UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie

STANOVENÍ VYBRANÝCH ANTIBIOTIK V MEDU KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ

DIPLOMOVÁ PRÁCE

2011

JANA CHMELÍKOVÁ

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie

STANOVENÍ VYBRANÝCH ANTIBIOTIK V MEDU KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Autor práce:

Bc. Jana Chmelíková

Studijní obor:

Analytická chemie

Vedoucí diplomové práce:

RNDr. Vítězslav Maier, Ph.D.

Olomouc 2011

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Vítězslava Maiera, Ph. D., veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou v seznamu použité literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké Fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci.

V Olomouci dne 21. 4. 2011

……………………………..

Děkuji RNDr. Vítězslavu Maierovi, Ph. D. za odborné vedení mé diplomové práce, za obětavou spolupráci, cenné připomínky, poskytnuté rady a za čas, který mi věnoval při konzultacích. Také bych chtěla poděkovat mému partnerovi a rodině za podporu.

Souhrn Diplomová práce se zabývá stanovením tetracyklinu a chloramfenikolu v medu kapilární elektroforézou s hmotnostní spektrometrií. Bylo analyzováno 6 medů, které byly zakoupeny ve velkoobchodních řetězcích. Teoretická část se věnuje fyzikálně-chemickým vlastnostem medu a dalším parametrům, které se sledují v laboratořích při běžné kontrole kvality. Tetracyklinu a chloramfenikolu je věnovaná samostatná kapitola. Antibiotika se v medu přirozeně nevyskytují, ale jsou zde přítomny v důsledku léčby nemocných včelstev. V České republice je podávání antibiotik včelám zakázáno. V práci je uveden přehled metod, které se používají ke stanovení antibiotik v medu. Ke každé metodě je uveden extrakční postup. Správný extrakční postup je důležitý pro úspěšnou analýzu. V kapitole CE-MS je věnována pozornost konstrukci hmotnostního spektrometru, mechanizmu ionizace, principu elektrospreje a kvadrupólu jako hmotnostnímu analyzátoru. V experimentální části jsou hledány ideální podmínky pro elektroforetickou separaci tetracyklinu a chloramfenikolu. Pozornost byla věnována zejména složení a pH pufru, průtoku a složení přídavné kapaliny, tlaku a teplotě dusíku, napětí na kapiláře, nástřiku a extrakčnímu postupu. Ideální podmínky byly aplikovány na reálné vzorky a obsah antibiotik v nich byl vyhodnocen metodou standardního přídavku.

Summary The aim of this diploma thesis is the evaluation of tetracycline and chloramphenicol in honey using capillary electrophoresis with mass spectrometry detection. We analyzed six different samples of honeys bought in supermarkets. The theoretical introduction deals with physical-chemistry properties of honey and other parameters which are measured during general quality control. Tetracycline and chloramphenicol are described in separate chapter. Antibiotics are not naturally abundant in honey, but they are used for treatment of ill colony of bees. Colony of bees treatment using antibiotic is prohibited in the Czech Republic. We summarized analytical methods for evaluation of antibiotics in honey in this work. Extraction procedure for each method is described. Good extraction procedure is essential for exact analysis. Mass spectrometer construction, principles of electrospray ionization method and quadrupole as mass filter are described in CE-MS chapter. The experimental part of this diploma thesis deals with optimization of electrophoretic separation of tetracycline and chloramphenicol. We aimed on composition and pH of buffer, composition and flow rate of sheath liquid, nitrogen pressure and temperature, capillary voltage, injection characteristic and extraction procedure. The amount of antibiotics was evaluated in real samples using optimized method and quantificated by standard addition method.

OBSAH 1

Úvod ................................................................................................................................... 1

2

Teoretická část .................................................................................................................. 2 2.1 MED ............................................................................................................................... 2 2.1.1

Fyzikálně – chemické vlastnosti medu .................................................................... 2

2.1.2

Složení medu ........................................................................................................... 7

3

Tetracyklin ...................................................................................................................... 10

4

Chloramfenikol ............................................................................................................... 11

5

Metody stanovení antibiotik v medu............................................................................. 12

6

Kapilární elektroforéza ve spojení s ionizací elektrosprejem a hmotnostní spektrometrií ................................................................................................................... 20 6.1 KONSTRUKCE HMOTNOSTNÍHO SPEKTROMETRU ............................................................ 20 6.2 IONIZACE ELEKTROSPREJEM .......................................................................................... 20 6.2.1

Mechanizmus ionizace elektrosprejem ................................................................. 21

6.2.2

Instrumentace elektrospreje ................................................................................. 26

6.3 HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTOR .......................................................................................... 27 6.4 DETEKTOR ..................................................................................................................... 29 6.5 SPOJENÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY S HMOTNOSTNÍM SPEKTROMETREM .................... 29 7

Experimentální část ........................................................................................................ 31 7.1 PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ................................................................................................ 31 7.2 CHEMIKÁLIE A VZORKY ................................................................................................. 31

8

Výsledky a diskuze ......................................................................................................... 32 8.1 EXPERIMENTÁLNÍ PODMÍNKY ........................................................................................ 32 8.2 ANALÝZA REÁLNÝCH VZORKŮ ...................................................................................... 41 8.3 STANOVENÍ TETRACYKLINU A CHLORAMFENIKOLU V REÁLNÝCH VZORCÍCH MEDU....... 43 8.4 ZÁVĚR ........................................................................................................................... 47

9

Literatura ........................................................................................................................ 48

10

Seznam zkratek ............................................................................................................... 52

1 Úvod Jedním z nejdůležitějších úkolů moderní analytické chemie je kontrola potravin, jejich nutričních hodnot a sledování reziduí nebezpečných látek. Pro obsah reziduí nebezpečných látek v potravinách byly stanoveny limity, jejichž hodnoty nejsou pro lidský organismus škodlivé. Tyto limity jsou doporučeny Světovou zdravotnickou organizací. Každá země má právo hodnoty upravit nebo používání určitých látek úplně zakázat. Při kontrole potravin je cílem ověření dodržování limitů. Analýza potravin je proto důležité téma, které vyžaduje vývoj nových analytických metod. Tyto metody by měly být rychlé, výkonné, levné, citlivé s vysokou selektivitou a robustní. Pro splnění právních předpisů je důležité, aby analytická metoda dokázala stanovit nižší koncentrace, než jsou dané limity. Hmotnostní spektrometrie je univerzální detekční technika, která poskytuje identifikaci analytu a strukturní informace, Ve spojení s kapilární elektroforézou poskytuje působivý analytický nástroj, který kombinuje rychlost separace a rozlišovací schopnosti CE s vysokou citlivostí a selektivitou MS. Ve srovnání s ostatními metodami je CE-MS málo používanou metodou v oblasti bezpečnosti potravin. Tato práce je zaměřena na analýzu antibiotik v medu. Antibiotika se v přirozeně v medu nevyskytují. Jejich přítomnost znamená, že včelstvo, ze kterého med pochází, bylo léčeno antibiotiky. Antibiotika jsou používána mimo EU k tlumení mikrobiálních onemocnění. Nejčastěji se používají k léčbě včelího moru. Použití antibiotik v chovu včel je schváleno v USA, v zemích jižní Ameriky a některých zemích východní Asie. V EU jsou antibiotika v živočišné výrobě zakázána. Některé země jejich používání upravují vnitřními směrnicemi.

1

2 Teoretická část 2.1 Med Podle vyhlášky č. 334/1997 Sb. je med definován jako: „potravina přírodního sacharidového charakteru, složená převážně z glukózy, fruktózy, organických kyselin, enzymů a pevných částic zachycených při sběru sladkých šťáv květů rostlin (nektar), výměšků hmyzu na povrchu rostlin (medovice), nebo na živých částech rostlin včelami, které sbírají, přetvářejí, kombinují se svými specifickými látkami, uskladňují a nechávají dehydratovat a zrát v plástech“[1]. Med je možné dělit podle [2]: a) původu 1. 2.

květový medovicový

b) způsobu získávání a úpravy 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

vytočený med plástečkový med lisovaný med vykapaný med med s plástečky filtrovaný med pastový med

2.1.1 Fyzikálně – chemické vlastnosti medu Fyzikálně – chemické vlastnosti medu závisí na jeho složení. Některé z nich jsou pak sledovány v kontrolních laboratořích.

a) Hydroxymethylfurfural 5–hydroxymethyl-2-furaldehyd

(HMF)

je

látka,

která

vzniká

zahříváním

jednoduchých cukrů (glukózy nebo fruktózy) v kyselém prostředí při pH menším než 5. Obsah HMF ukazuje, zda nebyl med dlouho a silně zahříván. Čerstvé a v chladu skladované medy mají obsah HMF do 10 mg.kg-1 [3]. Med, který byl ztekucený šetrným ohřátím, může vyhovět normě 40 mg.kg-1, protože při šetrném ohřátí koncentrace HMF nestoupne nad 40 mg.kg-1 podle evropské normy, nebo 30 mg.kg-1, což je kritérium pro kvalitní med podle

2

normy Český med [4]. Med s vysokým obsahem HMF není nijak škodlivý, ale řada biologicky cenných látek, které jsou citlivé na teplo, může být poškozena. Med, který obsahuje velké množství HMF má karamelovou chuť, která se u kvalitního přírodního medu nevyskytuje.

Obr. 1: Struktura 5-hydroxymethyl-2-furaldehydu [5]

O

HOH 2 C

CHO

b) Invertáza Invertáza je enzym důležitý při přeměně nektaru a medovice na med. Štěpí se na glukózu a fruktózu a katalyzuje tvorbu vyšších cukrů. Invertáza se tvoří v hltanových žlázách včel. Při vyjádření aktivity invertázy se nejčastěji používá Gontarského jednotka, která je definovaná jako enzymová aktivita 50 g medu, jehož účinkem se rozštěpí 1g sacharózy za dobu 2 hodin. Invertáza je citlivá na přehřátí medu. Její aktivita klesá i při dlouhodobém skladování. Med musí mít pro konzumní účely aktivitu invertázy vyšší než 10 jednotek Gontarského [4].

c) Diastáza Diastáza je enzym, který štěpí škroby a jednoduché cukry. U kvalitního medu s vysokou aktivitou diastázy se předpokládá vysoký obsah a aktivita ostatních enzymů. Podle evropské normy je hodnota minimální aktivity 8 jednotek Schade [4]. Schade jednotka je definována jako množství enzymu, který přeměnil 0,01 g škrobu na daný cukr za 1 hodinu při 40 °C za podmínek testu. Výsledky vyjadřujeme v Schade jednotkách na 1 g medu [6]. Při měření aktivity diastázy lze podobně, jako při měření HMF, odhalit případné dlouhodobé skladování, nesprávné zahřívání medu či dokonce jeho ošetření v mikrovlnách [7].

3

d) Kyselost Kyselost je pomocné kritérium hodnocení medů. V medu je obsaženo několik desítek různých druhů kyselin. Nejvíc je zastoupena kyselina glukonová. Medy běžně obsahují do 15 mmol kyselin na 1 kg medu. Podle norem je limit 20 mmol.kg-1. Pokud je kyselost vyšší, je to známka kvašení medu. Příčinou kvašení bývá vyšší obsah vody ve vytočeném medu. Zralý hustý med nekvasí. Kyselost medů můžeme vyjádřit hodnotou pH, která se pohybuje od 3,0 do 4,0. Nektarové medy jsou kyselejší a jejich pH je 3,4 a medovicové medy dosahují hodnot až 6,1. Příčinou menší kyselosti těchto medů je vyšší obsah minerálních látek, které mají tlumivé účinky na kyselost [3].

e) Elektrická vodivost Elektrická vodivost nezředěného medu je nízká, proto se měří ve 20% roztoku medu. Vodivost způsobují minerální látky a kyseliny obsažené v medu. Medy květové mají nízkou vodivost, naopak medovicové medy vysokou [4].

f) Obsah vody a hustota medu Hustota medu je závislá na obsahu vody v medu. Rozmezí obsahu vody je 13 - 20 %. Čím menší množství vody je v medu, tím je med kvalitnější. Medy, které jsou nezralé nebo vytočené než včely ukončily konzervaci, mají obsah vody větší než 20 %. Obsah vody se stanovuje refraktometricky (měření lomu světla ve vrstvě medu). Kapka ztekuceného medu se nanese mezi hranoly refraktometru a linka, která tvoří rozhraní světlé a tmavé plochy v hledáčku, se porovnává se stupnicí přístroje Měření je závislé na teplotě. Vzorek medu i refraktometr by měli mít teplotu 20 °C [3]. Obsah vody v kvalitních medech se pohybuje v rozmezí 17 – 18 %. Česká i evropská norma požadují, aby obsah vody byl maximálně 19 % [4].

g) Hygroskopicita Pokud je relativní vlhkost vzduchu vysoká, přijímá med z okolního prostředí vodu. Tento jev se nazývá hygroskopicita. Jestliže není nádoba s medem dobře uzavřená a je skladovaná ve vlhku může med zřídnout a začít kvasit [3]. Proto je důležité med uchovávat v suchém prostředí a dobře uzavřený.

4

h) Viskozita a povrchové napětí Viskozita je závislá na obsahu vody, teplotě a chemickém složení medu. Při teplotě 20 °C je viskozita 10 000 krát větší než viskozita vody (η = 0,001 N.s.m-2) [3]. Med má nízké povrchové napětí. Toho se využívá v kosmetickém průmyslu, protože med lehce a snadno proniká póry pokožky [4].

i) Barva medu Medy mají různé barvy. Jejich barevnost je určena botanickým původem medu. Nejčastější jsou odstíny žluté až hnědé, ale existují i medy, které jsou zbarvené do červenohněda (původ z lesních plodů), oranžova (slunečnice) i do zelena (jedlová medovice). Čistě akátový med je nejsvětlejší s jemným nádechem do žluto-zelena. Běžný řepkový med je velmi světlý, ale po několika dnech krystalizuje do bílé barvy [4]. V medu jsou obsažena rostlinná barviva, jednak barviva, která vznikla chemickými reakcemi při skladování a zpracování medu a také barviva, která byla vnesena do medu činností včely [8]. Barvu medu ovlivňují flavonoidy, anthokyany, karotenoidy, xantofyly a chlorofyly. Pro účely mezinárodní obchodní deklarace barvy medu se používá stupnice podle Pfunda [3]. Ta udává barvu medu v milimetrech a pohybuje se v rozmezí 0 – 114 mm. Na začátku je typ vodojasný (0-8 mm), na konci hnědočerný (více než 114 mm) [9].

j) Krystalizace medu Krystalizace je dána tím, že je med přesycený roztokem cukrů. Z cukrů, které jsou přítomné v medu, je nejméně rozpustná glukóza. Stupeň přesycení je závislý na jejím obsahu. Fruktóza naopak zpomaluje krystalizaci glukózy z přesycených roztoků. Na rychlost krystalizace má vliv přítomnost krystalů, pylových nebo prachových zrn, mechanický šok při odstřeďování nebo tepelný šok při zpracování medu. Samotná krystalizace má dvě fáze: 1. Nukleace – vytvoření zárodečných krystalů (závisí na podmínkách získávání a skladování medu). 2. Vlastní krystalizace – zárodečné krystaly rostou do velikosti, která je viditelná pouhým okem (med ztuhne v celé hmotě) [3].

5

k) Index lomu světla Index lomu světla je závislý u medu na obsahu vody a teplotě. Sleduje se při 20 °C a 40 °C, protože některé medy jsou při pokojové teplotě krystalické [3]. Z hodnoty nD při 40 °C vypočítáme % sušiny podle vzorce: sušina ሺ%ሻ = 78 + 390,7 ∙ ሺnୈ ସ଴ − 1,4768ሻ

(1)

Obsah vody se stanovuje měřením lomu světla při 20 °C refraktometricky. Stupnice jsou kalibrovány buď v indexu lomu, nebo v procentech cukru. Obsah vody se dopočítává do sta [10].

l) Optická otáčivost Medy stáčejí rovinu polarizovaného světla většinou doleva, protože ve většině z nich převažuje fruktóza. Existují medy, které stáčejí rovinu polarizovatelného světla doprava. Patří mezi ně medovicové medy nebo medy z pozdní snůšky vojtěšky nebo jetele. Tyto medy velmi jemně krystalizují a díky tomu je lze odlišit od porušených medů, které krystalizují obtížně [3].

6

2.1.2 Složení medu a) Cukry Cukernou sušinu většiny medů tvoří fruktóza a glukóza. Fruktóza převažuje v téměř všech druzích medů. Projevuje se to tím, že med stáčí rovinu polarizovaného světla doleva. Sacharóza je obsažena v nektaru a medovici a enzymaticky se štěpí. Proto je její obsah v neporušeném medu okolo 1 %. Enzym invertáza, který je obsažený v hltanových žlázách včel, štěpí sacharózu na směs glukózy a fruktózy [11]. Vyšší cukry (oligosacharidy a dextriny) bývají přítomny hlavně v medovicových (10 %), méně v nektarových (2 – 3 %) medech. Nejčastěji přítomným oligosacharidem je maltóza. Melecitóza je častým trisacharidem, který je přítomný v medu a způsobuje krystalizaci medu v plástech během několika dnů. Není pro včely stravitelná a její přítomnost v zimních zásobách může způsobit oslabení a následný úhyn včelstva [12].

b) Kyseliny Mezi základní kyseliny, které jsou obsaženy v medu, patří kyselina glukonová. Tato kyselina vzniká z glukózy enzymatickou oxidací. V medu je obsažená ve formě laktonu, který po zředění vodou přechází na kyselinu glukonovou. Další významné kyseliny obsažené v medu jsou kyselina citrónová, jablečná a jantarová. V menším množství kyseliny octová, mravenčí, máselná, mléčná, šťavelová, glykolová, α-ketoglutarová. Znakem pravosti medu je bohaté spektrum organických kyselin [3].

c) Aminokyseliny Na chuťových vlastnostech medu se výrazným způsobem podílejí aminokyseliny. Podle obsahu aminokyselin můžeme určit geografický původ medů. Nejvíce zastoupenou aminokyselinou je prolin. Vyskytuje se v koncentracích 200 – 500 mg.kg-1 [3]. Skladováním medu při vyšší teplotě se obsah prolinu snižuje.

d) Bílkoviny a peptidy Asi polovina dusíkatých látek obsažených v medu jsou nízkomolekulární látky, peptidy. Ostatní mají vysokomolekulární charakter, vykazují biochemickou aktivitu a patří mezi enzymy urychlující různé metabolické reakce. Významným enzymem v medu je invertáza. Štěpí sacharózu na glukózu a fruktózu. Jestliže sacharózu obsaženou v nektaru rozpustíme ve vodě, zvýšíme tím rozpustnost cukrů a celkovou stabilitu vznikajícího medu. Další funkcí 7

invertázy je vytváření složitých cukrů z jednoduchých. Spotřebovává k tomu glukózu a tím snižuje náchylnost medu ke krystalizaci. Aktivita invertázy svědčí o kvalitě medu. Teplem a skladováním se její aktivita snižuje. Med obsahuje kromě invertázy také diastázu, která je souborem enzymů štěpících škrob. Glukooxidáza vytváří z glukózy kyselinu glukonovou a peroxid vodíku. Tento enzym pochází z hltanových žláz včel a výrazně se podílí na tvorbě kyselosti medu. Med obsahuje katalázu, která štěpí peroxid vodíku na kyslík a vodu. Dále jsou zde obsaženy kyselá fosfatáza a další enzymy [3].

e) Minerální látky V medech jsou minerální látky obsaženy až do koncentrace 1 %. Z makrobiogenních prvků jsou zde obsaženy draslík, sodík, vápník, hořčík, síra a fosfor. Ze stopových prvků jsou zastoupeny železo, zinek, měď a mangan [13]. České medy obsahují větší množství niklu, ale obsah olova je hluboko pod hranicí hygienických limitů. Obsah minerálních látek a kyselost medu souvisí s barvou medu. Např.: Medovicové medy mají tmavší barvu mimo jiné proto, že obsahují větší množství železa, manganu [3].

f) Látky hormonálního charakteru Přirozeným přenašečem vzruchů v periferním nervovém systému je acetylcholin. V medu se jeho obsah pohybuje v koncentracích až 45 mg.kg-1. Je zde také obsaženo 20 µg volného a 20 – 60 µg vázaného adrenalinu na 1 kg medu. Med obsahuje také mnoho jiných látek hormonálního charakteru např.: noradrenalin, dopamin, látky z mateří kašičky [14].

g) Barviva V medu převažují rostlinná barviva. Je zde obsaženo 11 – 13 různých barviv, která patří mezi anthokyany a flavonoidy (např.: kvercetin a rutin) [15]. Barviva z medných a pylových zásob přecházejí do vosku a odtud do medu. To způsobuje, že je v medu obsaženo více druhů rostlinných barviv, než odpovídá jeho botanickému původu. Jinou skupinu barviv tvoří barviva, která mají původ ve zbytcích košilek po včelím plodu. Melanoidní barviva vznikají z tyrosinu. Aromatické aminokyseliny reagují s cukry, nejčastěji s fruktózou, a vznikají hnědá barviva se specifickým aroma, které bývá často velmi výrazné [3].

8

h) Vitamíny Většina vitamínů pochází z pylu, menší množství z nektaru nebo medovice. Jsou zde obsaženy hlavně tiamin, riboflavin, kyselina pantotenová, vitamíny A, B, C, D, H, K, E a niacin [16]. Z výživového hlediska jde pouze o doplňkový zdroj vitamínů.

i) Tukové látky Med obsahuje 0,015 % různých lipidů např.: estery cholesterolu, triglyceridy a volný cholesterol [17]. A z mastných kyselin, které tvoří estery, se zde vyskytují kyselina kaprylová, laurová, palmitoleová, palmitová, stearová, oleová, arachidonová a linoleová [3].

j) Mikroorganizmy Mikroorganismy nejsou schopné v medu růstu. Výjimku tvoří kvasinky, bakterie a mikroorganismy, které jsou běžné v okolním prostředí. Patogenní druhy pro člověka nebyly v medu prokázány. Medy, které pocházejí ze včelstev nakažených morem včelího plodu, obsahují spory původce moru Bacillus larvae. Pro člověka tento med není škodlivý, ale mohl by být zdrojem nákazy pro další včelstva [3]. V ČR se ohniska moru likvidují, a proto nález moru ukazuje na zahraniční původ medu. A není jisté, jestli med neobsahuje residua antibiotik, která se v některých zemích používají k léčbě tohoto onemocnění [18].

Pro kontrolu kvality se používá soubor několika laboratorních zkoušek, které určují chemické složení medu a jeho fyzikální vlastnosti. Při laboratorních rozborech se sledují tyto parametry: hydroxymethylfurfural (HMF), invertáza, diastáza, kyselost, elektrická vodivost, obsah vody a hustota medu, hygroskopicita, viskozita a povrchové napětí, barva medu a krystalizace, index lomu světla, optická otáčivost [3, 4].

9

3 Tetracyklin Tetracykliny jsou širokospektrální antibiotika, která působí proti grampozitivním i gramnegativním bakteriím, spirochetám (bakterie charakteristického spirálovitého tvaru), chlamydiím (kulovité nepohyblivé gramnegativní bakterie) a rickettsiím (malé gramnegativní bakterie). Tetracykliny vykazují řadu vedlejších nežádoucích účinků. K nejzávažnějším patří deformace kostí a zubů. Proto je nevhodné jejich dlouhodobé podávání dětem mladším 6 - ti let a těhotným ženám [19]. Tetracykliny jsou metabolickými produkty hub rodu Streptomyces [20].

Tabulka 1: Fyzikálně – chemické vlastnosti tetracyklinu [21 - 24] Synonymum

4-(dimethylamino)-3,6,10,12,12a-pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-2-naftacenkarboxamid

Sumární vzorec

C22H24N2O8 H3C

Strukturní vzorec

N

OH

H3C

CH3

OH

NH2 OH OH

O

OH

O

O

Molární hmotnost

444,4 g.mol-1

pKa

3,3; 7,7; 9,7

CAS

60-54-8

vzhled

Žlutý, krystalický, amfoterní prášek, který ztmavne na vlhkém vzduchu a při vystavení silnému slunečnímu záření.

rozpustnost

Těžce rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v ethanolu a methanolu, prakticky nerozpustný v chloroformu a etheru, mírně rozpustný v acetonu, rozpouští se ve zředěných alkalických roztocích.

biologický poločas

8 – 8,5 hodin 10

4 Chloramfenikol Chloramfenikol

je

získáván

synteticky.

Má široké

spektrum

účinku.

Působí

bakteriostaticky až bakteriocidně na grampozitivní a gramnegativní bakterie. Je vysoce účinný na streptokoky, stafylokoky a střevní bakterie (E. coli, salmonely) [25]. Nevýhodou chloramfenikolu je jeho rizikovost z pohledu zdravotně – hygienických požadavků, proto je přísně kontraindikován pro zvířata, která produkují živočišné suroviny [26]. Tyto produkty nejsou poživatelné člověkem, 3 – 5 dnů (mléko), 9 dnů (maso, aplikace v pitné vodě) a 12 dnů (vejce) po ukončené aplikaci. Chloramfenikol zaujímá významné místo ve veterinární farmakoterapii. Aplikuje se parentálně, perorálně v pitné vodě, lokálně v pěně a ve spreji [26].

Tabulka 2: Fyzikálně – chemické vlastnosti chloramfenikolu [ 22, 23, 27,] Synonymum

2,2-dichloro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-(4nitrofenyl)ethyl]acetamid

Sumární vzorec

C11H12Cl2N2O5

Strukturní vzorec

Cl

OH NH

Cl O OH

O2N

Molární hmotnost

323,1 g.mol-1

pKa

5,5

CAS

56-75-7

vzhled

bílé až bílo-šedé nebo žluto-bílé krystaly

rozpustnost

Těžce

rozpustný

ve

vodě,

snadno

rozpustný

v ethanolu

a

propylenglykolu, velmi rozpustný v acetonu a ethylacetátu, mírně rozpustný v chloroformu a etheru. biologický poločas

2,5 - 3 hodiny

11

5 Metody stanovení antibiotik v medu Antibiotika se v medu přirozeně nevyskytují. Jestliže se včely léčí antibiotiky, pak část antibiotik přechází do medu. Stanovení skupiny tetracyklinových antibiotik v medu je velmi častou záležitostí. Nejčastěji se k tomu využívá kapalinové chromatografie s různými druhy detekce. Mezi nejvíce používané typy detektorů patří hmotnostní spektrometrie [28, 33, 35, 36, 37, 43, 44] a UV detekce [31, 34, 38, 41]. Ke stanovení chloramfenikolu v medu se stále častěji využívají biosenzory, jako jednoduchý a rychlý způsob detekce [56]. Nejvíce používanou technikou ke stanovení je kapalinová

chromatografie

nejčastěji

ve

spojení

s hmotnostním

spektrometrem

jako detektorem [45, 46]. Ke stanovení chloramfenikolu lze použít i plynové chromatografie, ale před vlastní separací je nutno analyt derivatizovat[55]. Kapilární elektroforéza je méně často užívanou metodou ke stanovení antibiotik v medu [72]. V tabulce 3 jsou uvedeny jednotlivé metody stanovení tetracyklinových antibiotik a chloramfenikolu v různých matricích. Uvedené postupy úpravy vzorku jsou aplikace na med jako matrici.

12

Tabulka 3: Metody stanovení antibiotik analyt med

med

antibiotika chlortetracyklin, demeclocyklin, doxycyklin, methacyklin, minocyklin, oxytetracyklin, tetracyklin, rolitetracyklin oxytetracyklin, tetracyklin, chlortetracyklin

med

oxytetracyklin, tetracyklin, methacyklin

med

oxytetracyklin, tetracyklin, chlortetracyklin

úprava vzorku vzorek rozpuštěn v 0,1 M Na2EDTA (pH 4,0) SPE extrakce (C18) – methanol, voda, 0,1 M Na2EDTA, ethyl acetát (eluce antibiotik), eluát odpařen do sucha za sníženého tlaku, t = 40 °C

metoda HPLC–UV–ESI– TOF-MS

separační podmínky kolona: C18, gradient (průtok 2 ml.min−1, z 5 % na 32 % (B) za 10 min), MF: 0,02 M kyselina šťavelová:0,01 M TEA (pH 2) (A), ACN (B)

cit. [28]

vzorek rozpuštěn v Na2EDTA MacIlvainovém pufru (pH 4), SPE - extrakce McIlvainovým pufrem (pH 4,0) obsahujícím 0,01 mol.l-1 Na2EDTA, methanol, voda, McIlvainův pufr (eluce antibiotik) Vzorek rozpuštěn v kyselině citronové (pH 4,5 – upraveno kyselinou citronovou nebo NaOH), přidán 0,1 M fosfátový pufr (pH 4,5), přečištění přes chromatografickou kolonu XAD-2, eluce 60% MeOH vzorek rozpuštěn v pufru kyseliny citronové a Na2EDTA, SPE (PLS-2) – voda, methanol (eluce antibiotik), odpaření pod dusíkem

HPLC – fluorescenční detekce

kolony: Hydrosphere C18 HS-301-3, Mightysil RP-18, (průtok 0,8 ml.min-1 při 40 °C) MF: imidazolový pufr (1 mol.l−1, pH 7,2):methanol (82:18, v/v)

[29]

HPLC chemiluminiscenční detekce

kolona: XDB-C18, isokratická eluce (průtok 0,5 ml.min-1, 16 % (A) za 11 min.) MF: acetonitrile (A):0,001 M kyselina fosforečná (B)

[30]

HPLC-UV-VIS

kolona: Tsk-gel ODS-80Ts MF: methanol: imidazolový pufr (1:3, v/v)

[31]

13

analyt med

zvířecí tkáně, med, mléko vejce, ryby Med

Med

antibiotika oxytetracyklin, tetracyklin, chlortetracyklin

úprava vzorku vzorek rozpuštěn v 0,1 M Na2EDTAMcIlvainovém pufru (pH 4,0), SPE (C18) - Na2EDTA-McIlvainův pufr (pH 4.0):methanol (85:15, v/v), voda, acetonitril (promývací krok), ethylacetát:methanol (75:25, v/v) – eluce antibiotik. Odpaření pod dusíkem ve vodní lázni při 30 – 35 °C, rozpuštění v methanol:voda (15:85 v/v) oxytetracyklin, vzorek smíchán s 0,1 M Na2EDTAtetracyklin, McIlvainovým pufrem (pH 4,0), chlortetracyklin, centrifugován, supernatant podroben doxycyklin SPE (Bond Elut ENV) – voda, methanol (eluce antibiotik), odpaření do sucha, rozpuštění v 1 ml voda:methanol (50:50, v/v) tetracyklin, vzorek rozpuštěn v 0,1 M Na2EDTAoxytetracyklin, McIlvainovém pufru (pH 4.0), chlortetracyklin, automatická SPE methacyklin, doxycyklin oxytetracyklin 5% HCl, kyselina extrakce tetracyklin, octová:methanol (1:9, v/v), chlortetracyklin, Molekulární vtištěný polymer SPE doxycyklin

metoda HPLCfluorescenční detekce

separační podmínky kolona: Zorbax Eclipse XDB-C8s, gradient (průtok 1,0 ml.min-1, z 30 % na 50 % (B) za 13 min.) MF: (A) 0,075 mol.l-1 dihydrát octanu sodného, 0,035 mol.l-1, dihydrát chloridu vápenatého a 0,025 mol.l-1 Na2EDTA (pH 6,5). (B) methanol:voda (95:5 v/v)

cit. [32]

HPLC-APCI-MSMS

kolona: Backerbond C8 (průtok 1,0 ml.min-1) MF: methanol:acetonitril:5 mM kyselina šťavelová (18:27:55, v/v/v)

[33]

HPLC-UV

kolona: C18, gradient (průtok 1 ml.min-1, z 5 na 24 % ACN za 4 min., poté na 40 % za 2 min.) MF: 0,8 % kyselina mravenčí, acetonitril

[34]

HPLC-MS-MS

kolona: Restek C18, (průtok 0,25 ml.min−1) MF: methanol:acetonitril:100 mmol.l−1 kyselina šťavelová (1:2:7, v/v/v).

[35]

14

analyt Med

antibiotika tetracyklin, oxytetracyklin, doxycyklin, chlortetracyklin

úprava vzorku v 50 mM vzorek rozpuštěn šťevelovém pufru (pH 4,0), centrifugován, supernatant podroben SPE (Oasis HLB) - voda, methanol (eluce antibiotik), odpaření pod dusíkem

metoda LC-MS-MS

separační podmínky kolona: Atlantis dC18, lineární gradient (0-5 min. 15 % (B), 5–10 min 40 % (B); 10–11 min 90 % (B); 11–12 min 90 % (B); 12–13 min 15 % (B) a 13–23 min 15 % (B), průtok 300 µl.min−1) MF: (A) voda s obsahem 1% kyseliny mravenčí, (B) methanol:acetonitril (50:50, v/v) s obsahem 1% kyseliny mravenčí kolona: Synergi Fusion-RP, lineární gradient ( 0–3 min na 9,5 % (A), 14,5 % (B), 76 % (C); 3–10 min z předchozí na 18 % (A), 30 % (B), 52 % (C), průtok 0,8 ml. min−1), MF: methanol (A), acetonitril (B), 5 mM kyselina šťavelová (C),

cit. [36]

Med

oxytetracyklin, tetracyklin, chlortetracyklin, doxycyklin

HPLC- resonance Rayleigh scattering detekce (RRS)

Med

oxytetracyklin

Med

oxytetracyklin, tetracyklin, chlortetracyklin, doxycyklin

vzorek rozpuštěn v 0,1 M octanu sodném (pH 4,5), SPE (Strata-X) – voda, octan sodný, octan ethylnatý, o dpaření do sucha za sníženého tlaku při teplotě 40 °C, rozpuštěn v rozpouštědle methanol:0,01 M kyselina chlorovodí ková (20:80; v/v) vzorek rozpuštěn v 0,1 M Na2EDTAMcIlvainovém pufru (pH 4,0), SPE (Waters Oasis™ HLB 3cc) – methanol, voda, ethylacetát, odpaření pod dusíkem při 40 °C, následné rozpuštění v MF vzorek rozpuštěn v 0,1 M Na2EDTAMcIlvainovém pufru (pH 4,0), SPE (C18) – voda, methanol

HPLC-UV

kolona: Luna 5 µm phenyl-hexyl, (průtok 1,0 ml.min−1) MF: methanol:acetonitril:0,01 M vodný roztok kyseliny šťavelové (2:3:16, v/v/v)

[38]

FAB-HPLC-MS

kolona: Inertsil Ph, průtok (0,1 ml.min−1) MF: acetonitril:methanol:0,005 M trifluoroctová kyselina (2:2:11, v/v/v)

[39]

15

[37]

analyt Med

antibiotika oxytetracyklin, tetracyklin

Med

tetracyklin, oxytetracyklin, chlortetracyklin, doxycyklin, minocyklin, methacyklin

Med

tetracyklin, oxytetracyklin, minocyklin, chlortetracyklin, methacyklin, doxycyklin

úprava vzorku vzorek rozpuštěn Na2EDTAMcIlvainovém pufru (pH 4,0), SPE (Waters Oasis HLB) – voda, methanol (eluce antibiotik), SPE (Varian Bond Elut LRC-PRS) – ethylacetát, voda, methanol, 1 M kyselina šťavelová:acetonitril (80:20) – eluce antibiotik vzorek rozpuštěn v Na2EDTAMcIlvainovém pufru (pH 4,0), SPE(Discovery DSC-phenyl) – acetonitril, kyselina šťavelová (pH 3,0), Na2EDTA, 10% methanol v ethylacetátu (eluce antibiotik), eluát zakoncentrován ve vakuu (240 bar, 40 °C), následné rozpuštění v roztoku kyseliny šťavelové vzorek rozpuštěn v 5% HClO4, centrifugován, SPE Shimadzu VPODS (impritovaná monolitická kolona) – methanol:acetonitril (20:80, v/v), acetonitril:kyselina octová (95:5, v/v) – eluce antibiotik, odpařen pod dusíkem

metoda HPLCfluorescenční detekce

HPLC-UV

HPLC-DAD

16

separační podmínky kolona: Nucleosil C18, (průtok 0,8 ml.min−1) MF: acetonitril:10 mM šťavelan (20:80, pH 2,0) derivatizace: hořečnatými ionty podle Haagsma aSherpenisse (reakce s octanem hořečnatým v borátovém pufru o pH 9,0 vysoce fluorescenční komplex – separace na RP C18 koloně) kolona: Discovery RP-Amide C16, (průtok 1 ml.min−1) MF: 10 mM kyselina šťavelová (pH 3): acetonitril (88:12,v/v) za 9 min

cit. [40]

kolona: C18, gradient, průtok (2,0 ml.min−1) MF: acetonitril:0,01 mol.l−1 NaH2PO4 (pH 3,0) - (9:91, v/v) 0-10 min, acetonitril:NaH2PO4 (12:88, v/v) 10-18 min, acetonitril:NaH2PO4 (18:82, v/v) 18-40 min

[42]

[41]

analyt Med

antibiotika tetracyklin, oxytetracyklin, chlortetracyklin, doxycyklin

Med

oxytetracyklin, tetracyklin, chlortetracyklin, doxycyklin

Med

chloramfenikol

úprava vzorku metoda vzorek rozpuštěn v Na2EDTA (pH UPLC-MS-MS 4,0), SPE (OASIS HLB) – methanol, acetonitril, voda, (eluce antibiotik – methanol, acetonitril a 0,04 % NH4OH rozpuštěný v methanolu), extrakt odpařen pod dusíkem, znovu rozpuštěn v roztoku methanol:0,05% vodný roztok kyseliny mravenčí (50:50, v/v). vzorek rozpuštěn v jantarovém pufru, HPLC-UV-MS-MS antibiotika odstraněny chelatací s kovovými ionty (Chelating Sepharose Fast Flow kolona), eluovány Na2EDTA-Mcllvainovým pufrem (pH 4,0), SPE (Oasis HLB) – voda, methanol (eluce TCs), odpařen pod dusíkem za teploty nepřesahující 40 °C, znovu rozpuštěn v rozpouštědle methanol:voda (30:70, v/v) vzorek rozpuštěn v 0,01 M uhličitanu HPLC-ESI-MS-MS amonném (pH 9,0), SPE - voda, uhličitan amonný, methanol (eluce chloramfenikolu), odpaření pod dusíkem, znovu rozpuštěn v acetonitril:voda (1:1), 17

separační podmínky kolona: UPLC BEH C18, gradient (20 % (A) za 0,5 min a lineárně zvýšen na 100 % za 5 min.) MF: methanol (A) a 0,05 % vodný roztok kyseliny mravenčí (B)

cit. [43]

UV: kolona: COSMOSIL 5C18-MS-II, průtok (0,7 ml.min−1) MF: 0,01 mol.l 1 kyselina šťavelová:methanol:acetonitril (63:27:10, v/v/v). MS: kolona: SunFire TM C8, gradient (0-6,0 min 90 % (A), 10 % (B); 6,0-8,0 min 10 % (A), 90 % (B); 8,1-10,0 min 90 % (A), 10 % (B), průtok 250 µl.min−1) MF: (A) 1 % roztok kyseliny mravenčí ve vodě, (B) methanol Kolona: Superspher RP-18, průtok . −1 (0,3 ml min ) MF: acetonitril:10 mM mravenčan amonný (pH 3,0) (40:60)

[44]

[45]

analyt Med

antibiotika chloramfenikol

Med

chloramfenikol

voda, mléko, med

chloramfenikol

med, mléko, vejce

chloramfenikol

Med

chloramfenikol, thiamfenikol

úprava vzorku metoda vzorek rozpuštěn ve vodě, míchán na HPLC-ESI-MS-MS třepačce, extrahován směsí dichlormethan:aceton (1:1, v/v), centrifugace, supernatant odpařen pod dusíkem(50 ◦C), znovu rozpuštěn ve fosfátovém pufru (pH7,8), SPE C18 – methanol, voda, ether, diethylether (eluce chloramfenikolu), odpaření pod dusíkem, znovu rozpuštění v MF disperzivní L-L mikroextrakce LC-VWD

vzorek rozpuštěn ve vodě, přidán 1- HPLC-UV butyl-3-methylimidazol tetrafluoroborát, a organická sůl (Na3C6H5O7), centrifugace, odebrán supernatant, 20mM fosfátovém roztoku (pH 4,0), HPLC-ESI-MS centrifugace, odebrán supernatant a použita polymer monolitická mikroextrakční technika disperzivní L-L mikroextrakce HPLC-VWD

18

separační podmínky Kolona: LUNA ODS(2) C18, průtok (0,2 ml.min−1) MF: methanol:5mM acetát amonný (60:40, v/v)

cit. [46]

Kolona: Varian Pursuit-C18, průtok . −1 (1,0 ml min ) MF: methanol:voda (55:45, v/v) kolona: An Eclipse XDB-C18, průtok (1,0 ml.min-1) MF: voda:methanol (55:45)

[47]

kolona: XTerra MS C18 column, průtok (0,2 ml.min-1) MF:(A) methanol:voda (10:90, v/v), (B) 100% methanol kolona: Varian Pursuit-C18 column, průtok (1,0 ml.min-1) MF: methanol:voda (55:45, v/v)

[48]

[49]

[50]

analyt med, tkáně

antibiotika chloramfenikol

úprava vzorku metoda vzorek rozpuštěn v acetátu sodném HPLC-ESI-MS-MS (pH 5,2), centrifugován, SPE(Extrelut) - dichlormethan (eluce chloramfenikolu), odpařen pod dusíkem, znovu rozpuštěn v MF

vejce, med, mléko

chloramfenikol

vzorek rozpuštěn ve vodě, SPE – HPLC-ESI-MS-MS methanol, aceton, dichlormethan, odpařen pod dusíkem, znovu rozpuštěn v MF.

Med

chloramfenikol

Med

chloramfenikol

Med

chloramfenikol

vzorek rozpuštěn v methanolu, přidán HPLC-MS-MS ethylacetát a voda, centrifugace, odebrána organická fáze, odpaření v rotační odparce, znovu rozpuštění v methanolu a naředění fosfátovým pufrem (pH 8,2). vzorek rozpuštěn ve vodě a HPLC-ESI-MS-MS acetonitrilu, centrifugace, supernatant odpařen do sucha a znovu rozpuštěn v acetonitrilu, centrifugace, supernatant k analýze. vzorek rozpuštěn ve vodě, SPE GC-MS (OASIS HLB) methanol, voda, acetonitril, odpaření pod dusíkem a následná derivatizace 19

separační podmínky kolona: sub-2µm particulate HPLC, průtok (0,45 ml.min-1), gradient: 0 min: 0 % B; 2,3 min: 20 % B; 2,5 – 3,2 min: 100 % B; 3,21 - 4,2 min 0 % B MF: (A) 1ml amonného roztoku (25%) v 1l 10% acetonitrilu. (B) 1ml amonného roztoku (25%) v 1l 100% acetonitrilu kolona: fused-core C18 column, průtok (0,4 ml.min-1), gradient 10 % B (t=0 min) lineárně na 70 % (t=3 min) MF: (A) 0,1% kyselina mravenčí, (B) acetonitril. kolona: Nucleosil 100-5 C18 HD, průtok (0,3 ml.min-1), gradient (B) z 0 na 70 % v 8 minutách MF: (A) voda:MeCN (50:50, v/v), (B) acetonitril.

cit. [51]

kolona: RP-18 monolithic, průtok (1 ml.min-1) MF: methanol:acetát amonný (45:55, v/v).

[54]

kolona: křemenná kapilára s fenyl . polysiloxanovou fází, průtok 1,0 ml min-1, Nosný plyn: Helium,

[55]

[52]

[53]

6 Kapilární elektroforéza ve spojení s ionizací elektrosprejem a hmotnostní spektrometrií 6.1 Konstrukce hmotnostního spektrometru Hmotnostní spektrometrie je analytická metoda, která slouží k převedení molekul na ionty. Vzniklé ionty separuje podle hodnoty podílu jejich hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů. Tato metoda je mimořádně citlivá, destruktivní a spotřeba látky k analýze je malá [57]. MS detektor separuje ionty podle jejich poměru m/z. Aby vzniklo hmotnostní spektrum, musí proběhnout tři procesy: tvorba, separace a detekce iontů [58]. Hmotnostní spektrometr má tři základní části (obr. 2): a) Iontový zdroj, který slouží k převedení molekul analytu na nabité částice. Konstrukce se liší podle použité ionizační techniky. b) Hmotnostní analyzátor, který slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle m/z. c) Detektor, který slouží k detekci iontů po separaci podle m/z a k určení relativní intenzity jednotlivých iontů.

Obr. 2: Obecné schéma konstrukce hmotnostního spektrometru

6.2 Ionizace elektrosprejem Ionizace elektrosprejem (ESI) je jednou z nejvýznamnějších ionizačních technik, které se

dnes

v

hmotnostní

spektrometrii

používají.

Ionizace

elektrosprejem

probíhá

za atmosférického tlaku a jde o techniku vhodnou k analýze převážně polárních a iontových látek [59]. ESI je řazena mezi měkké ionizační techniky, což znamená, že ionizovaná

20

molekula získá mnohem menší množství energie než u tvrdých ionizačních technik, a proto ve spektrech pozorujeme protonované (při záznamu kladných iontů) nebo deprotonované (při záznamu záporných iontů) molekuly a minimum fragmentovaných iontů. Tato technika převádí ionty z roztoku do plynné fáze a umožňuje získat ionty (př. [M+H]+, [M-H]-) i u látek s vysokou molekulovou hmotností. Vzniklé ionty jsou dále podrobeny separaci podle poměru m/z v hmotnostním analyzátoru. Elektrosprej byl znám dávno před svou aplikací v hmotnostní spektrometrii jako technika pro disperzi kapalin a tvorbu aerosolů. Poprvé byl popsán v roce 1917 [60]. Dole v roce 1968 použil ESI jako iontový zdroj v hmotnostní spektrometrii [61]. V osmdesátých letech práce Yamashita a Fenna přispěly k rozšíření ESI [62]. ESI a ionizace za atmosférického tlaku (APCI) jsou dnes nejpoužívanější ionizační techniky a jejich spojení s MS se používá v biologických a biomedicínských oblastech např. v oblasti analýzy peptidů a proteinů [63]. Nobelovou cenou za chemii byli v roce 2002 oceněni tři vědci, kteří přispěli k vývoji metod pro analýzu biomolekul [64].

6.2.1 Mechanizmus ionizace elektrosprejem V elektrospreji probíhají 4 základní procesy: a) vznik nabitých kapek na konci sprejovací kapiláry, b) zmenšování nabitých kapek v důsledku odpařování rozpouštědla a jejich opakovaného rozpadu, c) uvolnění iontů do plynné fáze z malých vysoce nabitých kapek, d) sekundární děje, kterých se účastní ionty v plynné fázi.

Na obr. 3 je zobrazen vznik iontů v elektrospreji. Vložíme – li na sprejovací kapiláru např.: kladné napětí, dochází k migraci kationtů v roztoku směrem k menisku kapaliny a aniontů ke sprejovací kapiláře, která představuje kladnou elektrodu.

21

Obr. 3: Schematický princip elektrospreje [65]

Odpuzování kladných iontů v povrchové vrstvě kapaliny působí proti povrchovému napětí a povrch kapaliny se začne rozpínat. Při určitém napětí (jednotky kV, konkrétní hodnota závisí na podmínkách analýzy a na konstrukci iontového zdroje), které vložíme na sprejovací kapiláru, se vytváří tzv. Taylorův kužel (obr. 4).

Obr. 4: Taylorův kužel na sprejovací špičce [65]

22

Z kuželu tryská proud kapaliny, který se rozpadá na malé, v tomto případě kladně nabité kapičky. V tuto chvíli probíhá rozprašování nebo-li zmlžování elektrosprejem [59]. Tok kationtů v elektrickém poli musí být v rovnováze s tokem elektronů. Proces, který probíhá v elektrospreji, musí zahrnovat elektrochemickou konverzi iontů na elektrony. Ke vzniku elektrospreje je potřeba určité napětí na sprejovací kapiláře Von. Jeho minimální hodnotu můžeme odhadnout pomocí vztahu: ସୢ

V୭୬ = 2 × 10ହ ሺσrୡ ሻଵ/ଶ ln ቀ ቁ ୰ౙ

(2)

kde: σ – povrchové napětí, rc – vnitřní průměr sprejovací kapiláry, d – vzdálenost kapiláry od protielektrody.

Stabilního spreje se dosahuje až při napětí, které je o několik set voltů vyšší (2 – 4,5 kV). Elektrický proud mezi protielektrodou a sprejovací kapilárou se pohybuje v intervalu 0,1 - 1 µA. Stabilita rozprašování se ovlivňuje vloženým napětím, složením rozprašované kapaliny, vnitřním a vnějším průměrem a tvarem sprejovací kapiláry. Dalším nárůstem napětí dojde ke změně Taylorova kužele na sprej (tzv. axiální sprej), u kterého jsou nabité kapky emitovány z řady bodů po obvodu sprejovací kapiláry [59]. Při dalším zvýšení napětí dochází k elektrickému výboji (obr. 5).

23

Obr. 5: Vznik nabitých kapek na konci sprejovací kapiláry (použito z přenášek hmotnostní spektrometrie a upraveno)

kde: Von – napětí potřebné ke vzniku elektrospreje , Vrim – napětí, při kterém vzniká více kuželů po celém objemu, Vdis – napětí, při kterém vzniká výboj. Elektrický výboj ovlivňuje elektrické pole v okolí sprejovací kapiláry a to vede k narušení tvorby nabitých kapek. Napětí, které potřebujeme ke sprejování je podobné pro pozitivní i negativní mód. V negativní módu je napětí, při kterém se objevuje výboj, nižší. K potlačení výboje se používají plyny schopné zachycovat elektrony (např. O2, SF6), nebo halogenovaná rozpouštědla [59]. Nabité kapky, které vzniknou v elektrospreji, se pohybují v elektrickém poli. Můžeme měřit elektrický proud, který je závislý na průtoku sprejovací kapaliny, její vodivosti a koncentraci iontů v roztoku. Závislost proudu na průtoku má lineární charakter, ale při vyšších průtocích dochází k poklesu proudu a tudíž ohybu této závislosti. S rostoucí vodivostí roztoku roste i proud v elektrospreji. Při větším průtoku předpokládáme formování větších kapek, což vede k nižšímu výtěžku iontů. Vyšší vodivost roztoku pomáhá k tvorbě malých kapiček a tedy vyššímu výtěžku iontů. Nabité kapky, které vznikly v první fázi 24

elektrosprejového děje, podléhají přeměnám v důsledku odpařování rozpouštědel, což má za následek zmenšování poloměru kapek. Počet nábojů se ale nemění a roste povrchová hustota náboje [59]. Kapky se přibližují k tzv. Rayleighově mezi stability, při které jsou odpudivé síly v rovnováze se silami, které udržijí kapku pohromadě. Rayleighův limit určuje vztah : q = 8πሺε଴ γr ଷ ሻଵ/ଶ

(3)

kde: q – náboj kapky, ε0 – relativní permitivita rozpouštědla, ߛ - povrchové napětí rozpouštědla, r – poloměr kapky.

K rozpadu kapky dochází v blízkosti Rayleighova limitu, ale ještě před jeho dosažením. Toto štěpení označujeme jako coulombickou explozi. Kapka se nerozpadne na stejně velké části, ale dochází k ději, při kterém je kapka rozprášena na řadu výrazně menších kapiček. Z těchto malých vysoce nabitých kapek mohou v dalším kroku přecházet ionty do plynné fáze. Jsou navrhnuty dva mechanizmy : a) „charged residue model“ – vznik malých kapek obsahujících pouze jeden ion, b) „ion evaporation“ – po zmenšení kapky na určitou velikost dochází k přímé emisi iontů a to převáží coulombovské štěpení kapek. Podle provedených experimentů je těžké rozhodnout, který z těchno mechanizmů je správný. Předpokládá se, že první převažuje u velkých molekul a druhý naopak u molekul malých [59]. Ionty v plynné fázi mohou podléhat změnám v důsledku sekundárních dějů. V oblasti s atmosférickým tlakem dochází k reakcím ion – ion, ion – molekula. Signál látky snižují děje způsobující neutralizaci náboje. Ion – molekulové reakce mezi molekulou analytu a iontu, který vznikl ionizací elektrosprejem z jiné složky roztoku, mohou poskytovat ion sledované látky (jedná se o uplatnění chemické ionizace) [59]. Přeměny iontů vyvolávají také kolize částic ve vakuovaném prostoru analyzátoru.

25

6.2.2 Instrumentace elektrospreje Základem elektrospreje je nerezová sprejovací kapilára, na kterou je vkládáno napětí. Vnitřní průměr kapiláry je 0,1 – 0,2 mm. Nejběžnější je koaxiální uspořádání spreje. Vzorek je přiváděn do iontového zdroje křemennou kapilárou (v případě CE - MS), která prochází sprejovací kapilárou. Do prostoru mezi kapilárami je čerpána pomocná kapalina (sheath liquid) pro zajištění vodivého spojení a za účelem zvětšení průtoku základního elektrolytu[66]. K vnějšímu povrchu sprejovací kapiláry je přiváděn zmlžovací plyn. Pro větší průtok lze do spreje koaxiálně přivádět plyn. V obou případech je používán převážně dusík (obr. 6). Pro kvalitu iontového signálu je nutné pro dosažení co největší účinnosti optimalizovat vkládané napětí na sprejovací kapiláru, průtok pomocných plynů, vzorku a pomocné kapaliny, napětí na vstupu do vakua v MS, teplotu vstupní kapiláry, teplotu pomocného plynu proudícího proti spreji a také pozice kapiláry na vstupu do vakuované části přístroje [59].

Obr. 6: Koaxiální uspořádání elektrospreje [67]

26

6.3 Hmotnostní analyzátor Jeden z nejčastějších analyzátorů používaných v MS je kvadrupólový analyzátor. Běžně se používá u hmotnostních spektrometrů, které jsou určeny pro spojení s HPLC, GC a CE. Separační

princip

kvadrupólového

analyzátoru

je

založen

na využití

kombinace

stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí. Kvadrupól je sestaven ze čtyř paralelních tyčí, které mají hyperbolický tvar a vytvářejí hyperbolické kvadrupólové pole. Prakticky jsou používány 4 kruhové tyče o délce 20 – 30 cm dobře aproximující hyperbolické pole (obr. 7). Tyče v diagonále jsou navzájem spojeny a připojeny ke zdrojům stejnosměrného a vysokofrekvenčního napětí. Na dvě protilehlé tyče je vloženo kladné stejnosměrné napětí (U), na zbývající dvě záporné stejnosměrné napětí. Na všechny je zároveň vkládáno vysokofrekvenční střídavé napětí. Pro páry tyčí platí: Eା = +ሺU − V ∙ cosωtሻ

(4)

Eି = −ሺU − V ∙ cosωtሻ

(5)

kde: E+ a E- - potenciál vložený na protilehlé dvojice tyčí, ω – frekvence vysokofrekvenčního pole, U – stejnosměrné napětí, V – amplituda střídavého napětí, t – čas.

Obr. 7: Kvadrupól [68]

27

Pohyb iontů podél tyčí k detektoru se v rovině x-y popisuje Mathieuovými rovnicemi stability [58], které definují oblast stabilní dráhy iontů pomocí parametrů a, q. Pomocí těchto rovnic se dá odvodit vztah pro U a V. Kvadrupól se chová jako hmotnostní filtr, který je nastavený na určitou hodnotu poměru m/z. Poměr U/V udává, pro které hodnoty poměru m/z je kvadrupólový filtr propustný. Nastavením hodnoty U/V můžeme ovlivňovat rozlišení a citlivost filtru (např. U = 0 propustnost je 100 %, ale rozlišení je 0). Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, se dostanou do střídavého elektrického pole a začnou oscilovat. Při vhodně zvolených hodnotách stejnosměrného a střídavého napětí a jejich vhodném poměru projdou kvadrupólem ionty o určitém poměru m/z. Ostatní ionty se zachytí na tyčích kvadrupólu nebo na stěnách přístroje. Postupnou změnou napětí, která vkládáme na tyče (tzv. skenováním), můžeme nechat projít filtrem ionty ve zvoleném intervalu hodnot m/z. Výhodou kvadrupólu je možnost rychlé změny hodnot napětí vkládaných na tyče. To umožňuje zvolit rychlý sken a mnohonásobné zaznamenání hmotnostních spekter během eluce úzkých píků, ať už v chromatografické nebo elektroforetické analýze. Nevýhodami je omezený hmotnostní rozsah závisející na konstrukci detektoru a jeho mezní hodnota se pohybuje okolo hodnoty m/z = 3000 [69]. Prakticky si to můžeme představit takto: ion je přiveden do středu osy kvadrupólu a zde začne oscilovat. V daný časový okamžik jsou, pro určitý poměr U/V, oscilace stabilní pouze pro ion s určitou hodnotou m/z, který projde kvadrupólem a dostane se na detektor. Všechny ostatní ionty jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu. Plynulou změnou (sken) hodnot stejnosměrného napětí U a amplitudy V (poměr U/V zůstává konstantní) jsou postupně propuštěny na detektor všechny ionty. Často diskutovaným problémem je citlivost detekce vs. skenovací rozsah. Pokud budeme skenovat např. v rozsahu 1000 m/z, tak na detekci jedné hodnoty m/z máme pouze 1/1000 z celkového času. Po zbytek času jsou ionty s touto hodnotou m/z zachyceny na tyčích kvadrupólu. Tzn. snížíme–li hmotnostní rozsah, zvýšíme citlivost detekce. Použijeme-li tzv. selektivní záznam iontu (SIM mód) zvýšíme citlivost detektoru, ale již se neměří hmotnostní spektrum jako takové, ale záznam intenzity iontu na čase. Tento mód je vhodný pro kvantitativní a stopovou analýzu látek se známou strukturou.

28

6.4 Detektor Poslední součástí hmotnostního spektrometru je detektor iontů. Detekce nejčastěji probíhá použitím fotonásobiče. Principem fotonásobiče je zesílení iontového proudu z kvadrupólu. Ionty při dopadu na fotokatodu interagují s elektrony fotokatody. Dochází k vyražení elektronů nad povrch katody. Elektrony jsou pak postupně urychlovány elektrickým napětím mezi jednotlivými elektrodami, které se nazývají dynody. Dopad urychlených elektronů na dynodu vyvolává emisi většího počtu elektronů tzv. sekundární emisi. Jejím výsledkem je znásobení počtu elektronů, které jsou urychlovány směrem k další dynodě. Po sérii zesílení proud elektronů dopadá na anodu. Pomocí fotonásobiče lze detekovat i jednotlivé fotony [63].

6.5 Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem Obdobně jako v případě HPLC - MS je v CE spojení s hmotnostním analyzátorem nejčastěji realizováno pomocí iontového zdroje typu elektrosprej. Hlavním technickým problémem, který komplikuje spojení těchto dvou technik, je nízký průtok základního elektrolytu separační kapilárou. A také problém s realizací vodivého spojení konce separační kapiláry se zemnící elektrodou vysokonapěťového zdroje pro elektroforézu [69]. Běžný průtok základního elektrolytu, který je daný tokem v separační kapiláře, je v řádu nl.min-1. Tento objem je nedostatečný pro vytvoření stabilního spreje v ESI. Základní typy spojení CE - MS jsou: a) s přídavným tokem kapaliny b) s vodivým kapalným spojením c) bez přídavného toku kapaliny Nejčastějším typem spojení jsou přístroje s přídavným tokem kapaliny. Chybějící objem kapaliny musíme dodat z externího zdroje. Separační kapilára je zavedena až na konec ESI sondy a okolo ní je koaxiálně přiváděna druhou kapilárou přídavná kapalina (sheath liquid) pro dosažení dostatečného průtoku, který je nezbytný pro stabilní sprej. Přídavná kapalina musí obsahovat elektrolyt kvůli zakončení elektrického obvodu elektroforézy. Jako přídavná kapalina se používá nejčastěji směs methanol a voda (nejčastěji 50 % v/v methanolu nebo propan-2-ol) o průtoku jednotek µl.min-1. Pro podpoření zvolené polarity ionizace se přidávají jednotky % kyseliny mravenčí (pozitivní mód) nebo amoniaku (negativní mód). [70]. 29

Pro podporu tvorby spreje a ke zvýšení jeho stability se do tohoto systému ještě přivádí pod vhodným tlakem zmlžovací plyn [69]. Při volbě složení nosného elektrolytu musíme respektovat omezení, která vyplývají z použití hmotnostního spektrometru. Pro zabránění kontaminace iontového zdroje a přerušení tvorby spreje během analýzy bychom měli používat těkavé soli (mravenčan, octan amonný). Pokud musíme použít elektrolyt s obsahem netěkavých složek, je vhodné používat roztoky v mnohem menších koncentracích než je v elektroforéze běžné. V CE-MS se obvykle pracuje v alkalické oblasti pH za podmínek stabilizované rychlosti elektroosmotického toku (EOF). Přívod přídavné kapaliny nevylučuje práci za nulového EOF v kyselých elektrolytech. Při použití pokrytých kapilár může za těchto podmínek docházet k nežádoucí migraci iontů z přídavné kapaliny do separační kapiláry a dojít tak k ovlivnění složení elektrolytu. Abychom potlačili tento efekt, přidáváme do nosného elektrolytu a do přídavné kapaliny stejnou sůl o stejné koncentraci. Volba složení a průtoku přídavné kapaliny z hlediska účinnosti ionizace je kritická a přímo ovlivňuje citlivost, mez detekce (LOD) a mez stanovení (LOQ). Organickým modifikátorem volíme běžná s vodou mísitelná rozpouštědla (např. methanol, 2 - propanol). Nevhodným rozpouštědlem je např. acetonitril. Volba pH přídavné kapaliny výrazně ovlivňuje efektivitu ionizace separovaných slabých elektrolytů. Při daném pH se musí látky rozseparovat a také následně dostatečně disociovat. Pro minimalizaci šumu je potřeba plynulý přívod přídavné kapaliny do zdroje ESI, což zajišťují chromatografické pumpy s tlumiči pulzů [69].

30

7 Experimentální část 7.1 Přístrojové vybavení Vzorky byly analyzovány kapilární elektroforézou Agilent Technologies s hmotnostním spektrometrem s kvadrupólovým analyzátorem (Agilent G6130). Tok přídavné kapaliny byl zajišťován isokratickou pumpou pro kapalinovou chromatografii (Agilent G1310)., data byla vyhodnocována s využitím softwaru ChemStation pracujícím pod operačním systémem Windows XP. Ke zpracování vzorků byl použit ultrazvuk Ecoson, centrifuga Centric a přístroj pro odpařování vzorků pod proudem dusíku Termovap.

7.2 Chemikálie a vzorky Chloramfenikol a tetracyklin byly zakoupeny u Sigma – Aldrich, St. Louis, USA a byly čistoty p.a. U firmy Merck spol. s.r.o. byly zakoupeny methanol a voda (gradient grade čistoty). Octová kyselina, amoniak a triethylamin byly zakoupeny u Fluka. Vzorky medu byly zakoupeny ve velkoobchodních řetězcích v Olomouci. K analýze reálných vzorků byly použity medy od výrobců uvedených v tabulce 4.

Tabulka 4: Analyzované medy číslo vzorku 1 2 3 4

5 6

název medu

původ výrobce směs medů ze zemí ES a zemí mimo Med květový luční Medokomerc s.r.o. ES směs medů ze zemí ES a zemí mimo Včelí med luční – ES, směs obsahuje med z regionů JSG med a.s. med květový s tropickým klimatem směs medů ze zemí ES a zemí mimo Med květový Medokomerc s.r.o. ES směs medů ze zemí ES a zemí mimo Včelí med lesní IS import-export, ES, směs obsahuje med z regionů smíšený spol. s.r.o. s tropickým klimatem Med květový směs medů ze zemí EU a zemí Kaufland ČR, (Stilla fiori Honey mimo EU, směs obsahuje med z v.o.s. floral) regionů s tropickým klimatem Včelí med plněno v ČR Moravia produkt květový nektarový

31

8 Výsledky a diskuze 8.1 Experimentální podmínky Separace tetracyklinu a chloramfenikolu byla prováděna s využitím nepokryté křemenné kapiláry o celkové délce 90 cm a vnitřním průměru 50 µm. Efektivní délka pro hmotnostní spektrometr je shodná s celkovou délkou. Pro experiment byly použity standardní roztoky chloramfenikolu a tetracyklinu o koncentraci 0,1 a 0,01 mg.ml-1 a pufr 50 mM acetát amonný, pH = 9,0. K dávkování bylo použito hydrodynamické dávkování 50 mbar/10 s. Separace kapilární elektroforézou byla prováděna při + 20 kV. Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem bylo realizováno elektrosprejem. Ionizace chloramfenikolu byla provedena v negativním módu při hodnotě – 4,0 kV a ionizace tetracyklinu byla provedena v módu pozitivním při hodnotě + 4,0 kV. Měření bylo prováděno s využitím přepínání polarity. Složení pomocné kapaliny bylo methanol:voda 20:80 (v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku. Průtok pomocné kapaliny byl nastaven na hodnotu 0,6 ml.min-1. Antibiotika byla detekována s využitím SIM módu, kde byl na kvadrupólu monitorován iont s poměrem m/z = 445 [M+H]+ pro tetracyklin a m/z = 321 [M-H]- pro chloramfenikol. Antibiotika byla identifikována metodou standardního přídavku. Před vlastní separací antibiotik byl studován vliv experimentálních parametrů. Pozornost byla věnována zejména složení a pH pufru, průtoku a složení přídavné kapaliny, tlaku a teplotě dusíku, napětí na kapiláře, nástřiku a extrakčnímu postupu. Pro separaci tetracyklinu a chloramfenikolu bylo sledováno složení pufru. Byly studovány acetát amonný a acetát triethylamonia o koncentraci 50 mM. Z důvodu lepší ionizace antibiotik a lepšího rozlišení (acetát triethylamonia – R = 7,2; acetát amonný – R = 8,9) byl vybrán acetát amonný (obr. 8). Vzhledem k tomu, že při měření musí dojít k přepínání polarity mezi pozitivním a negativním módem ionizace v elektrospreji je pro dosažení nejefektivnější ionizace nutné co nejvyšší rozlišení mezi oběma analyty. Pro tento pufr bylo sledováno optimální pH (obr. 9). Bylo vybráno pH = 9,0 z důvodu lepší opakovatelnosti a ionizace analytu. Z obrázku 8 plyne, že kation pufru (NH4+, TEA+) hraje významný vliv zejména při ionizaci tetracyklinu, který se ionizuje v kladném módu a kation pufru tak představuje konkurenční ion snižující výtěžnost kladně ionizovaných iontů tetracyklinu. Z tohoto důvodu byl jako vhodnější pracovní elektrolyt zvolen acetát amonný.

32

Obr. 8: Výběr složení pufru

4,0E+07 3,5E+07 plocha píku

3,0E+07 2,5E+07 2,0E+07

tetracyklin

1,5E+07

chloramfenikol

1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 acetát amonný

acetát triethylamonia

složení pufru

Podmínky separace: 50 mM pufr, pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, dávkování 50 mbar/20 s MS detekce:: Ionizace: ESI – tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu 20 psig, průtok pr zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda voda (20:80, (20:80 v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pr pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1.

Obr. 9: Výběr pH pufru

4,0E+07 3,5E+07 plocha píku

3,0E+07 2,5E+07 2,0E+07

tetracyklin

1,5E+07

chloramfenikol

1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 9

9,5

10

pH

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, dávkování 50 mbar/20 mbar/ s MS detekce:: Ionizace: ESI – tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu 20 psig, průtok pr zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda voda (20:80, (20:80 v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pr pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1. 33

Účinnost innost ionizace elektrosprejem lze ovlivnit vhodným průtokem pr tokem pomocné kapaliny. Nastavení vhodného průtoku toku pomocné kapaliny ovlivňuje ovliv uje citlivost, meze detekce a stanovení. Pro

ionizaci

tetracyklinu

a

chloramfenikolu

bylo

studováno

r rozmezí

průtoků

od 0,4 do 1,0 ml.min-1. Z obr. 10 je zřejmé, že nejvyšší odezvy u tetracyklinu bylo dosaženo při průtoku 0,6 ml.min-1 a u chloramfenikolu při p 1,0 ml.min-1. Jako kompromis byl zvolen průtok 0,6 ml.min-1, který byl použit při p všech následujících analýzách.

plocha píku

Obr. 10: Průtok tok pomocné kapaliny 1,4E+07 1,2E+07 1,0E+07 8,0E+06 6,0E+06 4,0E+06 2,0E+06 0,0E+00

tetracyklin chloramfenikol

0,4

0,6

0,8

1

průtok [ml.min-1]

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný, pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, dávkování 50 mbar/20 mbar/ s MS detekce:: Ionizace: ESI – tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu 20 psig, průtok pr zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda voda (20:80, (20:80 v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku. amoniaku

Významným parametrem ovlivňujícím ovliv citlivost techniky CE-ESI-MS MS je složení pomocné kapaliny. Tato kapalina zajišťuje zajiš vodivé spojení elektrických okruhů kapilární elektroforézy a hmotnostního spektrometru, spektrometru a také upravuje průtok základního elektrolytu pro ionizaci elektrosprejem. ktrosprejem. Byly studovány různé r poměry složení pomocné kapaliny (obr. ( 11). Pro ionizaci tetracyklinu bylo nejvhodnější jší složení methanol:voda 20:80 s přídavkem 0,5 % amoniaku. Pro separaci chloramfenikolu bylo nejvhodnější ější složení methanol:voda 80:20 s 0,5 % amoniaku. Tato pomocná kapalina použita nebyla, protože opakovatelnost analytu byla nižší a probíhala zde špatná ionizace. Při P i všech následujících analýzách byla použita pomocná kapalina se složením methanol:voda 20:80 s přídavkem řídavkem 0,5 % amoniaku. 34

Obr. 11: Složení ložení pomocné kapaliny

3,0E+07

plocha píku

2,5E+07 2,0E+07 tetracyklin 1,5E+07

chloramfenikol

1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 MeOH:H2O (50:50)

MeOH:H2O (80:20)

MeOH:H2O (20:80)

slo složení pomocné kapaliny s 0,5 % (v/v) NH3

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný, pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, dávkování 50 mbar/20 mbar/ s MS detekce:: Ionizace: ESI – tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu 20 psig, průtok pr zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, průtok pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1.

Účinnost separace můžeme ůžeme žeme také ovlivnit nastavením vhodného tlaku zmlžovacího zmlž plynu. Pro separaci tetracyklinu a chloramfenikolu chloramfenikolu bylo studováno rozmezí tlaku dusíku od 10 do 30 psig (obr. 12). ). Nejvyšší účinnosti ú innosti bylo dosaženo pro tetracyklin při p tlaku 20 psig a pro chloramfenikol 10 psig. Z důvodu nižší opakovatelnosti u chloramfenikolu byl zvolen tlak 20 psig, který byl použit použ u všech ostatních analýz. Ionizaci analytu ovlivňuje ovlivň teplota zmlžujícíhoo plynu. Pro separaci antibiotik byla sledována teplota v rozmezí 170 – 250 °C (obr. 13). Při teplotě 250 °C bylo dosaženo nejvyšší účinnosti innosti a nejlepší ionizace obou antibiotik, proto proto tato hodnota byla aplikována ve všech následujících analýzách. Při vyšších teplotách by mohlo docházet k dekompozici studovaných analytů,, což ale nebylo prokázáno.

35

Obr. 12: Tlak dusíku

1,6E+07 1,4E+07 plocha píku

1,2E+07 1,0E+07 8,0E+06

tetracyklin

6,0E+06

chloramfenikol

4,0E+06 2,0E+06 0,0E+00 10

20

30

tlak [psig]

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný, pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, dávkování 50 mbar/20 mbar/ s MS detekce:: Ionizace: ESI – tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol - 4,0 kV, T = 250 °C, průtok zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda methanol (20:80,v/v) . -11 s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, amoniaku průtok pomocné kapaliny 0,6 mg ml .

Obr. 13: Teplota zmlžovacího plynu 4,0E+07 3,5E+07 plocha píku

3,0E+07 2,5E+07 2,0E+07

tetracyklin

1,5E+07

chloramfenikol

1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 170

200

230

250

teplota plynu[°C]

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný, pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, dávkování 50 mbar/20 mba s MS detekce:: Ionizace: ESI – tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, tlak zmlžovacího plynu 20 psig, průtok tok zmlžovacího zmlž plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda (20:80, v/v) v/v s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok ůtok pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1. 36

K efektivní ionizaci bylo studováno napětí na sprejovací kapiláře. kapilá Pro separaci chloramfenikolu a tetracyklinu bylo studováno napětí nap v rozmezí 2,5 – 4,5 kV (obr. 14). Nejlepší ionizace onizace chloramfenikolu byla provedena v negativním ním módu při př hodnotě – 4,0 kV a tetracyklinu v pozitivním módu při hodnotě + 4,0 kV.

napě na kapiláře Obr. 14: Optimalizace napětí 4,0E+07 3,5E+07 plocha píku

3,0E+07 2,5E+07 2,0E+07

tetracyklin (+)

1,5E+07

chloramfenikol (-) (

1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 2500

3000

3500

4000

4500

napětí [V]

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný, pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, dávkování dávk 50 mbar/10 s MS detekce:: Ionizace: ESI – T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu 20 psig, psi průtok zmlžovacího . -1 plynu = 13 l min , složení pomocné kapaliny – methanol:voda voda (20:80, (20:80 v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok ůtok pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1.

37

Pro elektroforetickou separaci je důležitým d ležitým parametrem doba a tlak nástřiku. nást Pro separaci tetracyklinu a chloramfenikolu byl optimalizován čas nástřiku (10 s, 20 s) při konstantním tlaku 50 mbar.. Nejlepší ionizace u obou antibiotik bylo dosaženo při ři dávkování 50 mbar/10 mbar/ s (obr. 15).

plocha píku

Obr. 15: Parametry nástřiku

2,0E+07 1,8E+07 1,6E+07 1,4E+07 1,2E+07 1,0E+07 8,0E+06 6,0E+06 4,0E+06 2,0E+06 0,0E+00

tetracyklin chloramfenikol

10s

20 s

čas při konstantním tlaku 50mbar

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný, pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, napětí = +20 kV, MS detekce:: Ionizace: ESI – tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu 20 psig, psig průtok zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda voda (20:80, (20:80 v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pr pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1.

38

Pro účely stanovení obsahu tetracyklinu a chloramfenikolu byla vypracována kalibrace a stanoveny některé základní charakteristiky (tabulka 5). Kalibrační roztoky byly zhotoveny v rozmezí koncentrací 0,0004 – 0,06 mg.ml-1 pro tetracyklin a 0,0006 – 0,01 mg.ml-1 pro chloramfenikol. Z dat byly zhotoveny kalibrační grafy pro tetracyklin (obr. 16) a chloramfenikol (obr. 17) za účelem zjištění kalibračních rovnic. K tomuto vyhodnocení byl použit program QC Expert. Obr. 16 Kalibrační závislost tetracyklinu Regresní křivka - Kalibrační závislost tetracyklinu

B 1.20E06

1.00E06

0.80E06

0.60E06

0.40E06

0.20E06

A 0.00E06 0.00E-03

1.00E-03

2.00E-03

3.00E-03

4.00E-03

5.00E-03

6.00E-03

7.00E-03

Obr. 17 Kalibrační závislost chloramfenikolu B

Regresní křivka - Kalibrační závislost chloramfenikolu

3.0E05

2.0E05

1.0E05

A 0.0E05 0.0000 0.0010

0.0020 0.0030 0.0040

0.0050 0.0060

39

0.0070 0.0080 0.0090

0.0100 0.0110

Tabulka 5: Základní a chloramfenikolu

analytické

parametry

pro

stanovení

tetracyklinu LOD

LOQ

(mg.l-1)

(mg.l-1)

0,999

0,22

0,31

0,994

0,56

0,77

Rovnice kalibrační přímky

R2

tetracyklin

y = 166590355x ± 2394154 - 3700 ± 7193

chloramfenikol

y = 20447571x ± 242525 + 21746 ± 3952

Konečné podmínky separace CE-MS: napětí = + 20 kV, separační pufr acetát amonný pH = 9,0, dávkování 50 mbar/10 s. Pro MS detekci byly ideální podmínky stanoveny pro ESI ionizaci pro tetracyklin + 4,0 kV, pro chloramfenikol - 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu = 20 psig, průtok zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda (20:80, v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1. Elektroferogram standardu za optimálních podmínek je na obr. 18. MSD2 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000081.D)

ES-API, Pos, SIM, Frag: 60, "tetracycline"

tetracyklin 175000

150000

125000

100000

75000

50000

25000

0 2 MSD4 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000081.D)

4 6 ES-API, Neg, SIM, Frag: 60, "chloramphenicol"

8

10

12

min

12

min

chloramfenikol 40000

30000

20000

10000

0 2

4

6

8

10

Obr. 18 Podmínky separace: 0,02 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, U = + 20 kV, separační pufr acetát amonný pH = 9,0, dávkování 50 mbar/10 s. MS detekce: Ionizace: ESI - tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu = 20 psig, průtok zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda (20:80, v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1.

40

8.2 Analýza reálných vzorků Cílem aplikace vyvinuté metody separace tetracyklinu a chloramfenikolu s pomocí CE-ESI-MS byla demonstrace její aplikovatelnosti na reálné vzorky. Vybraných 6 druhů medu od různých výrobců bylo analyzováno za uvedených experimentálních podmínek. Vzorek medu obsahuje velké množství cukrů. Postup přípravy vzorku, lze shrnout do následujících bodů: •

vzorek byl navážen a smíchán s organickým rozpouštědlem

•

poté byl 5 min. třepán

•

vialka se vzorkem byla umístěna na 10 min. do ultrazvuku

•

poté byl vzorek 10 min. centrifugován

•

byl odebrán supernatant, který byl odpařen do sucha za laboratorní teploty pod proudem dusíku

•

poté byl odparek znovu rozpuštěn v 50 µl vody a nadávkován do CE

Pro extrakci antibiotik z medu bylo vyzkoušeno různé složení extrakční směsi (obr. 19.). Hammel a kol. [71] jako extrakční činidlo použili směs NaH2PO4 a ACN. Dalšími použitými extrakčními činidly byly ethylacetát a butylacetát. Směs NaH2PO4 a ACN byla nevyhovující z důvodu rozpuštění cukrů v této směsi. Butylacetát byl vhodný pro extrakci pouze chloramfenikolu. Jako nejlépe vyhovující rozpouštědlo byl zvolen ethylacetát.

41

výtěžnost [%]

Obr. 19: Složení extrakční ční směsi sm

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

tetracyklin chloramfenikol

NaH2PO4 + ACN

ethylacetát

butylacetát

extrakční činidla

Podmínky separace: 50 mM acetát amonný pH = 9,0, 0,1 mg.ml-1 tetracyklin, chloramfenikol, U = + 20 kV, dávkování 50 mbar/10 mbar/ s. MS detekce: Ionizace: ESI - tetracyklin + 4,0 kV, chloramfenikol – 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu = 20 psig, průtok pr zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda thanol:voda (20:80, v/v) s přídavkem p 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pr pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1.

42

8.3 Stanovení tetracyklinu a chloramfenikolu v reálných vzorcích medu Kontrola medu v zemích EU podléhá přísným normám. Přítomnost tetracyklinu a chloramfenikolu v medu je v těchto zemích zakázána. Antibiotika se do medu dostanou během léčby nemocných včelstev. Pokud se nemocné včelstvo léčí antibiotiky, může se určité množství vyskytovat i v medu. V tabulce 6 je uveden obsah jednotlivých antibiotik v analyzovaných medech. Každá analýza byla provedena 5 x. Obsah antibiotik byl vyhodnocován metodou standardního přídavku.

Tabulka 6: Obsah antibiotik v analyzovaných medech vzorky (n=5) tetracyklin (µg.kg-1) RSD (%) chloramfenikol (µg.kg-1) RSD (%) 1

˂LOD

˂LOD

2

˂LOD

4,0

3

˂LOD

˂LOD

4

˂LOD

6,0

0,35

5

7,5

18,5

6,8

6

˂LOD

8,5

4,3

1,8

5,5

Jak je patrné z tabulky 6, tetracyklin byl detekován pouze u vzorku č. 5. Chloramfenikol nebyl detekován u vzorku č. 1, 3. Vzhledem k tomu, že většina vzorků byla směsí medů ze zemí EU a mimo EU, nedá se s určitostí říci, zda antibiotika pochází od včelstev ze zemí EU. Povolené limity pro tetracyklin se v některých zemích EU (Švýcarsko, Belgie, Francie, Velká Británie) pohybují v rozmezí 20 - 50 µg.kg-1 [30, 32, 34, 72]. Používání chloramfenikolu je v zemích EU zakázáno. V ČR je používání antibiotik k léčbě včel zakázáno. Na obr. 20 – 31 jsou elektroferogramy z analýz jednotlivých vzorků medu. Konečné podmínky separace CE-MS: napětí = + 20 kV, separační pufr acetát amonný pH = 9,0, dávkování 50 mbar/10 s. Pro MS detekci byly ideální podmínky stanoveny pro ESI ionizaci pro tetracyklin + 4,0 kV, pro chloramfenikol - 4,0 kV, T = 250 °C, tlak zmlžovacího plynu = 20 psig, průtok zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny methanol:voda (20:80, v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1.

43

Obr. 20: Vzorek č. 2 – chloramfenikol v extraktu

5 10 15 MSD4 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000121.D) ES-API, Neg, SIM, Frag: 60, "chloramphenicol" 4500

20

25

30

35

20

25

30

35

chloramfenikol

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 5

10

15

min

Obr. 21: Vzorek č. 3 – tetracyklin v extraktu

MSD2 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000124.D) ES-API, Pos, SIM, Frag: 60, "tetracycline"

tetracyklin 1600

1400

1200

1000

800

600

400

2.5 5 7.5 MSD4 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000124.D) ES-API, Neg, SIM, Frag: 60, "chloramphenicol"

10

44

12.5

15

17.5

min

Obr. 22: Vzorek č. 4 – chloramfenikol v extraktu MSD4 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000129.D) ES-API, Neg, SIM, Frag: 60, "chloramphenicol"

2500

chloramfenikol

2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

20

22.5

min

Obr. 23: Vzorek č. 5 – tetracyklin a chloramfenikol v extraktu MSD2 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000132.D) ES-API, Pos, SIM, Frag: 60, "tetracycline" 8000

tetracyklin

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

2.5 5 7.5 MSD4 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000132.D) ES-API, Neg, SIM, Frag: 60, "chloramphenicol"

14000

10

12.5

15

17.5

20 min

12.5

15

17.5

20 min

chloramfenikol

12000

10000

8000

6000

4000

2000 2.5

5

7.5

10

45

Obr. 234: med č. 6 – čistý extrakt

MSD4 TIC, MS File (D:\VITEK\ATB\ATB000135.D) ES-API, Neg, SIM, Frag: 60, "chloramphenicol"

11000

chloramfenikol

10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2

4

6

8

10

46

12

14

16

18

min

8.4 Závěr Kapilární elektroforéza je analytická separační metoda, která by mohla být používaná v běžné kontrole potravin z důvodu univerzálnosti, vysoké účinnosti, vysoké rychlosti, nízké spotřeby činidel a vzorků. Další výhodou kapilární elektroforézy je také dostupnost vhodné detekční techniky od běžné UV-vis spektrofotometrie až po hmotnostní detekci. Pro

stanovení

tetracyklinu

a

chloramfenikolu

v medu

byly

prostudovány

experimentální podmínky metody CE-MS. Pozornost byla věnována zejména složení a pH pufru, průtoku a složení přídavné kapaliny, tlaku a teplotě dusíku, napětí na kapiláře, nástřiku a extrakčnímu postupu. Jako reálné vzorky byly použity vzorky medů od různých výrobců, které byly zakoupeny ve velkoobchodní síti řetězců. Pro analýzu reálných vzorků byla použita metoda CE-MS s následujícími podmínkami separace CE-MS: napětí = + 20 kV, separační pufr acetát amonný pH = 9,0, dávkování 50 mbar/10 s. Pro MS detekci byly ideální podmínky stanoveny pro ESI ionizaci pro tetracyklin + 4,0 kV,

pro

chloramfenikol - 4,0 kV,

T = 250 °C,

tlak

zmlžovacího

plynu = 20 psig, průtok zmlžovacího plynu = 13 l.min-1, složení pomocné kapaliny – methanol:voda (20:80, v/v) s přídavkem 0,5 % (v/v) amoniaku, průtok pomocné kapaliny 0,6 ml.min-1. Srovnáním prezentovaných výsledků obsahu jednotlivých antibiotik s povolenými limity je vidět, že obsah chloramfenikolu a tetracyklinu překračuje povolené limity. Vzhledem k tomu, že většina vzorků byla směsí medů ze zemí EU a mimo EU, nedá se s určitostí říci, zda antibiotika pochází od včelstev ze zemí EU. Z uvedených výsledků vyplývá, že CE-MS je metoda vhodná k identifikaci nízkých hodnot koncentrací, což je v kontrole potravin nezbytné.

47

9 Literatura [1]

http://lexdata.abcsys.cz/lexdata/sb_free.nsf/c12571cc00341df10000000000000000 /c12571cc00341df1c12566d40074a5fb?OpenDocument, staženo 28. 10. 2010.

[2]

Švamberk, V.: Tajemný svět včel, Vimperk 2000.

[3]

Veselý, V. a kol.: Včelařství, Praha 2003.

[4]

Tintěra, D.: Včelí produkty mýtů zbavené, Praha 2006.

[5]

Jun, M., Shao, Y., Ho, C. T., Koetter, U., Lech, S., J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 6340-6346.

[6]

Schade, J. E., Marsh, G. L., Eckert, J. E., Food Res. 23 (1958) 446-463.

[7]

http://www.ceskymed.cz/hodnoceni_dle_eu_%283%29.htm, staženo 3. 8. 2010.

[8]

Přidal, A., Čermák K., Včelařství, Brno 2005.

[9]

http://www.21stoleti.cz/view.php?cisloclanku=2004072128, staženo 2. 10. 2010.

[10]

Kamler, F., Veselý, V., Titěra, D.: Produkce kvalitního medu, VÚVč, Libčice nad Vltavou 2004.

[11]

http://www.vceliweb.cz/?t=o-vcelich-produktech-o-medu, staženo 2. 10. 2010.

[12]

http://www.vcelarstvisedlacek.cz/vcelareni.php?id=1276695719&cat=melecitoza-ajak-na-ni-?, staženo 2. 10. 2010.

[13]

http://www.vcelky.cz/oo-cukr-nebo-med.htm, staženo 2. 10. 2010.

[14]

http://www.rokytnikvcely.cz/?page=med-jako-lek&lang=cs, staženo 18. 10. 2010.

[15]

http://vcela.webnode.cz/vse-o-vcelarstvi/vceli-produkty/vlastnosti-a-druhy-medu/, staženo 18. 10. 2010.

[16]

http://www.obh.cz/index.php?m=nutric, staženo 18. 10. 2010.

[17]

http://vcelarske-potreby.on-line-obchod.cz/o-medu, staženo 18. 10. 2010.

[18]

Kubišová, S., Háslbachová, H.: Včelařství, Brno 1998.

[19]

Lochmann, O.: Nežádoucí účinky antiinfekčních léčiv, TRITON Praha 2008.

[20]

Hampl, F., Rádl, S., Paleček.: Farmakochemie, VŠCHT Praha 2007.

[21]

http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?Name=tetracycline&Units=SI, staženo 8. 3. 2011.

[22]

Moffat, A. C., Osseltan, M. D., Widdap (Eds.), B., Clarke´s Analysis of Drugs and Poisons in Pharmaceutical Press, Body Fluids and Postmortem Material,vol. 2, Pharmaceutikal Press, London, 2004.

[23]

Suchopar, J.: Antibiotika, antimykotika, antivirotika, Remedia Praha 1992. 48

[24]

Český lékopis 2005 – Doplněk 2006, 2. díl, Grada Publishing, 2006.

[25]

Ševčík, B., Lamka, J.: Veterinární farmakologie pro farmaceuty, Praha 1991.

[26]

Lamka, J., Ducháček, L.: Veterinární léčiva pro posluchače farmacie, Praha 1998.

[27]

http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?Name=chloramphenicol&Units=SI, staženo 8. 3. 2011.

[28]

Carrasco-Pancorbo, A., Casado-Terrones, S., Segura-Carretero, A., FernandezGutierrez, A., J. Chromatogr A 1195 (2008) 107–116.

[29]

Fujita, K., Ito, H., Michiyo, I., Sachi, I., Tanaka, H.,Tanigutchi, M., J. Food Hyg. Soc. Japan 49 (2008) 196–203.

[30]

Wan, G.-H., Cui, H., Zheng, H.-S., Zhou, J., Liu, L.-J., Yu, X-F., J. Chromatogr. B 824 (2005) 57–64.

[31]

Hakuta, T., Shinzawa, H., Ozaki, Y., Analytical Sciences 25 (2009) 1149-1153.

[32]

Peres, T. G., Rath, S., Reyes Reyes, F. G., Food Control 21 (2010) 620–625.

[33]

Nakazawa, H., Ino, S., Kato, K., Watanabe, T., Ito, Y., Oka, H., J. Chromatogr. B 732 (1999) 55–64.

[34]

Li, J., Chen, L., Wang, X., Jin, H., Ding, L., Zhang, K., Zhang, H., Talanta 75 (2008) 1245–1252.

[35]

Jing, T., Gao, X.-D., Wang, P., Wang, Y., Lin, Y.-F., Hu, X.-Z., Hao, Q.-L., Zhou, Y.K., Mei, S.-R., Anal Bioanal Chem 393 (2009) 2009–2018.

[36]

Khong, S.-P., Hammel, Y.-A., Guy, F. A., Rapid Commun. Mass Spectrom.19 (2005) 493–502.

[37]

Wang, L.-F., Peng, J.-D., Liu, L.-M., Analytica Chimica Acta 630 (2008) 101–106.

[38]

Pagliuca, P., Gazzotti, T., Serra, G., Sabatini, A. G., Apidologie 33 (2002) 583–584.

[39]

Oka, H., Ikai, Y., Hayakowa, J., Masuda, K., Harada, K.-I., Asukabe, H., Suzuki, M., Himei, R., Horie, M., Nakazawa, H., MacNeil, J. D., J. Agric. Food Chem. 42 (1994) 2215-2219.

[40]

Pena, A., Pelantova, N., Lino, C. M., Silveira, M. I. N., Solich, P., J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 3784-3788.

[41]

Viñas, P., Balsalobre, N., López-Erroz, C., Hernández-Córdoba, M., J. Chromatogr. A 1022 (2004) 125–129.

[42]

Sun, X., He, X., Zhang, Y., Chen, L., Talanta 79 (2009) 926–934.

[43]

Vidal, J. L. M., Aguilera-Luiz, M. Del M., Romero-Gonzalez, R., Frenich, A. G., J. Agric. Food Chem. 57 (2009) 1760–1767. 49

[44]

Liu, Y., Xu, J.-H., Tao, D., Li, G.-H., Chinese Journal Of Chemistry 25 (2007) 12941299.

[45]

Bogusz, M. J., Hassan, H., Al-Enazi, E., Ibrahim, Z., Al-Tufail, M., J. Chromatogr. B 807 (2004) 343–356.

[46]

Forti, A. F., Campana, G., Simonella, A., Multari, M., Scortichini, G., Analytica Chimica Acta 529 (2005) 257–263.

[47]

Chen, H., Ying, J., Chen, H., Huang, J., Liao, L., Chromatographia 68 (2008) 629– 634.

[48]

Han, J., Wang, Y., Yu, C-I., Yan, Y-S., Xie, X-Q., Anal Bioanal Chem 399 (2010) 1295-1304.

[49]

Huang, J.-F., Zhang, H.-J., Feng, Y.-Q., J. Agric. Food Chem. 54 (2006) 9279-9286.

[50]

Chen, H., Chen, H., Ying, J., Huang, J., Liao, L., Analytica Chimica Acta 632 (2009) 80–85.

[51]

Kaufmann, A., Butcher, P., Rapid Commun. Mass Spectrom. 19 (2005) 3694–3700.

[52]

Lu, Y., Shen, Q., Dai, Z., Zhang, H., Anal Bioanal Chem 398 (2010) 1819–1826.

[53]

Ortelli, D., Edder, P., Corvi, C., Chromatographia 59 (2004) 61–64.

[54]

Pan, C., Zhang, H., Chen, S., Xu, Y., Jiang, S., Acta Chromatographica 17 (2006) 320327.

[55]

Sánchez-Brunete, C., Albero, B., Miguel, E., Tadeo, J. L., Bull. Environ. Contam. Toxicol. 75 (2005) 459–465.

[56]

Ferguson, J., Baxter, A., Young, P., Kennedy, G., Elliott, Ch., Weigel, S., Gatermann, R., Ashwin, H., Stead, S., Sharman, M., Analytica Chimica Acta 529 (2005) 109–113.

[57]

Watson, J. T., Sparkman, O. D., Introduction to Mass Spectrometry, Wiley, USA, CA 2009.

[58]

Vřeštál, J. a kol.: Hmotnostní spektrometrie, Brno 2000.

[59]

Holčapek, M.: Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (HPLC/MS), 5. – 7. 11. 2001 sborník přednášek kurzu HPLC/MS pořádaného Spektroskopickou společností Jana Marka Marci a Univerzitou Pardubice, str. 51-59, Kongresová hala Univerzity Pardubice, Pardubice, 2001.

[60]

Zeleny, J., Phys. Rev. 10 (1917) 1–7.

[61]

Dole, M., Hines, R. L., Mack, L. L., Mobley, R. C., Ferguson, L. D., Alice, M. B., Macromolecules 1 (1968) 96–97.

[62]

Yamashita, M., Fenn, J. B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451–4459. 50

[63]

Gross, H. J.: Mass spectrometry a textbook, Berlin, 2004.

[64]

Hanuš, V., Herman, Z., Lemr, K., Vesmír 82 (2003) 312–313.

[65]

Kebarle, P., J. Mass Spectrom. 35 (2000) 804–817.

[66]

Stutz, H., Electroforesis 26 (2005) 1254-1290.

[67]

Simó, C., Barbas, C., Cifuentes, A., Electrophoresis 26 (2005) 1306–1318.

[68]

http://ksicht.natur.cuni.cz/serialy/detektivni-chemie/2, staženo 24. 11. 2010.

[69]

Štulík, K. a kol.: Analytické separační metody, Univerzita Karlova v Praze 2004.

[70]

Holčapek, M.: Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (HPLC/MS), 5. – 7. 11. 2001 sborník přednášek kurzu HPLC/MS pořádaného Spektroskopickou společností Jana Marka Marci a Univerzitou Pardubice, str. 93-99, Kongresová hala Univerzity Pardubice, Pardubice, 2001.

[71]

Hammel, Y.-A., Mohamed, R., Gremaud, E., LeBreton, M.-H., Guy, P. A., J. Chromatogr. A 1177 (2008) 58-76.

[72]

Casado-Terrones, S., Segura-Carretero, A., Busi, S., Dinelli, G., Fernández-Gutiérrez, A., Electrophoresis 28 (2007) 2882–2887.

[73]

Rønning, H. T., Einarsen, K., Normann Asp, T., Journal of Chromatography A, 1118 (2006) 226–233.

51

10 Seznam zkratek ACN

acetonitril

APCI

chemická ionizace za atmosférického tlaku

CE

kapilární elektroforéza

ČR

Česká republika

DAD

detektor s diodovým polem

EDTA

ethylendiamintetraoctová kyselina

EOF

elektroosmotický tok

ES

Evropské společenství

ESI

ionizace elektrosprejem

EU

Evropská unie

FAB

ionizace urychlenými atomy

GC

plynová chromatografie

HMF

5-hydroxymethylfuraldehyd

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

LC

kapalinová chromatografie

LOD

limit detekce

LOQ

limit kvantifikace

MF

mobilní fáze

MS

hmotnostní spektrometrie

pKa

disociační konstanta

RP

reverzní fáze

RRS

detektor Rayleighova rozptylu

RSD

relativní směrodatná odchylka 52

SIM

selektivní záznam iontu

SPE

extrakce tuhou fází

TEA

triethylamonium

TOF

průletový analyzátor

UPLC

extrémně účinná kapalinová chromatografie

USA

Spojené státy americké

UV

ultrafialová oblast spektra

VIS

viditelná oblast spektra

VWD

detektor s volitelnou vlnovou délkou

53