UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra analytické chemie
Stanovení kyseliny D,L-glycerové pomocí kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií
Autor práce:
Bc. Lucie Klásková
Studijní obor:
Analytická chemie
Vedoucí diplomové práce:
RNDr. Vítězslav Maier, Ph.D.
Olomouc 2011
Prohlašuji,
že
jsem
tuto
práci
vypracovala
samostatně
pod
vedením
RNDr. Vítězslava Maiera, Ph. D. a s použitím uvedené literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci.
V Olomouci dne 22. 4. 2011
……………………………..
Děkuji RNDr. Vítězslavu Maierovi, Ph. D. za odborné vedení mé diplomové práce, za obětavou spolupráci, cenné připomínky, poskytnuté rady a za čas, který mi věnoval při konzultacích.
Shrnutí Diplomová práce se zabývá vývojem separace enantiomerů D,L-glycerové kyseliny s využitím vankomycin chloridu jako chirálního selektoru kapilární elektroforézou s hmotnostní spektrometrií V teoretické části diplomové práce byly popsány základy chirálních separací. Byl uveden přehled chirálních selektorů používaných v kapilární elektroforéze a podstatná část byla věnována makrocyklickým antibiotikám, hlavně skupině glykopeptidů. Dále bylo popsáno spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí, výhody a nevýhody tohoto spojení. Byla popsány obecné vlastnosti glycerové kyseliny, její biologické působení v organismu, a uveden přehled dosud publikovaných metod zabývajících se stanovením glycerové kyseliny. V experimentální části byla provedena optimalizace systému CE-ESI-MS pro chirální separaci standardů DL-glycerové kyseliny. Pozornost byla věnována především složení a pH základního elektrolytu a koncentraci vankomycinu jako chirálního selektoru. Pomocí statistického softwaru byly vyhodnoceny základní parametry pro stanovení obsahu enantiomerů glycerové kyseliny. Byly provedeny stanovení D- a L- glycerové kyseliny ve vzorcích moči po jejich předcházející úpravě a zakoncentrování.
Summary This diploma thesis deals with development of separations enantiomers glyceric acid with usage of vancomycin chlorid as a chiral selector for capillary electrophoresis with mass spectrometry. In the theoretical part of diploma paper the principle of chiral separations was described. There was intoduced a list of chiral selectors used in capillary electrophoresis. A major part was devoted to macrocyclic antibiotik and in the main glycopeptides. There was described a connection between capillary electrophoresis and mass spektrometry, advantages and disadvantages of this connection too. There was described a general characteristics of glyceric acid, its biological incidence in a organism and preceded the list of till this time Publisher method of determination of glyceric acid was made too. In the experimental part was optimized a system of CE-ESI-MS for chiral separation of standard of DL-glyceric acid. There was given care to composition and pH of buffer, and a concentration of vankomycin, which was used to as a chiral selektor. There was evaluated a basic parametrs for determination of content enantiomers of glyceric acid. The enantiomers was determined in urine next to preparation and prekoncentration.
Obsah 1
ÚVOD ..................................................................................................................................... 7
2
TEORETICKÁ ČÁST .......................................................................................................... 8
2.1
CHIRÁLNÍ SEPARACE .......................................................................................................... 8
2.1.1
CHIRÁLNÍ SELEKTORY POUŽÍVANÉ V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE ................................. 9
2.1.2
MAKROCYKLICKÁ ANTIBIOTIKA JAKO CHIRÁLNÍ SELEKTORY V KAPILÁRNÍ
ELEKTROFORÉZE ......................................................................................................................... 10
2.1.2.1
Ansamyciny ................................................................................................................. 10
2.1.2.2
Polypeptidy a aminoglykosidy ..................................................................................... 13
2.1.2.3
Glykopeptidy................................................................................................................ 13
2.2
SPOJENÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY S HMOTNOSTNÍ DETEKCÍ ................................. 25
2.2.1
ROZHRANNÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA – HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE ................. 26
2.2.1.1
Rozhraní s přídavnou kapalinou („Sheath-flow“) ........................................................ 26
2.2.1.2
Rozhraní bez přídavné kapaliny („Sheathless“)........................................................... 27
2.2.2
ZDROJ IONIZACE .................................................. CHYBA! ZÁLOŽKA NENÍ DEFINOVÁNA.
2.2.3
ANALYZÁTOR .................................................................................................................. 29
2.2.4
POUŽITÍ CE-ESI-MS PŘI CHIRÁLNÍCH SEPARACÍCH ....................................................... 30
2.3 3
GLYCEROVÁ KYSELINA .................................................................................................... 32 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .............................................................................................. 36
3.1
PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ .................................................................................................. 36
3.2
CHEMIKÁLIE A POMŮCKY ................................................................................................ 36
3.3
POSTUP POKRÝVÁNÍ KAPILÁR ......................................................................................... 36
3.4
EXPERIMENTÁLNÍ PODMÍNKY ......................................................................................... 37
4
VÝSLEDKY A DISKUSE .................................................................................................. 39
4.1.1
VÝBĚR ZÁKLADNÍHO ELEKTROLYTU .............................................................................. 39
4.1.2
VÝBĚR KONCENTRACE VANKOMYCINU .......................................................................... 40
4.1.3
KALIBRAČNÍ DATA .......................................................................................................... 41
4.1.4
ANALÝZA REÁLNÝCH VZORKŮ ....................................................................................... 43
5
ZÁVĚR................................................................................................................................. 46
6
SEZNAM ZKRATEK A SYMBOLŮ................................................................................ 47
7
POUŽITÁ LITERATURA ................................................................................................. 49
6
1
Úvod
Kapilární elektroforéza je moderní analytickou separační technikou, která nachází uplatnění v mnoha vědách jako medicína, farmacie, proteomika, ale i vědách environmentálních. Vyniká množstvím technik provedení, vysokou účinností, rychlostí analýzy, vysokou opakovatelností a citlivostí, nízkou spotřebou vzorku a činidel k analýze.
Kapilární
elektromigrační
techniky
dovolují
stanovovat
jak
biomakromolekuly jako proteiny, peptidy, fragmenty DNA aj, tak i jednoduché organické a anorganické ionty, aminokyseliny, optické izomery. Chirální separace látek kapilární elektroforézou je zajímavou metodou pro obory jako farmacie, životní prostředí, zemědělství aj. V mnoha případech jeden z enantiomerů poskytuje žádoucí aktivitu, ale druhý izomer může být neaktivní nebo může vykazovat nežádoucí účinky a případně způsobovat nepříznivé poruchy a defekty. Pro kapilární elektroforézu existuje velké množství výběru chirálních selektorů, ty jsou ale velmi často limitovány svou rozpustností a detekčním charakterem. Jednou ze skupin jsou makrocyklická antibiotika, která jsou relativně novou třídou chirálních selektorů využívaných v separačních technikách. Mají množství sterogenních center a funkčních skupin, které jim umožňují rozmanité interakce s chirálními molekulami jako jsou tvorba vodíkových můstků, hydrofobní interakce, π-π interakce, dipól-dipól interakce aj. Nejvíce používanými a také nejúspěšnějšími makrocyklickým antibiotiky jsou glykopeptidy, hlavně vankomycin. Chirální 2-hydroxykyseliny jsou známy jako důležité biochemické indikátory vrozených poruch metabolismu. Pro rozpoznání těchto vrozených metabolických onemocnění je právě důležité určení úplné konfigurace produktů metabolismu. Optické izomery těchto kyselin často vznikají rozdílnou metabolickou cestou a právě metabolické vyšetření může odhalit případný nedostatek enzymů a vrozené metabolické vady.
7
2
Teoretická část
2.1 Chirální separace Chiralita se projevuje existencí dvou konstitučně identických molekul, které mají stejný sumární vzorec, ale liší se prostorovým uspořádáním atomů či skupin, nejčastěji na tzv. chirálním atomu uhlíku. Tyto dvě molekuly jsou navzájem zrcadlové obrazy a označují se jako enantiomery [1]. V mnoha oblastech života se setkáváme s množstvím chirálních molekul, ať již v přírodě s L-aminokyselinami a D-cukry, u léčiv, kdy enantiomery mohou mít různé účinky na lidské zdraví, u potravin, kdy mohou ovlivňovat vůni a chuť nebo u zemědělských chemikálií [1]. Chirální molekuly mají stejné fyzikální vlastnosti a v achirálním prostředí vykazují i stejné chemické vlastnosti, proto je dělení obtížné. Pro separaci je možno využít různé analytické metody, jako plynovou chromatografii, kapalinovou chromatografii, elektromigrační metody [1-4]. Tyto techniky můžeme dělit na přímé a nepřímé. U přímých metod se využívá tvorby přechodných diastereomerních komplexů mezi enantiomery a chirálním selektorem vázaným na stacionární fázi nebo přidaným do mobilní fáze. Vzniklé diastereomerní komplexy se již liší v chromatografických a elektroforetických vlastnostech. U nepřímých metod se chirální molekula derivatizuje chirálním činidlem a poté je již separována v achirálním prostředí [1-3]. V kapilárních elektromigračních technikách se využívá především přímých metod. Výhodou takovýchto chirálních separací kapilární elektroforézou oproti jiným chromatografickým metodám spočívá v téměř neomezeném výběhu chirálních selektorů, v jejich nižší spotřebě a možnosti změny koncentrace a samotného chirálního selektoru.
8
2.1.1
Chirální
selektory
používané
v
kapilární
elektroforéze Jak již bylo uvedeno v kapitole 2.1, má kapilární elektroforéza oproti dalším jiným chromatografickým metodám výhodu v téměř neomezeném výběru chirálních selektorů. Mezi nejpoužívanější chirální selektory patří cyklodextriny a jejich deriváty [1-3,5-7]. Jsou to neutrální přírodní cyklické oligosacharidy skládající se ze šesti (αCD), sedmi (β-CD) nebo osmi (γ-CD) glukopyranozových jednotek. V prostoru zaujímají tvar komolého kužele, vnější povrch je hydrofilní a kavita je relativně hydrofobní s vysokou elektronovou hustotou, která umožňuje vytvářet inkluzní komplexy s nepolárními analyty. Enantioselektivita CD je dána asymetrickými uhlíky glukózy a hydroxylovými skupinami, které jsou schopné derivatizace.
Obrázek 1: Struktury α-CD, β-CD, γ-CD [3]
Mezi další, mnohem méně používaní chirální selektory, se řadí lineární neutrální a nabité sacharidy [4,5,7] a crown-ethery, které jsou používané především pro separace aminokyselin a léčiv obsahující primární aminoskupiny [4-7]. Velké skupinou, používanou nejen v kapilární elektroforéze, ale také ve vysoce účinné kapalinové chromatografii a v tenkovrstevné chromatografii jsou makrocyklická antibiotika (více viz kapitola 2.1.2) [8]. Chirální selektory musí splňovat několik základních podmínek. Měly by být stereoselektivní a tvořit diastereomerní komplexy s každým z dvojice enantiomerů,
9
kinetika tvorby těchto komplexů by měla být rychlá. Chirální selektory by měly být v pracovním elektrolytu dobře rozpustné a chemicky stabilní a neměly by interferovat při detekci [3].
2.1.2
Makrocyklická antibiotika jako chirální selektory v kapilární elektroforéze
Makrocyklická antibiotika se jako chirální selektory požívají v technikách jako CE, HPLC nebo TLC [8,10,11]. Díky těmto chirálním selektorům se podařilo rozdělit stovky chirálních směsí obsahujících např. nesteroidní protizánětlivá léčiva, hydroxykyseliny, herbicidy, aminokyseliny. Tuto obsáhlou skupinu sloučenin můžeme rozdělit do několika skupin, které se liší strukturou, a to na: glykopeptidy, ansamyciny, polypeptidy
a
aminoglykosidy
[5,10].
Ačkoliv
aminoglykosidy
(kanamycin,
fradiomycin) nejsou považovány za vyloženě makrocyklická antibiotika, jsou to antibiotika používaná při chirálních separacích v kapilární elektroforéze. V CE se využívají především glykopeptidy, které mají ale i značné využití v HPLC, kde se používají jako vázané chirální stacionární fáze [2-3,8,10]. Ve struktuře makrocyklických antibiotik se nachází několik sterogenních center a funkčních skupin, které se účastní rozmanitých interakcí s chirálními molekulami analytu. Interakce mezi molekulou antibiotika a analytu mohou být různé povahy. Primárně jde o interakce nábojů selektoru a analytu nebo interakce iontů, dále hydrofobní interakce, přes dipól – dipól a π – π interakce, po vodíkové vazby a sterické odpuzování [5,8-10,12]. Molekuly antibiotik také obsahují hydrofilní skupiny stejně jako množství ionizovatelných skupin, díky nimž se stávají velmi dobře rozpustné ve vodných roztocích [9,10,12]. 2.1.2.1
Ansamyciny
Ansamyciny [6,9], rifamycin B a rifamycin SV, mají pro kapilární elektroforézu především historický význam. Byly to první chirální selektory použité v kapilární elektroforéze dříve než v HPLC [10]. Ansamyciny mají charakteristickou ansa strukturu, skládající se z kruhové konstrukce nebo chromoforu, které jsou překlenuty alifatickým „mostem“ [13].
10
Všechny rifamyciny mají tento alifatický řetězec vysoce substituovaný, a jeden od druhého se odlišují typem a umístěním substituentů na jejich naftohydrochinonovém kruhu.
Rifamycin
B
se
od
rifamycinu
SV
liší
skupinou
vázanou
na naftohydrochinonovém kruhu v pozici 9. U rifamycinu SV to je hydroxyl (-OH), zatím co u rifamycinu B oxyoctová kyselina (-OCH2COOH) [9,13]. Alifatický řetězec rifamycinu B a rifamycinu SV je na uhlíku C21 obsazen ethylesterem a na uhlíku C23 methyletherem [9,10,12]. Struktura těchto antibiotik je zobrazena na obrázku 2. Rifamycin B je enantioselektivní pro kationové sloučeniny a rifamycin SV enantioselektivní pro neutrální a aniontové sloučeniny [10]. Rifamycin B a rifamycin SV silně absorbují v UV a viditelné oblasti spektra díky naftohydrochinonovém kruhu. Každá ze sloučenin má absorpční maxima okolo 220, 304 a 425 nm a absorpční minima okolo 275 a 350 nm [10,12]. Rifamycin B je rozpustný ve vodě, jeho rozpustnost se zvětšuje v acetonu a v alkoholech s krátkým řetězcem [8]. Rifamycin B a rifamycin SV tvoří žluté až oranžové roztoky v závislosti na pH a organických spolurozpouštědlech [9,13]. Rifamycin B je dvojsytná kyselina s pKa 2,8 a 6,7 [9,10]. Fyzikální a chemické vlastnosti ansamycinů jsou shrnuty v tabulce 1. V tabulkách 2 a 3 je uveden výběr publikovaných pracích zabývajících se chirální separací s použitím rifamycinu B a rifamycinu SV jako chirálních selektorů v CE. Tabulka 1: Fyzikální a chemické vlastnosti ansamycinů [2,10,14]
vlastnost Typ analytů molekulová hmotnost počet stereogenních center počet hydroxylových skupina počet aromatických kruhů počet amido skupin počet methoxy skupin počet karboxylových skupin počet methoxy-ester skupin produkováno použití v a
rifamycin B kationty 755 9 4 (2) 2 1 2 1 1 Norcardia mediterranei HPLC, CE
číslo v závorce uvádí počet fenolických skupin
11
rifamycin SV anionty 698 9 5 (3) 2 1 2 0 1 Norcardia mediterranei CE
(A)
(B)
Obrázek 2: Chemická struktura, číslování a jednoduché schéma pro rifamycin B (A) a rifamycin SV (B) [10] Tabulka 2: Přehled prací používajících rifamycin B jako chirální selektor v CE
analyt Terbutalin, Isoproterenol, Bametan, Metaproterenol, Synephrin, Metanephrin, Salbutamol, Epinefrin, Norfenyleprin, Oktopamin, Norepinefrin, Normetanefrin, Metoprolol, Alprenolol, Atenolol, Oxprenolol, Efedrin, Pseudoefedrin
koncentrace rifamycinu B
složení pufru, detekce
citace
25 mM
0,1 M fosfát pH 7, propan-2-ol (60:40 v:v), přímá UV 254 nm
[15]
Indolol, Propranolol, Amphetamin
25 mM
Alprenolol, Epinefrin, Metaprolol, Norepinefrin, Normetanefrin, Oktopamin, Oxprenolol, Pindolol
25 mM
12
0,1 M fosfát pH 7, propan-2-ol (70:30 v:v), přímá UV 254 nm 0,1 mM fosfát pH 7, propan-2-ol (70:30 v:v), nepřímá UV 350 nm
[16]
[16]
Tabulka 3: Přehled prací používajících rifamycin SV jako chirální selektor v CE
koncentrace rifamycinu SV
analyt Glutethimid, Hexobarbital, Dansylasparagová kyselina
2.1.2.2
25 mM
složení pufru, detekce 0,1 M fosfát pH 7, 40 % propan-2-ol, nepřímá UV 350 nm
citace [16]
Polypeptidy a aminoglykosidy
Další skupinou makrocyklických antibiotik používanou v chirálních separacích, především v HPLC, jsou polypeptidy [5,10]. Do této skupiny řadíme sloučeninu thiostrepton. Mezi aminoglykosidy řadíme antibiotika: Kanamycin, streptomycin a fradiomycin [5,8,10]. Jejich struktura se skládá několika glykosidických kruhů, tři u kanamycinu a streptomycinu a čtyři u fradiomycinu. pKa hodnoty byly určeny 7,8 pro fradiomycin, 7,2 pro kanamycin a 8,7 pro streptomycin. Všechny jsou neomezeně rozpustné ve vodě, ale prakticky nerozpustné v alkoholech a nepolárních rozpouštědlech [10,17,18]. Aminoglykosidy (3% kanamycin nebo 3% fradiomycin) byly použity při separaci 1,1´-Binaftyl-2,2´-dikarboxykyselin v 20 mM fosfát-borátu pH 7,5 – 9 s přídavkem 30% MeOH [19]. 2.1.2.3
Glykopeptidy
Makrocyklická
antibiotika
skupiny
glykopeptidů
jsou
k dnešnímu
datu
nejúčinnější chirální selektory [10,20,21]. Řadíme sem avoparcin, ristocetin A, teicoplanin, vankomycin a dva derivatizované analogy vankomycinu. Všechny tyto sloučeniny jsou složeny z části aglykonu, která je tvořena spojenými makrocyklickými kruhy, které mají charakteristický tvar basketbalového koše a částí sacharidů připojených na cyklus aglykonu [9,10]. “Koš” aglykonu se skládá z 3 nebo 4 makrocyklických kruhů složených z navzájem spojených aminokyselin a substituovaných fenolů [9]. Sacharidová část antibiotika se skládá z jednoho nebo více neutrálních sacharidů a jednoho nebo více monosacharidů [13]. Tato antibiotika se pak liší typem a množstvím vázaných sacharidových jednotek a substituentů. Sacharidové skupiny vázané na koš aglykonu jsou volně otáčivé a mohou zaujímat rozmanité orientace [10]. Rozdíly ve struktuře antibiotik jsou shrnuty v tabulce 4 a jednotlivá antibiotika zobrazena na obrázku 3.
13
Tato antibiotika silně absorbují v UV oblasti. V kyselých roztocích absorbují silně pod 250 nm a kolem 260 nm vykazují malé absorpční minimum. Ačkoliv takto silně absorbují, dá se díky nízkých používaným koncentracím (1-5 mM) v základním elektrolytu, použít přímá detekce právě okolo absorpčního minima 260 nm [10,12]. Makrocyklická glykopeptidická antibiotika jsou rozpustná ve vodě, pufrech a kyselých vodných roztocích, méně v neutrálních roztocích. Částečně rozpustná v polárních aprotických rozpouštědlech (DMSO a DMF) a nerozpustná ve většině nepolárních organických rozpouštědlech [9,12]. Tabulka 4: Fyzikálně-chemické vlastnosti glykopeptidických antibiotik, avoparcinu, ristocetinu A, teicoplaninu a vankomycinu [9,10,14]
vlastnost relativní molekulová hmotnost počet stereogenních center počet makrocyklů počet sacharidových zbytků počet aromatických kruhůd počet hydroxyskupine počet amidů ve vazbách počet amino skupin počet sekundárních aminů pI produkováno bakteríi použití v
avoparcina
ristocetin Ab
teicoplaninc
vankomycin
α = 1907,6 β = 1942
2066
1877
1449
32
38
23
18
3
4
4
3
5
6
3
2
7 (α=1,β=2)
7
7 (2)
5 (2)
16 (4)
21 (4)
15 (4)
9 (3)
6
6
7
7
3
2
1
2
1
0
0
1
7,5 Streptomyces candidas
7,5 Norcardia lurida
4,2; 6,5 Actinoplanes teicomyceticus
CE
HPLC,CE
HPLC, CE
7,2 Streptomyces orientalis HPLC, CE, TLC
a
Avoparcin existuje jako směs dvou úzce spojených komponent přibližného složení: 67 % β-avoparcin a 33% α-avoparcin.
b
Ristocetin A existuje ve dvou formách, které se od sebe liší počtem uhlíkových atomů vázaných na jeden z cukrů.
c
Teicoplanin existuje jako směs pěti podobných sloučenin, které se mezi sebou liší v počtech atomů uhlíků a substituovaných
skupin na masných kyselinách postranního řetězce vázaných na amin cukru. d
Číslo v závorce odpovídá počtu chlorovaných skupin vázaných na aglykon.
e
Číslo v závorce značí počet fenolových skupin.
14
Obrázek 3: Chemické struktury makrocyklických glykopeptidických antibiotik: (A) Vankomycin, (B) Teicoplanin, (C) Avoparcin, (D) Ristocetin A [10]
Glykopeptidy jsou amfoterní, ve struktuře obsahují kyselé i zásadité skupiny a množství ionizovatelných skupin, které kontrolují jejich náboj a ovlivňují interakce s chirálními analyty. Náboj antibiotika je pak řízen pH základného pufru. Obrázek 4 zobrazuje, jak se elektroforetická mobilita mění s pH v 0,1 M fosfátovém pufru.
15
Obrázek 4: Efekt pH na elektroforetickou mobilitu vankomycinu, ristocetin A a teicoplaninu v 0,1 M fosfátu [8]
Křivky závislosti elektroforetické mobility v závislosti na pH pro ristocetin A a vankomycinu mají podobný průběh. Z těchto křivek lze pro dané podmínky vyčíst hodnoty izoelektrických bodů (pI), pro vankomycinu 7,2 a pro ristocetin A 7,5. Z toho vyplývá, že ionizovatelné skupiny jsou při pH nižších než 7,5 pozitivně nabité. Křivka pro teicoplanin je mezi hodnotami pH 3 a 6,5 docela rovná a pro hodnoty vyšší než 4,5 není možné získat teicoplanin kladně nabitý. Odlišné elektroforetické chování teicoplaninu od vankomycinu a ristocetinu A je závislé především na dvou strukturních vlastnostech teicoplaninu. Ve struktuře chybí volná amino skupina na cukru (obě aminoskupiny jsou N-acetylované) a za druhé je to schopnost teicoplaninu tvořit micely [8-10]. Struktura všech glykopeptidů je tvořena volnými amino skupinami, které mají tendenci interagovat se stěnami kapiláry. Nejsilnější interakce a adsorpce chirálního selektoru na stěnu kapiláry se uskutečňuje v případě avoparcinu se třemi volnými amino skupinami, následován je vankomycinem s dvěmi skupinami. Z toho důvodu jsou separace s těmito glykopeptidy delší než při použití teicoplaninu a ristocetin A, jejichž interakce tak silná není [9]. Jelikož struktura glykopeptidy obsahuje ionizovatelné skupiny, má na použití těchto antibiotik jako chirálních selektorů značný vliv i pH základního elektrolytu. Obecně, snižující se pH základního elektrolytu zvyšuje enantioseparaci testovaných látek [9]. pH má vliv i na stabilitu glykopeptidů, které při pH nižším než 4 a pH vyšším než 9 nejsou v roztoku stabilní. U většiny enantioseparací, používajících vankomycin,
16
avoparcin a ristocetin A jako chirálních selektorů, jsou hodnoty pH použitých pufrů mírně pod hodnotou jejich pI. Při použití teicoplaninu jsou to hodnoty nad jeho pI. Maxima enantioselektivity je nejčastěji dosaženo, když elektromigrace chirálního selektoru a chirálního analytu jsou opačné [9,22-24]. Efekt přídavku organických přísad na separaci je pro vankomycin, avoparcin a ristocetin A většinou malý. Mnohdy je enantioseparace horší než před přídavkem organické přísady. U většiny separací s teicoplaninem je však požadováno alespoň malé množství acetonitrilu k dosažení lepších separací, někdy k dosažení separace vůbec. Tento malý přídavek acetonitrilu způsobí inhibici samoagregace teicoplaninu do micel, která někdy může bránit chirální separaci [9]. Všechny makrocyklická antibiotika skupiny glykopeptidů podléhají s časem ve vodném roztoku degradaci. Rozklad glykopeptidických antibiotik je rychlejší při vysokých a nízkých pH, tj. při pH nižší než 4 a pH vyšší než 8, a se zvyšující se teplotou. Degradace má většinou za následek zvýšení migračních časů, šum základní linie a snížení rozlišení enantiomerů [9,13]. Rozklad se často projevuje žloutnutím a tvorbou sraženiny (v závislosti na složení pufru) [9]. Stabilita glykopeptidy se odvíjí od počtu sacharidových skupin [12]. Vankomycin s 2 sacharidy ve struktuře je nejméně stabilní. Roztoky v rozmezí pH 5 a 7, i když jsou chlazeny na 4 °C, se během 6 až 7 dní degradací znehodnotí [12]. Teicoplanin je za stejných podmínek stabilnější, po dobu 2-3 týdny vykazují roztoky stejné rozlišení dvojice enantiomerů. Mezi hydrolyticky nejstabilnější makrocyklická antibiotika se řadí ristocetin A a avoparcin, jejichž roztoky mohou být používány až 4 týdny [9,22].
17
2.1.2.3.1 Vankomycin Struktura vankomycinu je tvořena třemi makrocyklickými kruhy tvořící aglykon a připojeného disacharidu skládajícího se z D-glukozy a vankosaminu [12]. Vankomycin obsahuje
několik
funkčních
skupin,
jako
hydroxylové,
amino,
chloro,
amidokarboxylové a aromatické a celkově 18 stereogenních center [12,18]. Vankomycin je rozpustný ve vodě a některých polárních rozpouštědlech jako dimetylsulfoxid a dimetylformamid a méně rozpustný nebo nerozpustný ve vyšších alkoholech [8]. Struktura vankomycinu obsahuje množství ionizovatelných skupin. pKa hodnoty pro vankomycin byly určeny na 2,9, 7,2, 8,6, 9,6, 10,5 a 11,7 [12,18]. Isoelektrický bod je okolo hodnoty 7,5. Vankomycin pod 250 nm silně absorbuje, čímž je limitováno jeho použití jako chirálního selektoru v CE [25]. Pomocí vankomycinu byly rozseparovány látky jako např. nesteroidní protizánětlivá
léčiva,
antineoplastická
léčiva,
pesticidy,
N-derivatizované
aminokyseliny, di- a tri- peptidy a jiné. Tabulka 5 uvádí přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE. Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE
analyt Trans, trans-abscisová kyselina N-acetyl-tryptofan N-t-Boc-tryptofan Indol-3-mléčná kyselina N-CBZ-tryptofan Chinolinkarboxylové kys.
koncentrace 2 mM
0,1 M fosfát pH 6
UV 254 nm
[26]
2 mM 2 mM 2 mM 2 mM 5 mM
0,1 M fosfát pH 7 0,1 M fosfát pH 6 0,1 M fosfát pH 6 0,1 M fosfát pH 7 0,1 M acetát pH 4
[26] [26] [26] [26] [27]
S-karboxymethylcystein
5 mM
10 mM sorbát His pH 5
N-acetamidokarboxycystein
5 mM
10 mM sorbát His pH 5
UV 254 nm UV 254 nm UV 254 nm UV 254 nm UV 300 nm nepřímá UV 254 nm, pokrytá kapilára nepřímá UV 254 nm, pokrytá kapilára UV 254 nm, pokrytá kapilára HDB UV 195 nm, pokrytá kapilára UV 205 nm, pokrytá kapilára
DDB a analogy DDB
6 mM
N-acetyl-aminokyseliny
2,5 nebo 5 mM
Loxoglumid
3 mM
složení pufru
40 mM fosfát Tris pH 6, 0.001% HDB acetát amonný pH 5 50 mM fosfát pH 6
18
poznámka
citace
[28]
[28]
[29] [30] [31]
Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE (pokračování)
analyt Herbicidy (mecoprop, fenoprop, dichlorprop, flamprop, haloxyfop, fluazifop, diclofop, fenoxaprop) Nesteroidní protizánětlivá léčiva (ketoprofen, suprofen, carprofen, flurbiprofen, naproxen, indoprofen)
koncentrace
složení pufru
poznámka
citace
6 mM
75 mM BrittonRobinson pH 5
205 nm, pokrytá kapilára, částečné plnění kapiláry
[32]
2 mM
50 mM fosfát pH 7, 21-103 mM SDS
UV 254 nm
[33]
Aminokyseliny
2 mM
50 mM fosfát pH 7, 21-103 mM SDS
UV 254 nm, Dansyl-
[33]
Aminokyseliny
0,1 – 5 mM
20 mM MOPS Tris pH 7
UV 254 nm, pokrytá kapilára, AQC
[34]
Aminokyseliny
0,1 – 1,5 mM
20 mM MOPS Tris pH 7
UV 254 nm, AQC
[35]
Nesteroidní protizánětlivá léčiva (ibuprofen, indoprofen, ketoprofen, flurbiprofen, suprofen, caprofen, naproxen, cicloprofen)
2,5 nebo 5 mM
75 mM BrittonRobinson pH 5
UV 205 nm, pokrytá kapilára (polyakrylamid)
[36]
Mléčná kyselina
10 mM
5 mM oxalát LHis pH 4,5
Nesteroidní protizánětlivá léčiva (fenoprofen, ketoprofen)
2 mM
50 mM fosfát Tris pH 6
Aminokyseliny
2 mM
50 mM fosfát Tris pH 6
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
5 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
1 mM
Aminokyseliny
5 mM
Aminokyseliny Aminokyseliny
5 mM 5 mM
0,1 M fosfát pH 4,9 nebo 7 0,1 M fosfát pH 6 0,1 M fosfát pH 6 nebo 7 0,1 M fosfát pH 6 0,1 M fosfát pH 4,9 nebo 6 0,1 M fosfát pH 7 0,1 M fosfát pH 7
19
vodivostní detekce UV 254 nm, dynamické pokrytí PDMA UC 254 nm, FMOC, dynamické pokrytí PDMA UV 254 nm, Nacetylované
[37] [38]
[38]
[24]
UV 254 nm, AQC
[24]
UV 254 nm, AQC UV 254 nm, Nbenzoyl UV 254 nm, karboxybenzoyl UV 254 nm, dansyl UV 254 nm, DNB UV 254 nm, DNP
[24] [24] [24] [24] [24] [24]
Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE (pokračování)
analyt
koncentrace
Aminokyseliny
5 mM
0,1 M fosfát pH 7
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Karboxylové kyseliny Nesteroidní protizánětlivá léčiva (caprofen, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indoprofen, ketoprofen, naproxen, suprofen
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
poznámka UV 254 nm, DNPyr UV 254 nm, Nformyl UV 254 nm, PHTH UV 254 nm
5 mM
0,1 M fosfát pH 7
UV 254 nm
[24]
Peptidy
0,5 mM
UV 254 nm, AEOC
[39]
Peptidy
0,5 mM
UV 254 nm, FMOC
[39]
Aminokyseliny
2 mM
UV 254 nm, AEOC
[39]
Aminokyseliny
2 mM
UV 254 nm, dansyl
[39]
Aminokyseliny
1 nebo 2 mM
UV 254 nm, FMOC
[39]
5-(4-hydroxyfenyl)-5fenylhydantoin
2 mM
UV 254 nm
[40]
Bromacil
2 mM
UV 254 nm
[40]
Coumachlor
2 mM
UV 254 nm
[40]
warfarin
2 mM
UV 254 nm
[40]
Aminokyseliny
1 nebo 2 mM
Nesteroidní protizánětlivá léčiva
1 nebo 2 mM
složení pufru
50 mM fosfát pH 7,5, 0-10 % propan-2-ol 50 mM fosfát pH 7,5, 0-10 % propan-2-ol 50 mM fosfát pH 7,5; 0 nebo 10 % propan-2-ol 50 mM fosfát pH 7,5; 0 nebo 10 % propan-2-ol 50 mM fosfát pH 7,5; 0 nebo 10 % propan-2-ol 50 mM fosfát pH 7, 50 mM SDS 95 % 50 mM fosfát pH 7, 5% MeOH a 25 mM SDS 90 % 50 mM fosfát pH 7, 10 % ACN a 50 mM SDS 50 mM fosfát pH 7, 25 mM SDS
UV 254 nm, 0, 1 M fosfát pH 6 pokrytá kapilára, dansyl UV 254 nm, 0,1 M fosfát pH 6 pokrytá kapilára
20
citace [24] [24] [24] [24]
[41] [41]
Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE (pokračování)
analyt
koncentrace
Peptidy
1 mM
Peptidy
1 mM
Nesteroidní protizánětlivá léčiva (fenoprofen, methotrexát) Nesteroidní protizánětlivá léčiva (Ketoprofen) Fenoxykyseliny
složení pufru 25 mM HEPES pH 7,6; 0 nebo 25 nebo 50 mM SDS 50 mM fosfát pH 7,6
poznámka
citace
UV 254 nm, FMOC
[42]
UV 254 nm, FMOC
[42]
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
UV 254 nm
[25]
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
UV 254 nm, SDS
[25]
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
[25]
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Hydroxykyseliny různé organické kyseliny
2 mM 2 mM
0,1 M fosfát pH 6 0,1 M fosfát pH 6
UV 254 nm UV 254 nm, Nacetylované UV 254 nm, FMOC UV 254 nm, AQC UV 254 nm, Nbenzoyl UV 254 nm, dansyl UV 254 nm, DNP UV 254 nm, PHTH UV 254 nm UV 254 nm
Aminokyseliny Aminokyseliny Aminokyseliny Aminokyseliny Aminokyseliny
[25] [25] [25] [25] [25] [25] [25] [25] [25]
2.1.2.3.2 Teicoplanin Teicoplanin je dalším antibiotikem ze skupiny glykopeptidů používaný jako chirální selektor v CE [2,25]. Vzniká fermentací Actinoplantes teichomiceticus jako směs 5-ti analogických sloučenin obsahující rozdílné řetězce masných kyselin (C10 a C11) vázané na aminu 2-amino-2-deoxy-β-D-glukopyranozylové skupině [8]. Díky tomuto hydrofobnímu řetězci je teicoplanin povrchově aktivní a tvoří micely, na rozdíl od dalších glykopeptidických antibiotik. Kritická micelární koncentrace je okolo 0,18 M v nepufrovaných vodných roztocích [18] a tato tvorba micel je podporována nízkým pH [9,10]. Stejně jako vankomycin obsahuje množství funkčních skupin, které mohou přispívat k rozlišení chirálních sloučenin. Teicoplanin obsahuje ve své molekule sacharidy D-glukosamin a D-mannozu a rezidua masných kyselin, která jsou vázaná na aminoskupinu glukosaminu [12]. Teicoplanin obsahuje jednu volnou amino skupinu
21
a jednu volnou karboxylovou skupinu, izoelektrický bod je pI je 3,8 [12]. Stejně jako vankomycin, teicoplanin silně absorbuje v oblasti UV spektra pod 250 nm. Na rozdíl od vankomycinu se neabsorbuje na stěnu kapiláry [10]. U teicoplaninu je nejvíce zřetelný vliv přídavku organických rozpouštědel na rozlišení chirálních analytů. Organická rozpouštědla mohou změnit a/nebo bránit samoagregaci teicoplaninu do micel [9]. Teicoplanin se hodí hlavně pro separace negativně nabitých sloučenin. V tabulce 6 je uveden přehled prací používajích teicoplanin jako chirální selektor v CE, mezi nejčastěji rozseparované látky touto sloučeninou patří nesteroidní protizánětlivá léčiva, N-blokované aminokyseliny. Tabulka 6: Přehled prací používajících teicoplanin jako chirální selektor v CE
analyt Trans, trans-abscisová kyselina
koncentrace 5 mM
N-acetyl-tryptofan
5 mM
N-t-Boc-tryptofan
5 mM
N-CBZ-tryptofan
2 mM
Indolin-2-karboxylová kyselina N-(3-Indolylacetyl)aspartová kyselina
5 mM 5 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
5 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
složení pufru 0,1 M fosfát pH 6, 10 % ACN 0,1 M fosfát pH 6, 30 % ACN 0,1 M fosfát pH 6, 20 % ACN 0,1 M fosfát pH 6, 20 % ACN 0,1 M fosfát pH 6, 30 % ACN 0,1 M fosfát pH 6, 20 % ACN 0, 1 M fosfát pH 6 (0-10 % ACN) 0, 1 M fosfát pH 6 (0-30 % ACN) 0, 1 M fosfát pH 6 (0-20 % ACN) 0, 1 M fosfát pH 6 (0-10 % ACN) 0, 1 M fosfát pH 6 (10-30 % ACN) 0, 1 M fosfát pH 6 (0-30 % ACN) 0, 1 M fosfát pH 6 0, 1 M fosfát pH 6 (0-30 % ACN) 0,1 M fosfát pH 6 (0-30 % ACN)
22
poznámka
citace
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm, Nacetylované
[43]
UV 254 nm, AQC
[43]
UV 254 nm, Nbenzoyl UV 254 nm, karboxybenzoyl UV 254 nm, DNB UV 254 nm, Dansyl UV 254 nm, DNP
[43] [43] [43] [43] [43]
UV 254 nm, DNP
[43]
UV 254 nm, FMOC
[43]
Tabulka 6: Přehled prací používajících teicoplanin jako chirální selektor v CE (pokračování)
analyt
koncentrace
složení pufru 0,1 M fosfát pH 6 (0-30 % ACN) 0, 1 M fosfát pH 6 0, 1 M fosfát pH 6 0,1 M fosfát pH 6 (0-30 % ACN)
poznámka
citace
UV 254 nm, DNPyr
[43]
UV 254 nm, DNPyr UV 254 nm, PHTH
[43] [43]
UV 254 nm
[43]
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny Aminokyseliny
5 mM 2 mM
Karboxylové kyseliny
2 mM
Nesteroidní protizánětlivá léčiva (Indoprofen, Caprofen, Ketoprofen, Suprofen, Fenoprofen)
2 mM
0,1 M fosfát pH 6 (0-20 % ACN)
UV 254 nm
[43]
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6 (ACN 0-30 %)
UV 254 nm, dansyl
[33]
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
UV 254 nm, Nformyl
[44]
Peptidy
1,2 mM
25 mM fosfát Tris pH 6,25, 40 % ACN
UV 254 nm
[45]
2.1.2.3.3 Ristocetin A Struktura ristocetinu A se skládá z části aglykonu, na němž jsou připojeny 4 makrocyklické kruhy, a na nich kovalentně vázány některé cukry (arabinoza, glukoza, mannoza a rhamnoza) [2, 25, 44]. Stejně jako u předcházejících antibiotik obsahuje molekula ristocetinu A několik funkčních skupin, jako ester, hydroxy, amid, primární amin a aromatické skupiny. Množství stereogenních center této molekuly je 38 [8]. Ristocetin A je amfoterní sloučenina, která je docela rozpustná v kyselých vodných roztocích a polárních rozpouštědlech jako dimethylsulfoxid a dimetylformamid. Ristocetin neabsorbuje záření ve viditelné oblasti spektra, ale intenzivně absorbuje v UV oblasti pod 250 nm [25]. Díky objemnější vázané skupině cukrů se ristocetin A méně váže na stěnu kapiláry než vankomycin, což se projevuje v kratších časech analýz a větší stabilitou v roztoku než u zmíněného vankomycinu [10]. Tabulka 7 uvádí přehled prací používajících ristocetin A jako chirální selektor v CE.
23
Tabulka 7: Přehled prací používajících ristocetin A jako chirální selektor v CE
analyt
koncentrace
N-t-Boc-tryptofan
2 mM
Indol-3-mléčná kyselina Cis, trans-abscisová kyselina Indolin-2-karboxylová kyselina
2 mM 2 mM
složení pufru 0,1 M fosfát pH 6, 20 % MeOH 0,1 M fosfát pH 6 0,1 M fosfát pH 6
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 7, 0-30 % pronan-2-ol
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6 nebo 7
Aminokyseliny
2 mM
0,1 M fosfát pH 6
Aminokyseliny
2 mM
Karboxylové kysleiny
2 mM
Nesteroidní protizánětlivá léčiva (Flurbiprofen, Indoprofen, Carprofen, Ketoprofen, Suprofen, Fenoprofen, Naproxen)
2 mM
0,1 M fosfát pH 6 nebo 7, 0-30 % propan-2-ol 0,1 M fosfát pH 7, 0-10 % propan-2-ol
0,1 M fosfát pH 6 nebo 7, 0-10 % propan-2-ol 0,1 M fosfát pH 6 nebo 7, 0-10% propan-2-ol
0,1 M fosfát pH 6
24
poznámka
citace
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm UV 254 nm
[26] [26]
UV 254 nm
[26]
UV 254 nm, AQC
[46]
UV 254 nm, FMOC UV 254 nm, Dansyl UV 254 nm, DNP UV 254 nm, PHTH UV 254 nm, N-benzoyl UV 254 nm, N-formyl UV 254 nm, N-acetylované UV 254 nm, karboxybenzoyl
[46] [46] [46] [46] [46] [46] [46] [46]
UV 254 nm, DNPyr
[46]
254 nm
[46]
254 nm
[46]
2.2 Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí Díky jednoduchosti online zapojení je UV-Vis detekce nejrozšířenější detekcí používanou v kapilární elektroforéze. Kapiláry používané v CE mají ale malý vnitřní průměr, a tím je i snížena citlivost UV-Vis z důvodu krátké optické dráhy, a minimální měřitelná množství se pak pohybují okolo µg/ml. Mnoho farmaceutických a biologických látek je ale ve směsích obsaženo v menších koncentracích, často ani neobsahují vhodné skupiny chromoforů a následná derivatizace může být, pro jejich stanovení UV-Vis detekcí, nutná. K tomu dochází i při použití fluorescenční detekce, zvláště při použití laserem indukované fluorescence (LIF), kdy pouze malé počty látek fluoreskují při vhodné vlnové délce laseru. Další možnou technikou detekce ve spojení s CE jsou elektrochemické detektory. Jejich nevýhodou je ale složité rozhraní mezi CE a detektorem a použití je omezeno pouze pro elektroaktivní látky. U všech těchto metod detekce pak můžeme identitu jednotlivých píků odhadnout pouze na základě migračních časů, což je často nedostačující pro přesné potvrzení totožnosti zvláště u složitějších vzorků [3]. Použití hmotnostní spektrometrie (MS) jako detektoru pro kapilární elektroforézu nám poskytuje možnost rychlých, účinných a citlivých analýz. Získáváme také možnost identifikace analytů, informace o molekulové hmotnosti a fragmentací informace o možné struktuře., což je důležité pro identifikaci a potvrzení analytů ve složitých směsích [46]. Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí má ale i své překážky, které musíme vzít v úvahu. Typické průtoky v CE kapilárách (pod 100 nl/min) nejsou kompatibilní s konvenčním rozhraním používaným v LC-MS, proto je nutná miniaturizace rozhraní a elektrospreje nebo použití pomocné kapaliny [47]. Další možnou překážkou mohou být aditiva přidávána do základního elektrolytu pro zvýšení selektivity. Tyto látky mohou být v mnoha případech netěkavé a to může vést ke kontaminaci iontového zdroje a analyzátoru [3,48].
25
2.2.1
Spojení
kapilární
elektroforéza
–
hmotnostní
spektrometrie Na rozdíl od tradičních spektrofotometrických detektorů je propojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem tvořeno tzv. otevřeným módem. Konec separační kapiláry není ve výstupní elektrolytové nádobce, ale je umístěn před vstup do MS. Toto rozhraní musí být provedeno tak, aniž by došlo k rozmývání zón migrujících analytů a změně účinnosti separace a byl zachován průchod elektrického proudu potřebný k elektroforetické separaci a ionizaci v MS. První typ spojení CE s MS je založen na přívodu pomocné kapaliny („sheath-flow“), zatímco druhý spočívá v miniaturizaci rozhraní bez potřeby přídavných kapalin („sheathless“) [3]. 2.2.1.1
Rozhraní s přídavnou kapalinou
Díky tokům kapaliny v CE, které jsou v rozsahu nl/min, probíhá proces odpařování docela snadno. Avšak na špičce kapiláry se mohou tvořit kapičky, které mohou vést k nestabilnímu toku do iontového zdroje hmotnostního spektrometru. Použitím přídavných kapalin se tomu dá ale předcházet. Zatímco realizace tohoto systému s přídavnou kapalinou je relativně jednoduchá, optimalizace operačních parametrů (průtok pomocné kapaliny a její složení, poloha špičky kapiláry), k získání stabilního a opakovatelného spreje, je docela komplikovaná. Používají se dva typy rozhranní s přídavnou kapalinou: s přídavným tokem kapaliny [49-53] (sheath-liquid interface) a s vodivým kapalným spojením [51-53] (liquid junction interface). Rozdíl je mezi začlenění pomocné kapaliny do uspořádání spojení. U spojení s přídavným tokem je pomocná kapalina vedena podél separační kapiláry do vstupu MS, u druhého typu spojení je pomocná kapalina přechodem mezi separační a sprejovací kapilárou. U spojení s přídavným tokem je CE kapilára umístěna ve středu spreje [49,50]. Pomocná kapalina, v rozsahu µl/min, je vedena nerezovou kapilárou, která obklopuje separační CE kapiláru (obrázek 5). Na konci je pomocná kapalina mísena s eluátem z CE kapiláry. Díky tomuto obklopení CE kapiláry pomocnou kapalinou se eliminuje vznik nepravidelných kapiček. Vnější, krajní kapilárou, také z nerezové oceli, je do tohoto systému veden zmlžující plyn, který napomáhá utváření spreje. Toto spojení
26
je díky množství výhod používáno nejčastěji. Spojení je snadněji realizovatelné a dává vhodné podmínky pro ionizaci a odpařování.
Separační kapilára Zdroj energie pro ESI
Pomocná kapalina
Zmlžující plyn
Obrázek 5: Schematické znázornění spojení s přídavným tokem [54]
U rozhranní s vodivým kapalným spojením [51-53] je spojení mezi kapilárami zajištěno pomocí nádržky, v níž je umístěna pomocná kapalina společně s elektrodou, která zajišťuje elektrické spojení kapilár (obrázek 6). Analyty se díky vlivu elektrického pole a „sifonovému efektu“ zmlžujícího plynu pohybují směrem k detektoru. Tato mezera mezi kapilárami ale může mít vliv na rozšíření zón anylytu a na zmenšení separační účinnosti. Zdroj vysokého napětí
Separační kapilára
Nádržka s pomocnou kapalinou Zmlžující plyn
Obrázek 6: Schematické znázornění rozhraní s vodivým kapalným spojením [54]
2.2.1.2
Rozhraní bez přídavné kapaliny
Rozhraní bez přídavné kapaliny můžeme rozdělit do dvou typů. U prvního je separační kapilára přímo spojena s jehlou nanospreje, kdy tato jehla může být nahrazena nezávisle na separační kapiláře [55]. U druhého typu spojení je separační kapilára
27
použita přímo jako emitor použitím vodivé vrstvy (viz obrázek 7) [3,56] nebo vložením vodivého drátu do výstupu kapiláry [3]. Tyto rozhranní jsou velmi citlivé. Redukcí průtoku se obvykle zlepší ionizace analytů a generují se menší kapky. Důležitý je také poměr iontů, které se dostanou do hmotnostního analyzátoru. V tomto mají rozhraní bez přídavného toku kapaliny výhodu, protože špička nanospreje je umístěna blíže k vstupnímu otvoru do MS v porovnání s rozhraními s přídavným tokem kapaliny. Toto spojení je ale v důsledku odlupování vodivé vrstvy méně stabilnější. Také elektroforetické a ionizační proudy jsou díky nízkému průtoku eluátu hůře nastavitelné.
Separační kapilára Pozlacená špička kapiláry
Zdroj energie pro ESI
Zmlžující plyn
Obrázek 7:Schematické provedení rozhranní bez přídavné kapaliny [54]
2.2.2
Iontový zdroj
Aby mohly být analyty separovány a detekovány pomocí hmotnostní spektrometrie, musí se ionizovat a desolvatovat. Oba procesy se uskutečňují díky množství ionizačních metod, jako jsou: ionizace za atmosférického tlaku (API), desorpce a ionizace laserem za asistence matrice (MALDI), ionizace induktivně vázaným plazmatem (ICP) [3]. Převládající ionizační metodou pro online CE-MS je nepochybně ionizace elektrosprejem (ESI). Je vhodná pro analýzy ionizovatelných a polárních sloučenin s hmotností 102 až 105 Daltonů. Vzorek, který je rozpuštěný v polárním těkavém rozpouštědle, je transportován skrze jehlu, na níž je umístěn vysoký negativní nebo pozitivní potenciál. Vysoký elektrický potenciál mezi špičkou jehly a tryskou (1 až 4 kV) způsobí vznik tzv. Taylorova kužele, jehož konec je obohacen kladnými nebo zápornými ionty (viz obrázek 8). Elektrickým polem jsou nabité ionty z Taylorova kužele uvolňovány [53,57]. Kapičky se díky odpařování zmenšují, odpařování
28
napomáhá také proud teplého dusíku. Ionty se tvoří za atmosférického tlaku, a postupně procházejí kuželovitými otvory až do hmotnostního analyzátoru, kde je vysoké vakuum [58,59]. Zmlžující plyn
Tryska
Taylorův kužel Tok kapaliny
Zdroj vysokého napětí
Obrázek 8: Schematický princip elektrospreje [59]
2.2.3 Mezi
Analyzátor nejpoužívanější
analyzátory používané
při
spojení
CE-MS
patří
kvadrupólový analyzátor díky jeho relativně nízké ceně, menším rozměrům a snadné obsluze. Separační princip je založen na využití kombinace stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí. Analyzátor je sestaven ze 4 paralelních kovových tyčí kruhového průřezu. Tyče jsou propojeny tak, že protilehlé jsou navzájem spojeny a připojeny ke zdrojům stejnosměrného a vysokofrekvenčního napětí. Na jednu dvojici tyčí je vkládáno kladné stejnosměrné napětí, na druhou dvojici záporné, na všechny je pak zároveň vkládáno vysokofrekvenční střídavé napětí [46,60]. Kvadrupól se chová jako hmotnostní filtr, v daném časovém okamžiku propouští pouze určitou hodnotu m/z a ostatní ionty se zachytí na tyčích kvadrupólu. Tento poměr m/z se nastaví změnou hodnot U (stejnosměrné napětí) a V (amplituda střídavého napětí) [60]. Plynulou změnou hodnot U a V, kdy poměr U/V zůstává vždy konstantní, jsou kvadrupólem propuštěny postupně všechny ionty. Tento skenovací mód není pro použití v CE-MS, díky velmi úzkým píků, vhodný. Častější je použití tzv.
29
selektivního záznamu spektra (SIM mód), kdy se již neměří hmotnostní spektrum, ale závislost intenzity daného iontu na času, což je vhodné pro kvantitativní analýzu látek se známou strukturou [3]. Na obrázku 9 je znázorněn schématicky kvadrupól a naznačeny dráhy iontů. Kvadrupól Detektor
Zdroj napětí Zdroj iontů
Obrázek 9: Schéma kvadrupólu a naznačenými dráhy iontů [60]
2.2.4
Využití CE-ESI-MS při chirálních separacích
Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí pro chirální separace brání používaní netěkavých aditiv, v tomto případě hlavně chirálních selektorů, které může vést ke ztrátě efektivity ionizace a/nebo ke kontaminaci iontového zdroje. Za účelem vyvarování se těmto nežádoucím vlivům, se v chirální CE-MS používá technika částečného plnění kapiláry (PFT). Tato technika spočívá v naplnění kapiláry základním elektrolytem s chirálním selektorem pouze do určité části kapiláry, většinou z 90% v případě použití MS nebo po detekční okno v případě použití UV/VIS detektoru. Zbývající prostor kapiláry (blíž k detektoru) je pak vyplněn pouze základním elektrolytem. V zóně s chirálním selektorem pak dochází k separaci, enantiomery pak migrují do nechirální zóny a jsou detekovány bez zásahu chirálního selektoru. Pokud separujeme kyselé analyty za použití vankomycinu, potom je vhodné zvolit takové pH pracovního elektrolytu, aby vankomycin byl kladně nabitý a analyty záporně nabité a analýzu pak provádíme při obrácené polaritě [3,8,10,12]. Schématicky je proces částečného plnění kapiláry naznačen na obrázku 10.
30
A) Naplnění kapiláry základním elektrolytem bez chirálního selektoru
B) Naplnění části kapiláry základním elektrolytem obsahující chirální selektor
C) Nadávkování dvojice enantiomerů – aniontů A a B
D) Vložení napětí do systému a následná elektroforetická separace
E) Detekce analytů bez přítomnosti chirálního selektoru
Obrázek 10: Schéma elektroforetické separace dvojice enantiomerů – aniontů – použitím PFT [8]
31
2.3 Glycerová kyselina Glycerová kyselina (2,3-dihydroxypropionová kyselina) patří mezi aldonové kyseliny, které jsou produkty mírné oxidace aldóz. Vzniká také oxidací glycerolu a glyceraldehydu. Fyzikálně chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 8. Tabulka 8: Fyzikálně chemické vlastnosti glycerové kyseliny [14]
vlastnosti rozpustnost optická otáčivost
vyskytuje se v D- a L- formě, bezbarvá sirupovitá kapalina, v bezvodém stavu bílý prášek dobře rozpustná ve vodě, alkoholu, acetonu estery a soli L- formy jsou levotočivé ([ߙ]ଶ =-14,6°), soli D- formy pravotočivé ([ߙ]ଶ =+14,5°)
pKa
3,55 (25°C)
Mr
106,08
V metabolismu savců se vyskytuje ve dvou enantiomerech, L- a D- (Obrázek 11). Oba tyto enantiomery jsou vylučovány ve stopových množstvích z těla močí, procentuální množství se u zdravého lidského jedince pohybuje v rozmezí 36 – 93 % Lglycerátu a 7 – 64 % D-glycerát [61]. Přítomnost jednoho z těchto enantiomerů v abnormální koncentraci může indikovat různé typy onemocnění. V moči zdravého jedince se množství DL-glycerátu pohybuje okolo 4,5 µmol/mmol kreatininu (0,00 – 9,00) [62] a v krevním séru 10,0 µM (0,0-24,0) [62]. Množství glycerátu je závislé na věku, jak je uvedeno v tabulce 9. U lidí s metabolickým onemocněním je množství vylučovaného glycerátu mnohonásobně vyšší, a to 1450 µmol/mmol kreatininu (1,2 – 2360,0) při primární hyperoxalurii II a 15000 µmol/mmol kreatininu (10000 – 20000) při D-glycerát aciduii [62].
Obrázek 11: Struktura L- a D- glycerové kyseliny
32
Tabulka9: Normální hodnoty koncentrací glycerové kyseliny v moči u člověka (µ µmol/mmol kreatininu) [62]
Střední koncentrace
Rozmezí normálních koncentrací
(µ µmol/mmol kreatininu)
(µ µmol/mmol kreatininu)
0-30 dní
21,6
0,5 – 91,1
0-1 roků
8,9
2,4 – 60,0
1-13 roků
5,3
0,1 – 37,3
13-18 let
3,5
0,1 – 8,0
18 a více let
4,5
0,0 – 9,0
Věková skupina
Mezi onemocnění charakterizované zvýšenou tvorbou a vylučováním jednoho z optických izomerů glycerové kyseliny patří D-glycerát academie/acidurie a primární hyperoxalurie typu 2 (PH II) (také L-glycerát academie/acidurie). D-glycerátdehydrogenáza hydroxypyruvátu
na
(D-GDH)
D-glycerát,
katalyzuje
přítomnost
D-GDH
vzájemnou také
řídí
přeměnu aktivitu
glyoxylátredukrázy (GR), který redukuje glyoxylát na glykolát. Při genetickém nedostatku D-GDH není hydroxypyruvát metabolizován na D-glycerát, ale díky Llaktátdehydrogenáze (LDH) převeden na L- glycerátu, a glyoxylát je metabolizován LDH na oxalát. Tato metabolická porucha vede k nadměrnému vylučování oxalátu a Lglycerátu v krvi a moči. Při tomto onemocnění PH II se nadměrně tvoří močové kameny (urolitiáza a nefrokalcinóza), což může vést až k selhání ledvin [63,64,65] Zvýšené vylučování D-glycerátu je vysvětlováno nedostatkem D-glycerátkinázy, která metabolizuje D-glycerovou kyselinu na 3-fosfoglycerát. Na obrázku 12 jsou znázorněny metabolické dráhy enantiomerů glycerové kyseliny.
33
Obrázek12: Metabolické dráhy L- a D- glycerátu. Neodstatek D-glycerátdehydrogenázy/glyoxylát reduktázy D-GDH/GR (1) vede ke zvýšené tvorbě oxalátu prostřednictvím L-laktátdehydrogenázy (2). Mimoto Dglycerát nemůže být metabolizován na pyruvát, ale je redukován na L-glycerát L-laktátdehydrogenázou [65].
Tabulka 10 uvádí přehled prací stanovující glycerovou kyselinu a její enantiomery. Tabulka 10: Přehled prací stanovující glycerovou kyselinu
analytická technika potenciometrie (EPME)
stanovení
podmínky separace
vzorek
citace
enantiomery
maltodextriny I, II, III
sérum, moč
[63]
moč
[64]
moč
[61]
MF: 0,1%triethylamin a 5% acerát LC-MS-MS
enantiomery
pH 4,1 + MeOH (9:1 v/v), SF: silikagel s ristocetinem A O-acetylované(+)-2-butyl estery nebo
GC-MS
enantiomery
O-acetylované(-)-methyl estery; DB5
GC-MS
směs
SP-1000 kolona
moč
[66]
CE
směs
300 mM borát pH 8,5
moč
[66]
CE
směs
0,2 M fosfát pH 6
moč
[67]
CE-MS-MS
směs
20 mM acetát amonný pH 8,5
moč
[68]
CE
směs
stolice
[69]
234 mM fosfát pH 6,0 + 12 % (v/v) MeOH, pokrytá kapiláry
34
Tabulka 10: Přehled prací stanovující glycerovou kyselinu (pokračování)
analytická technika
stanovení
podmínky separace
vzorek
citace
moč
[70]
O-trifluoroacetylované (S)-(+)-3GC-MS
enantiomery
methyl-2-butylestery; DB-5 a DB-17 kolony
GC-MS
směs
DB-1 kolona
moč
[71]
GC
směs
10%OV-1 a 10%OV-17 kolony
moč
[72]
GC-MS
enantiomery
moč
[73]
ITP
GC-MS
směs
enantiomery
O-trifluoroacetylované (-)methylestery; DB-5 a DB-17 kolony vedoucí: 10 mM HCl pH 3,0 +
oxidace
β.alanin + 0,2% Triton X, koncový:
hexóz
5,6 mM acetát sodný
Pd(II)
O-acetylované methylestery
moč, sérum
35
[74]
[75]
3
Experimentální část
3.1 Přístrojové vybavení Všechny analýzy byly provedeny separací kapilární elektroforézou s hmotnostní spektrometrií jako detekcí. Použita byla ionizace elektrosprejem a jako hmotnostní analyzátor byl použit kvadrupól. CE-MS systém Agilent Technologies. Kapilární elektroforéza CE HP3D (Agilent, Německo) s detektorem diodového pole a hmotnostním spektrometrem pracujícím na principu jednoduchého kvadrupólu (Agilent G6130), tok přídavné kapaliny byl zajišťován isokratickou pumpou pro kapalinovou chromatografii (Agilent G1310).
3.2 Chemikálie a pomůcky Byly použity chemikálie: octová kyselina (Sigma), mravenčí kyselina (Fluka), hydroxid amonný (Fluka), L-Glycerová kyselina (Sigma), DL-Glycerová kyselina (Sigma), deionizovaná voda, vankomycin chlorid (Sigma), methanol (Merck), amoniak (Fluka), hydroxid amonný (Sigma), kyselina dusičná (Sigma), ethanol (Sigma), 3trimethylsilylpropylmethakrylát
(Sigma),
tetramethylendiamin
peroxodisíran
(Sigma),
akrylamid draselný
(Sigma), (Sigma),
N,N,N´,N´2-ethyl-2-
hydroxymálesná kyselina, THF (Sigma), diethyletrher (Sigma), butylacetát (Sigma), ethylacetát (Sigma), kyselina chlorovodíková (Fluka). Všechny použité chemikálie byly p.a. čistoty. Reálné vzorky krevního séra a moči. Ultrazvuk ElmaSonic S4OH, Ultracentrifuga Thermo Electron Corporation MR23i, Filtry Millipore (průměr 25 µm)
3.3 Postup pokrývání kapilár Při separaci glycerové kyseliny byla použita pokrytá křemenná kapilára. Pokrytím došlo k potlačení elektroosmotického toku, a při daných separačních podmínkách vankomycin migroval jako kation směrem ke katodě, tj. od detektoru, a anionty glycerové kyseliny k anodě, tj. k detektoru. Postup použitého polyakrylamidového kovalentního pokrytí byl publikován Schützerem roku 1994 [76].
36
Křemenná kapilára se promývá 3 hodiny roztokem 1 mol.l-1 NaOH, poté 30 minut deionizovanou vodou a nakonec 3 hodiny roztokem 1 mol.l-1 HNO3. Po promytí následuje silanizace 1% (v/v) roztokem 3-trimethylsilylpropylmethakrylátem v etanolu po dobu 3 hodin. Po silanizace se kapilára opět promyje deionizovanou vodou po dobu 30 minut. Polyakrylamidové pokrytí silylované kapiláry se provede roztokem 4% (w/v) akrylamidu v čerstvě převařené a zchlazené deionizované vody s přídavkem 0.1 % (w/v) peroxodisíranu draselného a 0,1 % (v/v) N,N,N´,N´-tetramethylendiamin (TEMED) po dobu 12 hodin. Po 12-ti hodinovém pokrývání se kapilára promyje 30 minut deionizovanou vodou.
3.4 Experimentální podmínky K separaci enantiomerů glycerové kyseliny byla použita křemenná kapilára vnitřního průměru 50 µm a celkové délky 85 cm, která byla pokryta způsobem popsaným v kapitole 3.3. V případě použití hmotnostního spektrometru jako detektoru je celková délka kapiláry rovna efektivní délce. V samotném experimentu byly použity standardní roztoky DL- a L- glycerátu o koncentraci 0,1 mg.ml-1, 25 mM roztok vankomycin chloridu a pufr 50 mM acetát amonný o pH 4,5. Při chirální separaci glycerové kyseliny byla použita metoda částečného plnění kapiláry, kdy pracovním elektrolytem s vankomycin chloridem jako chirálním selektorem byla kapilára naplněna z 90 % celkové délky. Jelikož vankomycin není dostatečně těkavý, kontaminací iontového zdroje by mohl snížit účinnost ionizace a citlivost detekce. Při použití částečného plnění kapiláry s kombinací kovalentně pokrytých kapilár lze kontaminaci vankomycinem zabránit. Po nadávkování vzorku obsahujícího DL-glycerovou kyselinu za zónu pufru s vankomycin chloridem a vložení negativního separačního napětí dojde k protisměrné migraci vankomycinu a enantiomerů glycerové kyseliny (při pH 4,5 pracovního elektrolytu je vankomycin kladně nabitý a migruje k anodě, od iontového zdroje, zatímco glycerová kyselina migruje jako anion ke katodě, do iontového zdroje). K dávkování
pracovního
elektrolytu
s vankomycinem
bylo
použito
hydrodynamické dávkování 50 mbar/1500 s. Za tuto zónu pufru s chirálním selektorem
37
byl nadávkován vzorek, hydrodynamicky 50 mbar/5 s a za vzorek hydrodynamicky 50 mbar/5 s pracovní pufr bez vankomycinu. Separace kapilární elektroforézou byla provedena při napětí -20 kV. Spojení kapilární elektroforézy a hmotnostní spektrometrie bylo realizováno použitím elektrospreje. Ionizace analytu v elektrospreji byla provedena v negativním módu při sprejovacím napětí -3,5 kV. Pomocná kapalina byla tvořena methanolem a vodou v poměru 50:50 (v/v) a přídavkem hydroxidu amonného 0,13% (v/v). Průtok pomocné kapaliny byl 4 µl/min. S využitím SIM módu byly na kvadrupólu detekovány pouze ionty s poměrem m/z = 105 ±0,5, to odpovídá iontům [M-H]-. Před chirální separací byl prostudován vliv experimentálních podmínek, pozornost byla věnována složení a pH pracovního pufru, koncentraci chirálního selektoru.
38
4
Výsledky a diskuse
4.1.1 Vliv základního elektrolytu Použitím hmotnostní spektrometrie jako detektoru jsme limitováni výběrem základního elektrolytu, který by měl být pro toto použití těkavý. Jako potencionálně vhodné základní elektrolyty byly vybrány 50 mM acetát amonný vytitrovaný do pH 4,0, 4,5 a 5,0 a 50 mM formiát amonný vytitrovaný do pH 4,0, 4,5 a 5,0. Za podmínek shrnutých v kapitole 3.4, použití ale 1 mg.ml-1 DL-glycerové kyseliny a 15 mmol.l-1 vankomycinu byly proměřeny signály pro jednotlivé základní elektrolyty. Z hodnot plochy signálu byly sestaveny histogramy, uvedené na následujících dvou obrázcích (Obrázek 13 a Obrázek 14). I přes vysokou odezvu při použití formiátových pufrů bylo od nich upuštěno, jelikož při dané koncentraci vankomycinu se rozlišení DL-glycerátu pohybovalo okolo 0,5 (jak je znázorněno na Obrázku 15) a píky analytů byly rozmyté. Pro acetát amonný bylo největšího signálu a také největšího rozlišení 1,6 pro 15 mM vankomycin dosaženo při použití pH 4,5.
Plochy píků v závislosti na pH základního elektrolytu (acetát amonný)
1000000 500000
2 109 945
2 175 221
2 172 135
1 488 805
1500000 1 427 203
Plocha
2000000
2 204 483
2500000
L-glycerát D-glycerát
0 4,0
4,5
5,0
pH
Obrázek 136: Velikost plochy píků v závislosti na pH použitého 50 mM acetátu amonného použitého jako základní elektrolyt při použití 15 mM vankomycinu jako chirálního selektoru.
39
Plochy píků v závislosti na pH základního elektrolytu (formiát amonný) 10000000
4000000 2000000
7 144 247
8 839 347
6000000 4 861 604
Plocha
8000000
D,L-glycerát
0 4,0
4,5
5,0
pH
Obrázek 147: Velikost plochy píků v závislosti na pH použitého 50 mM formiátu amonného použitého jako základní elektrolyt při použití 15 mM vankomycinu jako chirálního selektoru.
Rozlišení
Velikost rozlišení 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
1,55
acetát amonný pH 4,0
1,6
acetát amonný pH 4,5
1,55
acetát amonný pH 5,0
0,5
0,55
0,55
formiát amonný pH 4,0
formiát amonný pH 4,5
formiát amonný pH 5,0
Obrázek 158: Velikost rozlišení DL-glycerátu v závislosti na použitém základním elektrolytu a jeho pH, při použití 15 mM vankomycinu.
4.1.2 Vliv koncentrace vankomycinu Po separaci D,L-glycerátu byl studován vliv koncentrace vankomycin chloridu na rozlišení. Studované koncentrační rozmezí bylo 5 – 25 mmol.l-1.
Dostatečné
. -1
rozlišení poskytoval roztok vankomycinu o koncentrace 25 mmol l . Se zvyšující se koncentrací vankomycinu dochází dále ke zvyšování rozlišení, ale také i k většímu
40
rozmývání separovaných zón a k poklesu účinnosti. Závislost rozlišení na koncentraci vankomycinu je zobrazena na Obrázku 16.
Závislost rozlišení na koncentraci vankomycinu 2,5
rozlišení
2 1,5 1 0,5 0 0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
koncentrace vankomycinu (mM)
Obrázek 169: Závislost rozlišení na koncentraci vankomycinu pro 50 mM acetát amonný pH 4,5
4.1.3 Kalibrační data Pro účel stanovení obsahu D- a L-
glycerátu byla zpracována kalibrace a
stanoveny některé ze základních charakteristik (Tabulka 11). Z těchto dat byly vyhotoveny kalibrační křivky pro jednotlivé enantiomery (Obrázek 17 a 18) a zjištěny rovnice kalibračních přímek. K tomuto vyhodnocení byl použit statistický program QC Expert. Na Obrázku 19 je pak elektroferogram standardu L- a D- glycerátu.
Obrázek 17: Kalibrační závislost pro L-glycerát, pro 50 mM acetát amonný pH 4,5 a 25 mM vankomycin.
41
Obrázek 10: Kalibrační závislost pro D-glycerát, pro 50 mM acetát amonný pH 4,5 a 25 mM vankomycin. Tabulka 11: Kalibrační data pro L- a D- glycerátu, pro 50 mM acetát amonný pH 4,5 a 25 mM vankomycin
0,9939
limit detekce (mg.l-1) 0,0849
limit kvantifikace (mg.l-1) 0,1207
0,9911
0,1011
0,1426
rovnice kalibrační přímky
R2
L-glycerát
y = 5493912x – 168932
D-glycerát
y = 5544802x – 189145
MSD2 TIC, MS File (D:\VITEK\GLYCERIC_LK\GLY000082.D)
ES-API, Neg, SIM, Frag: 60, "105"
70000
D-glycerát
60000
50000
L-glycerát 40000
30000
20000
10000
0 2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
m in
Obrázek19: Elektroferogram standardu D- a L- glycerátu. Podmínky separace: 1 mg.ml-1 DL-glycerát, U = -20 kV, pufr: 50 mM acetát amonný pH 4,5, 25 mM vankomycin, PFT pufr s vankomycinem do 90 % celkové délky kapiláry 50mbar/1500s; MS detekce: negativní ionizace -3,5 kV, T=175°C, tlak zmlžujícího plynu 10 psig, průtok zmlžujícího plynu 13 l.min-1, pomocná kapalina 50:50 methanol:voda (v:v) s přídavkem 0,13 % hydroxid amonný, průtok 4 µl.s-1.
42
4.1.4 Analýza reálných vzorků Pro aplikaci vyvinuté metody chirální separace D,L-glycerové kyseliny pomocí CE-ESI-MS byly vybrány dva typy vzorků, moč a krevní sérum. Moč i krevní sérum obsahují celou řadu látek, i vysokomolekulární povahy. Přítomností těchto látek by mohlo docházet k ucpávání kapiláry, proto je vhodné před vlastním nadávkováním vzorky upravit. Úpravou vzorků můžeme současně i analyzované látky zakoncentrovat. Pro úpravu vzorků byly vybrány 3 různé postupy L-L extrakce. 1) kombinace diethyletheru a THF - použita pro izolaci glycerové kyseliny autory Dietzen a kol. [71] 2) extrakce ethylacetátem - použita pro extrakci glycerové a mléčné kyseliny Kamerlingem [75] 3) a extrakce butylacetátem V prvním případě, kdy bylo jako extrakčního činidla užito diethyletheru a THF, byl vzorek okyselen kyselinou chlorovodíkovou na pH 1, nejprve 3x extrahován diethyletherem v poměru 1:1, poté 3x THF v poměru 1:1. Oba extrakty (diethylether a THF) byly spojeny a odpařeny do sucha pod mírným proudem dusíku při laboratorní teplotě. Získaný odparek byl rozpuštěn v deionizované vodě a analyzován. Výtěžnost tohoto postupu extrakce byla pro moč i krevní sérum nízká. Při extrakci ethylacetátem byl vzorek taktéž okyselen kyselinou chlorovodíkovou na pH 1. Byly studovány různé poměry extrakčního činidla a vzorku (vzorek:ethylacetát 2:1, 1:2, 4:1, 1:4, 1:1) a různé počty opakování (1x, 2x, 4x). Odparek byl odpařen do sucha pod mírným proudem dusíku za laboratorní teploty, rozpuštěn v deionizované vodě a analyzován. Výtěžnost extrakce ethylacetátem byla nejvyšší v případě, kdy byl poměr vzorku a ethylacetátu 4:1 a extrakce byla provedena opakovaně 4x a dílčí extrakty spojeny. Při použití butylacetátu jako extrakčního činidla bylo použito stejného postupu jako u ethylacetátu. Bohužel butylacetát jako méně polární rozpouštědlo se pro extrakci glycerové kyseliny neosvědčil opět z důvodu nízké výtěžnosti. Nejlepší výsledky z hlediska nejvyšší výtěžnosti a její opakovatelnosti poskytoval ethylacetát pro moč i krevní sérum. U vzorků krevního séra byla také provedena extrakce výše popsaným způsobem, ale poměr ethylacetátu a séra byl 1:1. V případě
43
moči i séra byla extrakce provedena smícháním vzorku v uvedených poměrech, směs byla sonifikována po dobu 10 minut a centrifugována při 19000 otáčkách/min po dobu 10 minut. Ethylacetátová vrstva byla odebrána a odpařena pod mírným proudem dusíku za laboratorní teploty, rozpuštěna ve vodě (10 x menším objemu než byl původní objem extraktu) a analyzována. Výsledky dokládající výtěžnosti použitých extrakčních postupů pro moč i sérum jsou v tabulce 12, graficky jsou výtěžnosti zobrazeny na obrázku 20. Tabulka 12: Výtěžnost extrakcí pro moč a krevní sérum
Extrakční činidlo
Výtěžnost pro moč
Výtěžnost pro krevní sérum
Diethylether + THF
20,1 ± 12,8 %
12,2 ± 7,2 %
Ethylacetát
95,6 ± 2,6 %
92,2 ± 3,1
Butylacetát
40,4 ± 5,8 %
36,1 ± 5,2 %
Výtěžnost byla stanovena pro racemát D,L-glycerové kyseliny přidané do moči nebo krevního séra tak, aby výsledná přidaná koncentrace odpovídala 20 µg/l.
Výtěžnost extrakce Procentuální výtěžnost extrakce
100,00% 95,6%
92,9%
80,00% 60,00%
diethylether + THF
40,4%
36,1%
40,00%
ethylacetát butylacetát
20,1% 12,2%
20,00% 0,00% moč
krevní sérum
Obrázek 2011: Výtěžnost extrakcí pro moč a krevní sérum při použití extrakčních činidel diethyletheru + THF, ethylacetát a butylacetátu. Chybové úsečky zobrazují RSD v %.
Uvedené extrakční postupy byly aplikovány na reálné vzorky moči a krevního séra, jejich elektroferogramy jsou zobrazeny na obrázcích 21 a 22. V moči byla
44
detekována pouze L-glycerová kyselina, jejíž identifikace byla provedena standardním přídavkem. Koncentrace L-glycerové kyseliny v moči byla 254 µg/L, což odpovídá koncentraci 2,4 µmol/l. V krevním séru byly detekovány oba enantiomery glycerové kyseliny. Koncentrace L-glycerové kyseliny v krevním séru byla 412 µg/l (3,90 µmol/l) a koncentrace D-glycerové kyseliny byla 28 µg/l (0,26 µmol/l). 20000
17500
L-glycerová L-glycerát k.
15000
12500
10000
7500
5000
2500
0 2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
min
Obrázek 21: Elektroferogram moči po extrakci 70000
L-glycerát L-glycerová k. 60000
50000
40000
D-glycerátk. D-glycerová
30000
20000
10000
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
Obrázek 22: Elektroferogram separace vzorku krevního séra po extrakci ethyacetátem
45
20
min
5
Závěr
Kapilární elektroforéza s hmotnostní detekcí se ukázala být vhodnou separační technikou pro stanovení enantiomerů glycerové kyseliny. Pro jejich stanovení bylo použito kombinace pokryté kapiláry a techniky částečného plnění kapiláry s použitím vankomycinu jako chirálního selektoru. Pro chirální separace D- a L- glycerové kyseliny byly prostudovány experimentální podmínky pro metodu CE-ESI-MS. Pozornost byla věnována především složení základního elektrolytu a koncentraci vankomycin chloridu. Separace byla provedena pro standardy glycerové kyseliny, tak pro reálné vzorky moči a krevního séra. Pro reálné vzorky byla studována nejvhodnější metoda izolace a prekoncentrace glycerové kyseliny z matrice. V reálných vzorcích se podařilo identifikovat a stanovit jednotlivé enantiomery glycerové kyseliny.
46
6
Seznam zkratek a symbolů
ACN – acetonitril AEOC – 2-(9-anthryl)ethylchlorformiát API – ionizace za atmosférického tlaku AQC – 6-aminoquinolyl-N-hydroxylsuccinimdyl karbamát Boc – N-t-Boc-tryptofan CBZ – karbobenzyloxy CE – kapilární elektroforéza CD – cyklodextrin DDB – dimethyldifenylbikarboxylát DMF – dimethylformamid DMSO – dimethylsulfoxid DNB – N-3,5-dinitrobenzoyl DNP – 2,4-dinitrofenyl DNPyr – N-3,5-dinitropyridyl EPME – enantioselektivní potenciometrické membránové elektrody ESI – ionizace elektrosprejem FMOC – 9-fluorenylmethyl chloroformát GC – plynová chromatografie HEPES – 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina HDB – hexadimethrin bromid His – histidin HNO3 – kyselina dusičná HPLC – vysokoúčinná kapalinová chromatografie ICP – indukčně vázané plazma ITP – izotachoforéza LC-MS – spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií LIF – laserem indukovaná fluorescence MALDI – desorpce a ionizace laserem za přítomnosti matrice MeOH – methanol
47
MF – mobilní fáze MOPS – 3-morpholinopropenesulfonát MS – hmotnostní spektrometrie NaOH – hydroxid sodný PDMD – polydimethylacetamid PFT – technika částečného plnění PHTH – phthaloyl SDS – dodecylsulfát sodný SF – stacionární fáze SIM – selektivní záznam spektra TEMED – N,N,N´,N´-tetramethylendiamin THF – tetrahydrofuran TLC – tenkovrstevná chromatografie Tris – tris(hydroxymethyl)aminomethan UV – ultra fialové (záření) U – napětí V – amplituda Vis – viditelné (záření)
48
7
Použitá literatura
[1] Analýza chirálních sloučenin, VŠCHT Praha 2007, ISBN 978-80-86238-23-4. [2] Chankvetadze B.: Capillary electrophoresis in chiral analysis. John Wiley & sons 1997. [3] Eeckhaut A. V., Michotte Y.: Chiral Separations by capillary electrophoresis. Chromatograpfy science series volume 100. CRC Press Taylor & Francis Group 2010. [4] Ševčík J., Tesařová E., Stránský Z.: Chem. Listy 95 (2001) 139-146. [5] Gübitz G., Schmid M. G.: J. Chromatogr. A 1204 (2008) 140-156. [6] Gübitz G., Schmid M. G.: J. Chromatogr. A 792 (1997) 179-225. [7] Ingelse B. A.: Chiral separations using capillary electrophoresis. Technische Universiteit Eindhoven 1997, ISBN 90-386-0958-2. [8] Desiderio C., Fanali S.: J. Chromatogr. A 807 (1998) 37-56. [9] Armstrong D. W., Nair U. B.: Electrophoresis 18 (1997) 2331-2342. [10] Ward T. J., Farris A. B.: J. Chromatogr. A 906 (2001) 73-89. [11] Ali I., Kumerer K., Aboul-Enein H. Y.: Chromatographia 63 (2006) 295-307. [12] Ward T. J., Oswald T. M.: J. Chromatogr. A 792 (1997) 309-325. [13] Hui F., Caude M.: Analusis 27 (1999) 131-138. [14] Merck Index 12 th Edition, Whitehouse Station, N. J. USA (1996). [15] Armstrong D. W., Rundlett K., Ried III G. L.: Anal. Chem. 66 (1994) 1690-1695. [16] Ward T. J., Dann III Ch., Blaylock A.: J. Chromatogr. A 715 (1995) 337-344. [17] Prokhorova A. F., Shapovalova E. N., Shpigun O. A.: J. of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 53 (2010) 1170-1179. [18] Aboul-Enein H. Y., Ali I.: Chromatographia 32 (2000) 679-691. [19] Nishi H., Nakamura K., Nakai H., Sato T.: Chromatografia 43 (1996) 426. [20] Ward T. J.: Anal. Chem. 74 (2002) 2863-2872. [21] Amini A.: Electrophoresis 22 (2001) 3107-3130. [22] Blanco M., Valverde I.: Trends in Analytical Chemistry 22 (2003) 428-439. [23] Fanali S.: J. Chromatogr. A 735 (1996) 77-121. [24] Armstrong D.W., Rundlett K. L., Chen J. R.: Chirality 6 (1994) 496-509. [25] Gasper M. P., Berthod A., Nair U. B., Armstrong D. W.: Anal. Chem. 68 (1996) 2501-2514. [26] Hui F., Ekborg-Ott K.H., Armstrong D.W.: J. Chromatogr. A 906 (2001) 91-103.
49
[27] Arai T., Nimura N., Kinoshita T.: J. Chromatogr. A, 736 (1996) 303-311. [28] Fanali S., Cartoni C., Aturki Z.: J. Sep. Sci. 24 (2001) 789-794. [29] Gao W., Kang J.: J. Chromatogr. A 1108 (2006) 145-148. [30] Fanali S., Crucianelli M., De Angelis F., Presutti C.: Electrophoresis 23 (2003) 3035-3040. [31] Fanali S., Desiderio C.:J. High Res. Chromatogr. A 736 (1996) 322-326. [32] Desiderio C., Polcaro C. M., Padiglioni P., Fanali S.: J. Chromatogr. A 781 (1997) 503-513. [33] Rundlett K. L., Armstrong D. W.: Anal. Chem. 67 (1995) 2088-2095. [34] Vespalec R., Corstjens H., Billiet H. A. H., Frank J., Luyben K. C. A. M.: Anal. Chem. 67 (1995) 3223-3228. [35] Vespalec R., Billet H. A. H., Frank J., Luyben K. C. A. M.: J. High Res. Chromatogr. 19 (1996) 137-142. [36] Fanali S., Desiderio C., Aturki Z.: J- Chromatogr. A 772 (1997) 185-194. [37] Maier V., Petr J., Knob R., Horakova J., Sevcik J.: Electrophoresis 28 (2007) 1815-1822. [38] Wang Z., Wang J., Hu Z. Kang J.: Electrophoresis 28 (2007) 938-943. [39] Wan H., Blomberg L. G.: Electrophoresis 17 (1996) 1938. [40] Armstrong D. W., Rundlett K.L.: J. Liq. Chromatogr. 18 (1995) 3659. [41] Ward TJ., Dann III C., Brown A. P.: Chirality 8 (1996) 77. [42] Wan H., Blomberg L. G.: J. Microcol. Sep. 8 (1996) 339. [43] Rundlett K. L., Gasper M. P. Zhou F. Y., Armstrong D.W.: Chirality 8 (1996) 88-107. [44] Armstrong D. W., Gasper M. P., Rundlett K. L.: J. Chromatogr. A 689 (1995) 285-304. [45] Wan H., Blomberg L. G.: Electrophoresis 18 (1997) 943. [46] Gross J. H.: Mass Spectrometry. Springer 2004. [47] Hoffmann de E., Stroobant V.: Mass Spectrometry: principles and applications. Third Edition. John Wiley sons 2007. [48] Olivares J.A., Nguyen N.T., Yonker C.R., Smith R.D.: Anal. Chem. 59 (1987) 1230-1232. [49] Smith R.D., Barinaga C.J., Udseth H.R.: Anal. Chem. 60 (1988) 1948-1952. [50] Smith R.D., Olivares J.A., Nguyen N.T., Udseth H.R.: Anal. Chem. 60 (1988) 436-411. [51] ChoudharyG., Apffel A., Jin H., Hancock H.: J. Chromatogr. A 887 (2000) 85-101. [52] Cai J., Henion J.: J. Chromatogr. A 703 (1995) 667-692. [53] Maxwell A. J., Chen D. D. Y.: Analytica Chemica Acta 627 (2008) 25-33.
50
[54] Cole R. B.: Electrospray ionisation Mass Spectrometry, John Wiley sons, New York 1997. [55] Kele Z., Ferenc G., Klement E., Toth G.K., Janaky T.: Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 19 (2005) 881-885. [56] Chang Y.Z., Chen Y.R., Her G.R.: Anal. Chem. 73 (2001) 5083-5087. [57] Bruins A.P: J. Chromatogf. A 794 (1998) 345-357. [58] Downard K.: Mass Spectrometry: A Foundation Course, The Royal Society of Chemistry, Cambridge 2004. [59] Ekman R., Silberring J., Westman-Brinkmalm A.M., Kraj A.: Mass Spectrometry: Instrumentation, interpretation and applications, Wiley sons, New Jersey 2009. [60] Johnstone R.A.W., Rose M.E.: Mass spektrometry for chemists and biochemists, second edition, Cambridge University Press, Ney York 1996. [61] Inoue Y., Shinka T., Ohse M., Kuhara T.: J. Chromatogr. B 823 (2005) 2-6. [62] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB00139 (staženo dne 1.4.2011) [63] Stefan R.I., Nejen R. M.: Sensors and Actuators B 106 (2005) 736-740. [64] Rashed M. S., Aboul-Enein H. Y., AlAmoudi M., Jakob M., Al-Ahaideb L. Y., Abbad A., Shabib S., Al-Jishi E.: Biomed. Chromatogr. 16 (2002) 191-198. [65] Kemper M. J., Conrad S., Müller-Wiefel D. E.: Eur. J. Pediatr. 156 (1997) 509-512. [66] Jellum E., Dollekamp H., Brunsvig A., Gislefoss R.: J. Chromatogr. B 689 (1997) 155-164. [67] García A., Muros M., Barbas C.: J. Chromatogr. B 755 (2001) 287-295. [68] Elgstoen K. B. P., Zhao J. Y., Anacleto J. F., Jellum E.: J. Chromatogr A 914 (2001) 265-275. [69] García A., Olmo B., Lopez-Gonzalvez A., Cornejo L., Rupérez F. J., Barbas C.: J. Pharm. Biomed. Anal. 46 (2008) 356-361. [70] Kim K.-R., Lee J., Ha D., Joen J., Park H.-G., Kim J. H.: J. Chromatogr. A 874 (2000) 91-100. [71] Dietzen D. J., Wilhite T.R., Kenagy D. N., Milliner D. S., Smith C. H., Landt M.: Clin. Chem. 43 (1997) 1315-1320. [72] Tanaka K., Hine D. G., West-Dull A., Lynn T. B.: Clin. Chem. 26 (1980) 1839-1846. [73] Kim K.-R., Lee J., Ha D., Kim J. H.: J. Chromatogr. A 891 (2000) 257-266.
51
[74] Petrushevska-Tozi L., Ristov T., Kavrakovski Z.: J- Chromatogr. A 757 (1997) 324-327. [75] Kamerling J. P., Gerwig G. J., Vliegenthart J. F. G.: J. Chromatogr. 143 (1977) 117-123. [76] Schutzner W., Caponecchi G., Fanali S., Rizzi E., Kenndler E.: Electrophoresis 15 (1994) 769.
52
