UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie
Metabolická odezva organismu na popálení
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Autor:
Veronika Palyzová
Studijní program:
B1406 Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Forma studia:
Prezenční
Vedoucí práce:
doc. RNDr. Jan Petr, Ph.D.
Termín odevzdání práce:
6. 5. 2013
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod odborným vedením doc. RNDr. Jana Petra, Ph.D. a všechny použité a prostudované literární a odborné zdroje jsem uvedla v seznamu literatury.
V Olomouci dne 3. 5. 2013
...........................................
2
Ráda bych poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce doc. RNDr. Janu Petrovi, Ph.D. za odborné vedení, ochotu, vstřícnost a cenné rady při plnění této práce. Také bych ráda poděkovala své rodině za podporu a pevné nervy po celou dobu mého studia.
3
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora
Veronika Palyzová
Název práce
Metabolická odezva organismu na popálení
Typ práce
Bakalářská
Pracoviště
Katedra analytické chemie, Laboratoř elektromigračních metod
Vedoucí práce
doc. RNDr. Jan Petr, Ph.D.
Rok obhajoby práce
2013
Abstrakt
Tato bakalářská práce je zaměřená na studium metabolické odezvy organismu na popálení pomocí kapilární elektroforézy. V teoretické části práce je pozornost věnována popáleninám obecně, dále potom
metabolismu
a
výživě
při
těchto
traumatických stavech. Jedna z kapitol je věnována kapilární elektroforéze, která byla použita jako základní metoda pro analýzu. Praktická část je zaměřena na studium a identifikaci látek vyskytujících se
v biologickém
materiálu
při
popáleninovém
traumatu. Jako biologický materiál byl použit krevní vzorek z popáleného pacienta na 30% těla. Klíčová slova
Popáleniny, metabolismus, výživa, kapilární elektroforéza
Počet stran
44
Počet příloh
0
Jazyk
Český
4
Bibliographical identification:
Autor’s first name and
Veronika Palyzová
surname Title
Metabolic response of the organism to burn injury
Type of thesis
Bachelor
Department
Department of Analytical Chemistry, Laboratory of electromigration methods
Supervisor
doc. RNDr. Jan Petr, Ph.D.
The year of presentation
2013
Abstract
This bachelor thesis is focused on Metabolic response of the organism to burn injury. The theoretical part is devoted to burn injuries generally, then metabolism and nutrition in postburn. One of the chapters is devoted to capillary electrophoresis which is used as basic metod for analysis. The experimental part is focused on study and identification selected substances occuring in biological material during burn trauma. As biological material was used blood sample from burn patient of 30 % total body surface area.
Keywords
Burn, metabolism, nutrition, capilary electrophoresis
Number of pages
44
Number of appendices
0
Language
Czech
5
Obsah
1.
Cíle práce.............................................................................................................................. 8
2.
Úvod ..................................................................................................................................... 9
3.
Popáleniny ......................................................................................................................... 11 3.1
Historie ....................................................................................................................... 13
3.2
Stavba kůže ................................................................................................................ 14
3.3
Klasifikace popálenin .................................................................................................. 15
3.3.1
Popálenina prvního stupně................................................................................. 15
3.3.2
Popálenina druhého stupně ............................................................................... 16
3.3.3
Popálenina třetího stupně .................................................................................. 17
4. Metabolismus ........................................................................................................................ 18 4.1 Změny metabolismu cukrů ............................................................................................... 19 4.2 Změny metabolismu tuků ................................................................................................ 20 4.3 Změny metabolismu bílkovin ........................................................................................... 20 5. Výživa ..................................................................................................................................... 22 5.1 Enterální výživa versus parentální výživa ......................................................................... 22 6. Genetika ................................................................................................................................. 24 7. Kapilární elektroforéza ........................................................................................................... 25 7.1 Elektroosmotický tok ........................................................................................................ 26 7.1.1 Zeta potenciál ............................................................................................................ 26 7.2 Instrumentace .................................................................................................................. 27 7.2.1 Kapiláry...................................................................................................................... 27 7.2.2 Detektory .................................................................................................................. 27 8. Nukleotidy .............................................................................................................................. 29 8.1 Funkce nukleotidů ............................................................................................................ 29 9. Materiál .................................................................................................................................. 32
6
9.1 Chemikálie ........................................................................................................................ 32 9.2 Přístrojové vybavení ......................................................................................................... 32 9.3 Biologický materiál ........................................................................................................... 32 9.4 Příprava biologického materiálu ...................................................................................... 32 9.4.1 Pomocí kyseliny trichloroctové (TCA): ....................................................................... 33 9.4.2 Pomocí acetonitrilu (ACN): ........................................................................................ 33 9.5 Směs standardů ................................................................................................................ 33 9.5.1 Příprava standardů .................................................................................................... 33 9.6 Příprava elektrolytů .......................................................................................................... 33 9.7 Instrumentace a experimentální podmínky ..................................................................... 34 10. Výsledky ............................................................................................................................... 35 10.1 Vliv elektrolytu na nukleotidy a biologický materiál ....................................................... 35 10.2 Srovnání deproteinace biologického materiálu (krve) pomocí ACT a TAC ...................... 35 10.3 Analýza standardů nukleotidů a jejich identifikace ........................................................ 36 10.4 Určení meze detekce ...................................................................................................... 39 10.5 Určeni opakovatelnosti metody ..................................................................................... 40 11. Závěr .................................................................................................................................... 41 12. Seznam použité literatury .................................................................................................... 42
7
1. Cíle práce
Vypracování přehledné rešerše na téma:
Podstaty popáleninového úrazu
Metabolismu
Genetických změn
Výživy u popáleninových traumat
Vývoj metody pro studium obsahu vybraných látek (nukleotidů) při popáleninovém úrazu
Identifikace látek (nukleotidů) v biologickém materiálu
8
2. Úvod Popáleninové trauma patří k jednomu z nejstarších zranění a s rozvojem techniky a vyspělostí civilizace vzrůstá jeho riziko výskytu. Stejně tak vzrůstá i kvalita poskytované péče. V dnešní době existují specializovaná pracoviště, kde popáleninová medicína dosahuje vysoké kvality. Zahrnuje jak moderní metody a postupy léčby tak i kvalifikovaný a proškolený personál - lékaři, všeobecné sestry, fyzioterapeuti, psychiatři a další. Bakalářská práce studuje danou problematiku na požádání Fakultní nemocnice v Ostravě. Jejím cílem je ověřit použití kapilární elektroforézy jako vhodné metody pro analýzu nízkomolekulárních látek v biologickém materiálu. Teoretická část bakalářské práce je zaměřena na klasifikaci, vznik a průběh popálenin. Poskytuje informace o metabolických změnách, ke kterým dochází při popáleninovém traumatu, o nutriční podpoře, která je důležitou součástí léčby pacientů s popáleninami a o kapilární elektroforéze, která byla použita jako základní metoda pro studium a analýzu vzorků. Experimentální část je zaměřena na studium vybraných látek – nukleotidů při popáleninách a na identifikaci látek vyskytujícím se v biologickém materiálu, pomocí kapilární elektroforézy.
9
Teoretická část
10
3. Popáleniny „Popáleninové trauma se řadí mezi nejstarší úrazy, které postihly lidstvo.“ (Königová, 2010a). Nepatří sice mezi nejčastější zranění ale svou komplikovanou léčbou a následky se řadí mezi nejzávažnější úrazy. Popáleniny negativně působí na kůži, která je největším orgánem lidského těla, a vážně ji narušují. Kůže slouží jako pokrývka, která chrání tělo před ztrátou nadměrného množství tekutin a podílí se na ochraně organismu před řadou vlivů z vnějšího prostředí, které mu škodí. Kůže obsahuje velké množství smyslových receptorů, prostřednictvím kterých přijímá signály z vnějšího prostředí a reguluje tělní teplotu (Lüllman, 2012). Léčba popálenin je velice náročná a zdlouhavá. Závisí na hloubce poranění, o kterém rozhoduje nejenom výše teploty, ale také doba působení tepla, stav pacienta a především jeho věk. Velký problém je v tom, že neexistuje jednotný postup pro léčbu popálenin, ale každý pacient vyžaduje individuální přístup podle rozsahu a hloubky poranění.
Nejdůležitějším
úkonem po hlubokém termickém úrazu je korekce vnitřního prostředí a nekrektomie, buď ostré, nebo chemické (Mager, 2005). V České republice se každoročně léčí na popáleninový úraz přibližně 1 % populace, přičemž 3 % se řadí mezi těžké případy a jsou hospitalizováni a celých 97 % se léčí pouze ambulantně. Dětské popáleniny tvoří 40 % případů (Obr. 1). Nejčastějším mechanismem poranění je opaření, a to až v 56 % případů. Druhým nejčastějším způsobem poranění je popálení plameny (Obr. 2) (www.epomed.cz).
11
1% 13%
24% 62%
Obr. 1: Termické úrazy v ČR v letech 2000-2009 z popáleninových center v Ostravě, Brně a Praze. 62 % ambulantně léčeno, 24 % přijatých dospělých, 13 % přijatých dětí, 1 % úmrtí (www.epomed.cz, vlastní zpracování)
1% 5%
4% 34%
56%
Obr. 2: Nejčastější způsoby popálení v ČR v letech 2000-2009 z popáleninových center v Brně a Ostravě. 56 % opaření, 34 % planem, 5 % kontakt, 4 % elektrotrauma, 1 % poleptání (www.epomed.cz, vlastní zpracování)
12
3.1 Historie Se vznikem života je spojen začátek používání ohně a tím i možnost vzniku popáleninového traumatu. Historie léčby popálenin je spojena s dějinami lidstva na naší planetě (Šimko, 1992a). S rozvojem civilizace stoupá riziko popáleninového úrazu. Již v době kamenné léčil člověk neandrtálský popáleniny pomocí rostlin. První písemná zmínka o popáleninách a jeho léčení, tzv. Ebersenův papyrus, pochází z roku 1600 př. Kr. a klade velký důraz na přesný postup při léčení popálených ploch pomocí „živočišných“ látek (např. syrové maso). Díky středověkým lékařům v čele s Hippokratem byla do herbální medicíny vnesena určitá logika. Ze středověku pochází důležitý poznatek o tom, že studená voda má pozitivní účinky při léčbě popálených ploch. Naopak vypalování popálených ploch ohněm bylo odsouzeno v 16. století Ambroisem Parém. Prvním, kdo se hlouběji zabýval popáleninovým traumatem, byl švýcarský lékař Wilhelm Fabry. Jako první definoval popáleninové trauma a informoval o jejích příčinách, příznacích, prognóze a léčení. Popálenina zde byla klasifikována do tří stupňů: I. gradus levis, II. gradus mediocris, III. gradus insignis. Fabry byl také toho názoru, že popáleninové trauma je onemocnění celkové, nikoli jen poranění kůže (Königová a kol., 1999a). Ke studiu a objasnění podstaty popáleninového traumatu přispěla hromadná lidská neštěstí. V roce 1928 se Československo stalo první zemí v Evropě, kde bylo zřízeno samostatné pracoviště plastické a rekonstrukční chirurgie, jehož zakladatelem byl prof. František Burian. Díky němu bylo v roce 1953 založeno popáleninové centrum, které bylo prví nejen v Československu, ale také na evropském kontinentu (Königová, 2010a). V současné době existují v České republice tři specializovaná popáleninová centra, a to v Ostravě, v Praze a v Brně.
13
3.2 Stavba kůže Kůže je největším orgánem lidského těla. Celková plocha kůže zaujímá u dospělého člověka 1,6 -1,8 m2. Kůže se skládá z epitelové složky - pokožka (epidermis) a z vazivové složky škára (dermis nebo také corium). Pod kůží leží tkáň vazivová a tuková - podkožního vazivo (tella subcutanea) (Obr. 3). Pokožka – je tenká vnější vrstva složena z rohovatějícího vrstevnatého dlaždicového epitelu. Povrch pokožky je tvořen rohovatějícími buňkami, které leží jedna na druhé. Tyto buňky odumírají a odlupují se a jsou nahrazovány rychle se dělícími buňkami z hlubších vrstev. V epidermis jsou uložené pigmentové buňky (melanocyty), které způsobují zbarvení kůže, dále Langerhansovy buňky patřící k imunitnímu systému a Merkelovy buňky, což jsou receptory dotyku. Pokožka tvoří vlastní povrch těla. Škára – silná vrstva skládající se z vazivových buněk, vláken kolagenu a elastinu. Často se zde nacházejí i tukové buňky. Dermis je bohatě prostoupena žlázami (potní, mazové), smyslovými tělísky, cévami a nervy. Z této vrstvy vyrůstají vlasy a chlupy. Škára je zodpovědná za odolnost kůže, je odolná proti roztržení ale vratně tažná. Podkožní vazivo - je tvořeno sítí elastických a vazivových vláken, mezi kterými jsou vmezeřeny vazivové buňky. Pružná vlákna připevňují kůži více, či méně pohyblivě k orgánům ležícím pod ní. V podkožním vazivu se ukládá tuk, který má funkci tlakového polštáře např. na chodidlech nebo slouží jako tepelná izolace, či zásobárna energie (Novotný, 2008; Stockleyová, 2003; Lüllmann-Rauch, 2012).
Obr. 3: Stavba kůže ve vztahu k hloubce postižení. (převzato z www.epomed.cz)
14
3.3 Klasifikace popálenin Popáleninové trauma vzniká dostatečně dlouhým působením velkého množství tepelné energie, popřípadě elektrickým proudem, radiozářením, působením chemikálií nebo třením (Šimko, 1992b). Závažnost popálenin můžeme rozdělit podle několika hledisek, a to dle:
mechanismu poranění na popáleniny teplem, elektrickým proudem, zářením, chemikáliemi;
rozsahu postižení, které se vyjadřuje procentuálně (plocha dlaně odpovídá 1 % plochy těla);
hloubky poranění, v České republice rozdělujeme popáleniny dle hloubky poranění do tří skupin, a to na popáleninu I. stupně, popáleninu II. stupně, která se dále dělí na povrchní (IIa) a hlubokou (IIb) a popáleninu III. stupně (Obr. 4);
lokalizace popáleniny (nejzávažnější jsou popáleniny hlavy a obličeje)
výskytu přidružených poranění;
stavu organismu v době úrazu (zdravotní stav, věk, nemoci) (Matek).
Mezinárodní rozdělení popálenin zahrnuje čtyři stupně popálenin: I., IIa, IIb, III. a IV. stupeň. Popáleninu I. a IIa stupně řadíme mezi povrchové postižení. Poškození kůže je jen částečné a zhojení je spontánní. K hlubokému postižení řadíme popáleniny IIb a III. a IV. stupně. Zde je zasažení hlubokých vrstev dermis a ztráta kůže v celém rozsahu. Nedochází k spontánnímu zhojení, ale je třeba chirurgický zákrok (Brychta a kol.). Hluboké popáleniny se řadí k nejzávažnějším úrazům (Mager, 2005).
3.3.1 Popálenina prvního stupně Jde o povrchové popálení, které se vyznačuje zarudnutím, bolestivostí v důsledku vyplavování vasoaktivních látek, otokem (rozdílný podle množství předané energie a reaktivity pacienta) a zvýšenou teplotou. U tohoto typu popálení nedochází k poškození nervových zakončení, a proto je tolik bolestivý (Matek). Jakmile odezní příznaky zánětu (rubor, tumor, calor, dolor) přestane zasažená plocha pálit a několik dní přetrvává pouze zarudnutí a mírný otok (Königová, 2010b).
15
Popálenina prvního stupně je reverzibilní. Bazální membrána ani vrstva bazálních buněk, fixovaná k membráně není poškozena. Zhojení trvá 3-6 dní a většinou bývá bez následků. V některých případech může dojít k přechodnému namnožení pigmentových buněk, jež za několik dní vymizí. Typickým zdrojem popálenin I. stupně je sluneční záření, např. při opalování bez dostatečného použití ochranných prostředků (www.pharmanews.cz).
3.3.2 Popálenina druhého stupně Stupeň IIa – povrchní popálenina druhého stupně - dochází k oddělování bazálních buněk epidermis od bazální membrány. Poškozena je epidermis, tvoří se buly (puchýře). Tekutý obsah buly je tvořen lymfou a filtrátem plazmy, obsahuje určité množství fibrinu v závislosti na míře poškození kapilárních stěn, ale neobsahuje červené krvinky. Podle množství fibrinu můžeme určit závažnost poranění. Čím více fibrinu se vyskytuje v obsahu buly, tím více je poranění závažnější. (Königová, 2010b) Poranění se zahojí většinou spontánně bez jizev během několika dní, často se změnou pigmentace a koloritu kůže (Brychta a kol.). Stupeň IIb – hluboké popáleniny druhého stupně - je zcela zničena epidermis a částečně je zasažena i dermis. Volná nervová zakončení v epitelu a svrchním dermis jsou nefunkční. Zachovány jsou pouze hluboké čití uložené ve spodních vrstvách dermis (Königová, 2010b). Popálená plocha je sytě červená. Bezprostředně po úrazu je popálená plocha po vyvinutí tlaku bledá, ale po krátkém čase opět zčervená (pozitivní test kapilárního návratu) (Königová a kol., 1999b). Existují popáleniny, které jsou bledé hned po úrazu. Řadí se k nim popáleniny způsobené vysokou teplotou po velmi krátkou dobu. Při tomto poranění je ztráta kůže částečná – povrchové poranění. Naproti tomu poranění způsobené působením nižších teplot (opaření) jsou bezprostředně po úrazu červené a ztráta kůže je v důsledku nekróz v celé tloušťce – hluboké postižení (http://zdravi.e15.cz; Königová a kol., 1999b). Hojení popálenin druhého stupně není spontánní ale velmi zdlouhavé, v závislosti na hloubce poranění trvá dva a více týdnů. Někdy se musí přikročit i k chirurgickému zákroku (Brychta a kol.; http://zdravi.e15.cz). Trvalým následkem jsou jizvy různého typy (ploché, hladké, nepravidelně pigmentované), někdy i hypertrofující jizvy.
16
3.3.3 Popálenina třetího stupně Je nejtěžší stupněm termického poškození kůže. Zasažena je kůže v celém rozsahu nekróza, často bývá poškozena vrstva podkožního tuku, ojediněle svalová fascie, svaly a ve výjimečných případech kosti. Popálenina je hnědočervená nebo voskovitě bílá. Jelikož jsou zničena veškerá nervová zakončení, bolestivost není průvodním znakem (Matek). Popáleniny třetího stupně jsou nejčastěji způsobeny elektrickým proudem vysokého napětí ale i dlouhodobou expozicí ohně nebo kontaktu se žhavými předměty při intoxikacích, bezvědomí nebo epileptických záchvatech (Königová, 2010b). Popáleniny třetího stupně nejsou schopné spontánního zhojení. Řešením je chirurgické odstranění nekrózy a následná autotransplantace. (Brychta a kol.) Trvalý následek je nepravidelná jizva, jejíž vzhled je odvozen od mnoha faktorů, jako jsou hloubka nekrózy, rozsah postižení, přítomnost infekce, typ a úspěšnost operačního výkonu (Königová, 2010b).
Obr. 4: Vztah mezi povrchovým vzhledem a hloubkou nekrózy dle Zawackiho (1987). (převzato z Königová, 2010)
17
4. Metabolismus Poranění způsobená popálením vedou k mnoha metabolickým změnám a zánětlivým onemocněním. Při popálení dochází k aktivaci osy hypotalamus – hypofýza – nadledviny a k uvolňování stresových hormonů. Hypotalamo – hypofyzární odpověď zvyšuje uvolňování antidiuretického hormonu (ADH), somatotropního hormonu (STH), adrenokortikotropního hormonu (ACTH) a beta-endorfinů. Uvolňování ADH a hormonu stimulujícího thyreocyty (TSH) bývá přechodné (Königová a kol., 1999c). Uvolňovány jsou také mediátory, jako tumor nekrotizující faktor, interleukiny (IL-6, IL-8), interferony a další (Kraft, 2011). Dále dochází k snížení hmotnosti, úniku vody a progresivnímu úbytku bílkovin (Šimko, 1992c). Rychlost metabolismu je v období popáleninového traumatu velmi vysoká. Energetické požadavky jsou obrovské a jsou splněny mobilizací bílkovin a aminokyselin. V důsledku toho jsou ohroženy funkce a struktura důležitých orgánů jako jsou srdce, játra, kosterní svalstvo, kůže, imunitní systém (Jeschke a kol., 2007). Rozsáhlé popáleniny vedou k těžké systémové metabolické odpovědi sestávající ze dvou fází (Gangemi, 2007). Okamžitě po úrazu nastává fáze odlivu „ebb“, která po několika hodinách až dnech přechází do fáze přílivu „flow“ (Königová, 2010c). Fáze odlivu se vyznačuje snížením potřeby kyslíku, srdečním výdejem, energetickými potřebami a sníženou tělesnou teplotou (Herndon, 2004). Naopak fáze přílivu je charakterizována hypermetabolismem, vzestupem tělesné teploty, vyšší spotřebou kyslíku a glukózy, zvýšenou produkcí oxidu uhličitého, glykogenolýzou, proteolýzou a lipolýzou (Königová, 2010c; Jeschke a kol., 2007). Fáze přílivu je aktivována glukoneogenezí a degradací proteinů, které mohou sloužit k zajištění metabolických substrátů pro zánět, hostitelské obranné mechanismy a proces hojení ran. Pro-zánětlivé cytokiny a vysoká hladina stresem indukovaných hormonů (glukagon, kortisol, katecholaminy) hrají hlavní roli v zachování katabolického stavu (Gangemi, 2007). Odpověď na popálení začíná 5 dní po popáleninovém úrazu a přetrvává ještě dalších 24 měsíců po úrazu. Je spojena se ztrátou svalové hmoty, ztrátou kostní hustoty, špatným hojením ran a svalovou slabostí. Zvýšený obrat proteinů, degradace a negativní dusíkatá bilance jsou charakteristické pro toto kritické onemocnění (Jeschke a kol., 2007; Chioléro, 1997). Popáleninový úraz se od ostatních závažných traumat odlišuje ve dvou jevech a to v délce trvání a intenzitě. Při popáleninovém traumatu dochází k zvýšení energetické potřeby
18
organismu až o 100% základního energetického výdeje. Na rozdíl od jiných traumat je u popáleninového úrazu hypermetabolismus prodlužován a přetrvává i dlouhou dobu po zahojení popálených ploch (Königová, 2010c). Za zvýšenou metabolickou odpověď jsou zodpovědné katecholaminy, glukagon a glukokortikoidy (Šimko, 1992c). Katecholaminy jsou vyplavovány sympatickým koncem nervů a dření nadledvin a v poměru k popálené ploše jsou dvakrát až desetkrát zvýšeny (Jeschke a kol., 2007). Uvolňování katecholaminů je dlouhodobé, nejen v době úrazu (Königová a kol., 1999c). Množství těchto hormonů je přímo úměrné ploše popálení (Šimko, 1992c). Studie
ukázaly,
že
zvýšená
velikost
popálení
je
spojena
se
zvýšeným
hypermetabolismem, s přetrvávajícím zánětem, s katabolismem, se změnami v tělesné kompozici, se zvýšenou produkcí stresových hormonů a orgánovou dysfunkcí. Mnohé studie také ukazují, že větší míra popálení vede k větší úmrtnosti pacientů.
4.1 Změny metabolismu cukrů Organismus se snaží co nejrychleji a co nejlépe zajistit využitelný zdroj energie. Těmito zdroji jsou glukosa a mastné kyseliny. Glukosa se při popáleninovém traumatu tvoří glukoneogenezí a odbouráváním jaterního glykogenu. Substráty pro glukoneogenezi jsou aminokyseliny (alanin – je zapojen do Krebsova cyklu), laktát, pyruvát (součástí Coryho cyklu) a glycerol, který se získává štěpením triacylglycerolů. Glykémie spolu se zvýšenou hladinou plazmatického insulinu jsou typické u pacientů v období popáleninového traumatu (Königová, 2010c). Hyperglykemie komplikuje metabolický stav pacienta, snižuje funkci imunitního systému, inhibuje agregaci destiček, zpomaluje hojení ran, je spojena se zvýšenou úmrtností a se zvýšeným odbouráváním proteinů (Gore, 2002). Anaerobní glykolýza je hlavní metabolickou cestou pro syntézu ATP. Zvýšeným přívodem glukosy můžeme snížit jaterní glukoneogenezi bez ovlivnění stupně katabolismu. Musíme však počítat pouze s její 50 % oxidací. Kosterní svalstvo šetří glukosu jako energetický substrát pro buňky nervového systému, erytrocyty a leukocyty. 50% exogenně dodávané glukosy je přeměňováno na glukagon nebo tuky (Königová a kol., 1999c).
19
Koncentrace glukosy v krvi je závislá na rozsahu popálení. Čím větší je popálená plocha, tím je vyšší koncentrace glukosy v krvi (Šimko, 1992c). Insulin a glukagon jsou pro metabolismus glukosy nejdůležitější. Oba hormony jsou vylučovány Langerhansovými ostrůvky pankreatu. Zde může nastat první problém vylučování insulinu v důsledku vazokonstrikce membrány. U popálených pacientů dochází k poklesu poměru insulin/glukagon a tím je inhibována glykolýza. Další faktor způsobující poruchu metabolismu glukosy je zvýšená sekrece adrenalinu (Šimko, 1992c). U některých pacientů nastává problém ve vytvoření potřebného množství glukosy. Proto jim je v období, kde jsou zvýšené nároky na energetickou spotřebu podávána glukózová infuze. Podávání glukosy a většího množství insulinu brání dehydrataci a snižuje stupeň katabolismu tím, že zamezuje přeměnu aminokyselin na glukosu. U části pacientů existuje tzv. insulinová rezistence. Insulin nesnižuje vysokou koncentraci glukosy v krvi i při vyšších dávkách (Šimko, 1992c).
Navíc
je
insulinová
resistence
hlavním
faktorem
zvýšené
zánětlivosti
a
hypermetabolických procesů (Kraft, 2011).
4.2 Změny metabolismu tuků Dalším problémem v období popáleninového šoku je u pacientů lipolýza – rozklad tuků na glycerol a volné mastné kyseliny. Při vysokém přívodu glukosy se navyšuje energetický výdej a tím se zvyšuje hladina katecholaminů (Königová, 2010c). Katecholaminy a glukagon stimulují hormon, senzitivní lipázu, který navozuje lipolýzu (Königová a kol., 1999c). Na rozdíl od hladovění, kdy jsou volné mastné kyseliny oxidovány, u popáleninového traumatu tomu tak není. Kyseliny jsou vychytávána a znovu reesterifikovány a připraveny pro transport zpět na periferii v podobě chylomikronů. U pacientů s popáleninami je však syntéza chylomikronů porušena a v důsledku toho dochází k ukládání tuku v játrech a vzniku jaterní steatózy (Königová, 2010c).
4.3 Změny metabolismu bílkovin Charakteristickým znakem pro všechny těžké úrazy je negativní dusíkatá bilance, která je při popáleninách přímo úměrná rozsahu a hloubce popálení. Ztráta bílkovin je spojena s odbouráváním svalstva. Za zvýšenou tvorbu svalových bílkovin je zodpovědný anabolický 20
agent – insulin (Tuvdendorj, 2011). Dusíková rovnováha, závislá na rovnováze mezi syntézou a odbouráváním proteinů, může být narušena dvěma způsoby. Buď převládá syntéza nad odbouráváním, nebo převládá odbourávání nad syntézou (Šimko, 1992c). Příčinou vystupňované proteinové degradace je TNF (Königová, 2010c). Po úrazu jsou svaly základním zdrojem dusíku. Ze svalové hmoty jsou v první řadě uvolňovány aminokyseliny. Odbourávání bílkovin svalstva, jako náhradní zdroj energie dosahuje až 30 g dusíku denně, což odpovídá 120 g bílkovin (Šimko, 1992c). Za jeden den se může rozpadnout 480 až 960 g proteinů (přepočteno na svalovou hmotu) (Königová, 2010c). Ke ztrátám dusíku dochází také přes ránu v exsudátu. Tyto ztráty představují až 25 % celkových ztrát. Rozpadem funkčních proteinů dochází k zhoršení imunity, což může vést až k multiorgánovému selhání (Königová, 2010c). Můžeme říci, že katabolismus nelze zvrátit ani v podmínkách nadměrného přísunu fyziologických nutričních substrátů v počáteční fázi poranění (Königová a kol., 1999c).
21
5. Výživa V posledních třiceti letech se na zlepšení přežívání pacientů s rozsáhlými popáleninami podílí kromě podávání antibiotik, moderní tekutinové resuscitace, včasné nekrektomie a transplantace i zavedení vhodné nutriční podpory. Umělá nutriční výživa je u pacientů s popáleninami důležitou podpůrnou léčbou, neboť u těchto pacientů je rozvoj podvýživy značně zrychlený (Chioléro, 1997). Pomocí výživy sice nejsme schopni zvrátit účinky hypermetabolismu na organismus, ale můžeme snížit jeho dopad (Konigová, 2010c). Naším cílem je zabránit úbytku tělesné hmotnosti pod 10 % původní váhy pacienta. Pokud dojde ke ztrátě hmotnosti nad 10 % původní váhy pacienta, přináší to s sebou značné komplikace. 10 % ztráta celkové tělesné hmotnosti vede k imunitní dysfunkci, 20 % ke snížení hojení ran a 30 % k výskytu závažných infekcí. Ztráta hmotnosti o 40 % vede k bezprostřední smrti. Zajištění správné rovnováhy mezi makro a mikronutrienty ve výživě, energií a dalšími antioxidanty je nezbytné pro zmírnění hypermetabolických stavů po popáleninovém úrazu (Hall, 2012; Rodriguez, 2011).
5.1 Enterální výživa versus parentální výživa Pro podávání výživy enterální cestou, která má řadu výhod, je potřeba správná funkce zažívacího traktu. Při enterální výživě není třeba zavádět žilní katétr, který může představovat určité riziko vzniku sepse. Absorpce živin v portálním systému podporuje metabolismus v oblasti splanchniku, zajišťuje lépe stabilitu gastrointestinální bariéry a snižuje riziko vzniku ulcerací v oblasti gastrointestinálního traktu. Enterální výživu je potřeba zavést co nejdříve, nejlépe do několika hodin po úrazu, nejpozději však do druhého dne po poranění (Königová a kol., 1999c). Podle studií je enterální způsob podávání živin mnohem lepší než parentální způsob. Důvody jsou jasné. Totální enterální výživa poskytuje mnohem lepší nutriční podporu než totální parentální výživa a to tak, že udržuje integritu střevní sliznice a zabraňuje zvýšenému vylučování katabolických hormonů. Poskytuje lepší regulaci odpovědi zánětlivých cytokinů a může přispívat k snížení imunosuprese po chirurgickém zákroku než parentální výživa. Kromě toho enterální výživa může snížit střevní propustnost, zachovává bariéru střevní sliznice a má příznivý vliv na redukci enterogenických infekcí.
22
Naproti tomu, parentální výživa (TPN) se jeví jako neúčinná v prevenci katabolické odpovědi po popálení. Použití centrálního žilního katétru výrazně zvyšuje riziko nemocnosti a úmrtnosti. TPN zvyšuje stresovou odpověď, zvyšuje endotoxinovou translokaci a vede k poškození imunity sliznice. Dále vede ke zvýšené expresi TNF-α a mRNA v orgánových tkáních se zvýšenou produkcí systémového TNF-α a k poklesu přežití po termickém úrazu (Andel, 2003). Plná parentální výživa se tedy indikuje pouze v případě, kdy pacient není schopen tolerovat enterální výživu. Doplňková parentální výživa přidaná k enterální výživě v prvních dnech po úrazu okamžitě zvyšuje některé nutriční parametry. Ačkoliv se zlepší příjem živin a upraví se některé výživové parametry (jako je retinol vázající protein a prealbumin), nemá to žádný účinek na zlepšení stavu pacienta, spíše naopak. Doplňková parentální strava výrazně zvyšuje riziko úmrtnosti (Andel, 2003). Celková energetická hodnota nutriční podpory je zastoupena ve většině případů z 15 20 % proteiny, ze 40 - 50 % cukry a z 30 – 40 % tuky. V mnoha případech mohou mít specializované přípravky odlišné složení. V nutričním přípravku je obsaženo i definované množství vlákniny, vody a uvedené osmolality. Dále musí obsahovat vitamíny, minerály a stopové prvky, popřípadě další doplňky jako karnitin, taurin. U pacientů s popáleninami je jejich stav komplikován častými zákroky v celkové anestezii (Königová a kol., 1999c). Nejlepší způsob jak řešit problém s hypermetabolismem je podávání výživy bohaté na sacharid a bílkoviny a chudou na tuky, s přídavkem antioxidantů a glutaminu (Hall, 2012).
23
6. Genetika Molekula DNA nesoucí genetickou informaci, je velice rezistentní. DNA je složena ze dvou protichůdných řetězců, které jsou navzájem pojeny vodíkovými můstky. Dvojitá šroubovice vydrží teplotu 900 C a k rozrušení dvojných a trojných vodíkových vazeb dochází až při pH 9-10. DNA je oproti ostatním buněčným strukturám velice odolná. Možné příklady poruchy, ke kterým může docházet po popálení:
při syntéze transkriptů RNA z DNA řetězců může vznikat velké množství transkriptů, závislé na receptorové informaci o ztrátě pevnosti kůže při špatné zpětné vazbě na CNS, blokovaného pevnou traumatickou emocí. Stav je doprovázen otokem, lymfatickou a kapilární stází, změnou místního pH. Experimentálně bylo prokázáno, že během reparačního zánětlivého procesu je nadměrná produkce kolagenu. Problém může být vyřešen časnou kompresí, která zamezuje počty impulsů o nedostatečné pevnosti kůže, zlepší cirkulaci při současném snížení otoku, normalizuje pH a optimalizuje produkci trankriptů.
RNA polymeráza nemá dokonalou schopnost opravy a dělá chyby i za fyziologických podmínek. Při špatném pH se zvyšuje pravděpodobnost výskytu chyb a zvyšuje se produkce patologického kolagenu.
RNA není určená pro stálé uchování informace a po čase zaniká. Jestliže není RNA v čas degradována, je proteinová a kolagenová nadprodukce přirozeným důsledkem rozvoje poruch.
Mediátorová neboli informační RNA (mRNA) řídí tvorbu bílkovin. V případě, že není v buněčném jádře vhodně sestřižena, rozvíjí se kvantitativní a kvalitativní chyby při přepisu do proteinu.
Neinformační RNA má enzymatickou funkci a hraje důležitou úlohu při transportu RNA do proteinu. Nemá schopnost opravy.
Transferová RNA (tRNA) je schopna vybrat správné aminokyseliny a umístit je na příslušné místo v rostoucím proteinovém řetězci. Také může chybovat a zaměňovat aminokyseliny (Bláha, 2006).
24
7. Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza je separační metoda, založená na rozdělování elektricky nabitých látek v roztoku na základě jejich rozdílné pohyblivosti v elektrickém poli. Elektrické pole se vytvoří po vložení stejnosměrného elektrického napětí na elektrody a je funkcí aplikovaného napětí a délky kapiláry (ve voltech/cm). Rychlost migrujících iontů je závislá na velikosti elektroforetické a elektroosmotické pohyblivosti. Elektroforetická rychlost je dána vztahem v = μe * E,
(1)
kde v je rychlost iontu, μe je elektroforetická mobilita a E je intenzita elektrického pole. Elektroforetická mobilita (pohyblivost) je dána rovnováhou mezi hnací silou migrujících iontů (1) a silou tření, kterou klade kapalina (2). Fe = q * E
(2)
Ff = -6 π η r v
(3)
Z rovnováhy rovnic (2) a (3) můžeme vypočítat elektroforetickou mobilitu, která je dána vztahem: μe = q/6 π η r,
(4)
kde q je náboj iontu, η je viskozita roztoku a r je efektivní poloměr iontu. Nabité částice se v elektrickém poli pohybují tím rychleji, čím větší mají náboj a čím jsou menší.
Obr. 5: Tvorba elektrické dvojvrstvy na stěně kapiláry. (převzato z Klouda, 2003) 25
7.1 Elektroosmotický tok (EOF) Po vložení napětí se v kapiláře vytvoří elektroosmotický tok v důsledku vzniku elektrické dvojvrstvy na stěně kapiláry disociací silanolové skupiny (obr. 5). Nejprve dochází k hydrolýze siloxanové skupiny za vzniku silanolové skupiny a k následné disociaci silanolových skupin, čímž se vnitřní povrch kapiláry pokrývá disociovanými křemičitanovými skupinami (≡Si-O-Si≡ → ≡SiOH→ ≡Si-O-). Disociací se stěna kapiláry nabíjí záporně a přitahuje vrstvu kladných iontů elektrolytu tak, aby dosáhla neutrality. Kationty, které se vyskytují ve středu kapiláry, tvoří difúzní proud. V kapalné fázi je konstantní pouze soubor iontů, který těsně přiléhá k rozhraní (kompaktní, Helmholzova vrstva), směrem dovnitř kapiláry (kapalné fáze) orientace částic postupně klesá, tak jak klesá intenzita elektrického pole dvojvrstvy, a stále více se projevuje jako difúzní děj (difúzní vrstva). Po zavedení napětí, kationty začnou migrovat ke katodě a při migraci s sebou strhávají celý roztok, takže jsou ke katodě strhávány i anionty (obr. 6). Velikost elektroosmotické rychlosti můžeme vyjádřit vztahem vEOF = ( ε ζ / η ) E
(5)
μEOF = (ε ζ / η)
(6)
a ze vztahu
můžeme
vypočítat
elektroosmotickou
mobilitu.
VEOF
je
rychlost,
μEOF
mobilita
elektroosmotického toku, ζ zeta potenciál (elektrokinetický potenciál) a ε dielektrická konstanta. (Heiger, 2000) Elektroosmotický tok je parametr, který můžeme kontrolovat a modifikovat podle potřeb a podmínek separace. „Změnou složení roztoku či modifikací povrchu kapiláry změníme rychlost, případně i směr EOF, nebo EOF zcela vyloučíme, zneutralizujeme-li náboj na povrchu kapiláry.“ (Štulík, 2004).
7.1.1 Zeta potenciál Zeta potenciál je dán velikostí náboje na stěně kapiláry. Náboj je závislý na pH, čím je pH vyšší tím je elektroosmotický tok větší, protože stěna kapiláry není protonována. Naopak je-li pH roztoku procházející kapilárou nízké, je i elektroosmotický tok zpomalen v důsledku ionizace stěn kapiláry. Zeta potenciál je také závislý na iontové síle pufru. Zvýšená iontová síla pufru vede ke snížení zeta potenciálu a tím ke snížení elektroosmotického toku (Heiger, 2000).
26
7.2 Instrumentace Zařízení pro kapilární elektroforézu se skládá ze dvou zásobníků s elektrolytem spojených elektrodami, které jsou připojeny na zdroj vysokého elektrického napětí. V každém zásobníku je ponořen jeden konec kapiláry, která je naplněna základním elektrolytem (Obr. 7). Vzorek je dávkován do konce kapiláry vzdálenějšího od detektoru, který je spojený s vyhodnocovacím zařízením. Vzorek může být dávkován několika způsoby a to tlakem, které je nejběžnější, poté rozdílem hladin, které je založena na principu spojitých nádob, anebo elektrokineticky, které je méně používané (Klouda, 2003).
7.2.1 Kapiláry V kapilární elektroforéze se používají křemenné kapiláry s polyimidovým pokrytím, které se v místě detekce odstraňuje. Kapilára má nejčastěji průměru 25 – 75 μm a délku 25 – 75 cm (Heiger, 2000). Výhodou křemenných kapilár je, že neabsorbují v UV oblasti a tudíž můžeme využít UV detektory. Nevýhodou je jejich křehkost (Klouda, 2003).
7.2.2 Detektory Detektory musí být velice citlivé, neboť průměr kapiláry je malý. Nejčastější detektory, které se v kapilární elektroforéze používají, jsou detektory založené na sledování absorpce ultrafialového záření a většinou využívají diodové pole. Další typy, které se využívají, jsou fluorescenční a vodivostní detektory. V současné době se často využívá spojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem. Díky tomu můžeme snadno identifikovat analyt a získat informace o jeho struktuře (Klouda, 2003).
Zdroj vysokého napětí
Kapilára Anoda
Detektor
Pufr
Vzorek
Katoda
Pufr
Obr. 7: Schéma zařízení kapilární elektroforézy 27
Obr. 6: Vznik elektroosmotického toku. (a)negativní změna povrchu křemenné kapiláry, (b) akumulace hydratovaných kationtů ke stěně kapiláry, (c) hromadný tok ke katodě při aplikaci elektrického pole, (převzato a upraveno z Heiger,2000)
28
8. Nukleotidy Z biochemického hlediska se nukleotidy skládají z purinové či pyrimidinové báze, která je napojena na cukr a zbytek kyseliny fosforečné - fosfát (Szitányi, 2007). Nukleotidy jsou důležité intracelulární molekuly, které regulují řadu biologických a biochemickým procesů v buňce a hrají důležitou roli v živých buňkách. Jsou základní buněčné složky, které se podílejí na přenosu energie, regulaci metabolismu, syntéze DNA a RNA (Friedecký a kol., 2007). Buňky jsou schopné sami syntetizovat nukleotidy ale jejich tvorba je energeticky velmi náročná, proto preferují zisk nukleotidů z vnějších zdrojů (Szitányi, 2007).
8.1 Funkce nukleotidů Nukleotidy jsou zdrojem energie v energeticky náročných enzymatických reakcích. Univerzálním přenašečem energie je adenosintrifosfát (ATP) (Obr. 8a) (Friedecký, 2007). Velké množství energie je „zakonzervováno“ ve fosfoanhydridové vazbě. Hydrolýzou anhydridové vazby vzniká adenosindifosfát (ADP) (Obr. 8b), popřípadě adenosinmonofosfát (AMP) (Obr. 8c), a uvolňuje se velké množství energie. Tato uvolněná energie pohání endogenní reakce v celé buňce (Benda, 2006). Nukleotidy dále slouží jako zdroj fosfátu. Pomocí fosfátu se nukleotidy napojují na hydroxyly sacharidů nebo glycerolu a karboxyly aminokyselin a tvoří reaktivní meziprodukty při syntéze sacharidů, proteinů a polárních lipidů (Benda, 2006). Nukleotidy jsou součástí struktury mnoha koenzymů (Szitányi, 2007). Tyto nukleotidy obsahují jako dusíkatou bázi nikotinamid. Příkladem může být NAD+ (obr. 8e), jeho redukovaná forma NADH+ (Obr. 8f), koenzym-A a dalších. Enzymy jsou využívány jako kofaktory v oxidačněredukčních reakcích (Benda, 2006). Některé specifické nukleotidy slouží jako signální buňky. Nejvýznamnější z nich je sekundární přenašeč cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) (Obr. 8d). Vzníká z ATP reakcí katalyzovanou enzymem adenylátcyklasa. Jeho tvorba je spouštěna hladinou metabolitů nebo receptorem, který přijímá extracelulární signál. cAMP se poté naváže jako specifický ligand na regulační protein čímž změní jeho strukturu a moduluje jeho aktivitu (Benda, 2006).
29
Nukleotidy jsou také využívány jako neurotransmitery. Purinové a pyrimidinové deriváty se používají jako antileukemické, antivirální a antirakovinné látky (Friedecký, 2006).
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Obr. 8: Struktura nukleotidů, (a) adenosintrifosfát, (b) adenosindifosfát, (c) adenosinmonofosfát, (d) cyklický adenosinmonofosfát, (e) nikotinamid adenin dinukleotid, (f) nikotinamid adenin dinukleotid redukovaná forma (převzato z www.wikipedie.cz)
30
Experimentální část
31
9. Materiál 9.1 Chemikálie Kyselina
citrónová
(99
%),
kyselina
γ-amimo
máselná
(GABA),
ethanol,
cetyltrimethylamonium bromid (CTAB, 99 %), hydroxid sodný (50 %, 5 % a 1 %), acetonitril, diethylether, kyselina trichloroctová (TCA, 99 %). Všechny chemikálie byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Používala se deionizovaná voda, čehož bylo dosaženo přístrojem Direct-Q 3 od firmy Millipore (Billerica, MA, USA). Adenosin-5´-difosfát (ADP), adenosin-5´-monofosfát (AMP), adenosin-5´-trifosfát (ATP), β-nikotinamidadenindinukleotid (NAD+), β-nikotinamidadenindinukleotid (NADH) redukovaná forma byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldricht (St. Louis, USA).
9.2 Přístrojové vybavení Studované látky byly analyzované pomocí kapilární elektroforézy vybavené automatickým systémem pro nástřik vzorku a UV-Vis detektorem diodového pole (HP3D CE, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Dále byly využity vortex, ultrazvuk, centrifuga, pH metr, pipety a digitální váhy.
9.3 Biologický materiál Pro analýzu byla použita krev (odběr do K2 EDTA zkumavky) od pacienta s popáleninou na 30 % povrchu těla z Popáleninového centra Fakultní nemocnice v Ostravě. Se vzorkem bylo nakládáno jako s potencionálně infekčním materiálem a byly dodržovány všechny bezpečnostní postupy. K použití vzorku i celé studii byl udělen souhlas etické komise FN Ostrava.
9.4 Příprava biologického materiálu Biologický materiál bylo potřeba před analýzou deproteinovat. Deproteinaci byla provedena dvěma způsoby, pomocí kyseliny trichloroctové a pomocí acetonitrilu.
32
9.4.1 Pomocí kyseliny trichloroctové (TCA): 30 μl vzorku bylo smícháno se 60 μl 1mol/l trichloroctové kyseliny a promícháno na vortexu. Směs byla vložena na 30 s do ultrazvuku a poté centrifugována po dobu 1 minuty při 5000 g. Následovala extrakce. K supernatantu bylo přidáno 1,8 ml diethylether, promícháno na vortexu a poté byla odstraněna vodní fáze. Extrakce se opakovala dvakrát. Po extrakci byla okamžitě provedena analýza vzorku, protože vzorek se do 30 minut rozkládá.
9.4.2 Pomocí acetonitrilu (ACN): Deproteinace byla stejná jako u kyselin citrónové ale místo kyseliny citrónové byl použit acetonitril.
9.5 Směs standardů Jako srovnávací vzorek byla použita směs nukleotidů (adenintrifosfát, adenimdifosfát, adeninmonofosfát,
β-nikotinamidadenindinukleotid,
β-nikotinamidadenindinukleotid
redukovaná forma.
9.5.1 Příprava standardů Jednotlivé nukleotidy byly naváženy a naředěny citrátovým pufrem na výslednou koncentraci 1 mg/ml. Poté byly všechny nukleotidy smíchány do roztoku o výsledné koncentraci 0,1mg/ml. Během měření byla koncentrace směsi nukleotidů upravována dle potřeby.
9.6 Příprava elektrolytů Pufr byl připraven smícháním odpovídajícím množstvím kyseliny citrónové a deionizované vody. Za stálého míchání a měření pH bylo upraveno pH na požadovanou hodnotu 4,4 postupným přidáváním kyseliny γ-amino máselné (GABA) do 40 mmol/l roztoku kyseliny trichloroctové. K takto připravenému pufru byl nakonec přidán 0,8 mmol/l CTAB, který vznikl smícháním požadovaného množství CTAB a deionizované vody. Podobným způsobem byl připraven borátový pufr. Odpovídající množství kyseliny borité bylo smícháno s deionizovanou vodou za vzniku 200 mmol/l roztoku. Za stálého míchání bylo upraveno pH roztoku přidáváním 50 % a 10 % roztok hydroxidu sodného na požadovanou hodnotu 9,5. 33
9.7 Instrumentace a experimentální podmínky Všechny analýzy byly prováděny na přístroji HP3D CE s UV-Vis detektorem diodového pole (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) (Obr. 9). Signály byly zpracovány v programu Agilent 35900E dvoukanálovám A/D převodníkem (Agilent Technologies). Byla použita křemenná kapilára (MicroSolv Technolgy, Eatontown, NJ, USA). Celková délka kapiláry byla 33,5 cm s efektivní délkou do UV detektoru 24 cm a o vnitřním průměru 50 μm. (MicroSolv Technology, Eatontown, NJ, USA). Kazeta s kapilárou byla temperována na 25 oC. Aplikované separační napětí bylo – 15 kV. Před každým měřením byla kapilára promyta 1 mol/l NaOH po dobu 2 minut, deonizovanou vodou po dobu 2 minut a nakonec roztokem pufru po dobu 3 minut.
Obr. 9: Fotografie přístroje HP3D CE, Agilent Technologies.
34
10. Výsledky 10.1 Vliv elektrolytu na nukleotidy a biologický materiál Je zřejmé, že výběr vhodného pufru je jedním z hlavních parametrů pro úspěšnou analýzu.
První analýzy probíhaly s použitím 200 mmol/l borátového pufru o pH 9,5. Po
několika analýzách bylo zjištěno, že pufr není vhodný, protože analýza trvala příliš dlouho a výsledky nebyly opakovatelné. Dalším použitým pufrem byl 40 mmol/l citrátový pufr o pH 4,4. Tento pufr byl k analýze směsi standardů i biologického materiálu mnohem vhodnější, avšak separace trvala také velice dlouho. Nejvhodnějším elektrolytem byl 40 mmol/l citrátový pufr o pH 4,4 s přídavkem 0,8 mmol/l CTAB, který obrátil elektroosmotický tok.
10.2 Srovnání deproteinace biologického materiálu (krve) pomocí ACT a TAC DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00017.D) mAU
Deproteinace pomocí TCA
16
14
12
10
8
6
4
2
0 1 DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00025.D)
2
3
4
5
6
min
mAU
Deproteinace pomocí ACN 8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
min
Obr. 10: Deproteinace krevního vzorku pomocí TCA a ACN.
35
Bylo
provedeno
srovnání
dvou
postupů
deproteinace
krevního
séra.
Z elektroforegramů (Obr. 10) je vidět, že k úpravě krevního vzorku je možné využít oba způsoby deproteinace. V našem případě jsme pak používali deproteinaci pomocí TCA, protože poskytovala lepší výtěžnosti analytů (více jak 90 % na rozdíl od ACN, které poskytovalo výtěžnosti do 90 %).
10.3 Analýza standardů nukleotidů a jejich identifikace DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00030.D) mAU
a)
20
17.5
15
12.5
10
7.5
5
2.5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00032.D) mAU
b) 40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
36
DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00033.D) mAU
c) 30
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00035.D) mAU
d)
30
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00038.D) mAU
e) ) )
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
37
DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00040.D) mAU
f)
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
14
min
DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00041.D) mAU
g) 20
17.5
15
12.5
10
7.5
5
2.5
0
0
2
4
6
8
10
12
Obr. 11: Analýza směsi standardů nukleotidů, (a) 0,02 mg/ml směs standardů nukleotidů, (b) 0,02 mg/ml směs standardů nukleotidů s přídavkem AMP, (c) 0,02 mg/ml směs standardů nukleotidů s přídavkem ADP, (d) 0,02 mg/ml směs standardů nukleotidů s přídavkem ATP, (e) 0,02 mg/ml směs standardů nukleotidů s přídavkem cAMP, (g) 0,02 mg/ml směs standardů nukleotidů s přídavkem NAD, (g) 0,02 mg/ml směs standardů nukleotidů s přídavkem NADH.
Pomocí těchto analýz jsme určili pořadí migrace jednotlivých nukleotidů. Pořadí migrace bylo: ATP, ADP, neidentifikovaný pík, NADH, cAMP, AMP a NAD. Neidentifikovaný pík pochází ze standardu NADH, jde pravděpodobně o rozkladný produkt NADH.
38
10.4 Určení meze detekce DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00055.D) mAU
a 5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00064.D) mAU
b
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
Obr. 12: Určení meze detekce, (a) 5 μg/ml směs nukleotidů, (b) 0,5 μg/ml směs nukleotidů
Pro určení nejnižší detekovatelné koncentrace jsme si vytvořili řadu roztoků o různé koncentraci nukleotidů (10 μg/ml, 5 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml a 0,2 μg/ml) a jednotlivé vzorky jsme zanalyzovali. Meze detekce jsou uvedeny v následující tabulce 1.
Tabulka 1: Mez detekce jednotlivých nukleotidů analyt
mez detekce (μg/ml)
ATP ADP AMP cAMP NAD NADH
0,71 0,69 0,55 0,59 0,49 0,68
39
10.5 Určeni opakovatelnosti metody DAD1 D, Sig=254,10 Ref=off (ERYTRO\ERY00049.D) mAU 20
17.5
15
12.5
10
7.5
5
2.5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
Obr. 13: Elektroforegram 0,02 mg/ml směsi standardů nukleotidů.
Dále byla studována opakovatelnost migračních časů a plochy píků při analýze 0,02 mg/ml směsi nukleotidů. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2: Opakovatelnosti migračních časů a ploch píků 0,02 mg/ml směsi nukleotidů opakovatelnost
opakovatelnost ploch
migračních času (% RSD)
píků (% RSD)
ATP
0,27
4,51
ADP
0,24
5,04
AMP
0,21
1,05
camp
0,22
1,57
NAD
0,19
1,72
NADH
0,24
7,09
analyt
Kapilární elektroforéza vykazuje velmi dobrou opakovatelnost pro stanovení vybraných nukleotidů. Opakovatelnost migračních časů byla nižší než 0,27 % RSD. Opakovatelnost ploch píků byla nižší než 7,09 % RSD.
40
11. Závěr V této práci jsme dokázali, že kapilární elektroforéza je jako metoda vhodná pro studium biologicky aktivních látek. V rámci této práce jsme upravili a otestovali kapilárně elektroforetickou metodu pro stanovení nukleotidů ve vzorcích krve popálených pacientů. Testovali jsme základní parametry validace metody, tak abychom tuto metodu mohli použít pro analýzy krve dalších pacientů v rámci spolupráce s Popáleninovým centrem Fakultní nemocnice v Ostravě. Vyvinutá metoda tak umožní blíže studovat metabolické změny v rámci popáleninového úrazu.
41
12. Seznam použité literatury Andel H., Kamolz L. P., Hörauf K., Zimpfer M. (2003) Nutrition and anabolic agents in burned patiens, Burns 29, 592-595 Bláha J. (2006) Physiology and patology of skin after burns and derangement of gene expression, Acta Chir. Plast. 48, 127-132 Friedecký D., Tomková J., Maier V., Janošťáková A., Procházka M., Adam T. (2007) Capillary electroforetic method for nukleotide analysis in cells: Application on inherited metabolic disorders, Electrophoresis 28, 373-380 Gangemi E. N., Garino F., Berchialla P., Martinese M., Arecco F., Orlandi F., Stella M. (2008) Low triiodothyronine serum levels as a predictor poor prognosis in burn patiens, Burns 34, 817-824 Gore D. C., Chinkes D. L., Hart D. W., Wolf S. E, Herndon D. N, Sanford A. P. (2002) Hyperglycemia exacerbates muscle protein catabolism in burn-injured patiens, Crit. Care Med. 30, 2438 – 2442 Hall K. L., Shahrokhi S., Jeschke M. G. (2012) Enteral nutrition support in burn care: A review of current recommendations as instituted in the ross tilley burn centre, Nutrients 4, 1554 -1565 Heiger D. (2000) High performance capillary electrophoresis, pp. 17 – 23, Agilent Technologies, Germany Herndon D. N., Tompkins R. G. (2004) Support of metabolic response to burn injury, Lancet 363, 1895-1902 Chioléro R., Revelly J. P., Tappy L. (1997) Energy metabolism in sepsis and injury, Nutrition 13, 45 – 51 Jeschke M. G., Mlcak R. P., Finnerty C. C., Norbury W. B., Gauglitz G.G., Kulp G. A. and Herndon D. N. (2007) Burn size determines the inflammatory and hypermetabolic response, Crit. Care 11 Klouda P. (2003) Moderní analytické metody, str. 34 – 35, Pavel Klouda, Ostrava
42
Königová R. a kol. (1999a) Komplexní léčba popálenin, str. 15 – 16, Grada Publishing, Praha Königová R. a kol. (1999b) Komplexní léčba popálenin, str. 32 – 33, Grada Publishing, Praha Königová R. a kol. (1999c) Komplexní léčba popálenin, str. 265 – 294, Grada Publishing, Praha Königová R., J. Bláha a kol. (2010a) Komplexní léčba popáleninového traumatu, str. 15 – 16, Karolinum, Praha Königová R., J. Bláha a kol. (2010b) Komplexní léčba popáleninového traumatu, str. 50 - 53 Karolinum, Praha Königová R., J. Bláha a kol. (2010c) Komplexní léčba popáleninového traumatu, str. 296 – 303, Karolinum, Praha Kraft R., Herndon D. N., Kulp G. A., Mecott G. A., Trentzsch H. and Jeschke M. G. (2011) Retinol binding protein: Marker for insulin resistence and inflammation postburn?, J. Parenter. Enteral Nutr., 35, 695-703 Lüllmann-Rauch R. (2012) Histologie, str. 452 – 460, Grada Publishing, Praha Mager R., Brychta P., Kaloudová Y.: Klinická studie debrase – první zkušenosti, 11. Výroční konference České společnosti popáleninové medicíny, Brno 2005, str. 24 Matek J., Zeman M. a kol., První pomoc pro bakaláře, Univerzita Karlova Praha Novotný I., Hruška M. (2008) Biologie člověka, 4. Vyd., str. 102 – 104, Fortuna, Praha Rodriguez N. A., Jeschke M. G., Williams F. N., Kamolz L. P. and Herndon D. N. (2011) Nutrition in Burns : Galveston Contributions, J. Parenter. Enteral Nutr., 35, 704-714 Sticker S. (2012) Anatomický atlas, str. 1 – 16, Svojtka & Co., Praha Stockleyová C., Oxlade Ch., Wertheimová J. (2003) Velká encyklopedie vědy, 2. Vyd., str. 340 – 341, Fragment, Český Těšín Šimko Š., Kollár J. a kol. (1992a) Popáleniny, str. 9, Osveta, Martin Šimko Š., Kollár J. a kol. (1992b) Popáleniny, str. 17, Osveta, Martin 43
Šimko Š., Kollár J. a kol. (1992c) Popáleniny, str. 100 – 105, Osveta, Martin Štulík K. a kolektiv (2004) Analytické separační metody, str. 39 – 42, Karolinum, Praha Tuvdendorj D., Chinkes D. L., Zhang X. J., Ferrando A. A., Elijah I. E., Mlcak R. P., Finnerty C. C., Wolfe R. R., Herndon D. N. (2011) Adult patiens are more catabolic than children during acute phase after burn injury: a retrospective analysis on muscle protein kinetics, Intensive Care Med., 37, 1317 - 1322
Elektronické zdroje: Benda V., Babůrek I., Kotrba P. (2006) Základy biologie, 1. Vyd, Vysoká škola chemickotechnologická
v Praze,
Praha,
(online),
dostupné
na:
(http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_isbn-80-7080-587-0/pdf/032.pdf) strana 32 (citováno 2013-03-5) Brychta P., Franců M. a kol.: Vybrané kapitoly z plastické chirurgie a popáleninové medicíny (online) dostupné na: http://www.med.muni.cz/Traumatologie/Popaleniny/Popaleniny.htm (citováno 2013-03-01) http://www.epomed.cz/rubriky/vyuka/hodnoceni-zavaznosti/ (citováno 2013-02-10) http://www.pharmanews.cz/2007_02/popaleniny.html (citováno 2013-02-19) Morovicsová E.: Ošetřovatelská péče o nemocné s popáleninami, Sestra 9/2009, online, dostupné
na:
http://zdravi.e15.cz/clanek/sestra/osetrovatelska-pece-o-nemocne-s-
popaleninami-444803 (citováno 2013-03-01) Szitányi P., Nevoral J. (2007) Nukleotidy ve výživě, Nutricia babyfood, (online) dostupné na: http://nutriciamedical.cz/download/noviny_1_kveten.pdf (citováno 2013-03-5)
44
