbé hatékony alternatív menekítő utak léteznek arra az esetre, ha az egyik UDG aktivitás valamely okból kifolyólag tönkremenne. Az UDG-k első azonosított képviselője az E. coli UNG-ja (U-DNS N-Glycosylase) [77]. Az UNG erősen konzervált, és megtalálható majd minden fajban (kivéve archeákban és metamorfózissal fejlődő rovarokban) E. coli-tól az emberig, sőt számos DNS vírus is kódolja genomjában [51]. Az UNG a többi UDG-hez képest több nagyságrenddel hatékonyabban (600-1000 uracil/min) képes eliminálni a DNS-ben lévő uracilt mind ssDNS, mind kettős szálú DNS-ből (dsDNS) az uracillal szemben álló bázis minőségétől függetlenül [125]. Az UNG kivételesen specifikus az uracilra, sem a timint, sem az 5-hidroximetil-uracilt (5hmeU), sem más módosult bázist nem képes effektíven kivágni, ennek a nagyfokú specificitásnak a háromdimenziós térszerkezetben jól értelmezhető okai vannak [124]. Nem ilyen egyértelmű, hogy az enzim milyen mechanizmussal találja meg megfelelő hatékonysággal a különböző kontextusban lévő uracilt: az A:U párban lévő uracil érzékelése feltehetőleg úgy lehetséges csupán, hogy az UNG a DNS-en haladva minden egyes bázist kifordít a kettőshélixből, és az uracilkötő zsebbe próbálja illeszteni [19]. Az UNG a dsDNS-t gyengébben (Kd = 1,5 μM), míg az uracilt tartalmazó DNS-t mintegy 25-ször erősebben köti (Kd = 50 nM). Az UNGDNS komplex kialakulása két lépcsőben történik: a gyenge, diffúzióvezérelt komplexálódás során kifordítja a bázist a DNS-hélixből, majd uracil felismerése esetén az UNG-ban indukálódik egy - triptofán fluoreszcencia kioltódással jellemezhető - konformációváltozás [126]. Az UNG továbbá a többi UDG-vel szemben, specifikusan gátolható az UGI fehérjével [127], valamint a termék AP helyek, a humán enzim esetét kivéve, is erős gátlást jelentenek [105]. Az AP helyek által mutatott gátlás racionalizálható értelme lehet, hogy a sejt számára 27

veszélyes, citotoxikus AP-helyekhez kötődő UNG mintegy elfedje azokat, míg a további javítás nem el nem kezdődik az APE által. Humán sejtekben az UNG-nak - a dUTPázhoz hasonlóan - két izoformáját találták, melyek alternatív promóterhasználat révén íródnak át ugyanazon génről [128]. A két izoforma az N-terminálison különbözik, ahol mindkettő esetén azonosították a lokalizációnak megfelelő szignálokat: az UNG2 nukleáris, míg az UNG1 mitokondriális lokalizációjú [129]. Hasonlóan a dUTPázokhoz, a mitokondriális enzim konstitutív, míg a magi izoforma S-fázishoz kötött kifejeződést mutat [112]. További hasonlóság a humán dUTPáz izoformákhoz, hogy a nukleáris UNG szintén a cdc2 ciklinfüggő kináz által foszforilálódik az N-terminális régióban [51]. A foszforiláció jelentősége itt sem tisztázott minden részletében, de feltételezik, hogy specifikus fehérjefehérje kölcsönhatások szabályozásában is szerepe lehet. Az UNG nukleáris izoformája feltehetőleg a PCNA és a replikációs protein A (RPA) fehérjékkel való kölcsönhatása által lokalizálódik a replikációs villában, ahol nagy hatékonysága és szigorú uracilspecificitása lehetővé teszi, hogy a timin helyett kis mennyiségben beépülő uracilt azonnal, a replikáció közben, javítsa [130, 131]. Ugyanakkor mind az uracil kontextusa felé mutatott aspecificitása, mind nagy hatékonysága, mind a részben nukleoplazmás lokalizációja elméletileg lehetővé teszi, hogy a citozin dezaminálásával keletkező uracil eliminálásában is szignifikáns szerepet játsszon [132]. Ezt támasztja alá, hogy ung- E. coli-ban a DNS uraciltartalma mintegy 30-szorosára nőtt a vadtípushoz képest, míg ezzel szemben a másik, kisebb hatékonyságú, hibáspár-specifikus E. coli UDG génjének (dug) kiütésének nem volt mérhető

következménye

[29].

Az

UNG

jelentősége

mindemellett

eltérő

lehet

baktériumokban és magasabb rendű eukariótákban, amit az is alátámaszt, hogy mutációja E. coli-ban erős mutátor fenotípust eredményez [133], ezzel szemben az ung-/- egérben csupán kisebb mértékű mutációs gyakoriság növekedés (1,3-1,4-szeres) figyelhető meg [131]. Ez az eltérés többek közt egy lehetséges alternatív útnak köszönhető, amiben feltehetőleg a SMUG1 UDG játszik szerepet [132] (ld. részletesen alább). Ugyanakkor a nullmutáns egér rövidült élettartammal továbbá immunrendszert érintő daganatokra való megnövekedett hajlammal jellemezhető [134], így feltételezhető, hogy az UNG-nak eukariótákban is, a meglévő kisebb hatékonyságú alternatív utak ellenére is, kitüntetett szerep jut a genomiális információ hosszútávú védelmében. Ezért is meglepő, hogy Drosophila-ban (és feltehetőleg a több hasonlóan metamorfózissal fejlődő rovar esetén is így igaz) az UNG-nak nincs homológja. Ez a mára tényként kezelhető adat eleinte – főként mielőtt a többi UDG család ismertté vált volna – heves viták kereszttüzében állt. Egyes csoportok azt állították, hogy nem mérhető [6, 7], mások pedig sikerrel mértek [8] UDG aktivitást Drosophila és más rovar extraktumokban. Az új családok megismerése után az UGI specifikus UNG-gátló 28

aktivitásának felhasználásával különbséget lehetett tenni a különböző UDG aktivitások közt, és úgy tűnt, hogy Drosophila-ból ill. más rovarokból is valóban hiányzik az UNG-szerű, ssDNS-ben lévő uracilt (ssU) is hatékonyan vágó, UGI-val gátolható aktivitás, míg a hibáspárban lévő uracilra specifikus aktivitás egyértelműen mérhető volt [135]. Továbbá a már jól annotált, teljes Drosophila genom adatbázison végzett bioinformatikai vizsgálatok sem mutattak ki ung-szerű gént [81]. Az UNG-on túl legalább négy további humán enzim is képes az uracilt eliminálni a DNS-ből. Az először Xenopus cDNS könyvtár in vitro transzlációja során azonosított SMUG1 az ssU felé erős preferenciát mutatott (Single-strand selective Monofunctional Uracil-DNA Glycosylase) [136]. A SMUG1 hatékonysága ssU javítása esetén csak kevéssé maradt el az UNG-étól, nemúgy a hibás U:G párban lévő uracil javítása esetén, amikor a MUG/TDG-hez (ld. később) hasonló alacsony hatásfokkal bírt. Specificitása mindazonáltal hasonlít az UNG-éhoz, jóllehet szekvenciában csupán távoli rokonok. Különbséget jelent, hogy nem olyan szigorúan specifikus az uracilra, mint az UNG: az 5hmeU-t éppoly hatékonyan eliminálja a DNS-ből, mint az uracilt, elsődleges szerepe éppen ez lehet [137]. Az UNG-gal ellentétben az expressziója nem sejtciklus-függő, és a replikációs villában sem lokalizálódik [132]. Habár a timint helyettesítő uracil kivágásában az UNG-nál messze kisebb hatékonyságú, ung-/- sejtekben mégis ez képviseli a fő UDG aktivitást [132], ezért feltételezhető, hogy ezesetben alternatív menekítő útvonalat jelenít meg [138, 139]. További különbség, hogy SMUG1 nem gátolható az UGI-val (bár a humán homológ esetén kismértékű gátlást tapasztaltak) [132]. A SMUG1-nek Drosophila-ban is megtalálható homológja (CG5285), azonban ezideig nem jellemezték sem szubsztrátspecificitását, sem katalitikus hatékonyságát, sem expressziós mintázatát, ezért nem lehet megmondani, képes-e, és ha igen, milyen mértékben helyettesíteni a Drosophila genomban nem kódolt UNGhomológot. A TDG (Timin DNS Glikoziláz) [135, 140] és az MBD4 (Methyl Binding Domain 4) [141] több nagyságrenddel kisebb aktivitás mellett sokkal specializáltabb funkciójú: csak a hibáspárban lévő uracilt (továbbá ilyen timint, és károsodott pirimidineket) vágja ki a kettősszálú DNS-ből, mindenekelőtt CpG ill. 5meCpG környezetből. A TDG továbbá hasonló hatékonysággal képes a hibás párban lévő 3,N4-eteno-dezoxicitidint (εC) és kevésbé hatékonyan az 5hmeU-t is felismerni. A bakteriális homológ MUG (Mismatch U-DNS Glycosylase, a dug gén terméke) az N-terminális régióban rövidebb, mint a humán enzim, és csupán a hibáspárban lévő uracilt képes vágni, a timint nem; továbbá érdekes megfigyelés, hogy az N-terminálison csonkolt humán TDG hasonló szelektivitást mutat az uracil felé [135]. A dsDNS preferenciáját az E. coli enzim DNS-komplexének 29

háromdimenziós

térszerkezetében detektált, mindkét szálra kiterjedő DNS-fehérje kölcsönhatások is magyarázzák [142]. Továbbá erős termékgátlás figyelhető meg a keletkező AP helyek által, amely az APE enzim AP helyek felé mutatott kompetíciója révén oltódik ki [106]. Érdekes, hogy a TDG transzkripciós faktorként is funkcionál [140], több kölcsönható partnere által kötődik a transzkripció szabályozásához [143].

30

A TDG-nek Drosophila-ban is megtalálható a homológja (CG1981), azonban ez egy hosszú, mintegy 600 aminosavnyi extra C-terminális régióval bír. Az extra régió nélküli aktív magot rekombináns úton előállították és jellemezték: hasonló specificitással bír, mint a humán TDG, bár a hibáspárban lévő timint sokkal kisebb mértékben képes eliminálni [144], ami

összecseng

azzal

a

korábbi

eredménnyel,

miszerint

különböző

Drosophila

extraktumokban csupán U:G-t javító aktivitás volt mérhető, T:G-t vagy ssU-t javító nem [135]. Mivel a Drosophila-ban a CpG környezetben lévő citozin metilálása nem jellemző, az 5-metil-citozinból keletkező hibáspárban lévő timin sem jellemző hiba. Így a Drosophila enzim eltérő szubsztrátspecificitása mellett is feltételezhetjük, hogy a citozin dezaminálással keletkező potenciálisan mutagén uracillal szembeni védelmet a TDG homológ enzim biztosítja. Az MBD4 elkülönülten tartalmaz egy metilkötő és egy glikoziláz domént [145]. Felismeri az U:G és T:G mellett az 5-fluorouracilt és kevésbé hatékonyan az εC-t. Továbbá az MBD4 nem csupán a BER-ben vesz részt, de specifikus kölcsönhatás révén kapcsolódik a hamisbázispár javításhoz is [141]. Az MBD4 kiütése megnövekedett mutációs gyakorisággal, valamint erősen csökkent apoptózis indukcióra való hajlandósággal jellemezhető [146]. A UDG-2 ciklinszerű UDG-t T-sejt cDNS könyvtárból izolálták elsőként, mely sokkal közelebbi homológiát mutat a ciklinekhez (humán UDG-2 és humán „ciklin A” fehérjék közt 25-30 % azonosság, 51 % hasonlóság), mint a többi eddig vázolt UDG-hez (humán UDG-2 és humán UNG2 közt csupán 10 % körüli a hasonlóság) [147]. Ennek ellenére kétségkívül rendelkezik UDG aktivitással, amint azt az in vitro transzkripciós és transzlációs rendszerben előállított rekombináns fehérje aktivitása igazolja [148]. Expressziója sejtciklustól függő: elsősorban M/G1 és S-fázisban jelentős [147]. Az UDG-2 kölcsönhatásba lép az E2F transzkripciós faktorral, ami által többek közt saját génjének transzkripció szabályozására is visszahat: túl sok UDG-2 leszabályozza az UDG-2 génjéről való RNS átírást [149]. Az UDG-2 enzimcsalád így kiváló példa lehet arra, hogy a DNS-javítás miként integrálódik a sejtciklus szabályozás folyamatába [149]. A humán UDG-2 fehérjeszekvenciával Drosophila genomon végzett hasonlósági keresés (tblastn) négy hasonló szekvenciát adott, azonban ezek kivétel nélkül annotált ciklinek voltak, amelyekkel végzett további hasonlósági keresés nem adta vissza az első 20 közt az UDG-2 találatot. Ezért valószínű, hogy Drosophila melanogaster-ben az UDG-2-nek nincs homológja. Archeákban, amelyekből mind az UNG, mind a SMUG1 homológok hiányoznak, további UDG családok találhatók, amelyek a TDG enzimekkel állnak legközelebbi rokonságban [81]. Említést érdemel továbbá, hogy a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) enzim 37 kD-os alegysége szintén képes kettős szálú oligodA:oligodU 31

szubsztrátból az uracilt eliminálni [150], bár katalitikus hatékonyságáról nincs adat. A GAPDH-nak az utóbbi időben több izoformáját, valamint számos glikolízistől független funkcióját is leírták [151].

3.1.5. Timinmentes sejthalál jelensége és terápiás alkalmazása A 2. ábrán vázolt timidilát bioszintézis útvonal bármelyik enzimét gátolva felborul a dezoxiribonukleotidok szigorúan szabályozott egyensúlya, ami a sejt számára végzetes következményekkel jár. A keletkező, viszonylag magas uraciltartalmú DNS-en ugyan működésbe lép a báziskivágásos javító mechanizmus, de ez a folyamat a továbbra is hibásan magas dUTP/dTTP arány mellett egy hiábavaló ismétlődő ciklusban felerősödik. Ennek során DNS száltörések révén kromoszómafragmentálódás következik be, ami pedig programozott sejthalálban végződik. Ez az ún. timinmentes sejthalál jelensége [152, 153] (8. ábra). A timinmentes sejthalál mechanizmusáról keveset lehet tudni, úgy tűnik egyes és kettős száltörések egyaránt keletkeznek, melyek közül ez utóbbi erőteljesebben képes a sejthalál irányába mozdítani a folyamatot [154]. Sokáig csupán az apoptózist ismerték, mint programozott sejthalált, azonban a közelmúltban több alternatív utat is megfigyeltek, melyek kapcsán a kaszpázok addig esszenciálisnak tűnő szerepe is megkérdőjeleződött [155]. A timinmentes sejthalálban előtérbe kerülhet a PARP-nak, mint DNS száltöréseket felismerő jelátviteli molekulának a szerepe is. Korábban is ismert volt, hogy a PARP részvesz a nekrotikus sejthalálban, nagymennyiségű DNS-hiba esetén intenzív poli(ADP-ribozil)-álás révén a NAD elvonásával a sejtet egy energia hiányos állapotba irányítja, aminek hatására bekövetkezhet a sejthalál [14]. Azonban a közelmúlt eredményei alapján az apoptózisban is feltételezik a PARP közvetlen szerepét, bár a mechanizmus részleteiben még itt sem tisztázott [156]. A PARP szerepének átláthatóságát nehezíti az is, hogy újabban már 12 eltérő lokalizációjú és kifejeződési mintázatú fehérjecsaládot azonosítottak, melyek PARP domént tartalmaznak, ill. PARP aktivitással bírnak [156].

32

A timinmentes apoptózis indukálása vírusfertőzött vagy rákos sejtekben ígéretes terápiás lehetőségnek mutatkozik [157], annál is inkább, mivel egyes sejttípusokban kimutatták, hogy az útvonal független az egyik legismertebb apoptózist indukáló tumorszupresszor fehérjétől, a p53-tól [158, 159]. A p53 deficiens tumorokban ugyanis a legtöbb terápiás stratégia csődöt mond. Több kemoterápiás szer is (antifolátok [160], methotrexát [161], fluorouracil [162]) forgalomban van, melyek a timidilát szintázt, vagy a dihidrofolát reduktázt gátolva fejtik ki hatásukat (9. ábra). Egyes tumor típusokban azonban idővel a fenti szerekre rezisztencia indukálódik. Ezekben a rezisztens tumorokban megfigyelték a dUTPáz enzim jelentős túltermelését [163-165], ill. hasonló rezisztenciát tudtak indukálni dUTPáz expressziója révén [166]. Ezért várható, hogy a dUTPázra 33

kifejlesztett specifikus gátlószerek, ill. gátlási eljárások önmagukban is, és az említett kemoterápiás szerekkel kombinálva is hatékony terápiás lehetőséget nyújtanak. A timinmentes sejthalál kiváltására gyakran alkalmazott 5-fluorodezoxiuridin azonban nem csupán a timidilát szintáz gátlása révén citotoxikus, hanem azt tapasztalták, hogy hatására fluorouracil is épül a DNS-be és az RNS-ekbe egyaránt.[167] Továbbá az UDG expresszió nem teszi a rákos sejteket érzékenyebbé a timidilát szintáz gátló szerekre [168]. Az is említést érdemel, hogy a timidilát szintáz nemcsak a dUMP dTMP-vé alakítását katalizálja,

de

számos

timidilát

metabolizmusban,

DNS-javításban

ill.

sejthalál

szabályozásában fontos fehérjék kifejeződésének szabályozásában is részt vesz.[169, 170].

Összefoglalva az uracilhiba DNS-ből történő kizárásában eddig két kulcsszerepben lévő enzimcsaládot ismertek: egyrészt a dUTPáz megakadályozza a timint helyettesítő uracilbeépülést, másrészt a bármely módon bekerült uracilt az UDG-k felismerik és eliminálják. Mivel a fő UDG, az UNG nem képes különbséget tenni a citozinból keletkezett, mutagén uracil, és az esetlegesen timin helyére beépülő, nem mutagén uracil között [123], az uracil általában is kerülendő hibaként jelenik meg a DNS-ben. A fentiek értelmében tehát az uracil beépülést gátló dUTPáznak fontos preventív DNS-javító szerep tulajdonítható, gátlásával jó eséllyel apoptózis indukálható rákos ill. vírusfertőzött sejtekben. Ezért terápiás

34

szempontból is indokolt a dUTPáz antagonizmusának lehetőségeit kutatni, melyhez elengedhetetlenek az alapkutatásból szerzett részletes információk, nemcsak a szerkezetről és a katalízisről, de kölcsönható partnereit és sejtbeli szabályozását illetően is. Amennyiben a két enzimaktivitás valamiképpen felfüggesztődik, lehetségessé válhat az „uracilhiba” megjelenése és huzamosabb ideig történő tolerálása is. Erre példa az életképes, inaktív dUTPázt kifejező dut-/ung- E. coli törzs (CJ236) [49], melynek genomjában a timint mintegy 1-2 %-ban helyettesíti uracil [29]. Felvetődik a kérdés, hogy a DNS uraciltartalma mennyiben változtatja meg az adott sejtben az expressziós mintázatot azáltal, hogy bizonyos transzkripciós faktorok eltérő affinitással kötik a normál ill. az uracillal szubsztituált DNS-t [32, 33]. Továbbá, hogy ez a hatás milyen mértékű uraciltartalomtól kezdve jelent szignifikáns veszélyt a sejt normális működésére nézve. Mindazonáltal a teljes U-DNS metabolizmus egyre tágabb horizonton történő vizsgálata nem csupán alapkutatási szempontból fontos, de a klinikai alkalmazások számára is lényeges új információkkal szolgálhat.

3.2. Uracil a DNS-ben, amikor nem csupán hiba Felmerülhet a kérdés, hogy valóban minden esetben csupán hibaként értendő-e az uracil megjelenése a DNS-ben, vagy esetleg bizonyos esetekben lehet fiziológiás szerepe is. Elvileg elképzelhető az uracil legitimitása bizonyos esetekben, mivel a timinnel tökéletesen analóg a bázispárképzési hajlamát tekintve, ráadásul a genetikai információ mobilis hordozójában, az RNS-ekben a timint valóban a nála egyébként egyszerűbb uracil helyettesíti. Feltehetőleg az evolúcióban is a timin a későbbi találmány. Az uracil lecserélése nyilván azzal az előnnyel járhatott, hogy a genetikai információ így stabilabbá vált, hiszen az UDG-k megjelenésével együtt lehetővé vált a citozinból átalakult uracil szelektív javítása. Vajon ez az uracil/timin csere az evolúcióban univerzálisnak mondható, vagy létezik olyan élő szervezet, amely számára megfelelő, esetleg bizonyos körülmények között előnyösebb maradt az egyszerűbb uracil bázis használata? Esetleg bizonyos fejlődési folyamatok őrzik ennek nyomait?

35

3.2.1. Uraciltartalmú genomok Eddig az élőlények természetes fajai közül csupán két-három bakteriofágról tudjuk, hogy genomjában timin helyett uracilt tartalmaz. A Bacillus subtilist fertőző PBS2 (ill. PBS1) bakteriofág genomja elsősorban uracilt tartalmaz, a timin uracilhoz viszonyított aránya mindössze 0,03 [1, 171]. További érdekesség, hogy az egész fág-genomban a C:G párok (mindössze 20 %) meglehetősen alulreprezentáltak az A:U párokkal szemben [171], amely eltolódás feltehetőleg az evolúció során – effektív javítás híján – a citozin spontán dezaminálásával keletkező uracilnak köszönhető [9]. A fággenom uraciltartalmának biztosítására több speciális fehérje is aktivizálódik a fertőzés során. Ilyen egy feltételezett dUTPáz inhibitor [70], továbbá egy dTMP foszfatáz [172], amelyek feltehetőleg a dUTP/dTTP arány nagyarányú növekedését okozzák a fertőzött baktériumban. A fág fertőzés során továbbá indukálódik a baktérium dCTP deamináza [173], ami a dUTP keletkezésének fő útját jelenti a baktériumban (vö. 2. ábra). Emellett speciális DNS polimeráz is indukálódik, amely enyhe preferenciát mutat az uraciltartalmú fág-DNS felé, a bakteriális DNS-sel szemben [171, 174, 175]. Továbbá a fág uracilos-DNS-ének megóvását a gazda szervezet UDG-jével szemben a fágban kódolt UDG inhibitor (UGI) biztosítja [127, 176, 177]. Ezeket a fehérjéket aktivitásuk alapján jellemezték, azonban - az UGI kivételével nem klónozták, így sem a fehérjék, sem az azokat kódoló gének szekvenciái nem váltak ismertté. Így azt sem lehet tudni minden esetben, hogy ezeket a Bacillus subtilis genomja tartalmazza-e, és csupán indukálódnak a fertőzés során, vagy a fág a saját genomjában kódolja. A részlegesen tisztított dTMP foszfatáz a nukleotidázok között ritka mértékű szubsztrátspecificitással bír a dTMP, ill. dUMP felé, ezzel a dTTP bioszintetikus útvonal két lépésénél is elvonja a kiindulási anyagot (vö. 2. ábra), amivel feltehetőleg hatékonyan gátlódik a dTTP szintézise [178]. Nemrégiben azonosították és jellemezték az E. coli-ban kifejeződő YjjG nukleotidázt [179], ami hasonló szubsztrát specificitással bír, mint a B. subtilis fent említett dTMP foszfatáza. A fiziológiás szerepéről azt gondolják, hogy a nemkanonikus nukleotid metabolitokkal szemben védi a sejtet (ún. „house-cleaning” enzim) [180], ill. bizonyos körülmények közt alternatív metabolikus utakat tesz elérhetővé [181]. Ezért valószínű, hogy az aktivitásában rokon B. subtilis dTMP foszfatáz is a baktérium genomjában kódolt, és a fertőzés során csupán indukálódik. A feltételezett dUTPáz inhibitor hatékonyan gátolja egyrészt a timidilát bioszintézis korábbi lépését, ami dUMP-t eredményez (vö. 2. ábra), másrészt az uracil beépüléséhez szükséges dUTP hidrolízisét is megakadályozza. A tisztított dUTPáz inhibitor és tisztított B. 36

subtilis dUTPáz aktivitását részletesen jellemezték, és kitűnt, hogy a pH = 8,5-9,0 tartományban (ami a dUTPáz aktivitás számára optimális) az inhibitor aktivitása erősen csökkent, míg pH = 6,5-7,2 (ahol a dUTPáz aktivitás mintegy 60 %-ban megőrződik), az inhibitor koncentrációfüggő módon képes a dUTPázt akár 90 %-ban is gátolni. Kihasználva ezt a pH-optimumban adódó különbséget, vizsgálták, hogy (pH = 8,2-ről pH = 8,9-re) lúgosított táptalajon logaritmikus növekedési fázisban lévő baktériumokat fertőzve, miképp változik a fág szaporodó képessége és DNS-ének uraciltartalma. Mind a szaporodó képesség tapasztalt jelentős csökkenése, mind a fág-genom emelkedett timin aránya (0,03-ról 1 fölé) aláhúzza a jellemzett dUTPáz inhibitor fehérje hangsúlyos szerepét a fág-genom uraciltartalmának biztosításában. Ezt tovább erősíti, hogy a magas pH-n történő fágfertőzés során nem detektáltak változást a fehérjeexpresszióban: az összes jellemzett fehérjeaktivitás (dTMP foszfatáz, dCTP dezamináz, dUTPáz, dUTPáz inhibitor) változatlanul kimutatható volt ezekből a sejtextraktumokból is [70]. A dUTPáz inhibitor aktivitás megjelenése mRNSés fehérjeszintézis-függő, mivel aktinomicin D ill. kloramfenikol hozzáadásával nem detektálható, ugyanakkor rifampin hatására – ami csupán a gazda szervezet RNS-szintézisét gátolja, a fágét nem - az inhibitor aktivitás változatlanul mérhető [70]. Ez azt is sugallja, hogy az inhibitor génje valószínűleg a fág-genomban kódolt. A bakteriális UNG-ot hatékonyan gátló UGI fehérjét a fág-genomból klónozták [182]. Az UGI a gazda szervezet fő UDG-jét gátolva megakadályozza, hogy a fág genomjába előzőleg beépült uracil kivágódjon. Önmagában ez az aktivitás nem növelné jelentős mértékben a DNS uraciltartalmát, amit alátámaszt az is, hogy nemrégiben azonosítottak UDG inhibitort olyan fágból, amelynek nem uracilos a genomja [183]. Az UGI-nak a bakteriális UNG-ok felé mutatott, rendkívüli affinitását már a korai publikációk is leírták [127, 176, 177]. Továbbá az UGI E. coli UNG-jával alkotott komplexének háromdimenziós térszerkezete [184], és mutációs vizsgálata [185] is megerősítette a specifikus, két lépcsőben kialakuló, kötődést, ami fiziológiás körülmények közt gyakorlatilag irreverzibilis. A másik ismert, uraciltartalmú fág-genomot nem régiben azonosították a több Yersinia fajt is fertőző, φR1-37 nevű fágban: az izolált, mintegy 270kb méretű fág-genomot különböző

nukleázokkal

nukleotidokig

emésztették,

majd

az

emésztményt

tömegspektrometriával (LC-MS/MS) analizálták, és abban timin gyakorlatilag nem detektáltak, csak uracilt [186]. Ugyanakkor itt még nincs körülírva az az enzim-rendszer, ami által a fág-DNS uraciltartalma biztosítódik. Ez a párhuzam egyben azt is sugallja, hogy lehet több, eddig nem azonosított, U-DNS-t hordozó bakteriofág is. (A bakteriofágok rendkívül népes csoport: minden ismert baktériumra 10 különböző fág jut [186]) Mindazonáltal még korántsem értettük meg, hogy milyen szerepe lehet a fág szaporodásában a DNS 37

uraciltartalmának. Úgy tűnik meglehetősen nagy energia fordítódik a timin kizárására, ezért felmerül a kérdés, milyen evolúciós előnnyel járhat az uracilszubsztituált genom. Lehetséges az is, hogy ezek a példák az evolúció korai szakaszának nyomait őrzik (RNS világban uracil -- megjelenő DNS-ben is uracil --- timin megjelenése/elterjedése a DNS-ben --- uracil kizárása a DNS-ből). A fenti természetben előforduló (vadtípusú) fágok mellett az E. coli T4 és T5 fágjából is generáltak és izoláltak olyan mutánsokat, amelyek a timidilát szintázt (T4 [187, 188], T5thy [189]) ill. a dUTPázt (T5dut [190]) nem tudják indukálni. Továbbá a T5dut és T5thy mutánsokat rekombinálva létrehoztak olyan kettős mutánst, amely genomja a mutációk következtében jelentős uraciltartalommal bír, ezért csak ung- mutáns E. coli törzset képes fertőzni. Ez a 1015 % körüli uraciltartalom befolyásolja a fágfertőzés során fellépő korai gének expresszióját: pl. a dTMP kináz indukcióját kétszeresére növeli [189]. Az egyszerű – önálló életre képtelen – fágokon kívül baktériumokban is sikerült létrehozni és szelektálni olyan mutációkat, melyek következtében felborul az egyébként szigorúan szabályozott dUTP/dTTP arány, és ezzel jelentős mennyiségű uracil épül a bakteriális genomba, ami azt követően nem javítódik hatékonyan. A fentiekben tárgyalt két kulcsfontosságú enzim, a dUTPáz és az UNG mutációja külön-külön a következő fenotípusos jegyekkel jellemezhető. Amennyiben csak az ung génben mutáns a törzs, nincs változás az életképesség terén, nem mutatható ki jelentős uraciltartalom a DNS-ben, a törzs megkülönböztető jegye, hogy U-DNS-t tartalmazó fágokkal fertőzhető [191] emellett megnövekedett C/G – T/A tranzíciós gyakoriságot mutat [192]. Amennyiben csupán a dUTPáz gén mutáns, a timinek csupán 5 % alatti része helyettesítődik uracillal [2], ugyanakkor lelassul a növekedési ütem, megnövekszik a mutációra valamint a rekombinációra való hajlam („hyper-rec” fenotípus), rövid Okazaki-fragmensekhez hasonló DNS detektálható, majd az életképesség is elvész, feltehetőleg az uracilt javító mechanizmus túlműködése miatt [193 ]. A dUTPáz és az UNG együttes mutációja E. coli törzsben mintegy 15-20 %-os uracillal való timinhelyettesítést eredményez, amennyiben dezoxiuridint adagolnak a tápoldathoz (a baktérium ugyanis képes exogén dezoxiuridint ill. timidint is hasznosítani bizonyos körülmények közt), a törzs életképes, bár a növekedési üteme lelassul (amit feltehetőleg a DNS stabil uraciltartalma által okozott DNS-fehérje kölcsönhatásokban bekövetkező változásokra lehet visszavezetni), továbbá enyhe mutátor fenotípussal jellemezhető [2].

38

A közel teljes mértékben uracilszubsztituált DNS-nek azonban jelentős hatása lehet olyan létfontosságú folyamatokra, mint az RNS- és fehérjeszintézis. Ugyanis az a többszörös mutáns (dCTP dezamináz, dUTPáz, UNG, timidin [dezoxiuridin] foszforiláz, timidilát szintáz) E. coli törzs, amely timidin megvonása mellett, dezoxiuridin jelenlétében az újonnan szintetizált DNS-szálba mintegy 93-96 % uracilt épít be timin helyett, közvetlenül a sejttömeg megduplázódása ill. a második replikációs ciklus előtt megáll a növekedésben és a DNS-szintézisben egyaránt [34]. A fenti példák egyértelműen alátámasztják, hogy, amennyiben a két kulcsfontosságú enzim (dUTPáz és UNG) aktivitása felfüggesztődik, bizonyos mennyiségű uracil előfordulhat és megtűrhető a DNS-ben, anélkül, hogy az jelentősen befolyásolná a sejt normális életét. Ugyanakkor a DNS uraciltartalma interferálhat bizonyos szükséges DNSfehérje kölcsönhatásokkal, ami egy határon túl lényeges változásokat is eredményezhet a sejt életében.

3.2.2. Uraciltartalmú DNS feltételezett szerepe bizonyos fiziológiás folyamatokban. Az irodalomban további három példát találunk arra, amikor a DNS-ben legalább átmenetileg megjelenő, limitált mértékű uraciltartalom valamiképp fontos biológiai/ fejlődési folyamatokban vesz részt, mintegy jel-szereppel bír. A három alább vázolt példa közül azonban csak egy igazán megalapozott és jól körülírt, nevezetesen az, hogy az immunoglobulin gének diverzifikációjában valamiképp szerepet játszik az AID enzim által katalizált citozin oxidatív dezaminálása, ill. az ennek nyomán a DNS-ben megjelenő, és az UNG katalízis folytán kivágódó uracil [3]. Az AID-t elsőként B-sejt specifikus, RNS-editáló fehérjeként azonosították [194]. Később bebizonyosodott, hogy DNS-en is aktív, sőt az ún. osztályváltó

(„class

switch”)

rekombinációban

és

a

szomatikus

hipermutációban

elengedhetetlen szerepet játszik [23, 195]. Az AID deficiencia bizonyos immunrendszeri megbetegedésekkel is összefüggésbe hozható [196, 197]. A fehérje kifejezése ung+ E. coliban mutátor fenotípust eredményezett, ung- E. coli-ban ez a mutátor fenotípus tovább erősödött, hátterében kontextus-függő dC-dG tranzíciók álltak [198]. Az UNG feltételezett szerepét a folyamatban tovább erősíti, hogy csirke DT40 B-sejtekben az UGI (UNG inhibitor) fehérjét kifejezve azt találták, hogy az immunoglobulin gének hipermutációjában a 39

transzverzióról átkerült a hangsúly a tranzícióra, azaz az AP-helyeken keletkező deléciók helyett a C→T átmenetek domináltak [199]. Az ung- egér fenotípusa a fejlődés kezdetén nem okoz szembeötlő változást, de később megnő a B-sejt limfomák kialakulásának gyakorisága [134]. Az ung mutációk továbbá humán esetben is összefüggnek az osztályváltó rekombináció hiányosságaival [200]. A témának kiterjedt irodalma van. A jelenleg nyitott kérdések: az AID fehérje immunoglobulin génekhez való irányítása, a mechanizmus további komponenseinek (többek közt AID paralóg fehérjék) azonosítása, a különböző mutáns fenotípusok jellemzése. Az U-DNS feltételezett sejtbiológiai szerepére vonatkozó második példa mindössze Burton és munkatársai 1979-ben megjelent cikkén alapul, melyben amellett érveltek, hogy a Chlamydomonas esetében a maternális kloroplaszt egyoldalú átörökítésének hátterében a paternális kloroplaszt-DNS-nek, uraciltartalma révén történő degradációja állhat [201].

3.2.3. U-DNS feltételezett szerepe a Drosophila melanogaster fejlődésében Az U-DNS fiziológiás folyamatban és/vagy egyedfejlődésben betöltött feltételezett szerepére vonatkozó harmadik példa a Drosophila lárvákban megjelenő U-DNS metamorfózishoz kapcsolt sejthalál folyamatokban betöltött feltételezett funkciója. Ezt a hipotézist egyetlen kutatócsoport vetette fel négy kísérletes és egy összefoglaló cikkben a nyolcvanas évek elejétől, hiányosságai miatt azonban viták kereszttüzébe került, aminek köszönhetően a témával immáron egy évtizede senki komolyan nem foglalkozott. A Drosophila dUTPázra vonatkozó – a jelen dolgozatban kifejtendő – eredményeink azonban összecsengeni látszottak a vitatott hipotézissel, ami további kutatásokra ösztönzött. Az alábbiakban a hipotézis, az azt övező vita, valamint a Drosophila metamorfózisa során zajló sejthalál folyamatokról azóta elérhetővé vált ismeretek részletes áttekintése következik.

3.2.3.1. Egy vitatott hipotézis fel- és eltűnése Deutsch és munkatársai szerint a Drosophila-ban az U-DNS javítása meglehetősen eltér a más organizmusok esetében leírtaktól. A nyolcvanas évek elején, a Drosophila UDG után kutatva – amit nem sikerült kimutatniuk egyetlen fejlődési stádiumban sem -, U-DNS-re specifikus nukleáz aktivitást detektáltak késői 3. stádiumú lárva extraktumból [6], de az 40

aktivitásért felelős fehérjét nem azonosították. Az aktivitást karakterizálták: kétértékű fémiontól független, nem eredményez szabad uracilt, helyette feltehetőleg több nukleotidnyi, savoldható termék keletkezik, az AP helyeken ill. más DNS hibák esetén nem mérhető, ssDNS is szubsztrátja, továbbá nem tesz különbséget a citozinból alakult uracil (U-G) ill. a timin helyett beépült uracil (U-A) közt. Az aktivitás a fejlődés során csupán a késői 3. lárvától a bábállapotok végéig detektálható. Ezek után kimutatták, hogy a Drosophila-ban az alkilált bázisok javítására sincs megfelelő DNS glikoziláz aktivitás, csupán metiltranszferáz [202]. Feltehetőleg a szigorúan U-DNS-re specifikus, csupán a metamorfózishoz kötötten kifejeződő nukleáz aktivitás jelenléte és az UDG aktivitás hiánya indíthatta a fenti kutatócsoportot arra, hogy vizsgálja a Drosophila dUTPázt is. Embrióból tisztított dUTPáz aktivitását jellemezték [63], anélkül, hogy klónozták, vagy szekvenálták volna a génjét. Az így nyert fehérjekémiai adataik meglehetősen eltérnek a mi csoportunkban a rekombináns úton előállított Drosophila dUTPázra meghatározottaktól [35]. Deutsch csoportja azt találta, hogy a dUTPáz aktivitás Drosophila-ban csupán az embrionális fejlődési szakaszban mutatható ki, sehol máshol. Ez alapján azt feltételezték, hogy a lárvaállapotok során uracil halmozódhat fel a DNS-ben – dUTPáz hiányában beépül, UDG hiányában nem is javítódik – azonban a 3. stádium végén kifejeződő U-DNS-re specifikus nukleáz ezt az uraciltartalmat mégiscsak „hibaként” ismerheti fel. Jóllehet korábban kidolgoztak egy eljárást a DNS-ben lévő uracil meghatározására [203], mégsem közöltek semmit arról, hogy a lárva DNS-ben valóban kimutatható-e ez a feltételezett uraciltartalom. Ezen a ponton vetették fel először azt a lehetőséget is, hogy az említett nukleáz aktivitása nyomán bekövetkező feltehetően nagyszámú DNS-törés valamiképp hozzájárulhat a metamorfózis során zajló sejthalál folyamatokhoz [204] (10. ábra). A későbbiekben szintén extraktumból kimértek egy dUTPáz inhibitor aktivitást, és az azért felelős fehérjét részlegesen tisztították is [5], de nem azonosították. Azt állították, hogy a dUTPáz inhibitor 60 kD körüli látszólagos molekulatömeggel bíró, hőstabil fehérje, de a kérdés, hogy sztöchiometrikus kötődés révén vagy proteolitikusan inaktiválja-e a dUTPázt, nyitott maradt. A nyolcvanas évek végén már több cikkben is vitatták Deutsch és munkatársai eredményeit. Először Breimer és munkatársai azonosítottak DNS glikoziláz aktivitást Drosophila embrióban [205], de UDG aktivitást ők sem tudtak mérni. Mindazonáltal ezzel megkérdőjelezték Deutschék azon állítását, miszerint glikozilázok híján Drosophila-ban a BER nem működik [6, 202].

41

Morgan és Chlebek Drosophila embrióban ill. Locusta migrata-ban (vándor sáska) a DNS mennyiségre vonatkoztatva, más aktívan osztódó sejteknek megfelelő mennyiségű UDG aktivitást mért kétféle módszerrel is [8]. Igaz, hogy a radioaktív módszer – melyben a

42

szubsztrát DNS-ben az uracil U:A párban található - esetén más feltárási módot kellett találni, hogy az aktivitás mérhetővé váljon, de egy különösen érzékeny fluoreszcens technika révén [206] – mely során a szubsztrát DNS az uracilt G-U párban tartalmazza - minden körülményben sikerült enzim aktivitást kimutatni. Továbbá UDG aktivitást mutattak ki 3. lárva extraktumban is, ahol állításuk szerint ez az aktivitás sokkal alacsonyabb, és az egyre sötétedő extraktumban lévő komponensek zavaró hatása miatt nem kvantifikálható. Ugyanakkor ebből az extraktumból nem tudtak kimutatni olyan nukleáz aktivitást, mint Deutsch és munkatársai, mely során savoldható nukleotid vagy oligonukleotid távozik. Megjegyzem, hogy a Morgan-csoport által használt 3. stádiumú lárva kivonat nem teljes extraktum volt, hanem egy második felülúszó, melyet az elsődleges csapadék szonikálásával kaptak. Az első felülúszó ugyanis nagy mennyiségű, fémionfüggetlen, nem specifikus nukleáz aktivitást tartalmazott, ami lehetetlenné tette a fluoreszcens módszerükkel való mérést. Megítélésem szerint ebben a frakcióban lehetett az az U-DNS specifikus nukleáz, amit a Deutsch-csoport mért, és amit a jelen dolgozatban azonosítottam. Érdemes azt is megjegyezni, hogy az UDG aktivitást Drosophila esetén a G:U párokat tartalmazó szubsztrátot használó módszerrel mérték igazán egyértelműen, habár vándor sáska tojásában mindkét módszerrel egyértelműen mérhető UDG aktivitás adódott. Megjegyzendő azonban, hogy a sáska ilyen szempontból nem egészen jó összehasonlítási alap a Drosophila-val, mert a sáska hemi-metamorfózissal fejlődik, mely fejlődésből a bábállapotok kimaradnak. Ezek után Deutsch és munkatársai részletesebben is megvizsgálták az UDG aktivitás lehetőségét, és több teljes átalakulással fejlődő rovarnál is (az ecetmuslica mellett cukornádfúró, bársonybab hernyó, méh) azt találták, hogy az UDG aktivitás nem mérhető. UDG aktivitást találtak viszont a házi tücsöknél, ami a vándor sáskához hasonlóan kihagyja a bábállapotot az egyedfejlődéséből [7]. Utoljára a kilencvenes évek közepén közöltek egy összefoglalót a fent vázolt hipotézisről [4], és azóta a témával sem ők, sem mások nem foglalkoztak kísérletes szinten. Közben azonban több ponton jelentősen előrehaladt a tudomány. Egyrészt nagyjából az utóbbi hét évben részletekbe menő ismereteink lettek a Drosophila bábállapotban zajló, az ekdizon hormon által indukált sejthalál folyamatokat illetően (ld. köv. fejezet). Másrészt elkészült a Drosophila genom szekvenálása és annotálása is, ami használható formában hozzáférhetővé is vált (http://flybase.bio.indiana.edu). Bioinformatikai munkák - részben alapozva az eredeti közlésekre - igazolják, hogy a genomból hiányzik az UNG-homológ gén [81]. Harmadrészt, a kételyeket növelték az újabban felfedezett UDG családok, (ld. 3.1.4. fej.) melyek közül kettőnek (SMUG1 és TDG) a homológja megtalálható a Drosophila-ban is (ld. bővebben 5.2. fej.). 43

A fent vázolt hipotézis (10. ábra) tehát egyrészt enzimológus körökben azért válhatott vitatottá, mert más csoportoknak sikerült glikoziláz és ezen belül UDG aktivitásokat kimutatni Drosophila-ban, amit a befejezett Drosophila genom szekvenálás is végső soron alátámasztott – jóllehet UNG-homológ UDG valóban nem található a genomban. Másrészt a genetikusok és fejlődésbiológusok körében sem talált visszhangra az U-DNS szerepéről alkotott hipotézis. Feltehetőleg azért, mert a hipotézis teljesen figyelmen kívül hagyta a Drosophila metamorfózisa során zajló sejthalál folyamatokról szerzett ismereteket, és meg sem kísérelte az eredményeket azok összefüggésébe helyezve értelmezni.

3.2.3.2. Programozott sejthalál a Drosophila fejlődésében A programozott sejthalálnak alapvetően három fajtáját ismerjük, melyek különböznek a nem programozott módon, gyulladással járó nekrózistól. A klasszikus – legrégebben ismert és leginkább jellemzett - forma az apoptózis, mely elnevezést gyakran használják az eredetinél tágabb értelemben is a programozott sejthalálra. Az apoptózist sajátos sejtbeli változások kísérik: kromatin kondenzáció, DNS-fragmentáció, plazmamembrán befűződés, citoplazma fragmentálódása apoptotikus testekké, amit végül a fagocita sejtek kebeleznek be, ahol

az

apoptotikus

testecskék

és

a

lizoszómák

összeolvadásával

keletkező

fagolizoszómákban történik a sejtalkotók végleges lebontása [207]. Az ilyen szűk értelemben vett apoptózis elsősorban izolált sejtekben fordul elő, pl. éretlen T-limfociták sejthalála [207]. Ezen kívül létezik ún. autofágiával járó sejthalál, amely során a citoplazma tartalmának lebontása nagy autofágikus vakuólumokban történik [207, 208]. A harmadik forma az ún. nem lizoszómális sejthalál, ami amellett, hogy ritkán megfigyelt, a legkevésbé jól jellemzett jelenség [207]. Muslicában a legtöbb apoptózisban szereplő fehérje homológja megtalálható, és a gépezet meglehetősen hasonlóan működik, mint akár a humán akár a C. elegans-beli megfelelője [207] (11. ábra). Az ismert kaszpázokon, apoptózis aktiváló faktor 1-gyel (Apaf-1) homológ „ark”-on, kaszpáz aktivált DNáz-on (CAD), ill. annak inhibitorán (ICAD), az apoptózis inhibitor „IAP”-okon kívül azonban vannak Drosophila specifikus szereplői is a sejthalál útvonalaknak, ilyenek a reaper, hid, grim gének termékei [207]. Ezeknek elsődleges szerepük az apoptózis indukcióban/szabályozásban van, és nem annyira az egész gépezet működtetésében: alapvetően kaszpázokat aktiválnak, de fizikai

44

kapcsolatban vannak az apoptózist gátló „DIAP1”-gyel is [207]. Míg magának az apoptózis folyamatának molekuláris hátterét egyre jobban ismerjük, a sejthalál aktiválása ill. a keletkező maradványok eltakarításának módja a fejlődő szervezetben kevésbé feltárt terület.

45

A Drosophila-ban a 20-hidroxi-ekdizon (ekdizon) hormont a különböző fejlődési folyamatok – köztük a metamorfózis során zajló sejthalál és sejtdifferenciáció – fő szabályozójának ismerjük, ugyanakkor a jelátviteli utak átfedése révén a juvenil hormon is szerepet kaphat a fejlődési állapottól függő sejtválasz indukálásában [209]. Az ekdizon olyan szteroid hormon, mely megfelelő nukleáris receptorokhoz kötődve az ún. korai gének transzkripcióját indukálja (11. ábra). A korai gének közt általában specifikus transzkripciós faktorok ill. további nukleáris receptor fehérjék találhatók, melyek aztán további gének kifejeződését indukálják. Az ekdizon impulzusra adott sejtválaszok tehát egy genexpressziós kaszkádon keresztül alakulnak ki [210]. Feltehetőleg a kaszkád komponenseinek változatosságában kereshető az oka annak, hogy ugyanaz a hormon, sejttípustól és egyedfejlődési állapottól függő módon, sokféle, egymással akár ellentétes jellegű sejtválaszt képes kiváltani [211]. Tehát számunkra az egyik legizgalmasabb kérdés az, hogy milyen korai gének felelősek az ekdizonválasz sejthalál felé irányításában. A korai gének közt az E93-ról tételeztek fel ilyen szerepet, a fehérje kifejeződési mintázatának és a sejthalál-válasz szöveti eloszlásának megfigyelt szigorú összefüggésére alapozva [212]. Kimutatták, hogy a fehérje bizonyos sejttípusokban szükséges és elégséges az ekdizonra adott sejthalál-válasz beindításához [213]. Azonban kimutatták azt is, hogy az E93 expressziója a β-FTZ F1 faktor (Fushi Tarazu faktor 1) közvetítésével indukálódik, mely faktor kifejeződése a bábállapotot indukáló két ekdizon impulzus között figyelhető meg, továbbá szükségesnek tűnik a programozott sejthalál során zajló DNS-degradációhoz [211]. Látható, hogy az ekdizonválasz sejthalál felé irányításának mechanizmusát csupán e két fehérje vizsgálatával nem értettük még meg. Egy másik csoport a citoszkeletonhoz asszociált p127 fehérje szerepét hangsúlyozza a nyálmirigy apoptózisának időzítésében [214] A közelmúltban nagy áteresztő képességű genomikai [215, 216] ill. proteomikai módszerekkel [217] a metamorfózis során zajló sejthalál folyamatokban feltehetőleg szereplő gének ill. fehérjék egész arzenálját azonosították. Az így szerzett nagy mennyiségű információ azonban egyáltalán nem jelenti a folyamat teljes leírását, mert az azonosított gének ill. fehérjék funkciójáról az esetek többségében semmit nem tudunk.

Nemcsak

ezeknek a modern nagy áteresztő képességű módszereknek, de a korábbi genetikai szemléletű megközelítésnek is hiányossága, hogy a rendszerekben azonosított komponensek elsődleges funkciójáról keveset tudunk, így nehéz rekonstruálni a különböző – egyenként is sokszor esszenciálisnak tűnő – fehérjék valódi szerepét és helyét a szignalizációs hálózatban. Ezért is jelent komoly előrelépést a jelen munkában azonosított és jellemzett UDE fehérje, mely specifikus aktivitásának ismeretében kiindulópontot jelenthet a további kutatások számára. 46

3.2.3.3. DNS degradáció szerepe a programozott sejthalál folyamán A programozott sejthalál folyamatok rendszerint az elhaló sejt DNS-ének fragmentációjával járnak. Ez a DNS emésztődés alapvetően háromtípusú lehet (12. ábra), melyek különböző nukleázoknak tulajdoníthatók, eltérő jellegű terméket adnak, és a sejthalál folyamatában betöltött szerepük is különböző súlyú. Időben a legkorábban az ún. „nagyskálájú” („large scale”) DNS hasítás következik be, ami kb. 50.000-300.000 bázispárnyi óriás fragmenseket eredményez [218]. Ezt követően jelenik meg az a klasszikus apoptózis markereként széles körben használatos ún. DNS létra (kb. 180nt szakaszok ill. ennek többszörösei), melyet a CAD által katalizált inter-nukleoszómális DNS-fragmentáció eredményez [219]. Továbbá az elhaló sejtek DNS-ének végleges, nukleotidig történő lebontását a fagocitózist követően a makrofágok lizoszómáiban lévő DNáz II végzi, attól függetlenül, hogy az apoptózis során volt-e inter-nukleoszómális fragmentáció vagy sem [220].

Az óriás fragmenseket eredményező első DNS-fragmentáció jellemzőiről kevesebbet tudunk. Feltehetőleg a CAD is képes ezt katalizálni, de itt több más nukleáz is szóba jöhet, mint pl. az endonukleáz G, ami normálisan a mitokondriumok intermembrán terében 47

lokalizálódik, és feltehetőleg az apoptózis indukció során transzlokálódik a magba [221, 222]. Az endonukleáz G a DNS-t csupán egy szálon hasítja be, szekvencia preferenciája a CAD-tól eltérő, továbbá a nukleoszómális feltekeredettségű DNS-en is képes hasítást katalizálni [223]. Több példa is mutatja, hogy a „nagyskálájú” DNS vágás önmagában, a klasszikus DNS létra nélkül is, elégséges a sejthalál kiváltásához. Így például a tumor nekrózis faktorral kezelt egér embrionális fibroblaszt sejtekben, ahol csupán a „nagyskálájú” DNS-fragmentálódás detektálható, a sejthalál feltehetőleg a DNS-száltörések által kiváltott PARP aktiválódás, és ennek eredményeképp a NAD elvonás révén következik be [224]. Ez a kezdeti DNS-hasítás az apoptózis indukció erősítésében fontos szerepet játszhat [224] Az internukleoszómális DNS-fragmentáció úgy tűnik, nem eszenciális, erre utal a kaszpáz- ill. CAD-független apoptózis lehetősége is [225, 226]. Továbbá a CAD nullmutáns – egyébként életképes és normális fenotípust mutató - egerekben az apoptózis során nem mutatható ki a DNS-létra, ugyanakkor nem halmozódik fel emésztetlen DNS sem a szövetekben [218]. Ilyenkor a fagocitózist követően a makrofágok lizoszómáiban a DNáz II képes a nagyrészt emésztetlen DNS-t teljesen feldarabolni, ezzel aktívan részt vesz az elhaló sejt eltakarításában [220, 227]. A CAD nullmutáns egér tímuszában csak gamma sugárzás hatására indukálódó nagy tömegű sejthalál esetén mutatkoztak eltérések, ilyenkor a makrofágok kapacitását meghaladva, az elhaló sejtek bekebelezetlenek maradnak, így a DNS-ük sem emésztődik, hanem felhalmozódik a szövetekben [218]. Az előbbiek a lizoszómális DNS-degradáció esszenciális szerepére utalnak, amit a DNáz II mutáns egerek letalitása is alátámaszt [228].

A 3.2. fejezetben bemutatott példák alapján mondhatjuk, hogy az uracil DNS-ben való megjelenését nem feltétlenül kell puszta hibaként felfogni. A jelen dolgozat lényeges új eredményekkel támasztja alá az U-DNS egyedfejlődésben betöltött feltételezett szerepét a Drosophila melanogaster esetében. Ezzel egyúttal ösztönözni is szeretné a további kutatásokat, melyek az U-DNS további fiziológiás folyamatokban és/vagy betegségekben betöltött esetleges szerepeit célozzák.

48

3.4. Célkitűzések és a kísérletek racionális tervezése A dUTPáz különleges fontossága, terápiás célpontként való lehetséges alkalmazása mellett a fentiekben ismertetett hipotézis (U-DNS metamorfózisban betöltött szerepe) adta az indíttatást a Drosophila dUTPáz behatóbb, proteomikai szemléletű vizsgálatára. A munkám során fokozatosan tárultak elénk olyan összefüggések, melyek megerősítik ezt a korai, felettébb vitatott eredményeken alapuló hipotézist. Elsőként célul tűztük ki a Drosophila dUTPáz fiziológiás formáinak kimutatását végig az egyedfejlődés során, ill. különböző szövetekben, továbbá az esetleges izoformák, ill. kölcsönható fehérjepartnerek azonosítását. Miután kimutattuk, hogy a dUTPáz kifejeződése a lárvaállapotok során az imaginális diszkuszokra szorítkozik, valamint a kész Drosophila genomadatbázison végzett részletes blast keresésekkel megerősítettük, hogy a fő UDG gén hiányzik a Drosophila genomból, feltételeztük, hogy a lárvális szövetek genomi DNS-ében a politenizáció során valóban uracil halmozódik fel. Ezután célul tűztük ki ennek az uracilnak a kimutatását. Miután a feltételezett uraciltartalmat is sikerült legalább kvalitatív módon kimutatni, ill. sikerült 3. stádiumú lárva extraktumból újra kimérni a feltételezett U-DNS nukleáz aktivitást [6], célul tűztük ki, hogy U-DNS-t felismerő fehérjéket izoláljunk késői 3. stádiumú lárvákból, ill. ezeket azonosítsuk. A kapott találatok in silico elemzése egyetlen kiemelkedő jelölttel szolgált az extraktumból kimutatott nukleáz aktivitásra, ezért célul tűztük ki ennek a génterméknek rekombináns úton történő előállítását, és annak jellemzését, ill. a rekombináns fehérjére kifejlesztett poliklonális szérum birtokában a fehérje fiziológiás formájának kimutatását a különböző fejlődési stádiumokban, ill. szövetekben.

.

49

4. Módszerek és módszertani eredmények 4.1. Anyagok Az oligonukleotidokat az MWG Biotech-től rendeltük. Sejtvonalak, modell szervezetek: BL21(DE3), XL1-Blue és CJ236 (dut-, ung-) E. coli törzsek (New England Biolabs) BL21(DE3) ung-151 ( Samuel Bennett laboratóriuma) Drosophila sejtvonal: S2 (Invitrogen, Schneider line 2 [229]) Oregon-R vadtípusú Drosophila melanogaster törzs (Friedrich Péter laboratóriuma)

4.2. Fehérjék termelése, tisztítása 4.2.1. Kétféle rekombináns dUTPáz forma előállítása A LD20050 plazmidról (Research Genetics, Inc.) [39] a dUTPáz gént polimeráz láncreakcióban (PCR-ben) szaporították fel. A PCR-hez használt 5’ primer szekvenciája: 5’ACGGAATTcaTatgccaAGCaccgatttcgccgacattc - 3’ (kisbetűvel a nem-komplementer bázisok);

két

különböző

3’

primer

szekvenciája

pedig:

5’-

ctgcCTCGAGTTA

cttgactccggtggaaccgaatc - 3’ (SD); ill. 5’- GAGCTCGAGATCtacgtagcaacaggagccggag - 3’ (LD). Így két Drosophila dUTPáz konstruktot hoztak létre: az egyik a teljes hosszúságú fehérjét kódolja (1-188, a továbbiakban LD dUTPáz, vö. 4. ábra), a másik pedig a Drosophila-ra jellemző extra C-terminális részt nélkülözi (1-160, a továbbiakban SD dUTPáz). A primerekkel egyúttal a következő restrikciós helyeket vitték be: a géntől 5’ irányban közvetlenül egy EcoRI (GAATTC) és a kezdő ATG kodonnal fuzionálva egy NdeI (CATATG) helyet, ill. a géntől 3’ irányban XhoI helyet (CTCGAG) az SD esetében, valamint egy a hosszú konstrukt esetén a stop TAG kodonnal fuzionált XhoI és BgIII kombinált helyet (AGATCT). Továbbá az eredeti TCASer kodont lecserélték az E. coli-ban használatosabb AGCSer kodonra. Az így nyert két dUTPáz formát kódoló DNS-t a pET22b (Novagen) expressziós plazmidba vágták (a továbbiakban LDdut-pET22b, ill. SDdutpET22b). A plazmidokat E. coli XL1-Blue-ban szaporítottuk, és „Quiagene midi” szettel tisztítottuk.

50

A plazmidokat E. coli BL21(DE3) törzsbe transzformálták elektroporálással. A transzformált törzset ampicillint tartalmazó standard LB agar-lemezeken éjszakán át 37 °Con növesztettük, amit aztán carbenicillint tartalmazó 500 ml LB tápoldatban rázatón növesztettünk tovább, exponenciális növekedési fázisig - a növekedést optikai denzitás mérésével követtük 600 nm-en. Majd a sejteket 0,5 mM izopropil-β-D-tiogalaktozid (IPTG) hozzáadásával indukáltuk, további 5-6 órát növesztettük, végül 8000 g-vel, 10 percig, 4°C-on centrifugáltuk, a sejtcsapadékot pedig –70 °C-on tároltuk feltárásig. A feltáráshoz használt puffer: 50 mM Tris/HCl ((aminometántriil)trimetanol – sósav puffer elegy) pH = 8,5, 1 mM etiléndiamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav (EDTA), 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 mM fenilmetánszulfonil-fluorid (PMSF) + 50 μg/ml lizozim, 1 μg/ml RNáz, 1 μg DNáz. A sejtszuszpenziót a következő lépések szerint tártuk fel: 0,5h jégen kevertetés, 3 X 1’ szonikálás, 20’ jégen kevertetés, 20’ centrifugálás 18000 g-vel, 4°C-on. A felülúszót 200 ml-es Q-szefaróz anioncserélő oszlopon választottuk el, amit előzőleg 1 mM ditio-treitolt (DTT) és 0,1 mM PMSF-t is tartalmazó 25 mM Na-foszfát pH = 7,5 pufferrel egyensúlyba hoztunk. Lineáris gradiens elúciót alkalmaztunk 0-1 M NaCl közt 700 ml-es teljes térfogattal (Gradifrac System, Amersham Biosciences). A dUTPáz rendszerint 0,5-0,6 M NaCl koncentrációnál eluálódott. Amennyiben szükséges volt további gélszűrést is alkalmaztunk: Superdex 200 HR oszlopon (Amersham Biosciences). Nátrium-dodecilszulfátot tartalmazó poliakrilamid gélen (SDS-PAGE) denzitometriás értékelés alapján az így nyert enzim preparátumok legalább 95 %-os tisztaságúak (13.A ábra). A preparátumokat MilliPore centrifugális szűrőn (10 kD pórusméret) 8-15 mg/ml végkoncentrációig töményítettük, amelyek így folyékony N2-ben lefagyasztva -70°C-on legalább 3 hónapig tárolhatók.

4.2.2. A rekombináns CG18410 géntermék (UDE) előállítása A Drosophila melanogaster CG18410 gén cDNS-ét (Open Biosystems) NdeI és XhoI restrikciós enzimekkel pET19b (Novagene) plazmidba Felföldi Ferenc klónozta. A rekombináns konstrukt tartalmaz egy hat hisztidinből álló címkét (továbbiakban His-címke, ill. a rekombináns fehérje His-UDE) és egy összekötő régiót az N-terminálison, ahol a pontos szekvencia (M)GSSHHHHHHSSGLVPRGS, amit a 39. ábrán látható szekvencia követ a 4. aminosavtól kezdődően. Így a rekombináns fehérje 369 aminosavas, pI=9,45, Mw= 41315.0.

51

A plazmidot (továbbiakban pET-HisUDE) hősokkot alkalmazva transzfektálták a következő

expressziós

törzsekbe:

BL21(DE3)pLysS,

BL21(DE3)ung-151

ill.

BL21(DE3)ung-151 pLysS. A transzfektált törzseket ampicillint tartalmazó standard LB táptalajon növesztették. Logaritmikus növekedési fázis elején 1 mM IPTG-vel indukálták a fehérjeexpressziót. Indukálás után a törzseket 25°C-os rázatóban növesztették tovább 4-5 órán keresztül, végül 8000 g-vel, 10 percig, 4°C-on centrifugálták, a sejtcsapadékot pedig 70°C-on tárolták feltárásig. A fehérje expresszióját és tisztítását Felföldi Ferenc tanácsai nyomán általában Pukáncsik Mária, Zagyva Imre és Leveles Ibolya végezte.

A feltáráshoz használt puffer: 50 mM Tris/HCl pH = 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 0,1 mg/ml lizozim, 2 μg /ml RNáz. A sejtszuszpenziót a következő lépések szerint tárták fel: 1h jégen kevertetés hozzáadott kvarchomokkal, 6X45 sec szonikálás, 30’ jégen kevertetés, majd 6X45 sec szonikálás, 20’ centrifugálás 22000 g-vel 4°C-on. A felülúszóból a rekombináns His-UDE fehérjét Ni-NTA oszlopon tisztították. Az oszlopot 3 oszloptérfogatnyi (Vo) LS pufferrel (50mM HEPES (N-(2-hidroxietil)piperazinN’-etánszulfonsav), pH = 7,5, 30 mM KCl) hozták egyensúlyba, a felülúszó oszlopra vitele után pedig sorban a következő mosási lépéseket végezték: 2 Vo LS, 2 Vo HS (50 mM HEPES pH = 7,5, 300 mM KCl), újra 1 Vo LS puffer. Ezután LS pufferben oldott 50 mM imidazollal 52

eluálták az esetlegesen aspecifikusan kötődő szennyeződéseket, közben Bradford módszer segítségével követték az eluálódó fehérjemennyiséget. Végül 200 mM vízben oldott imidazollal eluálták a His-UDE-t, az elúciót szintén Bradford reakcióval követék. Az ezt követően 150 mM KCl-ot, 1 mM DTT-t tartalmazó 20 mM HEPES pH = 7,5 pufferbe dializált His-UDE SDS-PAGE-n denzitometriás értékelés alapján legalább 95 %-os tisztaságú (13.B ábra). A preparátumok 1-5 mg/ml végkoncentrációig töményítve, folyékony N2-ben lefagyasztva -70°C-on legalább 3 hónapig tárolhatók.

4.2.3. Fehérjekoncentráció meghatározása Fehérjekoncentráció meghatározása Bradford reagenssel A barna színű Bradford reagens (BioRad) a fehérje lizin oldalláncaihoz kötődve kék színű lesz [230]. A kék szín megjelenését kvantitatíve követjük a különböző hígítások 595 nm-en mért abszorbanciájának mérésével, ami arányos az elegy mg/ml-ben kifejezett fehérjekoncentrációjával. A rendszert ismert koncentrációjú marha szérum albumin (BSA) oldat hígítási sorához kalibráljuk. A protokoll szerint 800 μl híg (0,1-10 μg/ml) fehérjeoldat hígítást készítünk vízzel, vortexen alaposan összekeverjük. Ehhez hozzámérünk 200 μl Bradford reagenst, vortexen ismét alaposan összekeverjük. 10’ elteltével műanyag küvettában, levegővel szemben mérjük az abszorbanciát. Egy tipikus kalibrációra illesztett egyenes egyenlete: ΔA = Amért - Avak = 0,059 * chíg (μg/ml). Fehérjekoncentráció meghatározása UV spektrum alapján A fehérjéknek 280 nm-nél specifikus elnyelésük van, amely a fehérjékben található aromás oldalláncoknak köszönhető. Ezért az aromás oldalláncok számától és a teljes fehérje molekulatömegétől függ, hogy mennyi az adott fehérje specifikus elnyelése. A koefficiens közelítő becslésére léteznek hozzáférhető szoftverek (pl. a ProtParam a www.us.expasy.org oldalon). Így a tiszta fehérjék oldatának UV spektrumából megbízhatóan becsülhető a fehérjekoncentráció. A specifikus elnyelési koefficiensek a következők: A0,1%1cm, 280nm = 0,32 a SD dUTPáz, 0,26 a LD dUTPáz, és 0,79 a His-UDE esetén.

53

4.3. Ecetmuslica minták készítése különböző fejlődési állapotokból 4.3.1. Ecetmuslica tenyésztése ill. S2 sejtvonal fenntartása A kísérleteket vad típusú Drosophila melanogaster Oregon-R törzsön, ill. S2 sejtvonalon végeztük. Az ecetmuslicákat vattával enyhén bedugaszolt, fenntartó táptalajt tartalmazó szélesnyakú üvegekben tartottuk, a táptalaj elhasználódásakor friss üvegekbe ráztuk a megmaradt legyeket. Ez a módszer lehetővé teszi a légytörzsek megfelelő módon elszigetelt, biztonságos fenntartását hosszú időn keresztül. A fenntartó táptalaj a következőket tartalmazta: 1,5 % bakteriológiai agar (Reanal), 6,6 % kukoricadara, 6,6 % élesztő, 9 % kristálycukor (ezek egyszerű élelmiszerboltban beszerezhetők), továbbá 9,2 mM NaCl (Sigma), 3,4 mM CaCl2 (Sigma) desztillált vízben. Az agar feloldódásáig forraljuk, majd kis hűlés után hozzáadunk etanolban oldott 10 %-os Nipagint (a végkoncentrációja 0,2 %), ami gombaölő hatása révén meggátolja a táptalaj idő előtti penészesedését. Aztán az üvegekbe ill. lemezekre töltve hagyjuk megszilárdulni a táptalajt. Petéztetés céljából műanyag lemezekre öntött tenyésztalajt alkalmaztunk, amire speciális kialakítású dunsztos üveget borítottunk: a dunsztos üveg levágott alja helyett gézt ragasztottunk, ami a megfelelő szellőzés mellett biztosította a legyek bezárását. A tenyésztalaj a következőket tartalmazta: 2 % szálas agar (Reanal), 10 % élesztő, 10 % kristálycukor desztillált vízben, amit 10 %-nyi málnaszörppel vagy egy kanál aktív szénnel színeztünk a lerakott petecsomók jobb észlelhetősége végett. A tenyésztalajhoz is adunk 0,15 % Nipagint. A petéztetés hatékonyságát növelendő élesztő granulátumot is szórtunk a tenyésztalajra. A petéztetést két órán keresztül (szinkronizált tenyésztés esetén, amikor szűkebb fejlődési intervallumot vizsgáltunk), vagy éjszakán át végeztük. A petéztető lemezek cseréje előtt a legyeket CO2 befúvással elaltattuk, ezzel meggátolva a szétrepkedésüket, ill. más légytörzsekkel való keveredésüket. A Drosophila S2 sejteket L-glutaminnal (Invitrogen, 10X híg) kiegészített steril SFM médiumban (Life Technologies, Inc.) (+10 % FBS) penicillin-streptavidin (Sigma, 100X híg, 50 egység/ml penicillin, 50 μg/ml sztreptavidin) antibiotikum mellett, 22°C-os steril termosztátban tenyésztettük. A sejtvonalt eredetileg 20-24 órás embriókból alapították, főként epitéliális sejtek alkották [229], mégis a forgalmazó leírása szerint sok tulajdonsága

54

utal arra, hogy makrofágszerű vonalból deriválódott. A sejteket nem lehet tripszinezni, be mechanikai behatással elválaszthatók a flaska aljáról, mert nem tapadnak egészen a felszínre. Mosásukat csak centrifugálással lehet kivitelezni, 1000 g-vel centrifugálhatók sérülés nélkül. 6-20x106 sejt/ml sűrűségnél kell passzálni 1:2 vagy 1:5 arányban.

4.3.2. Fejlődési stádiumok gyűjtése Az alábbi táblázat a Drosophila melanogaster fejlődését [231] foglalja össze, mely a dolgozatban bemutatott munka szempontjából érdekesebb fejlődési stádiumokra helyezi a nagyobb hangsúlyt: az embrionális stádiumokra [232, 233], ill. a bábállapotokra [215]. A jellemzőket is elsősorban praktikus szempontok alapján tüntettem fel. Megjegyzendő, hogy az adatok 25°C-ra vonatkoznak. A tapasztalat szerint mind a hőmérsékletbeli eltérések, mind a tápanyag ellátottság erősen képes befolyásolni az egyes stádiumokban töltött időt. Ezért, amikor részletesebb vizsgálat alá vettük az embrionális ill. a 3. lárvaállapotot, a petéztetés időtartamát 2 órára szűkítettük, termosztált helységben és élesztőgranulátum folyamatos utánpótlásával kívántuk biztosítani a kiegyensúlyozott körülményeket a legyűjtött fejlődési állapotok jó reprodukálhatósága érdekében. Stádium:

Idő Szüretelés intervallum (petéztetéstől

Jellemzők

ováriumban (petefészekben) oogenezis (peteérés)

A peteérés ideje kb. 70 óra [234]

embrió (pete)

A megtermékenyüléstől számított 1-22h

Az ováriumban a kisméretű, éretlen folliculusoktól (tüsző) fokozatosan növekvő sorban az egyre érettebbek kapcsolódnak egymáshoz, és az aktuálisan érett petesejt a sor végén lefűződik. A folliculust alkotó 16 db haploid sejtből 15 dajkasejtként szolgál, melyek az érés során fokozatosan összehúzódnak, és anyagukat (maternális mRNS és fehérje készlet) a gyűrűcsatornákon keresztül a petesejtbe pumpálják. Az érés során a dajkasejtek az anterior pólusra húzódnak. Megtermékenyülés után a pete kikerül a légyből. Fehér mozdulatlan csomók, ahol a tojás alakú petéken két függelék látható. A sima felületű petéztető talajról ecsettel legyűjthetők. Az embriogenezis során számos időzített fontos fejlődési folyamat zajlik:

számítva)

11h

55

A petében az első 70 percben 9db magi mitotikus ciklus zajlik szinkronban, amely tisztán a maternális mRNS és fehérje készletre alapozódik. Ekkor az összes sejtmag közös citoplazmában található (szinciciális blasztoderma). Elsőként az ivarsejtek fűződnek le (70-90 perc). A 10. ciklus során van lehetőség először az embrionális DNS-ről való transzkripcióra. A 10-13. magi mitotikus ciklusok (90-130h) még jórészt a maternális mRNS és fehérje készletre alapozódnak, de a 13. ciklus alatt megtörténik a „zigotikus kapcsolás”, mely után a további mitotikus ciklusok teljes mértékben zigotikus szabályozás alá kerülnek. 130-180 óra közt történik a blasztoderma cellularizálódása. [233] Az ezt követő fejlődési szakaszban még 3 posztblasztodermális mitotikus ciklus zajlik, ill. a sejtek intenzív differenciációja. Az első stádiumú lárva a megtermékenyítés után 21-22 óra elteltével kell ki. 1. lárva 22-46h 34h A petéknél nem sokkal nagyobbak, de mozgékonyak, és nincs csápjuk. Vízzel lemoshatók a petéztetőről, a vízben elsüllyednek. 2. lárva 46-70h 58h Nagyobb méretűek, kezdik berágni magukat a táptalajba. 3. lárva

70-120h

95h

A bábhoz hasonló méretűek, a stádium vége felé kimásznak a tápból. Színük még a fehérhez közelít. A lárvaállapotok során a kilenc imaginális diszkuszban ill. további öt imaginális gyűrűben különböző időzítéssel aktív sejtosztódás folyik. Ezek az imaginális szövetek képezik a felnőtt egyed szövetei differenciálódásához szükséges progenitor sejteket [235] késői 3. stádiumú A pupárium ~118h Kevéssé mozgékony, bebábozódásra („vándorló”) formálódást alkalmas helyet keresve – rendszerint lárva megelőző az edény falára mászik. Egy erőteljes mintegy 10 mintegy 6 óráig tartó ekdizon órányi impulzus indukálja a pupárium szakasz formálódást. Az impulzus a pupárium formálódás előtt 4 órával éri el maximumát. prepupa a pupárium ~126h Kövérebb, mint a 3. stádiumú lárva, formálódás sötétebb, sárgásba hajló színű. Ekkor után 0-12h zajlik a lárvális középbél programozott sejthalála. A stádium végén (10-12h PF után) egy második, kisebb intenzitású ekdizon impulzus indukálja az átmenetet a bábállapotba. Fiatal báb a pupárium ~140h Okker színű, tokba zárt merev formálódás képződmény, az edény falához erősen után tapad. Ekkor számos időzített 12 - ~70h fejlődési folyamat zajlik, például rögtön a stádium elején a lárvális nyálmirigy programozott sejthalála. késői báb ~70 - ~100h ~210h Sötétebb barna, mert a kifejlődő légy már áttetszik a kitinfalon. Imágó/ felnőtt kb. 60 napig A legyeket CO2 áramban altatva lehet légy élnek összegyűjteni, ill. áthelyezni más edénybe. 56

A különböző fejlődési állapotok legyűjtését PBS pufferbe végeztük, a legyűjtést követően pedig a mintát alaposan meg is mostuk a pufferrel, eltávolítandó az esetleges táp maradékokat. A PBS puffer összetétele: 10X PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 800 ml (pH = 7,4). A mintákat folyékony N2-ben lefagyasztva, -70°C-on tároltuk a feltárásig. Az ovárium izolálást és frakcionálást a következők szerint végeztük. A boncolást Zagyva Imre végezte 1000-szer hígított proteázgátló koktélt (Sigma) és 1 mM EDTA-t tartalmazó Drosophila Ringer pufferben. Az 50 darab fél órán belül boncolt ováriumot, 1-2 percig inkubáltam tripszin-EDTA-val (Sigma) szobahőmérsékleten, mikroszkóp alatt követve a petekamrák elválását, majd 5 mM PMSF-fel leállítottam a tripszinolízist. Felülúszó leszívása után 3-szor PBS-sel mostam, majd az egyedi petekamrákat 30μm-es membránon (Millipore) szűrve méret szerint két frakcióra választottam. Az érett ill. éretlen petekamrák dúsulását a megfelelő frakciókban mikroszkóp alatt ellenőriztem.

4.3.3. Fehérjekivonatok készítése a különböző fejlődési stádiumokból A leszüretelt S2 sejteket 1000 x g-vel centrifugáltam, majd kétszer mostam PBS pufferrel, végül lízis pufferbe felszuszpendáltam. Az S2 lízis puffer a következőket tartalmazta: 10 mM Tris/HCl, pH = 7,2, 40 mM KCl, 10 % glicerin, 1 mM EDTA, és mindig frissen hozzáadva 1 mM DTT-t ill. 1000-szeres hígításban proteázgátló koktélt (Sigma), 0,5 mM PMSF, 2 mM benzamidin. A homogenizálás során az ismételt lefagyasztás-felolvasztás mellett vékony fecskendőn történő préselést alkalmaztam, illetve Potter-Elvhejem homgenizátort követően szonikálást. A homogenizátumot 18 000 x g-vel centrifugáltam. Ez a felülúszó a nyers extraktum, melyből 5 percig történő forró vízfürdőn való inkubálással és azt követő centrifugálással nyertem a hőstabil extraktum frakciót. Az embriók és különösen a lárvák feltárásának az első kritikus lépése a homogenizálás: a vastag kutikulát erőteljes fizikai behatással lehet csak összezúzni, ezért először PotterElvehjem homogenizátort használtam, miután fagyasztás, szonikálás valamint vékony fecskendőn való átpréselés kombinációját háromszor ismételtem. Rendszerint a lárvák becsült térfogatával megegyező mennyiségű lízis pufferben homogenizáltam a mintát. A lízis puffer a következőket tartalmazta: embrióhoz és 1. stádiumú lárvához: 10 mM Tris/HCl pH = 7,5, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 2 mM benzamidin, 500-szor hígított

57

proteázgátló koktél (Sigma); 3. stádiumú lárvákhoz pedig: 50 mM K-foszfát, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 500-szor hígított proteázgátló koktél (Sigma), 1 mM DTT. Az első centrifugálás (30’, 18.000 g, 4°C) után általában nem tökéletes az ülepedés, ami feltehetőleg a lárvák nagy zsírtartalmának köszönhető. A centrifugálás után nagyjából három fázisra válik a homogenizátum: az oldhatatlan lárvabőr és egyéb alkotók a csapadékban, az oldható fehérjék a kissé zavaros felülúszóban találhatók, de - különösen 3. stádiumú lárvák esetében - a felülúszó tetején vastag zsír/lipid réteg halmozódik fel. A felülúszót a tetején úszó zsírréteg alól fecskendővel lehetet a leghatékonyabban kiszívni, aminek ismételt centrifugálásával, majd a felülúszó sterilszűrőn való átpréselésével tiszta extraktumot kaptam. A celluláris fehérjék hőstabil frakcióját – a továbbiakban forralt extraktum – minden esetben a nyers extraktum 5 perces forró vízfürdőn történő hőkezelésével nyertem, a denaturálódott fehérjéket 18 000 g-vel centrifugálással távolítottam el.

4.3.4. Mitokondriumizolálás Drosophila embriókból 12h-ás embriókat gyűjtöttem, mostam, majd homogenizáltam 50 mM PIPES pH = 7,9 pufferben Potter-Elvehjem homogenizátorban. A puffer a következőket tartalmazta még: 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF. A homogenizátumot ultracentrifugán, 4°C-on különböző lépésekben centrifugáltam [236]. Először 10’ 700 g-vel való centrifugálás során a nukleáris frakció ülepedett, mely az esetleg oldhatatlan sejtalkotókat is tartalmazza egyben. A felülúszó további 10’-es 24 000g-vel történő centrifugálása utáni második csapadék a mitokondriumokban dús frakció, míg az utolsó 1hás 54 000 g-s centrifugálás utáni csapadék a membrán frakció (plazma membrán és endoplazmás retikulum) a felülúszó pedig a celluláris fehérjéket tartalmazza. A frakciókból egyenlő mennyiségű összfehérjét tartalmazó mintákat választottam el SDS-PAGE-n, majd Western bloton a dUTPáz-tartalomra nézve analizáltam.

4.4. Gél-elektroforézis A gél-elektroforézis töltött makromolekulák elválasztására ad lehetőséget. Az elválasztás alapja, hogy a gélállapotú közegben a feszültséggradiens hatására elmozduló töltött makromolekula mozgása gátolt, mégpedig a méretétől és alakjától függő mértékben. 58

4.4.1. DNS minták natív agaróz gél-elektroforézise Mivel a DNS a molekula méretének függvényében egységesen negatívan töltött, és alakja is rendszerint egységes (amennyiben 2-szálú DNS mintánk van), a gélelektroforézisben minden adalékanyag nélkül megvalósítható a méret szerinti elválás. A relatíve nagy molekulaméretek miatt poliakrilamid helyett a nagyobb pólusméretet biztosító agarózt használják a plazmid vagy gén méretű DNS-ek elválasztására (100-10.000nt). Az agaróz koncentrációjával bizonyos határok közt változtatható a pólusméret is. 1,5 %-os agaróz megfelelő a legtöbb génméretű DNS (pl. PCR-termékek) számára, a 0,8 %-os pedig a legtöbb plazmid DNS számára. Az agarózt TAE (40 mM Tris/acetát, 1 mM EDTA, pH = 8,5) pufferben felmelegítve oldom, majd 50°C körülire hűtve 2-3 csepp 0,008 %-os etídiumbromidot adok hozzá, és a gélöntő apparátusban hagyom megdermedni. A gélre a DNS mintákat mintakoktélban („6X Loading dye”, Fermentas) visszem fel. Az elektroforézist TAE pufferben végzem, 100 mV feszültséggel. A gélben lévő DNS-t GelDoc denzitométerben (Bio-Rad), UV megvilágítással detektálom, ahol a DNS-etídium-bromid komplex fluoreszcens jelet ad.

4.4.2. Fehérje minták gél-elektroforézise (SDS-PAGE) A fehérjék gél-elektroforézise során ahhoz, hogy lehetőség szerint tisztán molekulatömeg szerinti elválasztást érjünk el, szükséges a fehérjék alakját egységesíteni, ami praktikusan denaturációt jelent, valamint egységes töltéssel ellátni. Mindkét célt megvalósítja az SDS detergens, ami a fehérjét egyrészt denaturálja, másrést a kitekert polipeptid lánchoz kötődve egységesen negatív töltésekkel látja el [237]. Az általam öntött SDS-PAGE elválasztó részének összetétele: 12 % poliakrilamid, 0,1 % SDS, 375 mM Tris/HCl pH = 8,8; a tömörítő gél összetétele pedig: 3,9 % poliakrilamid, 0,1 % SDS, 125 mM Tris/HCl, pH = 6,8. A gélek polimerizálódását ammónium-perszulfáttal (Bio-Rad) és Temed (Bio-Rad, NNN’N’-tetra-metil-etilén-diamin) reagenssel indítottam. A géleket vertikális Protean III berendezésben (Bio-Rad) 200V feszültséggel futtatom. Az elektroforézis előtt a mintákat mintakoktélban 5 percig forró vízfürdőn inkubálom. A mintakoktél összetétele: 62,5 mM Tris/HCl, pH = 6,8, 25 % glicerin, 2 % SDS, 0,01 % brómfenolkék, 350 mM DTT. A futtatóelegy összetétele 3,03 g/l Tris bázis, 14,4 g/l glicin, 1,0 g/l SDS, pH = 8,3. A megfuttatott géleket először desztillált vízben alaposan kimosom

59

(3X5 percig), majd kolloidális Coomassie Brillant Blue (Biosafe Coomassie, Bio-Rad) festékkel fél órán keresztül festem. A felesleges festék eltávolítása után a gélen megjelenő fehérjesávokat GelDoc denzitométerrel (Bio-Rad) detektálom, ami lehetőséget ad a foltintenzitások kvantitatív értékelésére is.

4.5. RNS kimutatás 4.5.1. RNS-izolálás A különböző fejlődési stádiumok ill. S2 sejtek RNS készletét TRIZOL reagenssel (Invitrogen) a gyártó által javasolt protokoll szerint izoláltam. A sejt- ill. szövetmintát 1ml Trizol reagenssel alaposan összeráztam, Potter-Elvehjem homogenizátorban összetörtem, 5 percig szobahőmérsékleten állni hagytam, majd 200 μl kloroformmal összeráztam. Ezt 15 percig 4°C-on 12000 g-vel centrifugáltam. (Eddig a DNS-izolálás protokoll is ugyanez, ld. 4.11. fej) A centrifugálás után háromfázisú oldatot kapunk, melyben a felső vizes fázis tartalmazza az RNS frakciót. Ezt elkülönítve 0,5 ml izopropanollal 10 percig szobahőmérsékleten inkubálva az RNS kicsapható. A csapadékot 4°C-on 10 percig 12000 gvel centrifugálva ülepítettem, majd hideg 75 %-os etanollal mostam. A beszárított csapadékot jégen 30-60 percig inkubálva RNáz-mentes vízben oldottam. Az RNS koncentrációt UV spektrum alapján határoztam meg A10μg/ml260nm,10mm = 0,25 koefficienssel számolva.

4.5.2. Félkvantitativ RT-PCR Izolált totál RNS készletből reverz transzkripcióval oligo-dT primer segítségével cDNS-sé írtam az izolátumban lévő érett – azaz poliA véggel rendelkező – mRNS-eket. Ezt követően a teljes cDNS készletből PCR-ben felszaporítottam a vizsgálandó mRNS specifikus primerek által meghatározott szakaszát. A PCR-termékeket 1,5 % agaróz gélen választottam el. A denzitometriás értékelést a GelDoc denzitométerrel végeztem, a szoftver „profilanalízis” funkciójával, ami a foltintenzitást a kijelölt területen a gélben lévő pozíció függvényében ábrázolja. A görbe alatti terület integrálásával olyan viszonyszámot kaphatunk a különböző mintákra, mely a folt területét és intenzitását egyaránt jól figyelembe veszi, így a PCR-termékek mennyisége viszonylag jól összevethető. A félkvantitatív jelleg abból adódik, 60

hogy nem tudunk ugyan pontos kópiaszámot mondani ezzel a módszerrel, azonban különböző fejlődési állapotokat ill. szövettípusokat össze tudunk vetni oly módon, hogy azonos teljes RNS mennyiségből indulunk, ill. belső kontrollként ún. háztartási fehérjék (pl. GAPDH) mRNS-eire is elvégezzük a kísérletet. Az M-MLV RT RNaseH(-) (Promega) reverz transzkriptázt a gyártó által javasol protokoll szerint használtam. A 18,5 μg/ml totál RNS-t, 12,5-ször híg oligo-dT primert, 50szer híg random hexamert, 40 μM dNTP-t, 50000-szer híg BSA-t, 25-ször híg reverz transzkriptázt, és 5-ször híg puffert tartalmazó reakcióelegyet 1,5 órát inkubáltam 37°C-on, majd 75°C-on 10 percig inaktiváltam. Az így nyert teljes cDNS mennyiségből a következő specifikus primereket alkalmazva 28-31 körös PCR-t végeztem. A dUTPáz cDNS-re az 5’ primer: 5’-CGACGCTGTGTTAAACCGCG-3’, a 3’ primer: 5’-CGTTTACGTAGC AACAGGAGCC-3’, a GAPDH cDNS-re: az 5’ primer: 5’-GTCCCTCTGGCAAACTG TGG-3’ , és a 3’ primer: 5’-CTGAAGAAGTCGGTGGAGCC-3’, az UDE (CG18410) cDNS-re az 5’ primer: 5’-GTCCTGACAATGACCAAGGCGG-3’, a 3’ primer pedig: 5’CCTCGCCATCGGAATCCTGGC-3’ volt. Az UDE esetén az 5’ primert exon-exon határra terveztem, ezzel biztosítva, hogy valóban csupán az érett („splicing”-on átesett) mRNS-t detektáljam. Ezekkel a primerekkel az UDE cDNS szekvenciának egy 782 nt

hosszú

szakasza szaporítható fel. A 25 μl PCR elegy 0,8 μl specifikus primereket, 0,8 μl dNTP-t, 2,5 μl RedTaq puffert, 1 μl RedTaq polimerázt és 2 μl totál cDNS mintát tartalmazott. A program 2 perc 94°C előinkubálás után a következő ismétlődő lépésekből állt: 15 sec 94°C, 30 sec 59°C, 40 sec 72°C.

4.5.3. In Situ RNS hibridizálás Az mRNS és a vele komplementer DNS-próba hibridizációján alapuló módszerrel sejtill. szövetmintákon tudjuk adott mRNS lokalizációját specifikusan megjeleníteni. A kísérletet a „Dig DNA Labeling and Detection Kit Non-radioactive” szettel végeztük, a javasolt protokoll szerint (Roche) (ld. továbbá [238]). A kísérletet Szegeden Jankovics Ferenc segédletével végeztem. A dUTPáz cDNS-ét PCR-rel állítottuk elő a LDdut-pEt22b expressziós plazmidról dUTPáz génre specifikus primerekkel (5’-ATGCCATCAACCGATTTCGC-3’ és 5’TTACGTAGCAACAGGAGCCGGAG-3’). Ezt templátként használva egy polimeráz reakcióval új szálat szintetizálva digoxigenin jelölt cDNS-t állítottunk elő a következő módon: TE pufferben (10 mM TRIS, pH = 8-at és 1 mM EDTA) oldott 20 μg cDNS-t 10 61

percig forralva denaturáltuk, majd gyorsan sós jégen lehűtve (a szálak újra hibridizálását meggátolva). A denaturált DNS-hez adtunk 2 μl hexanukleotid mixet (random primer), 2 μl dNTP mixet, amiben megfelelő arányban volt DIG-dCTP is, 1 μl Klenow enzimet, és éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. A reakciót 2 μl 0,2 M EDTA pH = 8,0 hozzáadásával állítottuk le. A DNS-t 2,5 μl 4 M LiCl és 75 μl –70°C-os etanol hozzáadásával csaptuk ki: – 80°C-on 30 percig inkubáltuk, majd 15 percig 12000 g-vel centrifugáltuk. A csapadékot 50 μl hideg etanolban mostuk, majd szárítottuk, végül 50 μl TE pufferben oldottuk vissza. A jelölés hatékonyságát cseppbloton ellenőrizzük. A próbából és a szettben levő kontrollból készített hígítási sort (1-1000X) UV fénnyel nitrocellulóz membránon immobilizáltuk. Ezután a következő lépésekben mostuk a membránt: 2-szer 5’ „puffer 1” (100 mM Tris/HCl, pH = 7,5 és 150 mM NaCl), 30’ „puffer 2” („puffer 1”-ben 0,5 % blokkoló reagens (Roche)). Majd 1 órán át PBT pufferbe (0,1 % Tween 20 PBS-ben) 2000szer hígított anti-digoxigenin antitesttel (Roche) szobahőmérsékleten inkubáltuk a membránt. Ezután a következő mosásokat alkalmaztuk: 3X10’ PBT-ben, 2X5’ „puffer 3”-ban (100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 100 mM TRIS, pH = 9,5 és 0,1 % Tween 20). Az előhíváshoz használt elegy összetétele: „puffer 3”-ban 0,1 mg/ml X-foszfát és 0,5 mg/ml NBT. Az antitesthez konjugált alkalikus foszfatáz hatására a reagensek lilás színreakciót adnak, aminek megjelenését pár percen belül láthatjuk. Ezután újra mossuk a membránt 2-szer 5 percig PBT-ben. A legyekből az ováriumok preparálását PBS-ben végezték. A szövetminta fixálása 20’ szobahőmérsékleten 1ml 4 % paraformaldehid PBT-ben történt, amihez még 100 μl 2 % Clorox hypot és100 μl DMSO-t adtunk. Majd 2-szer 5 percig PBT-ben mostuk. Ezután 50 μg/ml proteináz K-val emésztettük a minta fehérjetartalmát 400 μl PBT-ben 5 percig szobahőmérsékleten inkubálva, amit a következő mosások követtek: 10’ 2 mg/ml glicin 1 ml PBT-ben, 5’ PBT. Majd a mintákat újra fixáltuk 4 % paraformaldehiddel PBT-ben, 20 percig szobahőmérsékleten inkubálva, amit 2-szer 5 perces PBT-s mosás, majd 10 perces, metanol/DMSO 9:1 elegyben, -20°C-on történő inkubálás, aztán újra 2-szer 5 perces PBT-s mosás követett, végül a mintákat 1 ml PBT/HB 1:1 elegybe mostuk. A hibridizáció előtt szükséges minimum 1 órán át 200 μl HB/tRNS/heparin elegyben 55°C-on prehibridizációt végezni, hogy a lehetséges aspecifikus kölcsönhatásokat megakadályozzuk. A tRNS a nukleinsavhelyeket blokkolja, míg a heparin a mintában maradt DNS-kötő fehérjéket. HB puffer összetétele: 5 ml formamid, 2,5 ml 20X SSC (3M NaCl, 0,3M Na-citrát) 10 μl Tween 20, pH = 6,5 (citromsavval állítva), majd desztillált vízzel 10

62

ml-re kiegészítve. Az 50 μl tRNS-t (20 mg/ml) és 5μl heparint (100mg/ml) frissen adtuk hozzá. A hibridizációt 100 μl „HB/tRNS/heparin” +1 μl DIG-DNS próba elegyét éjszakán át 55°C-on inkubálva végeztük. A próbát előzőleg vízfürdőn felmelegítettük, és sós jégen hirtelen lehűtöttük. Az inkubálás után a következő mosásokat alkalmaztuk: 15’ HB 55°C, 15’ HB:PBT 55°C (1:1), 2-szer10’ PBT szobahőmérsékleten. A mintán hibridizált DNS-t 2000-szer hígított alkalikus foszfatázzal konjugált antidigoxigenin antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 2-szer 10 percig PBTben mostuk. Az előhívást a cseppblotnál ismertetett módon végeztük. A megjelenő lilás színreakció után a mintákat mikroszkóplemezeken 10 X PBS : glicerin

9:1 elegyben

beágyaztuk, a fedőlemezt körömlakkal szigeteltük. A mintákat Leica DMLS fluoreszcens mikroszkóppal analizáltuk.

4.6. Felszíni Plazmon Rezonancia (SPR) A módszerrel makromolekulák közti kölcsönhatást tudunk detektálni, oly módon, hogy az egyik partnert immobilizáljuk egy cianogén-bromid (CNBr) által aktivált felszínen (szenzor chip CM5, Biacore), a Biacore X műszer (Biacore AP, Uppsala, Svédország) pedig folyadékot áramoltat a felszínen, amelynek folyamatosan detektálja a törésmutatóját. Ha az áramoltatott folyadék makromolekulát tartalmaz, a törésmutató ugrásszerűen megváltozik. Amennyiben ezek a makromolekulák kötődnek is a felszínen, a törésmutató folyamatosan növekszik, míg a fehérjeoldat áramlik a felszín felett, mivel a kötődés miatt a felszínen a makromolekulák koncentrációja egyre növekszik. Majd mikor a pufferrel mossuk tovább a felszínt, ezek lassan disszociálnak, amitől a jelintenzitás folyamatosan csökken. Tehát egy kísérletben követhetjük a komplex komponenseinek asszociációját és disszociációját, sőt a görbékből – tiszta fehérjék esetén - Kd-t is számolhatunk. A felszínen a rekombináns Drosophila dUTPáz mindkét formáját (LD, SD) immobilizálták külön-külön. Az immobilizálást a gyártó által javasolt protokoll alapján végezték. Az immobilizált dUTPáz felett 5 μl/min ill. 20 μl/min sebességgel áramoltattunk különböző extraktumokat 10 mM HEPES pH = 7,4 pufferben, ami tartalmazott még 150 mM NaCl-ot, 3 mM EDTA-t és 0,005 % P20 detergenst. 30-35 μl SD dUTPázt (0,15mg/ml), BSA-t (0,15 mg/ml), ill. első stádiumú lárva extraktumokat (0,05-0,28 mg/ml) injektáltunk.

63

4.7. Fehérjék immunodetektálása 4.7.1. Antiszérumok Az antiszérumokat Erdei Anna csoportjában állították elő: a rekombináns fehérjékkel (LD dUTPáz ill. UDE) nyulakat immunizáltak. Az antiszérumok specificitását Western bloton teszteltük: mindkét dUTPáz esetén a 100.000-szeres hígítás, ill. UDE esetén 150.000szeres hígítás megfelelő specificitású és érzékenységű jelet ad (14. ábra).

Az anti-dUTPáz antitestet részlegesen tisztítottam is az antiszérumból a következő protokoll

szerint

[239,

240].

40

%

telítettségű

ammónium-szulfáttal

kicsapott

szérumfehérjéket, 4°C-on, 30 percig, 18 000 g-vel centrifugáltam, a csapadékot annyi "A" pufferben (5 mM Na-foszfát pH = 8) oldottam vissza, ami kb. tízszeres töményedést is eredményezett. Ezt az oldatot "A" pufferbe dializáltam, majd mono-Q anioncserélő oszlopon választottam el, az elúció során "B" puffer (300 mM Na-foszfát, pH = 5) gradienst használva. Az IgG az átesőben jött le, míg a többi Ig a további eluálás során. A frakciókat csúcsok szerint manuálisan gyűjtöttem, amiket aztán egyenként Drosophila dUTPázt, ill. kontrollként E. coli dUTPázt tartalmazó cseppbloton a szokásos Western technikával teszteltem, és a 64

reaktív antitest nagy része valóban az átesőben volt található. Megjegyzendő, hogy ez a tisztítás valóban csak részleges. Próbáltam továbbá az anti-dUTPáz szérumot affinitás alapon tisztítani dUTPáz-konjugált gyantán. Ez azonban nemcsak az antigén-antitest kölcsönhatás extrém erőssége miatt ütközött nehézségekbe, de a megfelelően drasztikus elúció (lúgos verzió: 50 mM trietanolamin pH = 11,5, 0,1 % Triton X-100, 0,15 M NaCl ill. savas verzió: 50 mM glicin-HCl pH = 2,5, 0,1 % triton X-00, 0,15 M NaCl [241] során a dUTPáz trimerekből is eloldódtak monomer egységek, így a tisztított specifikus antitestet minden esetben az antigén is szennyezte. Így például a far Western technikánál nem lehetséges megfelelő Western blot kontrollt készíteni.

4.7.2. Western blot A módszer lehetővé teszi SDS-PAGE-n elválasztott és nitrocellulóz vagy PVDF membránra blotolt fehérjék specifikus festését. A specifikus festés alapja az antigén-antitest kölcsönhatás specificitása. A membránt először a specifikus antitesttel inkubáljuk, majd az antitestre specifikus, valamilyen enzimmel konjugált, anti-nyúl Ig antitesttel (másodlagos antitest, Sigma). A konjugált enzim, amely megfelelő reagensekkel színreakciót, vagy kemilumineszcens jelet ad, teszi lehetővé a vizsgált fehérje specifikus megjelenítését. A Western blot szokásos protokollja [242] a következők szerint alakul, amelyben a blokkolásnak, az alkalmazott detergensnek és a mosásoknak nagy jelentősége van a háttérzaj csökkentésében. A Drosophila szöveteket 500-szor híg proteázgátló koktélt, 1 mM DTT-t, 1 mM EDTA-t, 0,1 % Tween 20-t is tartalmazó PBS-ben, Potter-Elvehjem homogenizátorban homogenizáltam, aztán 5 percig forró vízfürdőn inkubáltam, szonikáltam, majd SDS-es mintakoktélban újra 5 percig forró vízfürdőn inkubáltam, végül 13 000 g-vel 10 percig centrifugáltam. Az SDS-PAGE-n elválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra blotoltam az erre a célra kifejlesztett Mini Protean (BioRad) apparátusban, 3-4 órán keresztül, 350 mA áramerősséggel, 10 mM CAPS, 10 % metanol, pH = 12 pufferben, jegelve és folyamatos kevertetés mellett. A membránra vitt fehérjéket nem specifikus Ponceau-S (Sigma) fehérjefestékkel reverzibilisen festettem (0,5 % Ponceau 1 % ecetsavban, egy-két perc rázatás), amit fotózás után TBS pufferben (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH = 7,5) 5-10 perc alatt el lehet távolítani. A membránt a következő oldatokban rázattam szobahőmérsékleten: 1 h Tween-es blokkoló (5 % sovány tejpor, 0,1 % Tween 20, TBS-ben), 3-szor TBS puffer, 2 h antiszérumot tartalmazó Tween-es blokkoló, 3-szor TBS puffer, kétszer 20’ TBST (0,1 %Tween 20 TBS-ben), 3-szor TBS puffer, 1 h a másodlagos antitestet tartalmazó 65

blokkolóban (HRP-konjugált anti nyúl Ig (Pharmacia) 2500-szeres hígítás, AF-konjugált anti nyúl Ig (Sigma) 80 000-szeres hígítás, AF-konjugált anti egér Ig (Sigma) 30 000-szeres hígítás), 3-szor TBS puffer, kétszer 20’ TBST, 3-szor TBS puffer. Az előhívás módja attól függ, hogy a másodlagos ellenanyag milyen enzimet konjugál. A torma peroxidáz (HRP) enzim az ECL (Enhanced Chemiluminescence) reagenseken (Amersham Biosciences) kemilumineszcenciával járó reakciót katalizál. A jelet röntgenfilmen fotóztam, amit a szokásos hívó és fixáló oldatokkal hívtam elő. Alternatív detektálási lehetőséget jelent, hogy a HRP enzim H2O2 és diamino-benzidin (DAB, Sigma) reagenseken sötétszürkés színreakciót katalizál. A reakcióhoz 1ml 0,5 mg/ml DAB oldathoz (0,2 % Triton X-100-at tartalmazó PBS-ben) adunk 10 μl H2O2-ot (100 ml deszt. vízben oldott tabletta). Az alkalikus foszfatáz (AF) 6-bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát (BCIP, Sigma) és Nitro Blue Tetrazolium (NBT, Sigma) reagenseken lilásszürke színreakciót ad. A reakcióhoz a reagenseket mindig frissen mérem be: 0,5 mg/ml NBT-t (50 mg/ml-es törzs 70 %-os DMF-ban oldva) és 0,1 mg/ml BCIP-et (20 mg/ml-es törzs vízben oldva) előhívó pufferbe (100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5m M MgCl2, pH = 9,5). A dUTPáz szintjének követéséhez - amellett, hogy összes fehérjére nézve egyenlő mennyiséget vittem gélre – tubulinra is végeztem Western blotot, mint belső kontrollra. Az alkalmazott elsődleges antitestet (Sigma) 80.000-szeres, a másodlagos alkalikus foszfatázzal konjugált anti-egér Ig-t (Sigma) pedig 30.000-szeres hígításban használtam.

4.7.3. Far Western blot A módszer fehérje-fehérje kölcsönhatások detektálására alkalmas. Megjegyzendő azonban, hogy a fiziológiásan releváns kölcsönhatásoknak csak egy részét lehet ilyen módon detektálni, ami függ az adott kölcsönhatás természetétől és/vagy erősségétől, ill. attól, hogy a membránra blotolt fehérje mennyire képes renaturálódni [243]. Embrióból és első stádiumú lárvákból készített mintákat SDS-PAGE-n elválasztottam, PVDF membránra blotoltam. A blot fejlesztésénél a szokásos Western protokollt alkalmaztam azzal a változtatással, hogy a tejport 3 % BSA-val helyettesítettem. Továbbá a blokkolás lépés után a membránt 2 % BSA-t tartalmazó TBST-ben 20 μg/ml dUTPázzal inkubáltam éjszakán át, 4°C-on, majd az antiszérumos inkubálás előtt alaposan mostam TBS pufferrel.

66

4.7.4. Immuno-hisztokémia A Western blotnál ismertetett elven nyugszik ez a módszer is, de ezúttal nem membránra blotolt fehérjéken, hanem sejtekben/szövetekben fixált fehérjéken építjük fel az antigén – antitest – másodlagos antitest komplexet. Ehhez általában a Western protokollban használtnál 10-szer töményebb antitesthígítás szükséges. A minták előkészítése nagyban függ a minta jelegétől: az S2 sejteket mikroszkópos fedőlemezen (11 mm-es, Menzel-Glasser) növesztették, és a festéssel járó inkubálásokat, mosásokat is ezen végezték. Az embriót szükséges festés előtt dekorionizálni [244], hogy permeábilis legyen a festékekre nézve. A boncolt szöveteken (ovárium és imaginális diszkusz) ezt nem kell elvégezni, a boncolás Drosophila Ringer pufferben történt. A mosások erőssége is részint a minta komplexitásától függ, alapvetően a [244] szerinti eljárást követték. A festéseknél egyaránt 10.000-szer híg szérumot alkalmaztak, amit blokkolóba (1,5 % BSA PBTT pufferben (PBS, 250 mM NaCl, 0,1 % Tween 20, 1 % Triton X-100, 0,001 % NaN3)) hígítottak, valamint másodlagos ellenanyagként 500-szor híg FITC konjugált anti rabbit Ig-t (Sigma). Továbbá a sejtmagok festéséhez 0,1 % 4’,6-diaminido-2-fenilindolt (DAPI, Sigma) használtak 10 %-os metanolos oldatából PBTA pufferben (PBS, 1 % BSA, 0,05 % Triton X-100, 0,02 % NaN3) kihígítva (9.6. protokoll [244]-ben). A Fluor Save beágyazóba (Calbiochem) ágyazott mintákat Leica DMLS fluorescens mikroszkóppal, ill. Olympos konfokális lézerpásztázó mikroszkóppal analizáltuk. Az immuno-hisztokémiás festéseket Zagyva Imre kivitelezte, a konfokális felvételeket pedig ketten készítettük és értelmeztük.

4.7.5. Immunoprecipitálás A módszer elve: makroszkópikus méretű részecskéken (pl.: Szefaróz gyanta) kovalens kötéssel vagy immunglobulinokat nagy affinitással kötő fehérjéken (protein A ill. protein G) keresztül immobilizálunk antitestet (szérumból különböző módon tisztított specifikus IgG-t). A gyantát ezután a fehérjeeleggyel inkubáljuk, melyből az antigént (és az esetleg hozzá kötődő molekulákat) izolálni akarjuk. Fontos, hogy a fehérje extraktum ne tartalmazzon DTT-t, mert a redukáló körülményben az Ig-kben lévő diszulfidhidak tönkremehetnek. Két alapvető módszert használtam [245], mindegyiknek más-más előnye ill. hátránya volt. CNBr aktivált szefaróz gyantán immobilizált ellenanyagot használva, nagyobb kapacitást tapasztaltam, ill. a protein A nem szennyezte a precipitátumot, viszont a megfelelő 67

specificitás érdekében mindenképp legalább részlegesen tisztított antitestet kellett használni. Továbbá a DTT-t tartalmazó mintakoktélos elúció során az immobilizált Ig láncok is eluálódtak, melyek a precipitátum gélképén zavaró mértékben is megjelenhettek. A protein A-t kovalensen kötő gyanta használta esetén nem volt szükség a szérum előtisztítására, mert a protein A nagy affinitással köti az IgG molekulákat, azonban a gyanta kapacitása jóval kisebb volt. A CNBr-aktivált szefarózra a 4.8.1. fejezetben ismertetett fehérjeimmobilizálási eljárással kötöttem kovalensen a legalább részben tisztított antitestet. Továbbá készítettem üresen blokkolt gyantát is kontrollként. Az üres gyantával előtisztított extraktumot antitestkonjugált gyantával inkubálva (2h, szobahőmérséklet) izoláltam az antigént. A centrifugálást (10’

3000

rpm)

követően

alaposan

mostam

a

gyantát

(20

gyantatérfogatnyi

lízishez/inkubáláshoz használt pufferrel). A mosott gyantáról SDS-es mintakoktéllal 5 percig forró vízfürdőn eluált fehérjéket SDS-PAGE-n analizáltam, ill. a kontrollokhoz képest relevánsnak tűnő fehérje sávokat a gélből tömegspektrometriás fehérje-meghatározás céljára preparáltam. A releváns csíkok kiválasztásához kétféle kontroll segít: egyrészt az extraktum előtisztításához használt „üres gyantát”, másrészt az előzőleg extraktummal nem érintkezett antitest-konjugált gyantát hasonlóképp mostam, eluáltam, és az immunoprecipitátum mellett SDS-PAGE-n elválasztottam. Így kiszűrhetők az aspecifikus kitapadásra hajlamos fehérjék, és az immobilizált részlegesen tisztított szérumból eluálódó komponensek. A másik módszerben is szükséges az extraktum előtisztítása: 50 μl felszuszpendált protein A agarózhoz teszünk 1 ml extraktumot (3-5 mg/ml összfehérje), a továbbiakban 30’ , 4°C rotátor, majd 5’ 16.000 g centrifugálás utáni felülúszót használtam a precipitáláshoz. Az antitest konjugált gyanta készítése: 1 ml PBS, 3 μl szérum (ill. negatív kontrollként preimmun szérum), 50 μl protein A-agaróz szuszpenzió elegy 1h, 4°C rotátorban, majd 2 sec 16.000 g centrifugálás, 2-szer 1ml (DTT nélküli!) lízis pufferes mosás, 2 sec 16.000 g centrifugálás. Az immunoprecipitálás lépésben az antitest konjugált gyantához ill. a preimmunszérumos kontrollgyantához az előtisztított extraktumot (ill. kontrollként üres lízis puffert) valamint 10 μl 10 %-os BSA-t, adunk. A három szuszpenziót (extraktum-antitestgyanta, extraktum-gyanta, puffer-antitest-gyanta) eztán 1,5 órán keresztül 4°C-on rotátorban forgatjuk, majd 5 sec, 16 000 g-vel centrifugáljuk. A gyantákat ezután alapos mosásnak vetjük alá: 4-szer 1 ml mosó pufferben (50 mM Tris/HCl, pH = 7,4, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,02 % NaN3, 0,1 % Triton X-100), végül 1 ml PBS-ben. Ezután 50 μl SDS-es mintakoktéllal eluáljuk a precipitált fehérjéket. A módszer elvileg alkalmas lehet az antigénhez erősebben kötődő fehérje partnerek kimutatására is. Ilyen ko-immunoprecipitáláshoz használt puffer: 50 mM Tris/HCl pH = 7, 5, 68

100 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PM SF, 20.000-szor híg proteázgátó koktél (Sigma).

4.7.6. Immunoaffinitás kromatográfia A módszer elve megegyezik az immunoprecipitáláséval, azzal a különbséggel, hogy itt a nagyobb mennyiségű antitest-konjugált gyantát oszlopba töltjük. Az oszlopot gyors fehérjefolyadékkromatográfiás (FPLC) készülékhez kötve lehetőség nyílik az elúció variálására, ill. folyamatos követésére, ezért ez a módszer alkalmasabb az antigén kölcsönható fehérjepartnereinek izolálására, mint az egyszerű precipitálás. Ezekben a kísérletekben CNBr-aktivált szefarózon immobilizáltam a részlegesen tisztított antitestet. Mind az immobilizálás, mind a kromatográfiás protokollt az affinitás kromatográfiáról szóló, következő fejezetben részletezem (ld. 18.B ábra).

4.8. Affinitás kromatográfia 4.8.1. dUTPáz-konjugált szefaróz gyanta készítése Fehérjéket a szabad aminocsoportjaikon keresztül kovalensen lehet CNBr-dal aktivált szefaróz gyantán (Sigma) rögzíteni. A rekombináns LD ill. SD dUTPáz fehérjét egyaránt immobilizáltam szilárd hordozón. 1 g CNBr-aktivált szefaróz gyantát 10 ml 1 mM HCl-val (pH = 3,0!) 10 percig jégben duzzasztottam, majd 200 ml 1 mM jegelt HCl-val, 50 ml desztillált vízzel, végül 50 ml jegelt kapcsoló pufferrel (5 mM TEA, 500 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, pH = 8,5) mostam Nuts-on. 10 ml, 2,5 mg/ml immobilizálandó fehérjét kapcsoló pufferben inkubáltam az előkészített gyantával éjszakán át 4°C-on rotátorban. A leszívott felülúszóban fehérjekoncentráció-méréssel meghatározható az immobilizálás hatásfoka is (általában min. 80 %, 15. ábra). A gyantát mostam 50 ml kapcsoló pufferrel, majd 10 ml 1 M etanolaminnal (pH = 9,0), majd a fennmaradó reaktív helyek blokkolása végett 2 órán át 10 ml 1 M etanolaminban inkubáltam 4°C-on rotátorban. Eztán a blokkolt gyantát 50 ml kapcsoló pufferrel, majd az affinitás kromatográfiához használt „A” pufferrel mostam. Az immobilizált fehérje 4°C-on 0,01 % NaN3-ot is tartalmazó pufferben két évig is tárolható, lefagyasztani azonban tilos. 69

4.8.2. U-DNS konjugált szefaróz gyanta készítése DNS immobilizálása CNBr-aktivált szefarózon hasonló elven nyugszik, mint a fent leírt fehérje immobilizálásé [246]. 3g CNBr-aktivált szefaróz gyantát 10 ml 1 mM HCl-val (pH = 3,0!) 1 percig jégben duzzasztottam, majd Nuts-on 500 ml 1 mM HCl-val, 100 ml desztillált vízzel, 100 ml 10 mM K-foszfát pH = 8 pufferrel mostam. 4 ml 10 mM K-foszfát pH = 8 pufferben felszuszpendált gyantához 50 μl desztillált vízben oldott 500 μg DNS-t adva éjszakán át szobahőmérsékleten, rotátorban inkubáltam. (A kísérletekben linearizált plazmid DNS-t használtam, előállítását ld. 4.12.1. fej.) A leszívott felülúszó spektrumából meghatározható az immobilizálás hatásfoka is (általában 90 % feletti, 16. ábra). Eztán a gyantát 2-szer 100 ml desztillált vízzel, majd 100 ml 1 M etanolaminnal (pH = 8) mostam, amit aztán 2 órán át rotátorban szobahőmérsékleten 1 M etanolaminban blokkoltam. Blokkolás után a gyantát 100 ml 10 mM K-foszfát pH = 8,0 pufferrel, 100 ml 1 M K-foszfát pH = 8,0 pufferrel, 100 ml 1 M KCl oldattal, 100 ml desztillált vízzel mostam. Amit oszloptároló pufferben (10 mM Tris/HCl pH = 7,8, 1 mM EDTA pH = 8,0, 0,3 M NaCl, 0,04 % NaN3), 4°C-on 1-2 évig is lehet tárolni. A már használt DNS-konjugált gyantát regeneráló pufferrel (10 mM Tris/HCl pH = 7,8, 1 mM EDTA pH = 8,0, 2,5 M NaCl, 1 % NP-40 detergens) lehet újra használhatóvá tenni.

70

4.8.3. dUTPáz-affinitás kromatográfia dUTPáz affinitás kromatográfiás kísérleteket FPLC készülékben végeztem, így egyenletes folyadékáramot biztosítottam, és az elúciót is folyamatosan követhettem. Alkalmazott pufferek: „A”: 50 mM Na-foszfát, pH = 7,5, 150 mM NaCl, „B”: 50 mM Nafoszfát, pH = 7,5, 1 M NaCl, „C”: 50 mM Na-foszfát, pH = 9,0, 1 M NaCl, amikhez frissen adtam még 1 mM benzamidint, 1 mM DTT-t és 0,1 mM PMSF-t.

Az elúciót az FPLC manuális üzemmódjában, szakaszosan végeztem: nem alkalmaztam gradiens elúciót. Ugyanis a többféle, de kis mennyiségben jelenlévő, potenciális dUTPáz-

71

kötő fehérjék egymás utáni elúciója kis intenzitású, összemosódó csúcsokat ad a kromatogramon, ami lehetetlenné teszi a különböző csúcsokhoz tartozó frakciók pontos elkülönítését, ill. analizálható mennyiségének kinyerését. Ezért az áteső csúcs lecsengése után egy lépésben eluáltam a „B” pufferrel, majd a lúgos „C” pufferrel. Így minden kísérletben három frakciót gyűjtöttem: A (áteső), B és C (17. ábra). A kísérletekben 1. stádiumú lárvából ill. S2 sejttenyészetből készített extraktumokkal dolgoztam. Az eredményesség szempontjából kritikus volt az extraktum mennyisége és koncentrációja (40 ml 3-4 mg/ml összfehérje koncentrációjú extraktum detektálható mennyiségű potenciális kötődő fehérjéket adott), továbbá a frakciók töményítése. A frakciók töményítésére a leghatékonyabbnak az illékony pufferbe történő dialízis utáni liofilizálás bizonyult, ill. ennek kétszeri ismétlése. A dialízis puffer összetétele 0,2 M ammónium-acetát pH = 7,0, 1 mM DTT volt. A liofilizálás miatti esetleges fehérjedenaturációval számoltunk, ami azonban a minták további analízise szempontjából közömbös. A másodszor liofilizált frakciókat mintakoktélban feloldottam, majd SDS-PAGE-n elválasztottam.

72

Mindenesetben többféle kontroll kísérletet is végeztem, melyek révén az affinitás kromatográfia eredményét az extraktumból üres blokkolt gyantán kötődő, ill. még az előzőleg nem használt dUTPáz-konjugált gyantáról eluálódó fehérjékkel tudtam összevetni. Ezzel lehetővé vált egy első szelekció a számos megjelenő sáv között, és csak a valóban relevánsnak tűnő csíkokat preparáltam tömegspektrometriás analízisre (18.A ábra). Érdekes, hogy a dUTPáz-konjugált gyantáról a kísérleti körülmények között tapasztalható volt szolid mértékű dUTPáz elúció, ami feltehetőleg a fehérje trimer mivoltára vezethető vissza. Ugyanis elképzelhető, ha csak az egyik monomer rögzül kovalensen, akkor a „C” pufferben, lúgos és sós körülményben esetleg fellazulhat a monomerek amúgy szokatlanul erős kapcsolata a trimer szerkezetben. A fent vázolt kísérleti elrendezést – különös tekintettel az eluált frakciók töményítésének módjára – saját módszertani eredménynek tekintem, mely hosszas kísérletezés után lehetővé tette a dUTPáz több feltételezett partnerének azonosítását.

4.8.4. U-DNS affinitás kromatográfia Extraktum előfrakcionálása heparin oszlopon A nyers extraktumot heparin oszlopon frakcionáltam. Előzetes kísérleteim alapján az összes mérhető nukleáz aktivitás az átesőben volt – habár a heparin ismert módon a DNSkötő fehérjéket képes kötni. A heparin oszlopon történő elválasztáshoz alkalmazott pufferek: „A puffer”: 50 mM K-foszfát, pH = 7,5, 0,15 M KCl, 1 mM benzamidin, 1 mM EDTA; „B puffer”: „A puffer”, de 1 M KCl-dal kiegészítve. U-DNS affinitás kromatográfia A heparinról áteső frakciót vittem U-DNS-t ill. normális (timines) DNS-t kovalensen kötő szefarózra. Az extraktumot elfelezve a Z*/0,1 M KCl (25 mM HEPES pH = 7,6, 20 % glicerin, 0,1 % triton X-100, 4 mM EDTA, 0,1 M KCl) pufferben párhuzamosan injektáltam mindkét oszlopra. A kromatográfiát manuálisan és párhuzamosan végeztem a két oszlopon. Az elúciót a következő lépések szerint szakaszosan valósítottam meg és a frakciókat is eszerint szedtem: 10 oszloptérfogat (Vo) PufferZ*/0,1 M KCl; 2Vo PufferZ*/0,4 M KCl; 2Vo PufferZ*/0,7 M KCl; 3Vo PufferZ*/1 M KCl. A frakciókat az előző fejezetben leírt módon (dialízis/liofilizálás) töményítettem, majd SDS-PAGE-n elválasztottam, az U-DNS-re specifikus sávokat tömegspektrometriás analízisre preparáltam (18.C ábra).

73

4.9. Fehérjék tömegspektrometriás azonosítása A fehérjék gélből történő tömegspektrometriás azonosítása fokozott tisztaságot és körültekintő előkészítést igényel. Nemcsak a megfelelő kontrollok szükségesek a releváns csíkok kiválasztásához, de a gélöntéstől kezdve a futtatáson át, a gél festéséig és kezeléséig mindent steril felületeken, polietilén kesztyűben kell végezni. A mintákat ugyanis könnyen elszennyezheti például a kézről, hajról, pulóverről bekerült keratin. A nagy pontossággal kivágott gélcsíkokat 50 μl deszt. vízben 4°C-on tárolhatjuk a további analízisig. A tömegspektrometriás méréseket kollaborációban Szegeden, Medzihradszky F. Katalin laboratóriumában, Hunyadi-Gulyás Éva (dUTPáz és kölcsönható partnerei, UDE azonosítása) ill. Klement Éva (UDE limitált emésztésének fragmensei) végezte. A módszer lényege, hogy a fehérjékre, mint egy ujjlenyomat, jellemző a triptikus peptidjei tömegeiből adódó mintázat, ezért ez fehérjék azonosításának alapját képezheti. A triptikus emésztmény mért tömegspektrumával keresnek az ismert fehérjék ill. prediktált géntermékek

számított

triptikus

tömegeit

tartalmazó

adatbázisokban.

A

módszer

használhatóságát alapvetően a „poszt-genomi aera” teszi lehetővé, ahol többek közt a Drosophila genomja is nemcsak teljes mértékben ismert, de jól annotált is. A gélben lévő fehérjéket tripszinnel (Promega) emésztették redukálás és alkilálás után. A triptikus emésztményt MALDI-TOF tömegspektrométerrel (Bruker, Németország) frakcionálás nélkül ill. reverzfázisú HPLC-n frakcionálva egyaránt analizálták. Mátrixként 2,5-dihidroxi-benzoesavat használtak. Az összes spektrumot pozitív reflekton módban rögzítették, késleltetett extrakcióval, külső kalibrációt használva. A fehérjeadatbázis keresést az NCBI honlapon elérhető ProteinProspector szoftverrel végezték (prospector.ucsf.edu/ ucsfhtml4.0/msfit.htm). A kiválasztott tömegcsúcsokhoz tartozó triptikus peptidek ún. „post source decay” (PSD) spektrumait is felvették, mely során a kiválasztott peptid további spontán ionizálódását mérik, ezáltal szekvenciára vonatkozó információt nyernek. Az eredmények közt közölt találatokat PSD spektrummal is minden esetben egyértelműen megerősítették.

4.10. A dUTPáz enzimaktivitás mérésére használt folyamatos módszer A dUTPáz által katalizált dUTP-hidrolízis során H+ szabadul fel, aminek koncentrációváltozását gyengén pufferolt közegben, fenolvörös indikátor mellett, 559 nm-en

74

spektrofotometriával folyamatosan követjük. Az aktivitás puffer: 1 mM TES-HCl pH = 7,5 150 mM KCl, 40 μM fenolvörös, 5 mM MgCl2. Rendszerint 40 μM dUTP-t ill. 25-100 nM enzimet alkalmaztam. A méréshez JASCO-V550 spektrofotométert használtam, ahol a 10 mm úthosszú műanyag küvettákat 25°C-ra termosztáltam. A mérést üres küvettára nullázva, levegővel szemben végeztem, 0,2 másodpercenként rögzített abszorbancia adatokkal. A reakciót az enzim bekeverésével indítottam. Az extraktum frakciók esetleges effektor hatását vizsgálva az 1ml elegybe először a frakcióból mértem 10 ill. 20 μl-t, majd az új alapvonal beállása után dUTPázzal indítottam a reakciót. A frakciók esetleges saját dUTPáz aktivitását is minden esetben ellenőriztem. Érdekes tapasztalat volt, hogy hőkezelés után az SD dUTPáz aktivitásának csaknem 100 %-a marad, míg a LD dUTPáz aktivitása mintegy 11 %-ra csökken, habár ugyanez a csökkenés extraktumban jelentősen kisebb. A görbék első 10 másodpercnyi szakaszára illesztett egyenesek meredekségéből kezdeti sebességeket számítottam. Az effektor hatás kiméréséhez az S2 sejtek nyers ill. hőkezelt extraktumát frakcionáltam gélből történő ureás extrakció és dialízis útján. Ureás extraháló oldat összetétele: 8 M urea, 10 mM TES, pH = 7,5, 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, 2 mM benzamidin, 2 mM leupeptin. A dialízis oldat összetétele megegyezik a fentivel, urea és leupeptin nélkül.

4.11. A genomi DNS uraciltartalmának kimutatása A genomi DNS izolálását a különböző fejlődési stádiumokból Trizol reagenssel (Invitrogen) végeztem a forgalmazó által mellékelt protokoll szerint (az első lépések megegyeznek az RNS-izolálásnál alkalmazottakkal, ld. 4.5.1. fej.). A centrifugálás után kapott háromfázisú oldat, RNS frakciót tartalmazó, felső vizes fázisát alaposan eltávolítottam, majd az interfázisból és fenolos fázisból 300 μl 100 % etanol hozzáadásával, 2-3 percig szobahőmérsékleten rázva precipitáltam a DNS-t, amit ezután 2000 g-vel 5 percig centrifugálva ülepítettem. A csapadékot a következő képpen mostam szobahőmérsékleten rázogatva: 2 X 30’ 0,1 M Na-citrát, 10 % etanol elegy, majd 20’ 75 %-os etanol, a csapadékot végül levegőn szárítottam, majd 300-600 μl 8 mM NaOH-ban visszaoldottam. Az oldhatatlan szennyezők eltávolítása érdekében az oldatokat 10 percig 12000 g-vel 4°C-on centrifugáltam. A pH-t HEPES-sel állítottam vissza, továbbá 1 mM EDTA-t is adtam az

75

oldatokhoz. A DNS koncentrációját UV spektrum alapján határoztam meg: 50μg/ml dsDNSre az A1cm,260nm = 1. Az izolált genomi DNS-t UNG (Sigma) és/vagy APE (Sigma) enzimekkel kezeltem (1h 37°C 2 egység UDG 15μg DNS-hez RedTaq pufferben, majd + 400 egység APE, +APE puffer, + víz, 1h 37°C). A 15 μg/ml töménységű kezelt minták 2 μl-én, 28 körös PCR-ben Pfu Turbo polimerázzal egy 500 nt hosszúságú szakaszt (praktikusan a dUTPáz gént) szaporítottam fel. Mivel a polimeráz gátlódik a templát szálon lévő bázismentes helyeken ill. száltöréseknél, az a DNS, mely szignifikáns mennyiségű uracilt tartalmazott, UDG ill. UDG+APE kezelés hatására kevesebb PCR-terméket ad, mint a kezelés nélküli vagy a csak APE-vel kezelt minták, ill. az uracilt nem tartalmazó DNS. A PCR program: 2’ 95°C, a ciklus: 30’’ 95°C, 1’ 59°C, 1’ 68°C; az alkalmazott primerek ugyanazok, mint a félkvantitatív RT- PCR esetén. Jóllehet a módszer egyelőre ad lehetőséget a DNS uraciltartalmának kvantitatív meghatározására, kvalitatíve azonban eredményesen detektáltam vele a 3. stádiumú lárva DNS-ben megnövekedett uracilmennyiséget (ld. eredmények). A kísérleti elrendezést saját módszertani eredménynek tekintem.

4.12. UDE aktivitásának, szerkezetének jellemzésére alkalmazott módszerek 4.12.1. U-DNS előállítása U-DNS előállítása céljából pSUPERIOR-puro (Invitrogen) plazmidot (bár számunkra a szekvencia egyelőre nem volt lényeges, a kísérletekben mégis következetesen mindig ezt a plazmidot alkalmaztuk) szaporítottam mind XL1-Blue (vadtípusú), mind CJ236 (dut-/ungkettősmutáns) E. coli törzsekben (New England Biolab). A mutáns E. coli törzsben a timineket átlagosan 1-3 %-ban helyettesíti uracil [29], ami azt jelenti, hogy a kb. 4000 nt hosszúságú plazmidon átlagosan mintegy 20 uracil lehet. A baktérium törzseket hősokkot alkalmazva transzformáltam a plazmiddal (1 μl plazmid + 150 μl kompetens sejt, 30’ jégen, 90’’ 42°C-on, 150 ml LB tápoldatban 1h 37°C rázató). A transzformált kultúrából 100 μl-t szélesztettem steril LB táptalajos, kloramfenikolt (CJ236) vagy tetraciklint (XL1 Blue) és ampicillint tartalmazó lemezekre, amit 37°C-on inkubáltam éjszakán át. A kinövő egyedi kolóniákból steril LB tápoldatba oltottam, majd éjszakán át 37°C-on növesztettem, végül a 76

plazmidokat Quiagene Plasmid Midi szettel izoláltam. UDG és/vagy APE-vel kezelve kimutattam az így termelt plazmid DNS uraciltartalmát, ill. a kontroll esetén kizártam azt (19.A ábra). A cirkuláris plazmid agaróz gélen különböző szupercsavart szerkezetei miatt több csíkban fut, ami a gélek denzitometriás kiértékelését megnehezíti. Ezért a tisztított cirkuláris plazmidokat NotI (New England Biolab) restrikciós enzimmel linearizáltam (37 μl 0,7 mg/ml plazmid + 3 μl NotI + 4,5 μl NE Buffer3 + 0,5 μl BSA; reakció: 1,5h 37°C, inaktiválás: 10’65°C), a hatékonyságot agaróz gélen ellenőriztem (19.B ábra). Azért választottam a NotI enzimet, mert a felismerő helyében nincs timin, ezért az enzimet biztosan nem zavarja a plazmid uracil tartalma, továbbá a plazmidon, csupán egyetlen NotI hely van. A linearizált plazmidot újra tisztítottam 50 % izopropanolban kicsapva, 70 % etanollal mosva, vízben visszaoldva. Mind az immobilizáláshoz, mind az UDE aktivitásméréshez ezt a linearizált, uracilos ill. kontrollként normál (timines) DNS plazmidot használtam.

Előzőleg az U-DNS specifikus aktivitás extraktumból való kimutatására használtam PCR-ben szintetizált, normál és uraciltartalmú (U/T = 1/10), mintegy 500 nt hosszú DNS 77

szubsztrátot is. Ezt PCR-ben állítottam elő normál plazmidról dUTP-vel kiegészített elegyben (dUTP : dNTP mix arány 1:40 volt). Mindkét féle U-DNS-nek, mint megfelelő UDE-szubsztrátnak az előállítását saját módszertani eredménynek tekintem.

4.12.2. Elektroforetikus mobilitás teszt (EMSA) Fehérjék DNS-kötő képességét vizsgálhatjuk a módszerrel, aminek lényege, hogy a fehérjét kötő DNS kevésbé mobilis a natív agaróz gél-elektroforézis során, így a gélen nagyobb molekulatömeg felé való eltolódás mutatkozik a fehérjét nem kötő DNS-kontrollhoz képest. Különböző mennyiségű fehérjét adtam a DNS mintákhoz, majd az elegyeket agaróz gélen elválasztottam, a DNS csíkokat a szokott módon detektáltam.

4.12.3. UDE katalízis uracil tartalmú plazmid DNS-en Az UDE fehérje aktivitásának gyors tesztelésére a következő módszert dolgoztam ki. A 4.12.1.-ben leírt módon nyert 20 μg/ml plazmid DNS-t UDE aktivitás pufferben (25 mM Tris/HCl, pH = 7,5, 100 μg/ml BSA, 2 mM MgCl2) 10 μg/ml UDE-val inkubáltam 37°C-on 1-1,5 órán át. A terméket 75°C-on 10 percig denaturáltam, majd agaróz gél-elektroforézis segítségével analizáltam. A reakciót mindig 0’-es és normál plazmidos kontrollok mellett értelmeztem.

A definiált tömegű plazmid – a random uraciltartalomnak megfelelően –

random hasítása sok különböző tömegű terméket eredményez, ezért a gélen csak a kiindulási anyag fogyását tudjuk megbízhatóan detektálni. Összehasonlító mérésekben használtam UNG

enzimet

is,

ugyanebben

a

pufferben

ugyanezeken

a

szubsztrátokon,

szobahőmérsékleten inkubálva, majd a keletkező AP helyeket elhasítandó 60 mM NaOH-dal kezeltem 10 percig. Az U-DNS specifikus nukleázszerű aktivitás extraktumból való kimutatásához ugyanebben a pufferben 4 μg/ml oligonukleotid szubsztrátot (U/T = 1/10) és 0,15 mg/ml fehérjekoncentrációjú 3. stádiumú lárva (ill. kontrollként embrionális) extraktumot használtam. Kollaborációban, az uracilt meghatározott helyen tartalmazó, 5’ végen radioaktív jelölt, 75 nt hosszú oligonukleotid szubsztrátokon vizsgálták az UDE reakciót, amikor a termékeket

78

denaturáló körülmények közt (8 M urea), nagyméretű szekvenáló gélen (4 % PAGE) választották el, majd a radioaktivitást detektálták (ld. 5.2.5.2. fej.). Ezekre az eredményekre támaszkodva a csoportban jelenleg kifejlesztés alatt áll egy olyan módszer az UDE aktivitásának mérésére, ami lehetőséget adhat majd a vágás pontos karakterizálására, a termékek

azonosítására,

esetleges

szekvencia-preferencia

meghatározására,

továbbá

feltehetőleg folyamatos mérési módszer kidolgozására is.

4.12.4. Limitált emésztés Az UDE fehérje limitált emésztését mind specifikus proteázokkal, mind specifikus kémiai hasító szerrel elvégeztük. Az alkalmazott proteázok: tripszin, kimotripszin, nagy specificitású kimotripszin, AspN endoproteináz voltak; továbbá sikeresen hasítottam a fehérjét hidroxilaminnal, aminek csupán egy potenciális hasítóhelye van a fehérjeszekvencián. A tripszin (Sigma) 67 potenciális hellyel bír az UDE szekvencián. K és R után hasít. A reakcióelegyek összetétele: 0,5 mg/ml UDE, 0 ill. 0,5 mg/ml U-DNS, 0,05 μg/ml tripszin, 50 mM Tris pH = 7,5, 1 mM MgCl2, 0,1 mg/ml BSA. A kimotripszin (Sigma) 63 potenciális hasító hellyel bír az UDE szekvencián. A nagyméretű hidrofób aminosavak (mindenekelőtt W, Y, F) utáni peptidkötést hasítja. A reakcióelegy összetétele: 0,5 mg/ml UDE , 0 ill. 0,5 mg/ml UGI, 0,1 μg/ml kimotripszin, 50 mM Tris pH = 7,5, 1 mM MgCl2, 0,1 mg/ml BSA. A nagy specificitású kimotripszin (Princeton Separations, Inc.) 19 potenciális hasítóhellyel bír az UDE szekvencián. A proteáz W, Y és F utáni peptidkötést hidrolizálja. Reakcióelegyek: 0,5 mg/ml UDE, 1,25 μg/ml proteáz, 50 mM Tris/HCl pH = 8,0, 1 mM CaCl2, 0 ill. 0,5 mg/ml cirk. U-DNS. Az elegyeket szobahőmérsékleten inkubáltam, időnként mintát vettem, amiben a reakciót 0,1 mM 4-(2-aminoetil)benzol-szulfonil-fluorid (AEBSF) hozzáadásával állítottam le! Az Asp-N endoproteináz (Sigma) 21 potenciális hasítóhellyel bír az UDE-n. A proteáz aszpartát és ciszteinsav előtt vág. A reakcióelegy összetétele: 100 mM Tris/HCl pH = 8,5, 5 mM MgCl2, 0,5 mg/ml UDE, 1,25 μg/ml proteáz, és 0 ill. 0,16 mg/ml cirkuláris U-DNS. Az elegyeket éjszakán át ill. 5 órán keresztül 37°C-on inkubáltam, időnként mintát véve. A proteáz metalloenzim, ezért a reakciót 5mM EDTA-val állítottam le.

79

A hidroxilamin (Sigma) aszparagin és glicin közti peptidkötést képes hasítani, ilyen hely az UDE-n csak egy van (N111-G112 a 36. ábrán feltüntetett szekvencia szerint számozva), éppen az első két konzervált motívum között. A reakció elegyösszetétele: 0,2 M K2CO3, pH = 9,0, 2 M hidroxilamin, 1 mg/ml UDE, 0,2 mM AEBSF proteázgátló (továbbá 1 mg/ml U-DNS, a DNS-védést vizsgálata esetén). A reakcióelegyet 2 ill. 8 órán át 37°C-on inkubáltam, majd dializáltam UDE dialízis pufferbe (ld. 4.1.2. fej.). Az emésztményeket SDS-PAGE-n analizáltam, és az Asp-N endoproteináz valamint a nagy specificitású kimotripszin esetén a specifikus fragmenseket tömegspektrometriával azonosítottuk is.

4.13. In silico eljárások Munkám tervezésében általában nagy segítséget jelentett a teljes és annotált Drosophila Genom adatbázis (FlyBase: http://flybase.bio.indiana.edu) [247]. A tömegspekrometriával azonosított fehérjetalálatok gyakran jelentettek prediktált géntermékeket, melyek in silico elemzése szükséges volt a kísérletek további tervezése szempontjából. Így a szekvenciákkal minden esetben többféle szoftverrel, leggyakrabban az NCBI honlapján (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) elérhető blast-tal, többféle adatbázison végeztem homológiakeresést. A homológ szekvenciák összerendezését az ExPaSy (http://au.expasy.org) honlapon elérhető CLUSTAL W programmal végeztem. Ugyanitt a homológ fehérjék elsődleges paramétereit, mint méret, tömeg, aminosav-összetétel, elméletileg számított extinkciós koefficiens és pI, a PROTPARAM programmal határoztam meg. A nukleotid szekvenciák hat keretben történő fordítását az ExPaSy honlapon elérhető TRANSLATE programmal végeztem. A dUTPáz NLS-ét első lépésben in silico azonosítottam egy NLS adatbázisban (http://cubic.bioc.columbia.edu/db/NLSdb/) végzett homológiakeresés segítségével. Az UDE fehérje limitált emésztését tervezendő, az ExPaSy honlapon elérhető PEPTIDCUTTER program segítségével választottam ki a számunkra megfelelőnek tűnő proteázokat ill. kémiai hasító szereket. Az UDE fehérjének több programmal (https://genesilico.pl/meta2/) is elvégeztük a másodlagos szerkezetpredikcióját, minden esetben egyöntetűen főként α-helikális szerkezet adódott a szekvenciára. Továbbá kollaborációban elkészült az 1A és 1B fragmensek de novo szerkezetmodellezése is ROSETTA módszerrel.

80

5. Eredmények és kifejtésük 5.1. A dUTPáz szabályozása ecetmuslicában 5.1.1. A dUTPáz két izoformája A rekombináns LD dUTPázra kifejlesztett poliklonális ellenanyag birtokában S2 sejtekből immunoprecipitáltam az enzimet. SDS-PAGE-n két fehérje csíkot kaptam 23 ill. 21 kD látszólagos molekulatömegnél (20.A ábra), melyekből a dUTPáz két izoformáját azonosítottuk gélben történő emésztés utáni tömegspektrometriás analízissel (20.B-F ábra). A tömegspektrometriás méréseket Hunyadi-Gulyás Éva készítette. A 23 kD-os sáv esetén a prediktált triptikus peptidek 72 %-a, míg a 21 kD-os sáv esetén 66 %-a volt detektálható. A mért tömegek 64 ill. 59 %-a illett egyértelműen a dUTPáz szekvenciára. A tömegspektrumban mindkét izoforma esetén azonosítható volt a C-terminális triptikus peptidnek megfelelő csúcs (20.B-C ábrán csillaggal jelölve, MH+ = 1261,6), amit PSD spektrummal is megerősítettek (20.D ábra, AAEPEGAAPAPVAT). Ez azt jelenti, hogy a Drosophila enzimre jellemző egyedi 28 aminosavas C-terminális régió a fehérje mindkét detektált izoformájában megtalálható. Ellenben az N-terminálison különbség mutatkozott: a 23 kD-os forma estén detektálható az N-terminális triptikus peptid tömegcsúcsa (20.C ábrán két csillaggal jelölve, MH+ = 1232,6), amit PSD spektrummal is megerősítettünk (20.E ábra, PSTDFADIPAAK). Érdekes megjegyezni, hogy a kezdő metionin feltehetőleg poszttranszlációsan levágódik, hasonlóan a humán enzim esetéhez [54]. Ez a módosítás hatással lehet a fehérje élettartamára (vö. „N-end rule” [248, 249]). A 21 kD-os formánál ez az előbbi tömegcsúcs hiányzik; az N-terminálishoz legközelebb így a MH+ = 876,5 csúcshoz tartozó, 17. aminosavtól kezdődő peptid esik (20.C ábra, két csillaggal jelölve), amit szintén PSD-vel is megerősítettek (20.F ábra, IDTCVLR). Természetesen pusztán ezzel a tripszinolízises módszerrel nem tudjuk megmondani a rövid izoforma pontos kezdetét, mert a két detektált N-terminális peptid közti KKMK szakasz triptikus fragmenseinek azonosítása bizonytalan. Az eredmény reprodukálhatósága és az alkalmazott proteázgátlók mennyisége megerősítettek minket abban, hogy nem aspecifikus fehérjedegradáció eredményét látjuk. Időközben a Drosophila genom adatbázisban (3.1 kiadás) megjelent egy újabb információ egy feltételezett intronról a gén 5’ végén (ld. 23. ábra). Az érintett szakasz a GU-AG szabálynak megfelelő szabályos intron [250]. A feltételezett intron alapján a jósolt rövidebb izoforma jól egyezik az általam immunoprecipitálással kísérletesen meghatározott formával. 81

23 kD 21 kD

A

MM

1141.6 2

[17-23] 876.5

1368.7 1794.8

200

400

1200

1400

1989.1

T T

1600

1800

2000

385.6 y4

499.5 y5

T

[64-77] 1548.7

847.8 b8

819.9 a8

619.7 b6

520.3 a5

685.5 y7

548.6 b5 0

1668.7 [88-102]

E

400

500

600

700

800

900

m/z

1352.7

[133-143]ox

+

IDTC(CH2CONH2)VLR MH =876.5

1989.0 [133-149] 2096.1

1368.6 1956.0

[133-149]ox

1752.8

2112.0

800

600

y2-NH3 270.8

400

1794.9

648.3 y5

175.3 y1

[103-120]

Ion counts

1251.6* [175-188]

[17-23]

4000

876.5 917.3

1200

832.9 y8

614.6 y5

401.4 b4

1000

1009.5

2000

1000

735.1 b7

2000

2200

[133-143]

[27-36]

[125-132] [150-160]

[48-57] 1076.5

1141.6

979.5

800

m/z

+

m/z

6000

600

25 x

1000 1000

1036.5

Ion Counts

[103-120]

0

8000

C

0

3000

1956.0

1752.8

800

1133.1 b13

794.7 b9

PSTDFADIPAAK MH = 1232.6

[133-149] 2096.1

T

B

1110.0 y12

1062.2 b12

754.9 y9

[133-149]ox 2112.1

Ion counts

979.5 917.3

1352.7 [133-143]ox

1232.6** [27-36]

1009.5

980.5 y11

697.3 b8, y8

[2-13] [133-143]

[125-132] 1036.5

1251.6* [175-188]

[150-160]

Ion Counts

6

272.2 b3

b2 PA 143 169

865.7 b10, y10-H2O

555.4 b6, y6 436.4 626.6 b7, y7 PAPVA

2000

D

1076.6

8

227.1 PE

4000 3000

386.7 y4

197.3 PV

1000

[88-102] 1668.8

[48-57]

10

4

IP

1548.7 [64-77]

3

5000

Ion counts

20,1 kD

12x10

+

AAEPEGAAPAPVAT MH =1251.6

6000

24 kD

cmC 133.1

490.2 b4 330.4 b3

288.5 y2

462.2 a4

387.8 y3

b2

200

589.5 b5

229.1

0 800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

m/z

F

0 100

200

300

400

500

600

m/z

20. ábra: A Drosophila dUTPáz két izoformája. A: S2 sejtekből immunoprecipitált dUTPáz. Az „MM” a molekula tömeg markert, az „IP” az immunoprecipitált Drosophila dUTPázt jelöli. A markerhez viszonyított pozíció alapján a dUTPáz két izoformájának látszólagos molekulatömege 23 ill. 21 kD. B,C: Triptikus emésztmények tömegspektrumai A 23 kD-os fehérje (B) ill. a 21 kD-os izoforma (C) triptikus emésztményének tömegspektruma egyaránt tartalmazza a C-terminális peptid MH+ = 1251,6-hoz tartozó jelét (*), [175-188] AAEPEGAAPAPVAT), különbség mutatkozik azonban az N-terminálison. A rövid izoforma első triptikus peptidje a MH+ = 876,5 tömegcsúcshoz tartozó, [17-23] IDTCVLR, míg a hosszú izoformában megtalálható a MH+ = 1232.6-hoz (**) tartozó [2-13] PSTDFADIPAAK szekvenciájú peptid is. D-F: A terminális peptidek PSD spektrumai. A mindkét izoformában jelen levő C-terminális (D), a hosszú forma N-terminális (E) és a rövid izoforma N-terminális triptikus peptidjei PSD spektrum által egyaránt megerősítést nyertek.

A két izoforma részben hasonlóságot mutat a humán dUTPáz esetében leírt mitokondriális és nukleáris dUTPáz izoformákkal [51], ezért vizsgáltam a lehetséges lokalizációs szignálokat. NLS adatbázisában [251] keresve a hosszú izoforma N-terminálisán in silico azonosítottam egy szegmenst, mely közeli homológiát mutat egy különleges típusú

82

NLS-sel (21. ábra). Ezt a típust először a c-Myc-ben azonosították [252], és kimutatták, hogy a savas és neutrális oldalláncoknak is szerepe van a szignálfelismerésben [253], jóllehet előzőleg az NLS-ekben csak a bázikus oldalláncok fontossága volt közismert. Továbbá a humán dUTPázban azonosított NLS is [53] a c-Myc NLS homológja.

c-Myc NLS: dUTPáz feltételezett NLS-e: RanBP3 NLS: humán dUTPáz homológ szakasza:

PAAKRVKLD PAAKKMKID PPVKRERTS SPSKRARPA

21. ábra: A feltételezett NLS homológjai A c-Myc fehérje kísérletesen azonosított, nem szokványos magi lokalizációs szignál szekvenciájának végén található savas és neutrális oldalláncoknak is szerepe van a magi transzportban [253]. A Drosophila dUTPáz N-terminálisán azonosított szakasz közeli homológja a c-Myc NLS-nek. Hasonló szakasz található a humán dUTPáz N-terminálisán is, mely régió NLS szerepéről az irodalomban szintén található kísérletes evidencia [53]. A konzervált aminosavak vastagon szedve láthatók.

A humán izoformákhoz képest azonban különbség, hogy a humán mitokondriális dUTPáz rendelkezik egy meglehetősen hosszú szignállal az N-terminálison [54], amihez hasonlót a Drosophila enzim esetében nem láttunk. A rövid izoformán továbbá nem sikerült más ismert lokalizációs szignált sem azonosítani. Mivel azonban az említett ismeretlen funkciójú extra C-terminális hordozhat eddig nem azonosított jel-szekvenciákat, a mitokondriális lokalizáció esélye nem volt kizárható. Ezért mitokondriumot izoláltam Drosophila embriókból, a frakciókat pedig Western bloton analizáltam (22. ábra). Látható, hogy a mitokondrium frakcióban nincs detektálható mennyiségű dUTPáz, ellenben meglepő módon mindkét izoforma egyenlő arányban megtalálható a magi frakciókban és a citoplazmában is. Felmerül a kérdés, hogy miként biztosítódik a megfelelő dUTP/dTTP arány a mitokondriumokban zajló autonóm DNS-replikáció során. Ismeretes, hogy DNSjavító fehérjék, köztük számos BER enzim (pl. dUTPáz, UNG) magasabb rendű eukarióták mitokondriumaiban jelen vannak [51], továbbá mitokondriális extraktummal in vitro rekonstruálható volt az egész BER folyamat [254]. A mitokondriális DNS-károsodás következményei (pl. öregedéssel való kapcsolata [57-59]) még nem teljesen tisztázottak, a fontos javító fehérjék jelenlétéből azonban úgy tűnik, hogy a mitokondriális DNS javítása, legalábbis magasabb rendű eukariótákban szükséges. A Drosophila esetében nincsenek irodalmi adatok a BER enzimek mitokondriális izoformáiról. Az UNG fehérje Drosophila83

ból való hiánya mellett elképzelhető, hogy az ecetmuslicában más különlegességek is jellemzik a BER rendszert.

N

Ns

M

C R

22. ábra: dUTPáz a sejtkompartmentekben A Drosophila embriókból végzett mitokondriumizolálás során Western bloton kimutattuk, hogy míg a magi (N) és citoplazmás (C) frakciók egyaránt tartalmazzák mindkét dUTPáz izoformát, a mitokondrium (M) frakcióból mindkettő hiányzik. Ns: az N frakció felülúszója, R: rekombináns dUTPáz.

A két izoforma egyenletes eloszlása a citoplazmás és a magi frakcióban egyben a fehérje rendhagyó magi transzportjára is utal. Az említett in silico azonosított NLS-t a csoportunkban Muha Villő kísérletes úton is megerősítette, mindemellett a rövid izoforma rendkívüli, mitózis alatt zajló magi transzportját is detektálta. Mindez arra utal, hogy a dUTPáz magi lokalizációját a magi póluskomplex apparátusán, a klasszikus NLS-eket felismerő importin α / β transzport rendszeren kívül más, feltehetően specifikus fehérjefehérje kölcsönhatások révén megvalósuló folyamatok is segítik. Ilyen rendhagyó transzport folyamatokra találhatunk irodalmi példákat is: a tubulin-függő transzport [255], a kis GTPáz Ran fehérje energiát termelő GTP hidrolízisétől független transzport [256], vagy a snurportin fehérje szerepe az érett U snRNP nukleáris importjában [257]. Ezzel együtt a két izoforma és ezek változó lokalizációjának fiziológiás jelentősége még nem tisztázott. Továbbá az sem, hogy a citoplazmában a dUTPáznak van-e és milyen funkciója, ill. mitokondriális forma hiányában miképp biztosítódik a mitokondriális DNS uracilmentessége a Drosophila-ban.

5.1.2. A dUTPáz mRNS-einek kimutatása az ecetmuslica egyedfejlődése során A Drosophila genom adatbázisban javasolt intron kimutatására félkvantitatív RT-PCR kísérletet végeztem megfelelő primer szekvenciákkal. A primereket úgy terveztem, hogy azok közrefogják a feltételezett intront (23. ábra), így egyetlen PCR elegyben mindkét előrejelzett mRNS felszaporítható.

84

tr-A -----cgacgctgtgttaaaccgcgttattttcagaccagaattctgcaagtaagctgaaaaaagtctctgtactttcgaagcattcctg 85 tr-B –-ttccgacgctgtgttaaaccgcgttattttcagaccagaattctgcaa---------------------------------------- 48 tr-A taataactcaatttgctccaaatgccatcaaccgatttcgccgacattccagctgccaagaagatgaagatcgacacgtgcgtcctgcga 175 tr-B ----------------------------------------------------ctgccaagaagatg************************ 86 1 M P S T D F A D I P A A K K M K I D T C V L R tr-A ttcgccaaactcaccgagaatgctttggagccggtgaggggatccgccaaagcggcgggagttgacctgcgcagcgcctacgacgttgtg 265 tr-B ****************************************************************************************** 176 24 F A K L T E N A L E P V R G S A K A A G V D L R S A Y D V V tr-A gtgccggcacgcggaaaggccattgtcaagaccgatctgcaagtgcaggttccggagggctcctacggacgcgtagccccacgatccggg 355 tr-B ****************************************************************************************** 266 54 V P A R G K A I V K T D L Q V Q V P E G S Y G R V A P R S G tr-A ctggcggtgaagaacttcattgatgtgggcgccggtgtggtggacgaggattatcgcggcaatctcggcgtcgtcctgttcaatcactca 445 tr-B ****************************************************************************************** 356 84 L A V K N F I D V G A G V V D E D Y R G N L G V V L F N H S tr-A gatgttgatttcgaggtgaagcatggcgaccgcatcgcccagttcatttgcgagcgtatcttctatccgcaactggtgatggtggacaaa 535 tr-B ****************************************************************************************** 446 114 D V D F E V K H G D R I A Q F I C E R I F Y P Q L V M V D K tr-A ctggaggacaccgagcgcggcgaggcaggattcggttccaccggagtcaaggatctgccggcagccaaggcgcagaacggcaacggagaa 625 tr-B ****************************************************************************************** 536 144 L E D T E R G E A G F G S T G V K D L P A A K A Q N G N G E tr-A aaggctgccgaaccggagggagctgctccggctcctgttgctacgtaaacgaggaactattgccgcattcttaatcccttcatggtcact 715 tr-B ****************************************************************************************** 626 174 K A A E P E G A A P A P V A T tr-A atcaaagagtttcattctgtatccttaagtgaaatatgttaatgtattggtatatttttatctattaaaaccgcaaatctacgaagaaa 804 tr-B ***************************************************************************************** 715

23. 23. ábra: ábra: Drosophila Drosophila dUTPáz dUTPáz fehérje fehérje és és cDNS cDNS szekvenciája szekvenciája Az adatbázisban prediktált két dUTPáz izoforma Az adatbázisban prediktált két dUTPáz izoforma cDNS-ének cDNS-ének szekvenciája szekvenciája valamint valamint aa fehérje szekvencia összerendezésével kitűnik egy feltételezett intron (tr-B fehérje szekvencia összerendezésével kitűnik egy feltételezett intron (tr-B 48-49 48-49 pozíciójánál), mely alternatív kivágódása magyarázatot adna a fehérje szinten detektált pozíciójánál), mely alternatív kivágódása magyarázatot adna a fehérje szinten detektált két két izoforma izoforma eredetére. eredetére. A A fehérjeszekvenciában fehérjeszekvenciában aa feltételezett feltételezett NLS NLS aláhúzással aláhúzással van van kiemelve. A A tr-B tr-B izoformában izoformában aa közös közös fehérjét fehérjét kódoló kódoló szakasz szakasz csillagokkal csillagokkal van van jelölve. jelölve. kiemelve. A A bekeretezett bekeretezett szegmensek szegmensek szolgáltak szolgáltak aa primertervezés primertervezés alapjául. alapjául.

A specifikus primerekkel végzett PCR termékeit a két mRNS prediktált méretének (670 és 578 nt) megfelelő pozíciókban detektáltam (24. ábra). Így sikerült a két fehérje szinten már detektált izoforma mRNS-einek azonosítása is. Az mRNS szint alakulását végigkövettem a Drosophila egyedfejlődése során. Az izoforma arányok változása mellett az expresszió konstitutívnak tekinthető mind a teljes mRNS mennyiségre, mind pedig a GAPDH mRNS-re vonatkoztatva (24. ábra). A különböző kísérletekben az izoforma arányok viszonylag tág határok között szórtak, de fiatal bábban minden esetben egyértelmű volt a hosszú (magi), míg a lárvaállapotokban a rövid (feltehetőleg citoplazmás) izoforma túlsúlya.

85

24. ábra: A dUTPáz izoformáknak megfelelő mRNS-ek kimutatása Félkvantitatív RT-PCR kísérlet eredménye agaróz gélen. Fent a dUTPáz izoformáknak megfelelő, lent a konstitutív belső markerként használt GAPDH cDNS látható végig a Drosophila fejlődése során. S2: S2 sejtek, O: ovárium, E: embrió, 1L: 1., 2L: 2., 3L: 3. stádiumú lárva, yP: fiatal báb, oP: öreg báb, I: felnőtt légy.

700 bp 600 bp

S2

O

E

1L 2L 3L yP

5.1.3. A dUTPáz fehérje hiánya a lárvális szövetekben Fehérje szinten Western bloton követtem a két izoforma szintjének alakulását a fejlődés alatt, és az mRNS-hez képest meglepő módon a lárvaállapotokban mindkét izoforma drasztikus (detektálhatósági szint alá) csökkenését tapasztaltam, mind a teljes fehérje koncentrációra, mind pedig tubulin kontrollra vonatkoztatva (25.A ábra). F

S2

E

1L

2L

3L

B

F- M

I M

C

A 25. ábra: A dUTPáz kifejeződése a fejlődés alatt ill. a különböző sejttípusokban. A: A dUTPáz expresszió a lárvastádiumok alatt erősen lecsökken. Fent dUTPázra, lent tubulinra, mint belső kontrollra végzett Western blot eredménye látható végig a fejlődés során. S2: S2 sejtek, O: ovárium, E: embrió, 1L: 1., 2L: 2., 3L: 3. stádiumú lárva, P: báb. B: A felnőtt légyben dUTPáz csak a petefészekben fejeződik ki számottevő mértékben. Azonos számú nőstény légyből (F), ovárium nélküli nőstényből (F-), hím légyből (M) és a kiboncolt ováriumokból (O) készített extraktumokon végzett Western blot látható. C: Az érett petesejtekben a rövidebb izoforma javára tolódik el a dUTPáz izoformák aránya. Tripszinolízis segítségével az ováriumokat egyedi folliculusokra bontottam, majd ezeket méret alapján érett (M) és éretlen (I) frakciókra választottam el. Az érett frakcióban a Western blot tanúsága szerint a rövidebb, feltehetőleg citoplazmás izoforma túlsúlya detektálható.

86

A fehérjeszint nagymértékű csökkenése minden valószínűség szerint poszttranszkripciós szabályozás eredménye, mivel az mRNS-szinten nem láttunk hasonló csökkenést. A poszt-transzkripciós szabályozásnak több módja is kínálkozhat [258-260]: mRNS szinten egyfajta raktározás, transzlációs gátlás, ill. a fehérje gyors degradációja. Érdekes poszt-transzkripciós szabályozásra láthatunk példát a timidilát anyagcserében résztvevő enzimek esetén is, ugyanis a timidilát szintáz képes a saját, ill. pl. a c-Myc, vagy a dihidrofolát reduktáz m-RNS-éhez kötődni és azt valamiképp szabályozni [170, 261, 262]. Ugyanakkor adatbázisok vizsgálatával nem találtam a dUTPáz mRNS-re jósolható mikroRNS-t sem egyéb ismert reguláló elemet. A dUTPáz drasztikus csökkenése összhangban van az irodalmi áttekintésben is kifejtett korai hipotézissel. Ezért tüzetesebb vizsgálatnak vetettük alá az enzim expresszióját ill. lokalizációját a különböző szövetekben ill. fejlődési állapotokban. Felnőtt légyben a fehérje csak az ováriumban fejeződik ki detektálható szinten (25.B ábra). Ez arra utal, hogy a felnőtt légyben más szövetekben meglepő módon nincs szükség dUTPázra, ami vagy azért lehetséges, mert nincsen más igazán aktívan osztódó szövete, vagy az UNG hiánya miatt az esetleg megjelenő timint helyettesítő uracil nem érzékelődik hibának. A jövőben a különböző szövetek genomi uraciltartalmának kvantitatív mérése végig a fejlődés során megadhatja a választ többek közt erre is. Izolált ováriumokat tripszinolízis alkalmazásával egyedi folliculusokra bontottam szét, amelyeket méretük szerint két frakcióra választottam (ld. 4.3.2. fej.). A nagyobb méretű frakció az érett, míg a másik az éretlen follikulusokban dúsult. A mintákon végzett Western bloton látható, hogy az éretlen follikulusok a két izoformát kiegyenlített arányban, míg az érett peték túlnyomórészt a rövidebb citoplazmás formát tartalmazzák (25.C ábra). Ismeretes, hogy a dajka sejtek által termelt fehérje és mRNS készlet a dajkasejtek citoplazmájából a gyűrűcsatornákon keresztül átpumpálódik a petesejtbe, hogy azt ellássa az első DNS duplikációkhoz szükséges makromolekulákkal (ld. 4.3.2. fej., táblázat). A peteérés során fent tapasztalt rövidebb, feltehetőleg citoplazmás dUTPáz izoforma felé való arányeltolódás hátterében az állhat, hogy a dUTPáz is átpumpálódik a petesejtbe a maternális mRNS és fehérjekészlet komponenseként. Azt, hogy a dUTPáz mRNS és fehérje a szükséges makromolekulák között van, jól demonstrálja az ováriumokon végzett in situ mRNS hibridizálás, melyben jól látható a dUTPáz mRNS-ének transzportja (26. ábra).

87

A

B

C

D

26. ábra: dUTPáz mRNS transzportja a peteérés során In situ RNS hibridizálás során jól látható, amint az egyre inkább visszahúzódó dajkasejtek a petesejtbe juttatják a dUTPáz mRNS-ét (lila festődés az A-C paneleken, negatív kontroll a D panelen).

További immuno-hisztokémiai kísérletekben a dUTPáz fehérje lokalizációját követtük. Éretlen ováriumokban magi lokalizációt detektáltunk, míg az érés során, amikor a dajkasejtek és a petesejt differenciációja is lezajlik, a dUTPáz lokalizációja fokozatosan áttevődik a citoplazmába (27.A ábra), ami összecseng a Western bloton fentebb kimutatott izoformaarány eltolódásával. Érdekes, hogy korai embriókban (2h, max. 7-8 nukleáris mitotikus ciklus, ld. 4.3.2. fej., táblázat), melyekben a DNS-duplikáció teljesen a maternális mRNS- ill. fehérjekészleten alapul („zigotikus switch” előtt), a fehérje mégis magi lokalizációt mutat (27.B ábra). Ez feltételez az azonosított NLS-en túl valamiféle további mechanizmust, ami a dUTPáz magi transzportját biztosítani képes (vö. 5.1.1. fejezet). Lárvaállapotok során kimutattuk, hogy míg a lárvális szövetekben valóban nem detektálható dUTPáz, az imaginális diszkuszokban igen (27.C ábra), méghozzá magi lokalizációban (27.D ábra). Itt szoros összefüggést tudtunk kimutatni a dUTPáz kifejeződése és az adott sejttípus sorsa közt: az imaginális diszkuszok a metamorfózis során nem halnak el, mint a többi lárvális szövet, hanem ezek képezik a felnőtt légy szerveinek kiindulási sejtjeit. Ez az eredmény ismét jól korrelál azzal a hipotézissel, miszerint a metamorfózishoz kapcsolódó sejthalál folyamatok indukálásában valamiképpen dUTPáz hiányában megjelenő U-DNS is szerepet kaphat. Az S2 sejtvonalban kisebb epitéliális jellegű sejtek [229], ill. nagyobb, feltehetőleg makrofág vonalhoz tartozó sejtek (Invitrogen termékismertető) egyaránt megtalálhatók. Ezzel a sejttípusbeli heterogenitással összhangban a dUTPáz lokalizációja is változatosságot mutat (27.E ábra), mégis túlnyomórészt (~85 %-ban) az enzim a magban található.

88

dUTPáz

DNS

mindkettő

27. ábra: A dUTPáz enzim lokalizációja Drosophila szövetekben Immuno-hisztokémiai kísérletekben a dUTPáz FITC-konjugált másodlagos antitestet alkalmazva zöld színben jelenik meg, míg a DAPI-val festett magi DNS kék színben. A: ováriumokban az éretlen follikulusokban a dajkasejtek magjában, míg az érettekben inkább citoplazmában lokalizálódik a dUTPáz. B: Fiatal embrióban, mely a zigotikus transzkripció bekapcsolása előtt a maternális mRNS és fehérje készletet használja a dUTPáz magi lokalizációt mutat. C: A lárvákban csupán az imaginális diszkuszokban találunk detektálható mennyiségű dUTPázt. D: A diszkuszokon belül a dUTPáz magi lokalizációt mutat. E: A heterogén S2 sejtvonalban a dUTPáz magi ill. citoplazmás lokalizációja egyaránt előfordul.

89

5.1.4. A dUTPáz sejtciklushoz kötött szabályozása Vizsgáltam, hogy a Drosophila dUTPáz izoformák expressziója is sejtciklushoz kötött-e, hasonlóan a humán nukleáris izoformához [52]. Ezért elsőként logaritmikus fázisban növő S2 sejteket hasonlítottam össze elöregedett populációval, ahol a sejtosztódások gyakorisága erősen lecsökken. Azt tapasztaltam, hogy míg az aktívan osztódó sejtek mindkét izoformát tartalmazzák, a jórészt szeneszcens állapotban lévők egyiket sem (28. ábra). Ez mindkét izoforma sejtciklus-függő kifejeződésére utal.

24 kD 20,1 kD

1

2

28. ábra: A dUTPáz enzim sejtciklus-függő kifejeződése S2 sejtekben Western bloton logaritmikus növekedési fázisban levő (1) és elöregedett (2) S2 sejtpopulációk eltérő dUTPáz tartalma látható. Molekulatömeg pozíciók oldalt.

Az S2 sejtek szinkronizálása feltehetőleg a sejtvonal heterogenitása miatt nem bizonyult kivitelezhetőnek, ezért kísérletesen nem tudtuk meghatározni azt a sejtciklus fázist, amelyben a dUTPáz expresszió felerősödik. Ugyanakkor a gént közvetlen megelőző, mintegy 250 bázispárnyi, feltételezett promóter régióban - a korábban azonosított „zeste” felismerő helyen [35] túl – in silico egy Drosophila specifikus, DNS-replikációhoz kapcsolt promóter elemből (DRE: TATCGATA [263]) közvetlenül egymást követő két kópiát azonosítottam. Ez megtalálható olyan sejtciklushoz kötötten szabályozott gének promóterén is, mint a PCNA ill. a DNS polimeráz α [263, 264]. A sejtciklus során változó dUTPáz expresszió felveti a kérdést, hogy miként biztosítódik a megfelelő dUTP/dTTP arány a sejtciklus azon fázisaiban, melyekben nincs jelen számottevő enzim, bár a javító DNS-szintézis számára szükséges lenne a megfelelő dUTP/dTTP arányt biztosítani. Ez a kérdés nem pusztán a Drosophila esetén merül fel, hanem ugyanúgy a többi faj esetében is. Munkahipotézisemben feltételezem, hogy esetleg specifikus kölcsönhatások révén, a javítás helyén lokalizálódva, minimális mennyiségű dUTPáz

is

képes

a

helyes

nukleozid-trifoszfát

mikrokörnyezetben.

90

arányt

biztosítani

legalább

a

5.1.5. A dUTPáz aktivitást befolyásoló makromolekuláris tényezők A Drosophila dUTPázzal folytatott kutatómunkánkat nagymértékben ösztönözte, az a korai publikáció, mely egy első stádiumú lárvákból izolált dUTPáz inhibitor aktivitást írt le. Az aktivitásért felelősnek tartott fehérjét részben tisztították (60 kD körül, hőstabil, fehérje), de azóta sem azonosították [5]. Egy ilyen inhibitor fehérje mindenképp áttörést jelenthetne a dUTPáz antagonizmusra alapuló gyógyszertervezés számára. dUTPáz inhibitort leírtak ugyan a PBS2 fágban is [70], de az azzal összefüggő fehérjét sem azonosították (ld. 3.2.1. fej.). A dUTPáz aktivitását szabályozó lehetséges Drosophila fehérjék azonosítása végett először S2 ill. lárva extraktumok továbbá ezek gélből 8 M ureával eluált, dializált frakcióinak dUTPáz-aktivitásra gyakorolt hatását teszteltem (ld. 4.10. fej.). A teljes nyers extraktum – sem S2 sejtekből, sem 1. stádiumú lárvából - nem volt hatással a rekombináns dUTPáz aktivitására. A frakciók közül azonban néhány erőteljes aktiváló hatást mutatott, mégpedig kizárólag a LD dUTPáz esetében (29. ábra). Ugyanezek a frakciók a SD dUTPázra, ami nélkülözi a Drosophila-ra jellemző extra C-terminális régiót, nem voltak ilyen reguláló hatással (eredmény nincs közölve). További érdekesség, hogy ez az aktiváló hatás hőkezelt extraktum frakcióiból is mérhető volt. Kérdés, hogy a teljes extraktumban mi fedhette el ezt az aktiváló hatást. Egyik lehetőség egy inhibitor fehérje feltételezése, azonban gátló aktivitást sehol nem sikerült mérnem. Másik lehetőség, ha az aktiválás hátterében egy reverzibilis poszt-transzlációs módosítást feltételezünk. A kísérletek ezen a ponton még kezdeti fázisban vannak. Az eredmény mindazonáltal ösztönöz egyrészt az extra C-terminális régió szerepének tisztázására, másrészt a dUTPáz kölcsönható partnereinek – köztük az aktiváló hatásért felelős fehérjének - azonosítására, és kiterjedt vizsgálatára.

91

5.1.6. A dUTPázzal kölcsönható makromolekuláris partnerek kimutatása Mivel a fentiekben részletezett sokrétű és sokszor különlegesnek mondható szabályozás előre vetíti bizonyos kölcsönható partnerek létét, igyekeztünk ezt több kísérletes úton is megerősíteni. Egyrészt felszíni plazmon rezonancia kísérletekben immobilizált rekombináns dUTPázt konjugáló felszín és 1. stádiumú lárva extraktum hőstabil frakciójának kölcsönhatását vizsgáltuk. Az első méréseket Németh-Pongrácz Veronika készítette az általam preparált Drosophila extraktumokkal, míg a LD és SD dUTPáz összehasonlító vizsgálatát magam végeztem. A hőstabil extraktum frakció koncentráció-függő kötődési jelet ad a rövid dUTPáz esetén (30.A ábra). Negatív kontrollként BSA-oldatot (eredmény nincs közölve) ill. a rekombináns dUTPáz oldatát (30.B ábra) is teszteltük előtte nem használt dUTPáz-konjugált felszínen, mely során nem kaptunk specifikus kötésre utaló jelet. Érdekes továbbá, hogy az extraktum esetében detektált jel nem tud teljesen lecsengeni, ami a kötődő makromolekulák teljes elúciójának sikertelenségére utal az adott körülmények között. Ezzel párhuzamosan megfigyelhető, hogy a már használt felszín képes a rekombináns dUTPáz megkötésére (30.C ábra), ami a dUTPázon többszörös kölcsönható felszínek létére enged következtetni. Összehasonlítva a LD és a SD dUTPázt konjugáló felszíneket, hőstabil lárvaextraktummal hasonló karakterisztikájú kötődési jelet detektáltunk (30.D ábra). Nyers extraktummal szintén megfigyelhető egyértelmű kötődés (ábra nincs közölve). Fentiek alapján elmondható, hogy 1. stádiumú

lárvában

létezik(nek)

a

dUTPázzal

kölcsönható,

esetleg

hőstabil

makromolekula(ák), melyek kötő felszíne nem kizárólag az extra C-terminális régió lehet. Másrészt far Western bloton extraktumokban számos dUTPázzal potenciálisan kölcsönható fehérjét mutattam ki. Látható a Western blothoz képest a far Western bloton további sávok jelennek meg (30.E ábra), amelyek feltehetőleg egy-egy, a dUTPázzal kölcsönható fehérjének tulajdoníthatók. Ez azért is erős érv dUTPáz fehérje-partnerek léte mellett, mert a kísérletben a fehérjék az SDS-PAGE elektroforézis során erősen denaturáló körülmények közé kerülnek, renaturálódásuk kétséges, így valószínűleg számos fiziológiásan releváns fehérje-fehérje kapcsolat nem detektálható a technikával. Ennek ellenére is sikerült néhány partnert kimutatnom, sőt az embrionális ill. az 1. stádiumú lárva extraktumban mutatkozó eltérő mintázat alapján az is elmondható, hogy a két fejlődési állapotban a dUTPáz-kölcsönható partnereknek eltérő populációja fejeződik ki.

92

19400

19200

19200

19000

19000

18800

18800

RU

RU

19400

18600 18400

18200

18000

A

II.

18400

18200

8400

I.

18600

18000 8600

8800

9000

9200

Time, sec

B

19400

3000

3200

3400

3600

3800

Time, sec

20800

19200

20600

19000

20400

RU

RU

18800 18600

20200

E

18400

20000 18200

C

600

E

1L

E

1L

19800

18000 800

1000

Time, sec

1200

1400

D

50

100

150

200

Time, sec

30. ábra: A dUTPáz enzimmel kölcsönható makromolekulák kimutatása A-D: Felszíni plazmon rezonancia. A SD dUTPázt kovalensen kötő felszínen lárvaextraktum hőstabil frakcióját tesztelve koncentrációfüggő kötődési jelet detektáltunk (A: világosszürkén 0,05, sötétszürkén 0,10 és feketén 0,15 mg/ml fehérjekoncentrációjú extraktum frakció jele). Előzőleg nem használt SD dUTPáz-konjugált felszínen rekombináns dUTPáz kötődését tesztelve nem (B), míg extraktummal előzőleg használt felszín esetében ugyanígy specifikus kötődési jelet detektáltunk (C). Lárvaextraktum hőstabil frakciójának (0,15mg/ml) kötődési jele LD (feketén) ill. SD (szürkén) dUTPáz-konjugált felszínen (D). E: Far Western blot. I: Western blot embrió- (E) és 1. stádiumú lárvaextraktumon (1L); II: far Western blot ugyanezen extraktumokon. A nyilak jelzik a far Western bloton detektált, potenciális dUTPáz kölcsönható fehérjéket jelentő, extra jeleket, melyek mintázata a két vizsgált fejlődési stádiumban eltérő.

A fenti két független módszerrel detektált makromolekuláris ill. fehérjepartnerek meggyőztek minket arról, hogy érdemes a dUTPáz kölcsönható partnereit izolálni és azonosítani különböző Drosophila mintákból.

5.1.7. Potenciális dUTPáz partnerek izolálása és azonosítása Mivel meggyőzően demonstráltuk többféle, a dUTPázzal kölcsönható fehérje létét Drosophila-ban, célul tűztük ki ezek azonosítását. Ehhez affinitás kromatográfiát, immunoaffinitás kromatográfiát és ko-immunoprecipitálást alkalmaztam. A kötődő frakciókat minden esetben hatékony töményítés (ld. 4.8.3. fej.) után SDS-PAGE-n elválasztottam, majd a relevánsnak tűnő fehérje sávokat tömegspektrometriás azonosításra preparáltam. Számos

93

kísérletből mintegy 25-30 potenciális partnert azonosítottam, melyek közt volt több apoptózissal és/vagy DNS-javítással kapcsolatba hozható fehérje is. A potenciális partnerek megerősítése, a kölcsönhatások fiziológiás jelentőségének tisztázása jelenleg is folyamatban van a csoportban, ezzel együtt az eredmények publikálása is várat még magára. Azonban néhány valóban érdekesnek tűnő találattal kapcsolatos munkahipotézisünket az alábbiakban összefoglalom. Előzőekben a dUTPáz sokrétű és sokszor rendhagyó szabályozását a következő folyamatokban mutattuk be: poszt-transzkripciós szabályozás, szubcelluláris lokalizáció, aktivitás szabályozása, sejtciklus-függő expresszió (ezzel összefüggésben feltételeztük DNSjavító komplexekben betöltött szerepét). E négy kategóriának megfelelően csoportosítottam a legalább részben ismert funkcióval rendelkező, potenciális dUTPáz partnerként azonosított fehérjéket (31. ábra). Látható, hogy az aktiváló hatásért felelős partner szerepére egyelőre nincs biztos jelöltünk. Azonban a poszt-transzkripciós szabályozással két fehérje találat is kapcsolatba hozható lehet. A hnRNP48 az mRNS-eket komplexáló heterogén nukleáris ribonukleoprotein komplexek (hnRNP) egyik komponense [265, 266]. A hnRNP-kben komplexálva történik a pre-mRNS-ek érése, transzportja, ezért az azonosított fehérje alkalmas lehet mRNS szintű szabályozás megvalósítására is [258]. A pros45 az ubikvitin-függő proteaszóma rendszer tagja, a proteaszóma reguláló alegységkomplexének integráns eleme [267]. Így esetleg szerepet játszhat a degradálandó fehérjék specifikus felismerésében [268]. Továbbá ugyanezt a fehérjét a TFIIH transzkripciós holokomplexben is megtalálták, amely komplexnek elfogadott a DNS-javításban betöltött szerepe [269]. Még érdekesebb azonban az a három - alapvetően riboszómális – fehérje, melyek a DNS-javítással közvetlenebb kapcsolatba hozhatók. A glikoziláz - AP liáz ill. az APE funkció egyértelműen a BER-hez tartozó aktivitások, ugyanakkor a PARP-kötő tulajdonságú RPL22 a PARP közvetítésével kerülhet kapcsolatba ugyanezen rendszerrel (részletesen a következő fejezetben, ld. 32. ábra). A TRanslin Asszociált X-faktor (TRAX) amellett, hogy a γ-sugárzásra bekövetkező DNSkárosodásra adott sejtválaszban játszhat szerepet [270, 271], bizonyos fehérjék szubcelluláris transzportját is befolyásolhatja [272]. A dUTPáz izoformák lokalizációjával kapcsolatban két kérdéses terület is adódik. Egyrészt a mitokondriális dUTP/dTTP arány biztosítása mitokondriális dUTPáz izoforma hiányában nem tűnik megoldottnak, bár nincs evidenciánk afelől, hogy ez az UNG-ot nélkülöző Drosophila-ban esszenciális feladat volna. Mégis a potenciális dUTPáz partnerek közt azonosított ADP/ATP transzlokázról elképzelhető, hogy különböző nukleotidok mitokondriális transzportját szabályozva [273], a dUTPázzal 94

kölcsönhatva – mely így a mikrokörnyezetből eliminálhatná a dUTP-t – az említett feladat megvalósításában szerepet játszhat. Az azonosított nukleáris dajkafehérjék, mint a Hsc70 [274] a dUTPáz rendhagyó magi transzportjában játszhatnak esetleg valamiféle szerepet, bár ezeknek a fehérjéknek a különböző sejtbiológiai folyamatokban egyaránt széleskörű funkciója van. A 31. ábrán szürke háttéren feltüntetett potenciális dUTPáz partnerek - valamint a PARP fehérje is - Burkitt limfóma sejtvonalakon indukált apoptózisban a dUTPázzal együtt leszabályozódnak [275]. DNS-javítás RpL22: PARP-kötő fehérje RpS3 glikoziláz/AP endonukleáz 60S riboszómállis fehérje P0: AP endonukleáz PARP Pros 45: proteaszóma alegység

TRAX Hsc70-4

Aktin

Nukleoplazmin és paralógja

hnRNP 48

Poszttranszkripciós szabályozás

Szubcelluláris lokalizáció

mitokondriális ADP/ATP transzlokáz

?

glikoprotein 93 (nukleáris dajkafehérje)

dUTPáz aktivitás szabályozása 31. ábra: Néhány azonosított feltételezett dUTPáz partner Néhány érdekesebb izolált dUTPáz partner csoportosítása lehetséges szerepük szerint. A dUTPáz regulációjának tanulmányozása alapján feltehetőleg specifikus fehérje-fehérje kölcsönhatások állnak az enzim poszt-transzkripciós szabályozása, a néhány tekintetben rendhagyó lokalizációja és az aktivitás szabályozása mögött, valamint ilyen kölcsönhatások köthetik közvetlenül a DNSjavító komplexekhez is. A szürke háttérben feltüntetett partnerek a dUTPázzal együtt leszabályozódnak Burkitt limfóma sejtek apoptózisában [275]. A PARP-ot affinitás kromatográfiával eddig nem azonosítottuk dUTPáz partnerként, de a többi partnerhez fűződő szerepe miatt érdemesnek látszott a kördiagramon kívül feltüntetni. A nyilak az általuk összekötött fehérjék közti kölcsönhatásra utalnak. A „?” pedig a tapasztalt, dUTPázt aktiváló hatásért felelős partner egyelőre ismeretlen voltára utal.

95

5.1.8.

Hipotézis

a

DNS-javításban

szereplő

potenciális

dUTPáz

partnerekről A potenciális dUTPáz partnerek közt számos riboszómális fehérje találatot is kaptam, melyekből több DNS-javítással és/vagy apoptózissal kapcsolatos egyéb funkcióval is bír. Ezeknek a BER-rel összefüggő szerepét a 32. ábrán vázoltam.

RpS3: glikoziláz/AP endonukleáz

DNS glikozilázok

dUTPáz

dUTPáz

APE

RpP0: AP endonukleáz

dUTPáz

RpL22

pol β +dNTP

PARP Polimeráz β

PCNA

ligáz III

polimeráz β/i ligáz I

32. ábra: A dUTPáz enzim szerepe a báziskivágásos javító mechanizmusban A Drosophila dUTPáz három DNS-javítással kapcsolatba hozható partnerét fekete keretben, szürke háttéren tüntettük fel, jelölve a dUTPázzal és esetleg más BER enzimekkel való kapcsolatukat is. A feltüntetett elsődlegesen azonosított kapcsolatok egy javító szuperkomplex létét sugallják, amelyben a dUTPáz is helyet kaphat.

96

Így a riboszómális RPL22 Drosophila-ban rendelkezik egy extra hisztonszerű Nterminális régióval, amiről kísérletesen kimutatták, hogy képes a PARP fehérje specifikus kötésére [276]. A PARP a báziskivágásos javító mechanizmusban is szerepet játszó fehérje [14, 102], mely DNS-száltöréseket ismer fel, és ezeken a helyeken toboroz további DNSjavító ill. apoptotikus fehérjéket, amelyeket poszt-transzlációsan módosít, poli(ADP-ribozil)ál, és ezzel szabályozza működésüket. Így a PARP is fontos döntő szereppel bír, amikor a sejt választ a DNS-javítás ill. az apoptózis közt [14]. Az RPL22 PARP kötése Drosophila specifikus lehet, a dUTPáz RPL22 kötéséről nincs ilyen információnk. Mindenesetre Drosophila-ban ez az azonosított kölcsönhatás a dUTPázt direkten a DNS-javítási folyamatokhoz kapcsolja, még ha eddig csupán preventív DNS-javító szereppel felruházott DNS-anyagcsere enzimnek tartottuk is. További két dUTPáz-kötőként azonosított riboszómális fehérje, az RPP0 [89] és a RPS3 [277], APE aktivitással rendelkezik. Az APE-k szerepét a BER-ben részletesen tárgyaltuk az irodalmi áttekintésben. Amennyiben a dUTPáz ebben a lépésben jelen van a javítás helyén, feltehetőleg biztosítani képes a megfelelően alacsony dUTP/dTTP arányt a mikrokörnyezetben az ezt követő polimeráz reakció számára. Az ábrán az azonosított kölcsönhatások nyomán kirajzolódik egy javító komplex lehetséges váza, mely a továbbiakban munkahipotézisként használható. Felmerül a kérdés, hogy milyen alternatív BER utat képviselhetnek az említett fehérjék a Drosophila-ban is megtalálható fő glikozilázok és APE-k által megvalósított mellett. Természetesen a kölcsönhatások független módszerrel történő megerősítése mind in vitro, mind in vivo szükséges ahhoz, hogy egy ilyen feltételezett komplexet és annak fiziológiás szerepét egyértelműen leírjunk. A fent vázolt potenciális kölcsönható partnerek sokaságára nézve két kérdés biztosan felötlik a szakavatott olvasóban. Egyrészt az azonosított potenciális partnerek nagy száma szokatlan. Ezzel kapcsolatban hangsúlyoznom kell, hogy a jelen munkában megvalósított, első lépésben azonosított feltételezett partnerek nem feltétlenül kötődnek közvetlenül a dUTPázhoz, és főleg nem egyszerre, ugyanazon sejttípus, ugyanazon sejtkompartmentében, ugyanazon fiziológiás és fejlődési állapotában. Ezért a továbbiakban szükséges az elsődleges kölcsönhatásokat kísérletesen azonosítani, ill. ezeket csoportosítani a különböző fiziológiás jelentőségük szerint, valamint az esetleges szuperkomplex szerveződéseket felderíteni. Másrészt az azonosított partnerek közt feltűnően sok riboszómális fehérje található. A riboszómális fehérjék a sejtmagon belül a nukleóluszban lokalizálódnak, részben itt szerelődnek össze a riboszómális RNS-ekkel, és a ribonukleoprotein részecskék exportja is 97

innen történik [278]. Kérdés, milyen folyamatok játszódhatnak a nukleóluszban, amelyek során ezek a riboszómálisok egyéb funkciókra is szert tehettek, és mindehhez hogy kapcsolódik a dUTPáz funkció. A kérdés megválaszolásához jelenleg nem áll rendelkezésünkre elegendő kísérletes adat. A nukleólusz a további kutatásaink egyik célpontja lehet, amelynek szokatlanul sokféle funkcióiról kiterjedt irodalom található [279281], még apoptózissal is kapcsolatba hozható [282], bár DNS-javításra utaló adatot nem találtam.

5.2. U-DNS-re specifikus nukleáz (UDE) izolálása, azonosítása és jellemzése A fentiekben részletezett, Drosophila dUTPázra vonatkozó eredmények alapvetően két irányban mozgatták tovább a kutatást: nemcsak a dUTPázzal specifikus kölcsönhatásba lépő fehérjék azonosítása ill. a kölcsönhatások jelentőségének tisztázása irányába, hanem a vitatott hipotézis elemeinek felülvizsgálata/megerősítése ill. további részleteinek tisztázása irányába is. Ez annál is inkább indokoltnak látszott, mert a vitatott hajdani hipotézis talán leggyengébb pontja, nevezetesen az UDG hiánya, a teljesen szekvenált Drosophila genom ismeretében könnyen tisztázhatóvá vált. Amellett, hogy két minor UDG (ld. alább) megtalálható a genomban, a fő UDG-t jelentő UNG hiánya egyértelműen megerősíthető [81]. Drosophila-ra szűkítve, csak az UNG fehérje konzervált motívumaival, tblastn programmal (fehérje szekvenciával keres 6 keretben fordított genomi DNS szekvencián) végzett homológiakeresés során sem sikerült a Drosophila genomban ung-homológ gént találnom. Két minor UDG-nek találtam Drosophila homológját. A CG5285 azonosítójú fehérje az emlős SMUG1 homológja, de az aktivitás jellemzőit csak az emlős enzim esetén írták le. A SMUG1 ssDNS-t preferál, és ezen a szubsztráton megközelíti az UNG hatékonyságát, azonban kettősszálú DNS-en több nagyságrenddel elmarad attól (részletesen ld. 3.1.4. fej.). A CG1981 azonosítójú Drosophila fehérje pedig az emlős TDG és az E. coli MUG enzimek homológja, melyek a hibás bázispárban lévő uracilt vágják ki, az UNG-nál több nagyságrenddel alacsonyabb hatékonysággal [135]. A Drosophila enzim továbbá mintegy 600 aminosavas kiterjesztést hordoz az N-terminálisán, melynek funkciója ismeretlen, csupán annyi bizonyos, hogy az emlős TDG-vel homológ rekombináns fragmens klasszikus

98

TDG aktivitással bír [144]. Értelemszerűen felmerülhet, hogy ezek a más fajokban minor UDG-k

Drosophila-ban

esetleg

helyettesíteni

képesek

a

hiányzó

UNG-ot,

ez

megkérdőjelezné az uracil lárvális DNS-ben történő feltételezett felhalmozódását. Az említett két enzim – aktivitás jellemzői alapján - valószínűleg képes a citozin dezaminálásával keletkező, hibáspárban lévő uracilt, valamint a transzkripcióhoz kapcsolt javítás során az ssDNS-ben lévő uracilt megfelelő módon javítani, megvédve ezzel a Drosophila genomban tárolt ill. a kifejeződő genetikai információt az esetleg káros mutációktól. A replikáció során – dUTPáz és UNG hiányában – timint helyettesítve beépült uracil teljes körű javítása mindazonáltal kérdéses marad. Azért, hogy a 3.2.3.1. fejezetben részletezett hipotézist tovább vizsgáljuk, először a lárvális DNS feltételezett uraciltartalmát, majd a szintén leírt állítólagos U-DNS nukleáz aktivitást kívántam ellenőrizni. Miután ezek több-kevesebb sikerrel megerősítést nyertek, megterveztem és sikerrel kiviteleztem a kérdéses aktivitásért felelős fehérje izolálását és azonosítását.

5.2.1. A lárvális DNS uraciltartalmának kimutatása Kvalitatíve kimutattam, hogy a 3. stádiumú lárva genomi DNS-e az embrionális vagy fiatal lárva DNS-hez képest emelkedett uraciltartalommal bír (33. ábra). Izolált genomi DNSt UDG és/vagy APE-val kezeltem, majd ezt követően PCR-ben egy mintegy 500 bázispárnyi specifikus szakaszt (praktikusan a dUTPáz gén egy szakaszát) felszaporítottam. A Pfu turbo polimeráz aktivitása erősen gátlódik amennyiben a templát DNS-ben AP helyek vagy a száltörések találhatók, így az UDG-vel kezelt ill. az UDG-vel és APE-val kezelt uracil tartalmú DNS a PCR-ben kevéssé szaporítható fel. Csupán 3. stádiumú lárva DNS esetében látható a PCR-termék mennyiségének csökkenése a kezeletlen ill. csak AP-val kezelt kontrollokhoz képest. Az eredmény alátámasztani látszik a genomi DNS uraciltartalmának növekedését a lárvaállapotok során, amit azonban szükséges a továbbiakban kvantitatív módszerrel is megerősíteni. E célból folyamatban van egy tömegspektrometriás mérési eljárás kidolgozása a kutatócsoportban. A hipotézis egyik sarkalatos pontja marad a megnövekedett uraciltartalom kvantifikálása azért is, hogy tisztázzuk, vajon a Drosophila genomban kódolt

99

minor UDG-k esetleg képesek-e részben - és mennyiben - átvenni a hiányzó UNG szerepét a lárvális szövetekben.

--

Embrionális DNS UDG U/A APE

--

1. lárvális DNS UDG U/A APE

--

3. lárvális DNS UDG U/A

APE

33. ábra: A 3. stádiumú lárva DNS-e megnövekedett uraciltartalmú Embrióból, első ill. harmadik stádiumú lárvából izolált genomi DNS azonos mennyiségét kezeltem U-DNS glikozilázzal (UDG), AP endonukleázzal (APE), ill. egymás után mindkettővel (U/A), majd PCR-ben specifikus primerekkel egy 500 bázispárnyi szakaszt szaporítottam fel. Az „UDG” ill. „U/A” minták intenzitáscsökkenése a „––” és „APE” mintákhoz képest csak a harmadik lárva esetén szignifikáns, ami annak megnövekedett uraciltartalmára utal.

5.2.2. U-DNS specifikus nukleáz aktivitás kimutatása lárva extraktumban Ezek után reprodukálni próbáltam Deutsch és munkatársai eredményét a 3. lárvában feltételezett U-DNS nukleáz aktivitásról. Teljes extraktumból a mérést jelentősen nehezítette az, hogy a késői 3. stádiumú lárva extraktumban nagyon erős aspecifikus DNS degradáló aktivitás mérhető, ami sokszor elfedte az alább bemutatott U-DNS specifikus aktivitást. Továbbá az extraktum DTT, EDTA és proteázgátló koktél hozzáadása mellett is meglehetősen gyors és erős elsötétedést mutat (ld. [205]), amely az extraktum minőségében bekövetkező nemkívánatos változásokra utalhat. Végül az eredmények reprodukálhatóságát illetően nem volt közömbös a lárvák pontos kora sem: ingadozó tápanyag- és vízellátás ill. hőmérséklet esetén ugyanis rendkívül eltérő volt a bebábozódásnak a megtermékenyítéstől számított ideje (120h-tól akár 140h-ig). A nehézségek ellenére is sikerült több kísérletben egyértelműen U-DNS specifikus DNS-vágó aktivitást kimutatnom (34. ábra).

100

embrió extrakt

3. lárva extrakt

0’

30’

0’

30’

0’

30’

0’

30’

kontroll DNS

U-DNS

34. ábra: U-DNS specifikus nukleáz aktivitás 3. lárva extraktumban A lárva extraktum az U-DNS-t 30 perc alatt teljesen (jobbra lent), míg a kontroll DNS-t egyáltalán nem (jobbra fent) emésztette. Hasonló reakció embrió extraktumban nem volt detektálható (balra fent és lent). Az extraktumok teljes fehérjekoncentrációja egyaránt 0,15 mg/ml volt, a reakcióelegyeket 75°C-on 10 perces denaturálás után választottam el agaróz gélen.

Természetesen ezen a ponton még nem lehettünk biztosak abban, hogy ez az aktivitás egyetlen fehérjétől származik, avagy esetleg UDG és APE kombinált aktivitását detektáltam. Azonban a szembeötlő különbség az embrionális és a késői lárva extraktum között megerősíti, hogy a lárva stádiumok végén valóban kifejeződhet egy újszerű U-DNS-t felismerő és valamiképp hasító enzim.

5.2.3. U-DNS kötő fehérjék izolálása és azonosítása 3. lárva extraktumból Azért, hogy a detektált U-DNS specifikus aktivitásért felelős fehérjét ill. az U-DNS felismerésében szerepet játszó esetleges további fehérjéket azonosítsam, DNS affinitás kromatográfiás kísérletet terveztem. A DNS-kötő fehérjék nagy számára való tekintettel (transzkripciós faktoroktól kezdve a javító fehérjéken keresztül a nagy mennyiségben jelen lévő hisztonokig), előfrakcionálást végeztem heparin oszlopon. Heparin oszlopot DNS-kötő fehérjék elválasztására szoktak használni, mivel a molekula a DNS szerkezetet mimikálja. Az oszlopra vitt 100 ml 7,5 mg/ml fehérjekoncentrációjú, sterilszűrt, késői 3. stádiumú lárvaextraktumból meglepő, ugyanakkor szerencsés módon az összes nukleáz aktivitás az áteső frakcióban jelentkezett. Ez a frakció a teljes extraktum fehérjéinek mintegy 70 %-át jelentette. A heparin oszlopon áteső frakciót vittem U-DNS-affinitás oszlopra, így a legtöbb DNS-kötő fehérje esetleg zavaró feleslegétől nem kellett tartani. Továbbá megelőzendő a gyantához konjugált DNS idő előtti leemésztődését, az aspecifikus nukleázok gátlására az injektálás előtt 4 mM EDTA-t adtam, valamint szakaszos elúciót terveztem, mivel az gyorsabban kivitelezhető. Végül megfontoltam, hogy az U-DNS hasonló mértékben köthet 101

számos DNS-kötő fehérjét, azonban feltehetően erősebben köti az U-DNS-re specifikusakat, mint az ugyanolyan szekvenciájú normál DNS. Ezért párhuzamosan kontroll kísérletet is végeztem. Az injektálandó frakció (112 ml) 1/3-át 250 μg normál DNS-t tartalmazó, 2/3-át pedig a mintegy 500 μg U-DNS-t tartalmazó oszlopon kromatografáltam. Az eluált frakciókat illékony pufferbe dializáltam, majd liofilizáltam, ill. visszaoldás után ezt még egyszer ismételtem, ami megfelelően hatékony töményítési eljárásnak bizonyult ahhoz, hogy SDS-PAGE-n történő elválasztás után detektálható fehérje sávokat kapjak. A gélen a kontrollal egybevetve az U-DNS specifikus fehérjesávokat preparáltam tömegspektrometriás azonosítás céljából (35.A ábra).

A MM

B

[Abs. Int. * 1000]

U 0,4

T 0,4

U 0,7

T 0,7

1234.468 107-118

14 13 12

1100.456 229-238 1074.570 209-218

11 10

67 45

9

1017.424 47-54 1001.433 47-54

29 24

6 876.460 257-263 5 4

1672.748 47-60

1307.498 61-70 1175.549 96-106

2090.028 140-158

1735.759 122-137

1315.559 140-152

1656.672 224-238 1646.618 1-12

8 7

35

2049.014 119-137 1416.685 94-106

1291.499 61-70

1630.627 1-12

1287.593 270-280

1624.752 209-223

2207.101 219-238 1978.939 122-139 1953.975 248-263 2333.191 138-158 2152.046 186-203

1405.582 186-197

3

20,1 14,2

1349.562 253-263

2 1 0 1000

1500

2000 m/z

2500

3000

35. ábra: U-DNS kötő fehérjék izolálása és azonosítása A: Az U-DNS affinitás kromarográfia frakciói SDS-PAGE-n. „MM”: marker (számok a megfelelő molekulatömegek kD-ban), „U 0,4”: 0,4 M sóval, „U 0,7”: 0,7 M sóval az U-DNS oszlopról; „T 0,4”: 0,4 M sóval, „T 0,7”: 0,7 M sóval a kontroll DNS oszlopról eluált frakció. A nyilak egyenként 40, 39, 35,5 kD látszólagos molekulatömegű U-DNS specifikus sávokat jelölnek, melyekből a CG18410 géntermék azonosítható volt. B: A 35,5 kD-nál jelentkező U-DNS specifikus fehérje triptikus emésztményének tömegspektruma.

Hét találat közül csupán egyetlennek nem volt ismert funkciója, továbbá ez a géntermék a gélen a legintenzívebb sávban (35,5 kD), ill. - valószínűleg kontrollálatlan proteolízisnek köszönhetően - további két hasonló molekulatömegű fehérjesávban is azonosítható volt (ld. nyilak a 35.A ábrán). A triptikus emésztmény tömegspektruma (35.B ábra) 40 %

102

lefedettséget és 45 % megfelelőséget mutatott a CG18410 géntermék adatbázisbeli szekvenciájával. A találatot a MH+ = 876.5 ([257-263] TSWDIVR) és a MH+ = 1001.4 ([4754] FGFKDMEK) csúcsok PSD spektrumai is megerősítik (spektrum nincs közölve).

5.2.4. A CG18410 géntermék in silico jellemzése Részletes

homológiakeresés

során

csak

teljes

átalakulással

fejlődő

rovarok

genomadatbázisaiból találtam homológ szekvenciákat, melyek szintén ismeretlen funkciójú fehérjét kódolnak. Első lépésben az NCBI honlapon elérhető protein blast linken psi-blast algoritmussal az első iterációban a Drosophila pseudoobscurá-ból, az Aedes aegypty-ből, az Anopheles gambiae-ból, a Tribolium castaneum-ból és az Apis mellifera-ból kaptam szignifikáns homológiát mutató fehérjetalálatokat. A második iteráció szerint a fehérje Nterminálisa igen távoli hasonlóságot mutat a β-laminin szekvenciák egy szegmensével, ami minden valószínűség szerint a funkció szempontjából már nem tekinthető szignifikáns hasonlóságnak. Az Apis mellifera szekvenciának két verzióját találtam: feltehetőleg az NCBI adatbázis (XP

001122207)

predikciója

hibás

(scaffold:AMEL1.1:Group15.11:93504:96209:-1)

és

az

Drosophila-val

Ensembl való

adatbázis

homológiát

is

figyelembe vevő megállapítása a helytálló. A Tribolium homológ esetén az N-terminális rövidebb, aminek hátterében azonban lehet a genom tökéletlen annotációja is, ugyanis az összes homológ összetett exon-intron szerkezettel bír, ami lehetőséget ad a prediktált „nyitott leolvasási keretek” („open reading frame”, ORF) eltérő összefűzésére. A selyemhernyó (Bombyx mori) szekvencia részlegesen szekvenált genomból került elő (http://papilio.ab.a.u-tokyo.ac.jp/genome/index.html). Az exonoknak megfelelő fragmensek aminosav-szekvenciáival külön-külön tblastn programmal keresve, a homológ szakaszokat különálló, részben átfedő „contig”-okban találtam (1. és 2. exonnal: BAAB01076745, contig413277, a 3. exonnal: BAAB01165760, contig6156). Ezeket manuálisan szereltem össze kiküszöbölve két szekvenálási hibát is. Az ORF-eket az NCBI honlapon elérhető GROMON programmal prediktáltam, továbbá az exon-intron határokat manuálisan az GUAG szabályra ill. a homológiára tekintettel határoztam meg. Ezért természetesen a

103

selyemhernyó homológ szekvenciájának kísérletes meghatározása is szükségessé válhat a későbbiekben.

104

A homológ szekvenciák összerendezését a ClustalW programmal végeztem (36. ábra). Ebből kitűnt öt konzervált régió, az első kettő egymással is homológ kiterjedtebb szakasz (1A és 1B 36. ábrán), esetleg a fehérje önálló doménjei lehetnek. Az 1A és 1B motívumból a Tribolium szekvenciában csak az egyik van jelen, a különbség jelentőségének kísérletes tisztázása szükséges. A

konzervált

motívumokkal

külön-külön

keresve

sem

sikerült

szignifikáns

homológokat találni más organizmusokból, továbbá ezek nem mutatnak hasonlóságot más ismert nukleázokkal vagy UDG-kkel sem, amellett, hogy más ismert motívumot vagy domént sem sikerült a szekvencián detektálni (37. ábra). Ezek után az NCBI honlapról nem elérhető, többé-kevésbé kész rovar genomok speciális

adatbázisaiban

tovább

keresve

a

Locusta

migratoria

(vándorsáska,

http://locustdb.genomics.org.cn) esetén találtam feltehetőleg ortológ fehérjéhez tartozó EST szekvenciákat, azonban az adatbázisból a prediktált aminosav-szekvencia nem érhető el, az elérhető elvileg átfedő nukleotid szekvenciák minősége rendkívül rossz, továbbá teljes „contig”-ok szekvenciái sem elérhetők. A találat jelentősége abban áll, hogy a vándorsáska a hemi-metamorfózissal fejlődő rovarokhoz tartozik, amelyek egyedfejlődésükben kihagyják a bábállapotot. Nem lenne érdektelen a sáska homológ szekvenciájának ismeretében számbavenni az esetleges különbségeket. Sajnos több hemi-metamorfózissal fejlődő fajnak nincs elérhető genom adatbázisa, így további homológokat nem sikerült azonosítani. A prediktált Drosophila fehérje 39,896 kD tömegű és bázikus karakterű (pI = 9,4), ami összhangban van a feltételezett DNS-kötő képességével. Továbbá a nem-konzervált Cterminális régióban található két lizinben és argininben gazdag traktus is, ami esetleg NLSként funkcionálhat. A fentiekben részletezett tulajdonságok miatt a találat megfelelő jelöltnek bizonyult a feltételezett U-DNS felismerő/vágó aktivitás hordozójára, ezért rekombináns úton előállítottuk a fehérjét karakterizálandó az aktivitását, szerkezetét és egyedfejlődésbeli szerepét (ld. 4.2.2. fej.).

105

106

5.2.5. A rekombináns UDE fehérje funkciójának jellemzése 5.2.5.1. DNS-kötő tulajdonsága A

tisztított,

rekombináns

His-UDE

jellemzését

a

DNS-kötő

képességének

megerősítésével kezdtem. Gél-elektroforézis mobilitási tesztben (38.A ábra) a linearizált normál és uraciltartalmú plazmid DNS (ld. 4.12.1. fej.) egyaránt a fehérjekoncentrációtól függő módon tolódott el, ami arra utal, hogy az UDE mind a normál, mind az uraciltartalmú DNS-t képes kötni a kísérleti körülmények között, jóllehet az eltolódás mintázata eltér a két esetben. Továbbá megfigyelhető az U-DNS foltintenzitásának csökkenése is párhuzamosan a fehérje koncentráció növekedésével.

107

5.2.5.2. U-DNS-re specifikus nukleáz aktivitása Először az extraktumban végzett protokoll szerint teszteltem a rekombináns fehérje aktivitását (38.B ábra). Az egyértelműen detektálható DNS-hasító aktivitás szigorú U-DNS specificitást mutat. Megjegyzendő, hogy a fehérje meglehetősen alacsony specifikus aktivitással rendelkezik, mert csak a DNS-sel összemérhető koncentrációban fél-egy órán át inkubálva detektálható szignifikáns DNS-fogyás. Továbbá a reakciót követő 75°C-on történő denaturáció szükséges ahhoz, hogy a degradáció agaróz gélen detektálhatóvá váljon, ami azt sugallja, hogy az enzim csak az egyik DNS-szálon vág. Az irodalmi példákból tanulva, minden kétséget kizáróan meg kívántuk mutatni, hogy a detektált U-DNS specifikus aktivitás az UDE fehérje sajátja, és nem kis mennyiségben esetleg szennyező, nagy specifikus aktivitással bíró bakteriális UNG fehérje aktivitásának köszönhető. Ezért az UNG és az UDE aktivitását összehasonlító elemzésnek vetettük alá. Emellett Pukáncsik Mária és Leveles Ibolya ung- sejtekben is előállították a rekombináns His-UDE-t, ami éppúgy U-DNS-re specifikus nukleáz aktivitást mutatott. Az agaróz géles tesztben az UNG-gal összehasonlítva egyértelmű különbségként tapasztaltam, hogy egy szimpla glikoziláz reakció nyomán nem detektálható száltörés pusztán a hődenaturáció következtében, azonban 60 mM NaOH-dal 75°C-on inkubálva igen (38.C,D ábra). A bemutatott UDE aktivitás hátterében elképzelhető egy UNG-APE kombinált reakció is, amely esetén detektálhatók lennének a keletkező bázismentes helyek (aldehid reaktív próba (ARP) teszt [29]) ill. a felszabaduló uracil (tömegspektrometriás analízis). Azonban ezek közül egyiket sem sikerült kimutatni az UDE reakció esetén, míg az UNG reakció mindkét módszerrel pozitív eredményt adott (39.A,B ábra). Az ARP (aldehid reaktív próba) tesztet Pukáncsik Mária és Leveles Ibolya végezte, míg a tömegspektrometriás mérést kollaborációban Kele Zoltán kivitelezte. Ezek után meggyőzően állíthatjuk, hogy a rekombináns UDE szigorúan U-DNS-re specifikus degradáló aktivitással bír (ennek nyomán neveztük UDE-nek), mely nem függ össze eddig ismert U-DNS-t felismerő és hatékonyan processzáló fehérje szennyezéssel. Ugyanakkor az UDE szekvencia sem mutat hasonlóságot semmilyen ismert U-DNS-t felismerő glikozilázzal, sem más nukleáz családokkal. Ezért a jelen fehérje első leírt tagját jelenti egy szerkezetileg és funkciójában is újszerű fehérjecsaládnak, ami alapkutatási szempontból is lényeges új ismeretekkel szolgálhat mind a nukleáz katalízist, mind az uracilfelismerést illetően.

108

109

A fehérje kifejezése során feltűnt, hogy ung- háttéren – de nem úgy ung+ háttéren – az expresszió sikeréhez szükséges a pLysS erős kontroll plazmid (39.C ábra), amit általában bizonyos citotoxicitással bíró fehérjék expressziójához használnak, megakadályozandó a fehérjének az indukció előtt esetlegesen fellépő alapszintű kifejeződését. Az ábrán látható, hogy a dUTPáz kifejezéshez ez a kontroll plazmid nem szükséges, sem ung-, sem ung+ háttéren. Ez arra utal, hogy az UDE aktivitása az ung- sejtek DNS-ének megnövekedett uraciltartalma következtében ártalmas lehet a sejtre nézve, ami további megerősítést jelent a fehérje fentiekben bemutatott, nem UNG-szerű, U-DNS specifikus degradáló aktivitása mellett. Mivel a detektált alacsony specifikus aktivitás hátterében állhat, hogy a fehérje számára nem optimálisak a reakciókörülmények, az enzimreakciót több körülményben is teszteltük. Viszonylag széles pH-tartományban nem mutat számottevő pH-függést (eredmény nincs közölve). Fémionok hatását vizsgálva azt találtuk, hogy a rekombináns UDE EDTA jelenlétében is hasonló aktivitást mutat, mint Mg2+ jelenlétében (40.A ábra, Leveles Ibolya gélje), ami relatív fémfüggetlenségre utal. Azonban néhány fémion, mint a Ca2+, a Zn2+ vagy a Cd2+ a fehérjét egyértelműen gátolni képes (40.B ábra, Leveles Ibolya gélje). Az alacsony specifikus aktivitás azonban fiziológiás jelentőséggel is bírhat, mivel egy DNS-hasító aktivitás potenciálisan nagy veszélyt jelenthet a sejt számára, amennyiben kontrollálatlanul működik. Elképzelhető, hogy bizonyos poszt-transzlációs módosítások vagy kölcsönható fehérje partnerek, esetleg más celluláris körülmények képesek aktiválni a fehérjét. Azonban egy relatíve alacsony fokú aktivitás is elégséges lehet ahhoz, hogy a fehérje betöltse a fiziológiás szerepét; sőt elképzelhető, hogy egy nagyobb aktivitás esetleg a sejtre nézve ártalmas is. Érdekes tapasztalatom, melyet később Leveles Ibolya mérései is megerősítettek, hogy az UDE UGI-val részben gátolható (40.C ábra). Az UGI fehérjét az UNG specifikus inhibitoraként ismerjük, de létezik irodalmi adat arra, hogy pl. a humán SMUG1-et is képes részben gátolni [132], valamint Drosophila extraktumból is mértek UGI-val részben gátolható UDG aktivitást [144], jóllehet az nem származhatott az UNG fehérjétől. Az UDE katalizált reakció során keletkező termékek részletesebb analízisét is megkezdtük. Egyelőre Haracska Lajos kutatócsoportjával kollaborációban radioaktívan jelölt, az uracilt meghatározott helyen tartalmazó oligonukleotid szubsztrátokat kezeltek UDE-val, majd a termékeket nagyméretű, szekvenáló gélen választották el, denaturáló körülmények között.

110

Ebből az előzetes kísérletből az UDE aktivitás szigorú U-DNS specifikus volta mellett megerősítést nyert, hogy az UDE a DNS-nek csak az uracilt tartalmazó szálát hasítja, a komplementer szálat érintetlenül hagyja (40.D ábra). Továbbá úgy tűnik, hogy az enzim az

111

uraciltól mind 5’, mind 3’ irányban képes hasítást katalizálni a cukor-foszfát gerincen (40.D ábra). A katalízis pontos helyének meghatározására a csoportban további kísérleteket tervezünk, melyek módszertanilag részben az itt bemutatott előzetes kísérleten alapulnak (ld. 4.12.3. fej.).

5.2.6. A rekombináns UDE fehérje szerkezetének jellemzése Az UDE szekvencia elemzése nem mutat szignifikáns hasonlóságot egyetlen ismert szerkezetű fehérjével sem, és ismert domén sem detektálható benne. Ezért értelemszerűen azonnal elkezdtük a fehérje kristályosítását is, azonban a fehérje DNS-nélkül meglehetősen instabil, nagyban kitett kontrollálatlan proteolízis veszélyének is, ezért a minták fokozatos heterogénné válása eddig megakadályozta a kristályosítást. Megoldást jelentene, ha megfelelő szubsztrátanalóggal együtt tudnánk kristályosítani, aminek tervezéséhez a katalízis részleteiről való információgyűjtés még folyamatban van. A szerkezettel kapcsolatban eddig a fehérje doménanalízisét, ill. az 1A és 1B fragmensek szerkezetmodellezését végeztük el.

5.2.6.1. A fehérje doménanalízise Limitált emésztési kísérletekben lehetőség nyílt feltérképezni az UDE fehérje doménszerkezetét, ami nagy segítséget jelent a fehérje bizonyos fragmenseinek kristályosításához is. Megmutattuk, hogy a DNS-kötés általában is védi az UDE-t a proteolízissel szemben. Tripszin esetén a lehetséges hasítóhelyek száma nagy (67) – ráadásul ezekből nagyon sok a minden valószínűség szerint kitett, nem-konzervált terminális régiókon található -, így a nagyszámú fragmens azonosítására nem volt lehetőség. A Pukáncsik Mária által készített gélen (41.A ábra) azonban látható, hogy DNS jelenlétében a limitált tripszinolízis megáll egy 23 kD-nál jelentkező fragmensnél, ami a fehérjének egyfajta aktív magját alkothatja. Az UDE DNS-kötése hasonló védelmet nyújt a kimotripszines emésztéssel szemben is (Pukáncsik Mária eredménye, nincs közölve), de a lehetséges hasító helyek nagy száma (63) miatt ez esetben sem azonosítottuk a preferált kötő helyeket.

112

113

Továbbá az UDE-t a kimotripszines emésztéssel szemben az UGI is védi, ugyanakkor a kötődés hatására egy új kimotripszin hasító hely válik elérhetővé (41.B ábra, Pukáncsik Mária által végzett kísérlet). Ez az eredmény szintén alátámasztja az UGI fehérje és az UDE közti, előző fejezetben említett, specifikus kölcsönhatás létét. Az UGI kötődés hatására megjelenő új kimotripszines fragmens azonosítása még folyamatban van. Specifikus fragmensek azonosítása végett két további proteolitikus enzimet választottam, melyek lényegesen kevesebb potenciális hasító hellyel bírnak az UDE szekvencián. Így nagy specificitású kimotripszinnel (19 potenciális hely, F, Y és W aminosavaktól C-terminális irányba eső peptidkötés hasad) valamint Asp-N endoproteinázzal (21 potenciális hely, D-től N-terminális irányba eső peptidkötés hasad) is elvégeztem a limitált emésztést (41.C,D ábra), és tömegspektrometriával azonosítottuk a preferált hasítóhelyeket is. A tömegspektrometriás méréseket Klement Éva végezte. Az aminosavak számozása a His-UDE szekvencia szerint történt, az UDE szekvencián ugyanezek a helyek 14-gyel kisebb számúak. Összevetve e két proteáz által preferált helyeket DNS jelenlétében és távollétében (41.E ábra), a következő tanulságok vonhatók le. 1. A terminális régiók a W24-ig, ill. a D347-től feltehetőleg flexibilis szakaszok, ahol a proteázok DNS jelenlétében és távollétében egyaránt könnyen hasítanak. 2. Az 1A és 1B motívumot tartalmazó Nterminális régió DNS nélkül gyorsan degradálódik, míg a DNS-kötés megvédi a proteolízistől. Így a fehérje N-terminális része nagy valószínűséggel részt vesz a DNSkötésben. A F118 és E119 közti peptidkötés hasadása a DNS-kötés hatására válik preferálttá, ami az N-terminális régió DNS-kötés által indukált konformációváltozására utal. Konformációváltozás történhet a C-terminálison is, ahol a Y325 és I326 közti peptidkötés szintén a DNS-kötés hatására válik hozzáférhetővé a kimotripszin számára. 3. A fehérje 2-4 motívumokat tartalmazó C-terminális része különösen kompakt lehet, mert sem DNS-sel, sem DNS nélkül nem azonosítottunk rajta preferált hasító helyet. Az enzimes emésztés mellett hidroxilaminnal is végeztem emésztési kísérletet a rekombináns His-UDE fehérjén. Ez egyrészt azért érdekes, mert a relatíve durva kísérleti körülmények közt (pH = 9,5) is az UDE natívhoz közeli állapotban maradt, legalábbis megtartotta DNS-kötő képességét, amint azt a detektált DNS-protekció jelzi (42.A ábra). Másrészt a hidroxilamin egyetlen potenciális hasító hellyel bír az UDE szekvencián (az N125 és G125 közti peptidkötés hasad), ami épp az 1A és 1B motívumok közé esik (ld. 41.E ábra, „HA N125” jelzés). A hasítással lehetővé vált az 1B-4 motívumokat tartalmazó C-terminális fragmens Ni-NTA oszlopon történő egyszerű tisztítása további vizsgálatok céljából (42.B 114

ábra). A reakcióelegyet Ni-NTA oszlopra injektáltam, ahol az intakt UDE és az N-terminális fragmens His-címkéjének köszönhetően kikötődött. A C-terminális fragmens a várakozással ellentétben nem az átesőben eluálódott, ami azt jelentheti, hogy továbbra is köti vagy az Nterminális fragmenst, vagy az intakt UDE-t. A fragmenst 1 M KCl-ot tartalmazó pufferrel eluálni tudtam. A tiszta fragmens gél-elektroforetikus mobilitási tesztben kimutatható DNSkötő képességgel bír (41.C ábra, a közölt gélt Pukáncsik Mária készítette). A hidroxilaminos hasítás lehetősége, a fragmensek izolálhatósága, valamint a C-terminális fragmens megőrzött DNS-kötő képessége, az 1A és 1B-4 motívumokat tartalmazó régiók relatív autonómiájára is utal, feltehetőleg ezeket a fehérje önálló doménjeinek tekinthetjük.

5.2.6.2. Az 1A és 1B fragmensek de novo szerkezetmodellezése A szekvencián számos elérhető másodlagos szerkezet predikciós szoftvert futtatva minden esetben alapvetően α-helikális szerkezet adódott, amit Pukáncsik Mária által a csoportban végzett CD spektroszkópiás mérések is alátámasztanak (eredmény nincs közölve).

115

Lengyel kollaboráló partnerünk, Janusz Bujnicki és Jan Kosinski az általam készített homológokkal való összerendezést és az általuk is végzett másodlagos szerkezet predikciókat alapul véve a fehérje harmadlagos szerkezetét kísérelte meg modellezni (GeneSilico Metaserver). Mivel ismert szerkezetű homológok híján homológiamodellezés nem volt lehetséges, először gombolyfelismeréssel (fold recognition) próbálkoztak: a homológ fehérjék szekvencia-összerendezését (mind a teljes fehérje, mind az 1A ill. 1B fragmens külön-külön, ill. egymáshoz rendezett, továbbá a 2-4 motívumokat tartalmazó C-terminális szekvenciák esetén) a metaszerveren keresztül számos gombolyfelismerő programmal analizálták, mégsem sikerült olyan ismert felgombolyodási mintázatot találni, mely az UDE szekvenciának, ill. a fragmenseknek megfelelő lett volna. Ez szintén azt sugallja, hogy a jelen munkában újonnan azonosított UDE fehérje nemcsak funkciójában, de szerkezetében is merőben újszerű. Ezután az 1A és 1B motívumok szekvenciabeli és prediktált másodlagos szerkezetbeli hasonlósága miatt reménytelinek tűnt a két fragmens szerkezetének de novo predikciója ROSETTA módszerrel, felhasználva a prediktált másodlagos szerkezeti elemeket is. A két szekvenciára külön-külön modellezett nagyszámú (10.000-30.000) alternatív szerkezetet hierarchikus klaszterező algoritmussal hasonlósági alapon csoportosították. A legnépesebb klasztert összehasonlítva a két függetlenül modellezett szerkezet egymásnak jól megfeleltethető (43.A,B ábra), ami megerősíti a modell szerkezetek relevanciáját. A modell szerint az első két homológ motívum/domén egyaránt három α-hélixből álló kötegbe rendeződik, melyek azonos topológiával és a hélixek azonos relatív orientációjával jellemezhetők (43.A,B ábra). A fragmenseket reprezentáló szerkezet részletesebb analízise során kitűnt egy összefüggő konzervált felszín (43.C ábra), mely egy hidrofób jellegű, de oldószernek kitett, ill. egy pozitívan töltött részből áll. A hidrofób felszín feltehetőleg a két domén és/vagy a fehérje további része közti kölcsönhatások színtere, a két fragmensben pozitívan töltött felszínek pedig a DNS-kötő és/vagy aktív hely kialakításában játszhatnak szerepet. Végül a fehérje C-terminális részére de novo nem sikerült megbízható modellt felállítani. A szerkezetmodellezés eredmények A fehérje háromdimenziós térszerkezetének meghatározása, valamint az aktivitásban fontos szerepet játszó aminosavak irányított mutagenezissel történő azonosítása a csoportunkban jelenleg folyamatban van.

116

117

5.2.7. Az UDE fehérje fejlődésbiológiai szerepének jellemzése

5.2.7.1. Az UDE fehérje kifejeződése a különböző szövetekben az egyedfejlődés során. Muha Villő által végzett kísérletben az S2 sejtekben kifejezett UDE-YFP konstrukt valóban magi lokalizációt mutat (44. ábra), ahogy ez a szekvencia C-terminálisán található két feltételezett NLS alapján várható volt.

A rekombináns UDE fehérje ellen nyulakban termeltetett antiszérum (ld. 4.7.1. fej.) birtokában vizsgáltuk a fehérje kifejeződését különböző szövetekben, ill. az egyedfejlődés különböző stádiumaiban. Azt találtuk, hogy UDE nem fejeződik ki detektálható mennyiségben a késői 3. stádiumú lárva diszkuszokban, míg a metamorfózis során halálra ítélt lárvális szövetekben egyértelműen detektálható (45.A ábra, Zagyva Imre blotja). Ez az apoptózissal korreláló szöveti eloszlás arra utal, hogy az UDE feltehetőleg nem egy, a hiányzó UNG-ot helyettesítő, U-DNS-t javító fehérje, amire a fejlődés során a különböző szövetekben egyaránt szükség lenne. A fehérje expressziós szintjét követtem Western bloton végig a fejlődés során (45.B ábra). Az UDE szigorúan a bábállapotokban ill. az azt közvetlen megelőző késői 3. lárva stádiumban detektálható csupán, ill. a felnőtt légyben lényegesen alacsonyabb szinten némileg eltolódott sávban látható jel. Az UDE aktivitását így inkább a bábállapotokban zajló programozott sejthalál folyamatokhoz köthetjük. Zagyva Imre által végzett kísérletben ugyanakkor a felnőtt legyekben az UDE nem volt detektálható (45.C ábra). Később Muha Villő - a bábállapot finomabb felbontásával végzett Western bloton -

118

kimutatta, hogy a bábállapotban végig konstitutívan jelenlévő UDE a bábból való kikelés után 5 percen belül gyorsan eliminálódik (eredmény nincs közölve). Továbbá a blotokon a fehérje rekombináns és fiziológiás formáinak látszólagos molekulatömegei közt szolid mértékű különbség figyelhető meg (45.A,B,C ábra), mely hátterében esetleges poszttranszlációs módosítás állhat. Ennek azonosítása a csoportban jelenleg folyamatban van.

Megjegyzendő, hogy az UDE fehérje celluláris koncentrációja meglehetősen alacsonynak tűnik, bár ezirányú kvantitatív mérések még folyamatban vannak.

119

5.2.7.2. Az UDE kifejeződésének szabályozása Drosophila-ban Félkvantitatív RT-PCR kísérletben az UDE mRNS kifejeződését követem a Drosophila egyedfejlődése során (46.A ábra). Azt tapasztaltam, hogy szemben a fehérje szigorúan bábállapothoz köthető kifejeződésével, az mRNS a fejlődés egész folyamán jelen van, ami a génkifejeződés poszt-transzkripciós szabályozására utal.

Muha Villő kísérletében ugyanakkor az UDE gén transzkripciója S2 sejtek ekdizon hormonra adott válaszában indukálódik (46.B ábra). Ez az indukció a korai gén BR-C („Broad Complex”, ekdizon indukálta korai gén) RNS-éhez viszonyítva későbbi fázisban jelenik meg, ami ekdizon indukált korai gének közvetítő szerepére utal. Villő továbbá in silico azonosított egy β-FTZ F1 kötő helyet (F1RE) a feltételezett promóter régióban, valamint hasonló helyeket talált a homológ gének esetén is. A β-FTZ F1 specifikus transzkripciós faktor funkciója a bábállapothoz és programozott sejthalálhoz köthető [211]. Az ekdizon általi indukálhatóságot és az mRNS folyamatos jelenlétét egyaránt figyelembe véve azt mondhatjuk, hogy az UDE fehérje a bábállapotokat közvetlenül megelőző késői 3. lárva stádiumban, feltehetőleg a meglévő mRNS poszt-transzkripciós szabályozása révén jelenik meg, ugyanakkor a prepupa szakaszt indító ekdizon impulzus erősítheti az UDE 120

mRNS-ének transzkripcióját. A két folyamat együttesen járulhat hozzá a bábállapotokban detektált magasabb UDE fehérje szint kialakulásához. Megjegyzendő, hogy a lehetséges poszt-transzkripciós szabályozási mechanizmusok közül érdemes lesz számbavenni a mikro RNS-ek szerepét, mivel a Drosophila-ban azonosított mikro RNS-ek közül négy is megfelelő az UDE transzkriptnek.

5.2.7.3. Az UDE aktivitás lehetséges szerepe a metamorfózis során zajló sejthalál folyamatokban. A fentiekben bemutattuk az UDE szigorúan U-DNS-re specifikus aktivitását és a bábállapotokban elhaló lárvális szövetekben való egyoldalú kifejeződését. Ezek az eredmények jól egybecsengenek a fehérje sejthalál folyamatokban betöltött feltételezett szerepével. Természetesen a fehérje szerepének teljes megértését csak UDE mutáns Drosophila törzsek fenotípusának karakterizálása adhatja meg, mely törzsek előállítása a csoportban jelenleg folyamatban van. Sajnálatos módon a FlyBase adatbázisban megtalálható két UDE nullmutánsnak, ugyanakkor életképesnek feltüntetett törzsről kiderült, hogy valójában nem UDE-mutánsok, ugyanis Muha Villő ki tudta mutatni belőlük az UDE fehérjét Western bloton. Másik vonalon az U-DNS Drosophila egyedfejlődésében betöltött szerepét egy „U-DNS nullmutáns” törzs jellemzésével ragadhatjuk meg leginkább, ennek érdekében pedig dUTPázt túlkifejező ill. a lárvális szövetekben is kifejező transzgenikus törzs létrehozásán dolgozunk. Az első transzgenikus törzsek sajnos csak mRNS-szinten mutattak túlkifejeződést, fehérje szinten csak a diszkuszokban, ami a dUTPázt poszt-transzkripciósan szabályozó mechanizmus hatékonyságát erősíti meg. Mindemellett eddigi ismereteink fényében megpróbálhatjuk elhelyezni az UDE fehérjét az irodalomban fellelhető metamorfózishoz kapcsolt sejthalál folyamatok komponenseinek hálózatában. Leszögezem, hogy alábbi spekuláció nem eredmény jellegű, csupán munkahipotézisként szolgál a további kutatás számára. Figyelembe véve az UDE aktivitás jellegzetességeit (egy szálon való vágás, alacsony specifikus aktivitás), továbbá a DNS-ben felhalmozódó uracil feltehetőleg viszonylag kis mennyiségét, nem valószínű, hogy az UDE a CAD-hoz hasonló effektív DNS degradáló szereppel bírna a programozott sejthalál folyamatában. Az UDE aktivitás sokkal inkább az ún. „nagyskálájú” DNS vágásban játszhat szerepet, ami rendszerint a programozott sejthalál folyamatában még a kaszpáz kaszkád indukálódása előtt történik [224]. Ugyanakkor az apoptózis eme korai szakaszában 121

bekövetkező DNS-hasítás DNS-hibaként is megjelenhet, ami felerősített apoptotikus jelet eredményezhet [224]. Az irodalomban az ekdizon válaszban megjelenő korai gének között az E93-at ill. ennek kifejeződését is szabályozó β-FTZ F1 fehérjéket azonosították, mint az ekdizonválaszt a sejthalál irányába vivő specifikus faktorokat (ld. 3.2.3.2. fej.) [212]. A továbbiakban feltétlenül vizsgálni fogjuk az UDE fehérje aktivitásának és a már azonosított sejthalál

útvonal

komponensek

kapcsolatát,

jelátviteli

és

molekuláris

biológiai

megközelítésben egyaránt. Érdemes megjegyeznem, hogy az irodalomban fellelhető nagyáteresztő képességű genomikai és proteomikai módszerek (ld. 3.2.3.2. fej.) nem voltak képesek az UDE szerepét detektálni a bábállapotban zajló sejthalál folyamatokban [216, 217]. Ennek fényében az UDE jelen azonosítása még nagyobb jelentőséget kap. A dolgozatban bemutatott eredmények jelentős evidenciával szolgálnak a fehérje bábállapotban való jelenlétéről és U-DNS specifikus degradáló aktivitásáról egyaránt. Azt gondolom, hogy „poszt-genomi” korunkban is elengedhetetlen az egyedi fehérjék tudás alapú kutatása. Nem szabad szem elől tévesztenünk, hogy a nagy áteresztő képességű technikák sem mindenhatók, és előfordulhat, hogy általuk éppen a kis mennyiségben jelen levő, finoman szabályozott, ugyanakkor esetleg lényeges jelző szereppel bíró molekulák csúsznak ki a kezünkből.

5.2.7.4. Az UDE lehetséges alkalmazási területei

Az UDE egyedülálló specifikus aktivitása révén számos alkalmazási lehetőséggel kecsegtet, ahogy ezt a témában beadott szabadalmunk is jelzi [283]. Az UDE alkalmazható lehet mutagenezis eljárásokban, amennyiben uraciltartalmú előzőleg dut-/ung- mutáns sejtekben előállított (ld. 4.12.1. fej.) - vadtípusú plazmid DNS templátot használunk, a vadtípusú DNS az UDE katalízis révén szelektíven lebontható a mutációt tartalmazó DNS mellől. A

különböző

biotechnológiai

eljárások

során

előállított

rekombináns

DNS

környezetszennyező potenciáljának veszélyeit csak most méri fel a tudományos világ. Az UDE a potenciálisan veszélyt jelentő DNS eliminálásában is alkalmazható lenne (enzim tartalmú tisztítószerek), amennyiben az ilyen DNS-t uracil tartalommal állítanánk elő. Az UDE feltehetőleg esszenciális szereppel bír a teljes átalakulással fejlődő fajok egyedfejlődésében, ugyanakkor az élővilágnak csupán ezen részében található. Így a fehérje

122

kiváló célpontként szolgálhat olyan kártékony, vagy emberre is veszélyes kórokozókat hordozó rovarok specifikus irtásában, mint a maláriát terjesztő Anopheles szúnyogok, vagy a sárgalázt okozó Aedes szúnyogok. Többek közt ez a lehetséges alkalmazás is sürgeti az UDE fejlődésbiológiai szerepének behatóbb tanulmányozását, amelyhez a jelen munkában megtettük az első kritikus lépéseket. Az UDE továbbá jó eséllyel alkalmazható lehet olyan molekuláris diagnosztikai eljárásokban, mint a valós idejű PCR (RT-PCR, Q-PCR). Ez az eljárás az adott betegséggel összefüggő mutációt hordozó RNS kvantitatív kimutatását célozza, megfelelő kontrollok mellett a pontos kópiaszámot is meg lehet állapítani. Az eljárásban, a PCR ciklusokban a templáthoz fluoreszcens jelölt próba is hibridizál, mely elbomlása a fluoreszcencia megjelenésével jár, így a PCR-ben felszaporított specifikus szekvencia mennyisége egyenesen arányos a megjelenő fluoreszcens jel intenzitásával. Amennyiben uraciltartalmú oligo-próbát jelölnénk mindkét végén, egymás fluoreszcenciáját az oligo hosszának megfelelő távolságon belül kioltó csoportokkal, az UDE alkalmazható lehet a próba specifikus degradálásában. Továbbá a génterápia fejlődésével, mind az UDE fehérje, mind a dUTPáznak esetleges reguláló fehérjéi alkalmazhatók lehetnek a timinmentes sejthalált kiváltó rákterápiás módszerekkel kombinálva, vagy akár önmagukban is.

123

6. Összefoglalás, konklúzió Munkám első részében [284] a Drosophila dUTPáz fejlődés során történő szabályozását vizsgáltam. A dUTPáz mRNS-ének és fehérjeszintjének ellentmondásos szabályozása, az azonosított két izoforma sejtbeli lokalizációjának sajátságai, dUTPázaktiváló hatás kimutatása sejtextraktumból, valamint a sejtciklushoz kötött kifejeződés már utalt arra, amit felszíni plazmon rezonancia kísérletekben és far-Western technikával is megerősítettünk: a dUTPáznak több makromolekuláris/fehérje-partnere is létezik Drosophila melanogaster-ben. Affinitás kromatográfiával izoláltam számos lehetséges fehérjepartnert, melyek között több DNS-javítással és/vagy apoptózissal kapcsolatba hozható fehérje is található. Eme feltételezett kölcsönhatások megerősítése és jelentőségüknek tisztázása a csoportban jelenleg is folyik. A

dUTPáz

expressziója

Drosophila-ban

szokatlan

képet

mutat:

a

fehérje

lárvaállapotokban gyakorlatilag nem detektálható Western bloton. Immuno-hisztokémiai kísérleteinkben azonban látható, hogy a maradék dUTPáz az imaginális diszkuszokban lokalizálódik. Eme sejtcsoportokból fejlődnek ki a felnőtt légy szervei a metamorfózis során. Azok a lárvális szövetek, amik a bábállapotban elhalnak, nem tartalmaznak dUTPázt, holott DNS szintézis ezekben a sejtekben is van; ugyan sejtosztódás nélkül, nagy politén kromoszómákat eredményezve. dUTPáz hiányában valószínűnek tűnik, hogy a DNSszintéziskor jelentős mennyiségű uracil is beépül. Ez az uraciltartalom azért nem okoz azonnal sejthalált, mert a Drosophila genomból hiányzik a fő UDG gén. Így a timin helyett beépült uracil elvileg nem jelentkezik hibaként. A feltételezett uraciltartalmat is sikerült kimutatnom harmadik stádiumú lárvákból izolált genomi DNS-ben.

124

Munkám másik felében [285] harmadik stádiumú lárva extraktumban azonosítottam az U-DNS specifikus nukleáz aktivitást. Ezt követően, affinitás kromatográfiás kísérletben izoláltam több feltételezett U-DNS kötő fehérjét késői harmadik stádiumú lárvából. Az azonosított fehérjéket in silico elemeztem: a gélen a legintenzívebb sávban azonosított CG18410 géntermék ismeretlen funkciójú, és homológjai csupán teljes átalakulással fejlődő rovarok genomjaiban találhatók. Hat homológ szekvencia összerendezésével öt konzervált régió tűnt ki: az első kettő egymáshoz is hasonlító, kiterjedtebb szakaszt inkább doméneknek gondolhatjuk, míg a másik három rövidebb motívum. A konzervált részek ismeretében sem sikerült semmi hasonlóságot találni más ismert szerkezetű és funkciójú fehérje családokkal. A szekvencia alapján továbbá valószínűsíthető volt a fehérje magi lokalizációja. 125

A gén klónozása és expressziója után a rekombináns fehérjét pozitív eredménnyel teszteltem az extraktumból kimutatott U-DNS specifikus nukleáz aktivitásra. Az aktivitást részletesebben is jellemeztem: U-DNS-re szigorúan specifikus, a DNS-nek csak egyik szálát vágja el, továbbá relatíve fémion-független, bár egyes kétértékű fémionok jelentősen képesek gátolni. Kizártuk továbbá egy esetleges UNG szennyezés lehetőségét: egyrészt ungsejtekben termelt UDE is mutatta a specifikus aktivitást, másrészt három független módszerrel is összehasonlítottuk az UDE és UNG aktivitásokat, melyek minden alkalommal egyértelműen különböztek egymástól. Szerkezetvizsgálatát illetően limitált emésztéssel megmutattuk, hogy a fehérje számára bizonyos védelmet jelent a proteolízissel szemben a DNS-kötés. A preferált hasítóhelyek meghatározásával analizáltam az UDE doménszerkezetét. Továbbá a hidroxilaminnal hasított, 1B-4 motívumokat tartalmazó fragmens DNS-kötő képességét is kimutattuk. Kollaborációban a másodlagos szerkezet predikcióján túl az első két fragmens szerkezetét de novo modelleztük. Specifikus poliklonális ellenanyag birtokában jellemeztük a fehérje expressziós mintázatát az ecetmuslica egyedfejlődése során, illetve a különböző szövetekben. Az UDE detektálható mértékben késői harmadik lárvastádiumban jelenik meg először, bábállapotban magas az expressziója, majd a felnőtt légyben hamar lecseng. Félkvantitatív RT-PCR kísérletben az UDE mRNS többé-kevésbé konstitutív szintjét detektáltam végig a Drosophila egyedfejlődése során, ezért a csupán bábállapotban tapasztalt fehérjeexpresszió feltehetőleg poszt-transzkripciós szabályozás eredménye. Emellett azonban az UDE transzkripció indukálható ekdizonnal is. Az általam azonosított UDE fehérjéről feltételezhető, hogy a lárvákban felhalmozódó genomi U-DNS elsődleges felismerője a 3. lárva állapot végén. Az U-DNS-en az UDE által katalizált száltörések erős apoptotikus jelet szolgáltathatnak a metamorfózis során halálra ítélt lárvális szövetekben. Az UDE azonosításával első ízben vált lehetővé a metamorfózis alatt zajló programozott sejthalál enzimológiai/biokémiai vizsgálata az eddig alkalmazott fejlődésbiológiai/genetikai megközelítés mellett. A most azonosított U-DNS nukleáz rengeteg további izgalmas kérdést vet fel: az UDNS hasítás pontos jellemzésétől a teljesen új fehérjecsalád nagyfelbontású szerkezetének megoldásáig, egy nullmutáns élettani hatásától a fehérje biotechnológiai alkalmazásáig valóban tág lehetőség nyílik a gyakorlatban is hasznosítható alapkutatás számára.

126

7. Irodalomjegyzék 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

Takahashi, I. and J. Marmur, Replacement of thymidylic acid by deoxyuridylic acid in the deoxyribonucleic acid of a transducing phage for Bacillus subtilis. Nature, 1963. 197: p. 794-5. Warner, H.R., et al., Synthesis and metabolism of uracil-containing deoxyribonucleic acid in Escherichia coli. J Bacteriol, 1981. 145(2): p. 687-95. Honjo, T., et al., AID to overcome the limitations of genomic information. Nat Immunol, 2005. 6(7): p. 655-61. Deutsch, W.A., Why do pupating insects lack an activity for the repair of uracilcontaining DNA? One explanation involves apoptosis. Insect Mol Biol, 1995. 4(1): p. 1-5. Nation, M.D., et al., Control of Drosophila deoxyuridine triphosphatase. Existence of a developmentally expressed protein inhibitor. Biochem J, 1989. 259(2): p. 593-6. Deutsch, W.A. and A.L. Spiering, A new pathway expressed during a distinct stage of Drosophila development for the removal of dUMP residues in DNA. J Biol Chem, 1982. 257(7): p. 3366-8. Dudley, B., A. Hammond, and W.A. Deutsch, The presence of uracil-DNA glycosylase in insects is dependent upon developmental complexity. J Biol Chem, 1992. 267(17): p. 11964-7. Morgan, A.R. and J. Chlebek, Uracil-DNA glycosylase in insects. Drosophila and the locust. J Biol Chem, 1989. 264(17): p. 9911-4. Pearl, L.H. and R. Savva, The problem with pyrimidines. Nat Struct Biol, 1996. 3(6): p. 485-7. Lindahl, T., Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 1993. 362(6422): p. 709-15. Lehmann, A.R., DNA repair-deficient diseases, xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Biochimie, 2003. 85(11): p. 1101-11. Ishikawa, T., et al., Importance of DNA repair in carcinogenesis: evidence from transgenic and gene targeting studies. Mutat Res, 2001. 477(1-2): p. 41-9. Hanawalt, P.C., Transcription-coupled repair and human disease. Science, 1994. 266(5193): p. 1957-8. Bernstein, C., et al., DNA repair/pro-apoptotic dual-role proteins in five major DNA repair pathways: fail-safe protection against carcinogenesis. Mutat Res, 2002. 511(2): p. 145-78. Berardi, P., et al., Functional links between transcription, DNA repair and apoptosis. Cell Mol Life Sci, 2004. 61(17): p. 2173-80. Li, G.M., The role of mismatch repair in DNA damage-induced apoptosis. Oncol Res, 1999. 11(9): p. 393-400. Horsfall, M.J., A. Borden, and C.W. Lawrence, Mutagenic properties of the T-C cyclobutane dimer. J Bacteriol, 1997. 179(9): p. 2835-9. Tu, Y., R. Dammann, and G.P. Pfeifer, Sequence and time-dependent deamination of cytosine bases in UVB-induced cyclobutane pyrimidine dimers in vivo. J Mol Biol, 1998. 284(2): p. 297-311. Krokan, H.E., F. Drablos, and G. Slupphaug, Uracil in DNA--occurrence, consequences and repair. Oncogene, 2002. 21(58): p. 8935-48. Guillet, M. and S. Boiteux, Origin of endogenous DNA abasic sites in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 2003. 23(22): p. 8386-94. Krokan, H.E., R. Standal, and G. Slupphaug, DNA glycosylases in the base excision repair of DNA. Biochem J, 1997. 325 ( Pt 1): p. 1-16.

127

22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42.

Shen, J.C., W.M. Rideout, 3rd, and P.A. Jones, High frequency mutagenesis by a DNA methyltransferase. Cell, 1992. 71(7): p. 1073-80. Longerich, S., et al., AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr Opin Immunol, 2006. 18(2): p. 164-74. Wu, X., et al., Immunoglobulin somatic hypermutation: double-strand DNA breaks, AID and error-prone DNA repair. J Clin Immunol, 2003. 23(4): p. 235-46. Fogg, M.J., L.H. Pearl, and B.A. Connolly, Structural basis for uracil recognition by archaeal family B DNA polymerases. Nat Struct Biol, 2002. 9(12): p. 922-7. Mosbaugh, D.W., Purification and characterization of porcine liver DNA polymerase gamma: utilization of dUTP and dTTP during in vitro DNA synthesis. Nucleic Acids Res, 1988. 16(12): p. 5645-59. Traut, T.W., Physiological concentrations of purines and pyrimidines. Mol Cell Biochem, 1994. 140(1): p. 1-22. Goulian, M., B. Bleile, and B.Y. Tseng, The effect of methotrexate on levels of dUTP in animal cells. J Biol Chem, 1980. 255(22): p. 10630-7. Lari, S.U., et al., Quantitative determination of uracil residues in Escherichia coli DNA: Contribution of ung, dug, and dut genes to uracil avoidance. DNA Repair (Amst), 2006. 5(12): p. 1407-20. Nyman, P.O., Introduction. dUTPases. Curr Protein Pept Sci, 2001. 2(4): p. 277-85. Weiss, B. and L. Wang, De novo synthesis of thymidylate via deoxycytidine in dcd (dCTP deaminase) mutants of Escherichia coli. J Bacteriol, 1994. 176(8): p. 2194-9. Rogstad, D.K., et al., Endogenous DNA lesions can inhibit the binding of the AP-1 (cJun) transcription factor. Biochemistry, 2002. 41(25): p. 8093-102. Klarmann, G.J., et al., Incorporation of uracil into minus strand DNA affects the specificity of plus strand synthesis initiation during lentiviral reverse transcription. J Biol Chem, 2003. 278(10): p. 7902-9. el-Hajj, H.H., L. Wang, and B. Weiss, Multiple mutant of Escherichia coli synthesizing virtually thymineless DNA during limited growth. J Bacteriol, 1992. 174(13): p. 4450-6. Kovari, J., et al., Altered active site flexibility and a structural metal-binding site in eukaryotic dUTPase: kinetic characterization, folding, and crystallographic studies of the homotrimeric Drosophila enzyme. J Biol Chem, 2004. 279(17): p. 17932-44. Mustafi, D., et al., Catalytic and structural role of the metal ion in dUTP pyrophosphatase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(10): p. 5670-5. Mol, C.D., et al., Human dUTP pyrophosphatase: uracil recognition by a beta hairpin and active sites formed by three separate subunits. Structure, 1996. 4(9): p. 1077-92. McGeoch, D.J., Protein sequence comparisons show that the 'pseudoproteases' encoded by poxviruses and certain retroviruses belong to the deoxyuridine triphosphatase family. Nucleic Acids Res, 1990. 18(14): p. 4105-10. Fiser, A. and B.G. Vertessy, Altered subunit communication in subfamilies of trimeric dUTPases. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 279(2): p. 534-42. Dauter, Z., et al., Crystal structure of dUTPase from equine infectious anaemia virus; active site metal binding in a substrate analogue complex. J Mol Biol, 1999. 285(2): p. 655-73. Vertessy, B.G., Flexible glycine rich motif of Escherichia coli deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase is important for functional but not for structural integrity of the enzyme. Proteins, 1997. 28(4): p. 568-79. McClure, M.A., Evolution of the DUT gene: horizontal transfer between host and pathogen in all three domains of life. Curr Protein Pept Sci, 2001. 2(4): p. 313-24.

128

43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52.

53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61.

Hill, F., D. Loakes, and D.M. Brown, Polymerase recognition of synthetic oligodeoxyribonucleotides incorporating degenerate pyrimidine and purine bases. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(8): p. 4258-63. Bjornberg, O., et al., dUTPase from herpes simplex virus type 1; purification from infected green monkey kidney (Vero) cells and from an overproducing Escherichia coli strain. Protein Expr Purif, 1993. 4(2): p. 149-59. Larsson, G., L.A. Svensson, and P.O. Nyman, Crystal structure of the Escherichia coli dUTPase in complex with a substrate analogue (dUDP). Nat Struct Biol, 1996. 3(6): p. 532-8. Barabas, O., et al., Structural insights into the catalytic mechanism of phosphate ester hydrolysis by dUTPase. J Biol Chem, 2004. 279(41): p. 42907-15. Takacs, E., V.K. Grolmusz, and B.G. Vertessy, A tradeoff between protein stability and conformational mobility in homotrimeric dUTPases. FEBS Lett, 2004. 566(1-3): p. 48-54. Gadsden, M.H., et al., dUTP pyrophosphatase is an essential enzyme in Saccharomyces cerevisiae. Embo J, 1993. 12(11): p. 4425-31. el-Hajj, H.H., H. Zhang, and B. Weiss, Lethality of a dut (deoxyuridine triphosphatase) mutation in Escherichia coli. J Bacteriol, 1988. 170(3): p. 1069-75. Baldo, A.M. and M.A. McClure, Evolution and horizontal transfer of dUTPaseencoding genes in viruses and their hosts. J Virol, 1999. 73(9): p. 7710-21. Caradonna, S. and S. Muller-Weeks, The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Curr Protein Pept Sci, 2001. 2(4): p. 335-47. Ladner, R.D. and S.J. Caradonna, The human dUTPase gene encodes both nuclear and mitochondrial isoforms. Differential expression of the isoforms and characterization of a cDNA encoding the mitochondrial species. J Biol Chem, 1997. 272(30): p. 19072-80. Tinkelenberg, B.A., et al., Identification of sequence determinants of human nuclear dUTPase isoform localization. Exp Cell Res, 2003. 287(1): p. 39-46. Ladner, R.D., et al., Characterization of distinct nuclear and mitochondrial forms of human deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase. J Biol Chem, 1996. 271(13): p. 7745-51. Ladner, R.D., et al., Identification of a consensus cyclin-dependent kinase phosphorylation site unique to the nuclear form of human deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase. J Biol Chem, 1996. 271(13): p. 7752-7. Lirette, R. and S. Caradonna, Inhibition of phosphorylation of cellular dUTP nucleotidohydrolase as a consequence of herpes simplex virus infection. J Cell Biochem, 1990. 43(4): p. 339-53. Bohr, V.A. and R.M. Anson, DNA damage, mutation and fine structure DNA repair in aging. Mutat Res, 1995. 338(1-6): p. 25-34. Mandavilli, B.S., J.H. Santos, and B. Van Houten, Mitochondrial DNA repair and aging. Mutat Res, 2002. 509(1-2): p. 127-51. Miquel, J., R. Binnard, and J.E. Fleming, Role of metabolic rate and DNA-repair in Drosophila aging: implications for the mitochondrial mutation theory of aging. Exp Gerontol, 1983. 18(2): p. 167-71. Hokari, S., et al., Expression of deoxyuridine triphosphatase during liver regeneration in rat. Biochem Mol Biol Int, 1995. 37(3): p. 583-90. Vilpo, J.A., Mitogen induction of deoxyuridine triphosphatase activity in human T and B lymphocytes. Med Biol, 1983. 61(1): p. 54-8.

129

62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82.

Strahler, J.R., et al., Maturation stage and proliferation-dependent expression of dUTPase in human T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(11): p. 4991-5. Giroir, L.E. and W.A. Deutsch, Drosophila deoxyuridine triphosphatase. Purification and characterization. J Biol Chem, 1987. 262(1): p. 130-4. Svejstrup, J.Q., Mechanisms of transcription-coupled DNA repair. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002. 3(1): p. 21-9. Frosina, G., et al., Two pathways for base excision repair in mammalian cells. J Biol Chem, 1996. 271(16): p. 9573-8. Matsumoto, Y., K. Kim, and D.F. Bogenhagen, Proliferating cell nuclear antigendependent abasic site repair in Xenopus laevis oocytes: an alternative pathway of base excision DNA repair. Mol Cell Biol, 1994. 14(9): p. 6187-97. Bowman, K.K., C.A. Smith, and P.C. Hanawalt, Excision-repair patch lengths are similar for transcription-coupled repair and global genome repair in UV-irradiated human cells. Mutat Res, 1997. 385(2): p. 95-105. Chu, R., et al., Cloning and identification of rat deoxyuridine triphosphatase as an inhibitor of peroxisome proliferator-activated receptor alpha. J Biol Chem, 1996. 271(44): p. 27670-6. Nemeth-Pongracz, V., et al., Interacting Partners of M-PMV NucleocapsidDUTPase. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2006. 25(9): p. 1197-200. Price, A.R. and J. Frato, Bacillus subtilis deoxyuridinetriphosphatase and its bacteriophage PBS2-induced inhibitor. J Biol Chem, 1975. 250(22): p. 8804-11. Lindahl, T., DNA glycosylases, endonucleases for apurinic/apyrimidinic sites, and base excision-repair. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1979. 22: p. 135-92. Krokan, H.E., et al., Base excision repair of DNA in mammalian cells. FEBS Lett, 2000. 476(1-2): p. 73-7. Fromme, J.C., Verdine, G. L., Base excision repair, in DNA Repair and Replication, W. Yang, Editor. 2004, Elsevier Academic Press: California. p. 1-41. Wyatt, M.D., et al., 3-methyladenine DNA glycosylases: structure, function, and biological importance. Bioessays, 1999. 21(8): p. 668-76. Seawell, P.C., C.A. Smith, and A.K. Ganesan, den V gene of bacteriophage T4 determines a DNA glycosylase specific for pyrimidine dimers in DNA. J Virol, 1980. 35(3): p. 790-6. Verdine, G.L. and S.D. Bruner, How do DNA repair proteins locate damaged bases in the genome? Chem Biol, 1997. 4(5): p. 329-34. Lindahl, T., An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proc Natl Acad Sci U S A, 1974. 71(9): p. 3649-53. Dodson, M.L., M.L. Michaels, and R.S. Lloyd, Unified catalytic mechanism for DNA glycosylases. J Biol Chem, 1994. 269(52): p. 32709-12. Mazumder, A., et al., Stereochemical studies of the beta-elimination reactions at aldehydic abasic sites in DNA: endonuclease III from Escherichia coli, sodium hydroxide, and Lys-Trp-Lys. Biochemistry, 1991. 30(4): p. 1119-26. Bhagwat, M. and J.A. Gerlt, 3'- and 5'-strand cleavage reactions catalyzed by the Fpg protein from Escherichia coli occur via successive beta- and delta-elimination mechanisms, respectively. Biochemistry, 1996. 35(2): p. 659-65. Aravind, L. and E.V. Koonin, The alpha/beta fold uracil DNA glycosylases: a common origin with diverse fates. Genome Biol, 2000. 1(4): p. RESEARCH0007. Stivers, J.T. and A.C. Drohat, Uracil DNA glycosylase: insights from a master catalyst. Arch Biochem Biophys, 2001. 396(1): p. 1-9.

130

83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101.

Higuchi, K., et al., Fate of DNA replication fork encountering a single DNA lesion during oriC plasmid DNA replication in vitro. Genes Cells, 2003. 8(5): p. 437-49. Yu, S.L., et al., The stalling of transcription at abasic sites is highly mutagenic. Mol Cell Biol, 2003. 23(1): p. 382-8. Guillet, M. and S. Boiteux, Endogenous DNA abasic sites cause cell death in the absence of Apn1, Apn2 and Rad1/Rad10 in Saccharomyces cerevisiae. Embo J, 2002. 21(11): p. 2833-41. Ljungquist, S. and T. Lindahl, Relation between Escherichia coli endonucleases specific for apurinic sites in DNA and exonuclease III. Nucleic Acids Res, 1977. 4(8): p. 2871-9. Mol, C.D., et al., DNA-bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1 and DNA repair coordination [corrected]. Nature, 2000. 403(6768): p. 451-6. Hosfield, D.J., et al., Structure of the DNA repair enzyme endonuclease IV and its DNA complex: double-nucleotide flipping at abasic sites and three-metal-ion catalysis. Cell, 1999. 98(3): p. 397-408. Yacoub, A., M.R. Kelley, and W.A. Deutsch, Drosophila ribosomal protein PO contains apurinic/apyrimidinic endonuclease activity. Nucleic Acids Res, 1996. 24(21): p. 4298-303. Wilson, D.M., 3rd, W.A. Deutsch, and M.R. Kelley, Cloning of the Drosophila ribosomal protein S3: another multifunctional ribosomal protein with AP endonuclease DNA repair activity. Nucleic Acids Res, 1993. 21(10): p. 2516. Allinson, S.L., Dianova, II, and G.L. Dianov, DNA polymerase beta is the major dRP lyase involved in repair of oxidative base lesions in DNA by mammalian cell extracts. Embo J, 2001. 20(23): p. 6919-26. Cappelli, E., et al., Involvement of XRCC1 and DNA ligase III gene products in DNA base excision repair. J Biol Chem, 1997. 272(38): p. 23970-5. Prasad, R., et al., Specific interaction of DNA polymerase beta and DNA ligase I in a multiprotein base excision repair complex from bovine testis. J Biol Chem, 1996. 271(27): p. 16000-7. Nicholl, I.D., K. Nealon, and M.K. Kenny, Reconstitution of human base excision repair with purified proteins. Biochemistry, 1997. 36(24): p. 7557-66. Pascucci, B., et al., Long patch base excision repair with purified human proteins. DNA ligase I as patch size mediator for DNA polymerases delta and epsilon. J Biol Chem, 1999. 274(47): p. 33696-702. Klungland, A. and T. Lindahl, Second pathway for completion of human DNA base excision-repair: reconstitution with purified proteins and requirement for DNase IV (FEN1). Embo J, 1997. 16(11): p. 3341-8. Matsumoto, Y., et al., Reconstitution of proliferating cell nuclear antigen-dependent repair of apurinic/apyrimidinic sites with purified human proteins. J Biol Chem, 1999. 274(47): p. 33703-8. Wilson, S.H., Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta. Mutat Res, 1998. 407(3): p. 203-15. Fortini, P., et al., Different DNA polymerases are involved in the short- and longpatch base excision repair in mammalian cells. Biochemistry, 1998. 37(11): p. 357580. Prasad, R., et al., DNA polymerase beta -mediated long patch base excision repair. Poly(ADP-ribose)polymerase-1 stimulates strand displacement DNA synthesis. J Biol Chem, 2001. 276(35): p. 32411-4. Dantzer, F., et al., Base excision repair is impaired in mammalian cells lacking Poly(ADP-ribose) polymerase-1. Biochemistry, 2000. 39(25): p. 7559-69.

131

102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121.

Dantzer, F., et al., Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair. Biochimie, 1999. 81(1-2): p. 69-75. Benjamin, R.C. and D.M. Gill, Poly(ADP-ribose) synthesis in vitro programmed by damaged DNA. A comparison of DNA molecules containing different types of strand breaks. J Biol Chem, 1980. 255(21): p. 10502-8. de Murcia, G., et al., Modulation of chromatin superstructure induced by poly(ADPribose) synthesis and degradation. J Biol Chem, 1986. 261(15): p. 7011-7. Parikh, S.S., et al., Base excision repair initiation revealed by crystal structures and binding kinetics of human uracil-DNA glycosylase with DNA. Embo J, 1998. 17(17): p. 5214-26. Waters, T.R., et al., Human thymine DNA glycosylase binds to apurinic sites in DNA but is displaced by human apurinic endonuclease 1. J Biol Chem, 1999. 274(1): p. 67-74. Ranalli, T.A., S. Tom, and R.A. Bambara, AP endonuclease 1 coordinates flap endonuclease 1 and DNA ligase I activity in long patch base excision repair. J Biol Chem, 2002. 277(44): p. 41715-24. Sekelsky, J.J., M.H. Brodsky, and K.C. Burtis, DNA repair in Drosophila: insights from the Drosophila genome sequence. J Cell Biol, 2000. 150(2): p. F31-6. Aravind, L., D.R. Walker, and E.V. Koonin, Conserved domains in DNA repair proteins and evolution of repair systems. Nucleic Acids Res, 1999. 27(5): p. 1223-42. Gillet, L.C. and O.D. Scharer, Molecular mechanisms of mammalian global genome nucleotide excision repair. Chem Rev, 2006. 106(2): p. 253-76. Sugasawa, K., The xeroderma pigmentosum group C protein complex and ultravioletdamaged DNA-binding protein: functional assays for damage recognition factors involved in global genome repair. Methods Enzymol, 2006. 408: p. 171-88. Haug, T., et al., Regulation of expression of nuclear and mitochondrial forms of human uracil-DNA glycosylase. Nucleic Acids Res, 1998. 26(6): p. 1449-57. Beard, B.C., S.H. Wilson, and M.J. Smerdon, Suppressed catalytic activity of base excision repair enzymes on rotationally positioned uracil in nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(13): p. 7465-70. Xanthoudakis, S., et al., Redox activation of Fos-Jun DNA binding activity is mediated by a DNA repair enzyme. Embo J, 1992. 11(9): p. 3323-35. Smulson, M.E., et al., Roles of poly(ADP-ribosyl)ation and PARP in apoptosis, DNA repair, genomic stability and functions of p53 and E2F-1. Adv Enzyme Regul, 2000. 40: p. 183-215. Kakolyris, S., et al., Human apurinic endonuclease 1 expression in a colorectal adenoma-carcinoma sequence. Cancer Res, 1997. 57(9): p. 1794-7. Moore, D.H., et al., Alterations in the expression of the DNA repair/redox enzyme APE/ref-1 in epithelial ovarian cancers. Clin Cancer Res, 2000. 6(2): p. 602-9. Robertson, K.A., et al., Altered expression of Ape1/ref-1 in germ cell tumors and overexpression in NT2 cells confers resistance to bleomycin and radiation. Cancer Res, 2001. 61(5): p. 2220-5. Bergoglio, V., et al., Deregulated DNA polymerase beta induces chromosome instability and tumorigenesis. Cancer Res, 2002. 62(12): p. 3511-4. Canitrot, Y., et al., Overexpression of DNA polymerase beta in cell results in a mutator phenotype and a decreased sensitivity to anticancer drugs. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(21): p. 12586-90. Coquerelle, T., J. Dosch, and B. Kaina, Overexpression of N-methylpurine-DNA glycosylase in Chinese hamster ovary cells renders them more sensitive to the

132

122. 123. 124. 125. 126. 127. 128.

129. 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141.

production of chromosomal aberrations by methylating agents--a case of imbalanced DNA repair. Mutat Res, 1995. 336(1): p. 9-17. Glassner, B.J., et al., Generation of a strong mutator phenotype in yeast by imbalanced base excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(17): p. 999710002. Krokan, H.E., et al., Properties and functions of human uracil-DNA glycosylase from the UNG gene. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 2001. 68: p. 365-86. Pearl, L.H., Structure and function in the uracil-DNA glycosylase superfamily. Mutat Res, 2000. 460(3-4): p. 165-81. Kavli, B., et al., Excision of cytosine and thymine from DNA by mutants of human uracil-DNA glycosylase. Embo J, 1996. 15(13): p. 3442-7. Stivers, J.T., K.W. Pankiewicz, and K.A. Watanabe, Kinetic mechanism of damage site recognition and uracil flipping by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry, 1999. 38(3): p. 952-63. Wang, Z.G., D.G. Smith, and D.W. Mosbaugh, Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene, 1991. 99(1): p. 31-7. Otterlei, M., et al., Nuclear and mitochondrial splice forms of human uracil-DNA glycosylase contain a complex nuclear localisation signal and a strong classical mitochondrial localisation signal, respectively. Nucleic Acids Res, 1998. 26(20): p. 4611-7. Bharati, S., et al., Human mitochondrial uracil-DNA glycosylase preform (UNG1) is processed to two forms one of which is resistant to inhibition by AP sites. Nucleic Acids Res, 1998. 26(21): p. 4953-9. Otterlei, M., et al., Post-replicative base excision repair in replication foci. Embo J, 1999. 18(13): p. 3834-44. Nilsen, H., et al., Uracil-DNA glycosylase (UNG)-deficient mice reveal a primary role of the enzyme during DNA replication. Mol Cell, 2000. 5(6): p. 1059-65. Kavli, B., et al., hUNG2 is the major repair enzyme for removal of uracil from U:A matches, U:G mismatches, and U in single-stranded DNA, with hSMUG1 as a broad specificity backup. J Biol Chem, 2002. 277(42): p. 39926-36. Duncan, B.K., Isolation of insertion, deletion, and nonsense mutations of the uracilDNA glycosylase (ung) gene of Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 1985. 164(2): p. 689-95. Nilsen, H., et al., Gene-targeted mice lacking the Ung uracil-DNA glycosylase develop B-cell lymphomas. Oncogene, 2003. 22(35): p. 5381-6. Gallinari, P. and J. Jiricny, A new class of uracil-DNA glycosylases related to human thymine-DNA glycosylase. Nature, 1996. 383(6602): p. 735-8. Haushalter, K.A., et al., Identification of a new uracil-DNA glycosylase family by expression cloning using synthetic inhibitors. Curr Biol, 1999. 9(4): p. 174-85. Boorstein, R.J., et al., Definitive identification of mammalian 5-hydroxymethyluracil DNA N-glycosylase activity as SMUG1. J Biol Chem, 2001. 276(45): p. 41991-7. Elateri, I., et al., hSMUG1 can functionally compensate for Ung1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair (Amst), 2003. 2(3): p. 315-23. Wibley, J.E., et al., Structure and specificity of the vertebrate anti-mutator uracilDNA glycosylase SMUG1. Mol Cell, 2003. 11(6): p. 1647-59. Hardeland, U., et al., Thymine DNA glycosylase. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 2001. 68: p. 235-53. Bellacosa, A., Role of MED1 (MBD4) Gene in DNA repair and human cancer. J Cell Physiol, 2001. 187(2): p. 137-44.

133

142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154. 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161.

Barrett, T.E., et al., Crystal structure of a G:T/U mismatch-specific DNA glycosylase: mismatch recognition by complementary-strand interactions. Cell, 1998. 92(1): p. 117-29. Mohan, R.D., et al., SUMO-1-dependent allosteric regulation of thymine DNA glycosylase alters subnuclear localization and CBP/p300 recruitment. Mol Cell Biol, 2007. 27(1): p. 229-43. Hardeland, U., et al., The versatile thymine DNA-glycosylase: a comparative characterization of the human, Drosophila and fission yeast orthologs. Nucleic Acids Res, 2003. 31(9): p. 2261-71. Hendrich, B., et al., The thymine glycosylase MBD4 can bind to the product of deamination at methylated CpG sites. Nature, 1999. 401(6750): p. 301-4. Sansom, O.J., et al., MBD4 deficiency reduces the apoptotic response to DNAdamaging agents in the murine small intestine. Oncogene, 2003. 22(46): p. 7130-6. Muller, S.J. and S. Caradonna, Cell cycle regulation of a human cyclin-like gene encoding uracil-DNA glycosylase. J Biol Chem, 1993. 268(2): p. 1310-9. Muller, S.J. and S. Caradonna, Isolation and characterization of a human cDNA encoding uracil-DNA glycosylase. Biochim Biophys Acta, 1991. 1088(2): p. 197-207. Walsh, M.J., et al., E2F-1 and a cyclin-like DNA repair enzyme, uracil-DNA glycosylase, provide evidence for an autoregulatory mechanism for transcription. J Biol Chem, 1995. 270(10): p. 5289-98. Meyer-Siegler, K., et al., A human nuclear uracil DNA glycosylase is the 37-kDa subunit of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(19): p. 8460-4. Berry, M.D. and A.A. Boulton, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and apoptosis. J Neurosci Res, 2000. 60(2): p. 150-4. Seno, T., et al., Thymineless death and genetic events in mammalian cells. Basic Life Sci, 1985. 31: p. 241-63. Goulian, M., et al., Mechanism of thymineless death. Adv Exp Med Biol, 1986. 195 Pt B: p. 89-95. Ahmad, S.I., S.H. Kirk, and A. Eisenstark, Thymine metabolism and thymineless death in prokaryotes and eukaryotes. Annu Rev Microbiol, 1998. 52: p. 591-625. Leist, M. and M. Jaattela, Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001. 2(8): p. 589-98. Nicoletti, V.G. and A.M. Stella, Role of PARP under stress conditions: cell death or protection? Neurochem Res, 2003. 28(2): p. 187-94. Ladner, R.D., The role of dUTPase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci, 2001. 2(4): p. 361-70. Munoz-Pinedo, C., F.J. Oliver, and A. Lopez-Rivas, Apoptosis of haematopoietic cells upon thymidylate synthase inhibition is independent of p53 accumulation and CD95-CD95 ligand interaction. Biochem J, 2001. 353(Pt 1): p. 101-108. Munoz-Pinedo, C., G. Robledo, and A. Lopez-Rivas, Thymidylate synthase inhibition triggers glucose-dependent apoptosis in p53-negative leukemic cells. FEBS Lett, 2004. 570(1-3): p. 205-10. Van Triest, B., et al., Downstream molecular determinants of response to 5fluorouracil and antifolate thymidylate synthase inhibitors. Ann Oncol, 2000. 11(4): p. 385-91. Schilsky, R.L., Methotrexate: an effective agent for treating cancer and building careers. The polyglutamate era. Stem Cells, 1996. 14(1): p. 29-32.

134

162. 163. 164. 165.

166. 167.

168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178.

Rich, T.A., R.C. Shepard, and S.T. Mosley, Four decades of continuing innovation with fluorouracil: current and future approaches to fluorouracil chemoradiation therapy. J Clin Oncol, 2004. 22(11): p. 2214-32. Ladner, R.D., et al., dUTP nucleotidohydrolase isoform expression in normal and neoplastic tissues: association with survival and response to 5-fluorouracil in colorectal cancer. Cancer Res, 2000. 60(13): p. 3493-503. Pugacheva, E.N., et al., Novel gain of function activity of p53 mutants: activation of the dUTPase gene expression leading to resistance to 5-fluorouracil. Oncogene, 2002. 21(30): p. 4595-600. Canman, C.E., et al., Resistance to fluorodeoxyuridine-induced DNA damage and cytotoxicity correlates with an elevation of deoxyuridine triphosphatase activity and failure to accumulate deoxyuridine triphosphate. Cancer Res, 1993. 53(21): p. 521924. Canman, C.E., et al., Induction of resistance to fluorodeoxyuridine cytotoxicity and DNA damage in human tumor cells by expression of Escherichia coli deoxyuridinetriphosphatase. Cancer Res, 1994. 54(9): p. 2296-8. Andersen, S., et al., Incorporation of dUMP into DNA is a major source of spontaneous DNA damage, while excision of uracil is not required for cytotoxicity of fluoropyrimidines in mouse embryonic fibroblasts. Carcinogenesis, 2005. 26(3): p. 547-55. Welsh, S.J., S. Hobbs, and G.W. Aherne, Expression of uracil DNA glycosylase (UDG) does not affect cellular sensitivity to thymidylate synthase (TS) inhibition. Eur J Cancer, 2003. 39(3): p. 378-87. Ju, J., et al., Regulation of p53 expression by thymidylate synthase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(7): p. 3769-74. Liu, J., et al., Thymidylate synthase as a translational regulator of cellular gene expression. Biochim Biophys Acta, 2002. 1587(2-3): p. 174-82. Price, A.R. and S.J. Cook, New deoxyribonucleic acid polymerase induced by Bacillus subtilis bacteriophage PBS2. J Virol, 1972. 9(4): p. 602-10. Price, A.R. and S.M. Fogt, Deoxythymidylate phosphohydrolase induced by bacteriophage PBS2 during infection of Bacillus subtilis. J Biol Chem, 1973. 248(4): p. 1372-80. Tomita, F. and I. Takahashi, A novel enzyme, dCTP deaminase, found in Bacillus subtilis infected with phage PBS I. Biochim Biophys Acta, 1969. 179(1): p. 18-27. Hitzeman, R.A. and A.R. Price, Bacillus subtilis bacteriophage PBS2-induced DNA polymerase. Its purification and assay characteristics. J Biol Chem, 1978. 253(23): p. 8518-25. Hitzeman, R.A. and A.R. Price, Relationship of Bacillus subtilis DNA polymerase III to bacteriophage PBS2-induced DNA polymerase and to the replication of uracilcontaining DNA. J Virol, 1978. 28(3): p. 697-709. Friedberg, E.C., A.K. Ganesan, and K. Minton, N-Glycosidase activity in extracts of Bacillus subtilis and its inhibition after infection with bacteriophage PBS2. J Virol, 1975. 16(2): p. 315-21. Bennett, S.E. and D.W. Mosbaugh, Characterization of the Escherichia coli uracilDNA glycosylase.inhibitor protein complex. J Biol Chem, 1992. 267(31): p. 2251221. Price, A.R., Deoxythymidylate phosphohydrolase from PBS2 phage-infected Bacillus subtilis. Methods Enzymol, 1978. 51: p. 285-90.

135

179. 180. 181. 182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189.

190. 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197.

Proudfoot, M., et al., General enzymatic screens identify three new nucleotidases in Escherichia coli. Biochemical characterization of SurE, YfbR, and YjjG. J Biol Chem, 2004. 279(52): p. 54687-94. Titz, B., et al., The Escherichia coli protein YjjG is a house-cleaning nucleotidase in vivo. FEMS Microbiol Lett, 2007. 270(1): p. 49-57. Weiss, B., YjjG, a dUMP phosphatase, is critical for thymine utilization by Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 2007. 189(5): p. 2186-9. Wang, Z. and D.W. Mosbaugh, Uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2: cloning and effects of expression of the inhibitor gene in Escherichia coli. J Bacteriol, 1988. 170(3): p. 1082-91. Serrano-Heras, G., M. Salas, and A. Bravo, A uracil-DNA glycosylase inhibitor encoded by a non-uracil containing viral DNA. J Biol Chem, 2006. 281(11): p. 706874. Ravishankar, R., et al., X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG. Nucleic Acids Res, 1998. 26(21): p. 4880-7. Acharya, N., S. Roy, and U. Varshney, Mutational analysis of the uracil DNA glycosylase inhibitor protein and its interaction with Escherichia coli uracil DNA glycosylase. J Mol Biol, 2002. 321(4): p. 579-90. Kiljunen, S., et al., Yersiniophage phiR1-37 is a tailed bacteriophage having a 270 kb DNA genome with thymidine replaced by deoxyuridine. Microbiology, 2005. 151(Pt 12): p. 4093-102. Simon, E.H. and I. Tessman, Thymidine-Requiring Mutants of Phage T4. Proc Natl Acad Sci U S A, 1963. 50: p. 526-32. Shapiro, D.M., J. Eigner, and G.R. Greenberg, Inability of Thymine-Dependent Mutants of Bacteriophage T4 to Induce Thymidylate Synthetase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1965. 53: p. 874-81. Swart, W.J., Jr. and H.R. Warner, Isolation and partial characterization of a bacteriophage T5 mutant unable to induce thymidylate synthetase and its use in studying the effect of uracil incorporation into DNA on early gene expression. J Virol, 1985. 54(1): p. 86-91. Warner, H.R., et al., The properties of a bacteriophage T5 mutant unable to induce deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase. Synthesis of uracil-containing T5 deoxyribonucleic acid. J Biol Chem, 1979. 254(16): p. 7534-9. Duncan, B.K., P.A. Rockstroh, and H.R. Warner, Escherichia coli K-12 mutants deficient in uracil-DNA glycosylase. J Bacteriol, 1978. 134(3): p. 1039-45. Duncan, B.K. and B. Weiss, Specific mutator effects of ung (uracil-DNA glycosylase) mutations in Escherichia coli. J Bacteriol, 1982. 151(2): p. 750-5. Hochhauser, S.J. and B. Weiss, Escherichia coli mutants deficient in deoxyuridine triphosphatase. J Bacteriol, 1978. 134(1): p. 157-66. Muramatsu, M., et al., Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J Biol Chem, 1999. 274(26): p. 18470-6. Muramatsu, M., et al., Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell, 2000. 102(5): p. 553-63. Hagen, L., et al., Genomic uracil and human disease. Exp Cell Res, 2006. 312(14): p. 2666-72. Tobollik, S., et al., Epstein-barr-virus nuclear antigen 2 inhibits AID expression during EBV-driven B cell growth. Blood, 2006.

136

198. 199. 200. 201. 202. 203. 204. 205. 206. 207. 208. 209. 210. 211. 212. 213. 214. 215. 216. 217. 218.

Harris, R.S., S.K. Petersen-Mahrt, and M.S. Neuberger, RNA editing enzyme APOBEC1 and some of its homologs can act as DNA mutators. Mol Cell, 2002. 10(5): p. 1247-53. Di Noia, J. and M.S. Neuberger, Altering the pathway of immunoglobulin hypermutation by inhibiting uracil-DNA glycosylase. Nature, 2002. 419(6902): p. 438. Imai, K., et al., Human uracil-DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin class-switch recombination. Nat Immunol, 2003. 4(10): p. 1023-8. Burton, W.G., C.T. Grabowy, and R. Sager, Role of methylation in the modification and restriction of chloroplast DNA in Chlamydomonas. Proc Natl Acad Sci U S A, 1979. 76(3): p. 1390-4. Green, D.A. and W.A. Deutsch, Repair of alkylated DNA: Drosophila have DNA methyltransferases but not DNA glycosylases. Mol Gen Genet, 1983. 192(3): p. 3225. Green, D.A. and W.A. Deutsch, Direct determination of uracil in [32P,uracil3H]poly(dA.dT) and bisulfite-treated phage PM2 DNA. Anal Biochem, 1984. 142(2): p. 497-503. Deutsch, W.A., Enzymatic studies of DNA repair in Drosophila melanogaster. Mutat Res, 1987. 184(3): p. 209-15. Breimer, L.H., A DNA glycosylase for oxidized thymine residues in Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun, 1986. 134(1): p. 201-4. Morgan, A.R. and J. Chlebek, Quantitative assays for uracil-DNA glycosylase of high sensitivity. Biochem Cell Biol, 1988. 66(2): p. 157-60. Lee, C.Y. and E.H. Baehrecke, Genetic regulation of programmed cell death in Drosophila. Cell Res, 2000. 10(3): p. 193-204. Lee, C.Y. and E.H. Baehrecke, Steroid regulation of autophagic programmed cell death during development. Development, 2001. 128(8): p. 1443-55. Dubrovsky, E.B., Hormonal cross talk in insect development. Trends Endocrinol Metab, 2005. 16(1): p. 6-11. Thummel, C.S., Molecular mechanisms of developmental timing in C. elegans and Drosophila. Dev Cell, 2001. 1(4): p. 453-65. Lee, C.Y., et al., Genetic mechanism for the stage- and tissue-specific regulation of steroid triggered programmed cell death in Drosophila. Dev Biol, 2002. 252(1): p. 138-48. Lee, C.Y., et al., E93 directs steroid-triggered programmed cell death in Drosophila. Mol Cell, 2000. 6(2): p. 433-43. Buszczak, M. and W.A. Segraves, Insect metamorphosis: out with the old, in with the new. Curr Biol, 2000. 10(22): p. R830-3. Farkas, R. and B.M. Mechler, The timing of drosophila salivary gland apoptosis displays an l(2)gl-dose response. Cell Death Differ, 2000. 7(1): p. 89-101. White, K.P., et al., Microarray analysis of Drosophila development during metamorphosis. Science, 1999. 286(5447): p. 2179-84. Lee, C.Y., et al., Genome-wide analyses of steroid- and radiation-triggered programmed cell death in Drosophila. Curr Biol, 2003. 13(4): p. 350-7. Martin, D.N., et al., Proteomic analysis of steroid-triggered autophagic programmed cell death during Drosophila development. Cell Death Differ, 2007. Nagata, S., et al., Degradation of chromosomal DNA during apoptosis. Cell Death Differ, 2003. 10(1): p. 108-16.

137

219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227. 228. 229. 230. 231. 232. 233.

234. 235. 236. 237. 238.

Wyllie, A.H., Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature, 1980. 284(5756): p. 555-6. McIlroy, D., et al., An auxiliary mode of apoptotic DNA fragmentation provided by phagocytes. Genes Dev, 2000. 14(5): p. 549-58. Li, L.Y., X. Luo, and X. Wang, Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature, 2001. 412(6842): p. 95-9. Parrish, J., et al., Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C. elegans. Nature, 2001. 412(6842): p. 90-4. Widlak, P., et al., Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I. J Biol Chem, 2001. 276(51): p. 48404-9. Boulares, A.H., et al., Roles of DNA fragmentation factor and poly(ADP-ribose) polymerase in an amplification phase of tumor necrosis factor-induced apoptosis. J Biol Chem, 2001. 276(41): p. 38185-92. Cipriani, B., et al., Curcumin inhibits activation of Vgamma9Vdelta2 T cells by phosphoantigens and induces apoptosis involving apoptosis-inducing factor and large scale DNA fragmentation. J Immunol, 2001. 167(6): p. 3454-62. Rho, J.H., et al., Doxorubicin induces apoptosis with profile of large-scale DNA fragmentation and without DNA ladder in anaplastic thyroid carcinoma cells via histone hyperacetylation. Int J Oncol, 2005. 27(2): p. 465-71. Odaka, C. and T. Mizuochi, Macrophages are involved in DNA degradation of apoptotic cells in murine thymus after administration of hydrocortisone. Cell Death Differ, 2002. 9(2): p. 104-12. Kawane, K., et al., Requirement of DNase II for definitive erythropoiesis in the mouse fetal liver. Science, 2001. 292(5521): p. 1546-9. Schneider, I., Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol, 1972. 27(2): p. 353-65. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54. Ashburner, M., Drosophila. A laboratory handbook. 1989, Cambridge: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Foe, V.E. and B.M. Alberts, Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. J Cell Sci, 1983. 61: p. 31-70. Foe, V.E., G.M. Odell, and B.A. Edgar, Mitosis and the morphogenesis in the Drosophila embryo: point and counterpoint. The development of Drosophila, ed. M. Barte, Martinez Arias, A. Vol. 1. 1993, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 149-300. Spradling, A.C. The Development of Drosophila melanogaster., ed. M. Bate, Martinez-Arias, A. 1993: Cold Sprin Harbor Press. Cohen, S. The Development of Drosophila melanogaster., ed. M. Bate, MartinezArias, A. 1993: Cold Sprin Harbor Press. Igaki, T., et al., Drob-1, a Drosophila member of the Bcl-2/CED-9 family that promotes cell death. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(2): p. 662-7. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(259): p. 680-5. Ephrussi, A., L.K. Dickinson, and R. Lehmann, Oskar organizes the germ plasm and directs localization of the posterior determinant nanos. Cell, 1991. 66(1): p. 37-50.

138

239. 240.

241.

242.

243.

244. 245.

246.

247. 248. 249. 250. 251. 252. 253. 254.

Tracey, D.E., S.H. Liu, and J.J. Cebra, Structure of the heavy chain from strain 13 guinea pig immunoglobulin G1: isolation of cyanogen bromide fragments. Biochemistry, 1976. 15(3): p. 624-9. Cooper, H.M., Paterson, Y., Purification of Immunoglobulin G fraction from Antiserum, Ascites Fluid, or Hybridoma Supernatant., in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Editor. 2000, John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ. Springer, T.A., Immunoaffinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Editor. 1996, John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ. p. 10.11.4. Gallager, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. R., Immunoblotting and Immunodetection., in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Editor. 1997, John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ. p. 10.8. Edmondson, D.G., Roth, S. Y., Identification of Protein-Protein Interactions by far Western Analysis., in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Editor. 2001, John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ. p. 20.6.1. Rothwell, W.F., Sullivan, W., Fluorescent Analysis of Drosophila, in Drosophila Protocols, W. Sullivan, Ashburner, M., Hawley, R. S., Editor. 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cambridge. Bonifacino, J.S., Dell'Angelica, E. C., Springer, T. A., Immunoprecipitation, in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Editor. 1999, John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ. p. 10.16.1-10.16.29, 1. és 13. protokoll. Kerrigan, L.A., Kadonaga, J. T., Purification of Sequence-Specific DNA-Binding Proteins by Affinity Chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Editor. 1996, John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ. p. 12.10.6.-9. Gerald Rubin, A.S., Roger Hoskins, Hugo Bellen, Susan Celniker, and Gary Karpen laboratories. Drosophila Genome Project, Release 4. 2004 [cited; Available from: http://www.fruitfly.org. Varshavsky, A., The N-end rule pathway of protein degradation. Genes Cells, 1997. 2(1): p. 13-28. Varshavsky, A., Recent studies of the ubiquitin system and the N-end rule pathway. Harvey Lect, 2000. 96: p. 93-116. Sharp, P.A. and C.B. Burge, Classification of introns: U2-type or U12-type. Cell, 1997. 91(7): p. 875-9. Nair, R., P. Carter, and B. Rost, NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res, 2003. 31(1): p. 397-9. Dang, C.V. and W.M. Lee, Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol, 1988. 8(10): p. 4048-54. Makkerh, J.P., C. Dingwall, and R.A. Laskey, Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol, 1996. 6(8): p. 1025-7. Stierum, R.H., G.L. Dianov, and V.A. Bohr, Single-nucleotide patch base excision repair of uracil in DNA by mitochondrial protein extracts. Nucleic Acids Res, 1999. 27(18): p. 3712-9.

139

255. 256. 257. 258. 259. 260. 261. 262. 263. 264. 265. 266. 267. 268. 269. 270. 271. 272. 273. 274.

Lam, M.H., et al., Nuclear transport of parathyroid hormone (PTH)-related protein is dependent on microtubules. Mol Endocrinol, 2002. 16(2): p. 390-401. Adam, S.A., Transport pathways of macromolecules between the nucleus and the cytoplasm. Curr Opin Cell Biol, 1999. 11(3): p. 402-6. Izaurralde, E. and S. Adam, Transport of macromolecules between the nucleus and the cytoplasm. Rna, 1998. 4(4): p. 351-64. Mitchell, P. and D. Tollervey, mRNA turnover. Curr Opin Cell Biol, 2001. 13(3): p. 320-5. Macdonald, P., Diversity in translational regulation. Curr Opin Cell Biol, 2001. 13(3): p. 326-31. Gingras, A.C., B. Raught, and N. Sonenberg, eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem, 1999. 68: p. 913-63. Kitchens, M.E., et al., Ligand-mediated induction of thymidylate synthase occurs by enzyme stabilization. Implications for autoregulation of translation. J Biol Chem, 1999. 274(18): p. 12544-7. Chu, E., et al., Identification of an RNA binding site for human thymidylate synthase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(2): p. 517-21. Matsukage, A., et al., The DRE sequence TATCGATA, a putative promoter-activating element for Drosophila melanogaster cell-proliferation-related genes. Gene, 1995. 166(2): p. 233-6. Yamaguchi, M., F. Hirose, and A. Matsukage, Roles of multiple promoter elements of the proliferating cell nuclear antigen gene during Drosophila development. Genes Cells, 1996. 1(1): p. 47-58. Matunis, M.J., E.L. Matunis, and G. Dreyfuss, Isolation of hnRNP complexes from Drosophila melanogaster. J Cell Biol, 1992. 116(2): p. 245-55. Matunis, M.J., E.L. Matunis, and G. Dreyfuss, Isolation and characterization of RNAbinding proteins from Drosophila melanogaster. Methods Cell Biol, 1994. 44: p. 191205. Akaishi, T., H. Yokosawa, and H. Sawada, Regulatory subunit complex dissociated from 26S proteasome: isolation and characterization. Biochim Biophys Acta, 1995. 1245(3): p. 331-8. Johnson, E.S., D.K. Gonda, and A. Varshavsky, cis-trans recognition and subunitspecific degradation of short-lived proteins. Nature, 1990. 346(6281): p. 287-91. Weeda, G., et al., The XPB subunit of repair/transcription factor TFIIH directly interacts with SUG1, a subunit of the 26S proteasome and putative transcription factor. Nucleic Acids Res, 1997. 25(12): p. 2274-83. Erdemir, T., et al., Saccharomyces cerevisiae C1D is implicated in both nonhomologous DNA end joining and homologous recombination. Mol Microbiol, 2002. 46(4): p. 947-57. Erdemir, T., et al., DNA damage-dependent interaction of the nuclear matrix protein C1D with Translin-associated factor X (TRAX). J Cell Sci, 2002. 115(Pt 1): p. 20716. Aoki, K., R. Ishida, and M. Kasai, Isolation and characterization of a cDNA encoding a Translin-like protein, TRAX. FEBS Lett, 1997. 401(2-3): p. 109-12. Louvi, A. and S.G. Tsitilou, A cDNA clone encoding the ADP/ATP translocase of Drosophila melanogaster shows a high degree of similarity with the mammalian ADP/ATP translocases. J Mol Evol, 1992. 35(1): p. 44-50. Akakura, S., et al., A role for Hsc70 in regulating nucleocytoplasmic transport of a temperature-sensitive p53 (p53Val-135). J Biol Chem, 2001. 276(18): p. 14649-57.

140

275. 276. 277. 278. 279. 280. 281. 282. 283.

284. 285.

Brockstedt, E., et al., Identification of apoptosis-associated proteins in a human Burkitt lymphoma cell line. Cleavage of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by caspase 3. J Biol Chem, 1998. 273(43): p. 28057-64. Koyama, Y., et al., Poly(ADP-ribose) polymerase interacts with novel Drosophila ribosomal proteins, L22 and l23a, with unique histone-like amino-terminal extensions. Gene, 1999. 226(2): p. 339-45. Wilson, D.M., 3rd, W.A. Deutsch, and M.R. Kelley, Drosophila ribosomal protein S3 contains an activity that cleaves DNA at apurinic/apyrimidinic sites. J Biol Chem, 1994. 269(41): p. 25359-64. Tschochner, H. and E. Hurt, Pre-ribosomes on the road from the nucleolus to the cytoplasm. Trends Cell Biol, 2003. 13(5): p. 255-63. Olson, M.O., K. Hingorani, and A. Szebeni, Conventional and nonconventional roles of the nucleolus. Int Rev Cytol, 2002. 219: p. 199-266. Raska, I., P.J. Shaw, and D. Cmarko, Structure and function of the nucleolus in the spotlight. Curr Opin Cell Biol, 2006. 18(3): p. 325-34. Pederson, T., The plurifunctional nucleolus. Nucleic Acids Res, 1998. 26(17): p. 3871-6. Horky, M., et al., Nucleolus and apoptosis. Ann N Y Acad Sci, 2002. 973: p. 258-64. Békési, A., Felföldi, F., Pukáncsik, M., Zagyva, I.,Vértessy, G.B., Uracil-DNA nuclease: protein enzyme possessing nuclease activity specific for uracil containing nucleic acid, process for its preparation and methods of use, in United States Patent and Trademark Office. 2005: USA. Bekesi, A., et al., Developmental regulation of dUTPase in Drosophila melanogaster. J Biol Chem, 2004. 279(21): p. 22362-70. Bekesi, A., et al., A novel fruitfly protein under developmental control degrades uracil-DNA. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 355(3): p. 643-8.

141

8. Közlemények listája: A dolgozat témájához kapcsolódó közlemények: Folyóirat cikkek: 1. Békési, A., Pukáncsik, M., Muha, V., Zagyva, I., Leveles, I., Hunyadi-Gulyás, E., Klement, E., Medzihradszky, K. F., Kele Z., Erdei A., Felföldi F., Kónya E., Vértessy B. G., „A novel fruitfly protein under developmental control degrades uracil-DNA”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. 355(3): p. 643-8. IF.: 2,836 2. Békési, A., Zagyva, I., Hunyadi-Gulyás, É., Pongrácz, V., Kovári, J., Nagy, Á., Erdei, A, Medzihradszky, F.K., Vértessy, B.G., „Developmental regulation of dUTPase in Drosophila melanogaster”, J.Biol. Chem. 2004. 279(21): p. 22362-70. IF.:6,482 Összesített impakt faktor: 9,318

Szabadalom: Békési, A., Felföldi, F., Pukáncsik, M., Zagyva, I.,Vértessy, G.B., Uracil-DNA nuclease: protein enzyme possessing nuclease activity specific for uracil containing nucleic acid, process for its preparation and methods of use, in United States Patent and Trademark Office. 2005: USA. Szóbeli előadások (az előadó neve aláhúzva): 1. Pukáncsik, M., Békési, A., Kónya, E., Zagyva, I., Vértessy, G. B. (MTA SzBK Enzimológiai Intézet, Budapest) „Uracil-DNS nukleáz fehérjeszerkezeti jellemzése.” 2007, A Peptidkémiai Munkabizottság tudományos ülése, Balatonszemes. 2. Pukáncsik, M., Leveles, I., Muha, V., Zagyva, I., Hunyadi-Gulyás, É., Klement, É., Kele, Z., Medzihradszky, F. K., Erdei, A., Vértessy, G. B., Békési, A., „A novel uracil-DNA specific nuclease in development of pupating insects.”, 2007, Alexander von Humboldt Workshop on Structure-Based Approaches Towards Disease Control, Mátraháza. 3. Békési, A., Muha, V., Pukáncsik, M., Leveles, I., Zagyva, I., Felföldi, F., HunyadiGulyás, É., Klement, É., Burkovics, P., Haracska, L., Medzihradszky, F. K., Erdei, A., Vértessy, G. B., „Uracil-DNS nukleáz: egy új nukleáz család.”, 2006, A Magyar Biokémiai Egyesület 2006. évi Vándorgyűlése, Pécs. 4. Békési, A., Zagyva, I., Nagy, Á., Pongrácz, V., Kovári, J., Hunyadi-Gulyás, É., Medzihradszky, F.K., Erdei, A., Vértessy, G. B., A dUTPáz szerepe a Drosophila proteomban. 2003 Straub-Napok, az MTA Szegedi Biológiai Központ éves munkaértekezlete, Szeged. 5. Békési, A., Zagyva, I., Nagy, Á., Pongrácz, V., Kovári, J., Hunyadi-Gulyás, É., Medzihradszky, F.K., Erdei, A., Vértessy, G. B., „A dUTPáz kölcsönhatása DNSjavító és apoptotikus faktorokka”. 2003, a Magyar Biokémiai Egyesület 2. Szignáltranszdukció konferencia, Hőgyész.

142

6. Békési, A., Zagyva, I., Nagy, Á., Pongrácz, V., Kovári, J., Hunyadi-Gulyás, É., Medzihradszky, F.K., Erdei, A., Vértessy, G. B., „A dUTPáz működésének szabályozása a Drosophila proteomban”, 2003, Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 8. munkaértekezlete, Tihany. Poszter-előadások (előadó neve aláhúzva): 1. Békési, A., Takács, E., Hunyadi-Gulyás, É., Zagyva, I., Nagy, Á. O., Erdei, A, Medzihradszky, F. K., Vértessy, B. G., „Uracil-DNA in Drosophila development.”, 2005 EMBO/HHMI Central European Scientist Meeting, Budapest, Hungary. 2. Békési, A., Zagyva, I., Hunyadi-Gulyás, É., Pongrácz, V., Kovári, J., Nagy, Á., Medzihradszky, F.K., Vértessy, B.G., „Developmental regulation and interacting protein partners of Drosophila dUTPase.”, Eur. J. Biochem. (26th FEBS Congress, Warsó), 2004 271(1): 9, (P1.1-11 abstract). IF: 2,849 3. Békési, A., Pongracz, V., Zagyva, I., Hunyadi-Gulyás, É., Medzihradszky, F. K., Erdei, A., Vértessy, B. G., „dUTPase in Drosophila proteome.”, Mol Cell Proteomics. (HUPO 2nd Annual and IUBMB XIX World Congress, Montreal, Canada) 2003 Sep;2(9):675-1005., (115.1 abstract). IF: 8,316 4. Kovári, J., Békési, A., Barabás, O., Takács, E., Szavicskó, I., Szabó, P., Vértessy, B. G., Drosophila melanogaster dUTPase: a preventive DNA repair factor, Revista de Oncología (17th meeting of the European Association of Cancer Research), 2002 4(1):112, (316. abstract) . A megjelent poszter kivonatok összesített impakt faktora: 11.165

Egyéb közlemények: Folyóirat cikkek: 1. Kovári, J., Barabás, O., Varga, B., Békési, A., Tölgyesi, F., Fidy, J., Nagy, J., Vértessy, B. G., „Methylene substitution at the α-β bridging position within the phosphate chain of dUDP profoundly perturbs ligand accommodation into the dUTPase active site.”, Proteins, közlésre elfogadva. IF.:4,313 2. Kovári, J., Barabás, O., Takács, E., Békési, A., Dubrovay, Zs., Pongrácz, V., Zagyva, I., Imre, T., Szabó, P., and Vértessy, B.G., „Altered active site flexibility and a structural metal-binding site in eukaryotic dUTPases”, J. Biol. Chem. 2004. 279(17): p. 1793244. IF.:6,482 3. Mustafi, D., Békési, A., Vertessy, B.G., Makinen, M. W., „Catalytic and structural role of the metal ion in dUTP pyrophosphatase”, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2003. 100(10): p. 5670-5. IF.:10,272 összesített impakt faktor: 21,067 Szóbeli előadások (az előadó neve aláhúzva):

143

1. Barabás O., Kovári, J., Békési, A., Dubrovay, Zs., Zagyva, I., Takács, E., Szabó, P., Perczel, A., Kókay, E., Nagy, J., Vértessy, B. G., „Form, function, and development in the homotrimeric dUTPase family” 2002, International Howard Hughes Research Scholar Meeting, Palm Cove, Australia 2. Devkumar Mustafi, Angéla Békési, Júlia Kovári, Beáta G. Vértessy, and Marvin W. Makinen;”Catalytic and Structural Role of the Metal Ion in dUTP Pyrophosphatase” Midwest Enzyme Chemistry Conference, 2002, Chicago, USA 3. Devkumar Mustafi, Júlia Kovári, Angéla Békési, Beáta G. Vértessy, and Marvin W. Makinen; „Catalytic and Structural Role of the Metal Ion in dUTP Pyrophosphatase”; Annual Meeting of the Biophysical Society, USA, March 1-5, 2002 4. A. Békési, O. Barabás, M. Rumlová, I. Pichová, D. Mustafi, M. W. Makinen, B. G. Vértessy, „The dUTPase enzyme family: preventive DNA repair via exclusion of uracil”, 2001. Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Scientific Meeting of International Research Scholars, Vancouver, Canada Poszter-előadások (előadó neve aláhúzva): 1. J. Kovári, A. Békési, O. Barabás, Zs. Dubrovay, I. Zagyva, E. Takács, P.Szabó, T. Imre, A. Erdei, A. Perczel and B. G. Vértessy, dUTPase-dependent preventive DNA repair via exclusion of uracil. Eur. J. Biochem 269 PS1 41, 2002, 28th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Istanbul, Turkey IF:2,849 2. Békési, A., Vértessy, G. B., VO2+ spincímke a dUTPáz enzim aktív centrumában. 2001, Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 6. munkaértekezlete, Sárospatak.

144

Uracil a DNS-ben: hiba vagy fejlődési jel Az uracil a DNS-ben általában hibaként jelenik meg a citozin spontán oxidatív dezaminálása, vagy a replikáció során timint helyettesítő beépülés révén. Az uracilhiba az uracil-DNS glikozilázok által javítódik. A timint helyettesítő uracilbeépülés elkerüléséért mindenek előtt a dUTPáz enzim a felelős, amely a sejtbeli dUTP/dTTP arányt hatékonyan képes csökkenteni a dUTP dUMP-vé és pirofoszfáttá történő hidrolízise révén. Az enzim hiányában az ún. timinmentes sejthalál indukálódik, ezért a dUTPáz kiváló célpont lehet vírus és rákterápiás gyógyszertervezésben. Többek közt ezért fontos a dUTPázt szabályozó sejtbeli mechanizmusokat vizsgálni. A Drosophila dUTPáznak – hasonlóan a humán enzimhez – két izoformáját azonosítottuk mind mRNS, mind pedig fehérje szinten. A Drosophila enzim szokatlan kifejeződési és lokalizációs mintázatot mutat, mely a fehérje többszintű sejtbeli szabályozására utal, feltehetőleg specifikus fehérje-fehérje kölcsönhatások révén. Ilyen makromolekuláris kölcsönható partnerek létét két független módszerrel is megerősítettük. Majd affinitás kromatográfiával izoláltunk és tömegspektrometriával azonosítottunk számos feltételezett partnert. A feltételezett kölcsönhatások jelentőségének tisztázása jelenleg is folyik. Lárva állapotok alatt a dUTPáz fehérje szintje, meglepő módon, drasztikusan lecsökken. A maradék dUTPáz expresszió az imaginális diszkuszokban figyelhető meg, mely szövetek a metamorfózis során nem halnak el, hanem a felnőtt légy szerveinek kiindulási sejtjeit adják. A Drosophila genomból hiányzik a fő uracil-DNS glikoziláz gén (ung), ezért a megfigyelt dUTPáz hiány a metamorfózisban halálra ítélt lárvális szövetek DNS-ében uracil felhalmozódását eredményezheti. Ezt az uraciltartalmat 3. stádiumú lárva DNS-ben kvalitatíve sikerült kimutatni. Felmerül a kérdés, hogy ennek az uraciltartalomnak lehet-e valamilyen szerepe a Drosophila fejlődésében. Amennyiben ez a metamorfózis során apoptotikus jelként szolgál, a késői lárvában ill. a bábban uracil-DNS-t specifikusan felismerő faktor(ok) kifejeződése szükséges. Megmutattuk, hogy uracil-DNS affinitás kromatográfiával késői 3. stádiumú lárvából izolált fehérjék közül a legintenzívebb találat uracil-DNS specfikus degradáló (UDE) aktivitással rendelkezik. Az UDE fehérjének továbbá nem található homológja, csupán metamorfózissal fejlődő rovarokban, mely homológok funkciója szintén ismeretlen. Az UDE nukleáz aktivitását jellemeztük, és több független módszerrel is kizártuk egy esetleges uracil-DNS glikoziláz szennyezés lehetőségét. Továbbá a fehérje doménanalízise és szerkezetmodellezése megerősítette a szerkezet újszerű, egyedi voltát is. Az UDE fehérje kifejeződése szigorúan a bábállapotokra szorítkozik, közvetlenül a bebábozódás előtt indukálódik, és felnőtt legyekben gyorsan eliminálódik. Az expresszió szabályozásában szerepet kap az ekdizon hormon is, feltehetőleg a βFTZ-F1 transzkripciós faktor közvetítésével. Az UDE kifejeződési mintázata jól korrelál a metamorfózis során zajló sejthalál indukálásában feltételezett szerepével. A jelen munkában azonosított UDE specifikus aktivitása és egyedi szerkezete révén - egy új, uracil-DNS-t felismerő nukleáz család első leírt képviselője, mely nem mutat rokonságot az eddig ismert uracil-DNS glikozilázokkal, sem más nukleázokkal, ugyanakkor lényegesen új betekintést kínál az uracilDNS metabolizmusba. Alapkutatási jelentőségükön túl mind az UDE, mind a dUTPáz számos alkalmazási lehetőséggel is kecsegtet rákellenes terápiákban éppúgy, mint más diagnosztikai, vagy biotechnológiai alkalmazásokban.

145

Uracil in DNA: damage or developmental signal Uracil in DNA usually appears as a mistake that may arise by cytosine deamination or thymine replacement and is removed during DNA repair. To avoid misincorporation of uracil during DNA synthesis, the enzyme dUTPase regulates cellular dUTP:dTTP ratio through hydrolysis of dUTP into dUMP and anorganic pyrophosphate. Lack of the enzyme initiates thymineless cell death, prompting studies on enzyme regulation. Similarly to human, two isoforms of Drosophila melanogaster dUTPase were identified at both mRNA and protein levels. The unusual expression pattern and localization of fly dUTPase suggests a multilevel regulation of the enzyme in the proteome, which may involve several interacting protein partners as well. Using independent approaches, the existence of such macromolecular partners was verified. Several putative partners (including DNA-repair and/or apoptotic proteins) were isolated and identified by affinity chromatography and mass spectrometry. Significance of these putative interactions is under current investigation. During larval stages, a drastic decrease of dUTPase expression was demonstrated at the protein level. Residual dUTPase expression occurs in the imaginal discs (surviving tissues during metamorphosis). The Drosophila genome lacks the major uracilDNA glycosylase gene, therefore the observed absence of dUTPase activity may cause accumulation of uracil-DNA in larval tissues sentenced to cell death during metamorphosis. This uracil content was, in fact, experimentally detected in 3rd staged larval DNA. What may be the role of this uracil-DNA in Drosophila development? If it is a signal for apoptotic processes during metamorphosis, late larval or pupal tissues must contain proteins recognizing uracil-DNA. We show the most intensive hit of uracil-DNA pull-down experiments in late 3rd larval extract is a uracil-DNA specific nuclease (UDE) with no detectable homology to other proteins except a group of sequences present in genomes of other pupating insects. Characterization of the nuclease activity of UDE was performed, in addition we exclude the possibility of a contaminating bacterial uracil-DNA glycosylase by several independent methods. Unique features of the UDE structure was suggested by domain analysis and structural modeling of the protein. UDE protein is strongly up-regulated right before puparium formation by an ecdysone-controlled mechanism potentially involving the transcription factor βFTZ-F1. Expression pattern of the enzyme is in good agreement with its putative role in apoptotic processes occuring in metamorphosis. Based on its unique specificity and primary structure, UDE represents a new class of nucleases offering essential novel insights into uracil-DNA metabolism. Both of the investigated enzymes are expected to be useful targets or tools in cancer therapies as well as in other diagnostic, or biotechnological methods.

146