A Drosophila melanogaster dUTPáz nukleáris lokalizációját irányító, illetve befolyásoló faktorok vizsgálata Diplomamunka Írta: Muha Villő biológus Témavezető: Dr. Vértessy Beáta MTA SZBK, Enzimológiai Intézet
Belső konzulens: Dr. Nyitray László ELTE TTK Biokémiai Tanszék
dUTPáz
Készült: a Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Központ, Enzimológiai Intézetében Budapest, 2005
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás -----------------------------------------------------------------------4 Rövidítések jegyzéke-----------------------------------------------------------------------5 Összefoglalás --------------------------------------------------------------------------------7 1. Irodalmi áttekintés----------------------------------------------------------------------8 1.1. A dUTPáz ------------------------------------------------------------------------------ 8 1.1.1. A dUTPáz élettani szerepe-------------------------------------------------8 1.1.2.
A
dUTPáz
potenciális
szerepe
a
gyógyászatban-----------------------14 1.1.3. A dUTPáz szerkezete----------------------------------------------------- 16 1.1.4. dUTPáz izoformák Drosophila melanogaster-ben--------------------18 1.1.5. A Drosophila dUTPáz szerepe az ecetmuslica fejlődése során -----20 1.2.Sejtmagi lokalizáció-------------------------------------------------------------------20 1.2.1. Nukleáris transzportfolyamat áttekintése-------------------------------21 1.2.2. Nukleáris lokalizációs szignál (NLS) szekvenciák--------------------26 2. Célkitűzés------------------------------------------------------------------------------- 29 3. A kísérlet folyamata-------------------------------------------------------------------30 4. Anyagok és módszerek--------------------------------------------------------------- 32 4.1. A pRm -YFP vektor------------------------------------------------------------------32 4.2. Drosophila melanogaster S2 (Schneider) sejtvonal------------------------------32 4.3. A pRm-21kDa-YFP és pRm-23kDa-YFP expressziós vektorok klónozása--33 4.4. PCR (Polimeráz láncreakció) -------------------------------------------------------33 4.5. Kompetens E.coli sejt előállítása és transzformálása----------------------------34 4.6. Plazmid preparálás QIAGEN Midi Kittel-----------------------------------------35 4.7. DNS koncentráció mérése-----------------------------------------------------------37 4.8. Agaróz gélelektroforézis-------------------------------------------------------------37 4.9 Drosophila S2 (Schneider) sejtvonal fenntartása---------------------------------38 4.10. S2 sejtek transzformálása és szelekciója-----------------------------------------38 4.11. S2 sejtek vizsgálata konfokális lézer szkenning mikroszkóppal--------------39 2
4.12. UV fénnyel előidézett DNS károsodás hatásának vizsgálata------------------39 4.13. S2 sejtek feltárása és sejtextrakt nyerése-----------------------------------------40 4.14. Drosophila embrió mikroinjektálása----------------------------------------------40 5. Eredmények és értékelésük----------------------------------------------------------41 5.1. Drosophila dUTPáz gén klónozása pRm-YFP vektorba------------------------41 5.2. Drosophila dUTPáz izoformák lokalizációja S2 sejtekben-------------------- 42 5.3. UV sugárzással előidézett DNS károsodás hatásának vizsgálata--------------43 5.4. Drosophila dUTPáz izoformák lokalizációja ecetmuslica embrióban--------47 5.5. dUTPáz NLS szekvenciák különböző organizmusokban-----------------------51 Eredmények összefoglalása-------------------------------------------------------------52 Irodalomjegyzék--------------------------------------------------------------------------54
3
Köszönetnyílvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy a kutatócsoportjában dolgozhassam, irányított a munkám során, és kedvességével és őszinte lelkesedésével páratlan támogatást nyújtott. Külön köszönet illeti Zagyva Imrét, amiért megosztotta velem asztalát, és megismertetett számos módszer alkalmazásával. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Szabad János professzor úrnak, hogy vendégül látott kutatócsoportjában és Venkei Zsoltnak, aki kitartóan segítséget nyújtott az ecetmuslica mikroinjektáláshoz. A konfokális mikroszkópia alapjaival és rejtelmeivel Dr. Homolya László ismertetett meg, türelméért külön köszönettel tartozom. Köszönet illeti továbbá valamennyi kollégámat támogatásukért, hasznos tanácsaikért, és a jó hangulat megteremtéséért, ami gyakran megkönnyítette a felmerülő nehézségek leküzdését. Köszönöm Dr. Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben.
4
Rövidítések jegyzéke A AP BER C dCMP DHFR DNS dTMP dTTP dUDP dUMP dUTP dUTPáz ER FdUMP G GDP GTP LEF-1 NES NLS NPC NUP PPARα
Adenin Abázisos pozíció Bázis kivágó javítás (Base excision repair) Citozin Dezoxi-citozin monofoszfát Dihidro-folát reduktáz Dezoxiribonukleinsav Dezoxi-timidin-monofoszfát Dezoxi-timidin-trifoszfát Dezoxi-uridin-difoszfát Dezoxi-uridin-monofoszfát Dezoxi-uridin-trifoszfát Dezoxi-uridin-trifoszfát nukleotidhidroláz Endoplazmatikus retikulum Fluoro-dezoxiuridin-monofoszfát Guanin Guanozin-difoszfát Guanozin-trifoszfát Limfoid stimuláló faktor 1 (Lymphoid enhancer factor 1) Nukleáris export szignál Nukleáris lokalizácós szignál Nukleáris pórus komplex Nukleoporin Peroxiszóma osztódás aktiválta receptor alfa
PPi RanBP3 RanGAP RanGEF
(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha) Anorganikus pirofoszfát Ran kötő fehérje 3 (Ran binding protein 3) Ran GTPáz aktiváló protein Ran guanozin cserélő faktor
RNS snRNP
(Ran guanozin exchange faktor) Ribonukleinsav Kis nukleáris ribonukleoprotein
TS U
(small nuclear ribonucleoprotein) Timidilát szintetáz Uracil
DAPI
4’6’Diamidin-2’fenilindol dihidroklorid
DEAD
Dietil-aminoetil
5
DTT
Ditio-treitol
EDTA
Etilén-diamin-N,N,N,,N,,-tetraecetsav
LB
Luria-Bertani médium
OD
Optikai denzitás
PBS
Foszfát és só puffer (Phosphate buffered saline)
PCR
Polimeráz láncreakció (Polymerase chain reaction)
PFA
Paraformaldehid
SDS
Nátrium-dodecil szulfát
SFM
Szérum mentes tápoldat (Serum free medium)
YFP
Sárga fluoreszcens protein (Yellow fluorescent protein)
6
Összefoglalás A dUTPáz enzim egyedülálló módon egyszerre preventív DNS hibajavító funkcióval
bír
és
a
nukleotidok
bioszintézisében
is
szerepet
játszik.
Ecetmuslicában két (23kDa és 21kDa) izoformáját azonosították, melyek eltérő szubcelluláris lokalizációt mutatnak. A 23kDa-os izoforma N terminálisa hordoz egy nem klasszikus nukleáris lokalizációs szignált (NLS), ami a sejtmagi lokalizációért felelős. A 21kDa-os formában egyelőre nem találtak semmilyen lokalizációt befolyásoló szignált, eloszlása elsődlegesen a citoplazmára korlátozódik. A 21kDa-os dUTPáz funkciója ismeretlen, eredményeim szerint lehet valami feladata a mitózis során. Dolgozatomban megállapítom, hogy a dUTPáz lokalizációját több folyamat befolyásolja. Elsődlegesen a nukleáris lokalizációs szignál megléte vagy hiánya a meghatározó. Mitózis során NLS független mechanizmusok specifikusan irányítják vagy aspecifikusan engedélyezik a dUTPáz másik sejttérbe való átjutását. A Drosophila melanogaster dUTPáz izoformák lokalizációjának változása szorosan a sejtciklushoz kötött és a sejtmaghártya valamint a nukleáris pórus komplexek (NPC) állapotától függ.
7
1.Irodalmi áttekintés 1.1. A dUTPáz enzim 1.1.1. A dUTPáz enzim élettani szerepe A dezoxi-uridin-trifoszfát nukleotidhidroláz (dUTPáz) enzim a pirimidin nukleotidok de novo bioszintézisének egyik kulcsfontosságú enzime: a dezoxitimidin-trifoszfát (dTTP) kizárólagos (obligát) prekurzorának (dUMP) szintézisét végzi, azáltal, hogy a dezoxi-uridin-trifoszfát (dUTP) foszfátészter-hidrolízisét katalizálja. A reakció során dezoxi-uridin-monofoszfát (dUMP) és pirofoszfát keletkezik.(1.ábra)
dUTP→ dUMP + PPi + nH+ 1.ábra: dUTP hidrolízise dUTPáz által katalizált folyamatban
A timin de novo bioszintézis másik útvonalán dezoxicitozin-monofoszfát (dCMP) dezaminálása révén keletkezik dUMP. (2.ábra) A dUMP-t a timidilát szintetáz (TS) enzim alakítja át a dezoxitimidin-monofoszfáttá (dTMP), amiből két foszfátcsoport hozzáadásával keletkezik a timin (dTTP). [1.] A dUTPáz működésével szabályozza a dUTP/dTTP szintet, alacsonyan tartva a dUTP
koncentrációját.
Mivel
a
nukleotidok
megfelelő
arányának
és
koncentrációjának szabályozása elengedhetetlen a DNS replikáció hűségének megőrzéséhez,
a
dUTPáz
élettani
szerepe
nélkülözhetetlen.
8
kiemelkedően
fontos
és
dUTPáz
2.ábra: A timin de novo bioszintézis két útja és a szintézisben a dUTPáz szerepe. A szintézist szabályozó folyamatokat a (serkentés) és (gátlás) karakterek jelölik.
DNS replikáció során a DNS polimeráz nem tud különbséget tenni uracil és timin között, nem érzékeli a két bázis közötti különbséget - a metilcsoport meglétét illetve hiányát - és így adeninnel szemben uracilt is beépíthet az újonnan szintetizálódó DNS láncba. Ez önmagában még nem lenne probléma, de uracil a DNS-ben citozin spontán oxidatív dezaminálódásával is keletkezhet, aminek eredményeképpen guaninnal szemben uracil fog állni. (3.ábra) [2.] Ez a módosulás igen gyakran következik be, egy emlős méretű genomban akár naponta több százszor.
9
N
H
N H
C N
C C
C N
O C
N C
N
H
H
H
C C
H
C N
oxidatív dezam inálás
C1'
H
N
H
C N
C C
C N
H C 1'
O
O
H
O
uracil
c itozin
H
C1'
guanin
C H3 H N H
C N C1'
C C
N C N
O
H
H
N C
C
C N
C
C N
H C1'
O H
adenin
tim in (5-m etil-urac il)
3.ábra: Citozin dezaminálása és a bázisok bázispárosodási tulajdonsága
Egy ilyen DNS lánc replikációja nyomán keletkező új DNS szál uracillal szemben adenint fog tartalmazni, tehát más információt fog hordozni, mint a templát DNS szál.
(4.ábra)
Citozinból
keletkező
uracil
a
DNS-ben
pontmutációk
megjelenéséhez vezethet.
Uracil épül be timin helyett:
UA bázispár
Citozinból keletkezik uracil: CG
UG bázispár
UA
Pontmutáció!
CG
DNS replikáció 4.ábra: Uracilt tartalmazó DNS keletkezésének lehetséges útvonalai
A környezetünkben található mutagén ágensek, valamint a sejtben lejátszódó biokémiai reakciók során is keletkező reaktív vegyületek kémiailag módosíthatják a DNS-t. A DNS integritásának megőrzése és a genetikai információ pontos továbbadása a legtöbb szervezet számára kulcsfontosságú, ezért a DNS-ben fellépő károsodások felismerésére és kijavítására számos út létezik a hiba természetétől függően.
10
A DNS-ben megjelenő bármilyen eredetű uracilt hibaként észleli egy báziskivágáson alapuló javítómechanizmus (BER). A BER rendkívül hatékonyan eliminálja az uracilt a DNS-ből, megelőzve a genetikai információ pontatlan másolását. A javítás az uracil-DNS-glikozidáz aktivitásán alapszik, mely lehasítja az uracilt a DNS cukorfoszfát gerincről. A keletkező abázisos pozícióban (AP hely) az AP endonukleáz elhasítja az 5’ foszfodiészter kötést, majd a hiányzó bázisokat a másik szál alapján egy javításért felelős DNS polimeráz építi be. (5.ábra)
Hibás bázis
DNS glikoziláz AP hely
AP endonukleáz
DNS polimeráz DNS ligáz
5.ábra: A bázis kivágáson alapuló DNS javító mechanizmus általános sémája dUTPáz hiányában a DNS polimeráz újra beépíthet uracilt, és a hibajavító mechanizmus egy hiábavaló ciklusba kerül, a DNS uraciltartalma pedig nem csökken.
11
Ha túlságosan sok uracilt tartalmaz a DNS, az a javítómechanizmus túlzott működéséshez és végső soron DNS kettős száltöréshez, és a kromoszómák fragmentálódásához vezet. (6.ábra) [3.] Ezt a jelenséget timinmentes sejthalálnak nevezik, mert kiindulásáért a dTTP alkotóelem alacsony szintje a felelős. [4.] [5.] A timinmentes sejthalált egy p53 fehérjétől független apoptotikus útvonalként írták le. [6.] [7.] [8.] A dUTPáz enzim hiánya végső soron timinmentes sejthalálhoz, vagyis a sejt pusztulásához vezet. dTTP
dUMP
A dUMP-nek, a dTTP prekurzorának termelése
dUTPáz
A dUTP szint csökkentése
dUTP Magas sejtbeli dUTP/dTTP arány DNS polimeráz U
U
U U
U U Uracil (U) szubsztituált DNS BER
DNS kettősszál törések Kromoszóma fragmentálódás SEJTHALÁL
12
dUTPáz hiánya
6.ábra: A dUTPáz szerepe a dTTP bioszintézisben és a DNS uracilmentességének biztosításában
Azáltal, hogy a dUTPáz alacsonyan tartja a dUTP szintet, megelőzi a hibás DNS szintézisét, tehát preventív hibajavító funkcióval bír. Összegzésként megállapítható, hogy a dUTPáz enzim azon kevés fehérjék egyike, mely mind a DNS replikáció hűségének biztosításában, mind a nukleotid bioszintézisében fontos szerepet játszik.
13
1.1.2. A dUTPáz potenciális szerepe a gyógyászatban A dUTPáz enzim esszenciális jelentőségű mind prokarióta, mind eukarióta szervezetek számára, továbbá sok vírus genomja is hordozza a dUTPáz gént. Elsősorban aktívan osztódó sejteknek van szüksége dUTPázra, pontos, uracilmentes DNS replikációhoz. Nyugvó sejtek dUTPáz szükséglete a hibajavítás során végbenő DNS szintézisre korlátozódik. Humán sejtekben a nukleáris dUTPáz expressziója sejtciklushoz kötötten szabályozott, a dUTPáz csak a sejtciklus S (DNS szintézis) fázisában mutatható ki. A fent említettek miatt a dUTPáz gátlása aktívan osztódó sejtekben káros, például tumorsejtekben, mert timinmentes sejthalált indukál. A tumor sejtekben fellépő mutációk közül a p53-at érintők nagyon gyakoriak: a p53 funkció kiesés a tumorok több, mint 50%-ában fordul elő. Ezekben a sejtekben a klasszikus értelemben vett apoptózis nehezen váltható ki. A timinmentes sejthalál egy p53 független apoptotikus út, így a p53 funkciót már elvesztett rákos sejteknél is indukálható. [7.] Ezek alapján egy dUTPáz inhibitor ígéretes rákterápiában alkalmazható gyógyszer lenne. [9.] Tumoros sejttenyészetek vizsgálata során kimutatták, hogy a dUTPáz expressziója sejtvonalanként nagyon eltérő lehet, így önmagában egy inhibitor csak korlátozott esetben lenne hatékony terápia. [9.] Jelenleg a klinikai alkalmazásban lévő kemoterápiák nagy része a DNS szintézis gátlásán alapszik vagy DNS károsodást okoz, így akadályozza meg a rákos sejtek további osztódását, és idézi elő azok pusztulását. (A daganatos sejtekre jellemző elsősorban a gyors egymást követő osztódási ciklusok.) E drogok egyik családja a timidilát bioszintézis útját gátolja, például antifolátok és fluoropirimidin származékok. A fluoro-dezoxiuridin-monofoszfát (FdUMP) a timidilát szintetázt (TS), míg a methotrexát a dihidro-folát reduktáz (DHFR) enzimet gátolja. (7.ábra) E szerek alkalmazásánál gyakran rezisztencia alakul ki, és a rákos sejt nem reagál többet a kemoterápiára. [10.] [11.] A rezisztencia kialakulásáért gyakran a dUTPáz megnövekedett expressziója a felelős, ekkor több dUMP szintetizálódik a sejtben és a dTMP szintézishez több szubsztrát keletkezik. Ezen tapasztalatok
14
alapján dUTPáz antagonista alkalmazásával a TS rezisztencia kialakulása elkerülhető lenne. [12.] [13.]
7.ábra: Timidilát metabolizmus gátlásának lehetőségei dUTPáz expresszió vizsgálata hasznos információkkal szolgálhat TS inhibitor alapú terápia hatékonyságának jóslásához, mivel azok a tumorok, melyek nem expresszálják a dUTPázt, jobban reagálnak ilyen kemoterápiára. [6.] A rákellenes kemoterápiás lehetőségeken túlmenően egy dUTPáz inhibitor tervezése és alkalmazása hatékony stratégia lehet sok patogén vírus ellen, melyek kódolják és expresszálják a dUTPázt replikációs ciklusuk alatt. Jelenlegi tudásunk szerint elsősorban olyan vírusoknak van szüksége dUTPázra, melyek nem aktívan osztódó sejteket fertőznek, például a herpesz vírusok. [14.] Egy új irányzata a dUTPáz kutatásnak a paraziták dUTPáz enzim fehérjéjét célozza, mely szerkezetileg eltérő a humán dUTPáz szerkezetétől, így elméletileg tervezhető hozzá specifikus gátlószer. [15.] Talán egy dUTPáz inhibitor lesz a jövő gyógyszere Leishmania major, Trypanosoma cruzi vagy Plasmodium falciparum egysejtű paraziták okozta megbetegedések esetében. [16.] [17.] [18.]
15
A dUTPáz gátlása többféle módon is megvalósulhat egy terápia során. Direkt módon tervezhető a dUTPáz enzimet inaktiváló inhibitor vagy indirekt módon, más, a dUTPáz szabályozásában szerepet játszó folyamatokat perturbáló ágens is alkalmazható szer lehetne. Egyik ilyen, a dUTPáz szabályozásában szerepet játszó folyamat a dUTPáz transzportja a sejtmagba. A dUTPáz nukleáris transzportjának gátlása a dUTPáz funkció kiesését okozná hasonlóan, mint magának az enzimnek a gátlása. Többek között ezért is érdekes, izgalmas és időszerű kutatási téma a dUTPáz lokalizációjának vizsgálata. 1.1.3. A dUTPázok szerkezete dUTPáz aktivitással szerkezetileg háromféle fehérjecsoport bír. Elsőként említeném a heterodimer szerkezetűeket, ilyen az egysejtű patogének esetében leírt dUTPáz enzim, mely mind szerkezetében, mind szekvenciájában teljesen eltérő a következőkben jellemzésre kerülő EuBaR, valamint a herpesz típusú dUTPázok csoportjától. [19.] Az EuBaR dUTPázok a legelterjedtebbek, eukarióta, bakteriális és retrovirális enzimek alkotják e csoportot. Annak ellenére, hogy az EuBaR csoporton belül a dUTPázok szekvenciája nagyon eltérő lehet - szekvencia egyezés mindössze 31%-os -, feltekeredése (folding) erősen konzervált, retrovírusoktól az emberig homotrimert alkot.(8.ábra) [20.,21.,22.,23.] Az alegységeket 133-168 aminosav alkotja és öt konzervált motívum jellemzi. Az enzim három egyenértékű és azonos aktív centrumot hordoz, minden egyes aktív centrum felépítésében mindhárom alegységhez tartozó oldalláncok részt vesznek. Az alegységek között létrejövő ilyen magas fokú kooperáció szokatlan a homooligomer fehérjék körében. A C. elegans dUTPáza már DNS szinten is homotrimerként kódolt, és így az alegységek között kovalens kapcsolat áll fenn.
16
Monomer A
Monomer C Monomer B
8.ábra - A dUTPáz trimer szerkezete A homotrimer enzim egyes alegységei eltérő színű szalagmodellel ábrázolva. Az aktív helyen kötött ligandumot (dUDP) pálcika-modell szemlélteti.
Az eukarióta dUTPáz esetében poláris és töltéssel rendelkező oldalláncok alakítják ki az alegységek közötti benső központi csatornát, míg a bakteriális és retrovirális dUTPáznál leginkább hidrofób kölcsönhatások képezik az összetartó erőt. E megfigyelés alapján a trimer dUTPázok családjának két jól elkülöníthető alcsaládja van. [24.] A herpesz típusú dUTPázok monomerek. Bennük a konzervált motívumok sorrendje eltérő, mint az EuBaR típusúaknál. [24.] Az enzim fontos kofaktora a Mg++-ion, mely elősegíti a szubsztrát kötődését és a katalízis sebességét maximalizálja. Minden alegység tartalmaz egy Mg++-iont. [25.] [26.]
17
1.1.4. dUTPáz izoformák Drosophila melanogaster-ben Drosophila melanogasterben két dUTPáz izoformát azonosítottak egy 21 és egy 23kDa-ost. A 23kDa-os izoformát csupán egy N-terminális régió különbözteti meg a 21kDa-os izoformától.(9.ábra) A Drosophila genomban egy dUTPáz gén található, mely egyetlen egy promóter régió szabályozása alatt áll, míg a humán enzim esetében a két dUTPáz izoforma expresszióját két különböző promóter szabályozza. [27.] [28.] Transzkripció során a DNS szálról egy úgynevezett pre-mRNS íródik át, mely tartalmazza az intronokat (nem kódoló szakasz) és exonokat (kódoló szakasz) egyaránt. A pre-mRNS-bõl kivágódnak az intronok, az exonokból pedig összeszerelődik az érett mRNS (RNS splicing), mely jóformán csak fehérjét kódoló szekvenciából áll. A pre-mRNS-ből a Drosophila dUTPáz esetében kétféle érett mRNS transzkript keletkezik, oly módon, hogy a rövid izoformát kódoló RNS-ből hiányzik az első exon. [28.] Az exonok szabályozott kombinálódása révén nyert többféle mRNS láncot létrehozó mechanizmust alternatív RNS splicing-nak nevezzük. [29.]
23kDa 21kDa
N’
C’
dUTPáz konzervált mag
PAAKKMKID
28as hosszúságú C terminális szegmens Ala/Pro gazdag régió Funkciója egyelőre ismeretlen
9.ábra: Drosophila melanogaster dUTPáz két izoformája
18
Transzláció után a 23kDa-os izoformáról levágódik az N-terminális kezdő metionin aminosav, ez a poszt-transzlációs módosítás rövidíti a fehérje féléletidejét.(10.ábra) A rövid izoformában lévő kezdő metionin sorsát egyelőre homály fedi. [28.] Mindkét izoforma tartalmaz egy flexibilis C-terminális szakaszt (10.ábra), mely nincs jelen sem a humán, sem az E. coli enzimben. [30.] Feltételezésünk szerint ez a régió valamilyen fehérje-fehérje kölcsönhatásban szerepet játszó kötő felszínt biztosíthat és részt vehet az enzim szabályozásában. A patkány dUTPáz egy Nterminális szakaszt tartalmaz, melynek szintén nincs a katalitikus reakcióban szerepe. Ez a szekvencia hordoz egy LXXLL motívumot, mely a kísérletek alapján a PPARα (Peroxiszóma osztódás aktiválta receptor alfa) fehérje kötéséért felelős. [31.]
(M)PSTDFADIPAAKKMKIDTCVLRFAKLTENA LEPVRGSAKAAGVDLRSAYDVVVPARGKAIVKT DLQVQVPEGSYGRVAPRSGLAVKNFIDVGAGVV DEDYRGNLGVVLFNHSDVDFEVKHGDRIAQFIC ERIFYPQLVMVDKLEDTERGEAGFGSTGVKDLP AAKAQNGNGEKAAEPEGAAPAPVAT
10.ábra:
Drosophila
dUTPáz
szekvenciája Piros: két izoforma kezdő metioninja, aláhúzott: PAAKKMKID szekvencia az NLS, sárga: C terminális lánc
A 23kDa-os izoforma tartalmaz egy, a csoportunk által szekvencia homológia kereséssel azonosított nukleáris lokalizációs szignált (NLS), míg a rövid izoformában nem találtunk semmilyen lokalizációt irányító szekvenciát. Ebből a szempontból
fontos
különbségre
derült
fény
a
humán
izoformákkal
összehasonlítva. Az egyik humán dUTPáz izoforma ugyanis mitokondriális lokalizációs szignált tartalmaz és valószínűleg a mitokondriumban zajló DNS replikácó
hűségének
megőrzéséhez
fontos. [32.][33.] Ezzel
ellentétben,
Drosophilában a mitokondriumban egyik dUTPáz izoforma sincs jelen és a 21kDa-os izoforma funkciója egyelőre ismeretlen. A Drosophila enzim 23kDa-os izoforma NLS szekvenciája homológiát mutat más humán fehérjékben kimutatott NLS funkcióval bíró szekvenciákkal. (1.táblázat) [28.] 19
Drosophila dUTPáz Humán c-myc
PAAKKMKID PAAKRVKLD
Humán RanBP
PPVKRERTS
Humán 23kDa
SPSKRARPA
1.táblázat: Drosophila dUTPáz NLS szekvenciához hasonló NLS-ek 1.1.5. A Drosophila melanogaster dUTPáz szerepe az ecetmuslica fejlődése során Az ecetmuslica teljes átalakulással (holometamorphosis) fejlődik, vagyis egyedfejlődése során a pete-lárva-báb-imagó stádiumokon megy keresztül. Báb állapot alatt a lárvális szövetek lebomlanak, és az immaginális diszkuszokból fejlődnek ki a felnőtt állat szervei. A lárvális szövetek lebomlása autofágiával és apoptózis útján megy végbe. Hipotézisünk szerint ehhez a folyamathoz a timinmentes sejthalál is hozzájárul, oly módon, hogy nagymértékű DNS degradációt idéz elő. Timinmentes sejthalál beindulásához magas uracil tartalmú DNS szükséges. Ennek az a feltétele, hogy hiányozzon a dUTPáz aktivitás a lárva stádiumok alatt – dUTP épüljön be DNS szintéziskor –, és ne legyen jelen aktív uracil-DNS glikoziláz ami a hibát kijavíthatná. Az utóbbi feltétel már genomi szinten megvalósul, mivel hasonlóan a többi teljes átalakulással fejlődő rovarhoz, az ecetmuslica genomból is hiányzik ez az enzim. [34.] Hasonló funkciót feltehetőleg egy uracil specifkus endonukleáz láthat el, melynek azonosítása és karakterizálása jelenleg folyik. A dUTPáz expressziója fejlődési állapottól függően szabályozott. A petében még jelen van az anyai eredetű enzim, majd a lárva stádiumok során kizárólag az immaginális diszkuszokban mutatható ki a dUTPáz, tehát teljesül a timinmentes sejthalál beindulásához szükséges másik előfeltétel is. Báb állapotban a dUTPáz expressziója hirtelen megnő, ami összhangban van azzal a ténnyel, hogy báb 20
állapotban intenzív sejtosztódások követik egymást, és az imagó légy szöveteinek kialakulásakor a dUTPáz fontos a DNS integritásának megőrzéséhez. [28.] Egy dUTPáz inhibitort is feltételeznek, mely feltehetőleg a dUTPáz fejlődési állapottól függő szabályozásáért felelős. [35.] Felnőtt légyben csak az osztódó szövetekben: ováriumban és immaginális diszkuszokban sikerült kimutatni a dUTPázt. A fejlődési stádiumok során a két dUTPáz izoforma körülbelül azonos arányban van jelen. [28.]
1.2. Sejtmagi lokalizáció 1.2.1. Nukleáris transzportfolyamat áttekintése Eukarióta sejtekben a DNS állomány a sejt egy elkülönült részében (kompartmentumban), a sejtmagban (nucleus) található. A sejtmagban zajlanak le a DNS-hez kapcsolt folyamatok: a DNS replikáció és a transzkripció. Ily módon, ellentétben a prokariótákkal, egy eukarióta sejtben térben és időben jól elkülönülten zajlik le a transzkripció (génátírás/ RNS szintézis) és a transzláció (fehérje szintézis). A fehérjék a citoplazmában szintetizálódnak, de a sejtmagban is rendkívül fontos feladatokat látnak el: génexpresszió, sejt ciklus szabályozása, külső szignálok közvetítése (szignáltranszdukció), valamint osztódás, növekedés és sejthalál. Egy becslés szerint egy eukarióta sejt fehérjéinek körülbelül 17 százaléka a sejtmagban látja el feladatát. [36.] A fehérjék bejutása a sejtmagba a maghártya miatt akadályozott, de egy hatékony transzport-mechanizmus biztosítja az anyagforgalmat. E transzportfolyamat komponensei az evolúció során mind funkció, mind szerkezet szempontjából megőrződtek és a mechanizmus azonos sémát követ. Ez a transzportfolyamat biztosítja nagyon változatos természetű, szerkezetű és méretű molekulák hatékony szállítását. A nukleáris transzportfolyamat juttatja be a sejtmagba a karioplazma strukturális fehérjéit (például hisztonok), a transzkripcióhoz és replikációhoz szükséges fehérjéket (például polimerázok), az RNS splicing-hoz a snRNP-et (kis nukleáris ribonukleoprotein), valamint a DNS javításhoz szükséges fehérjéket és
21
mindezen folyamatokat szabályozó fakorokat. Ugyanez a mechanizmus biztosítja az mRNS (hírvivő RNS), a tRNS (transzfer RNS) és a riboszómák exportját a sejtmagból a citoplazmába. A szignál molekulák bejutása a sejtmagba nagyon fontos azért, hogy a sejt transzkripció szinten is tudjon reagálni a belső környezetére,
illetve
az
őt
ért
külső
hatásokra.
[37.]
A
sejtmag
kompartmentalizációja lehetővé tette a szabályozás un. szekvesztáló (sequester) módját, aminek alapja, hogy a fehérje lokalizációja szabályozott, és ezáltal korlátozza annak aktivitását. [38.] Eukarióta sejtben a sejtmagot a sejtmaghártya (nuclear envelope) veszi körül. Mitózis alatt a sejtmaghártya lebomlik és alkotóelemei az endoplazmatikus retikulumba (ER) kerülnek. [39.] A sejtmaghártyát (nuclear envelope) egy kettős lipid membrán alkotja, ami folytonos az ER-mal. A nukleáris pórus komplexeknél (NPC) kapcsolódik egymáshoz a sejtmag felőli (inner) és a citoplazma felőli (outer) membrán. A belső membrán alatt a lamina húzódik, mely intermedier filamentumokból áll. A sejtmaghártya alatt a laminát alkotó filamentumok, a NPC-hez kötött fehérjeláncok és a kromatin fehérjéi egy protein hálózatot képeznek. [39.] A sejtmagba csak a NPC-en keresztül juthatnak be hidrofil komponensek, a sejtmaghártya számukra átjárhatatlan. [40.] A NPC csatornaként szolgál, és mindkét irányú transzportnak - sejtmagból a citoplazmába és citoplazmából a sejtmagba - teret biztosít, egy adott pillanatban egy darab NPC-en keresztül is végbemehet akár mindkét irányú transzport folyamat. A NPC-en keresztül lezajló transzport rendkívül hatékony, 520-1000 molekula is átjuthat egyik oldalról a másikra egyetlen egy darab NPC-en keresztül egy másodperc alatt. Az
ionok,
kisebb
molekulák,
metabolitok
(pl.:
nukleotidok),
és
kis
molekulatömegű fehérjék (<40kDa) passzív transzport folyamat során, diffúzióval jutnak el a NPC-en keresztül a megfelelő sejttérbe. 40kDa-nál nagyobb makromolekulák szállításáért aktív, energia befektetést igényélő mechanizmus a felelős. A szállítható molekula méretének a NPC csatornájának átmérője szab határt, melyen 39nm-nél nagyobb átmérőjű makromolekulák nem juthatnak át.
22
Ellentétben a mitokondriális és az ER-ba zajló fehérjeimporttal, ahol kitekert (unfolded) preproteinek jutnak át a megfelelő csatornákon, a sejtmagba a fehérjék harmadlagos ill. negyedleges szerkezetüket megőrizve jutnak be, a transzporter fehérjékkel többtagú komplexeket alkotva. A nukleáris pórus komplexek, mint ahogyan azt a nevük is jelzi, hatalmas fehérje komplexek, az őket alkotó proteineket nukleoporinoknak (NUPs) nevezik. A NPC szerkezete konzervált és nagyon hasonló minden eukarióta sejtben, legyen az sörélesztő vagy humán sejt. Emlős rendszerekben a felépítése kissé összetettebb, humán sejtből izolált NPC-et többféle alegység alkotja és finomabb szabályozás jellemzi. Gerinceseknél körülbelül 30-50 különféle nukleoporinból épül fel és a mérete elérheti a 60 MDa-t. [41.] [42.] Három fő szerkezeti alegység különíthető el: citpolazmatikus fibrilumok, központi mag, és kosár.(11.ábra) A központi csatornát 8 un. küllő építi fel, melyek a citoplazmafelőli és a sejtmagi gyűrűk között húzódnak. Mind a citoplazmába nyúló fibrillumok, mind a sejtmagban lévő kosár dokkoló felszínt biztosít a transzportereknek és a szabályozó elemeknek. [38.]
Citoplazmába nyúló filamentumok Külső gyűrű Citoplazma
Sejtmag
Belső gyűrű Kosár Disztális gyűrű
Riboszóma
11.ábra: A NPC szerkezetének sémája (Nature Reviews Cancer 2004 Febr.p106)
23
Az aktív transzport-folyamathoz energia és szállítómolekula szükséges. Szállítómolekula feladatát az un. karioferin (karyopherin) transzport receptorok látják el. A karioferineket a szállítás irányától függően exportinnak vagy importinnak is nevezik. [40.] A szállítandó molekula vagy kargó, hordoz egy szignál szekvenciát, ami kijelöli, hogy a kargónak mely sejttérbe kell mennie. A nukleusba való bejutáshoz egy un. nukleáris lokalizációs szignál (NLS), míg a citoplazmába kijutáshoz egy nukleáris export szignál (NES) szükséges. Ezeket a szignálokat ismerik fel a transzport receptorok. Nukleáris import esetében a NLS-t az importin-α ismeri fel és azon keresztül köti a kargót, mintegy adaptorként szolgálva. Az importin-α-hoz kötődik az importinβ, ami a transzport folyamatot közvetíti. A szubsztrátok sokféleségéhez képest a karioferinek száma erősen limitált, tehát annak a néhány féle transzporter szerkezetnek kell rengeteg féle szubsztrát kötését lehetővé tenni. Importin-β-án végzett energy landscape mérések szerint az importin-β-nak az energy landscapeje „hepehupás”, tehát képes sokféle különböző konformációt felvenni, így különböző ligandokat kötni. [43.] A kargo, az importin-α és az importin-β trimer komplexet alkot, majd a NPC citoplazmába
nyúló
fibrillumain
dokkolódik.
A
NPC-en
való
átjutás
mechanizmusa nem pontosan ismert, feltehetőleg egy sor asszociációs és disszociációs lépésből áll, ami a nukleoporinok és a transzport komplex között történik meg. A nukleoporinok felszínén lévő FXFG vagy GLFG motívum ismétlődései vesznek részt a transzport receptor kötésében és ezeken a karioferinek úgymond „átlépkednek” a membrán másik oldalára. [38.] Ez a mechanizmus feltételezi, hogy a nukleoporinok és egyúttal a NPC szerkezete dinamikusan változhat, és flexibilis kötőfelszínt biztosít. [44.] Ezt támasztja alá az a tény is, hogy több mint 20 karioferin ismert emlős sejtben, melyek mind ugyanazon a NPC-en keresztül közlekednek. [37.]
24
A sejtmagban a transzport komplex szétdisszocál a RanGTP - importin-β kötés hatására, majd a RanGTP-importin-β komplex reciklizálódik a citoplazmába. Az imporin-α−t annak a saját export receptora, a CAS szállítja vissza.(12.ábra) [38.] A Ran egy Ras fehérjecsaládba tartozó, kis molekulatömegű G fehérje (GTPáz aktivitása van), mely két eltérő konformációban van jelen a sejtmaghártya két oldalán attól függően, hogy GTP-t vagy GDP-t köt. [45.] RanGTP elsősorban a sejtmagban van jelen, és a citoplazmából bejutott transzport komplex disszociációját okozza. A sejtmagból történő export folyamatnál szerepe épp ellenkező, a transzport komplex összeépüléséhez szükséges. Az exportált komplex disszociációját a citoplazmában egy RanGAP (Ran GTPáz aktiváló protein) okozza, mely aktiválja a Ran fehérje GTPáz aktivitását, és a Ran fehérje GDP kötött állapotba kerül, ami kisebb affinitással kötődik már az exportin (CRM1)-kargó komplexhez. A RanGDP visszakerül a sejtmagba, ahol egy RanGEF (Ran guanozin cserélő faktor) kicseréli a GDP-t GTP-re. A folyamat eredménye, hogy a RanGTP a sejtmagban, a RanGDP a citoplazmában lokalizálódik. (12.ábra) A RanGTP/RanGDP eltérő lokalizációja hajtja a nukleáris transzport folyamatokat, azáltal hogy a transzport receptor-kargó komplexek asszociációját és disszociációját okozza a megfelelő kompartmentumban. [40.] A Ran közvetítette transzport aktív folyamat, GTP hidrolízisével, tehát energia befektetéssel jár. Az előbbiekben vázolt nukleáris transzportmechanizmus a valóságban lejátszódó folyamat egy egyszerűsített modellje, melyhez más, szabályozó rendszerek kapcsolódnak. Jól ismert tény, hogy a kargo foszforiláltságától függ annak lokalizációja. Egy kevésbé széles körben elterjedt eredmény szerint a szállítandó fehérjéhez kapcsolt N-acetilglükózamin (O-GlcNAc) csoport megléte vagy hiánya is a nukleáris lokalizációt befolyásoló tényező. [46.] A transzportfolyamatban részt vevő komponensek szerepköre egyre bővül, és nem kizárólagosan a transzportra korlátozódik. A RanGTP nélkülözhetetlen a NPC összeszerelődéséhez, és imporin-β szükséges a sejtmaghártya felépüléséhez. [47.]
25
RanGDP
NLS protein
NES protein
CRM1
α β
Ran GAP
Citoplazma NPC Sejtmag RanGTP NLS protein
NES RanGTP protein
β
CRM1
α
12.ábra: Nukleáris transzportfolyamatok egyszerűsített sémája. Import receptorok: α = importin-α, β= importin-β; Export receptor: CRM1
Egy fehérje nukleáris transzportjának felderítése több szempontból is érdekes lehet, fontos információkkal szolgálhat a fehérje szabályozásának megértéséhez, a kölcsönható partnerek megismeréséhez. Ezen alapkutatásból származó eredmények rengeteg ötletet adhatnak vírusok elleni vagy rákterápiát célzó gyógyszerkutatásnak. A sejtmagba való célzott bejuttatása a drognak növelheti annak hatékonyságát és specificitását.
1.2.2. Nukleáris lokalizációs szignál szekvenciák (NLS) Eukarióta sejtben többféle sejtorganellum térben szeparáltan van jelen a citoplazmától, a fehérjeszintézis helyétől. Mindegyiknek azonban van megfelelő transzport mechanizmusa, amivel hozzájut a szükséges komponensekhez. A proteinek esetében, a fehérjének tartalmaznia kell egy szignál szekvenciát, ami a megfelelő organellumhoz irányítja és engedélyezi a bejutást. Ilyen például az ER fehérjéinek a retenciós KDEL szignálja is.
26
A sejtmagba való bejutáshoz egy NLS (nukleáris lokalizációs szignál), kijutáshoz egy NES (nukleáris export szignál) szükséges. Azok a fehérjék, melyek hordozzák mind a két típusú szignált, képesek a citoplazma és a sejtmag között ingázni. A NLS-ek egy-egy rövid, néhány aminosavból álló szekvenciák, melyek egy sor bázikus aminosavból állnak, elsősorban lizinből néhány argininnel tarkítva. A klasszikus NLS-ek egy 9 aminosav hosszúságú szignálban legalább 5 bázikus aminosavat tartalmaznak. Ilyen például a SV40 vírus nagy T antigénjének vagy a LEF-1 (limfoid stimuláló faktor 1) fehérjének a NLS-e. [48.] Gyakori, hogy ezek a szignálok tartalmaznak még egy prolint is, ami úgyszintén fontos a felismeréséhez. A szignál lehet egytagú (monopartite) vagy kéttagú (bipartite), ahol a két szignál szekvencia közé néhány aminosavnyi (kb. 10) szakasz ékelődik. A NLS a fehérje felszínére esik, biztosítva annak hozzáférhetőségét és egyszerű felismerését. Az utóbbi években azonosítottak több olyan NLS-t melyek kissé eltérnek a klasszikus NLS-ektől. Ilyen a c-myc humán onkoprotein szignálja is, mely csak három bázikus aminosavat tartalmaz és funkciójához egy savas karakterű aszparaginsav is nélülözhetetlen. A c-myc NLS-ának vizsgálata bebizonyította, hogy nem csak a megfelelő karakterű aminosavak megléte, hanem azok egymáshoz viszonyított helyzete is fontos. [49.] A c-myc NLS-éhez hasonló szignál szekvenciát hordoznak a RanBP3 (Ran Binding Protein 3), a humán és a Drosophila dUTPáz nukleáris izoformái is. A RanBP3 NLS-ének felismeréséért az importin-α3 a felelős. [50.] Feltételezhető, hogy a c-myc típusú nukleáris lokalizációs szignált tartalmazó fehérjék ugyanúgy transzportálódnak, mint a klasszikus NLS-t hordozó fehérjék, csak más importin izoforma ismeri fel őket.
27
SV40 T-ag LEF-1 Nucleoplasmin c-erb-A c-myc c-myb p53 N-myc RanBP3 Humán dUTPáz-N Drosophila dUTPáz
PKKKRKV KKKKRKREK KRPAATKKAGQAKKKK SKRVAKRKL PAAKRVKLD PLLKKIKQ PQPKKKP PPQKKIKS PPVKRERTS SPSKRARPA PAAKKMKID
2.táblázat: Különböző típusú nukleáris lokalizációs szignál szekvenciák: a klasszikus NLS szekvenciákat a táblázat első négy sora tartalmazza, a többi felsorolt NLS az un. nem-klasszikus típusú NLS csoportba tartozik. (A bázikus aminosavakat félkövér betűtípus, a fontos prolinokat aláhúzás jelöli.) [33, 49, 50, 51.]
Az irodalomban még egy teljesen eltérő típusú NLS-t említenek, melynek jellemzője egy glicin-gazdag régió. [36.]
28
2. Célkitűzés Kísérleteim célja a Drosophila melanogaster dUTPáz izoformák szubcelluláris lokalizációjának vizsgálata volt, melynek során az alábbi kérdésekre kerestem a választ: •
A két dUTPáz izoforma lokalizációjában milyen különbségek mutatkoznak?
•
Más NLS-okkal homológiát mutató PAAKKMKID szekvencia valóban NLS funkcióval bír-e?
•
Mesterségesen előidézett DNS károsodás hatására változik-e a dUTPáz lokalizációja?
•
Változik-e a dUTPáz lokalizációja a sejtciklus során?
•
Milyen más faktorok és mechanizmusok szabályozzák a dUTPáz szubcelluláris eloszlását?
•
21kDa-os dUTPáz izoformának mely folyamatokban lehet szerepe?
•
Hasonló NLS található-e más élőlények dUTPázában?
29
3. A kísérlet folyamata A vizsgálatokat Drosophila Schneider Line 2 sejtvonalon és Drosophila embriókon végeztem. Az enzim lokalizációját fluoreszcens proteinnel jelölt dUTPáz vizsgálatával követtem nyomon. A két izoforma összehasonlítása céljából két YFP (sárga fluoreszcens protein) fúziós dUTPázt kódoló plazmidot hoztam létre, amikkel külön-külön S2 sejteket transzformáltam. Puromicines szelekcióval stabil expressziós sejtvonalakat sikerült előállítani. A sejteket fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltam. DNS károsodást UV besugárzással idéztem elő. Másik kísérleti objektumként Drosophila embriót (4. stádiumban lévő) választottam, ahol a két izoforma eltérő viselkedését a sejtciklus különböző fázisaiban követtem nyomon. A YFP-dUTPázt expresszáló sejtvonalból nyert sejtextraktot mikroinjektáltam Drosophila embrióba, és in vivo fluoreszcens mikroszkóppal a két izoforma mozgását vizsgáltam. A kísérlet lépéseit a 13. ábra foglalja össze.
30
dUTPázt kódoló DNS szakasz felszaporítása LD 20050 plazmidról PCR-rel
pRm-YFP vektor tisztítása XL1Blue E.coli sejtből
Fragmens hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI
pRm-YFP vektor hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI
Megfelelő fragmens tisztítása agaróz gélből
Két fragmens ligálása
XL1Blue E.coli transzformálása pRm-21kDa-YFP és pRm-23kDa-YFP plazmidok tisztítása
S2 sejtek transzformálása és szelekciója S2 sejtek feltárása és sejtextrakt nyerése
UV besugárzással DNS
károsodás előidézése S2 sejtek vizsgálata konfokális lézer szkenning mikroszkóppal
Drosophila embrió mikroinjektálása
31 dUTPáz lokalizációjának vizsglata in vivo sejtmagosztódások alatt
pRm-YFP vektor tisztítása XL1Blue E.coli sejtből
Fragmens hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI
pRm-YFP vektor hasítása restrikciós enzimekkel: NotI és NheI
Megfelelő fragmens tisztítása agaróz gélből
Két fragmens ligálása
XL1Blue E.coli transzformálása pRm-21kDa-YFP és pRm-23kDa-YFP plazmidok tisztítása
S2 sejtek transzformálása és szelekciója S2 sejtek feltárása és sejtextrakt nyerése
UV besugárzással DNS
károsodás előidézése S2 sejtek vizsgálata konfokális lézer szkenning mikroszkóppal
Drosophila embrió mikroinjektálása
dUTPáz lokalizációjának vizsglata in vivo sejtmagosztódások alatt
13.ábra: dUTPáz lokalizációjának vizsgálata során elvégzett munka folyamata
32
4. Anyagok és módszerek 4.1. A pRm -YFP vektor A pRm-YFP egy Drosophila specifikus expressziós vektor, melynek mérete 4624bp.
(14.ábra)
(metallotioneinek:
Hordoz
egy
nehézfémek
ecetmuslica
detoxikálásában
metallothionein játszanak
promótert
szerepet),
ami
nehézfémmel (például: CuSO4) indukálható. Ampicilin rezisztencia gén biztosítja a pRm-YFP plazmiddal transzformált E.coli sejtek szelekcióját. A klónozó helyet egy YFP-t (sárga fluoreszcens protein) kódoló szekvencia követi, így a vektor alkalmas YFP fúziós fehérje expresszálására. Klónozó hely
NotI
NheI
YFP
Metallothionein promóter pRm-YFP 4624bp
Ampicilin rezisztencia
14.ábra: pRm-YFP plazmid sematikus felépítése 4.2. Drosophila melanogaster S2 (Schneider) sejtvonal Az S2 sejtvonalat I. Schneider 1972-ben izolálta kései (20-24órás) Drosophila embrióból. A sejtvonalat többféle sejt keveréke alkotja, makrofág és epithél szerű sejtekből áll, melyek szemi-adherens kultúrát képeznek. Az S2 törzset elterjedten használják a Drosophila kutatásban mint sejtes modellrendszert.
33
4.3. A pRm-21kDa-YFP és pRm-23kDa-YFP eszpressziós vektorok klónozása A külön-külön a 21kDa, illetve a 23kDa dUTPáz izoformát kódoló DNS darabot pRm-YFP vektorba klónoztam. A megfelelő dUTPáz génszakaszt PCR-rel szaporítottam fel az LD 20050 plazmidról, ami tartalmazta a teljes Drosophila dUTPáz gén cDNS-ét. A primerek NheI (5’ primer) illetve NotI (3’ primer) restrikciós enzimek hasítóhelyeit tartalmazták. A 3’ primer nem tartalmazta a gén STOP kodonját, így a YFP-t kódoló szakasza a plazmidnak is átíródott. A PCR fragmens, illetve a pRm-YFP vektor NotI és NheI enzimekkel való emésztését követően a ragadós végekkel rendelkező DNS fragmentumokat T4 DNS ligázzal (New England BioLabs) összeligáltam. A kész plazmidot XL1Blue kompetens sejtbe transzformáltam, felszaporítottam és onnan tisztítottam. A kész plazmidokat (pRm-23kDa-YFP és pRm-21kDa-YFP) szekvenálással (MWG) ellenőriztem. 4.4. PCR (Polymerase chain reaction) A PCR módszert DNS szakaszok amplifikálására használják. A PCR reakció egy ciklusa 3 lépésből áll: •
DNS szál denaturálása (94˚C) - DNS két külön szálra válik szét
•
Hibridizáció – a primerek hozzátapadnak az egyszálú DNS lánchoz
•
Elongáció (72˚C) - a polimeráz a primertől elindulva szintetizálja a templát DNS szál alapján a másik szálat
A ciklust 30-33-szor ismételjük, ami alatt a kívánt DNS szakasz mennyisége a ciklusok számával exponenciálisan emelkedik. A ciklusok számának további emelése nem vezet lényeges kópiaszám emelkedéshez, mivel a DNS polimeráz enzim aktivitása a ciklusok során lecsökken. Klónozáshoz PfuTurbo DNS polimerázt (Stratagene) használtam, ami egy hibajavító 3’-5’ exonukleáz aktivitással is rendelkező enzim.
34
Külön-külön a 21kDa és a 23kDa dUTPázt kódoló szakasz felszaporításához az alábbi primereket terveztem (15.ábra): •
5’primer (forward)
NheI
21kDa: 5’CTAGCTAGCATGAAGATCGACACGTGCGTCCTGCG3’ NheI
23kDa: 5’CTAGCTAGCATGCCATCAACCGATTTCGCCGAC3’ •
NotI
3’primer (reverz): 5’ATAGTTTAGCGGCCGCGTAGCAACAGGAGCCGGAGC3’
15.ábra: A felhasznált primerek szekvenciája. A beépített hasítóhelyeket és a restrikciós endonukleázok felismerőhelyeit piros szín jelzi.
A PCR reakció az alábbi program szerint zajlott (3.táblázat): 94˚C 2perc 62˚C 1perc 1× 72˚C 1perc 94˚C 15mp 62˚C 30mp 33× 72˚C 1perc 72˚C 10perc 1× 3.Táblázat: dUTPáz cDNS felszaporítására használt PCR program 4.5. Kompetens E.coli sejt előállítása és transzformálása E.coli XL1Blue törzsből előkultúrát 12,5 µg/ml tetraciklint tartalmazó 5 ml LB tápoldatban (1000 ml desztilált víz, 10 g tripton, 5 g élesztő kivonat, 10 g NaCl, pH 7.0) egy éjszakán át 37°C-on rázatóban növesztjük, majd másnap 50 ml LB-be abból 1 ml átoltunk, és addig növesztjük, míg a sejtek el nem érnek a logaritmikus növekedési fázisba. Ez fotometria alkalmazásával ellenőrizhető, a sejtszuszpenzió OD (optikai denzitás) értékének 0.4-0.6 közé kell esnie. A sejteket lefugáljuk (3600 rpm, 4°C, 20 perc), majd a sejtcsapadékot 5 ml 0.1 M MgCl 2-oldatban felszuszpendáljuk, és jégen inkubáljuk 20 percig. A következő lépésben újra lefugáljuk (3600 rpm, 4°C, 20 perc), ezután a sejtcsapadékhoz 1 ml 0.1 M CaCl 2oldatot adunk és jégen inkubáljuk további 20 percig.
35
Az így nyert kompetens sejt 150 µl-ét transzformáljuk 1-10 µl plazmiddal. A sejteket hősokkoljuk (30 perc jégen, 90 másodperc 42˚C-on, 2 perc jégen), majd 150 µl LB hozzáadása után 1 órán át 37˚C-on rázatjuk. A sejteket a megfelelő antibiotikumokat (12,5 µg/ml tetraciklin + 167 µg/ml ampicilin) tartalmazó táplemezre szélesztjük. Éjszkán át 37˚C-os termosztátban növesztjük. 4.6. Plazmid preparálás QIAGEN Midi Kittel A munkához szükséges plazmidokat QIAGEN Midi Kittel preparáltam. A kit tartalmaz egy anion-cserélő oszlopot, mely a tisztítási eljárás alapját képezi. Az anion-cserélő oszlop töltete pozitív töltésű és a felvitt oldatból a negatív töltésű ionokat (anionokat) és molekulákat köti. Az itt alkalmazott oszlop töltete dietil-aminoetil (DEAE) csoportokkal fedett, amihez a DNS lánc negatív töltésű foszfát csoportjai kötődnek. A mintát alacsony pH-án és sókoncentráció mellett visszük fel az oszlopra, ekkor a negatív töltéssel rendelkező komponenseket kiköti. Az RNS, a proteinek és alacsony molekulatömegű egyéb szennyeződések az oszlopról egy közepes ionerősségű mosással eltávolíthatóak, és a plazmid DNS szelektíven magas sókoncentrációjú pufferrel lemosható. A plazmid tisztítás lépései a következők: • • •
a baktérium tenyészet növesztése a baktérium sejtek összegyűjtése és alkalikus lízise a plazmid DNS tisztítása
1. Transzformált (a kívánt plazmidot hordozó) XL1Blue E.coli sejteket 50 ml LB tápoldatban tetraciklin (12,5 µg/ml) és ebben az esetben ampicilines (167µg/ml) szelekció mellett egy éjszakán át 37˚C-on rázatóban növesztjük.
2. A sejteket lefugáljuk (18000 rpm, 4˚C, 20 perc)
36
3. A sejteket 4ml P1 pufferben (50 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA;100µg/ml RNáz A) felszuszpendáljuk. Az oldatban található EDTA a Mg2+ ionok komplexbe vitelével a sejt nukleáz enzimeinek aktivitását gátolja, az RNáz A az RNS-eket bonja. 4. 4 ml P2 puffert (200 mM NaOH, 1% SDS) adunk a sejtekhez. Az SDS a membránok lipid szerkezetének dezintegrálásával idézi elő a sejtek lízisét. 5. 4 ml jéghideg P3 puffert (3.0 M kálium acetát, pH 5.5) hozzámérésével az oldatban szolubilizált fehérjék, membrán törmelékek, a hozzájuk kapcsolódó genomiális DNS-sel együtt kicsapódnak. A dodecilszulfát kálium sója is oldhatatlan, így az is a csapadékba kerül. 6. Lecentrifugáljuk (18000 rpm, 4˚C, 20 perc) a kicsapott anyagokat. 7. Az oszlopot 5ml QBT pufferrel (750 mM NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% izopropanol; 0.15% Triton® X-100) egyensúlyba hozzuk. Az ioncserélő oszlop töltött csoportjaihoz ebben a fázisban könnyen kicserélhető egyszerű ionok (klorid) kapcsolódnak. 8. A tiszta felülúszót, ami tartalmazza a plazmid DNS-t is, az oszlopra visszük, ahová az reverzibilisen köt. 9. Az
oszlopról
közepes
ionerővel
és
semleges
pH-n
lemossuk
a
szennyeződéseket 2×10 ml QC pufferrel (1.0 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% izopropanol) 10. A plazmid DNS-t nagy ionerővel és enyhén lúgos 5 ml QF pufferrel (1.25 M NaCl; 50 mM Tris·Cl, pH 8.5;15% izopropanol) eluáljuk. 11. A DNS-t izopropanollal kicsapjuk. 12. A csapadékot lecentrifugáljuk (13400 rpm, 15 perc, 4˚C) 13. A DNS csapadékot mossuk 70%-os etanollal 14. A csapadékot lecentrifugáljuk (13400 rpm, 15 perc, 4˚C) 15. A DNS csapadékot szárítjuk fülke alatt letakarva egy éjszakán át. 16. A csapadékot 50µl TE (10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA) pufferben feloldjuk és összemossuk 17. A minta DNS koncentrációját fotométerrel megmérjük, a plazmid tisztasága agaróz gélelktroforézissel ellenőrizhető.
37
Ezzel a módszerrel 50 µl 0,3-3 mg/ml koncentrációjú DNS izolálható. 4.7. DNS koncentráció mérése A DNS koncentrációját fotometriával a minta 200-400 nm közti spektrumát felvéve határozzuk meg. A mérést kvarc küvettában végezzük, 600 µl térfogatra hígítunk 1-5 µl mintát. A spektrumról leolvassuk a 260, 280, 350 nm-en mért értékeket. 260 nm-en a nukleinsavaknak, 280 nm-en a fehérjéknek (aromás aminosavaknak) van elnyelési maximumuk, 350 nm-en mért abszorbancia érték az alapvonal. A 280 nm-en mért érték a minta fehérjékkel való szennyezettségére utal. A Lambert-Beer-törvény szerint a minta DNS koncentrációja egyenesen arányos a mért abszorbancia értékkel. Tapasztalati úton meghatározták, hogy ha A260=1, akkor a [dsDNS]=50 µg/ml. A két összefüggésből kiszámítható a dsDNS (kettős szálú DNS) koncentrációja. 4.8. Agaróz gélelektroforézis Elektromos erőtér alkalmazásával a nukleinsavakat (DNS és RNS) vándorlásra késztetjük, az egyes nukleinsavak eltérő töltésük miatt különböző sebességgel mozognak, így ezen különbség alapján egymástól elválaszthatók. A nukleinsavak töltése arányos a tömegükkel és a hosszúságukkal, tehát a módszer tömeg szerinti elválasztásra is alkalmazható. A futás sebességét a nukleinsavak másodlagos szerkezete befolyásolja, azonos tömegű helikális és lineáris nukleinsav molekulák különböző sebességgel futnak. Nukleinsavak elektroforézisét agaróz gélben végezzük, az elválasztani kívánt nukleinsav méretétől függ a gél agaróz koncentrációja. Általában 0,75%-os agaróz gélt használnak, de 1kb-nál kisebb fragmensek elválasztására töményebb, 1-2%-os gél alkalmazása ajánlott. A nukleinsavakat etídium-bromiddal mutatjuk ki. Az etídium-bromid, ha DNShez kötődik UV fény hatására fluoreszkál. Az etídium-bromidot a gél mátrix tartalmazza. A DNS futtatás lépései a következők: • Agaróz gél öntése 38
• •
Elektroforézis Detektálás
1. 0.75%-os agaróz gélhez 22 ml TAE (0.04 M Trisz-acetát, 0.001 M EDTA; pH 8.0) pufferben feloldunk 0.15 g agarózt. Az elegyet mikrohullámú sütőben felforraljuk. 2. 50-60˚C hőmérsékletű oldatot a tartályba öntjük. 3. Kesztyűt húzunk! 4. 12.5 µl 0.008% etídium-bromidot adunk hozzá, a tartályt billentgetve alaposan elkeverjük. A fésűt behelyezzük. 5. Kb. 10 perc alatt bepolimerizálódik az agaróz 6. A gélt a tartállyal együtt behelyezzük a futtató kádba, amit feltöltünk TAE pufferrel. 7. A mintákat (1 µl Loading Dye (Fermentas) + 5 µl minta) és 5 µl 1 kb GeneRuler DNS markert (Fermentas) betöltjük a zsebekbe. 8. 100V-on végezzük az elektroforézist, kb. 30 percig. 9. A gélképet UV fénynél transzilluminátorral rögzítjük. 4.9 Drosophila S2 (Schneider) sejtvonal fenntartása Az S2 sejteket Drosophila SFM (Serum Free Medium - Gibco) tápoldatban tartjuk fenn, ami tartalmaz még 8mM L- glutamint és 10Unit/ml penicillin, illetve 0.1mg/ ml streptomicin (Sigma) antibiotikumokat. A sejteket 25 ˚C-on növesztjük. A médiumot 4 naponta cseréljük, és hetente a médium 5 ml-ébe 1 ml S2-t oltunk át. Az átoltást mindig steril körülmények között végezzük. 4.10. S2 sejtek transzformálása és szelekciója 2-5×104 S2 sejtet/lyuk, 24 lyukú sejttenyésztő tálcán egy éjszakán át növesztjük, 30-50%-os konfluencia eléréséig. A sejteket 0.5 µg tisztított plazmiddal 5 µl Cellfectin (Invitrogen) lipid alapú reagens jelenlétében transzformáljuk, 100 µl Opti-MEM (Gibco) médiumban. A Cellfectin reagens komplexet képez a plazmid DNS molekulákkal és képes átjutni a sejtmembránon.
39
Puromicin rezisztenciát kódoló plazmiddal is kotranszfektáljuk, a puromicin rezisztenciát hordozó plazmid 1:20 arányban van jelen a pRm plazmidhoz képest. A sejteket szelekció előtt 2 napig antibiotikum mentes médiumban növesztjük. A dUTPáz-YFP konstrukt expresszióját 6 órán át 0.7 mM-os CuSO4–oldatban történő inkubálással indukáljuk. Stabil expressziós törzset antibiotikumos szelekcióval hozunk létre. A sejteket 3 héten keresztül szelektáljuk 50 µg/ml puromicin (Sigma) jelenlétében, a médiumot ekkor 7 naponta cseréljük. 4.11. S2 sejtek vizsgálata konfokális lézer szkenning mikroszkóppal Stabil dUTPáz-YFP expressziós törzsből sejteket fedőlemezre növesztjük, minimum 6 órán át 0.7 mM CuSO4-tal indukáljuk. A sejteket mossuk PBS-sel (10 mM NaPO4, 0,9 % NaCl; pH 7.2), 3%PFA (paraformaldehid) oldatban fixáljuk (5 perc), majd háromszor mossuk PBS-sel. A DNS-t DAPI-val (10.000-szeres higítás PBTA-ban) (Sigma) jelöljük (30perc), amit megint mosás (3×) követ PBTA-val (1×PBS, 1%BSA, 0.05% TrtitonX-100, 0.02% nátrium-azid). Az aktint rhodamin-falloidinnel (Sigma) festjük (30 perc), majd a mintákat PBTT-vel mossuk (4˚C, éjszakán át). A mintákat beágyazzuk. A sejteket konfokális lézer szkenning mikroszkóppal (Olympus IX70) 60× olaj immerziós objektívvel vizsgáljuk. 4.12. UV fénnyel előidézett DNS károsodás hatásának vizsgálat A sejteket fedőlemezre növesztjük, 6 órán át 0.7 mM CuSO4-tal indukáljuk, majd a steril fülke UV lámpája alatt 2 órán át besugározzuk. A sejttenyésztő tálca fedelét amíg a besugárzás tart levesszük. A sejteket fluoreszcens mikroszkóppal (Leica) 100× olaj immerziós objektívvel vizsgáljuk.
4.13. S2 sejtek feltárása és sejtextrakt nyerése
40
Éjszakán át 0.7 mM CuSO4-tal indukált S2 sejteket pipettával lemossuk a sejttenyésztő flaska aljáról és Eppendorfba gyűjtjük. A sejteket lefugáljuk (1000rpm, 1 perc), PBS-ben mossuk, és egy eppendorfba gyűjtjük. 50µl feltáró pufferben (150 mM NaCl, 10% glicerin, 10 mM Tris pH 7.4, 1 mM DTT, proteináz inhibitor) szövethomogenizálóval jégen a sejteket szétdörzsöljük. Lecentrifugáljuk (14300 rpm, 15 perc, 4˚C), a felülúszót tiszta eppendorfba teszük és mikroinjektáláshoz használhatjuk.
4.14. Drosophila embrió mikroinjektálása Oregon R (vad) Drosophila melanogaster légytörzset 30 percig 25˚C-on petéztetünk, a petéket egy órán át termosztátban 25˚C-on inkubáljuk. Ez idő alatt jut el az ecetmuslica fejlődése a syntitialis blastoderma stádiumba. Az embriókat egyszer mossuk PBS-ben, majd hipós (Chlorox) kezeléssel a vitellinburkot leoldjuk. Az embriókat mossuk PBS-ben (3×), majd szenes agarkockára egy sorba kirakjuk. Tárgylemezre ragasztjuk át őket, 10 percig szárítjuk. A mikroinjektáláshoz és a mikroszkópos munkához lefedjük olajjal, hogy ne száradjanak ki. Az injektálást 20˚C-on végezzük. 4 µl S2 sejtextrakt és 4 µl 1%-os TRITC fluoreszcens protein konjugált dextrán keverékből körülbelül 200 picolitert injektálunk be minden embrióba mikromanipulátorral. Ez az embrió teljes térfogatának kb. 2%-át teszi ki. Az injektálás után azonnal az embriókat konfokális mikroszkóppal (Zeiss LSM410) vizsgáljuk.
41
5. Eredmények és értékelésük 5.1. Drosophila dUTPáz gén klónozása pRm-YFP vektorba Sikerült PCR-rel felszaporítani a megfelelő dUTPáz gént kódoló DNS szakaszokat, melyek várt méretüknek megfelelő helyen futottak agaróz gélen. (16.ábra) A 21kDa-os és a 23kDa-os dUTPáz izofomát kódoló két DNS szakasz mérete közti különbség a gél felbontása miatt csak nehezen kivehető. 1.
2.
3.
1. 1kb DNS marker (Fermentas) 2. 23kDa-os izoformát kódoló cDNS 3. 21kDa-os izoformát kódoló cDNS
16.ábra: PCR-rel amplifikált dUTPáz gén A PCR terméket M&N Nucleospin Extract Kittel tisztítottam, majd NheI és NotI enzimekkel egyszerre emésztettem. A pRm-YFP plazmidot szintén NotI és NheI enzimekkel elhasítottam, és a megfelelő fragmenst elektroforézis után agaróz gélből M&N Nucleospin Extract Kittel kitisztítottam. (17.ábra) A tisztítás során a minta jelentősen hígult, a tisztítás hatékonysága nem a legkedvezőbb. 1.
2.
3.
4.
17.ábra: A megfelelő fragmensek a tisztítás után 1. 1kb DNS marker (Fermentas) 2. pRm-YFP plazmid fragmens: hasítás és tisztítás után 3. 23kDa-os izoformát kódoló cDNS: hasítás és tisztítás után 4. 21kDa-os izoformát kódoló cDNS: hasítás és tisztítás után
42
A dUTPáz gént beillesztettem az elhasított pRm-YFP vektorba, így születtek a pRm-21kDa-YFP és pRm-23kDa-YFP plazmidok, amiket XL1Blue E.coli sejtekben szaporítottam fel. A transzformáció jól sikerült, intolerancia a plazmidok és az XL1Blue E.coli törzs között nem lépett fel. Három-három telepet PCR-rel ellenőriztem, mindegyik esetben felszaporodott a dUTPáz génnek megfelelő szakasz. (18.ábra) 1. 2. 3. 4. 5. 6.
7. 18.ábra:
Klónozás
ellenőrzáse
PCR
reakcióval: 1.
1kb DNS marker (Fermentas)
2-4. pRm-21kDa-YFP –vel transzformált telepek 5-7. pRm-23kDa-YFP –vel transzformált telepek
A szekvenálás megerősítette, hogy a klónozás sikeres volt, és a plazmidok tartalmazzák a dUTPáz gént. A plazmidokat QIAGEN Midi Kittel tisztítottam, az így nyert minták koncentrációját az alábbi táblázat tartalmazza: pRm-YFP pRm-23kDa-YFP pRm-21kDa-YFP
2.161 mg/ml 3.927 mg/ml 0.561 mg/ml
4.táblázat: Tisztított plazmidok koncentrációja
5.2 Drosophila dUTPáz izoformák lokalizációja S2 sejtekben S2 sejteket transzformáltam a pRm-YFP, pRm-23kDa-YFP és pRm-21kDa-YFP plazmidokkal Cellfectin reagenst alkalmazva. A transzfekció hatékonyága nem érte el Cellfectinnel elérhető legmagasabb értéket. Szelekció után minden 4-7. sejt expresszálta a megfelelő pRm vektor által kódolt fehérjét. 43
A sejtek DNS-ét DAPI-val, az aktint rhodamin-phalloidinnel festettem. A pRm-YFP-vel transzformált sejteket kontrollként használtam, ott az önálló YFP fehérje szubcelluláris lokalizációját néztem. Más kutatócsoportok tapasztalatai alapján a YFP fehérje önmagában, NLS-t hordozó partner nélkül is képes bejutni a sejtmagba. Az dUTPáz NLS-ének sejtmagba írányító szerepének bizonyításához elengedhetetlen volt a YFP viselkedésének tisztázása. Tapasztalataink megerősítették, hogy a YFP képes bejutni a sejtmagba. Megfigyeléseink szerint a YFP lokalizációja mind a nukleusra, mind a citoplazmára kiterjed. A 23kDa-os izoforma lokalizációja elsősorban a sejtmagra korlátozódik, de nem mutat
egyértelműen
együttes
előfordulást
a
DNS-sel.
Feltehetően
a
karioplazmában található valamely strukturális fehérjékhez kötötten van jelen, mivel a lokalizációja nem diffúz, hanem struktúrához való kötöttséget sugall.(19/ A és 19/B ábra) A 21kDa izoforma a citoplazmában marad, nem képes bejutni a sejtmagba. (19/C ábra) A 21kDa-os és a 23kDa-os dUTPáz izoforma esetében tapasztalt lokalizációbeli különbséget a két fehérje szekvenciájában rejlő különbségre lehet visszavezetni. A két izoforma N-terminális régiója tér el csupán egymástól, a 23kDa-os izoforma tartalmaz egy extra 14 aminosav hosszúságú láncot. A kísérleti eredmények szerint ez a 14 aminosavnyi szekvencia felelős a 23kDa-os izoforma sejtmagi lokalizációjáért. Az általunk szekvencia homológia alapján azonosított NLS, a PAAKKMKID szekvencia is ebbe a régióba esik, ezért valószínűsíthető, hogy az irányítja a 23kDa-os izoformát a sejtmagba. Habár a régió egyik részlete már megvan a 21kDa-os izoformában is, az nem elegendő a NLS funkcióhoz. Ezzel az eredménnyel összhangban van a humán c-myc fehérje NLS-val végzett
44
vizsgálatok, melyek szerint a teljes szignál szekvencia szükséges a fehérje sejtmagba történő transzportjához. A PAAKKMKID szekvenciával homológiát mutat a humán RanBP3 fehérje NLS-e (1.táblázat), melyről kimutatták, hogy transzportjáért az importin-3α a felelős. Feltételezhető, hogy a dUTPáz 23kDa-os izoformája is az importin-α és importin-β transzport receptorok közreműködésével a NPC-en keresztül szállítódnak a nukleusba. A Drosophila dUTPáz szekvenciájában eddig még nem találtak nukleáris export szignált. A többi EuBaR típusú dUTPázokkal összehasonlítva, a Drosophila dUTPáz szerkezetében a katalitikus magon kívül van egy extra 28 aminosav hosszú C terminális szakasz, melynek szerepe egyelőre ismeretlen. E szakaszon belül sem sikerült azonosítani semmilyen klasszikus vagy attól eltérő export szignált. A 28 aminosavnyi C terminális régió lokalizációt befolyásoló hatását még vizsgálni kívánjuk.
45
A
19.ábra: S2 sejtekben a dUTPáz izoformák lokalizációja. A dUTPáz-YFP zöld, a DNS kék, az aktin piros. A) A 23kDa-os dUTPáz izoforma a karioplazmában feltehetőleg valamilyen strukturális fehérjével együtt fordul elő.
B
B) A 23kDa-os izoforma nukleáris lokalizációt mutat.
C
C) A 21kDa-os izoforma a citoplazmában reked.
46
Az S2 sejteken végzett vizsgálatokhoz nem szinkronizált sejtvonalat, hanem a sejtciklus különböző stádiumában lévő sejteket használtam. Ez alkalmat adott interfázisban lévő, illetve osztódó sejtek együttes megfigyelésére. S2 sejtek osztódása az eukariótákra jellemző nyílt mitózissal zajlik. A mitózis nyílt, mert osztódás során a sejtmagpórusok szétesnek, a sejtmaghártya felbomlik és eltűnik, tehát megszűnik minden gát (barrier) a sejtmag és a citoplazma tere között. Mitózis alatt a fehérjék lokalizációját más faktorok irányítják, mint interfázisban. Osztódó sejtek esetében azt volt tapasztalható, hogy a 23kDa-os izoforma lokalizációja nem kizárólagosan a sejtmagnak megfelelő térre korlátozódott. (20.ábra) A megbomlott maghártyán át a dUTPáz kijutott és az egész sejtben előfordulhatott. Ennek ellenére a leánysejt DNS állománya körül nem figyelhető meg a felhalmozódása, mint az az anyasejt DNS-e körül megfigyelhető. Citokinézis alatt a sejtmaghártya már felépült, és a 23kDa-os izoforma ismét a sejtmagban van csak jelen. A leánysejtbe látszólag nem került a szülősejt dUTPázából.
20.ábra: A 23kDa-os dUTPáz izoforma lokalizációja osztódó S2 sejtekben. A dUTPázYFP zöld, a DNS kék, az aktin piros.
47
5.3 UV fénnyel előidézett DNS károsodás hatásának vizsgálata Ultraibolya sugárzás DNS károsodást okoz. A hiba kijavítása során végbemenő DNS szintézishez szükség van dUTPázra, hogy ne legyen uracil a DNS-ben, tehát UV fénnyel történő besugárzás hatására a sejt dUTPáz szükséglete elvileg megnő. E teóriából kiindulva UV fénnyel besugárzott sejtekben a két izoforma viselkedését vizsgáltuk. 2 órás UV fénnyel történő besugárzás után a sejtekben nem volt tapasztalható különbség a két dUTPáz izoforma lokalizációját illetően: a 23kDa-os izoforma a sejtmagban, a 21kDa-os izoforma a citoplazmában fordult elő. A 21kDa-os izoforma nagyobb mértékű DNS károsodás, illetve megnövekedett dUTPáz igény esetében sem volt képes belépni a sejtmagba. Ennek fényében levonható a következtetés, hogy a 21kDa-os izoforma funkciója nem a megfelelő dUTP/dTTP arány biztosítása a DNS hibajavításhoz kötött DNS szintézis során. 5.4 Drosophila dUTPáz izoformák lokalizációja ecetmuslica embrióban Syntitialis blastoderma stádiumban (1:20-2:10 min:h idős) lévő ecetmuslica embrió jó kísérleti objektum a mitózishoz kapcsolt folyamatok vizsgálatára, mert szinkronizáltan lezajló, gyors egymást követő mitózisok, un. magosztódások (nuclear clevage) követik egymást (10-13. magosztódás). Ezek az osztódások kizárólag a sejtmagokat érintik, mivel ekkor még nincsenek szeparált sejtek sejtmaghártyával elválasztva egymástól. A nukleáris transzport vizsgálatához azonban ez egy speciális rendszer, mert a Drosophila embrió ebben a fejlődési szakaszában lezajló osztódások un. félig-zárt (semi-closed)
mitózis
sémáját
követik.
[52.]
Ennek
során
a
NPC-ek
szétszerelődnek és komponensei az ER-ban raktározódnak, azonban a sejtmaghártya (itt: spindle envelope) nem bomlik fel. A dUTPáz két izoformájának a lokalizációjában megfigyelt különbség még élesebben jelentkezik interfázisban lévő embrióban, tehát a 23kDa-os izoforma kizárólag a sejtmagban, a 21kDa-os izoforma a citoplazmában fordul elő.(21.ábra)
48
Injektálás után nagyon gyorsan, néhány másodperc alatt a megfelelő sejttérbe kerül mindkét izoforma, ami bizonyítja a lokalizációt irányító mechanizmus nagyfokú specificitását, és hogy a 23kDa-os izoforma transzportja aktív folyamat.
B
A
100µm
25µm
21.ábra: A dUTPáz lokalizációja Drosophila embrióban. dUTPáz-YFP zöld, a TRITCdextrán piros. A dextrán túl nagy mérete miatt nem lépes bejutni a sejtmagba, és kirajzolja a citoplazmát. A) a 23kDa-os izoforma a sejtmagban lokalizálódik, B) a 21kDa-os izoforma a citoplazmában található. A körülhatárolt területen már elindult egy osztódási hullám, azok a sejtmagok már nem interfázisban vannak.
A magosztódások alatt ez a kép merőben változik. (22.ábra) (Csatololt CD: 23kDa és 21kDa képsorok) Amint szétszerelődnek a NPC-ek, a sejtmaghártya átjárhatóvá válik és az izoformák átjutnak a másik sejttérbe is: a 23kDa-os izoforma kiáramlik a citoplazmába, a 21kDa-os izforma pedig bejut a sejtmagba. A NPC szétesése profázisra tehető. [52.] Metafázis alatt a 21kDa-os izoforma akkumulálódik a kromoszómák körül, ami rendkívül érdekes és nem várt jelenség. Ez feltehetőleg valamilyen specifikus kötődés következménye lehet. Hipotézisünk szerint a 21kDa-os izoforma beáramlása akadálytalan, de a kötődés miatt a kiáramlás korlátozott. A 21kDa-os izoforma felhalmozódása a sejtmagban aktív folyamat, mely nem igényel NLS-t. Ezen eredményeink felvetik a lehetőségét, hogy a 21kDa-os dUTPáznak szerepe lehet a mitózis folyamatában. Nehéz azonban elképzelni olyan fehérje-fehérje közti kölcsönhatást, mely azért jöhet létre, mert a partner protein nem tartalmaz egy plusz szekvenciát. Hipotézisünkből ugyanis az következne, hogy a hosszabb
49
23kDa-os fehérje nem képes kötődni egy olyan fehérjéhez, ami kölcsönhat a 21kDa-os rövidebb izoformával. Ez csak úgy képzelhető el, ha 23kDa-os izoformát egy mechanizmus vagy más partner módosítja a nukleuson belül. A 21kDa-os izoforma esetleges szerepét a mitózisban vizsgálni szeretnénk. Telofázis alatt a NPC-ek összeépülnek és helyreáll a sejtmag és a citoplazma közötti transzporfolyamat. [52.] Minden fehérje a rá jellemző sejttérbe kerül. A 23kDa-os izoforma a sejtmagba transzportálódik, a 21kDa-os izoforma kirekesztődik a citoplazmába. Mind a két irányú transzport aktív folyamat. A Drosophila melanogaster dUTPáz izoformák lokalizációjának változása szorosan a sejtciklushoz kötött és a sejtmaghártya valamint a NPC-ek állapotától függ.
22.ábra dUTPáz izoformák lokalizációja ecetmuslica embrióban a magosztódások alatt. Interfázisban a 23kDa-os izoforma a sejtmagban, a 21kDa-os izoforma a citoplazmában található. Mitózis alatt, miután a NPC-ek szétestek, a 23kDa-os izoforma kiáramlik a citoplazmába, míg a 21kDa izoforma nukleáris akkumulációja figyelhető meg. Az akkumuláció a mitózis a metafázisára tehető. A kromoszómák szegregációja után felépül a két leánysejtmag maghártyája és a dUTPáz izoformák az interfázisban megfigyelt sejttérbe kerülnek vissza. A képeken a megfelelő stádiumban lévő sejtmagokat a piros kör jelzi.
50
23kDa
21kDa 5.5 Interfázis NPC és a sejtmagmembrán intakt
Profázis NPC szétszerelődik
Metafázis Kromoszómák a sejtmag félsíkjába rendeződnek
Anafázis
Telofázis NPC összeépülése elkezdődik
Citokinézis után Két új sejtmag kialakul
22. ábra 51
. dUTPáz nukleáris lokalizációs szignálok különböző organizmusokban Különböző szervezetek nukleáris dUTPáz izoformáiban a Drosophila dUTPáz NLS-lal homológ szignál szekvenciákat azonosítottam. Valamennyi megvizsgált dUTPáz szekvencia hordozott NLS-t. Ezek a szignálok a fehérje N-terminálisára estek, általában 10-14 aminosav távolságra a kezdő aminosavtól. Az azonosított NLS-ek a c-myc típusú NLS-ekhez hasonlítanak, 3 bázikus aminosavat tartalmaznak a 9 tagú szekvenciából. A kezdő prolin vagy szerin is feltehetőleg nélkülözhetetlen a nukleáris transzport folyamathoz. Valószínűleg a trimer fehérje mindegyik alegysége hordozza a NLS-t, kivéve a C.elegans dUTPáza. A fonálféreg dUTPáza már DNS szinten is homotrimerként kódolt, és így az alegységek között kovalens kapcsolat áll fenn. A trimer alegységei nem pontosan azonosak, és csak az egyik alegység hordoz NLS-t. Homo sapiens c-myc Homo sapiens RanBP3 Homo sapiens 23kDa dUTPáz Mus musculus dUTPáz Rattus norvegicus dUTPáz Gallus gallus dUTPáz Caenorhabditis elegans dUTPáz Drosophila melanogaster dUTPáz Konszenzus szekvencia
PAAKRVKLD PPVKRERTS SPSKRARPA SASKRARAE SVSKRARAE SPSKRQKGS PALKKSKTE PAAKKMKID PAzKKxKz
Lycopersicon esculentum dUTPáz Oryza sativa dUTPáz
SPzKRxRz PSPKVQKLD PLLKVKKLS
5. táblázat: Eukarióta organizmusok dUTPázának NLS-jai a humán c-myc és RanBP3 fehérje NLS-jával mutatnak homológiát. A növények dUTPázában lévő NLS ettől kissé eltérő.(z-apoláris aminosav, x-bármilyen aminosav)
Eredmények összefoglalása Munkám eredményeiből az alábbi következtetéseket tudtam levonni:
52
•
A Drosophila melanogaster dUTPázának NLS-ja a PAAKKMKID szekvencia.
•
A PAAKKMKID szekvenciát csak a 23kDa-os dUTPáz izoforma hordozza, ez a nukleáris izoforma.
•
A 23kDa-os izoforma RanGTP által hajtott szállítás következtében kerül a sejtmagba.
•
A 21kDa-os izoforma nem tartalmaz NLS-t és a citoplazmában lokalizálódik.
•
A 21kDa-os izoforma DNS károsodás esetében sem transzportálódik a nukleusba, nincs olyan kölcsönható partnere, mely lehetővé tenné intakt sejtmaghártyán és funkciónálisan ép NPC-en keresztül a sejtmagba történő transzportját.
•
A 21kDa-os fehérje specifikus kötődést mutat valamely sejtmagi fehérjéhez
magosztódás
során
Drosophila
sytitialis
blastoderma
stádiumban lévő embrióban. •
A 21kDa-os fehérje NPC és NLS független transzport folyamat révén akkumulálódik
a
sejtmagban,
ami
nem
aspecifikus
diffúzió
következménye. •
A 21kDa-os izoformának lehet mitózishoz kapcsolódó szerepe.
•
A dUTPáz NLS-e konzervált: a konszenzus szekvenciája PAzKKxKz illetve SPzKRxRz
A két izoformát érintő transzportfolyamatokat az alábbi, 23.ábra foglalja össze.
53
23kDa-os izoforma
21kDa-os izoforma
Interfázis NLS
Interfázis
dUTPáz
NPC
NLS függő NPC-on keresztül Aktív import
dUTPáz nukleus
Profázis
NLS nélkül a citoplazmában reked
nukleus
Profázis
NLS
NLS független NPC független Passzív folyamat
dUTPáz
dUTPáz
NLS független NPC független Aktív folyamat?
Telofázis
Telofázis
NLS
NPC
dUTPáz
NPC
NPC
dUTPáz
NLS független Aktív export
NLS függő NPC-on keresztül Aktív import
23.ábra: a Drosophila melanogaster dUTPáz két izoformájára ható transzport folyamatok a sejtciklus során.
54
Irodalomjegyzék 1.
Pearl, L. H. and R. Savva (1996). "The problem with pyrimidines." Nat Struct Biol 3(6): 485-7.
2.
Lindahl, T. (1993). "Instability and decay of the primary structure of DNA." Nature 362(6422): 709-15.
3.
Kouzminova, E. A. and A. Kuzminov (2004). "Chromosomal fragmentation in dUTPase-deficient mutants of Escherichia coli and its recombinational repair." Mol Microbiol 51(5): 1279-95.
4.
Goulian, M., B. M. Bleile, et al. (1986). "Mechanism of thymineless death." Adv Exp Med Biol 195 Pt B: 89-95.
5.
Traut, T. W. (1994). "Physiological concentrations of purines and pyrimidines." Mol Cell Biochem 140(1): 1-22.
6.
Pugacheva, E. N., A. V. Ivanov, et al. (2002). "Novel gain of function activity of p53 mutants: activation of the dUTPase gene expression leading to resistance to 5-fluorouracil." Oncogene 21(30): 4595-600.
7.
Munoz-Pinedo, C., F. J. Oliver, et al. (2001). "Apoptosis of haematopoietic cells upon thymidylate synthase inhibition is independent of p53 accumulation and CD95-CD95 ligand interaction." Biochem J 353(Pt 1): 101-108.
8.
Munoz-Pinedo, C., Robledo, G., et al (2004). "Thymidylate synthase inhibition triggers glucose-dependent apoptosis in p53-negative leukemic cells." FEBS Lett 570(1-3): 205-10.
9.
Grasser, F. A., B. F. Romeike, et al. (2001). "dUTPase in human neoplastic cells as a potential target for therapeutic intervention." Curr Protein Pept Sci 2(4): 349-60.
10.Ladner,
R. D. (2001). "The role of dUTPase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy." Curr Protein Pept Sci 2(4): 361-70.
11.Tinkelenberg,
B. A., Hansbury, M. J., et al (2002). "dUTPase and uracil-DNA glycosylase are central modulators of antifolate toxicity in Saccharomyces cerevisiae." Cancer Res 62(17): 4909-15.
12.Koehler,
S. E. and R. D. Ladner (2004). "Small interfering RNA-mediated suppression of dUTPase sensitizes cancer cell lines to thymidylate synthase inhibition." Mol Pharmacol 66(3): 620-6.
55
13.Chano,
T., K. Mori, et al. (2004). "Differentially expressed genes in multidrug resistant variants of U-2 OS human osteosarcoma cells." Oncol Rep 11(6): 1257-63.
14.Chen,
R., H. Wang, et al. (2002). "Roles of uracil-DNA glycosylase and dUTPase in virus replication." J Gen Virol 83(Pt 10): 2339-45.
15.Stout,
C. D. (2004). "Induced fit, drug design, and dUTPase." Structure (Camb) 12(1): 2-3.
16.Camacho,
A., F. Hidalgo-Zarco, et al. (2000). "Properties of Leishmania major dUTP nucleotidohydrolase, a distinct nucleotide-hydrolysing enzyme in kinetoplastids." Biochem J 346 Pt 1: 163-8.
17.Pena-Diaz,
J., M. Akbari, et al. (2004). "Trypanosoma cruzi contains a single detectable uracil-DNA glycosylase and repairs uracil exclusively via short patch base excision repair." J Mol Biol 342(3): 787-99.
18.Whittingham,
J. L., I. Leal, et al. (2005). "dUTPase as a platform for antimalarial drug design: structural basis for the selectivity of a class of nucleoside inhibitors." Structure (Camb) 13(2): 329-38.
19.Harkiolaki,
M., E. J. Dodson, et al. (2004). "The crystal structure of Trypanosoma cruzi dUTPase reveals a novel dUTP/dUDP binding fold." Structure (Camb) 12(1): 41-53.
20.Larsson,
G., L. A. Svensson, et al. (1996). "Crystal structure of the Escherichia coli dUTPase in complex with a substrate analogue (dUDP)." Nat Struct Biol 3(6): 532-8.
21.Mol,
C. D., J. M. Harris, et al. (1996). "Human dUTP pyrophosphatase: uracil recognition by a beta hairpin and active sites formed by three separate subunits." Structure 4(9): 1077-92.
22.Gonzalez,
A., G. Larsson, et al. (2001). "Atomic resolution structure of Escherichia coli dUTPase determined ab initio." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57(Pt 6): 767-74.
23.Dauter,
Z., R. Persson, et al. (1999). "Crystal structure of dUTPase from equine infectious anaemia virus; active site metal binding in a substrate analogue complex." J Mol Biol 285(2): 655-73.
24.Fiser,
A. and B. G. Vertessy (2000). "Altered subunit communication in subfamilies of trimeric dUTPases." Biochem Biophys Res Commun 279(2): 534-42.
56
25.Mustafi,
D., A. Bekesi, et al. (2003). "Catalytic and structural role of the metal ion in dUTP pyrophosphatase." Proc Natl Acad Sci U S A 100(10): 5670-5.
26.Barabás,
O., V. Pongrácz, et al. (2004). "Structural insights into the catalytic mechanism of phosphate ester hydrolysis by dUTPase." J Biol Chem 279(41): 42907-15.
27.Ladner,
R. D. and S. J. Caradonna (1997). "The human dUTPase gene encodes both nuclear and mitochondrial isoforms. Differential expression of the isoforms and characterization of a cDNA encoding the mitochondrial species." J Biol Chem 272(30): 19072-80.
28.Békesi,
A., I. Zagyva, et al. (2004). "Developmental regulation of dUTPase in Drosophila melanogaster." J Biol Chem 279(21): 22362-70. J.M., J.L.Tymoczko, L.Stryer (2002) ˝Biochemistry˝ (5th Edition) W.H. Freeman and Company , New York
29.Berg,
30.Kovari,
J., O. Barabas, et al. (2004). "Altered active site flexibility and a structural metal-binding site in eukaryotic dUTPase: kinetic characterization, folding, and crystallographic studies of the homotrimeric Drosophila enzyme." J Biol Chem 279(17): 17932-44.
31.Kan,
L., S. Jain, et al. (1999). "Cloning and expression of the mouse deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase gene: differs from the rat enzyme in that it lacks nuclear receptor interacting LXXLL motif." Gene Expr 8(4): 231-46.
32.Caradonna,
S. and S. Muller-Weeks (2001). "The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity." Curr Protein Pept Sci 2(4): 335-47.
33.Tinkelenberg,
B. A., W. Fazzone, et al. (2003). "Identification of sequence determinants of human nuclear dUTPase isoform localization." Exp Cell Res 287(1): 39-46.
34. Deutsch, W.A. (1995) Why do pupating insects lack an activity for the repair of uracil-containing DNA? One explanation involves apoptosis. Insect Molecular Biology, 4 (1): 1-5 35.Nation,
M. D., S. N. Guzder, et al. (1989). "Control of Drosophila deoxyuridine triphosphatase. Existence of a developmentally expressed protein inhibitor." Biochem J 259(2): 593-6.
57
36.Cokol,
M., R. Nair, et al. (2000). "Finding nuclear localization signals." EMBO Rep 1(5): 411-5.
37.Xu,
L. and J. Massague (2004). "Nucleocytoplasmic shuttling of signal transducers." Nat Rev Mol Cell Biol 5(3): 209-19.
38.Kau,
T. R., J. C. Way, et al. (2004). "Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention." Nat Rev Cancer 4(2): 106-17.
39.Mattaj,
I. W. (2004). "Sorting out the nuclear envelope from the endoplasmic reticulum." Nat Rev Mol Cell Biol 5(1): 65-9.
40.Hoelz,
A. and G. Blobel (2004). "Cell biology: popping out of the nucleus." Nature 432(7019): 815-6.
41.Mosammaparast,
N. and L. F. Pemberton (2004). "Karyopherins: from nuclear-transport mediators to nuclear-function regulators." Trends Cell Biol 14(10): 547-56.
42.Suntharalingam,
M. and S. R. Wente (2003). "Peering through the pore: nuclear pore complex structure, assembly, and function." Dev Cell 4(6): 775-89.
43.Nevo,
R., V. Brumfeld, et al. (2005). "Direct measurement of protein energy landscape roughness." EMBO Rep.
44.Pante,
N. (2004). "Nuclear pore complex structure: unplugged and dynamic pores." Dev Cell 7(6): 780-1.
45.Timinszky,
G., L. Tirian, et al. (2002). "The importin-beta P446L dominantnegative mutant protein loses RanGTP binding ability and blocks the formation of intact nuclear envelope." J Cell Sci 115(Pt 8): 1675-87.
46.Guinez,
C., W. Morelle, et al. (2005). "O-GlcNAc glycosylation: a signal for the nuclear transport of cytosolic proteins?" Int J Biochem Cell Biol 37(4): 765-74.
47.Walther,
T. C., P. Askjaer, et al. (2003). "RanGTP mediates nuclear pore complex assembly." Nature 424(6949): 689-94.
48.Prieve,
M. G., K. L. Guttridge, et al. (1998). "Differential importin-alpha recognition and nuclear transport by nuclear localization signals within the high-mobility-group DNA binding domains of lymphoid enhancer factor 1 and T-cell factor 1." Mol Cell Biol 18(8): 4819-32.
58
49.Makkerh,
J. P., C. Dingwall, et al. (1996). "Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids." Curr Biol 6(8): 1025-7.
50.Welch,
K., J. Franke, et al. (1999). "RanBP3 contains an unusual nuclear localization signal that is imported preferentially by importin-alpha3." Mol Cell Biol 19(12): 8400-11.
51.Dang,
C. V. and W. M. Lee (1989). "Nuclear and nucleolar targeting sequences of c-erb-A, c-myb, N-myc, p53, HSP70, and HIV tat proteins." J Biol Chem 264(30): 18019-23.
52.Kiseleva,
E., S. Rutherford, et al. (2001). "Steps of nuclear pore complex disassembly and reassembly during mitosis in early Drosophila embryos." J Cell Sci 114(Pt 20): 3607-18.
59
