Univerzita Palackého v Olomouci. Diplomová práce

Univerzita Palackého v Olomouci

Diplomová práce

Olomouc 2013

Pavel Flídr

Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie a genetiky

Expresní profil protoplastových kultur

Diplomová práce

Pavel Flídr Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie Forma studia: prezenční

Olomouc 2013

Vedoucí práce: doc. RNDr. Vladan Ondřej, Ph.D.

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci s názvem Expresní profil protoplastových kultur vypracoval samostatně pod vedením mého školitele doc. RNDr. Vladana Ondřeje, Ph.D. a že jsem pro její vypracování použil pouze uvedené zdroje.

V Olomouci dne:

Pavel Flídr

Poděkování: Tímto chci poděkovat svému školiteli doc. RNDr. Vladanovi Ondřejovi, Ph.D. za odborné vedení mé diplomové práce, cenné připomínky a pomoc při získání a zpracování výsledků experimentální části mé práce. Poděkování patří také celému pracovnímu kolektivu laboratoře katedry botaniky za pomoc a utvoření příjemného pracovního prostředí.

Souhrn Protoplasty jsou buňky zbavené buněčné stěny, které prošly procesem dediferenciace a vykazují schopnost regenerovat v jakýkoli typ rostlinného pletiva. Během regenerace musí znovu vystavět buněčnou stěnu a vstoupit do buněčného cyklu. V průběhu regenerace je pak buňka vystavena vysoké hladině reaktivních forem kyslíku. Aby nedošlo k poškození buněčných struktur, musí protoplasty reagovat zvýšením tvorby enzymů antioxidativního systému. V této práci byla metodou kvantitativní real-time RT-PCR srovnávána exprese genů pro katalázy, superoxid dismutázy a lipoxygenázy u listů a protoplastů během prvních 72 hodin kultivace. Produkty těchto genů jsou zapojeny do systému obrany proti oxidativnímu stresu a odpovědi na napadení patogenem. Během kultivace protoplastů došlo u většiny sledovaných genů k výraznému nárůstu exprese, což odráží potřebu buňky regulovat zvýšenou hladinu reaktivních forem kyslíku.

Summary Protoplasts are plant cells with completely removed cell wall, which goes through the process of cellular dedifferentiation. It means that protoplasts are able to redifferentiate into any kind of plant tissue. During regeneration process, cells have to generate new cell wall and re-enter the cell cycle. Protoplast regeneration is accompanied by high level of reactive oxygen species. To prevent cell structure damage, protoplasts increase antioxidant enzymes gene expression. In this work, real-time quantitative reversetranscription PCR analysis was used to compare expression level of catalase, superoxid dismutase and lipoxygenase genes between the fresh leaf and protoplasts within the first 72 hours after isolation. These gene products are involved in oxidative stress defense system and pathogenesis defense system. During protoplast cultivation, most of observed genes markedly increase expression, which reflects urgency to regulate high reactive oxygen species level.

Obsah 1. Cíle práce ......................................................................................................................8 2. Úvod..............................................................................................................................9 3. Současný stav řešené problematiky ........................................................................... 10 3.1 Regenerativní schopnost rostlin ............................................................................. 10 3.2 Změny struktury chromatinu po dediferenciaci ..................................................... 10 3.3 Vliv rostlinných hormonů na kultivaci protoplastů ............................................... 11 3.4 Resyntéza buněčné stěny protoplastů ..................................................................... 12 3. 4. 1 Stavba buněčné stěny ..................................................................................... 12 3. 4. 2 Studium proteinů zapojených do syntézy buněčné stěny protoplastů ............... 13 3.5 Podobnost senescentní a dediferencované buňky .................................................. 16 3.6 Protoplasty a oxidativní stres ................................................................................. 17 3.6.1 Reaktivní kyslíkaté radikály ............................................................................. 17 3.6.2 Kyslíkaté radikály a regenerace protoplastů...................................................... 17 3.6.3 Superoxid dismuázy ......................................................................................... 18 3.6.4 Katalázy a peroxidázy ...................................................................................... 19 3.6.5 Lipoxygenázy................................................................................................... 20 3.6.6 Geny PR1 a RBOHC ........................................................................................ 20 4 Materiál a metody ....................................................................................................... 22 4.1 Biologický materiál ................................................................................................ 22 4.2 Seznam použitých chemikálií ................................................................................. 22 4.3 Seznam použitých médií a roztoků ......................................................................... 22 4.4 Seznam použitých komerčních kitů........................................................................ 23 4.5 Přístrojové vybavení laboratoře ............................................................................. 23 4.6 Pěstování pokusných rostlin .................................................................................. 24 4.7 Izolace protoplastů ................................................................................................. 24 4.8 Měření koncentrace a životnosti protoplastů ......................................................... 25 4.9 Kultivace protoplastových kultur ........................................................................... 25 4.10 Izolace genomické DNA....................................................................................... 25 4.11 Izolace mRNA ...................................................................................................... 26 4.12 DNasa .................................................................................................................. 26 4.13 Reverzní transkripce ............................................................................................ 27

4.14 PCR a elektroforetická separace .......................................................................... 27 4.15 qPCR.................................................................................................................... 28 5. Výsledky ..................................................................................................................... 30 5.1 Izolace, četnost a životnost protoplastů .................................................................. 30 5.2 Kultivace protoplastů ............................................................................................. 31 5.3 Izolace nukleových kyselin, reverzní transkripce ................................................... 31 5.4 Exprese studovaných genů .................................................................................... 33 5.4.1 Exprese genů kódujících katalázy ..................................................................... 33 5.4.2 Exprese genů kódujících superoxid dismutázy.................................................. 36 5.4.3 Exprese genu RBOHC...................................................................................... 39 5.4.4 Exprese genů kódujících lipoxygenázy ............................................................. 40 5.4.5 Exprese genu PR1 ............................................................................................ 41 5.5 Exprese genů použitelných jako kalibrace ............................................................. 42 5.6 Srovnání exprese studovaných genů v listu ........................................................... 45 6. Diskuze ....................................................................................................................... 46 7. Seznam použitých zkratek ......................................................................................... 49 8. Závěr........................................................................................................................... 50 9. Seznam použité literatury .......................................................................................... 51

1. Cíle práce Cílem této práce je shromáždit dostupnou literaturu a napsat rešerši na téma expresní profil protoplastových kultur. Dále pak zvládnout techniky izolace a kultivace protoplastů Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. a pomocí metod izolace RNA, RT-PCR a kvantitativní real-time RT-PCR popsat průběh exprese vybraných genů, zejména pak genů zapojených do procesů buněčné odpovědi na oxidativní stres, u regenerujících mezofylových protoplastů. Tyto hodnoty pak porovnat s expresí daných genů v listech.

8

2. Úvod Protoplastem je nazývána rostlinná buňka, případně buňka hub nebo bakterií, která je zbavena buněčné stěny, a její povrch kryje pouze plazmatická membrána. Buněčná stěna byla dříve odstraňována mechanicky, takto izolované protoplasty však nebylo možné kultivovat. Dnes jsou protoplasty izolovány výhradně pomocí působení lytických enzymů, což umožňuje reproduktibilní práci s kulturami protoplastů o vysoké hustotě buněk izolovaných s různých pletiv donorového organismu. Šetrné odstranění buněčné stěny pomocí enzymů taktéž umožnilo rozvoj kultivačních technik vedoucích až k regeneraci celé rostliny z jediného protoplastu. Vlivem ztráty buněčné stěny totiž projde protoplast dediferenciací a může za působení určitých růstových regulátorů, podobně jako kmenové buňky, rediferencovat v jakýkoli typ rostlinného pletiva. Bez buněčné stěny lze u protoplastů také indukovat buněčnou fúzi. Absence stěny jako mechanické bariéry také umožňuje snadnější vnášení cizorodé DNA, a lze tak relativně snadno transformovat jadernou DNA. Tímto se dostávají protoplasty do popředí zájmu při výzkumu buněčné diferenciace, somatické hybridizace a tvorbě cybridů, nebo transformace rostlin (Davey et al., 2005). Rostlinná buňka je po protoplastizaci nucena obnovit buněčnou stěnu a znovu se zapojit do pochodů buněčného cyklu zakončených buněčným dělením. Samotné odstranění a tvorba nové buněčné stěny jsou provázeny zvýšenou tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS), jako jsou superoxidový a hydroxylový radikál či peroxid vodíku. Buňka protoplastu je tak vystavena extrémnímu oxidativnímu stresu, s kterým se může vyrovnat zvýšením produkce antioxidantů nebo enzymů katalyzujících redukci volných kyslíkatých radikálů, jako jsou superoxid dismutáza nebo kataláza. Dediferenciaci, stejně jako obranu proti oxidativnímu stresu, resyntézu buněčné stěny a vstup do buněčného cyklu, tak provázejí četné změny na úrovni organizace chromosomů a na úrovni genové exprese. Jako vhodný model pro studium těchto změn se jeví huseníček rolní (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) Má malý počet chromosomů (2n=10), většina jeho genů je známá a podrobně popsaná, a byly vyvinuty spolehlivé postupy kultivace protoplastů až do stadia dospělé rostliny (O´Ńeill et Mathias, 1993)

9

3. Současný stav řešené problematiky

3.1 Regenerativní schopnost rostlin Vysoká regenerativní schopnost rostlin je podmíněná určitou mírou plasticity diferencovaných somatických buněk, které jsou schopné za určitých podmínek dediferencovat a regenerovat pak v závislosti na hormonální signalizaci v jakýkoliv typ rostlinného pletiva. Tato schopnost je potlačena jen ve velmi specializovaných pletivech, jejichž buňky, například v případě sítkovic, ztrácejí jádro, nebo v případě trachejí zcela odumře protoplast. Dediferenciace je pak spojena s charakteristickými změnami na úrovní genové exprese, kdy buňka upouští od exprese genů spojených se specializovanými funkcemi diferencovaného pletiva a naopak spouští expresi genů nutných pro vstup do buněčného cyklu, rediferenciaci v jiný typ pletiva nebo ke spuštění mašinerie vedoucí k buněčné smrti. Rovněž dochází ke značné reorganizaci struktury chromatinu a změnám v oblasti jadérka. Vysoce dekondenzovaný chromatin je společným znakem jak rostlinných, tak živočišných kmenových buněk (Grafi, 2004; Grafi et al., 2011).

3.2 Změny struktury chromatinu po dediferenciaci Základní strukturní jednotka chromatinu formovaného v chromosomy je nukleosom tvořený vláknem DNA obtáčejícím 4 páry bílkovin histonů H2A, H2B, H3 a H4. Vlákno chromatinu je vlivem proteinových interakcí podle potřeby buňky různě kondensované. V případě transkripčně aktivních oblastí, kdy je vlákno značně rozvolněno, mluvíme o euchromatinu. Heterochromatin je oblast s velkou mírou kondenzace chromatinu. Obsahuje oblasti s velmi malou nebo žádnou transkripční aktivitou, tedy oblasti repetic, oblasti kolem centromer a telomer. Dynamické změny struktury chromatinu jsou ovlivněné modifikacemi DNA a aminoterminálních konců histonů (Grafi, 2004). Na rozdíl od špatně barvitelného euchromatinu lze heterochromatin obarvit např. fluorescenčním barvivem DAPI a vizualizovat pomocí fluorescenční mikroskopie. V interfázním jádře pak tvoří heterochromatin dobře barvitelné shluky, tzv. chromocentra. Diferencovaná buňka huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) má několik dobře rozlišitelných chromocenter. Jedná se o pericentrické regiony všech chromosomů a také například

vysoce

kondensované

subtelomerické

45S

ribozomální

repetice

na chromosomech 2 a 4. Tyto chromocentra pak nesou značky epigenetického umlčení genů, jako jsou metylace DNA a dimetylace histonů H3K9 (Fransz et al., 2002). 10

Během procesu protoplastizace a s tím spojené dediferenciace však dochází ihned k masivní dekondenzaci chromocenter. Jejich zpětná rekondenzace je pak mnohem pomalejší proces a závisí na stupni regenerace protoplastu. Zajímavým fenoménem je pak hladina metylace DNA, která se během rozvolnění heterochromatinu nemění. Taktéž nemusí dekondenzace heterochromatinu způsobená dediferenciací buňky vést k aktivaci exprese umlčených genů (Tessadori et al., 2007; Ondřej et al., 2010). Ondřej et al. (2010) také pozoruje korelace mezi rychlostí rekondenzace chromocenter a mírou oxidativního stresu způsobeného reaktivními kyslíkovými radikály. Ošetřením protoplastové kultury antioxidantem kyselinou askorbovou docílil snížení míry oxidativního stresu stimulací exprese askorbát peroxidázy a katalázy, což vedlo k větší míře rekondenzace chromocenter v porovnání s neošetřenou kulturou protoplastů.

3.3 Vliv rostlinných hormonů na kultivaci protoplastů Přítomnost rostlinných hormonů auxinů a cytokininů v kultivačním médiu je jednou ze základních podmínek pro udržení životaschopné kultury protoplastů a jejich úspěšný vstup do buněčného cyklu zakončeného buněčným dělením. Tyto hormony hrají majoritní roli v regulaci vývoje rostlin a jsou nenahraditelné při studiu regulace buněčného dělení in vitro. Čerstvě izolované mezofylové protoplasty se nacházejí převážně v G0 fázi buněčného cyklu. Kultivací v médiu obsahujícím auxiny a cytokininy dochází k iniciaci buněčného cyklu a v případě protoplastů tabáku dochází k dělení buněk již po 36 hodinách kultivace. Protoplasty tabáku kultivované v médiu neobsahujícím jeden z hormonů vykazují minimální četnost buněčného dělení. Přítomnost auxinů je esenciální už v raných fázích kultivace, kdežto přítomnost cytokininů je nutná až přibližně 10 hodin po izolaci. Přechod protoplastu do S fáze buněčného cyklu je na molekulární úrovni doprovázen např. zvýšením exprese genu pro histon H3, pozorovatelném již 18 hodin od izolace nebo expresí cyklin-dependentní kinázy cdc2, pozorovatelné ještě o 6 hodin dříve (Carle et al., 1998) Pasternak et al. (2002) poukazuje na rozdíly v morfogenezi regenerujících protoplastů při různé koncentraci auxinů a stres indukujících látek. Protoplasty tolice vojtěšky (Medicago sativa L.) kultivované v médiu s vysokou koncentrací auxinů (1µM 2,4-D) vykazují během 4 dnů kultivace dlouživý růst a dochází k výraznému zvětšení objemu centrální vakuoly. Mnoho z takto kultivovaných protoplastů později odumře, a to i

11

v případě přenesení do plnohodnotného kultivačního média. Protoplasty kultivované při koncentraci 2,4-D 10 µM zůstávají kulovité s větším množstvím malých vakuol bohatých na proteiny a nevykazují tendence k morfologicky asymetrickému dělení. Podobnou stavbu také vykazují protoplasty kultivované při nízké koncentraci auxinů, avšak s přídavkem 1mM Fe ve formě Fe-EDTA. Přídavek železa totiž během prvních 3 dnů kultivace výrazně zvyšuje aktivitu askorbát peroxidázy reagující na vzniklý oxidativní stres, který se jeví jako jedna z příčin dediferenciace. Za takovýchto podmínek tvoří protoplasty po přenesení do média s 1 µM 2,4-D globulární proembryu podobné struktury. Protoplasty dlouhodobě kultivované při vysoké koncentraci auxinů nebo železa se morfologicky nemění po dlouhou dobu, schopnost dělení a tvorby mikrokalusů je však značně inhibována.

Obr. č. 1: Základní schéma reakce protoplastu na obsah hormonů v kultivačním médiu. Upraveno dle Grafi (2004).

3.4 Resyntéza buněčné stěny protoplastů

3. 4. 1 Stavba buněčné stěny Jednou ze základních podmínek, se kterými se musí regenerující protoplast vyrovnat před vstupem do buněčného cyklu, je kompletní resyntéza buněčné stěny. Buněčná stěna je tenká dynamická struktura na povrchu buňky složená převážně z polysacharidů a proteinů, vymezující tvar a velikost buňky. Její přesné chemické složení je závislé na druhu rostliny, typu pletiva, vývojovém stádiu a věku buňky, růstových podmínkách, ale také na vnitrodruhové genetické variabilitě. Drobné změny v této 12

struktuře mohou být určitým znakem identity jednotlivých buněk a mohou hrát roli v různých biologických procesech, jako je růst a diferenciace, nebo odpověď na abiotický stres a napadení jiným organismem (Yang et al., 2008). Podle struktury, funkce a způsobu tvorby, lze rozdělit buněčnou stěnu na 3 vrstvy. První vrstvou směrem od extracelulárního prostoru je tzv. střední lamela. Syntéza této části začíná již v telofázi buněčného dělení, kdy v oblasti fragmoplastu splývají váčky původem z Golgiho aparátu obsahující pektiny, což jsou polymery kyseliny α-D-galakturonové. Druhou vrstvou je ontologicky mladší primární stěna, která se začíná tvořit již během expansního růstu buňky. Zprvu je elastická, později plastická. Vzniká pomocí exocytosy sekretorických váčků původem z Golgiho aparátu, které obsahují xyloglukany (dříve hemicelulosy) a pektiny (Luštinec et Žárský, 2005). Xyloglukany, arabinoxylany a mannny tvoří síť propojující mikrofibrily celulosy. Celulosa je jako majoritní složka buněčných stěn, a tím veškeré rostlinné biomasy, syntetizována hexamerickými komplexy celulázasyntásy lokalizované v plasmatické membráně. Pektiny jako rhamnogalakturonan, homogalakturonan, xylogalakturonan nebo arabinogalaktan tvoří spolu s xyloglukany kovalentní zesíťování (Cosgrove, 2005). Ukládáním nových vrstev pod primární stěnu vzniká u některých buněk stěna sekundární obsahující kromě celulosy také velké množství ligninu dodávajícího stěně odolnost při zachování její pružnosti. Ukládání ligninu do sekundární stěny je podstatou dřevnatění. Proteiny mají ve složení buněčné stěny pouze minoritní podíl, jejich různorodost je však důvodem obrovské rozmanitosti ve vlastnostech, funkčnosti a dynamice stěny (Chivasa et al., 2002). Díky pokroku v proteomice jsou dnes známy stovky proteinů podílejících se na stavbě buněčné stěny nebo katalyzující reakce spojené se syntézou polysacharidových složek stěny. S nejdůležitějších lze uvést kromě komplexů celulosasyntásy, zajišťující tvorbu základního stavebního prvku stěny, také expansin, xyloglukan endotransglykosylázu/hydrolázu a galaktosidázy.

3. 4. 2 Studium proteinů zapojených do syntézy buněčné stěny protoplastů Existuje více způsobů a metod studia proteinů zapojených do syntézy buněčné stěny. Jednou z možností studia komplexity syntetických reakcí a studia samotných strukturních proteinů obsažených v buněčné stěně je proteomická analýza. Další možnosti, umožňující studovat zejména dynamiku syntézy jednotlivých prvků, nabízejí metody studia transkriptomu. Kwon et al. (2005) provedl proteomickou analýzu apoplastických bílkovin huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) sekretovaných do prostoru buněčné stěny, a to 13

zvlášť u buněčné suspenze regenerujících protoplastů 1 hodinu od izolace a protoplastů stáří 3 hodiny od izolace. Použitím dvojdimenzionální polyakrylamidové elektroforézy a MALDI-TOF analýzy pozoroval u regenerujících protoplastů určitou progresi v množství proteinů buněčné stěny. Identifikoval 71 proteinů podílejících se na stavbě buněčné stěny buněčné suspenze, 175 proteinů u protoplastů stáří 1 hodiny a 212 proteinů u protoplastů starých 3 hodiny. Z těchto identifikovaných proteinů byla vždy téměř polovina specifických pro studovaný vzorek. Taktéž zjistil, že mnohé z identifikovaných proteinů podléhaly posttranslačním modifikacím, zejména fosforylaci a glykosilaci. Z proteinů izolovaných z regenerujících protoplastů, které nebyly identifikovány u nativních buněk buněčné suspenze, lze uvést např. chitinázu, β-glukosidázu nebo glutamát dehydrogenázu. Jiný přístup studia resyntézy buněčné stěny, tentokrát na úrovni transkripce, zvolil Oomen et al. (2003). Ke studiu exprese kandidátních genů zapojených do biosyntézy primární buněčné stěny použil metodu cDNA-AFLP. Studii provedl na protoplastech lilku amerického (Solanum americanum Mill.) stáří 0, 3, 6, 12 a 18 hodin od izolace, kdy měla většina protoplastů stěnu obnovenou. Výsledky srovnával s in vitro rostoucími rostlinami a s fyzicky poškozenými rostlinami. Vybral a osekvenoval 156 transkripčních fragmentů, které vykazovaly změnu exprese během 18 hodin izolace protoplastů. 37% studovaných fragmentů vykazovalo vzrůstající expresi, 27% pak klesající. U velké části studovaných fragmentů však nebylo možné přirovnat sekvence k tehdy známým genům. Sekvence, u nichž byla zjištěna homologie se známými geny, rozdělil do několika skupin. Překvapující bylo zjištění, že pouze jeden studovaný fragment, identifikovaný jako pektin esteráza, bylo možné přiřadit přímo k syntéze buněčné stěny. Ostatní fragmenty pak byly určeny jako geny zapojené do metabolismu proteinů, reakce na stres či poškození, geny ovlivňující růst a vývoj, buněčný transport nebo regulační geny. Tato práce ukázala, že syntéza buněčné stěny nemusí být doprovázena výraznými změnami úrovně exprese genů, jejichž produkty se na syntéze přímo podílejí. Yang et al. (2008) využil ve své studii dynamiky exprese genů syntézy buněčné stěny u protoplastů bavlníku Gossypium hirsutum L. metodu subtraktivní hybridizace a makroarray. Metoda je založena na selektivní amplifikaci genů s rozdílnou mírou exprese mezi vzorkem a kontrolou. Takto se podařilo vytvořit u protoplastů stáří 0, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48 a 72 hodin knihovnu SSH konstruktů. Z těchto cDNA konstruktů byl pak na hybridizační membráně vytvořen makroarray a zjištěna míra exprese. Geny vykazující rozdíly v expresi byly osekvenovány a identifikovány porovnáním v databázi GenBank.

14

Podle získaných dat byly geny rozděleny do několika klastrů podle funkce a expresního profilu. Získané poznatky shrnuje v modelu regenerace buněčné stěny bavlníku (Obr. č.2).

Obr. č. 2: Model regenerace buněčné stěny protoplastů bavlníku založený na studiu exprese genů a jejich funkčním rozdělení. Upraveno dle Yang et al. (2008). Podle exprese dělí Yang et al.(2008) geny do čtyř klastrů. První skupina reprezentuje geny vykazující nejvyšší míru exprese v iniciální fázi syntézy buněčné stěny, tedy 3 až 6 hodin od izolace protoplastů. Největší funkční podskupinu genů exprimovaných v rané fázi regenerujících protoplastů tvoří různorodé transkripční faktory, jako proteiny rodin MYB, WRKY nebo proteiny zinkových prstů rodiny CCCH i C3HC4. Kromě transkripčních faktorů se mezi ranně exprimovanými geny objevuje také tonoplast intrinsic protein zapojený do transmembránového transportu, auxin responsivní gen, protein kináza, superoxid dismutáza MSD1 nebo strukturní proteiny buněčné stěny, jako jsou nodulin nebo expansin-like protein. Druhá skupina reprezentuje geny exprimované během střední fáze regenerace buněčné stěny 12 až 18 hodin od izolace. Do této skupiny patří geny strukturních proteinů bohatých na prolin (PRP) a glycin (GRP), oxidoreduktáza ATB2, antioxidant peroxyredoxin nebo transkripční faktor ANAC016. Třetí skupinu tvoří pozdně exprimované geny zapojené do výstavby a přestavby sekundární buněčné stěny, jako je fasciclin-like arabinogalaktan protein (FLA2) nebo lakáza, dále například transkripční faktor SUS2 nebo o-methyltransferáza. Jako zástupce posledního klastru

15

zahrnujícího geny overexprimované rovnoměrně po celou dobu kultivace protoplastů lze uvést osmotin, aktin nebo S-adenosylmethionin dekarboxylázu zapojenou v biosyntéze polyaminů.

3.5 Podobnost senescentní a dediferencované buňky K expresi transkripčních faktorů v rané fázi regenerace protoplastů se vrací Grafi et al. (2011). Použitím microarray technologií srovnal expresi desítek transkripčních faktorů protoplastů huseníčku rolního (Arabidopsi thaliana) s expresí ve stresovaných buňkách, senescentních buňkách a v kmenových buňkách apikálního meristému. Porovnávané transkripční faktory náležely převážně do rodiny WRKY, ANAC a b-ZIP. Skupina WRKY je jednou z největších rodin transkripčních faktorů regulujících mnoho fyziologických pochodů. Proteiny této rodiny fungují jako aktivátory i jako inhibitory. Mohou interagovat s mnoha jinými regulačními proteiny, jako jsou MAP kinázy, 14.3.3. proteiny nebo kalmodulin. Často jsou asociovány s imunitní odpovědí rostliny na biotický i abiotický stres. Spoluvytvářejí síť regulace transkripce s množstvím smyček zpětné vazby (Eulgem et Somssich, 2007). Proteiny ANAC jsou podskupinou rodiny transkripčních faktorů NAC obsahujících konzervativní N-terminální NAC doménu. Tyto regulátory jsou zapojeny ve vývojových procesech apikálních meristémů nebo obranných reakcích a v odpovědi na hormonální regulaci (Ernst et al., 2004). Rodina b-ZIP sdružuje homo či heterodimerní proteiny s DNA vazebnou b-ZIP doménou. Proteiny z této skupiny se podílejí na regulaci procesů obrany proti patogenům, na stresové a světelné signalizaci nebo na vývoji květu (Jakoby et al., 2002) Studované geny pro transkripční regulátory byly v protoplastech oproti listu výrazně více exprimovány. Míra exprese u protoplastů také vykazuje téměř shodné výsledky jako u senescentních a stresovaných buněk. Na základě tohoto zjištění vyslovil Grafi et al. (2011) hypotézu, že senescentní somatické buňky projdou před smrtí nejprve procesem dediferenciace, kdy lze ještě vlivem endogenních signálů a vlivem prostředí zvrátit jejich osud a znovu nastartovat procesy transdiferenciace nebo vstup do buněčného cyklu.

16

3.6 Protoplasty a oxidativní stres

3.6.1 Reaktivní kyslíkaté radikály Za fyziologických podmínek tvoří metabolicky aktivní rostlinná buňka množství reaktivních forem kyslíku (ROS, reactive oxygen species). Jejich tvorba začíná aktivací molekulárního kyslíku, kdy přenosem energie slunečního záření při fotosyntéze dochází ke tvorbě singletového kyslíku 1O2. Singletový kyslík je pak v buňce postupně redukován za vzniku superoxidového radikálu O2 •-, hydroxylového radikálu OH•, peroxidu vodíku a v konečné fázi vody. Vysoká hladina reaktivních buněk kyslíku je průvodním jevem stresových situací, a pokud není antioxidačním systémem buňky včas regulována, může dojít k oxidativnímu poškození membrán, oxidaci proteinů, inaktivaci enzymů a poškození dědičné informace. Vysoká a neregulovaná hladina ROS tedy může vést až ke zhroucení celého systému a buněčné smrti. Některé z těchto sloučenin ale hrají významnou roli v buněčné signalizaci a v obranných mechanismech rostliny. Proto je nutné, aby rostliny produkcí antioxidantů a enzymů katalyzujících vzájemné přeměny radikálů udržely v buněčném prostoru redoxní

homeostázu (Piterková et

al.,

2005).

Hlavními

antioxidačními enzymy jsou superoxid dismutázy (EC 1.15.1.1) katalyzující redukci superoxidového radikálu na peroxid vodíku, vzniklý peroxid je pak eliminován peroxidázami (EC 1.11.1.7), katalázami (EC 1.11.1.6) a enzymy Halliwell-Asadova cyklu askorbát peroxidázou (EC 1.11.1.11) a glutathion reduktázou (EC 1.6.4.2) (Papadakis et al., 2002).

3.6.2 Kyslíkaté radikály a regenerace protoplastů Jedním ze zdrojů reaktivních radikálů je samotná izolace protoplastů pomocí enzymů. Dochází během ní vlivem činnosti endoxylanáz obsažených v mixu celuláz a pektináz k tvorbě určitého množství superoxidového radikálu. Dalším zdrojem je zvýšený metabolismus cukrů. Určité množství reaktivních forem kyslíku je však pro regenerující protoplasty nezbytné. ROS hrají důležitou roli při regeneraci buněčné stěny. Metabolickou cestou vzniklé radikály totiž můžou např. ve formě peroxidu vodíku sloužit jako substrát peroxidáz regulujících zesíťování strukturních proteinů buněčné stěny, jako jsou extensiny, nebo hrajících roli v biosyntéze ligninu a suberinu. V regenerujících protoplastech byla zaznamenána exprese několika peroxidáz, které nebyly v listu detekované. Hydroxylový radikál zase hraje roli při rozkladu polymerů buněčné stěny

17

v průběhu její reorganizace během buněčného dělení a růstu. Jednou z podmínek úspěšného dělení je totiž plasticita buněčné stěny zajištěná právě činností peroxidáz. Nerovnováha mezi množstvím ROS a množstvím antioxidantů může vést u protoplastů k procesu zvanému rekalcitrance, kdy se protoplast přestane vyvíjet a nedělí se (Papadakis et al., 2002). V případě

peroxidu

vodíku

je

také

důležitá

jeho

lokalizace

v buňce.

Cytoplazmatický peroxid je krajně toxický a je likvidovaný činností askorbát peroxidázy. Přítomnost apoplastického peroxidu vodíku je naopak esenciální pro resyntézu buněčné stěny a nastartování procesů dělení buněk. Protoplasty, u kterých byla pokusně inhibována činnost askorbát peroxidýzy, se nedělí a odumírají během čtyř dní kultivace. Inhibice kataláz regulujících apoplastický peroxid neměla na schopnost dělení a životnost kultury protoplastů signifikantní vliv. Naopak umělou regulací apoplastického peroxidu přídavkem kataláz do kultivačního média došlo k inhibici buněčného dělení a odumření protoplastové kultury (de Marco et Roubelakis-Angelakis, 1996). Nadměrný oxidativní stres způsobený peroxidem vodíku může také negativně ovlivňovat vstup do buněčného cyklu. Peroxidem aktivována MAPKKK ANP1 (mitogenem aktivovaná protein kináza-kináza-kinázy) totiž spouští fosforylační kaskádu Map-kinázové dráhy vedoucí k upregulaci exprese stres-responsivních genů a inhibici exprese genů indukovaných auxinem vedoucích k buněčnému dělení (Hirt et Affiliations, 2000)

3.6.3 Superoxid dismuázy Jedním z prvních kroků dráhy redukce reaktivních forem kyslíku je přeměna superoxidového radikálu O2-

na méně reaktivní peroxid vodíku. Tato reakce je

katalyzovaná enzymy rodiny superoxid dismutáz. U huseníčku Arabidopsis thaliana bylo objeveno 7 izoenzymů superoxid dismutáz, které byly podle povahy kovového kofaktoru rozděleny na tři Fe-SOD vázající železo (FSD1, FSD2 a FSD3), tři Cu/Zn-SOD využívající jako kofaktor měď nebo zinek (CSD1, CSD2 a CSD3) a jednu Mn-SOD vázající jako kofaktor mangan. Jednotlivé enzymy jsou také charakteristické lokalizací v celulárním prostoru. MSD je typicky lokalizovaná v mitochondriích, FSD téměř výhradně v plastidech. Enzymy CSD jsou hlavními cytoplasmatickými superoxid dismutázami, objevují se ale také v chloroplastech, peroxisomech, vakuolách a v extracelulárním prostoru. Činnost superoxid dismutáz je také spojována s tvorbou peroxidu vodíku při imunitní odpovědi rostliny na napadení patogenem, tzv. oxidativním vzplanutím 18

(Kliebenstein et al., 1998). Při studiu exprese genů kódujících superoxid dismutázy bylo zjištěno, že jeden ze sedmi genů, FSD1, podléhá cirkadiánní regulaci. Jeho exprese kulminuje uprostřed světelné fáze, tedy kolem poledne. Tento fenomén je spojován s lokalizací jeho produktu v chloroplastech (Kliebenstein et al., 1998). Tento jev pozorují také de Marco et Roubelakis-Angelakis (1996) při studiu oxidativního stresu u protoplastů tabáku kultivovaných ve tmě. Zatímco aktivita cytoplasmatické Cu/Zn SOD v průběhu kultivace rostla, aktivita plastidové Fe SOD vlivem postupné degradace chloroplastů klesala.

3.6.4 Katalázy a peroxidázy Dalším krokem v metabolismu ROS je odstranění peroxidu vodíku. Tato reakce je katalyzovaná enzymy rodin kataláz a peroxidáz. Genom huseníčku Arabidopsis thaliana obsahuje tři geny pro katalázy značené CAT1, CAT2 a CAT3, jejichž produkty tvoří 6 známých izoenzymů. Geny CAT1 a CAT3 jsou lokalizovány na chromosomu 1, gen CAT2 pak na chromosomu 4. Exprese CAT1 a CAT2 je indukovaná světlem. CAT2 a CAT3 pak navíc podléhají cirkadiánnímu řízení exprese. CAT2 dosahuje vrcholu exprese ve večerních hodinách, kdežto CAT3 dosahuje maxima v ranních hodinách po krátké světelné expozici. Katalázy rozkládají molekuly peroxidu vodíku generovaného převážně během procesu elektronového transportu v mitochondriích a během β-oxidace mastných kyselin probíhající ve speciálních peroxisomech zvaných glyoxysomy. Katalázy lze detekovat na membránách většiny organel, většinou však právě v peroxisomech a mitochondriích. Nevyskytují se volně v cytosolu (McClung, 1997). Aktivita kataláz u regenerujících protoplastů tabáku prudce stoupá již během macerace v enzymatickém roztoku. Během kultivace pak relativně rychle klesá a nahrazuje ji aktivita askorbát peroxidázy. Pokles aktivity kataláz však není pozorován u nedělících se protoplastů révy vinné. Vysoká aktivita kataláz spolu s trvale nízkou aktivitou askorbát peroxidázy se v pozdní fázi kultivace protoplastů zdá být společným znakem nedělících se protoplastů a potvrzuje domněnku vlivu nerovnováhy antioxidativního systému na rekalcitranci protoplastů (Siminis et al., 1994; de Marco et Roubelakis-Angelakis, 1996). Vzrůstající expresi askorbát peroxidázy a katalázy u regenerujících protoplastů okurky seté (Cucumis sativus L.) pozoruje Ondřej et al. (2010) a Cápal (2012). Exprese katalázy je u obou studií zpočátku nízká. Později roste a svého maxima dosahuje

19

u protoplastů stáří 48 hodin, tedy ve fázi plně regenerované buněčné stěny před buněčným dělením.

3.6.5 Lipoxygenázy Vysoká hladina ROS může vést mimo jiné k degradaci membrán způsobené oxidací a

tvorbou

hydroperoxidových

derivátů

lipidů.

Některé

hydroperoxideriváty

polynenasycených mastných kyselin však mají v buňce využití. Tyto látky jsou syntetizované lipoxygenázovou (též oktadekanovou) cestou, jejichž ústředními enzymy jsou lipoxygenázy (Holková et al., 2009). Fungují jako antimikrobiální látky nebo jako signální molekuly v obranné odpovědi na napadení patogeny nebo poranění. Lipoxygenázy jsou přímo zapojeny v procesech biosyntézy růstového regulátoru kyseliny jasmonové, která reguluje množství reakcí spouštěných vlivem biotického i abiotického stresu (Melan et al., 1993). Za fyziologických podmínek jsou lipoxygenázy nejvíce exprimovány v klíčících semenech, kde se účastní mobilizace energie uložené v zásobních tucích a mají vliv na vývoj a růst kořene. Při napadení patogeny se masivní oxidací lipidů podílejí lipoxygenázy na hypersenzitivní reakci vedoucí k buněčné smrti (Holková et al., 2009). Průvodním jevem hypersenzitivní reakce je oxidativní vzplanutí, kdy dochází k razantnímu nárůstu množství kyslíkatých radikálů, zejména pak peroxidu vodíku. Přídavkem nadlimitního množství peroxidu vodíku do kultivačního média během regenerace kořenových protoplastů čočky došlo k simulaci oxidativního vzplanutí. Razantní nárůst exprese lipoxygenáz následoval již 6 hodin po zvýšení koncentrace peroxidu a do 24 hodin, pak došlo k programové buněčné smrti (Maccarrone et al., 2000).

3.6.6 Geny PR1 a RBOHC S činností lipoxygenáz je prostřednictvím signální dráhy kyseliny jasmonové spojena činnost dalších proteinů reagujících na napadení patogeny a regulujících kaskády obranných reakcí. Některé z těchto proteinů jsou souhrnně označovány jako pathogenesis related proteiny. PR1 protein huseníčku Arabidopsis thaliana se podílí na vzniku systematické odpovědi rostliny při napadení patogenem. Akumulace tohoto proteinu vede také k indukci signálních drah kyseliny salicylové (Pieterse et al., 1996). Dalším studovaným genem zapojeným do oxidativního stresu je gen RHD2 (root hair defective 2) označovaný též jako respiratory burst oxidase homolog C (RBOHC). Tento gen kóduje enzym s NADPH oxidázovou aktivitou a je exprimován v elongační a diferenciační zóně trichoblastů a kořenových vlásků. Tento enzym je odpovědný 20

za tvorbu reaktivních forem kyslíku v závislosti na extracelulární ATP signalizaci. Kaskádou reakcí vyvolaných tvorbou superoxidového radikálu, reprezentovaných mimo jiné regulací vstupu vápenatých iontů do cytosolu, se enzym RHD podílí na indukci transkripce mitogenem aktivované kinázy MPK3. Tato kináza se účastní na odpovědi na rozličné formy stresu. RHD2 se také produkcí ROS podílí na reakci na stres vyvolaný nedostatkem nutrientů. V případě akutního nedostatku draslíku se jeho exprese zvyšuje již 6 hodin po změně složení výživného roztoku (Shin et Schachtman, 2004; Demidchik et al., 2009).

21

4 Materiál a metody

4.1 Biologický materiál Jako výchozí množitelský materiál byla použita semena a nezralé šešule huseníčku rolního Arabidopsis thaliana var. Columbia z vlastní produkce katedry botaniky Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci.

4.2 Seznam použitých chemikálií Chloramin B (Bochemie, Česká republika), Murashige a Skoog medium (MS medium, Duchefa,

Nizozemsko),

2-(N-morfolino)ethansulfonová

kyselina

(MES,

Duchefa,

Nizozemsko), Plant agar (Duchefa, Nizozemsko), sacharosa (Duchefa, Nizozemsko), hydroxid draselný (Chemapol, Česká republika), mannitol (Duchefa, Nizozemsko), macerozym

R-10

(Duchefa,

Nizozemsko),

cellulasa

Onozuka

R-10

(Duchefa,

Nizozemsko), alginát sodný (Sigma-Aldrich, USA), chlorid vápenatý bezvodý (Lach-ner, Česká republika), indol-3-octová kyselina (IAA), 2,4-dichloro-phenoxyoctová kyselina (2,4D), 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine riboside (IPAR), ethanol, fluorescein diacetát (FDA, Serva, USA), 2-merkaptoethanol (Sigma-Aldrich, USA), agarosa (Lonza, Švícarsko),

tris(hydroxymethyl)aminomethan

(Tris,

Sigma-Aldrich,

USA),

ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA, Sigma-Aldrich, USA), diethylpyrokarbonát (Sigma-Aldrich, USA).

4.3 Seznam použitých médií a roztoků Růstové médium:

Murashige a Skoog médium včetně vitamínů MES Sacharosa Agar KOH do pH 5,7 Sterilizace autoklávováním

2,203 g/l 0,976 g/l 30g/l 8 g/l

0,45M sacharosa

Sacharosa KOH do pH 5,8 Sterilizace autoklávováním

154 g/l

0,45M mannitol

Mannitol KOH do pH 5,8 Sterilizace autoklávováním

82 g/l

22

Protoplastové médium PM

Murashige a Skoog médium včetně vitamínů Sacharosa IAA 2,4-D IPAR KOH do pH 5,7 Sterilizace autoklávováním

Enzymatický roztok

Protoplastové médium Celluláza Onozuka R-10 Macerozym R-10 KOH do pH 5,7 Sterilizace filtrací

2,203 g/l 154 g/l 2,0 mg/l 0,5 mg/l 0,5 mg/l

10 g/l 2,5 g/l

Médium s alginátem

Murashige a Skoog médium včetně vitamínů Sacharosa Alginát sodný KOH do pH 5,7 Sterilizace autoklávováním

2,203 g/l 154 g/l 10 g/l

Vápenatý agar

CaCl2 Sacharosa Agar KOH do pH 5,7 Sterilizace autoklávováním

2,22 g/l 154 g/l 10 g/l

4.4 Seznam použitých komerčních kitů InnuPREP Plant DNA Kit (Analytik Jena, Německo) RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Německo) RQ1 RNase-free DNase (Promega, USA) Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Německo) GoTaq® DNA Polymerase (Promega, USA) LightCycler® Fast Start DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche, Německo)

4.5 Přístrojové vybavení laboratoře Předvážky (Kern, Německo), váhy analytické AE 240 (Mettler Toledo, Česká republika), elektromagnetická míchačka (IKA, Německo), mikrovlnná trouba, parní sterilizátor vertikální (Vitrum, Česká republika), horkovzdušný sterilizátor Stericell (BMT, Česká republika), digitální pH metr HI 221 (Hanna Instruments, Česká republika), laminární flowbox Telstar H-100 (Telstar Group inc. USA), centrifuga Rotofix 32A (Hettich Zentrifugen, Německo), světelný mikroskop inverzní Olympus CK40 (Olympus, 23

Japonsko), světelný a fluorescenční mikroskop Olympus BX60 (Olympus, Japonsko) s CCD kamerou (CoolSnap, Photometrics, USA), kultivační komora s termostatem (Binder, Německo) sada automatických pipet (Eppendorf, Německo), centrifuga Eppendorf 5415D (Eppendorf, Německo), thermoblok (BIOER Technology, Čína), thermocycler XP (BIOER Technology, Čína), elektroforéza (BioTech, Česká republika), UV transluminátor UVT 20M (Herolab, Německo) s fotoaparátem Kodak 290 (Kodak, USA), spektrofotometr NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologist, USA) LightCycler Nano (Roche, Německo).

4.6 Pěstování pokusných rostlin Semena a nezralé šešule huseníčku Arabidopsis thaliana byly vysterilizovány v roztoku chloraminu o koncentraci 2,5 % po dobu 30 minut. Sterilní semena byla pomocí skleněné tyčinky vyseta do petriho misek na tuhé růstové médium (1/2 MS, 0,8% agar). Po 7 dnech byly naklíčené rostliny pinzetou přesázeny do plastových boxů s tuhým růstovým médiem s, nebo bez obsahu sacharosy, kde byly kultivovány dalších 4-5 týdnů. Petriho misky i plastové boxy byly umístěny v růstové komoře se světelným režimem 16 hodin světlo/8 hodin tma, při teplotě 22 °C.

4.7 Izolace protoplastů Mezofylové protoplasty byly izolovány z listů 4-5 týdnů starých rostlin huseníčku Arabidopsis thaliana pěstovaných in vitro v aseptických podmínkách. Listy byly ve sterilních podmínkách flowboxu opláchnuty v 0,45M roztoku sacharosy a skalpelem nařezány na několik menších kusů. Kusy listů byly přeneseny do Petriho misky s 5 ml Protoplastového média s obsahem enzymů (1% celuláza, 0,25% macerozym), kde byly ve tmě při pokojové teplotě inkubovány po dobu 16 hodin. Pro oddělení protoplastů od zbytků rostlinného pletiva byla směs přefiltrována přes uhelonové síto hustoty 72µm a zbytky listů byly lehce protlačeny pomocí skleněné hokejky. Pro oddělení protoplastů od zbytků rostlinného pletiva byla suspenze buněk přenesena pomocí Pasteurovy pipety do centrifugační zkumavky a centrifugována 5 minut při 500 rpm. Po centrifugaci byl odstraněn sediment obsahující zbytky rostlin a supernatant byl opatrně převrstven 2ml 0,45M roztoku mannitolu tak, aby nedošlo ke smísení kapalin. Po opětovné centrifugaci 5 minut při 500 rpm se na rozhraní roztoků různé hustoty utvořil tmavě zelený proužek floatujících protoplastů. Protoplasty byly přeneseny do nové 24

centrifugační kyvety a promývány 2x 5ml 0,45M mannitolu. Po každém promytí byla směs centrifugována 5 minut při 600 rpm. Před změřením koncentrace a životnosti protoplastů byla suspenze opět centrifugována 5 minut při 600 rpm, sediment byl resuspendován v 5 ml Protoplastového média a suspenze byla přenesena do kultivačních boxů o objemu 25 cm3. Část protoplastů byla zalita médiem s obsahem alginátu sodného. Suspenze protoplastů v médiu s obsahem alginátu byla po cca 300 µl nakapána do Petriho misky na tuhý vápenatý agar, kde po 45 minutách utvořilo médium polotuhé pecičky. Tyto pecičky byly přeneseny do kultivačních boxů a zality Protoplastovým médiem.

4.8 Měření koncentrace a životnosti protoplastů Koncentrace protoplastů byla zjištěna spočtením buněk v 10 polích Bűrkerovy komůrky a přepočtem na celkový objem suspenze. Pro zjištění životnosti protoplastů byla na podložním skle smísena kapka protoplastové suspenze s pracovním roztokem fluorescein diacetátu (FDA) vzniklým smísením 1 ml Protoplastového média s 10 µl roztoku FDA. Takto ošetřené živé protoplasty rozkládají FDA za vzniku látky emitující ve fluorescenčním mikroskopu při použití hranolu U-MWB2 zelené světlo. Neživé protoplasty svítí ve fluorescenčním mikroskopu červeně. Životnost pak byla spočtena jako poměr živých, zeleně fluoreskujících protoplastů k celkovému počtu buněk.

4.9 Kultivace protoplastových kultur Protoplastové kultury byly pro potřeby dlouhodobé kultivace kultivovány při 22 °C za tlumeného osvětlení (kultivační box byl shora chráněn proti přímému světlu překrytím alobalem). Pro potřeby zjištění genové exprese byly kultury kultivovány ve tmě při teplotě 25 °C. Z důvodu přísunu živin bylo u všech vzorků po 7., 14. a 21 dnů kultivace vyměněno 2,5 ml Protoplastového média za čerstvé.

4.10 Izolace genomické DNA Pro ověření velikosti PCR produktů a nasedání použitých primerů na analyzované geny byla z čerstvých listů huseníčku Arabidopsis thaliana izolována genomická DNA. Pro izolaci byl použit komerční kit Innu PREP Plant DNA Kit firmy AnalytikJena. Přibližně 200 mg rostlinného materiálu bylo ve třecí misce v tekutém dusíku rozdrceno na prach. K homogenizovanému materiálu bylo přidáno 400 µl SLS roztoku a 25 µl 25

Proteinasy K. Směs byla krátce vortexována a inkubována za občasného promíchání 30 minut při 50 °C. Po inkubaci byla směs přenesena do filtrační kolony a centrifugována 1 minutu při 12 000 rpm. Filtrát byl ošetřen RNAsou A, po krátké inkubaci bylo ke směsi přidáno 200 µl pufru SBS. Směs byla přenesena do izolační kolony a centrifugována 2 minuty při 12 000 rpm. DNA zachycená na koloně byla promyta postupně 500 µl HS a 750 µl MS a eluována 2x 25 µl sterilní destilované vody. Koncentrace izolované DNA byla změřena na spektrofotometru a pro další práci byl roztok DNA zředěn na koncentraci 50 ng/µl.

4.11 Izolace mRNA Pro analýzu exprese vybraných genů byla z listů, čerstvě izolovaných a kultivovaných mezofylových protoplastů izolována RNA pomocí kitu RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Německo). Protoplasty a listy rozdrcené v tekutém dusíku na prášek byly lyzovány ve 450 µl roztoku RLT s obsahem guanidin thiokyanátu a 2-merkaptoethanolu v množství 10 µl 2-ME na 1 ml RLT roztoku. Pro větší výtěžnost reakce byla směs inkubována 3 minuty při 56 °C. Po inkubaci byl lyzát přefiltrován přes fialovou filtrační kolonku centrifugací po dobu 2 min při 12 000 rpm. Ze získaného filtrátu byl opatrně oddělen supernatant, který byl přenesen do nové zkumavky. K supernatantu bylo přidáno 200 µl ethanolu, směs byla přenesena do růžové kolonky a centrifugována 15 s při 12 000 rpm. RNA zachycená na kolonce byla promyta postupně roztokem RW1, 2x roztokem RPE a eluována 30 µl RNAse free vody. Koncentrace izolované RNA byla změřena na přístroji Nanodrop ND-1000 a její kvalita zjištěna pomocí elektroforézy v 1,5% agarosovém gelu. Získaná RNA byla ihned podrobena ošetření DNasou a reverzní transkripci.

4.12 DNasa Z důvodu odstranění zbytků DNA z izolované RNA byl roztok RNA ošetřen DNasou. K tomuto kroku byl použit komerční kit RQ1 RNase-free DNase firmy Promega. K 8 µl roztoku izolované RNA byl připipetován 1 µl RQ1 DNase 10x reakční pufr, 0,2 µl RQ DNase a 0,8 µl sterilní PCR vody. Směs byla inkubována 5 minut při 37 °C v termocycleru XP (BIOER). Pro inaktivaci DNasy byl ke směsi po inkubaci přidán 1 µl RQ1 DNase STOP roztoku a směs byla opět inkubována 10 minut při 65 °C.

26

4.13 Reverzní transkripce K přepisu izolované RNA do cDNA metodou reverzní transkripce byl použit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit firmy Roche. K 10 µl RNA ošetřené DNasou byl přidán 1 µl Anchored-oligo(dT)18 primerů a 2 µl vody.

Z důvodu

predenaturace před reverzní transkripcí byla směs inkubována v termocycleru Bioer 10 minut při 65 °C a následně zchlazena na ledu. K vychlazené směsi byly přidány 4 µl Transcriptor reverse reakčního pufru, 0,5 µl RNase protectoru, 2 µl dNTP mixu a 0,5 µl reverzní transkriptázy. Reverzní transkripce probíhala při teplotě 55 °C 30 minut. Poté byla transkriptáza inaktivována při teplotě 85 °C. Nově syntetizovaná cDNA byla po změření koncentrace na Nanodropu ND-1000 zředěna na 50 ng/µl a uchována při -20 °C.

4.14 PCR a elektroforetická separace Pro ověření přítomnosti transkriptů a optimalizaci reakce byla provedena řada PCR reakcí na vzorcích cDNA izolované z listů a cDNA izolované z mezofylových protoplastů stáří 0, 24, 48 a 72 hodin od izolace. Pro ověření nasedání primerů byla provedena PCR reakce také na vzorku genomické DNA izolované z listu. K PCR reakci byl použit kit GoTaq® DNA Polymerase firmy Promega. Teplotní profil PCR reakce provedené v thermocycleru XP (BIOER) ukazuje tabulka č. 1. Pro vizualizaci produktů PCR reakce byla provedena elektroforetická separace v 1,5% agarosovém gelu v TBE pufru s přídavkem 2 µl GelRedu nebo EtBr při napětí 100V. Jako marker molekulové hmotnosti byl použit 100bp HyperLadder IV (Bioline). Po provedení elektroforézy byl gel zdokumentován na UV transluminátoru.

Tab. č.1: Teplotní podmínky PCR reakce Teplota

Čas

Počet cyklů

Predenaturace

95 °C

2 min

1

Denaturace

95 °C

30 s

Annealing

44-48 °C

30 s

Elongace

72 °C

45 s

Extenze

72 °C

5 min

32-38

1

27

Tab. č. 2: Seznam analyzovaných genů a sekvence použitých primerů Gen

Sekvence primerů

AT2G28390 L : aactctatgcagcatttgatccact R: tgattgcatatctttatcgccatc CAT1 L: aagtgcttcatcgggaagga AT1G20630 R: cttcaacaaaacgcttcacga CAT2 L: aactcctccatgaccgttgga AT4G35090 R: tccgttccctgtcgaaattg CAT3 L: tctccaacaacatctcttccctca AT1G20620 R: gtgaaattagcaaccttctcgatca MSD1 L: atgtttgggagcacgcctac AT3G10920 R: aacctcgcttgcatatttcca FSD1 L: ctcccaatgctgtgaatccc AT4G25100 R: tggtcttcggttctggaagtc CSD1 L: tccatgcagaccctgatgac AT1G08830 R: cctggagaccaatgatgcc LOX1 L: ttggctaaggcttttgtcgg AT1G55020 R: gtggcaatcacaaacggttc LOX2 L: tttgctcgccagacacttg AT3G45140 R: gggatcaccataaacggcc RBOHC L: tcaccagagactggcacaataaa AT5G51060 R: gatgctcgacctgaatgctc UBQ10 L: ggccttgtataatccctgatgaataag AT4G05320 R: aaagagataacaggaacggaaacatagt PR1 L: agctcttgtaggtgctcttg AT2G14610 R:agtctgcagttgcctcttag

Délka produktu Produkt na cDNA genomické DNA 61bp 164bp

Teplota annealingu 45°C

103bp

200bp

44ºC

91bp

167bp

45°C

91bp

246bp

47°C

101bp

184bp

44°C

101bp

Nenasedá

47°C

102bp

497bp

47°C

101bp

182bp

45°C

102bp

437bp

45°C

101bp

187bp

47°C

61bp

61bp

48°C

174bp

174bp

45°C

4.15 qPCR Ke zjištění míry exprese jednotlivých genů byla za použití kitu LightCycler® Fast Start DNA MasterPlus SYBR Green I (Roche) na přístroji LightCycler Nano (Roche) provedena kvantitativní PCR reakce. Reakční objem v čirých PCR mikrozkumavkách činil 20 µl. Reakční směs byla složena z 8 µl PCR grade vody, 2x 2 µl roztoku primeru zředěných na koncentraci 5µM, 4 µl Sybr Green master mixu a 4 µl vzorku obsahující 200 ng cDNA. Teplotní profil reakce je uveden v tabulce č. 3. Primární hodnoty CT a křivky teploty tání získané v programu LightCycler Software 4.1 byly statisticky zpracované v programu MS Excel. Exprese genů byla vypočtena metodou ∆∆CT. Jako standard byla použita exprese genu AT2G28390 patřícího mezi geny kódující SAND

28

proteiny. Jako kontrola byla použita exprese daného genu v listu huseníčku Arabidopsis thaliana.

Postup při výpočtu relativní exprese: Relativní exprese = 2-∆∆CT ∆∆CT = ∆CT vzorku -∆CT kontroly ∆CT = CT studovaného genu – CT kalibrace Tab. č. 3: Teplotní profil kvantitativní PCR reakce Teplota

Čas

Počet cyklů

Predenaturace

95 °C

3 min

1

Denaturace

95 °C

30 s

Annealing

44-48 °C

30 s

Elongace

72 °C

30 s

32-38

Analýza teploty tání 60°C - 95°C

1

29

5. Výsledky

5.1 Izolace, četnost a životnost protoplastů Pro účely izolace protoplastů byly rostliny huseníčku rolního Arabidopsis thaliana var. Columbia vypěstovány na tuhém 1/2MS médiu s přídavkem sacharosy. Rostliny kultivované na médiu bez sacharosy vykazovaly velmi pomalý růst a jejich listy vykazovaly známky chlorózy. Protoplasty byly izolovány ze zdravých a svěže zelených listů in vitro pěstovaných rostlin stáří 5 až 6 týdnů, které dosud nekvetly. Četnost izolovaných protoplastů v kulturách s 5 ml Protoplastového média, zjištěná spočtením v Bürkerově komůrce, se pohybovala mezi 1,7 x 105/ml až 6,5 x 105/ml.

A

B

Obr č. 3: Nařezané listy huseníčku Arabidopsis thaliana macerované v 5 ml roztoku lytických enzymů (A), prstenec protoplastů ustálený na rozhraní média s 0,45M sacharosou a promývacího roztoku s 0,45M mannitolem

Životnost čerstvě izolovaných protoplastů zjištěna pomocí fluorescenčního mikroskopu se pohybovala mezi 75 a 90 procenty. V průběhu kultivace pak životnost rychle klesala. Živé protoplasty floatovaly během kultivace těsně pod hladinou kultivačního média, kdežto mrtvé buňky často praskaly a klesaly ke dnu. Během 72 hodin kultivace docházelo na četnosti živých buněk ke značným ztrátám.

30

A

B

Obr. č. 4: Detail živého čerstvě izolovaného protoplastu bez buněčné stěny s velkými svěže zelenými chloroplasty (A), Detail živého protoplastu v roztoku FDA, za použití hranolu U-MWB2 emituje látka vzniklá rozkladem FDA zelené světlo (B)

5.2 Kultivace protoplastů Regenerující protoplasty byly po dobu 4 týdnů paralelně kultivovány ve formě suspenze buněk v tekutém Protoplastovém médiu s obsahem růstových regulátorů a ve formě buněk zalitých v pecičkách polotekutého alginátu plovoucích v tomtéž médiu. První sporadické dělení buněk odvozených z protoplastů bylo v tekutém médiu pozorováno 72 hodin od izolace. U kultur kultivovaných v tekutém médiu docházelo k občasnému dělení, buňky však ani po 4 týdnech kultivace netvořily mikrokalusy. Při kultivaci protoplastů v polotekutém alginátu docházelo k častějšímu dělení buněk a k tvorbě pozorovatelných mikrokalusů již během 3. týdne kultivace.

5.3 Izolace nukleových kyselin, reverzní transkripce Ze tří vzorků čerstvých listů a protoplastů stáří 0, 24, 48 a 72 hodin od izolace byla s různou úspěšností izolována celková RNA, jejíž kvalita byla ověřena elektroforézou. Koncentrace izolované RNA a cDNA syntetizované metodou reverzní transkripce jsou uvedené v tabulce č. 3. Kontrolní genomická DNA z listů byla vyizolována v koncentraci 331 ng/µl. Pro další analýzy byla cDNA naředěna na shodnou koncentraci 40 ng/µl. Izolovaná RNA byla podle fotografie elektroforézy lehce degradovaná (Obr. č. 5). Specifita zvolených primerů byla otestována PCR reakcí na genomické DNA. V souladu s předchozím porovnáním v programu PrimerBlast nasedá na genomickou DNA 11 z 12 párů primerů (viz. Obr. č. 6) a tvoří produkty očekávané délky. Primery pro gen 31

FSD1 nasedají na rozhraní dvou exonů, díky čemuž nenasedají na genomickou DNA a eliminují tak případné kontaminace v mixu cDNA. Vzorek

Koncentrace

Koncentrace

RNA (ng/µl)

cDNA (ng/µl)

Vzorek

Koncentrace

Koncentrace

RNA (ng/µl)

cDNA (ng/µl)

0a

34,1

1484

48c

10,4

1390

0b

31,3

1504

72a

8,2

1387

0c

37,4

1058

72b

7,3

1392

24a

14,4

1362

72c

9,7

1300

24b

10,0

1371

La

238

1433

24c

25,6

1375

Lb

374

1363

48a

10,7

1379

Lc

97,6

1494

48b

14,8

1353

Tab. č. 3: koncentrace izolované RNA a syntetizované cDNA

L

0a

0b

0c

24a 24b

24c

48a 48b 48c

Obr. č. 5: Elektroforetická separace části vzorků izolované RNA

Obr. č. 6: Elektroforéza produktů PCR provedené na genomické DNA (28 cyklů)

32

5.4 Exprese studovaných genů Exprese jednotlivých genů v listech a protoplastech stáří 0, 24, 48 a 72 hodin od izolace byla zjištěna metodou kvantitativní real-time RT-PCR na přístroji LightCycler Nano (Roche). Pro porovnání a kontrolu byla pro každý gen provedena RT-PCR. Délky PCR produktů na cDNA i na genomické DNA jsou popsány v kapitole 4.14.

5.4.1 Exprese genů kódujících katalázy Katalázy jsou enzymy z rodiny oxidoreduktáz katalyzující přeměnu peroxidu vodíku na vodu a kyslík. Jsou tak nenahraditelným prvkem v regulaci množství reaktivních kyslíkatých radikálů (ROS) vznikajících při metabolických reakcích jako je elektronový transport v mitochondriích a β-oxidace mastných kyselin nebo při stresových podmínkách kultivace. Gen CAT1 vykazuje mezi ostatními katalázami v porovnání s listem největší rozdíly exprese. Ihned po izolaci je jeho exprese téměř 20x větší než v listu. Během kultivace pak hladina exprese klesá, avšak i v protoplastech stáří 72 hodin je jeho exprese oproti listu trojnásobná. Gen CAT 2 má své expresní maximum obdobně jako CAT1 ihned po izolaci, není však tak výrazné. Během kultivace protoplastů se pak exprese CAT2 dostává pod úroveň exprese v listu. Gen CAT3 je během prvních 24 hodin kultivace téměř bez exprese. U 48 hodin starých protoplastů se jeho exprese zvyšuje na poloviční hodnoty exprese v listu, při další kultivaci však opět klesá. Expresní profil genů pro katalázy vypočtený metodou ∆∆CT ukazují grafy č. 1 až 3. Elektroforetickou separaci produktů RT-PCR příslušných genů ilustrují obr. č. 7–9.

Graf č. 1: Relativní exprese genu CAT1 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu 33

Graf č. 2: Relativní exprese genu CAT2 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

Graf č. 3: Relativní exprese genu CAT3 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

Obr. č. 7: Elektroforéza produktů RT-PCR genu CAT1 (38 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

34

Obr. č. 8: Elektroforéza produktů RT-PCR genu CAT2 (38 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

Obr. č. 9: Elektroforéza produktů RT-PCR genu CAT3 (38 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

35

5.4.2 Exprese genů kódujících superoxid dismutázy Superoxid

dismutázy

jsou

významné

antioxidanty

katalyzující

přeměnu

superoxidového radikálu O2 - na méně škodlivý peroxid vodíku. V rámci této práce byla sledována exprese tří genů z rodiny superoxid dismutáz, kódujících enzymy lišící se kovovým kofaktorem v aktivním místě. Jedná se o FSD1, CSD1 a MSD1. Největší rozdíly exprese byly zaznamenány u genu CSD1, jehož exprese vrcholila v protoplastových kulturách stáří 48 hodin, kdy byla přibližně 17x vyšší než v listu. Exprese genu MSD1 byla během prvních 48 hodin kultivace konstantní a dosahovala trojnásobku exprese v listu. U 72 hodin starých protoplastů se hladina exprese obou genů vrací k hodnotě exprese v listu. Gen FSD1 je po celou dobu kultivace protoplastů exprimován téměř 5x méně než v listu. Expresní profil genů pro superoxid dismutázy znázorňují grafy č. 4 až 6. Produkty RT-PCR příslušných genů ukazují obr. č. 10–12.

Graf č. 4: Relativní exprese genu CSD1 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

36

Graf č. 5: Relativní exprese genu MSD1 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

Graf č. 6: Relativní exprese genu FSD1 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

37

Obr. č. 10: Elektroforéza produktů RT-PCR genu CSD1 (38 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

Obr. č. 11: Elektroforéza produktů RT-PCR genu MSD1 (38 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

Obr. č. 12: Elektroforéza produktů RT-PCR genu FSD1 (32 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

38

5.4.3 Exprese genu RBOHC Respiratory burst oxidáza je enzym s NADPH oxidázovou aktivitou, jehož gen je exprimovaný převážně v dělivých zónách rostoucích pletiv. Je zodpovědný za tvorbu reaktivních

radikálů

jako

odpověď

na

extracelulární

signály.

Spolu

s geny

pro lipoxygenázy je v listu exprimován jen velmi málo. V protoplastech však jeho exprese vykazuje vysokou aktivitu ihned po izolaci a svého maxima dosahuje v kulturách stáří 72 hodin, kde již dochází k dělení buněk. Expresní profil genu RBOHC je znázorněn v grafu č. 7. Produkty RT-PCR genu RBOHC prezentuje obr. č. 13.

Graf č. 7: Relativní exprese genu RBOHC v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

Obr. č. 13: Elektroforéza produktů RT-PCR genu RBOHC (32 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

39

5.4.4 Exprese genů kódujících lipoxygenázy Lipoxygenázy

jsou

dioxygenázy

katalyzující

tvorbu

hydroperoxidů

polynenasycených mastných kyselin. Tyto sloučeniny mají pak signální nebo antimikrobiální funkce. Exprese genů kódujících lipoxygenázy v dospělém listu je velmi nízká. V regenerujících protoplastech však exprese LOX1 strmě stoupá a u protoplastů stáří 48 hodin dosahuje až 150x vyšších hodnot než v listu. Exprese LOX2 je mnohem nižší, přesto dosahuje v protoplastech stáří 24 hodin sedminásobku exprese v listu. Expresní profil genů LOX1 a LOX2 ilustrují grafy č. 8 a 9. Elektroforéza produktů RT-PCR je znázorněna obrázky č. 14 a 15.

Graf č. 8: Relativní exprese genu LOX1 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

Graf č. 9: Relativní exprese genu LOX2 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

40

Obr. č. 14: Elektroforéza produktů RT-PCR genu LOX1 (32 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

Obr. č. 15: Elektroforéza produktů RT-PCR genu LOX2 (32 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc) 5.4.5 Exprese genu PR1 Exprese genu pro pathogenesis-related protein je indukována jako odpověď na napadení rostliny patogeny. Jeho exprese v listu je relativně nízká, v protoplastových kulturách však roste a u kultur starých 48 hodin dosahuje průměrně čtrnáctinásobku exprese v listu. Při další kultivaci exprese PR1 klesá. Expresní profil genu PR1 znázorňuje graf č. 10. Elektroforéza produktů RT-PCR je pak ilustrována obrázkem č. 16.

41

Graf č. 10: Relativní exprese genu PR1 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

Obr. č. 16: Elektroforéza produktů RT-PCR genu PR1 (32 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

5.5 Exprese genů použitelných jako kalibrace Jako kalibraci lze použít tzv. provozní geny (housekeeping geny), jejichž exprese je stálá ve všech typech buněk všech vývojových stádií. Pro tuto práci byly vybrány geny UBQ10 a AT2G28390. Gen UBQ10 je jeden z pěti genů kódujících polyubiquitin, signální protein kovalentně vázaný na protein určený k degradaci v proteasomu. Gen AT2G28390 kóduje protein z rodiny SAND podílející se na vezikulárním transportu. Ovlivňuje pak zejména transport vápenatých iontů. Expresní profil těchto genů by měl být v závislosti jeden na druhém rovnoměrný a beze změn. Reálný profil ukazují grafy č. 11 a 12. Pro kalibraci

42

studovaných genů byl pak vybrán gen AT2G28390 vykazující podle Ct hodnot stabilnější expresi zejména u protoplastů stáří 72 hodin. Kontrolní elektroforézu produktů RT-PCR prezentují obrázky č. 17 a 18.

Graf č. 11: Relativní exprese genu UBQ10 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu

Obr. č. 17: Elektroforéza produktů RT-PCR genu UBQ10 (32 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

43

Graf č. 12: Relativní exprese genu AT2G28390 v regenerujících protoplastových kulturách v časech 0 až 72 hodin od izolace porovnaná s expresí v listu, kalibrováno genem UBQ10

Obr. č. 18: Elektroforéza produktů RT-PCR genu AT2G28390 (32 cyklů) v protoplastech stáří 0 až 72 hodin od izolace (0a-72c) a v listech (La-Lc)

44

5.6 Srovnání exprese studovaných genů v listu Na závěr práce byly srovnány exprese jednotlivých studovaných genů v listu a porovnány s expresí genu AT2G28390 zvoleného jako kalibrátor. Gen UBQ10 vykazoval v listu 60x vyšší expresi než zvolený kalibrátor. Geny pro superoxid dismutázy a gen CAT3 vykazovaly expresi řádově srovnatelnou s expresí AT2G28390. O řád nižší expresi pak vykazovaly geny CAT1 a CAT2. Exprese genů PR1, RBOHC a LOX je pak o 2 až 3 řády nižší, než exprese kalibrátoru. Souhrnný pohled na expresi studovaných genů ilustruje graf č. 13.

Graf č. 13: Relativní exprese studovaných genů v listu huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) v porovnání s genem AT2G28390

45

6. Diskuze Úplnou degradací buněčné stěny pomocí enzymů lze izolovat protoplasty většiny druhů rostlin a stimulovat tím procesy vedoucí k jejich dediferenciaci. Některé z nich lze po izolaci úspěšně kultivovat v regenerujícím médiu a přes stádium mikrokalusů z nich vypěstovat celou rostlinu (Davey et al., 2005). Protoplasty však během regenerace buněčné stěny trpí vysokým oxidativním stresem způsobeným tvorbou reaktivních forem kyslíku během metabolických pochodů. Samotný oxidativní stres se jeví být jednou z podmínek dediferenciace (Grafi et al., 2011), nerovnováha mezi množstvím radikálů a antioxidativním systémem však může vést k buněčné smrti nebo stavu zvaném rekalcitrance, kdy zůstávají buňky malé a kulovité, nedělí se a zdánlivě se nevyvíjejí (Papadakis et al., 2002). Regenerující buňky odvozené z protoplastů proto vykazují četné změny na úrovni transkripce genů spojených s obnovou buněčné stěny, odpovědí na rozličné formy stresu a vstupem do buněčného cyklu (Yang et al., 2008). V této práci byla provedena izolace a dlouhodobá kultivace mezofylových protoplastů huseníčku rolního Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. za účelem pozorování jejich regenerační schopnosti. Dále byla metodou kvantitativní real-time RT-PCR zjištěna a porovnána exprese genů tří kataláz, tří superoxid dismutáz, dvou lipoxygenáz, patogenesis-related proteinu 1 a enzymu RBOHC s NADPH oxidázovou aktivitou, a to mezi regenerujícími protoplasty během prvních 72 hodin kultivace a listem. Protoplasty byly kultivovány za tlumeného osvětlení po dobu 4 týdnů zvlášť v tekutém médiu a zvlášť v polotekutém stavu zalité v pecičkách alginátu. V tekutém médiu došlo zřejmě vlivem oxidativního stresu způsobeného tlumeným světlem k procesu rekalcitrance. Protoplasty vykazovaly neměnnou morfologii, dělily se jen velmi sporadicky, ale v žádném případě nevytvořily mikrokalusy. U protoplastů kultivovaných v alginátu došlo v některých případech k překonání oxidativního stresu, dělení a tvorbě mikrokalusů. Pokus potvrzuje literaturou avizovanou vhodnost použití polotekutých médií pro dlouhodobou kultivaci a regeneraci protoplastů (Davey et al., 2005). Většina studovaných genů vykazovala během určité fáze regenerace buněk zvýšenou expresi. Exprese genů CAT1 a CAT2 vykazuje ihned po izolaci několikanásobek exprese v listu, při další kultivaci se pak míra jejich exprese vrací k hodnotám exprese v listu. Strmý nárůst aktivity kataláz s pozdějším poklesem při kultivaci pozorují

46

u protoplastů tabáku Nicotiana tabacum L. také de Marco et Roubelakis-Angelakis (1996). Podle jejich studie je pokles aktivity kataláz během kultivace doprovázen nárůstem aktivity askorbát peroxidázy. Růst exprese genů peroxidáz pozorují během kultivace protoplastů okurky Cucumis sativus také Ondřej et al. (2010) a Cápal (2012). Tito autoři však u protoplastů nepozorují prudký nárůst exprese katalázy s následným pozvolným slábnutím. Gen pro katalázu vykazuje v jejich studiích postupnou stoupající tendenci s maximem u protoplastů stáří 48 hodin. Tyto zdánlivě protichůdné výsledky korelují s expresí genu CAT3 u regenerujících protoplastů huseníčku Arabidopsis thaliana popsané v této práci, kdy exprese CAT3 vykazuje shodný profil s maximem u protoplastů stáří 48 hodin. Srovnání exprese genů CAT2 a CAT3 u protoplastů kultivovaných ve tmě s expresí v listu může být však vzhledem k jejich cirkadiánnímu řízení a indukcí světlem poněkud relativní. Gen CAT2 dosahuje vrcholu exprese ve večerních hodinách, kdežto CAT3 brzy po ozáření v ranních hodinách. Tento rozdíl je patrný i v porovnání exprese studovaných genů v listu, provedeném v této práci. V listech, jejichž RNA byla izolována v dopoledních hodinách, byla exprese CAT3 několikanásobně vyšší než exprese CAT2. Změnu exprese kataláz v závislosti na cirkadiánních rytmech a světelné indukci podrobně popisuje McClung (1997). Expresní profil superoxid dismutáz vázajících jako kofaktor mangan (MSD1) a měď nebo zinek (CSD1) vykazuje během kultivace protoplastů postupný růst a kulminuje u protoplastů stáří 48 hodin. Gen FSD1 kódující výhradně plastidovou Fe-SOD vykazuje v porovnání s listem velmi malou expresi, což může být způsobeno jednak cirkadiánní regulací exprese FSD1 s maximem v poledních hodinách a jednak samotnou degradací chloroplastů u ve tmě kultivovaných protoplastů. Podobný rozdíl v aktivitě cytosolových a plastidových superoxid dismutáz pozoruje u protoplastů tabáku Nicotiana tabacum Papadakis et al. (2001). S nárůstem množství reaktivních forem kyslíku souvisí také exprese lipoxygenáz. Tyto enzymy jsou u protoplastů spojovány s indukcí hypersenzitivní reakce a buněčné smrti. U listů je jejich exprese minimální (Maccarrone et al., 2000). U regenerujících protoplastů byl v této práci zjištěn intenzivní nárůst exprese s maximem u 24 hodin starých protoplastů v případě LOX2 a 48 hodin starých protoplastů v případě LOX1, což může souviset se ztrátami na životnosti protoplastů během kultivace a s jejich případnou mírou rekalcitrance. Kumulaci oxidovaných lipidů u nedělících se protoplastů tabáku (Nicotiana tabacum) a révy vinné (Vitis vinifera) pozoruje i Papadakis et al. (2001). Exprese dalšího genu PR1 vykazuje stejný profil jako exprese LOX1, což koreluje s jejich vzájemnou 47

provázaností přes signální dráhu kyseliny jasmonové a s jejich zapojením v regulaci odpovědi na napadení patogenem (Pieterse et al., 1996). Exprese genu RBOHC je po celou dobu kultivace několikanásobně vyšší než exprese v listu, což může být spojeno se zjištěnou indukcí stres-responzivních drah cestou indukce exprese MPK3 (Demidchik et al., 2009). Výsledky této práce poukazují na komplexitu buněčné odpovědi a provázanost reakcí, jimiž se buňka brání proti nadměrnému oxidativnímu stresu provázejícím proces dediferenciace. Tento stres je pak důležitým prvkem v regulaci dediferenciace a indukci totipotence jednotlivých buněk.

48

7. Seznam použitých zkratek 2,4-D

kyselina dichlorfenoxyoctová

ATB2

oxidoreduktáza

CAT

kataláza

cDNA-AFLP

polymorfismus délek amplifikovaných cDNA fragmentů

CSD, Cu/Zn SOD

superoxid dismutáza obsahující měď nebo zinek

DAPI

4,6 –diamidino-2-fenylindol

EDTA

kyselina ethylendiamintetraoctová

FDA

fluorescein diacetát

FLA2

fasciklin-like arabinogalaktan protein

FSD, Fe SOD

superoxid dismutáza obsahující železo

GRP

protein bohatý na glycin

IAA

kyselina indol-3-octová

IPAR

6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine riboside

LOX

lipoxygenáza

MALDI-TOF MAP

průletový analyzátor s využitím ionizace laserem za přítomnosti matrice mitogenem aktivovaná protein kináza

MAPKKK

mitogenem aktivovaná protein kináza-kináza-kinázy

ME

2-merkaptoethanol

MPK3

mitogenem aktivovaná protein kináza 3

MS médium

médium dle Murashiga a Skooga

MSD, Mn SOD

superoxid dismutáza obsahující mangan

PCR

polymerázová řetězová reakce

PR1

patogenesis-related protein

PRP

protein bohatý na prolin

qPCR

kvantitativní real-time PCR

RBOHC, RHD2

respiratory burst oxidáza homolog C

ROS

reaktivní formy kyslíku

RT-PCR

reverzní transkripce - PCR

SSH

supresivní subtraktivní hybridizace

SUS2

abnormální suspenzor 2

UBQ10

polyubiquitin 10

49

8. Závěr Regenerující protoplasty čelí, díky zvýšené hladině metabolismu sacharidů a zvýšené hladině stresu během kultivace, zvýšené produkci reaktivních kyslíkatých sloučenin, jako je superoxidový radikál nebo peroxid vodíku. Tyto látky mohou sloužit jako signální molekuly, ve větší míře však poškozují buněčné struktury. Proti vysoké hladině těchto radikálů se buňky během regenerace brání zvýšením tvorby antioxidantů. V expresi obranných genů vykazují protoplasty jistou podobnost s buňkami napadenými patogeny. V této práci byla sepsána literární rešerše na téma expresní profil protoplastových kultur. V praktické části byla kromě vlastního zvládnutí metod izolace a kultivace protoplastů provedena studie vývoje exprese deseti genů reagujících na oxidativní stres nebo napadení patogenem v regenerujících protoplastech huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) během prvních 72 hodin kultivace buněk. Ze tří studovaných kataláz vykazovaly během regenerace protoplastů zvýšenou aktivitu CAT1 a CAT2. Nejvyšší exprese byla u těchto genů zaznamenána ihned po izolaci. Exprese genu CAT3 byla po celou dobu kultivace velmi nízká, pouze u protoplastů stáří 48 hodin došlo k mírnému nárůstu. Geny pro Mn a Cu/Zn superoxid dismutázy taktéž vykazovaly mnohem vyšší expresi než v listu. Maximum exprese genu CSD1 bylo zjištěno u protoplastů starých 48 hodin. Gen MSD1 vykazoval ihned po izolaci vyšší expresi, která ještě do 48 hodin pozvolně rostla. U starších buněk již vykazovala hodnoty srovnatelné s expresí v listech. Gen FSD1 vykazoval po celou dobu kultivace oproti listu jen velmi malou expresi. Exprese lipoxygenáz katalyzujících tvorbu hydroperoxidů lipidů, která byla v listu velmi malá, u protoplastů strmě rostla. Svého maxima dosáhla v případě genu LOX2 24 hodin od izolace, v případě genu LOX1 o dalších 24 hodin později. Exprese genu PR1, jehož produkty jsou zapojeny v signálních drahách kyseliny salicylové, dosahuje u protoplastů starých 48 hodin několikanásobku exprese v listu. Studium exprese genů zapojených do odpovědi na oxidativní stres a napadení patogeny vyžaduje komplexní znalosti fyziologie rostlinné buňky, je však důležitým předpokladem různorodých biotechnologických aplikací.

50

9. Seznam použité literatury Carle, S. A., Bates, G. W., Shannon, T. A. (1998): Hormonal control of gene expression during reactivation of the cell cycle in tobacco mesophyll protoplasts. Journal of Plant Growth Regulation, 17, 221-230. Cápal, P. (2012): Epigenetické aspekty protoplastových kultur. Diplomová práce, str. 34. Cosgrove, D. J. (2005): Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6, 850-861. Chivasa, S., Ndimba, B. K., Simon, W. J., Robertson, D., Yu, X. L., Knox, J. P., Bolwell, P, Slabas, A. R. (2002): Proteomic analysis of the Arabidopsis thaliana cell wall. Electrophoresis, 23, 1754-1765. Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. (2005): Plant protoplast technology: Current status. Acta Physiologiae Plantarum, 27, 117-129. De Marco, A., Roubelakis-Angelakis, K. A. (1996): Hydrogen peroxide plays a bivalent role in the regeneration of protoplasts. Journal of Plant Physiology, 149, 109-114. Demidchik, V.,Shang, Z., Shin, R., Tompson, E., Rubio, L.,Laohavisit, A., Mortimer, J. C., Chivasa, S., Slabas, A. R., Glover, B. J., Schachtman, D. P., Shabala, S. N., Davies, J. M. (2009): Plant extracellular ATP signaling by plasma membrane NADPH oxidase and Ca2+ channels. The Plant Journal, 58, 903–913. Ernst, H. A., Olsen, A. N., Skriver, K., Larsen, S., Leggio, L. L. (2004): Structure of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors. EMBO Reports, 5, 297-303. Euglem, T., Somssich, I. E. (2007): Network of WRKY transcription factors in defense signaling. Current Opinion in Plant Biology, 10, 366-371. Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R. Schubert, I. (2002): Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. PNAS, 99, 14584-14589. Grafi, G. (2004): How cells dedifferentiate: a lesson from plants. Developmental Biology, 268, 1–6. Grafi, G., Chalifa-Caspi, V., Nagar, T., Plaschkes, I., Barak, S., Ransbotyn, V. (2011): Plant response to stress meets dedifferentiation. Planta, 233, 433-438. 51

Hirt, H. (2000): Connecting oxidative stress, auxin, and cell cycle regulation trough a plant mitogen-activated protein kinase pathway. PNAS, 97, 2405–2407 Holková, I., Bezáková, L., Vanko, M., Bilka, F., Obložinský, M. (2009): Lipoxygenázy a ich význam v biochemických procesoch v rastlinných organismoch. Chemické listy, 103, 487-495 Jakoby, M., Weisshaar, B., Dröge-Laser, W., Vincente-Carbajosa, J, Tiedemann, J., Kroj, T., Percy, F. (2004): bZIP transcription factors in Arabidopsis. Trends in Plant Science, 7, 106-111. Kliebenstein, D. J., Monde, R. A., Last, R. L. (1998): Superoxid dismutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family disparate regulation and protein localization. Plant Physiology, 118, 637-650. Kwon, H. K., Yokoyama, R., Nishitani, K. (2005): A proteomic approach to apoplastic proteins involved in cell wall regeneration in protoplasts of Arabidopsis suspension-cultured cells. Plant and Cell Physiology, 46, 843–857. Luštinec, J., Žárský, V.(2005): Úvod do fyziologie vyšších rostlin, Univerzita Karlova v Praze, nakladatelství Karolinum, 40-45. Maccarrone, M., Van Zadelhoff, G., Veldink, G. A., Vliegenthart, J. F. G., Finazzi-Agroa, A. (2000): Early activation of lipoxygenase in lentil (Lens culinaris) root protoplasts by oxidative stress induces programmed cell death. European Journal of Biochemistry, 267, 5078-5084. McClung C. R. (1997): Regulation of catalases in Arabidopsis. Free Radical Biology and Medicine, 23, 489-496. Melan, M. A., Dong, X., Endara, M. E., Davis, K. R., Ausubel, F. M., Peterman, T. K. (1993): An Arabidopsis thaliana lipoxygenase gene can be induced by pathogens, abscisic acid and methyl jasmonate. Plant Physiology, 101, 441-450. O´Neill, C. M., Mathias, R. J. (1993): Regeneration of plants from protoplasts of Arabidopsis thaliana L. cv. Columbia (C24), via direct embryogenesis. Journal of Experimental Botany, 44, 1579-1585. Ondřej, V., Navrátilová, B., Protivánková, I., Piterková, J., Sedlářová, M., Luhová, L. Lebeda, A. (2010): Recondensation level of repetitive sequences in the plant protoplast nucleus is limited by oxidative stress. Journal of Experimental Botany, 61, 2395–2401.

52

Oomen, R.J.F.J., Bergervoet, M.J.E.M., Bachem, C.W.B., Visser, R.G.F., Vincken, J.P. (2003): Exploring the use of cDNA-AFLP with leaf protoplasts as a tool to study primary cell wall biosynthesis in potato. Plant Physiology and Biochemistry, 41, 965–971. Papadakis, A. K., Siminis, C. I., Roubelakis-Angelakis, K. A. (2001): Reduce activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in plant protoplasts. Plant Physiology, 126, 434-444. Papadakis, A. K., Roubelakis-Angelakis, K. A. (2002): Oxidative stress could be responsible for the recalcitrance of plant protoplasts. Plant Physiology and Biochemistry, 40, 549 – 559. Pasternak, T. P., Prinsen, E., Ayaydin, F., Miskolczi, P., Potters, G., Asard, H., Van Onckelen, H. A., Dudits, D., Feher, A. (2002): The role of auxin, pH and stress in the activation of embryogenic cell division in leaf protoplast-derived cells of Alfalfa. Plant Physiology, 129, 1807-1819. Pieterse, C. M. J., Van Wees, S. C. M., Hoffland, E., VanPelt, J. A., VanLoon, L. C. (1996): Systemic resistance in Arabidopsis induced by biocontrol bacteria is independent of salicylic acid accumulation and pathogenesis-related gene expression. The Plant Cell, 8, 1225-1237. Piterková, J., Tománková, K., Luhová, L., Petřivalský, M., Peč, P. (2005): Oxidativní stres: lokalizace tvorby aktivních forem kyslíku a jejich degradace v rostlinném organismu. Chemické listy, 99, 455 – 466. Shin, R., Schachtman, D.P. (2004): Hydrogen peroxide mediates plant root cell response to nutrient deprivation. PNAS, 101, 8827–8832. Tessadori, F., Chupeau, M. Ch., Chupeau, Y., Knip, M., Germann, S., van Driel, R., Fransz, P., Gaudin, V. (2007): Large-scale dissociation and sequential reassembly of pericentric heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells. Journal of Cell Science 120, 1200–1208. Yang, X., Tu, L., Zhu, L., Fu, L., Min, L., Zhang, X. (2008): Expression profile of genes involved in cell wall regeneration during protoplast culture in cotton by suppression subtractive hybridization and macroarray. Journal of Experimental Botany, 59, 3661-3674.

53