Univerzita Palackého v Olomouci
Diplomová práce
Olomouc 2014
Bc. Tereza Kršjaková
Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie a genetiky
Exprese molekul post-transkripční regulace inhibitorů proteolytických enzymů u zánětlivých onemocnění plic. Diplomová práce
Bc. Tereza Kršjaková Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie Forma studia: Prezenční
Olomouc 2014
Vedoucí práce: Prof. MUDr. Martin Petřek, CSc. Školitel-specialista: Mgr. Zdenka Navrátilová, Ph.D
Prohlašuji, že jsem předkládanou diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením Prof. MUDr. Martina Petřka, CSc. a Mgr. Zdenky Navrátilové, Ph.D s použitím uvedených literárních zdrojů.
V Olomouci dne 30.4.2014
………………………….
SOUHRN Chronický zánět plic je společným znakem chronické obstrukční plicní nemoci (CHOPN),
astma
bronchiale
(AB)
a
plicní
sarkoidózy
(plicní
S).
Aktivované
bronchoalveolární (BAL) buňky během chronického zánětu produkují nadměrné množství cytokinů, chemokinů a proteolytických enzymů. Exprese těchto zánětlivých molekul je na post-transkripční úrovni regulována pomocí RNA-vazebných proteinů. regulovat
také
inhibitory
proteolytických
enzymů
RBPs mohou a
ovlivňovat
proteolytickou-antiproteolytickou rovnováhu. Exprese RBPs nebyla dosud u pacientů se zánětlivými onemocněními plic studována. Cílem experimentální části práce proto bylo stanovit expresi dvou inhibitorů matrix metaloproteinas (RECK a PTEN) a šesti RNA-vazebných proteinů (AUF1, HuR, TIA-1, TIAR, NCL a PCBP2). Relativní mRNA exprese genů AUF1, HuR, TIA-1, TIAR, NCL, PCBP2, RECK a PTEN byla kvantifikována v buňkách bronchoalveolární laváže (BAL) pacientů s CHOPN (n=30), AB (n=19) a plicní S (n=50) a u kontrolních jedinců (n=23) metodou RT-qPCR. U všech pacientů byla ve srovnání s kontrolním souborem podstatně snížena relativní mRNA exprese AUF1, nejvýrazněji u pacientů plicní S (p<0,001), méně pak u pacientů s CHOPN (p=0,01) a s AB (p=0,03). Kromě AUF1 byla u pacientů s CHOPN a plicní S snížena také bronchoalveolární mRNA exprese HuR (p=0,02; p<0,001). Relativní exprese TIA-1 (p<0,001), TIAR (p=0,001) a PCBP2 (p=0,005) byla snížena jen u pacientů s plicní S. U všech sledovaných diagnóz (CHOPN, AB, plicní S) byl zaznamenán nižší počet transkriptů RECK (p=0,003; p=0,02; p<0,001), jehož mRNA na svém 3´konci obsahuje vazebné motivy pro studované RBPs. Podrobnější analýza výsledků ukázala pozitivní korelaci relativní mRNA exprese všech studovaných RBPs s relativní mRNA expresí RECK. Přínosem předkládané práce je první stanovení exprese RBPs in vivo. Navíc byla mRNA exprese měřena v buňkách BAL pacientů se třemi různými plicními nemocemi. Vztah mezi RBPs a RECK by měl být předmětem dalšího studia.
SUMMARY Chronic pulmonary inflammation is a common characteristic of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma bronchiale (AB) and pulmonary sarcoidosis (S). The activated bronchoalveolar (BAL) cells of the chronic inflammation synthesize the elevated amount of inflammatory cytokines, chemokines and proteolytic enzymes. Expression of these inflammatory molecules is post-transcriptionally regulated by RNA-binding proteins (RBPs). RBPs can also affect the expression of two inhibitors of proteolytic enzymes (RECK and PTEN) and by this way modify proteolytic-anti-proteolytic balance of the inflammation. There is not any information on the expression profile of key RBPs in COPD, AB and pulmonary S patients. The aim of this master thesis was therefore to evaluate the relative expression of six RBPs (AUF1, HuR, TIA-1, TIAR, NCL and PCBP2) and two inhibitors of proteolytic enzymes (RECK, PTEN) and their mutual relationship in COPD, AB and pulmonary S. Relative mRNA expression of AUF1, HuR, TIA-1, TIAR, NCL, PCBP2, RECK and PTEN genes was quantified in BAL cells from the patients with COPD (n=30), AB (n=19) and pulmonary S (n=50) and controls (n=23) using RT-qPCR method. Immunocytochemistry was carried out to indentify the BAL cells producing AUF1 and RECK proteins. Results of this thesis shew decreased mRNA expression of AUF1 in patients with pulmonary S (p<0.001), COPD (p=0.01) and AB (p=0.03) compared to control group. Besides AUF1 the mRNA expression of HuR was decreased in COPD and pulmonary S (p=0.02; p<0.001). TIA-1 (p<0.001), TIAR (p=0.001) and PCBP2 (p=0.005) were only down-regulated in the patients with pulmonary S. Regarding two inhibitors of proteolytic enzymes, the number of RECK mRNA transcripts was decreased
in all three diagnosis compared to controls (pCOPD =0.003;
pAB=0.02; pS<0,001). We failed to observe any differences in PTEN expression between our patients and control cohort (p>0.05). The BAL expression of RECK, which mRNA contains binding motifs for RBPs, correlated positively with the BAL mRNA expressions of all six RBPs. Main benefit of this study is the first in vivo investigation of the expression profile of RNA-binding proteins (RBPs). In addition, RBPs were investigated in bronchoalveolar cells associated with three different lung pathogeneses. The relationship between RNA-binding proteins and RECK should be a subject of further protein and functional studies.
Tato práce vznikla v rámci účasti školitele v projektech IGA MZ ČR NS10267-3, NT/11117-6
a
za
grantové
podpory
IGA
PU
LF
2013_009,
2014_012
a CZ.1.05/2.1.00/01.0030.
Ráda bych poděkovala v první řadě svému vedoucímu Prof. MUDr. Martinu Petřkovi, CSc. za možnost pracovat v Laboratoři imunogenomiky a imunoproteomiky (LIGP) LF UP v Olomouci a za odborné vedení. Srdečně děkuji také mé školitelce Mgr. Zdence Navrátilové, Ph.D za vstřícný přístup, cenné rady, trpělivost a ochotu, se kterou mi věnovala svůj čas. Velký dík patří také všem členům kolektivu LIGP za vytvoření příjemných pracovních podmínek. Děkuji také mým rodičů, kteří mě podporovali po celou dobu mého studia.
OBSAH 1
ÚVOD ................................................................................................................................ 8
2
CÍLE PRÁCE.................................................................................................................... 9
3
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY ..................................................... 10 3.1
3.1.1
Chronická obstrukční plicní nemoc .................................................................... 10
3.1.2
Astma bronchiale ................................................................................................ 12
3.1.3
Sarkoidóza .......................................................................................................... 15
3.2
RNA-vazebné proteiny .............................................................................................. 18
3.2.1
Vazebná místa pro RNA-vazebné proteiny ........................................................ 19
3.2.2
Interakce RNA-vazebných proteinů mezi sebou ................................................ 20
3.2.3
RNA-vazebné proteiny a miRNAs: komplexní síť regulace .............................. 20
3.2.4
AUF1 .................................................................................................................. 22
3.2.5
HuR..................................................................................................................... 23
3.2.6
Nucleolin ............................................................................................................ 24
3.2.7
TIA-1 a TIAR ..................................................................................................... 26
3.2.8
PCBP2 ................................................................................................................ 26
3.2.9
Role RBPs v regulaci mediátorů zánětu ............................................................. 27
3.3
4
Zánětlivá onemocnění plic ......................................................................................... 10
Matrix metaloproteinasy a jejich inhibitory............................................................... 29
3.3.1
Role matrix metaloproteinas v respirační imunitě .............................................. 30
3.3.2
RECK ................................................................................................................. 31
3.3.3
PTEN .................................................................................................................. 32
MATERIÁL A METODY ............................................................................................. 33 4.1
RT-qPCR ................................................................................................................... 33
4.1.1
Charakteristika studovaného souboru a biologický materiál .............................. 33
4.1.2
Izolace buněk bronchoalveolární laváže............................................................. 33
4.1.3
Izolace celkové RNA .......................................................................................... 34
4.1.4
Reverzní transkripce ........................................................................................... 35
4.1.5
Real-time PCR .................................................................................................... 36
4.1.6
Analýza dat z real-time PCR .............................................................................. 38
4.1.7
Statistické zpracování ......................................................................................... 39
4.2
Imunocytochemie ...................................................................................................... 39
4.2.1
Zpracování bronchoalveolární laváže pro imunocytochemii ............................. 39
4.2.2
Vlastní provedení imunocytochemie .................................................................. 39
4.2.3
Hodnocení preparátů........................................................................................... 40
4.3
Použité chemikálie a roztoky ..................................................................................... 40
4.4
Přístrojové vybavení .................................................................................................. 43
5 VÝSLEDKY ........................................................................................................................ 44 5.1
Relativní exprese vybraných molekul u pacientů se zánětlivým onemocněním plic 44
5.1.1
RNA vazebné proteiny ....................................................................................... 44
5.1.2
Vazební partneři ................................................................................................. 51
5.1.2
Inhibitory proteolytických enzymů .................................................................... 51
5.1.3
Korelace mezi RNA vazebnými proteiny a inhibitory proteolytických enzymů 53
5.2
Imunocytochemická detekce AUF1 a RECK ............................................................ 55
6
DISKUZE ........................................................................................................................ 57
7
ZÁVĚR ............................................................................................................................ 61
8
LITERATURA ............................................................................................................... 62
9
SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ .................................................. 78
PŘÍLOHY ............................................................................................................................... 82
1
ÚVOD Matrix metaloproteinasy (MMPs) patří mezi proteolytické enzymy, které hrají
významnou roli v imunitních procesech probíhajících v dýchacím systému. Tyto zinekdependentní endopeptidasy jsou schopny degradovat všechny složky extracelulární matrix. Jsou ovšem důležité také pro regulaci uvolnění a aktivace chemokinů, cytokinů a dalších bioaktivních molekul a podílejí se tak na udržování homeostázy mnoha tkání. Vzhledem k tomu, že nekontrolovaná exprese a aktivita MMPs vede k narušení homeostasy a k patologickýcm procesům, podléhají tyto enzymy komplexní regulaci. Zásadní regulační faktor na post-transkripční úrovni představují RNA-vazebné proteiny (RBPs). Ty ovlivňují stabilitu a/nebo translaci cílových mRNA transkriptů. RBPs se váží přímo na mRNA MMPs nebo na ně působí prostřednictvím specifických a nespecifických inhibitorů. RBPs jsou potenciálními cíli protizánětlivé terapie plicních onemocnění, a proto by jejich studium nemělo být opomíjeno. Teoretická část předkládané diplomové práce pojednává o molekulární podstatě zánětlivých onemocnění plic se zaměřením na roli MMPs a jejich post-transkripční regulaci. Zvláštní pozornost je věnována právě RBPs. Předmětem experimentální části práce je hodnocení bronchoalveolární mRNA exprese vybraných RBPs (AUF1, HuR, TIA-1, TIAR, NCL a PCBP2) a specifických inhibitorů MMPs (RECK a PTEN) u pacientů se zánětlivými onemocněními plic. Studovány byly tři různé diagnózy- chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidóza (plicní S).
8
2 CÍLE PRÁCE 1. Zpracování literární rešerše zaměřené na problematiku RNA-vazebných proteinů (RBPs). 2. Stanovení mRNA exprese genů pro RBPs v bronchoalveolárních buňkách pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (plicní S).
3. Stanovení mRNA exprese vybraných genů, které by mohly podléhat regulaci řízené RNA-vazebnými proteiny (RBPs). 4. Interpretace výsledků v kontextu patogeneze studovaných onemocnění.
9
3
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
3.1
Zánětlivá onemocnění plic Předkládaná práce se zabývá třemi onemocněními plic, jejichž společným
jmenovatelem je zánět. Liší se ovšem typem a lokalizací zánětu, etiologií a patogenezí. Jedná se o dvě obstrukční nemoci- chronickou obstrukční plicní nemoc (CHOPN) a astma bronchiale (AB) a jedno intersticiální plicní onemocnění- plicní sarkoidózu (plicní S).
3.1.1 Chronická obstrukční plicní nemoc Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) definuje chronickou obstrukční plicní nemoc (CHOPN) jako nemoc charakterizovanou omezeným průtokem vzduchu v průduškách- bronchiální obstrukcí, která není úplně reverzibilní. Bronchiální obstrukce většinou progreduje a je spojena s abnormální zánětlivou odpovědí na škodlivé částice a plyny. Podle tíže onemocnění se průběh CHOPN dělí na 4 stádia. V současné době je CHOPN celosvětově čtvrtou nejčastější příčinou úmrtí (Vestbo et al., 2013). Celosvětová prevalence CHOPN se pohybuje v průměru mezi 5-10 % (www.thoracic.org). Patologickými změnami jsou u pacientů s CHOPN postiženy především proximální dýchací cesty, periferní průdušky, plicní parenchym a plicní cévy. Klinicky se CHOPN projevuje kašlem, zvýšenou produkcí hlenu, dušností a s ní související sníženou tolerancí fyzické námahy. Průběh onemocnění bývá provázen také hypertenzí v plicnici a vývojem plicního srdce (Kolek et al., 2011). Na vzniku CHOPN se podílejí genetické faktory v kombinaci se škodlivými vlivy vnějšího prostředí. Celosvětově nejrozšířenějším rizikovým faktorem je kouření cigaret. To způsobuje 85-90 % případů CHOPN. Z genetických faktorů je nejlépe popsán dědičný nedostatek α1-antitrypsinu. Asi 1 % pacientů s CHOPN má tuto dědičnou formu nemoci. Pokud nedojde k exacerbaci (viz níže), je vývoj CHOPN pozvolný (Bureš et Horáček 2003). Molekulární mechanismus vedoucí k vývoji CHOPN není dosud zcela objasněn. Pravděpodobné schéma patogeneze je znázorněno na Obr. 1. Opakovaná expozice cigaretovému kouři (pasivní i aktivní) vede k aktivaci alveolárních makrofágů, které produkují chemotaktické faktory, například interleukin 8 (IL-8) a leukotrien B4 (LTB4). Důsledkem je migrace neutrofilů do sliznice dýchacích cest. Aktivované neutrofily produkují proteolytické enzymy (neutrofilní elastasu, katepsin G a matrix metaloproteinasy - MMPs), které narušují pojivovou tkáň plicního parenchymu. Proteolytické enzymy zároveň stimulují 10
sekreci hlenu. Za fyziologických podmínek je udržována rovnováha mezi proteolytickými enzymy a jejich inhibitory. Hlavními antiproteasovými faktory jsou α1-antitrypsin a α1-chymotrypsin. Epitelové buňky dýchacích cest produkují sekreční leukocytární proteasový inhibitor s lokálním protektivním účinkem. V plicní tkáni vznikají tkáňové inhibitory metaloproteinas (TIMPs) a cystatiny rovněž inhibující MMPs. Dysbalance proteasového-antiproteasového systému vede k destrukci elastinových vláken a ke vzniku emfyzému.
V kaskádě
zanětlivého
procesu
mohou
být
zapojeny
i
cytotoxické
CD8+ T-lymfocyty (Barnes 2002; Bureš et al., 2003) .
Obr. 1: Etiopatogeneze chronické obstrukční plicní nemoci (Barnes 2002), upraveno. Průběh onemocnění často provází exacerbace. Exacerbace je charakterizována zhoršením symptomů nemoci (dušnosti, kašle a/nebo vykašlávání) a amplifikací zánětu. Během exacerbace se ve sputu zvyšuje celkové množství zánětlivých buněk (T-lymfocytů, makrofágů, eosinofilů) a hladina mediátorů zánětu IL-6, IL-8, RANTES (chemoatraktant pro eosinofily), eosinofilního kationtového proteinu (ECP) a myeloperoxidasy (MPO). Exacerbace může být vyvolána bakteriemi (nejčastěji Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae a Moraxella catarrhalis), viry (převážně rhinoviry), znečištěním ovzduší, chladným a sychravým počasím, přerušením léčby nebo kontraindikací některých léků (například sedativ, narkotik, β-blokátorů). Typickým markerem u bakteriální exacerbace je
11
zvýšená hladina IL-8 ve sputu pacienta. V případě exacerbace vyvolané virální infekcí je ve sputu zvýšen obsah IL-6 (Kolek et al., 2011). Pro diagnostiku CHOPN má zásadní význam potvrzení obstrukce spirometrickým vyšetřením. Pacienti s CHOPN mají sníženou hodnotu FEV1 (usilovně vydechnutý objem za 1 s). Poměr FEV1/FVC (FVC usilovná vitální kapacita) snížený pod 0,7 svědčí o obstrukci. U pacientů s CHOPN zůstává i po usilovném výdechu část vzduchu v plicích, a proto tito pacienti vykazují zvýšenou hodnotu RV (reziduální objem). V krevním séru je vyšetřován počet neutrofilů, hladina C-reaktivního proteinu (CRP), IL-6, IL-8, interferonu γ (IFNγ) stimulujícího makrofágy k produkci Tumor Necrosis Factor α (TNFα). Ve sputu pacientů s CHOPN je detekován zvýšený počet zánětlivých buněk (lymfocytů, makrofágů, neutrofilů, při exacerbacích i eosinofilů) a zvýšená hladina LTB4, cytokiny TNFα, IL-6, IL-8, při exacerbacích i RANTES. BAL umožňuje navíc sledovat hladinu neutrofilní elastasy a myeloperoxidasy (Kolek et al., 2011; Vestbo et al., 2013). Dalším potenciálním markerem je matrix metaloproteinasa 12 (MMP-12) (Wu et al., 2003).
3.1.2 Astma bronchiale Astma bronchiale (AB) je chronické zánětlivé onemocnění dýchacích cest provázené hyperreaktivitou průdušek. Zánět je v plicích pacientů přítomen trvale i v bezpříznakovém období. V důsledku zánětlivých procesů dochází k reverzibilní bronchiální obstrukci a k remodelaci stěny bronchů. Celosvětová prevalence AB se pohybuje mezi 1-18 % (Kolek et al., 2011). AB se projevuje opakující se dušností, kašlem, hvízdavým dýcháním a pocitem tíhy na hrudi. K těmto epizodám dochází nejčastěji v noci a časně ráno. V průběhu onemocnění může dojít k amplifikaci zánětu a zhoršení stavu- exacerbaci, dříve označované jako akutní astma nebo astmatický záchvat. Mimo exacerbace může být pacient zcela asymptomatický. V rozvoji astmatu převažuje vliv prostředí nad faktory genetickými. Nejzávažnějším predisponujícím genetický faktorem je atopie, kdy pacient reaguje na alergeny vnějšího prostředí nadměrnou tvorbou protilátek IgE. Geny zodpovědné za atopii jsou lokalizovány na chromozomech 5 a 11. Geneticky predisponovaní jedinci mají narušenou rovnováhu v zastoupení lymfocytů silně ve prospěch Th2 lymfocytů. Genetická predispozice se vyvíjí již od 22. týdne nitroděložního vývoje v závislosti na negativních faktorech vnějšího prostředí (induktorech) (Bureš et al., 2003; Agostinis et al., 2008; Kolek et al., 2011). Faktory vnějšího prostředí, podílející se na manifestaci astmatu, dělíme na induktory (alergeny, iritancia), které jsou samy schopny navodit zánět, a spouštěče (tělesná námaha, 12
kouření, znečištění vzduchu, emoční vlivy, gastroezofageální reflux a některé léky) které samy o sobě zánět nevyvolávají, ale mohou zánětlivé procesy vystupňovat (Teřl et al., 2004). V patogenezi astmatu je zapojeno velké množství buněk, viz Obr. 2. Th2 lymfocyty v reakci na antigen produkují velké množství cytokinů (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13). IL-4 spolu s IL-6 a IL-13 indukují přeměnu B-lymfocytů na plazmatické buňky, které ve velkém množství produkují IgE protilátky, vážící se na receptory žírných buněk. Prostřednictvím IL-5 jsou aktivovány eosinofily, jejichž produkty se podílejí na remodelaci stěny průdušek. Při opakovaném styku s alergenem nebo jiným spouštěčem aktivované zánětlivé buňky produkují další mediátory (histamin, leukotrieny, substance P a další). Prostřednictvím mediátorů dochází k vazodilataci, stimulaci mucinózních žlázek a podráždění nervových zakončení. Důsledkem jsou patologické změny dýchacích cest- nadměrná tvorba hlenu, edém sliznice a bronchokonstrikce. Tyto změny vedou k výše zmiňovaným klinickým příznakům (Bureš et al., 2003; Barnes 2008).
Obr. 2: Etiopatogeneze astmatu, převzato (Barnes 2004).
13
Základem diagnostiky AB je průkaz reverzibilní bronchiální obstrukce a bronchiální hyperreaktivity.
Reverzibilita
obstrukce
je
vyšetřována
po
provedení
spirometrie
bronchodilatačním testem. Pacientovi je inhalačně podáno 400 µg salbutamolu. Jedná se o β2 agonistu s rychlým nástupem účinku. Po 30 min je hodnocena křivka průtok/objem. Bronchodilatační test je vhodným nástrojem pro prvotní diferenciální diagnostiku mezi AB a CHOPN. U pacientů s normálním výsledkem spirometrického měření jsou prováděny testy bronchiální hyperreaktivity. Podstatou tohoto testu je sledování změny citlivosti dýchacích cest po inhalaci histaminu nebo metacholinu (Agostinis et al., 2008; Kolek et al., 2011). Pro klinickou praxi má velký význam vyšetření znaků zánětu. V séru je sledován počet eosinofilů a hladina eosinofilního kationtového proteinu (ECP). Ve vydechovaném vzduchu je měřena koncentrace oxidu dusnatého u astmatiků korelující s aktivitou eosinofilního zánětu. Vyšetření zastoupení jednotlivých typů zánětlivých buněk v indukovaném sputu má význam
pro
určení
zánětlivého
fenotypu
astmatu
(eosinofilní,
neutrofilní,
paucigranulocytární, smíšený). Pacienti s eosinofilním fenotypem zánětu obvykle dobře reagují na léčbu kortikosteroidy. Odběr BAL se běžně neprovádí, ale jeho analýza je přínosem pro diferenciální diagnostiku (Agostinis et al., 2008; Kolek et al., 2011). CHOPN a AB patří mezi obstrukční zánětlivá respirační onemocnění, sdílející některé společné znaky, proto bývá často složité tyto dvě diagnózy od sebe odlišit. V Tab. 1 jsou shrnuty znaky, ve kterých se CHOPN a AB většinou liší. Tab. 1: Základní diagnostické aspekty pro odlišení chronické obstrukční plicní nemoci (CHOPN) a bronchiálního astmatu (AB) dle (Kolek et al., 2011; Vestbo et al., 2013). CHOPN
AB alergická rýma nebo ekzém,
anamnéza
kouření
rodinná anamnéza astmatu či alergie
nástup onemocnění
ve středním věku
v mladším věku (často v dětství)
obstrukce
ireverzibilní
reverzibilní
zánět
neutrofilní
převážně eosinofilní
místo zánětu
periferní dýchací cesty, plicní parenchym, plicní cévy
proximální dýchací cesty, při těžkém AB i periferní dýchací cesty
14
Pokračování Tab. 1: Základní diagnostické aspekty pro odlišení chronické obstrukční plicní nemoci (CHOPN) a bronchiálního astmatu (AB) dle (Kolek et al., 2011; Vestbo et al., 2013).
CHOPN
AB
neutrofily ++, makrofágy ++,
eosinifily ++, makrofágy +,
CD8+ T lymfocyty (Tc1)
CD4+ T lymfocyty (Th2)
mediátory zánětu
IL-8, TNFα, IL-1β, IL-6, NO+
eotaxin, IL-4, IL-5, IL-13, NO+++
oxidační stres
+++
+
buňky
*IL- interleukin, NO- oxid dusnatý, TNF- tumor nekrotizující faktor
3.1.3 Sarkoidóza Sarkoidóza je multisystémové granulomatózní onemocnění neznámé etiologie, histologicky charakterizované přítomností nekaseifikujících granulomů v postižených orgánech. Nejčastěji se projevuje bilaterální hilovou lymfoadenopatií, plicní infiltrací a očními a kožními lézemi. V 90 % případů sarkoidóza postihuje plíce, může ale napadat i jiné orgány- játra, slezinu, lymfatické uzliny, slinné žlázy, srdce, nervový systém, svaly, kosti (1999) (dle American Thoracic Society). Nejčastěji jsou sarkoidózou postiženi dospělí jedinci mladšího a středního věku (obvykle ve věku 25-40 let). Častěji se sarkoidóza vyskytuje u žen (incidence 19/100000 obyvatel) než u mužů (incidence 16,5/100000 obyvatel). V mnoha případech se toto onemocnění objevuje u mladých žen po porodu, což je pravděpodobně dáno poklesem hormonální aktivity navozené těhotenstvím. Vyšší prevalence sarkoidózy byla zaznamenána ve Skandinávii, nižší naopak v tropických zemích a v zemích s častým výskytem tuberkulózy (Nunes et al., 2007; Kolek et al., 2011). Jedinci postižení plicní sarkoidózou mohou být asymptomatičtí a onemocnění je u nich objeveno náhodně při rentgenovém snímku plic, na kterém je patrné oboustranné zvětšení hilových uzlin. Manifestní formy onemocnění se projevují akutním nebo chronickým syndromem zánětlivé odpovědi. Sarkoidóza je považována za chronickou, pokud trvá déle než dva roky. Dle výsledků skiagramu hrudníku se plicní sarkoidóza dělí do 5 stádií. Charakteristika jednotlivých stádií je uvedena v Tab. 2. Respiračními příznaky jsou kašel a dušnost, objevující se až ve stádiu, kdy v plicním intersticiu dochází k fibrotickým změnám (stádium III a IV). U některých pacientů se objevuje také bolest na hrudi (Bureš et al., 2003; Teřl et al., 2004).
15
Tab 2.: Charakteristika stádií plicní sarkoidózy dle (Bureš et al., 2003; Teřl et al., 2004). stádium 0 I
II
charakteristické znaky lymfocytární alveolitida, bez rtg nálezu oboustranné symetrické zvětšení hilových uzlin, horečka, artralgie, nodózní erytém hlavně na bércích a kolem kotníků (Löfgrenův syndrom) bilaterální hilová lymfoadenopatie s plicními infiltráty převážně v horním a středním poli plic
III
plicní infiltráty bez hilové lymfoadenopatie („útěk do plic“)
IV
plicní infiltráty, fibróza, často cysty a emfyzematózní buly
*rtg- rentgen
Etiologie sarkoidózy dosud není objasněna, předpokládá se ovšem, že u geneticky vnímavého jedince je působením vnějších faktorů vyvolána abnormální imunitní odpověď. Pro určitou genetickou predispozici svědčí familiární
výskyt
sarkoidózy,
zaznamenaný
v 5-16 % případů, a větší konkordance u monozygotních dvojčat v porovnání s dvojčaty dizygotními. Genetická predispozice není dána defektem jednoho genu, ale podílí se na ní více genů malého účinku (Grunewald 2008; Spagnolo et Grunewald 2013). Mnoho genů souvisejících se sarkoidózou bylo objeveno díky celogenomovým asociačním studiím. Ty prokázaly například význam polymorfismů genů hlavního histokompatibilního systému HLA (human leukocyte antigen) třídy I a II. Alely HLA genů I. třídy HLA-B7 a HLA-B8 a alely HLA genů II. třídy HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*12, HLA-DRB1*14 a HLA-DRB1*15 souvisí s vyšším rizikem sarkoidózy. Alela HLA-DRB1*03 je spojena s akutní formou onemocnění. Alely HLA genů II. třídy HLA-DRB1*01 A HLA-DRB1*04 představují pro svého nositele ochranu před sarkoidózou (Morgenthau et Iannuzzi 2011). Mezi geny, u nichž byla zaznamenána asociace se sarkoidózou, patří také Butyrophilin-like 2 (BTNL-2), jehož produkt je kostimulátorem T-lymfocytů. V exonu 5 genu BTNL-2 se nachází jednonukleotidový polymorfismus (SNP) související s alternativním sestřihem a tím pádem se syntézou různých proteinů. Nefunkční BTNL-2 vzniklý v důsledku alternativního sestřihu by mohl vést k nadměrné aktivaci T-lymfocytů, což je v souladu s patofyziologií sarkoidózy (Rybicki et al., 2005). U pacientů se sarkoidózou bývá narušena rovnováha v přežívání aktivovaných zánětlivých buněk. Tato nerovnováha souvisí s funkcí annexinu A11, regulátoru buněčného dělení a apoptózy. V sekvenci genu ANXA11 byl objeven SNP (přítomnost cytosinu C nebo 16
thyminu T) zásadní pro vznik funkčního proteinu (Moss et Morgan 2004). Přítomnost alely T má protektivní účinek vůči chronické sarkoidóze. U pacientů s Löfgrenovým syndromem byl zaznamenán genotyp TT (Mrazek et al., 2011). Dalšími kandidátními geny, objevenými v posledních letech, jsou OS9 (osteosarcoma amplified 9) a NOTCH4 (Adrianto et al., 2012). Ani role environmentálních faktorů v etiologii sarkoidózy není dosud dostatečně prozkoumána. Potenciálními antigeny jsou látky produkované bakteriemi, především mKatG (Mycobacterium catalase-peroxidase) (Song et al., 2005; Chen et al., 2008). Dalšími rizikovými faktory jsou pyl borovic, plísně, pesticidy, prach s částečkami hliníku nebo křemíku a kouření (Valeyre et al., 1988; Newman et al., 2004). Sarkoidóza je charakteristická Th1 odpovědí a akumulací imunokompetentních buněk v epiteloidním granulomu. Centrum granulomu je tvořeno makrofágy, z nichž některé jsou transformovány do vzhledu epiteloidních buněk, spolu s pomocnými CD4+ T-lymfocyty. Periferní oblast granulomu tvoří cytotoxické CD8+ T-lymfocyty spolu s plasmocyty. Starší granulomy jsou obklopeny fibroblasty a kolagenními vlákny (Kolek et al., 2011). Zásadními faktory v tvorbě granulomů jsou cytokiny produkováné Th1 lymfocyty a chemokiny a jejich receptory zodpovědné za infiltraci Th1 lymfocytů do plic (Petrek et al., 2000; Nunes et al., 2007; Agostinis et al., 2008). Vznik granulomu je znázorněn na Obr. 3.
*IFN- interferon; MHC- hlavní histokompatibilní komplex; TCR- T-buněčný receptor; TGF- transformující růstový faktor; TNF- tumor nekrotizující faktor; T Reg- regulační T-lymfocyty
Obr. 3: Vznik granulomu dle (Morgenthau et al., 2011), upraveno. 17
Pro diagnózu sarkoidózy je nutná radiologicky prokázána přítomnost epiteloidního granulomu, v němž nedochází ke kaseifikační nekróze. Zásadním vyšetřením je HRCT (high resolution computed tomography), které pomáhá nejen stanovit diagnózu, ale také posoudit aktivitu onemocnění. Funkční vyšetření plic u pacientů s plicní S na rozdíl od CHOPN a AB většinou neukazuje žádné postižení. Laboratorní vyšetření plicní S není specifické a má v klinické praxi význam pouze orientační. Obvykle je u pacientů se sarkoidózou pozorována zvýšená sedimentace erytrocytů a CRP, leukopenie a lymfopenie. Hyperkalcemie a hyperkalciurie se objevuje v důsledku tvorby vitamínu D3 v granulomu. Imunoregulační index (IR, poměr exprese CD4+/CD8+ na povrchu T-lymfocytů je v krvi snížen (0,8-1). Bronchoalveolární laváž pacientů s plicní sarkoidózou
obsahuje
20-40
%
lymfocytů,
mezi
kterými
převažují
pomocné
CD4+ T-lymfocyty nad cytotoxickými CD8+ T-lymfocyty, IR je zvýšen nad 3,5 (Kolek et al., 2011).
3.2
RNA-vazebné proteiny Post-transkripční kontrola genové exprese spočívá v regulaci stability mRNA a její
translace. Zvláště důležité jsou tyto mechanismy v buňkách imunitního systému, které musí být schopné flexibilně přizpůsobit expresi efektorových proteinů a reagovat tak na měnící se podmínky vnitřního i vnějšího prostředí (Ivanov et Anderson 2013). Post-transkripční regulace genové exprese probíhá prostřednictvím RNA-vazebných proteinů a miRNAs. K interakci s těmito regulačními molekulami dochází především na 3‘ UTR (untranslated region) a 5‘ UTR mRNA. Zatímco interakce s miRNA vede k represi translace nebo k degradaci transkriptů, funkční spektrum RNA-vazebných proteinů je rozmanitější- zvyšují nebo snižují poločas rozpadu mRNA nebo stimulují/inhibují translaci (Abdelmohsen 2012; Ivanov et al., 2013). Funkce RNA-vazebných proteinů, které jsou předmětem této práce, jsou uvedeny v Tab. 3. RNA-vazebné proteiny ovlivňují expresi genů účastnících se odpovědí na stres, imunitní odpovědi, buněčného dělení, diferenciace, apoptózy, senescence a karcinogeneze (Abdelmohsen 2012).
18
Tab. 3: Způsoby post-transkripční regulace genové exprese RNA-vazebnými proteiny. název RBP AUF1
HuR
NCL
funkce
zdroj
destabilizace mRNA, stabilizace mRNA, (Paschoud et al., 2006; Liao et al., 2007; usnadnění translace
Pont et al., 2012; Krishnan et al., 2014)
stabilizace mRNA, usnadnění translace, (Kullmann et al., 2002; Galban et al., 2008; inhibice translace stabilizace mRNA, usnadnění translace, inhibice translace
Abdelmohsen 2012) (Sengupta et al., 2004; Fahling et al., 2005; Takagi et al., 2005; Griffin et al., 2006; Abdelmohsen et al., 2011)
TIA-1 TIAR
PCBP2
inhibice translace, alternativní sestřih
stabilizace mRNA, usnadnění translace, inhibice translace
(Le Guiner et al., 2001; Yu et al., 2003) (Kiledjian et al., 1995; Rieder et al., 2003; Sean et al., 2008; Ostareck-Lederer et Ostareck 2012)
*AUF1- AU-rich element RNA-binding protein; HuR=ELAV L1- embryonic lethal, abnormal vision Drosophila-like 1; NCL- nucleolin; PCBP2- poly(rC) binding protein 2; TIA-1- TIA-1 cytotoxic granule-associated RNA binding protein; TIAR- TIA-1 related
3.2.1 Vazebná místa pro RNA-vazebné proteiny Nejčastějšími motivy rozpoznávanými RBPs jsou ARE (adenine-uridine rich elements) o délce 50-150 nukleotidů. Poprvé byly ARE objeveny u cytokinů s krátkým poločasem účinku (Caput et al., 1986). Později byly nalezeny také v mRNA genů pro růstové faktory, transkripční faktory a protoonkogeny. ARE místa jsou přítomna v 5-10 % mRNA lidských genů a jsou tak hlavním faktorem určujícím stabilitu mRNA (Bakheet et al., 2006). Základními motivy ARE jsou pentamery AUUUA a nonamery UUAUUUAUU, často se ovšem vyskytují ve skupinách a mohou se překrývat (Chen et Shyu 1995). Podle sekvenčních motivů a kinetiky zkracování polyA konce lze ARE rozdělit do třech tříd. I. třída obsahuje menší počet nepřekrývajících se AUUUA pentamerů, II. třída větší počet částečně se překrývajících pentamerů, ARE III. třídy tyto pentamery vůbec neobsahují. ARE II. třídy jsou spojeny s rychlým zkracováním polyA konce, u ARE I. a III. třídy je tento proces pozvolný (Chen et al., 1995). Dalším možným vazebným motivem je CDE (constitutive decay element) (Stoecklin et al., 2003). 19
3.2.2 Interakce RNA-vazebných proteinů mezi sebou Jeden transkript může být rozeznáván jedním nebo více RNA-vazebnými proteiny. Ty mohou kompetovat o vazbu na jedno místo nebo se mohou vázat na různé vazebné motivy téhož transkriptu. RBPs mohou mít na cílovou mRNA stejný účinek nebo mohou působit antagonisticky (Lal et al., 2004). V tomto směru je nejlépe prozkoumaná dvojice proteinů s antagonistickým účinkem AUF1 a HuR. AUF1 je většinou spojen s destabilizací mRNA, HuR naopak s její stabilizací. Vazba těchto dvou RBPs na stejnou cílovou mRNA byla pozorována v jádře, zatímco v cytoplazmě se jejich lokalizace liší- HuR bývá spojen s translačním aparátem, AUF1 s exosomy. Kolokalizace AUF1 a HuR závisí na sekvenci a konformaci cílové mRNA, na dostupnosti obou proteinů (snížení koncentrace jednoho znamená snazší podmínky pro vazbu druhého a naopak) a na stresových faktorech působících na buňku (Loflin et al., 1999; Brennan et Steitz 2001; Lal et al., 2004). Jedním z genů, jehož transkript je rozeznáván AUF1 i HuR, je antiapototický gen BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma 2). Součástí regulační dráhy je i další RBP NCL (nucleolin). Zatímco HuR a NCL stabilizují BCL-2 mRNA, AUF-1 přispívá k její degradaci (Sengupta et al., 2004; Ishimaru et al., 2009; Ishimaru et al., 2010). Zajímavým příkladem kooperace více RBPs je komplex HuR, TIA-1, TIAR a HNRNPU,
který
pozitivně
reguluje
gen
kódující
prozánětlivý
enzym
cyklooxygenasu 2 (COX-2) (Cok et al., 2003).
3.2.3 RNA-vazebné proteiny a miRNAs: komplexní síť regulace 3.2.3.1 Role RNA-vazebných proteinů v biogenezi miRNAs miRNAs jsou krátké (20-23 nt) molekuly RNA negativně regulující stabilitu a/nebo translaci cílové mRNA. V posledních letech byly publikovány studie poukazující na roli RBPs v biogenezi miRNAs. Konkrétně AUF1 se váže na DICER1 mRNA a snižuje tak její stabilitu. Důsledkem je snížení koncentrace proteinu DICER, nezbytného pro maturaci miRNA (Abdelmohsen et al., 2012). Na biogenezi miRNAs se podílí i další RBP nucleolin (Pickering et al., 2011). 3.2.3.2 Současné působení RNA-vazebných proteinů a miRNAs na cílovou mRNA RNA-vazebné proteiny a miRNA mohou navzájem ovlivňovat svou expresi, mohou se navzájem podporovat ve svém účinku na cílovou mRNA nebo na ni mohou působit opačně. Současné působení RBPs a miRNAs na společný cílový transript je zachyceno na Obr. 4. Dle 20
kooperačního modelu je účinek miRNA na cílovou mRNA usnadněn RBP, který otevírá strukturu mRNA a umožňuje tak vazbu miRNA na jinak těžko dostupné transkripty. Dle kompetitivního modelu může RBP působit proti miRNA tak, že rozeznává místo překrývající se s místem pro vazbu miRNA. Pokud se rozpoznávaná místa nepřekrývají, může ke sterickému nebo nesterickému bránění, zahrnujícímu změny sekundární struktury mRNA (Ciafrѐ et Galardi, 2013).
Obr. 4: Kooperativní a kompetitivní působení RBP a miRNA na společnou cílovou mRNA (dle Ciafrѐ et Galardi, 2013, upraveno). Jedním z proteinů interagujícím s širokým spektrem miRNAs jak kooperativně, tak kompetitivně je HuR. Vzhledem k převažujícímu stabilizačnímu vlivu HuR na transkripty se kompetitivní vztah k miRNAs jakožto negativním regulátorům exprese dá očekávat. Příkladem antagonistického působení je regulace transkriptu pro NCL (nucleolin, rovněž RBP) pomocí HuR a miR-494 (Tominaga et al., 2011) a transkriptu pro COX-2 (cyklooxygenasa 2) pomocí HuR a miR-16 (Young et al., 2011). Jsou ale případy, kdy se HuR projevuje jako negativní regulátor a jeho vztah k miRNAs je kooperativní. HuR například usnadňuje interakci komplexu let7-RISC s c-MYC 3’UTR, což vede k represi translace (Kim et al., 2009).
21
Co se týče vzájemné regulace exprese HuR a miRNAs, exprese HuR je negativně regulována miR-125a, miR-519, miR-16 a miR-34a, naopak HuR může negativně ovlivnit expresi miR-7 a nepřímo také miR-16 (Sirkantan et al., 2012).
3.2.4 AUF1 AUF1 (AU-rich element RNA-binding protein), známý také jako hnRNPD (heterogenous nuclear ribonucleoprotein D), je kódován genem lokalizovaným na dlouhém raménku chromozomu 4 (4q21). V důsledku alternativního sestřihu pre-mRNA se AUF1 vyskytuje ve čtyřech různých izoformách, lišících se přítomností domén kódovaných exony 2 a 7: p45AUF1 obsahuje obě zmíněné domény, p42AUF1 obsahuje pouze doménu kódovanou exonem 7, p40AUF1 obsahuje pouze doménu kódovanou exonem 2 a p37AUF1 neobsahuje ani jednu z uvedených domén (Zhang et al., 1993; Wagner et al., 1998). Všechny čtyři izoformy obsahují dvě tandemově uspořádané neidentické RNA rozpoznávající domény (RRMs) a osm aminokyselin dlouhý na glutamin bohatý motiv na C-konci RRM2 (DeMaria et al., 1997). Přítomnost domény kódované exonem 2 je spojena s nižší afinitou k cílové mRNA (Zucconi et al., 2010). p45AUF1 a p42AUF1 se nachází převážně v jádře, menší izoformy se vyskytují i v cytoplazmě (Zhang et al., 1993). AUF1 se běžně vyskytuje ve formě dimerů, může tvořit i oligomery. Tvorba oligomerů je pravděpodobně usnadněna doménou kódovanou exonem 7 (Zucconi et al., 2010). Důležitým faktorem ovlivňujícím afinitu RBP k cílové mRNA je lokální struktura mRNA. AUF1 se preferenčně váže na jednovláknové domény cílové mRNA, zatímco jeho afinita k lokálním dvouvláknovým strukturám je podstatně nižší (Fialcowitz et al., 2005). Po vazbě na ARE místo naopak AUF1 ovlivňuje strukturu cílové mRNA (Wilson et al., 2001). Regulace pomocí AUF1 vede převážně k degradaci substrátů, cílové transkripty jsou směřovány do exosomů a proteasomu. Takto jsou regulovány například geny spjaté s buněčným cyklem CCND1 (cyklin D1), p21, p27 a p16INK4a (Lal et al., 2004; Wang et al., 2006; Trojanowicz et al., 2009; Chang et al., 2010), gen pro regulátor apoptózy BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma 2a) zánětlivé geny GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) a interleukin 6 (IL-6) (Paschoud et al., 2006; Krishnan et al., 2014). V některých případech však AUF1 reguluje své cíle pozitivně. Pozorováno bylo například usnadnění translace mRNA c-MYC (Liao et al., 2007). AUF1 se podílí také na udržování telomer - stimuluje transkripci genu kódujícího katalytickou podjednotku telomerasy Tert (Pont et al., 2012).
22
AUF-1 podléhá post-translačním modifikacím, které značně ovlivňují jeho funkci. Nejčastěji se jedná o fosforylaci. Fosforylace serinu 83 a 87 isoformy p40AUF1 je spojena s destabilizací cílových transkriptů (Wilson et al., 2003), naopak hyperfosforylace katalyzovaná NPM-ALK (nucelophosmin-anaplastic lymphoma kinase) koreluje se stabilizací cílové mRNA (Fawal et al., 2006). U všech čtyř isoforem byla pozorována metylace v oblasti C-terminální RGG (arginin-glycin-glycin) repetice, která je nezbytná pro destabilizaci některých substrátů (Ong et al., 2004). Buněčná koncentrace AUF1 je regulována polyubiquitinací, zaznamenanou u isoforem p37AUF1 a p40AUF1. Zdá se, že přítomnost domény kódované exonem 7 tuto modifikaci inhibuje (Laroia et Schneider 2002). Popsána byla také isomerizace katalyzovaná enzymem Pin1, která potlačuje destabilizační funkci AUF1 během aktivace eosinofilů a T-lymfocytů (Shen et al., 2005; Esnault et al., 2006). Jak již bylo zmíněno výše, výsledný efekt AUF1 na cílový transkript závisí také na přítomnosti dalších RBPs a miRNAs rozpoznávajících stejnou mRNA.
3.2.5 HuR HuR, známý také jako ELAV L1 (embryonic lethal, abnormal vision Drosophila-like 1), patří do rodiny Hu/ELAV proteinů. Na rozdíl od ostatních poteinů této rodiny, které jsou primárně neuronální, není exprese HuR orgánově omezena (Abdelmohsen 2012). Tento RBP je kódován genem lokalizovaným na krátkém raménku chromozomu 19 (19p13.2). HuR na svém N-konci obsahuje dva RRM (RNA recognition motifs) rozpoznávající mRNA sekvence bohaté na adenin a uracil, následuje sekvence pro transport proteinu mezi jádrem a cytoplazmou (nucleocytoplasmic shuttling sequence, HNS) a na C-konci se nachází RRM rozpoznávající polyA konec cílové mRNA (Fan et Steitz 1998; Lopez de Silanes et al., 2004). HuR se nachází převážně v jádře, ale pomocí HNS sekvence se za účasti proteinu CRM1 (chromosome region maintenance 1), transportinů 1 a 2 a importinu-1α může přesunout do cytoplazmy a slouží tak jako adaptor pro mRNA (Rebane et al., 2004). Co se týče regulace transkripce, je HuR známý svým stabilizačním účinkem na cílovou mRNA. Stabilizuje geny pro proteiny hrající roli v buněčném cyklu- cykliny A2, B1, E1, D1 a p21, geny zapojené v procesech proliferace a přežívání buněk- BCL-2, EGF (epidermální růstový faktor), eIF4E (eukaryotický iniciační faktor 4E) a ProTα (prothymosin α) a gen zásadní pro angiogenezi VEGF (vascular endothelilal growth factor) (Abdelmohsen, 2012). mRNA BCL-2, CCNDI (cyklin D1) a Protα jsou navíc vazbou HuR na jejich 3‘ UTR pozitivně regulovány na úrovni translační (Srikantan et Gorospe 2012). Stabilizací mRNA MMP-9 (matrix metaloproteinasa 9) může HuR podporovat karcinogenezi 23
(Abdelmohsen 2012). Funkce HuR se uplatňuje zřejmě také v procesech sestřihu a tvorby zralé mRNA z pre-mRNA. Některé transkripty mohou být působením tohoto RBP regulovány jak pozitivně, tak negativně. Vyplývá to například ze studie, jejíž výsledky naznačují, že HuR stabilizuje mRNA genů TNF-α (tumor nekrotizující faktor α) a COX-2, zatímco ve spolupráci s translačním inhibitorem TIA-1 potlačuje jejich translaci (Katsanou et al., 2005). HuR může podporovat translaci asociací s IRES (internal ribosome entry site) na 5’ konci cílové mRNA. Tímto způsobem je regulován například transkript genu HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1α) (Galban et al., 2008). Pokud dojde k narušení IRES, je translace inhibována. Tak je tomu v případě genu p27, hrajícím roli v buněčném cyklu a proliferaci (Kullmann et al., 2002). Vazba HuR na cílové transkripty je ovlivněna fosforylací aminokyselinových zbytků v oblasti RRMs. Jedním z enzymů katalyzujících fosforylaci HuR, je Chk2 (checkpoint kinase 2), která fosforyluje serin 88, serin 100 a threonin 118, nacházející se v místě RRM1 a RRM2 a mezi nimi (Abdelmohsen et al., 2007; Masuda et al., 2011). Stabilita HuR je regulována ubiquitinací v reakci na teplotní stres a štěpením kaspázami (Mazroui et al., 2008; Abdelmohsen et al., 2009).
3.2.6 Nucleolin Nucleolin (NCL), jehož gen je lokalizován na dlouhém raménku chromozomu 2 (2q.37.1), patří k RBPs s dosud nejkomplexnější popsanou funkcí. Podílí se na různých aspektech metabolismu DNA- na replikaci, udržování telomer, opravách DNA a rekombinaci (Yang et al., 2002; Seinsoth et al., 2003; Khurts et al., 2004; Yang et al., 2009). Roli hraje také při remodelaci chromatinu (Angelov et al., 2006). Co se týče funkcí spjatých s RNA, tento RBP se podílí na transkripci a maturaci ribozomální RNA (rRNA) a biogenezi ribosomů (Bouvet et al., 1998; Ginisty et al., 2000). V posledních letech je velká pozornost věnována funkcím souvisejícím s vazbou NCL na mRNA. Jak název tohoto proteinu naznačuje, NCL se nachází převážně v jadérku, ale přítomen je také v ostatních částech jádra, v cytoplazmě a v plazmatické membráně. Vzhledem k jeho roli při biogenezi ribosomů bývá vysoká exprese NCL pozorována v proliferujících buňkách. Rozmanitosti funkcí, které NCL zastává, odpovídá také jeho komplexní struktura. N-terminální konec, obsahující mnoho fosforylačních míst, je důležitý pro funkce související s rRNA. V centrální části se nachází čtyři RNA rozpoznávající motivy (RRMs). C-konec
24
obsahuje RGG (arginine/glycine-rich) doménu, zprostředkovávající interakce jak s mRNA, tak s dalšími proteiny, včetně ribosomálních proteinů (Abdelmohsen et Gorospe 2012). Vazebnými místy pro NCL na cílové mRNA jsou AREs, přítomné převážně na 3‘ UTR, a sekvence bohaté na guanin rozmístěné na 3‘ UTR, v kódující sekvenci i na 5‘ UTR (Sengupta et al., 2004; Abdelmohsen et al., 2011). Byla popsána řada způsobů, jak NCL reguluje stabilitu a translaci mRNA transkriptů. Vazbou na 3‘ UTR NCL stabilizuje například již zmiňovaný transkript antiapoptotického a pronokogenního genu BCL-2, genu HBB pro β globin a genu APP pro amyloidní prekurzorový protein, spojený s patogenezí Alzheimerovy choroby (Zaidi et Malter 1995; Sengupta et al., 2004; Jiang et al., 2006). Transkript IL-2 je pozitivně regulován vazbou NCL na 5‘ UTR v kooperaci s dalšími proteiny při aktivaci T-lymfocytů (Chen et al., 2000). Spolu s HuR NCL podporuje translaci MMP-9, oba RBPs se váží na 3‘ UTR (Huwiler et al., 2003; Fahling et al., 2005). Translace může být usnadňována také vazbou na elementy bohaté na guanin. Tak je tomu v případě transkriptů antiapototického genu CCNI a genu Akt1, kódujícího kinasu aktivní především v nádorových buňkách (Griffin et al., 2006). NCL může translaci také potlačovat- váže se například na 5‘ UTR mRNA TP53, kódující tumor supresorový protein p53, a zabraňuje tak indukci tvorby tohoto proteinu po poškození DNA (Takagi et al., 2005). Ukazuje se, že NCL hraje roli také při virové infekci. Tento RBP usnadňuje vstup viru do buňky, je důležitý pro translaci a replikaci virové RNA. Byla popsána funkce NCL pro umožnění vstupu lidského parainfluenza viru typu 3 (HPIV3 a jako receptoru pro respirační syncytiální virus (RSV) (Bose et al., 2004; Tayyari et al., 2011). Hladina NCL v buňce je regulována proteolyticky. Oxidativní stres indukuje štěpení NCL, heat-shock proteiny naopak NCL před štěpením chrání (Wang et al., 2004; Wang et al., 2011). V dělících se T-lymfocytech byla zaznamenána snížená autoproteolytická aktivita toho RBP (Chen et al., 1991). Loklizace NCL je ovlivněna fosforylací. Cyklin-dependentní kinasa 1 (Cdk1) podporuje lokalizaci NCL v cytoplazmě, zatímco defosforylované formy se nacházejí v jádře (Schwab et Dreyer 1997). Glykosylace aminokyselinových zbytků je spojena s umístěním NCL v plazmatické membráně (Losfeld et al., 2009). NCL podléhá také dalším posttranslačním modifikacím- metylaci a ADP-ribosylaci, jejich vliv na funkci tohoto RBP ovšem zatím není objasněn (Leitinger et Wesierska-Gadek 1993; Guderian et al., 2011).
25
3.2.7 TIA-1 a TIAR TIA-1 (TIA1 cytotoxic granule-associated RNA binding protein) a TIAR (TIA-1 related), známý také jako TIAL1 (TIA1 cytotoxic granule-associated RNA binding proteinlike 1) jsou příbuzné RNA-vazebné proteiny, homologní ve více než 80 % své aminokyselinové sekvence. Někdy jsou společně označovány jako TIA proteiny. TIA-1 je kódován genem lokalizovaným na krátkém raménku chromozomu 2 (2p13), TIAR genem na dlouhém raménku chromozomu 10. Oba proteiny na svém N-konci obsahují tři RRMs a na C-konci doménu bohatou na glutamin, hrající zásadní roli při tvorbě stresových granul. TIA-1 i TIAR se vyskytují ve dvou izoformách, daných alternativním sestřihem (Kawakami et al., 1994; Beck et al., 1996; Kim et al., 2007). TIA proteiny se podle potřeby přesouvají mezi jádrem a cytoplazmou (Zhang et al., 2005). TIA-1 a TIAR jsou známy především jako translační represory. Váží se zejména na adenin bohaté motivy na 3‘ UTR cílového transkriptu (Kim et al., 2011). Translaci mohou ovšem
regulovat
také
vazbou
na
oligopyrimidinovou
sekvenci
na
5‘
konci
(5‘ TOP- 5‘ olygopyrimidine tracts) některých mRNA v reakci na stresové vlivy vnějšího prostředí (Damgaard et Lykke-Andersen 2011). TIA proteiny jsou součástí stresových tělísek, ve kterých mohou být transkripty přechodně uchovávány, dokud nenastanou vhodné podmínky pro jejich translaci (Kedersha et Anderson 2002). Mezi vazebné cíle TIA proteinů patří některé prozánětlivé cytokiny a enzymy spojené se zánětem. Regulace transkriptu COX-2 pomocí kompelxu RBPs HuR, TIA-1, TIAR a HNRNPU byla již zmíněna v kapitole 3.2.2. Oba TIA proteiny jsou také součástí komplexu regulujícího expresi TNFα (Piecyk et al., 2000). TIAR inhibuje translaci proteolytického enzymu MMP-13, jehož exprese je spojena se zánětlivými onemocněními a rakovinou (Yu et al., 2003). TIA-1 je spojen s represí transkripce cytokinů IL-4 a IL-13 v aktivovaných T-lymfocytech (Scheu et al., 2006). TIA proteiny jsou také regulátory alternativního sestřihu. Vazba TIA-1 nebo TIAR na elementy intronů bohaté na adenin spouští procesy vedoucí k zařazení exonů, které by za normálních okolností byly vystřiženy (Le Guiner et al., 2001). Popsána byla také role TIA proteinů v replikaci virů (Li et al., 2002).
3.2.8 PCBP2 PCBP2 (poly(rC) binding protein 2), označovaný také jako hnRNPE2 nebo α-CP2, patří do rodiny hnRNPE RNA-vazebných proteinů. Je kódován genem umístěným na dlouhém raménku chromozomu 12 (12q13.3). Tento RBP obsahuje tři KH (K homology)
26
domény, pomocí níž se specificky váže na jednovláknové polycytosinové (polyC) motivy RNA. PolyC RNA-vazebná aktivita PCBP2 je snižována fosforylací aminokyselinových zbytků (Tommerup et Leffers 1996). PCBP2 se nachází v jádře i cytoplazmě. Co se týče cytoplazmatické lokalizace, za normálních podmínek je PCBP2 akumulován v P-tělískách, které se vyznačují vysokým obsahem RNas a jsou místem degradace mRNA (Sheth et Parker 2003; Cougot et al., 2004; Fujimura et al., 2008). Během působení stresových faktorů se zvyšuje koncentrace PCB2 ve stresových granulech, přítomen ovšem zůstává i v P-tělískách (Fujimura et al., 2008). Původně byl PCBP2 identifikován jako součást α-komplexu lidského α-globinu, jehož mRNA stabilizuje vazbou na 3‘ UTR (Kiledjian et al., 1995). Stabilizační funkce PCBP2 byla potvrzena také u transkriptů genů pro kolagen α1 a tyrosinhydroxylasu (Paulding et CzyzykKrzeska 1999; Lindquist et al., 2000). PCBP2 je regulátorem exprese také na úrovni translační. Spolu s dalšími příbuznými proteiny negativně reguluje translaci 15-lipoxygenasy (LOX) v erytroblastech a brání tak předčasné iniciaci translace transkriptu LOX. Správné načasování exprese tohoto enzymu má zásadní význam pro vývoj erytrocytů (Ostareck-Lederer et al., 2012). PCBP2 se také účastní translace a replikace mnoha virů, například poliovirů, coxasackievirů a rhinovirů (Rieder et al., 2003; Toyoda et al., 2007; Sean et al., 2008; Sean et al., 2009; Beura et al., 2011). V posledních letech byla studována také funkce PCBP2 v antivirové imunitní odpovědi. PCBP2 negativně ovlivňuje antivirovou aktivitu mitochondrií- interaguje s mitochondriálním antivirovým signálním proteinem a brání tak indukci exprese antivirových genů (Jacobs et Coyne 2013). V jiné studii bylo naopak prezentováno usnadnění antivirového účinku interferonu α (IFN-α) proti viru hepatitidy C prostřednictvím působením PCBP2 na proteiny zapojené v signální dráze IFN-α (Xin et al., 2011).
3.2.9 Role RBPs v regulaci mediátorů zánětu Již předchozí odstavce naznačují význam RBPs v post-transkripční regulaci prozánětlivých cytokinů, chemokinů a enzymů spojených se zánětlivými procesy. Přehled mediátorů zánětu, u jejichž exprese byl zjištěn vliv námi studovaných RBPs, je uveden v Tab. 4. Proniknutí do komplexní problematiky regulace exprese zánětlivých molekul má pro diagnostiku pouze doplňkový význam, jednotlivé molekuly regulační kaskády jsou však potenciálními cíli pro terapii zánětlivých onemocnění.
27
Tab. 4: Regulace exprese zánětlivých molekul vybranými RNA-vazebnými proteiny.
mRNA
CCR2
CCL11
protein
funkce
chemokinový
chemokinový
receptor 2
receptor
eotaxin
chemokin lipoxygenasa,
COX-2
cyklooxygenasa 2
syntéza prostaglandinů
regulující
mechanismus
RBP
regulace
zdroj
stabilizace
(Marcais et al.,
mRNA
2006)
stabilizace
(Atasoy et al.,
mRNA
2003)
HuR,
stabilizace
(Cok et al.,
TIA-1,TIAR
mRNA
2003)
AUF1
stabilizace mRNA
(Krishnan et al.,
stabilizace
(Wang et al.,
mRNA
2006)
destabilizace
(Sirenko et al.,
mRNA
2002)
stabilizace
(Yarovinsky et
mRNA
al., 2006)
inhibice
(Scheu et al.,
translace
2006)
destabilizace
(Paschoud et
mRNA
al., 2006)
stabilizace
(Casolaro et al.,
mRNA
2008)
inhibice
(Scheu et al.,
translace
2006)
HuR
HuR
cytokin,
GM-CSF
granulocyte-
stimulace
macrophage colony-
diferenciace
stimulating factor
myeloidních
2014)
buněk cytokin, IFNγ
interferon γ
stimulace
HuR
makrofágů IL-1β
IL-4
IL-6
IL-13
interleukin 1 β
interleukin 4
interleukin 6
interleukin 13
prozánětlivý cytokin
cytokin, indukce Th2
prozánětlivý cytokin
cytokin, indukce Th2
AUF1
HuR
TIA-1
AUF-1
HuR
TIA-1
28
Pokračování Tab. 4: Regulace exprese zánětlivých molekul vybranými RNA-vazebnými proteiny. mRNA
iNOS
funkce
synthasa oxidu
syntéza oxidu
dusnatého
dusnatého
matrix
MMP9
metaloproteinasa 9
MMP13
TNFα
protein
matrix metaloproteinasa 13
VEGF-A
3.3
regulace
HuR
NCL
kolagenasa
faktor α
cytokin
faktor
RBP
gelatinasa
prozánětlivý
endoteliální růstový
mechanismus
HuR
tumor nekrotizující
vaskulární
regulující
angiogenní růstový faktor
TIAR
HuR
TIA-1, TIAR
HuR
zdroj
stabilizace
(Linker et al.,
mRNA
2005)
stabilizace
(Huwiler et al.,
mRNA
2003)
usnadnění
(Fahling et al.,
translace
2005)
inhibice translace
(Yu et al., 2003)
stabilizace
(Wang et al.,
mRNA
2006)
inhibice
(Piecyk et al.,
translace
2000)
stabilizace
(Levy et al.,
mRNA
1998)
Matrix metaloproteinasy a jejich inhibitory Matrix metaloproteinasy (MMPs), nazývané také matrilysiny, patří do rodiny na zinku
závislých endopeptidas, metzincinů. Ve své katalytické doméně obsahují vazebné místo pro zinek. Původně se předpokládalo, že hlavní funkcí MMPs je degradace složek extracelulární matrix, nyní je již známo, že hrají roli v regulaci uvolnění a aktivace chemokinů, cytokinů, růstových faktorů a dalších bioaktivních molekul a podílejí se tak na udržování homeostázy mnoha tkání. MMPs se účastní procesů spojených s imunitní odpovědí, přestavbou kostí, hojením ran a angiogenezí (Loffek et al., 2011). Lidský genom obsahuje celkem 24 genů pro MMPs. Na chromozomu 11, konkrétně v oblasti 11q22, se nachází shluk genů pro MMPs -1, -3, - 7, -8, -10, -12, -13, -20, -27. Ostatní geny pro MMPs jsou lokalizovány na 10 různých chromozomech (Fanjul-Fernandez et al., 2010). Dle substrátové specifity se MMPs dělí do několika skupin: kolagenasy 29
(MMP-1, -8 a -13), gelatinasy (MMP-2 a -9), stromelysiny (MMP-3, -10, -11), elastasy (MMP-7, MMP-12), membránové MMPs (MT-MMPs, MMP-14, -15, -16, -17) a ostatní MMPs (Elkington et Friedland 2006). Nadměrná exprese a aktivita MMPs vede k narušení homeostasy a k patologickým procesům (nekontrolované odbourávání extracelulární matrix, růst buněk a migrace buněk, zánět), proto musí tyto enzymy podléhat komplexní regulaci. K regulaci dochází na úrovni transkripce, aktivace proenzymů (většinou odštěpením prodomény) a inhibice pomocí specifických a nespecifických inhibitorů (Ra et Parks 2007). Nespecifickým inhibitorem MMPs v krvi a dalších tělních tekutinách je α2-makroglobulin, který inhibuje téměř všechny třídy endopepitdas (Strickland et al., 1990). Mezi specifické inhibitory MMPs patří tkáňové inhibitory (TIMP 1-4, tissue inhibitors of matrix metalloproteinases), vyvazující atom zinku. Obecně mají TIMPs mezi MMPs široké spektrum substrátů, liší se ovšem specifitou. Jediný TIMP3 inhibuje všechny MMPs (Lӧffek et al., 2011). Dalšími molekulami, u nichž byla pozorována inhibice některých MMPs, jsou například RECK a PTEN, které jsou předmětem experimentální části této práce. Dle databáze AREsite (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/AREsite.cgi) některé z uvedených inhibitorů (α2-makroglobulin, TIMP-2, TIMP-3, RECK a PTEN) obsahují ve své mRNA sekvenci ARE místa a mohou tedy být předmětem regulace pomocí RBPs.
3.3.1 Role matrix metaloproteinas v respirační imunitě Přestože exprese MMPs v plicní tkáni je spojena spíš s patologickými procesy, mají tyto enzymy význam také pro účinnou imunitní odpověď (Brinckerhoff et Matrisian 2002). Jejich funkce spočívá v usnadnění migrace buněk, kontrole aktivity chemokinů a cytokinů, aktivaci defensinů a zprostředkování buněčné signalizace (Gearing et al., 1994; Legrand et al., 1999; Wilson et al., 1999; Opdenakker et al., 2001). Donedávna byla za hlavní enzym zodpovědný za proteolytický charakter CHOPN považována neutrofilní elastasa. Ta je totiž inhibována α1-anitrypsinem, jehož vrozený nedostatek je hlavní genetickou příčinou CHOPN. Ukazuje se ovšem, se na degradaci plicní extracelulární matrix (ECM) se u pacientů s CHOPN podílí i MMPs (Barnes 2004). Ty jsou schopny štěpit všechny složky ECM, včetně kolagenu I a elastinu (Elkington et al., 2006). V BAL pacientů s CHOPN byla zaznamenána vyšší exprese MMP-1 (kolagenasa fibroblastového typu) a MMP-9 (gelatinasa B) (Finlay et al., 1997). Pomocí imunohistochemie plicní tkáně byla kromě zmíněných MMPs zjištěna také vyšší hladina MMP-2 (kolagenasa A) a MMP-8 (neutrofilní kolagenasa). Neutrofily byly identifikovány 30
jako hlavní zdroj MMP-8 a MMP-9, MMP-1 a MMP-2 byly produkovány makrofágy a epiteliálními buňkami (Segura-Valdez et al., 2000). V jiné studii byla prezentována spojitost mezi vyšší expresí MMP-12 (makrofágová elastasa) alveolárními makrofágy a kouřením a emfyzémem (Babusyte et al., 2007). Vyšší hladina MMP-12 byla potvrzena také ve sputu pacientů s CHOPN (Demedts et al., 2006). U pacientů s AB byla ve sputu detekována vyšší exprese MMP-9 a MMP-2. Zvýšení exprese MMP-9 bylo u astmatiků potvrzeno tak v BAL a v krevním séru (Finlay et al., 1997; Lee et al., 2001). Stejně jako u pacientů s CHOPN se i u astmatiků na degradaci extracelulární matrix podílí MMP-12. Dalšími MMPs, u nichž se předpokládá role v patogenezi astmatu, jsou MMP-1, MMP-3 (stromelysin 1), MMP-7 (matrilysin) a MMP-19 (MMP RASI) (Vandenbroucke et al., 2011). Snížení plicní funkce u pacientů se sarkoidózou bývá obecně spojeno s vyšší kolagenasovou aktivitou, detekovanou v BAL. Za tuto aktivitu je pravděpodobně zodpovědná MMP-8. Ve sputu a BAL pacientů se sarkoidózou byla pozorována také vyšší hladina MMP-9 (Fireman et al., 2002; Henry et al., 2002). Všechny MMPs uvedené v podkapitole 3.3.1 kromě MMP-9 obsahují ve své mRNA sekvenci vazebné motivy pro RBPs (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/AREsite.cgi).
3.3.2 RECK RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) je membránový glykoprotein, kódovaný genem na chromozomu 9 (9p13.3). N-terminální hydrofobní část RECK slouží jako signální peptid, C-terminální část je důležitá pro ukotvení proteinu v membráně a ve střední části jsou obsaženy tři domény pro inhibici serinových proteinas (Takahashi et al., 1998). RECK je důležitým tumor supresorovým genem. Inhibuje minimálně tři MMPsMMP-2 a MMP-9 (gelatinasy A a B) a membránovou MT1-MMP. Brání tak tvorbě metsatáz a angiongenezi (Takahashi et al., 1998; Oh et al., 2001; Liu et al., 2003). MMPs inhibuje na několika úrovních – může přímo inhibovat jejich aktivitu, bránit jejich sekreci a podobně (Welm et al., 2002). Exprese RECK je výrazně snížena v nádorových buňkách ve srovnání s normálními lidskými tkáněmi (Takahashi et al., 1998). Patologické snížení exprese tohoto inhibitoru bylo pozorováno u mnoha typů rakoviny, včetně rakoviny plic. Snížená exprese RECK u pacientů s rakovinou navíc koreluje s horší prognózou (Masui et al., 2003; Span et al., 2003; Takenaka et al., 2004; Kang et al., 2007). Transkripce RECK je negativně regulována onkogeny, 31
například ras a HER-2/neu. Ras nepřímo působí methylaci a deacetylaci promotou RECK a brání tak transkripci tohoto genu (Takahashi et al., 1998; Hsu et al., 2006). Pro regulaci exprese genu RECK je důležitý vzájemný poměr transkripčních faktorů Sp1 a Sp3- pokud převažuje Sp1, je transkripce stimulována, pokud převažuje Sp3, je transkripce inhibována (Chang et al., 2004). Nesteroidní
protizánětlivá
léčiva
jsou
známa
svým
antiangiogenním
a antimetastatickým účinkem. Jedním z uvažovaných mechanismů působení těchto léčiv je právě indukce RECK a následná inhibice MMPs (Liu et al., 2002).
3.3.3 PTEN PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten) je tumor supresorový gen umístěný na dlouhém raménku chromozomu 10 (10q.23.3). Produkt tohoto genu je multifunčkní fosfatasou. Protein PTEN ve své aminokyselinové sekvenci obsahuje shluky serinových a threoninových zbytků, které jsou fosforylovány v mnoha buňkách (Li et al., 1997; Steck et al., 1997). PTEN je zapojen v regulaci mnoha signálních drah. Nejčastějším substrátem PTEN je PIP3 (fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfát), druhý posel signální dráhy PI3K/Akt (fosfoinositid3-kinasa/Akt kinasa), jejíž aktivita je spojena s mitogenním a antiapoptotickým účinkem. PTEN defosforyluje PIP3 a tak tuto signální dráhu blokuje. Tímto způsobem je PTEN zapojen do kontroly dělení buněk (Toker et Cantley 1997; Yamada et Araki 2001). Bylo zjištěno, že PTEN hraje roli ve vývoji mnoha tkání, včetně T a B lymfocytů a epiteliálních buněk (Timura et al., 2003, Suzuki et al., 2003; Hagenbeek et al., 2004; Hamada et al., 2005). Deaktivace signální dráhy PI3/Akt v bronchoalveolárních buňkách pomocí PTEN je nezbytná pro normální morfogenezi plic a slouží také jako ochrana před rakovinou plic (Yanagi et al., 2007). Co se týče MMPs, podílí se PTEN na snížení exprese a aktivity MMP-2 a sekrece MMP-9 (Koul et al., 2001; Park et al., 2002).
32
4
MATERIÁL A METODY
4.1
RT-qPCR
4.1.1 Charakteristika studovaného souboru a biologický materiál Studovaný soubor zahrnoval pacienty trpící chronickou obstrukční nemocí (n=30), astma bronchiale (n=19) a plicní sarkoidózou (n= 50) a zdravé kontrolní jedince (n=23). Biologickým materiálem pro tuto studii byla bronchoalveolární laváž (BAL) všech testovaných jedinců, poskytnutá Klinikou plicních nemocí a tuberkulózy ve Fakultní nemocnici Olomouc. Chronická obstrukční plicní nemoc byla lékaři diagnostikována dle kritérií Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (Rabe et al., 2007). Ze studie byli vyloučeni pacienti, u nichž se šest měsíců nebo dříve před odběrem BAL objevily akutní exacerbace, a pacienti léčení kortikosteroidy. Astma bronchiale bylo diagnostikováno na základě dokumentu Global Initiative for Asthma (GINA) (Agostinis et al., 2008). Plicní sarkoidóza byla diagnostikována dle dokumentu vydaného American Thoracic Society (ATS) ve spolupráci s European Respiratory Society (ERS) a World Association of Sarcoidosis and Other Granulomatous Disorders (WASOG) (1999). Soubor obsahoval BAL pacientů se sarkoidózou ve stádiu I a II. Kontrolní jedinci nikdy nejevili příznaky chronického zánětlivého onemocnění plic a výsledek spirometrického vyšetření byl u nich v normě. Také buněčný profil BAL byl u kontrol normální.
4.1.2 Izolace buněk bronchoalveolární laváţe Zpracování bronchoalveolární laváže (BAL) provádíme na ledě, centrifugační kroky probíhají při 4 °C. BAL byla nejprve zfiltrována přes 1 vrstvu sterilní gázy a centrifugována při 1650 g po dobu 10 min. Supernatant byl rozpipetován po 1,2 ml do 1,5ml mikrozkumavek a uložen do -80 °C pro další analýzu. Pelet byl promyt pomocí 10 ml PBS+0,1% DEPC. Po řádném promíchání následovala centrifugace opět při 3750 g po dobu 10 min. Supernatant byl slit a k peletu byly přidány 2 ml PBS+0,1% DEPC. Buňky byly řádně promíchány s promývacím roztokem a přepipetovány do 2ml mikrozkumavky. 5 µl vzorku ze zkumavky bylo v Burkerově komůrce smícháno s 5 µl methylenové modři zředěné 1:10. Pod mikroskopem 33
byly sečteny buňky (lymfocyty a makrofágy) z 5 různých čtverců a byla vypočítána koncentrace buněk/ml vzorku. 2ml mikrozkumavka s promytými buňkami byla poté centrifugována při 3750 g po dobu 20 min. Supernatant byl opatrně odpipetován tak, aby na dně zůstalo pouze 30-50 µl, v nichž byl promíchán pelet. Takto připravený vzorek byl uložen do -80 °C. Pokud bylo dle výpočtu v Burkerově komůrce více než 400000 buněk, byl vzorek promíchán s 300 µl RNA later a uschován v lednici do druhého dne. Druhý den byl vzorek uložen do -20 °C. RNA later je činidlo stabilizující RNA a buňky v něm uchované je možné k izolaci RNA použít i po několika letech.
4.1.3 Izolace celkové RNA K izolaci celkové RNA z buněk bronchoalveolární laváže byl použit High Pure miRNA Isolation Kit (Roche). Základním principem extrakce je v případě tohoto kitu zachycení RNA na speciální skleněná vlákna v přítomnosti chaotropní soli. Navázaná RNA je řadou promývacích a centrifugačních kroků zbavena solí, proteinů a dalších buněčných nečistot. Takto přečištěná RNA je následně eluována s využitím roztoku s nízkou koncentrací solí (http://www.roche-applied-science.com). Před prvním použitím kitu je k celému objemu promývacího roztoku přidáno 40 ml 100% ethanolu. Kit je skladován při pokojové teplotě. Celý proces izolace RNA probíhá ve sterilních podmínkách laminárního flow-boxu. Vzorky skladované v -80 °C byly rozpuštěny v chladícím stojánku, k vzorkům skladovaným v RNA later bylo přidáno 350 µl PBS+0,1% DEPC a následně byla provedena centrifugace při 4000 g a 4 °C po dobu 60 min. Ze vzorků byl odsán supernatant. Před vlastní extrakcí RNA bylo nutné buňky zhomogenizovat a zlyzovat. Ke vzorku bylo přidáno 150 µl 20% Binding Buffer, buňky byly rozbity pomocí pipety a vortexu a centrifugovány maximální rychlostí po dobu 2 min. Lyzát byl přenesen do nové RNA zkumavky. K lyzátu bylo přidáno 312 µl Binding Buffer a 200 µl Binding Enhancer. Po důkladném promíchání pomocí pipety byl lyzát nanesen na High Pure filtr, který je součástí kolonky dodávané v kitu. Kolonka byla centrifugována při 13000 g po dobu 30-60 s. Protečený supernatant byl odsán Pasteurovou pipetou. Následovalo dvojí promytí. Na kolonku bylo naneseno 500 µl, resp. 300 µl Wash Buffer, byla provedena centrifugace opět při 13000 g po dobu 30-60 s a byl odsán supernatant. Kolonka byla přenesena do nové RNA zkumavky. Po nanesení 50 µl Elution Buffer a centrifugaci při 13000 g po dobu 60 s zůstala
34
ve zkumavce čistá RNA. K izolované RNA byl na závěr přidán 1 µl RNasinu, který zabraňuje enzymatické degradaci RNA. RNA byla uložena pro pozdější zpracování do -80 °C.
4.1.4 Reverzní transkripce K účelu měření relativní exprese transkriptů vybraných genů bylo nutné provést reverzní transkripci celkové RNA získané v předchozím kroku. Při této reakci vzniká komplementární DNA (cDNA) kopie každé přítomné mRNA, která slouží jako templát. V prvním kroku nasedá na mRNA krátký oligonukleotid komplementární k polyA konci mRNA, sloužící jako primer pro reverzní transkriptasu. Poté reverzní transkriptasa syntetizuje vlákno DNA podle RNA templátu. Vzniká hybridní DNA/RNA dvoušroubovice. Reverzní transkriptasa má mimo jiné aktivitu RNAsy H, díky níž vytváří v templátovém RNA vlákně zářezy a následně toto vlákno degraduje. Nakonec je dosyntetizováno komplementární vlákno cDNA, výsledkem je tedy dvoušroubovice cDNA (Alberts 2008). Reverzní transkripce byla provedena s využitím Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). Všechny reagencie kromě reverzní transkriptasy je před vlastním provedením experimentu nutné promíchat na vortexu a krátce stočit. Práce probíhá v laminárním flow-boxu. Všechny kroky kromě těch, které probíhají v termocycleru, jsou prováděny na ledě, popř. v chladícím stojánku. Počet vzorků byl vynásoben 3 a do chladícího stojánku byl připraven odpovídající počet 0,2ml zkumavek (z důvodu snahy o omezení chyb probíhá reakce v triplikátech). 1 zkumavka byla přidána navíc pro účel negativní kontrolní reakce. Do připravených zkumavek byl pipetován templát-primer mix dle Tab. 5. Stejný vzorek byl pipetován do 3 zkumavek. Zkumavky byly na 10 min přemístěny do cycleru temperovaného na 65°C. Mezitím byl dle Tab. 6 připraven RT mix. Po skončení inkubace byly zkumavky na 5 min umístěny do chladícího stojánku. Poté byl obsah jemně promíchán a zkumavky byly krátce stočeny. Do každé zkumavky bylo přidáno 7 µl RT mixu. Po jemném promíchání a krátkém stočení byly zkumavky opět přeneseny do cycleru. Zde probíhala při teplotě 50 °C po dobu 60 min vlastní reverzní transkripce. Enzym byl následně inaktivován působením teploty 85 °C po dobu 5 min. Po přenesení zkumavek do vychlazeného stojánku byl obsah zkumavek se stejným vzorkem spojen do jedné 1,5ml zkumavky. Získaná cDNA byla skladována v -20 °C.
35
Tab. 5: Složení templát-primer mixu. reagencie
objem na 1 reakci
objem na negativní kontrolu
[µl]
*µl+
celková RNA
5
0
Anchored Oligo (dT)18 Primer
1
1
H2O PCR Grade
7
12
celkem
13
13
Tab. 6: Složení RT mixu. reagencie
objem na 1 reakci [µl]
Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×
4
Protector RNase Inhibitor, 40 U/μl
0,5
Deoxynucleotide Mix, 10 mM každý dNTP
2
Transcriptor Reverse Transcriptase, 20 U/ μl
0,5
celkem
7
4.1.5 Real-time PCR Real-time PCR (qPCR) je variantou PCR, umožňující kvantifikaci amplifikovaného produktu v reálném čase. Záznam amplifikace je založen na principu fluorescence. Změna intenzity emitovaného záření přímo odráží množství nasyntetizované DNA. Fluorescenčním substrátem může být nespecifické interkalační barvivo nebo specifická oligonukleotidová sonda. V našem případě byly použity TaqMan LNA sondy. LNA (Locked Nucleic Acids) jsou analogy nukleových kyselin, které obsahují ribosu uzamčenou metylenovým můstkem, spojujícím 2´OH a 3´C furanosového kruhu. Tato konformace
zajišťuje
zvýšenou
teplotní
stabilitu
a
specifitu
hybridizace
(http://www.roche-applied-science.com). Technologie TaqMan je založena na přítomnosti dvou fluoroforů– reportéru na 5´ konci a zhášeče (quencher) na 3´ konci sondy. Při vzájemné blízkosti těchto dvou fluoroforů dochází ke zhášení emitovaného záření. Na počátku reakce je cDNA denaturována teplotou 94 °C. Následné snížení teploty umožní nasednutí primerů a sondy na cílovou sekvenci. TaqDNA polymerasa poté syntetizuje komplementární vlákno
36
DNA. Jakmile narazí na sondu, svou 5´nukleasovou aktivitou ji rozštěpí a reportér se dostane z blízkosti zhášeče, což se projeví vysokým nárůstem fluorescence. Příprava reakčních směsí pro qPCR probíhá na ledě, resp. na vychlazené PCR desce. Všechny reagencie kromě TaqDNA polymerasy je před začátkem experimentu třeba promíchat na vortexu a krátce stočit. LNA TaqMan sondy je nutné chránit před světlem. Dle Tab. 7 a 8 byly připraveny reakční mixy – jeden pro amplifikaci referenční cDNA, na jejímž základě byla sestrojena kalibrační křivka, druhý pro měření relativní exprese transkriptu konkrétního studovaného genu. Jako referenční DNA byla použita lidská cDNA, vzniklá reverzní transkripcí RNA genu PSMB2. Reakční mix byl pipetován po 20 µl do PCR mikrozkumavek uložených ve vychlazené PCR desce. Následně bylo přidáno 5 µl referenční DNA, resp. cDNA vzorku. Relativní exprese studovaných genů byla měřena pomocí přístroje RotorGene3000. Reakční podmínky qPCR jsou uvedeny v Tab. 9. Ke kvantifikaci amplifikované cDNA byla použita metoda maxima druhé derivace. Vzhledem k tomu, že se jednalo o kvantifikaci relativní, byla kalibrační křivka využita pouze ke kompenzaci intra a inter variability mezi jednotlivými měřeními, ne k určení absolutní koncentrace přítomné cDNA. Tab. 7: Složení PCR mixu pro referenční cDNA. reagencie
objem na 1 reakci [µl]
PCR H2O
[µl] 7,8
AB pufr, 10x
2,5
MgCl2, 25 mM
3,5
dNTPs, 10 mM
1
primer-L, 10 pmol/ μl
2,25
primer-R, 10 pmol/ μl
2,25
TaqMan LNA sonda
0,5
Thermo-Start TAQ DNA polymerase, 5 U/ μl
0,2
celkem
20
37
Tab. 8: Složení PCR mixu pro amplifikaci konkrétního studovaného genu. reagencie
objem na 1 reakci [µl]
H2O PCR Grade
[µl] 3,8
AB pufr, 10x
2,5
MgCl2, 25 mM
7,5
dNTPs, 10 mM
1
primer-L, 10 pmol/μl
2,25
primer-R, 10 pmol/μl
2,25
TaqMan LNA sonda
0,5
Thermo-Start TAQ DNA polymerase, 5 U/ μl
0,2
celkem
20
Tab. 9: Reakční podmínky qPCR. proces
teplota
čas
počet cyklů
aktivace Thermo-Start TAQ DNA polymerase
95
15 min
1
denaturace
94
30 s
40
annealing a elongace
60
45 s
4.1.6 Analýza dat z real-time PCR Výsledky měření relativní exprese analyzovaných genů byly zpracovány v programu RotorGene software 6.1.71. Byla použita metoda druhé derivace (comparative quantitation), která počítá s hodnotou take off a amplifikací. Take off point odpovídá počtu cyklů, kdy fluorescence produktu dosáhne 20 % maxima druhé derivace fluorescence. Výsledná relativní koncentrace je dle manuálu RotorGene 3000 počítána následovně: 1. Nejprve je spočítán také-off point každého vzorku. 2. Po čtyřech cyklech od dosažení také-off point jsou naměřené hodnoty zprůměrovány. 3. Odlehlé hodnoty amplifikace jsou z analýzy vynechány. Zbylé hodnoty amplifikace jsou zprůměrovány. 4. Dále je spočítán také-off point pro všechna opakování kalibrátoru. 5. Relativní koncentrace je spočítána dle vzorce: c=amplifikacetake-off kalibrátoru-take-off vzorku. Relativní exprese studovaných genů byla vztažena k expresi housekeeping genu PSMB2 (Kriegova et al., 2008). 38
4.1.7 Statistické zpracování Výsledky analýzy byly zpracovány v SPSS 17.0. Pro srovnání relativní exprese genů u dvou nezávislých skupin (kontroly vs pacienti s CHOPN/ astma bronchiale/ plicní sarkoidózou) byl použit neparametrický Mann-Whitney U-test. Korelační analýzy byly provedeny pomocí Spearmanova korelačního koeficientu (rs). Za signifikantní byla považována hodnota p<0,05. Grafické zpracování výsledků bylo provedeno v programu GraphPad Prism 5.01.
4.2
Imunocytochemie Exprese genů AUF1 a RECK byla u jednoho pacienta s CHOPN a jednoho kontrolního
jedince detekována také na proteinové úrovni. K tomuto účelu posloužila imunocytochemie. Imunocytochemie využívá specifické vazby antigenu a protilátky k detekci a lokalizaci konkrétní molekuly v buňce.
4.2.1 Zpracování bronchoalveolární laváţe pro imunocytochemii Pro účel imunocytochemické analýzy byly z vybraných vzorků BAL připraveny cytospiny. Vzorek byl nejprve promyt 10-40 ml PBS. Po každém promytí následovala centrifugace při 4000 g po dobu 10 min. Poté byl vzorek naředěn kultivačním médiem (1 cytospin= 40000 buněk + 200 μl média). Naředěný vzorek byl pipetován po 200 µl na cytospin, centrifugován při 300 g po dobu 3 min a následně sušen na buničině při pokojové teplotě po dobu 1 h. Nakonec byl vzorek na cytospinu fixován roztokem aceton:chloroform 1:1 a krátce usušen při pokojové teplotě.
Takto připravený preparát byl zabalen do
mikrotenové fólie a skladován v -20 °C.
4.2.2 Vlastní provedení imunocytochemie U imunocytochemie je důležité dbát na dodržování inkubačních dob a neustálé uchovávání preparátů ve vlhkém prostředí. Preparát je s jednotlivými roztoky inkubován ve vlhké komůrce při pokojové teplotě. Dobu inkubace s chromogenem je třeba přizpůsobit konkrétní primární protilátce tak, aby byl dosažen co nejlepší poměr specifické barvení:pozadí. Od obou testovaných jedinců byly zpracovány čtyři cytospiny (1 pro detekci AUF1, 1 pro detekci RECK, komerčně dodávaná negativní kontrola, negativní kontrola bez primární protilátky). Na preparáty bylo naneseno 100 µl TBS. Po 5 min bylo TBS odsáto čtverečkem 39
buničiny a nahrazeno 100 µl TBS-0,5% BSA-0,1% Saponin. Po 15 min inkubace ve vlhké komůrce byl pufr odsát a na preparáty bylo pipetováno 100 µl Peroxidase block, s nímž byly preparáty inkubován po dobu 7 min. Poté bylo opět naneseno100 µl TBS-0,5% BSA-0,1%, tentokrát na dobu 10 min. Po odsátí pufru následovala 25min inkubace se 100 µl Peroxidase block- serum free. Mezitím byla primární protilátka naředěna TBS-0,5% BSA v poměru 1:50 (AUF1), respektive 1:10 (RECK). Negativní kontrola ředěna nebyla. Po odsátí pufru bylo na preparáty naneseno 100 µl primární protilátky. Následovala inkubace v uzavřené komůrce po dobu 90 min. Po odsátí pufru byly preparáty 2x po 5 min promývány v TBS-0,5% BSA. Poté byly naneseny 2 kapky značené sekundární protilátky Dual Link System-HRP, s níž byl vzorek inkubován po dobu 60 min. Následovalo trojí promytí v TBS-0,5% BSA, vždy po 5 min. Dále proběhlo vyvíjení působením 100 µl roztoku DAB chromogen po dobu 10 min ve tmě. Po ukončení vyvíjení byl chromogen opláchnut destilovanou vodou a poté vodou z kohoutku. Osušené preparáty byly dobarveny působením 100 µl instantního hematoxylinu (barvení buněčných jader) po dobu 5 min a následně opláchnuty vodou z kohoutku. Po usušení byly preparáty zabaleny do fólie a uloženy do -20 °C.
4.2.3 Hodnocení preparátů Preparáty byly pozorovány v mikroskopu Olympus BX50 při zvětšení 20x. Fotografie byly pořízeny s využitím Olympus Soft Imaging Solutions- FiveWire Camera. Následně byly snímky zpracovány v programu AnalySIS GetIT.
Pouţité chemikálie a roztoky
4.3
Izolace buněk BAL: methylenová modř (Serva); RNA later (Ambion, USA) PBS+0,1% DEPC (všechny komponenty Sigma Aldrich, USA) KCl
0,2 g
KH2PO4
0,24 g
NaCl
8g
Na2HPO4.12H2O
2,88 g
40
doplnit do 1 l H2O, přefiltrovat, přidat 1 ml DEPC, následující den sterilizovat v autoklávu, skladovat v lednici
Izolace celkové RNA: High Pure miRNA Isolation Kit (05080576001, Roche, USA): Binding Buffer, Binding Enhancer, Elution Buffer, Wash Buffer; ethanol, 100% (Dr. Kulich Pharma, Česká republika); RNasin (Invitrogene, USA),
Reverzní transkripce: Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (04897030001, Roche, USA): Anchored Oligo (dT)18 Primer, Deoxynucleotide Mix, 10 mM každý dNTP, Protector RNase Inhibitor 40 U/μl, Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer 5×, Transcriptor Reverse Transcriptase, 20 U/ μl; H2O PCR Grade (5 PRIME, USA)
Real-time PCR (Thermo Scientific, USA); AB pufr, 10x (Thermo Scientific, USA); MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, USA); Thermo-Start TAQ DNA polymerase (Thermo Scientific, USA; dNTPs, 10 mM (Thermo Scientific, USA), H2O PCR Grade (5 PRIME, USA)
Tab. 10: Soubor specifických primerů a LNA sond pro studované RBPs a inhibitory proteolytických enzymů. zkratka genu
GenBank accession number primery (forward a reverse)
AUF1
U02019.1
gcgaagattgacgccagta
LNA sonda* #88
tcccagctaaggcctcctat
HuR
U38175.1
ccaggcgcagagattcag
#72
ggttgtagatgaaaatgcaccag
NCL
NM_005381.2
ccacttgtccgcttcaca
#70
tcttggggtcaccttgattt
TIA
M77142.1
agggagctggacctggag
#46
tggaaaggttaccgacgtataga
TIAR
M96954.1
ggcaaccatggaatcaaca
#84
agcaccaaatccacccatc *číslo LNA sondy příslušející k danému páru primerů určeno dle http://universalprobelibrary.com
41
Pokračování Tab. 10: Soubor specifických primerů a LNA sond pro studované RBPs a inhibitory proteolytických enzymů. zkratka genu
GenBank accession number
PCBP2
NM_005016.5
RECK
NM_021111.2
PTEN
NM_000314.4
PSMB2
NM_002794.4
primery (forward a reverse) agatctgcgtggtcatgttg tgctgtacctgtcctgacca caagtgtccttcgctcttgg cacataatgggcaacaagca gcacaagaggccctagatttc cgcctctgactgggaatagt
gtgagagggcagtggaactc gaaggttggcagattcagga
LNA sonda* #14 #42 #60 #50
*číslo LNA sondy příslušející k danému páru primerů určeno dle http://universalprobelibrary.com
Zpracování bronchoalveolární laváže pro imunocytochemii: aceton (Penta, Česká republika); chloroform (Penta, Česká republika); PBS (peroxohydrát boritanu sodného, Sigma Aldrich, USA) Kultivační médium pro cytospiny RPMI 1640+L-glutamin (Life Technologies, Velká Británie) 20 ml H2O
69,6 ml
NaH2CO3 (Sigma Aldrich, USA)
2,4 ml
glutamin (Sigma Aldrich, USA)
1,2 ml
penicilin-streptomycin (2:1) (Sigma Aldrich, USA)
0,16 ml
Vlastní provedení imunocytochemie: anti-hnRNPD 1 mg/ml (rabbit polyclonal antibody, OriGene TA314020, USA); En Vision+Dual Link System- HRP (Dako, Německo); FLEX Negative Control Rabbit (Dako, Německo); hematoxylin instantní (Shandon, USA); Liquid DAB+Substrate Chromogen System (Dako, Německo); RECK antibody (Center, Purified rabbit Pab) (Abgent AP9259c, USA)
42
TBS pufr (pH 7,6) Tris-HCl (Serva, USA)
7,8 g
NaCl (Sigma Aldrich, USA)
8,7 g
doplnit do 1 l autoklávovanou destlivanou H2O, upravit pH pomocí NaOH na 7,6 TBS-0,5% BSA BSA, 22% (Exbio, USA)
2,27 ml
TBS
97,73 ml
TBS-0,5% BSA-0,1% Saponin Saponin (Sigma Aldrich, USA)
20 mg
rozpustit ve 20 ml TBS-0,5% BSA
4.4
Přístrojové vybavení
automatické pipety (10 μl, 20 μl, 100 μl,1000 μl) (Eppendorf, Německo) centrifuga Jouan MR1812 (Francie) centrifuga Spectrafuge M16 (Labnet International, USA) centrifuga Z 233-MK2 (Hermle, Německo) laminární flow-box (Gelaire, Itálie) mikroskop Olympus BX50 Olympus Soft Imaging Solutions- FiveWire Camera thermocycler RotorGene 3000 (Corbett Research, Velká Británie) vortex MS1 minishaker IKA (Sigma Aldrich, USA)
43
5 VÝSLEDKY
5.1
Relativní exprese vybraných molekul u pacientů se zánětlivým onemocněním plic V této diplomové práci byla měřena relativní mRNA exprese šesti genů pro
RNA-vazebné proteiny (RBPs) a dvou genů pro inhibitory proteolytických enzymů (RECK a PTEN), jejichž mRNA je potenciálním vazebným cílem RBPs. 5.1.1 RNA vazebné proteiny (AUF1, HuR, TIA-1, TIAR, NCL a PCBP2) U všech pacientů byla ve srovnání s kontrolním souborem podstatně snížena relativní mRNA exprese AUF1, nejvýrazněji u pacientů trpících plicní sarkoidózou (S, p<0,001), méně pak u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN, p=0,01) a astma bronchiale (AB, p=0,03), Obr. 5, Tab. 11. Relativní mRNA exprese HuR byla oproti kontrolním jedincům nižší u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (p=0,02) a s plicní sarkoidózou (p<0,001), Obr. 6, Tab. 12. Relativní mRNA exprese NCL byla snížená rovněž u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (p=0,04) a s plicní sarkoidózou (p<0,001), Obr. 7, Tab. 13. Relativní mRNA exprese TIA-1 ((p<0,001) byla snížená pouze u pacientů s plicní sarkoidózou Obr. 8, Tab. 14. Podobně tomu bylo v případě TIAR (p=0,001) a PCBP2 (p=0,005), Obr. 9 a 10, Tab. 15 a 16. Při srovnání relativní mRNA exprese RBPs mezi jednotlivými diagnózami byl zaznamenán rozdíl mezi dvojicemi skupin CHOPN-S a AB-S u všech RBPs kromě PCBP2. Skupiny CHOPN a AB se mezi sebou v expresi nelišily. Konkrétní výsledky popisné statistiky jsou uvedeny v Tab. 11-17.
44
p=0,01
relativní exprese AUF1
8
p=0,03 p<0,001
6 4 2
=5
0)
=1 9)
(n
(n
S
B A
C
H O
K
PN
(n
(n
=2
=3
3)
0)
0
Obr. 5: Srovnání relativní mRNA exprese AUF1 mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S). Tab. 11: Vyhodnocení změn relativní mRNA exprese AUF1 dle popisné statistiky. popisná statistika 25% percentil medián 75% percentil
K/CHOPN K/AB 2,1 1,7 1,2
K/S 2,0 1,3 1,2
1010,1 6,0 1,9
CHOPN/S AB/S 479,8 3,5 1,5
505,1 4,5 1,5
45
p=0,02
relativní exprese HuR
5
p<0,001
4 3 2 1
=5
0)
=1 9) S
(n
(n B A
C
H O
K
PN
(n
(n
=2
=3
3)
0)
0
Obr. 6: Srovnání relativní mRNA exprese HuR mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S). Tab. 12: Vyhodnocení změn relativní mRNA exprese HuR dle popisné statistiky. popisná statistika 25% percentil medián 75% percentil
K/CHOPN K/AB 3,9 2,0 1,4
K/S NS NS NS
CHOPN/S AB/S 26,7 3,9 2,6
6,8 1,9 1,9
9,8 3,2 1,8
*NS: mezi srovnávanými skupinami nebyl rozdíl
46
p=0,04 p<0,001
relativní exprese NCL
5 4 3 2 1
0) (n
=5
=1 9) S
(n B A
C
H O
K
PN
(n
(n
=2
=3
3)
0)
0
Obr. 7: Srovnání relativní mRNA exprese NCL mezi mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S). Tab. 13: Vyhodnocení změn relativní mRNA exprese NCL dle popisné statistiky. popisná statistika 25% percentil medián 75% percentil
K/CHOPN K/AB 1,7 1,3 1,2
K/S NS NS NS
CHOPN/S AB/S 11,3 6,8 4,5
6,6 5,2 3,6
6,2 7,1 5,3
*NS: mezi srovnávanými skupinami nebyl rozdíl
47
relativní exprese TIA-1
2.5
p<0,001
2.0 1.5 1.0 0.5
50 )
19 ) S
(n =
(n = B A
C
H O
K
PN
(n =
(n =2 3)
30 )
0.0
Obr. 8: Srovnání relativní mRNA exprese TIA-1 mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S). Tab. 14: Vyhodnocení změn relativní mRNA exprese TIA-1 dle popisné statistiky. popisná statistika 25% percentil medián 75% percentil
K/CHOPN K/AB NS NS NS
K/S NS NS NS
CHOPN/S AB/S 84,0 6,1 3,3
58,7 4,6 3,0
40,7 6,0 3,7
*NS: mezi srovnávanými skupinami nebyl rozdíl
48
p=0,001
relativní exprese TIAR
4 3 2 1
=5
0)
=1 9) S
(n
(n B A
C
H O
K
PN
(n
(n
=2
=3
3)
0)
0
Obr. 9: Srovnání relativní mRNA exprese TIAR mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S). . Tab. 15: Vyhodnocení změn relativní mRNA exprese TIAR dle popisné statistiky. popisná statistika 25% percentil medián 75% percentil
K/CHOPN K/AB NS NS NS
K/S NS NS NS
CHOPN/S AB/S 11,3 6,8 4,5
6,6 5,2 3,6
6,2 7,1 5,3
*NS: mezi srovnávanými skupinami nebyl rozdíl
49
4
2
0) S
B A
PN C
H O
(n
(n
=3 (n
=2 (n K
=5
0)
=1 9)
0 3)
relativní exprese PCBP2
p=0,005
6
Obr. 10: Srovnání relativní mRNA exprese PCBP2 mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S). Tab. 16: Vyhodnocení změn relativní mRNA exprese PCBP2 dle popisné statistiky. popisná statistika 25% percentil medián 75% percentil
K/CHOPN K/AB NS NS NS
K/S NS NS NS
≥3636,4 3,1 2,4
*NS: mezi srovnávanými skupinami nebyl rozdíl
50
5.1.2 Vazební partneři RNA-vazebných proteinů (RBPs) V
databázi
AREsite
(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/AREsite.cgi)
byli
dále
vyhledáni vazební partneři pro RBPs.
RECK
PTEN
Obr. 11: Geny inhibitorů proteolytických enzymů RECK a PTEN a jejich ARE místa.
5.1.2 Inhibitory proteolytických enzymů U všech pacientů byla ve srovnání s kontrolním souborem podstatně snížená relativní mRNA exprese RECK, nejvýrazněji u pacientů trpících plicní sarkoidózou ( p<0,001), méně pak u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (p=0,003) a astma bronchiale (p=0,02), Obr. 12, Tab. 17. V případě PTEN nebyla v relativní mRNA expresi zaznamenána žádná signifikantní změna (p>0,05), Obr. 13.
51
p=0,003 p=0,02 p<0,001
relativní exprese RECK
0.8 0.6 0.4 0.2
50 ) S
(n =
19 ) (n = B A
C
H O
K
PN
(n =
(n =2 3)
30 )
0.0
Obr. 12: Srovnání relativní mRNA exprese RECK mezi mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S). Tab. 17: Vyhodnocení změn relativní mRNA exprese RECK dle popisné statistiky. popisná statistika 25% percentil medián 75% percentil
K/CHOPN K/AB 2,1 1,7 1,2
K/S 2,0 1,3 1,2
≥1010,1 6,0 1,9
CHOPN/S AB/S ≥479,8 3,5 1,5
≥505,1 4,5 1,5
52
relativní exprese PTEN
50 40 30 20 10
50 ) S
(n =
19 ) (n = B A
C
H O
K
PN
(n =
(n =
23 )
30 )
0
Obr. 13: Srovnání relativní mRNA exprese PTEN mezi kontrolními jedinci (K) a pacienty s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (S).
5.1.3 Korelace mezi RNA vazebnými proteiny a inhibitory proteolytických enzymů Dále byly provedeny korelační analýzy za účelem prozkoumání vztahu mezi RBPs a jejich možnými vazebnými partnery. Relativní mRNA exprese RECK vykazovala pozitivní korelaci s relativní mRNA expresí všech studovaných RBPs. Grafické znázornění těchto korelací viz Obr. 13 a 14 a Obr. P1-P4. Výsledky všech korelačních analýz jsou uvedeny v Tab. P1, z níž je patrná pozitivní korelace relativní exprese transkriptů téměř všech studovaných RBPs mezi sebou.
53
relativní exprese AUF1
3
r s=0,65 p<0,001
2
1
0 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
relativní exprese RECK
Obr. 14: Korelace relativní mRNA exprese RECK a AUF1.
relativní exprese HuR
4
rs=0,509 p<0,001
3 2 1 0 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
relativní exprese RECK
Obr. 15: Korelace relativní mRNA exprese RECK a HuR.
54
5.2
Imunocytochemická detekce AUF1 a RECK Zdroj proteinů AUF1 a RECK v buňce byl detekován na čtyřech cytospinech (AUF1,
RECK a negativní kontroly) pomocí imunobarvení. AUF1 a RECK byly lokalizovány v makrofázích BAL pacienta s CHOPN a kontrolního jedince.
Obr. 16: Exprese RNA-vazebného proteinu AUF1 (A) a inhibitoru proteolytických enzymů RECK (B) a dvě negativní kontroly (komerčně dodávaná univerzální negativní kontrola (C) a negativní kontrola bez primární protilátky (D)) v bronchoalveolárních buňkách zdravého kontrolního jedince. Buněčná jádra zbarvena modře, detekované proteiny hnědě.
55
Obr. 17: Exprese RNA-vazebného proteinu AUF1 (A) a inhibitoru proteolytických enzymů RECK (B) a dvě negativní kontroly (komerčně dodávaná univerzální negativní kontrola (C) a negativní kontrola bez primární protilátky (D)) v bronchoalveolárních buňkách pacienta s CHOPN. Buněčná jádra zbarvena modře, detekované proteiny hnědě.
56
6
DISKUZE Výsledky předkládané diplomové práce ukazují význam RNA-vazebných proteinů
(RBPs) v patogenezi zánětlivých onemocnění plic. Konkrétně u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (plicní S) byla ve srovnání s kontrolním souborem pozorována snížená exprese RBP AUF1. Kromě AUF1 byla u pacientů s CHOPN a plicní S snížena také bronchoalveolární exprese HuR. Exprese RBPs TIA-1, TIAR a PCBP2 byly sníženy jen u pacientů s plicní S. Relativní mRNA exprese všech RBPs pozitivně korelovaly s expresí RECK, jehož mRNA na svém 3´konci obsahuje
vazebné
motivy
pro
studované
RBPs
(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-
bin/AREsite.cgi). Zaznamenané změny mRNA exprese RBPs u testovaných diagnóz jsou znázorněny na Obr. 18.
Obr. 18: Grafické shrnutí pozorovaných změn exprese jednotlivých RBPs u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidózou (plicní S). V experimentální části diplomové práce byla poprvé studována bronchoalveolární (BAL) exprese RECK u pacientů s CHOPN, AB a plicní S. Zásadním poznatkem byla snížená relativní exprese RECK u pacientů s uvedenými diagnózami ve srovnání s kontrolními jedinci. Glykoprotein RECK je exprimován na povrchu buněk imunitního systému a inhibuje expresi a enzymovou aktivitu proteolytických enzymů (Chang et al., 2008; Takagi et al., 57
2009). Snížená exprese inhibitoru RECK pozorovaná v této studii je proto v souladu se zvýšeným proteolytickým charakterem imunitní odpovědi u pacientů s CHOPN, AB a plicní S (Elkington et al., 2006; Gueders et al., 2006; Churg et Galateau-Salle 2012). Snížená relativní mRNA exprese RECK byla navíc již popsána ve sputu astmatiků (Paulissen et al., 2006). Protein RECK je spojen také s progresí rakoviny plic (Takenaka et al., 2004). Nižší exprese inhibitoru RECK v nádorových buňkách vede k vyšší aktivitě proteolytických enzymů. Ty narušují extracelulární matrix a napomáhají tak uvolnění buněk primárního nádoru a tvorbě metastáz (Chang et al., 2008). Podobně by u pacientů s plicním zánětem mohla nízká exprese RECK přispívat k buněčné chemotaxi, rozvoji chronického zánětu a u emfyzému k destrukci plicních sept. Zatímco následky snížené exprese RECK jsou předmětem intenzivního studia (Chang et al., 2007; Namwat et al., 2011), příčiny snížené exprese jsou méně známé. Sekvence mRNA genu RECK obsahuje několik regulačních ARE (adenine-uracil-rich elements), na která se váží RBPs. Transkript genu RECK může proto podléhat post-transkripční regulaci pomocí RBPs, což naznačila i v této práci provedená korelační analýza. Relativní mRNA exprese RECK vykazovala pozitivní korelaci s relativní mRNA expresí všech studovaných RBPs. Vzhledem k tomu, že RBPs často tvoří komplexy a společně rozpoznávají stejný ARE motiv, se dá korelace s expresí více RBPs předpokládat. Molekula HuR patří mezi RBPs, které stabilizují mRNA sekvence a tím zvyšují počet transkriptů dostupných pro translaci (Lopez de Silanes et al., 2004; Mukherjee et al., 2011). Nízká exprese proteinu HuR by proto mohla přispívat ke zvýšené degradaci mRNA genu RECK a tím snižovat koncentraci inhibitoru RECK u pacientů s plicním onemocněním. V souladu s touto hypotézou měli námi studovaní pacienti sníženou relativní mRNA expresi jak RECK, tak HuR a obě exprese spolu korelovaly. Podobně jako HuR i relativní exprese AUF1 vykazovala výraznou pozitivní korelaci s RECK. AUF1 má většinou destabilizační efekt na cílovou mRNA, a proto byla očekávána negativní korelace. Jedním z možných vysvětlení pozitivní korelace je nepřímé působení AUF1 na RECK přes některý inhibitor RECK exprese. Takovýmto kandidátem může být transkripční faktor Sp3, který inhibuje expresi genu RECK, a současně může být jeho mRNA sekvence rozpoznána RBP AUF1 (Chadjichristos et al., 2002; Chang et al., 2004) (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/AREsite.cgi). Tato hypotéza je znázorněna na Obr. 19. Dalším vysvětlením může být, že RECK podobně jako některé onkogeny představuje výjimku a jeho mRNA je vazbou AUF1 stabilizována (Liao et al., 2007).
58
Obr. 19: Hypotetický mechanismus regulace mRNA genu RECK pomocí RBPs a transkripčních faktorů. V současné době je také intenzivně studován vztah mezi AUF1 a HuR (Chang et al., 2010; Krishnan et al., 2014). HuR a AUF1 často rozpoznávají stejný mRNA transkript a mohou vzájemně soupeřit o stejnou regulační ARE sekvenci (Lal et al., 2004). RECK mRNA
obsahuje
hned
několik
strukturně
odlišných
vazebných
ARE
motivů
(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/AREsite.cgi). AUF1 a HuR se mohou lišit v ochotě vázat tyto regulační ARE sekvence (Lal et al., 2004). Rozdíly ve vazebných vlastnostech AFU-1 a HuR nejsou doposud známé. Na základě současných znalostí proto nemůže být interpretace naší korelační analýzy jednoznačná. Další zde studované RBPs jsou TIA-1 a TIAR, jejichž mRNA exprese byla snížena jen u pacientů s plicní S. TIA-1 a TIAR patří mezi inhibitory translace, a to zejména inhibitory cytokinů. Jejich snížená exprese u plicní S by proto mohla přispívat ke zvýšené syntéze IL-6, IFNγ, IL-1β, IL-13, TNFα, GM-CSF a dalších zánětlivých cytokinů (Piecyk et al., 2000; Scheu et al., 2006). Co se týče proteolytických enzymů, snížená exprese TIAR by u pacientů v pokročilém stádiu S mohla pozitivně ovlivnit expresi MMP-13 (Yu et al., 2003). Snížená relativní exprese TIA-1 a TIAR byla pozorována u pacientů s plicní S i ve srovnání s pacienty s CHOPN a AB. TIA-1 a TIAR proto mohou být klíčovými regulačními faktory, které odlišují proteinový expresní profil u pacientů s plicní S od pacientů s CHOPN a AB. Další dva zde studované geny NCL a PCBP2 patří také mezi geny kódující RBPs, současně však hrají důležitou roli při virové a bakteriální infekci. NCL je exprimován na povrchu buněk a usnadňuje vstup virů do hostitelské buňky (Hegele 2012). PCBP2 podporuje replikaci virů (Toyoda et al., 2007; Beura et al., 2011). Následně imunitní systém rozvíjí proti 59
infikovaným buňkám zánětlivou imunitní odpověď. V této práci byla v buňkách z místa zánětu pacientů s plicní S zaznamenána snížená mRNA exprese NCL a PCBP2 ve srovnání s kontrolními jedinci. K léčbě pacientů se sarkoidózou se standardně používají steroidy, které mají protizánětlivé vlastnosti (American Thoracic Society, 1999). Nízká exprese NCL a PCBP2 u studovaných pacientů s plicní S by proto mohla být jedním z důsledku protizánětlivé terapie. V předkládané studii byla měřena exprese pouze na úrovni mRNA. Je tedy třeba brát v úvahu, že transkripty RBPs podléhají alternativnímu sestřihu, vedoucímu ke vzniku různých izoforem, které mohou mít různou funkci. Dále se uplatňují posttranslační modifikace (nejčastěji fosforylace) a interakce s miRNAs (Ciafre et Galardi 2013). RBPs navíc často sdílí stejný vazebný motiv, o který kompetují. Na jednu mRNA se pak mohou vázat dva i více RBPs, které mohou mít na mRNA stejný účinek, nebo mohou působit antagonisticky (Lal et al., 2004). Ani proteinová koncentrace tedy není přímým důkazem interakce daného RBP s mRNA. Jedinečnost experimentální části této práce spočívá ve stanovení relativní exprese RBPS in vivo. Zatímco post-transkripční regulace prostřednictvím miRNAs je u zánětlivých onemocnění plic intenzivně studována, většina poznatků o RBPs v tomto směru pochází ze studií buněčných liniích a nádorových buněk (Blaxall et al., 2000; Akool el et al., 2003; Tauler et Mulshine 2009). Interpretace předkládaných výsledků je tedy založena převážně na funkčních studiích. Přínosem pro další studium mechanismu patogeneze zánětlivých onemocnění plic je také skutečnost, že relativní exprese studovaných molekul byla měřena v buňkách bronchoalveolární laváže (BAL), tedy v buňkách pocházejících přímo z místa zánětu. BAL ovšem obsahuje různé typy buněk (makrofágy, lymfocyty). Vzhledem k tomu, že funkce RBPs se liší v závislosti na buněčné lokalizaci, lze předpokládat odlišné funkce (Colombrita et al., 2013) i mezi jednotlivými buněčnými subpopulacemi. Vhodné řešení pro měření relativní exprese RBPs a jejich potenciálních vazebných cílů na proteinové úrovni v jednotlivých typech buněk představuje průtoková cytometrie. Analýza RBPs v BAL testovaného souboru pacientů a kontrolních jedinců pomocí průtokové cytometrie bude předmětem dalšího studia. Plánem do budoucna jsou také subanalýzy zohledňující věk pacienta, odlišnosti expresních profilů v závislosti na stádiu onemocnění a studium vlivu kouření.
60
7
ZÁVĚR RNA-vazebné proteiny (RBPs) jsou spolu s miRNAs hlavními post-transkripčními
regulátory genové exprese. Zatímco role miRNAs je v současné době intenzivně studována, význam RBPs nebyl doposud u plicních nemocí in vivo studován. Předkládaná diplomová práce poukazuje na význam RBPs u pacientů s plicním zánětem. Celkem tři zánětlivé plicní nemoci byly studovány v této diplomové práci: chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN), astma bronchiale (AB) a plicní sarkoidóza (plicní S). Společným znakem všech tří plicních nemocí byla snížená mRNA exprese RBP AUF1. Nízká exprese AUF1 může u pacientů s plicním zánětem ovlivňovat proteolytickou aktivitu. Jedním z možných mechanismů je deregulace inhibitorů proteolytických enzymů, například inhibitoru RECK. Zde prezentovaná data současně naznačují, že funkce AUF1 v regulaci zánětu má komplexní charakter. Je proto vysoce pravděpodobné, že konkrétní význam AUF1 v patogenezi plicního zánětu je ovlivněn interakcemi s dalšími RBPs nebo interakcemi s druhým post-transkripčním regulátorem genové exprese, miRNA. Studie zaměřené na kooperaci mezi oběma skupinami post-transkripčních regulátorů (RBPs a miRNAs) jsou velkou výzvou pro nové laboratorní technologie. Jedinečným přínosem této práce je také srovnání tří odlišných plicních nemocí. Největší rozdíly v expresi RBPs byly v této diplomové práci pozorovány u pacientů s plicní S. Konkrétně exprese všech šesti zde studovaných RBPs byla snížená u našich pacientů s plicní S. Plicní S je spojena se zvýšenou expresí Th1 cytokinů a řada těchto cytokinů je vazebným partnerem RBPs. Význam snížené exprese RBPs v zánětu plicní S by proto neměl být opomíjen.
61
8
LITERATURA
(1999). "Statement on Sarcoidosis." Am J Respir Crit Care Med 160(2): 736-755. Abdelmohsen, K. (2012). Modulation of Gene Expression by RNA Binding Proteins: mRNA Stability and Translation. Abdelmohsen, K. and M. Gorospe (2012). "RNA-binding protein nucleolin in disease." RNA Biol 9(6): 799-808. Abdelmohsen, K., R. Pullmann, Jr., A. Lal et al., (2007). "Phosphorylation of HuR by Chk2 regulates SIRT1 expression." Mol Cell 25(4): 543-557. Abdelmohsen, K., S. Srikantan, X. Yang et al., (2009). "Ubiquitin-mediated proteolysis of HuR by heat shock." EMBO J 28(9): 1271-1282. Abdelmohsen, K., K. Tominaga, E. K. Lee et al., (2011). "Enhanced translation by Nucleolin via G-rich elements in coding and non-coding regions of target mRNAs." Nucleic Acids Res 39(19): 8513-8530. Adrianto, I., C. P. Lin, J. J. Hale et al., (2012). "Genome-wide association study of African and European Americans implicates multiple shared and ethnic specific loci in sarcoidosis susceptibility." PLoS One 7(8): e43907. Agostinis, F., C. Foglia, M. Landi et al., (2008). "GINA Report, Global Strategy for Asthma Management and Prevention." Allergy 63(12): 1637-1639. Akool el, S., H. Kleinert, F. M. Hamada et al., (2003). "Nitric oxide increases the decay of matrix metalloproteinase 9 mRNA by inhibiting the expression of mRNA-stabilizing factor HuR." Mol Cell Biol 23(14): 4901-4916. Alberts, B. (2008). Molecular Biology of the Cell: Reference edition, Garland Science. Angelov, D., V. A. Bondarenko, S. Almagro et al., (2006). "Nucleolin is a histone chaperone with FACT-like activity and assists remodeling of nucleosomes." EMBO J 25(8): 1669-1679. Atasoy, U., S. L. Curry, I. Lopez de Silanes et al., (2003). "Regulation of eotaxin gene expression by TNF-alpha and IL-4 through mRNA stabilization: involvement of the RNA-binding protein HuR." J Immunol 171(8): 4369-4378.
62
Babusyte, A., K. Stravinskaite, J. Jeroch et al., (2007). "Patterns of airway inflammation and MMP-12 expression in smokers and ex-smokers with COPD." Respir Res 8: 81. Bakheet, T., B. R. Williams and K. S. Khabar (2006). "ARED 3.0: the large and diverse AU-rich transcriptome." Nucleic Acids Res 34(Database issue): D111-114. Barnes, P. J. (2002). "New treatments for COPD." Nat Rev Drug Discov 1(6): 437-446. Barnes, P. J. (2004). "New drugs for asthma." Nat Rev Drug Discov 3(10): 831-844. Barnes, P. J. (2008). "Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease." Nat Rev Immunol 8(3): 183-192. Beck, A. R., Q. G. Medley, S. O'Brien et al., (1996). "Structure, tissue distribution and genomic organization of the murine RRM-type RNA binding proteins TIA-1 and TIAR." Nucleic Acids Res 24(19): 3829-3835. Beura, L. K., P. X. Dinh, F. A. Osorio et al., (2011). "Cellular poly(c) binding proteins 1 and 2 interact with porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1beta and support viral replication." J Virol 85(24): 12939-12949. Blaxall, B. C., L. D. Dwyer-Nield, A. K. Bauer et al., (2000). "Differential expression and localization of the mRNA binding proteins, AU-rich element mRNA binding protein (AUF1) and Hu antigen R (HuR), in neoplastic lung tissue." Mol Carcinog 28(2): 7683. Bose, S., M. Basu and A. K. Banerjee (2004). "Role of nucleolin in human parainfluenza virus type 3 infection of human lung epithelial cells." J Virol 78(15): 8146-8158. Bouvet, P., J. J. Diaz, K. Kindbeiter et al., (1998). "Nucleolin interacts with several ribosomal proteins through its RGG domain." J Biol Chem 273(30): 19025-19029. Brennan, C. M. and J. A. Steitz (2001). "HuR and mRNA stability." Cell Mol Life Sci 58(2): 266-277. Brinckerhoff, C. E. and L. M. Matrisian (2002). "Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince." Nat Rev Mol Cell Biol 3(3): 207-214. Bureš, J. and J. Horáček (2003). Základy vnitřního lékařství, Galén. Caput, D., B. Beutler, K. Hartog et al., (1986). "Identification of a common nucleotide sequence in the 3'-untranslated region of mRNA molecules specifying inflammatory mediators." Proc Natl Acad Sci U S A 83(6): 1670-1674. 63
Casolaro, V., X. Fang, B. Tancowny et al., (2008). "Posttranscriptional regulation of IL-13 in T cells: role of the RNA-binding protein HuR." J Allergy Clin Immunol 121(4): 853859 e854. Ciafre, S. A. and S. Galardi (2013). "microRNAs and RNA-binding proteins: a complex network of interactions and reciprocal regulations in cancer." RNA Biol 10(6): 935942. Cok, S. J., S. J. Acton and A. R. Morrison (2003). "The proximal region of the 3'-untranslated region of cyclooxygenase-2 is recognized by a multimeric protein complex containing HuR, TIA-1, TIAR, and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U." J Biol Chem 278(38): 36157-36162. Colombrita, C., V. Silani and A. Ratti (2013). "ELAV proteins along evolution: back to the nucleus?" Mol Cell Neurosci 56: 447-455. Cougot, N., S. Babajko and B. Seraphin (2004). "Cytoplasmic foci are sites of mRNA decay in human cells." J Cell Biol 165(1): 31-40. Damgaard, C. K. and J. Lykke-Andersen (2011). "Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR." Genes Dev 25(19): 2057-2068. DeMaria, C. T., Y. Sun, L. Long et al., (1997). "Structural determinants in AUF1 required for high affinity binding to A + U-rich elements." J Biol Chem 272(44): 27635-27643. Demedts, I. K., A. Morel-Montero, S. Lebecque et al., (2006). "Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD." Thorax 61(3): 196-201. Elkington, P. T. and J. S. Friedland (2006). "Matrix metalloproteinases in destructive pulmonary pathology." Thorax 61(3): 259-266. Esnault, S., Z. J. Shen, E. Whitesel et al., (2006). "The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 regulates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA stability in T lymphocytes." J Immunol 177(10): 6999-7006. Fahling, M., A. Steege, A. Perlewitz et al., (2005). "Role of nucleolin in posttranscriptional control of MMP-9 expression." Biochim Biophys Acta 1731(1): 32-40. Fan, X. C. and J. A. Steitz (1998). "HNS, a nuclear-cytoplasmic shuttling sequence in HuR." Proc Natl Acad Sci U S A 95(26): 15293-15298.
64
Fanjul-Fernandez, M., A. R. Folgueras, S. Cabrera et al., (2010). "Matrix metalloproteinases: evolution, gene regulation and functional analysis in mouse models." Biochim Biophys Acta 1803(1): 3-19. Fawal, M., F. Armstrong, S. Ollier et al., (2006). "A "liaison dangereuse" between AUF1/hnRNPD and the oncogenic tyrosine kinase NPM-ALK." Blood 108(8): 27802788. Fialcowitz, E. J., B. Y. Brewer, B. P. Keenan et al., (2005). "A hairpin-like structure within an AU-rich mRNA-destabilizing element regulates trans-factor binding selectivity and mRNA decay kinetics." J Biol Chem 280(23): 22406-22417. Finlay, G. A., K. J. Russell, K. J. McMahon et al., (1997). "Elevated levels of matrix metalloproteinases in bronchoalveolar lavage fluid of emphysematous patients." Thorax 52(6): 502-506. Fireman, E., Z. Kraiem, O. Sade et al., (2002). "Induced sputum-retrieved matrix metalloproteinase 9 and tissue metalloproteinase inhibitor 1 in granulomatous diseases." Clin Exp Immunol 130(2): 331-337. Fujimura, K., F. Kano and M. Murata (2008). "Identification of PCBP2, a facilitator of IRESmediated translation, as a novel constituent of stress granules and processing bodies." RNA 14(3): 425-431. Galban, S., Y. Kuwano, R. Pullmann, Jr. et al., (2008). "RNA-binding proteins HuR and PTB promote the translation of hypoxia-inducible factor 1alpha." Mol Cell Biol 28(1): 93107. Gearing, A. J., P. Beckett, M. Christodoulou et al., (1994). "Processing of tumour necrosis factor-alpha precursor by metalloproteinases." Nature 370(6490): 555-557. Ginisty, H., G. Serin, L. Ghisolfi-Nieto et al., (2000). "Interaction of nucleolin with an evolutionarily conserved pre-ribosomal RNA sequence is required for the assembly of the primary processing complex." J Biol Chem 275(25): 18845-18850. Griffin, S. V., J. P. Olivier, J. W. Pippin et al., (2006). "Cyclin I protects podocytes from apoptosis." J Biol Chem 281(38): 28048-28057. Grunewald, J. (2008). "Genetics of sarcoidosis." Curr Opin Pulm Med 14(5): 434-439.
65
Guderian, G., C. Peter, J. Wiesner et al., (2011). "RioK1, a new interactor of protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5), competes with pICln for binding and modulates PRMT5 complex composition and substrate specificity." J Biol Chem 286(3): 19761986. Gueders, M. M., J. M. Foidart, A. Noel et al., (2006). "Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of MMPs in the respiratory tract: potential implications in asthma and other lung diseases." Eur J Pharmacol 533(1-3): 133-144. Hegele, R. G. (2012). "Making sense of cell surface nucleolin: implications for respiratory syncytial virus prophylaxis and therapy." Cell Cycle 11(1): 1-2. Henry, M. T., K. McMahon, A. J. Mackarel et al., (2002). "Matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in sarcoidosis and IPF." Eur Respir J 20(5): 1220-1227. Hsu, M. C., H. C. Chang and W. C. Hung (2006). "HER-2/neu represses the metastasis suppressor RECK via ERK and Sp transcription factors to promote cell invasion." J Biol Chem 281(8): 4718-4725. Huwiler, A., S. Akool el, A. Aschrafi et al., (2003). "ATP potentiates interleukin-1 beta-induced MMP-9 expression in mesangial cells via recruitment of the ELAV protein HuR." J Biol Chem 278(51): 51758-51769. Chadjichristos, C., C. Ghayor, J. F. Herrouin et al., (2002). "Down-regulation of human type II collagen gene expression by transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta 1) in articular chondrocytes involves SP3/SP1 ratio." J Biol Chem 277(46): 43903-43917. Chang, C. K., W. C. Hung and H. C. Chang (2008). "The Kazal motifs of RECK protein inhibit MMP-9 secretion and activity and reduce metastasis of lung cancer cells in vitro and in vivo." J Cell Mol Med 12(6B): 2781-2789. Chang, H. C., C. Y. Cho and W. C. Hung (2007). "Downregulation of RECK by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in non-small cell lung cancer." Cancer Sci 98(2): 169-173. Chang, H. C., L. T. Liu and W. C. Hung (2004). "Involvement of histone deacetylation in rasinduced down-regulation of the metastasis suppressor RECK." Cell Signal 16(6): 675679.
66
Chang, N., J. Yi, G. Guo et al., (2010). "HuR uses AUF1 as a cofactor to promote p16INK4 mRNA decay." Mol Cell Biol 30(15): 3875-3886. Chen, C. M., S. Y. Chiang and N. H. Yeh (1991). "Increased stability of nucleolin in proliferating cells by inhibition of its self-cleaving activity." J Biol Chem 266(12): 7754-7758. Chen, C. Y., R. Gherzi, J. S. Andersen et al., (2000). "Nucleolin and YB-1 are required for JNK-mediated interleukin-2 mRNA stabilization during T-cell activation." Genes Dev 14(10): 1236-1248. Chen, C. Y. and A. B. Shyu (1995). "AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation." Trends Biochem Sci 20(11): 465-470. Chen, C. Y., N. Xu and A. B. Shyu (1995). "mRNA decay mediated by two distinct AU-rich elements
from c-fos
and granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor
transcripts: different deadenylation kinetics and uncoupling from translation." Mol Cell Biol 15(10): 5777-5788. Chen, E. S., J. Wahlstrom, Z. Song et al., (2008). "T cell responses to mycobacterial catalaseperoxidase profile a pathogenic antigen in systemic sarcoidosis." J Immunol 181(12): 8784-8796. Churg, A. and F. Galateau-Salle (2012). "The separation of benign and malignant mesothelial proliferations." Arch Pathol Lab Med 136(10): 1217-1226. Ivanov, P. and P. Anderson (2013). "Post-transcriptional regulatory networks in immunity." Immunol Rev 253(1): 253-272. Jacobs, J. L. and C. B. Coyne (2013). "Mechanisms of MAVS regulation at the mitochondrial membrane." J Mol Biol 425(24): 5009-5019. Jiang, Y., X. S. Xu and J. E. Russell (2006). "A nucleolin-binding 3' untranslated region element stabilizes beta-globin mRNA in vivo." Mol Cell Biol 26(6): 2419-2429. Kang, H. G., H. S. Kim, K. J. Kim et al., (2007). "RECK expression in osteosarcoma: correlation with matrix metalloproteinases activation and tumor invasiveness." J Orthop Res 25(5): 696-702. Katsanou, V., O. Papadaki, S. Milatos et al., (2005). "HuR as a negative posttranscriptional modulator in inflammation." Mol Cell 19(6): 777-789.
67
Kawakami, A., Q. Tian, M. Streuli et al., (1994). "Intron-exon organization and chromosomal localization of the human TIA-1 gene." J Immunol 152(10): 4937-4945. Kedersha, N. and P. Anderson (2002). "Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability." Biochem Soc Trans 30(Pt 6): 963-969. Khurts, S., K. Masutomi, L. Delgermaa et al., (2004). "Nucleolin interacts with telomerase." J Biol Chem 279(49): 51508-51515. Kiledjian, M., X. Wang and S. A. Liebhaber (1995). "Identification of two KH domain proteins in the alpha-globin mRNP stability complex." EMBO J 14(17): 4357-4364. Kim, H. S., Y. Kuwano, M. Zhan et al., (2007). "Elucidation of a C-rich signature motif in target mRNAs of RNA-binding protein TIAR." Mol Cell Biol 27(19): 6806-6817. Kim, H. S., M. C. Wilce, Y. M. Yoga et al., (2011). "Different modes of interaction by TIAR and HuR with target RNA and DNA." Nucleic Acids Res 39(3): 1117-1130. Kolek, V., V. Kašák and M. Vašáková (2011). Pneumologie, Maxdorf. Koul, D., R. Parthasarathy, R. Shen et al., (2001). "Suppression of matrix metalloproteinase-2 gene expression and invasion in human glioma cells by MMAC/PTEN." Oncogene 20(46): 6669-6678. Kriegova, E., A. Arakelyan, R. Fillerova et al., (2008). "PSMB2 and RPL32 are suitable denominators to normalize gene expression profiles in bronchoalveolar cells." BMC Mol Biol 9(69): 1471-2199. Krishnan, N., M. A. Titus and R. Thapar (2014). "The prolyl isomerase pin1 regulates mRNA levels of genes with short half-lives by targeting specific RNA binding proteins." PLoS One 9(1): e85427. Kullmann, M., U. Gopfert, B. Siewe et al., (2002). "ELAV/Hu proteins inhibit p27 translation via an IRES element in the p27 5'UTR." Genes Dev 16(23): 3087-3099. Lal, A., K. Mazan-Mamczarz, T. Kawai et al., (2004). "Concurrent versus individual binding of HuR and AUF1 to common labile target mRNAs." EMBO J 23(15): 3092-3102. Laroia, G. and R. J. Schneider (2002). "Alternate exon insertion controls selective ubiquitination and degradation of different AUF1 protein isoforms." Nucleic Acids Res 30(14): 3052-3058.
68
Le Guiner, C., F. Lejeune, D. Galiana et al., (2001). "TIA-1 and TIAR activate splicing of alternative exons with weak 5' splice sites followed by a U-rich stretch on their own pre-mRNAs." J Biol Chem 276(44): 40638-40646. Lee, Y. C., H. B. Lee, Y. K. Rhee et al., (2001). "The involvement of matrix metalloproteinase-9 in airway inflammation of patients with acute asthma." Clin Exp Allergy 31(10): 1623-1630. Legrand, C., C. Gilles, J. M. Zahm et al., (1999). "Airway epithelial cell migration dynamics. MMP-9 role in cell-extracellular matrix remodeling." J Cell Biol 146(2): 517-529. Leitinger, N. and J. Wesierska-Gadek (1993). "ADP-ribosylation of nucleolar proteins in HeLa tumor cells." J Cell Biochem 52(2): 153-158. Levy, N. S., S. Chung, H. Furneaux et al., (1998). "Hypoxic stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by the RNA-binding protein HuR." J Biol Chem 273(11): 6417-6423. Li, J., C. Yen, D. Liaw et al., (1997). "PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer." Science 275(5308): 1943-1947. Li, W., Y. Li, N. Kedersha et al., (2002). "Cell proteins TIA-1 and TIAR interact with the 3' stem-loop of the West Nile virus complementary minus-strand RNA and facilitate virus replication." J Virol 76(23): 11989-12000. Liao, B., Y. Hu and G. Brewer (2007). "Competitive binding of AUF1 and TIAR to MYC mRNA controls its translation." Nat Struct Mol Biol 14(6): 511-518. Lindquist, J. N., S. G. Kauschke, B. Stefanovic et al., (2000). "Characterization of the interaction between alphaCP(2) and the 3'-untranslated region of collagen alpha1(I) mRNA." Nucleic Acids Res 28(21): 4306-4316. Linker, K., A. Pautz, M. Fechir et al., (2005). "Involvement of KSRP in the posttranscriptional regulation of human iNOS expression-complex interplay of KSRP with TTP and HuR." Nucleic Acids Res 33(15): 4813-4827. Liu, L. T., H. C. Chang, L. C. Chiang et al., (2002). "Induction of RECK by nonsteroidal anti-inflammatory drugs in lung cancer cells." Oncogene 21(54): 8347-8350.
69
Liu, L. T., H. C. Chang, L. C. Chiang et al., (2003). "Histone deacetylase inhibitor up-regulates RECK to inhibit MMP-2 activation and cancer cell invasion." Cancer Res 63(12): 3069-3072. Loffek, S., O. Schilling and C. W. Franzke (2011). "Series "matrix metalloproteinases in lung health and disease": Biological role of matrix metalloproteinases: a critical balance." Eur Respir J 38(1): 191-208. Loflin, P., C. Y. Chen and A. B. Shyu (1999). "Unraveling a cytoplasmic role for hnRNP D in the in vivo mRNA destabilization directed by the AU-rich element." Genes Dev 13(14): 1884-1897. Lopez de Silanes, I., M. Zhan, A. Lal et al., (2004). "Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR." Proc Natl Acad Sci U S A 101(9): 2987-2992. Losfeld, M. E., D. E. Khoury, P. Mariot et al., (2009). "The cell surface expressed nucleolin is a glycoprotein that triggers calcium entry into mammalian cells." Exp Cell Res 315(2): 357-369. Marcais, A., M. Tomkowiak, T. Walzer et al., (2006). "Maintenance of CCL5 mRNA stores by post-effector and memory CD8 T cells is dependent on transcription and is coupled to increased mRNA stability." Eur J Immunol 36(10): 2745-2754. Masuda, K., K. Abdelmohsen, M. M. Kim et al., (2011). "Global dissociation of HuR-mRNA complexes promotes cell survival after ionizing radiation." EMBO J 30(6): 1040-1053. Masui, T., R. Doi, T. Koshiba et al., (2003). "RECK expression in pancreatic cancer: its correlation with lower invasiveness and better prognosis." Clin Cancer Res 9(5): 17791784. Mazroui, R., S. Di Marco, E. Clair et al., (2008). "Caspase-mediated cleavage of HuR in the cytoplasm contributes to pp32/PHAP-I regulation of apoptosis." J Cell Biol 180(1): 113-127. Morgenthau, A. S. and M. C. Iannuzzi (2011). "Recent advances in sarcoidosis." Chest 139(1): 174-182. Moss, S. E. and R. O. Morgan (2004). "The annexins." Genome Biol 5(4): 219.
70
Mrazek, F., A. Stahelova, E. Kriegova et al., (2011). "Functional variant ANXA11 R230C: true marker of protection and candidate disease modifier in sarcoidosis." Genes Immun 12(6): 490-494. Mukherjee, N., D. L. Corcoran, J. D. Nusbaum et al., (2011). "Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability." Mol Cell 43(3): 327-339. Namwat, N., J. Puetkasichonpasutha, W. Loilome et al., (2011). "Downregulation of reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) is associated with enhanced
expression
of
matrix
metalloproteinases
and
cholangiocarcinoma
metastases." J Gastroenterol 46(5): 664-675. Newman, L. S., C. S. Rose, E. A. Bresnitz et al., (2004). "A case control etiologic study of sarcoidosis: environmental and occupational risk factors." Am J Respir Crit Care Med 170(12): 1324-1330. Nunes, H., D. Bouvry, P. Soler et al., (2007). "Sarcoidosis." Orphanet J Rare Dis 2: 46. Oh, J., R. Takahashi, S. Kondo et al., (2001). "The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis." Cell 107(6): 789-800. Ong, S. E., G. Mittler and M. Mann (2004). "Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC." Nat Methods 1(2): 119-126. Opdenakker, G., P. E. Van den Steen, B. Dubois et al., (2001). "Gelatinase B functions as regulator and effector in leukocyte biology." J Leukoc Biol 69(6): 851-859. Ostareck-Lederer, A. and D. H. Ostareck (2012). "Precision mechanics with multifunctional tools: how hnRNP K and hnRNPs E1/E2 contribute to post-transcriptional control of gene expression in hematopoiesis." Curr Protein Pept Sci 13(4): 391-400. Park, M. J., M. S. Kim, I. C. Park et al., (2002). "PTEN suppresses hyaluronic acid-induced matrix metalloproteinase-9 expression in U87MG glioblastoma cells through focal adhesion kinase dephosphorylation." Cancer Res 62(21): 6318-6322. Paschoud, S., A. M. Dogar, C. Kuntz et al., (2006). "Destabilization of interleukin-6 mRNA requires a putative RNA stem-loop structure, an AU-rich element, and the RNA-binding protein AUF1." Mol Cell Biol 26(22): 8228-8241.
71
Paulding, W. R. and M. F. Czyzyk-Krzeska (1999). "Regulation of tyrosine hydroxylase mRNA stability by protein-binding, pyrimidine-rich sequence in the 3'-untranslated region." J Biol Chem 274(4): 2532-2538. Paulissen, G., N. Rocks, F. Quesada-Calvo et al., (2006). "Expression of ADAMs and their inhibitors in sputum from patients with asthma." Mol Med 12(7-8): 171-179. Petrek, M., J. Drabek, V. Kolek et al., (2000). "CC chemokine receptor gene polymorphisms in Czech patients with pulmonary sarcoidosis." Am J Respir Crit Care Med 162(3 Pt 1): 1000-1003. Piecyk, M., S. Wax, A. R. Beck et al., (2000). "TIA-1 is a translational silencer that selectively regulates the expression of TNF-alpha." EMBO J 19(15): 4154-4163. Pont, A. R., N. Sadri, S. J. Hsiao et al., (2012). "mRNA decay factor AUF1 maintains normal aging, telomere maintenance, and suppression of senescence by activation of telomerase transcription." Mol Cell 47(1): 5-15. Ra, H. J. and W. C. Parks (2007). "Control of matrix metalloproteinase catalytic activity." Matrix Biol 26(8): 587-596. Rabe, K. F., S. Hurd, A. Anzueto et al., (2007). "Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease - GOLD executive summary." American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 176(6): 532-555. Rebane, A., A. Aab and J. A. Steitz (2004). "Transportins 1 and 2 are redundant nuclear import factors for hnRNP A1 and HuR." RNA 10(4): 590-599. Rieder, E., W. Xiang, A. Paul et al., (2003). "Analysis of the cloverleaf element in a human rhinovirus type 14/poliovirus chimera: correlation of subdomain D structure, ternary protein complex formation and virus replication." J Gen Virol 84(Pt 8): 2203-2216. Rybicki, B. A., J. L. Walewski, M. J. Maliarik et al., (2005). "The BTNL2 gene and sarcoidosis susceptibility in African Americans and Whites." Am J Hum Genet 77(3): 491-499. Sean, P., J. H. Nguyen and B. L. Semler (2008). "The linker domain of poly(rC) binding protein 2 is a major determinant in poliovirus cap-independent translation." Virology 378(2): 243-253.
72
Sean, P., J. H. Nguyen and B. L. Semler (2009). "Altered interactions between stem-loop IV within the 5' noncoding region of coxsackievirus RNA and poly(rC) binding protein 2: effects on IRES-mediated translation and viral infectivity." Virology 389(1-2): 45-58. Segura-Valdez, L., A. Pardo, M. Gaxiola et al., (2000). "Upregulation of gelatinases A and B, collagenases 1 and 2, and increased parenchymal cell death in COPD." Chest 117(3): 684-694. Seinsoth, S., H. Uhlmann-Schiffler and H. Stahl (2003). "Bidirectional DNA unwinding by a ternary complex of T antigen, nucleolin and topoisomerase I." EMBO Rep 4(3): 263268. Sengupta, T. K., S. Bandyopadhyay, D. J. Fernandes et al., (2004). "Identification of nucleolin as an AU-rich element binding protein involved in bcl-2 mRNA stabilization." J Biol Chem 279(12): 10855-10863. Shen, Z. J., S. Esnault and J. S. Malter (2005). "The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 regulates the stability of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA in activated eosinophils." Nat Immunol 6(12): 1280-1287. Sheth, U. and R. Parker (2003). "Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies." Science 300(5620): 805-808. Scheu, S., D. B. Stetson, R. L. Reinhardt et al., (2006). "Activation of the integrated stress response during T helper cell differentiation." Nat Immunol 7(6): 644-651. Schwab, M. S. and C. Dreyer (1997). "Protein phosphorylation sites regulate the function of the bipartite NLS of nucleolin." Eur J Cell Biol 73(4): 287-297. Sirenko, O., U. Bocker, J. S. Morris et al., (2002). "IL-1 beta transcript stability in monocytes is linked to cytoskeletal reorganization and the availability of mRNA degradation factors." Immunol Cell Biol 80(4): 328-339. Song, Z., L. Marzilli, B. M. Greenlee et al., (2005). "Mycobacterial catalase-peroxidase is a tissue antigen and target of the adaptive immune response in systemic sarcoidosis." J Exp Med 201(5): 755-767. Spagnolo, P. and J. Grunewald (2013). "Recent advances in the genetics of sarcoidosis." J Med Genet 50(5): 290-297.
73
Span, P. N., C. G. Sweep, P. Manders et al., (2003). "Matrix metalloproteinase inhibitor reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs: a prognostic marker for good clinical outcome in human breast carcinoma." Cancer 97(11): 2710-2715. Srikantan, S. and M. Gorospe (2012). "HuR function in disease." Front Biosci (Landmark Ed) 17: 189-205. Steck, P. A., M. A. Pershouse, S. A. Jasser et al., (1997). "Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers." Nat Genet 15(4): 356-362. Stoecklin, G., M. Lu, B. Rattenbacher et al., (2003). "A constitutive decay element promotes tumor necrosis factor alpha mRNA degradation via an AU-rich element-independent pathway." Mol Cell Biol 23(10): 3506-3515. Strickland, D. K., J. D. Ashcom, S. Williams et al., (1990). "Sequence identity between the alpha 2-macroglobulin receptor and low density lipoprotein receptor-related protein suggests that this molecule is a multifunctional receptor." J Biol Chem 265(29): 17401-17404. Takagi, M., M. J. Absalon, K. G. McLure et al., (2005). "Regulation of p53 translation and induction after DNA damage by ribosomal protein L26 and nucleolin." Cell 123(1): 49-63. Takagi, S., S. Simizu and H. Osada (2009). "RECK negatively regulates matrix metalloproteinase-9 transcription." Cancer Res 69(4): 1502-1508. Takahashi, C., Z. Sheng, T. P. Horan et al., (1998). "Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK." Proc Natl Acad Sci U S A 95(22): 13221-13226. Takenaka, K., S. Ishikawa, Y. Kawano et al., (2004). "Expression of a novel matrix metalloproteinase regulator, RECK, and its clinical significance in resected non-small cell lung cancer." Eur J Cancer 40(10): 1617-1623. Tauler, J. and J. L. Mulshine (2009). "Lung cancer and inflammation: interaction of chemokines and hnRNPs." Curr Opin Pharmacol 9(4): 384-388. Tayyari, F., D. Marchant, T. J. Moraes et al., (2011). "Identification of nucleolin as a cellular receptor for human respiratory syncytial virus." Nat Med 17(9): 1132-1135.
74
Teřl, M., G. Krákorová and M. Pešek (2004). Plicní lékařství, Karolinum. Toker, A. and L. C. Cantley (1997). "Signalling through the lipid products of phosphoinositide-3-OH kinase." Nature 387(6634): 673-676. Tommerup, N. and H. Leffers (1996). "Assignment of human KH-box-containing genes by in situ hybridization: HNRNPK maps to 9q21.32-q21.33, PCBP1 to 2p12-p13, and PCBP2 to 12q13.12-q13.13, distal to FRA12A." Genomics 32(2): 297-298. Toyoda, H., D. Franco, K. Fujita et al., (2007). "Replication of poliovirus requires binding of the poly(rC) binding protein to the cloverleaf as well as to the adjacent C-rich spacer sequence between the cloverleaf and the internal ribosomal entry site." J Virol 81(18): 10017-10028. Trojanowicz, B., L. Brodauf, C. Sekulla et al., (2009). "The role of AUF1 in thyroid carcinoma progression." Endocr Relat Cancer 16(3): 857-871. Valeyre, D., P. Soler, C. Clerici et al., (1988). "Smoking and pulmonary sarcoidosis: effect of cigarette smoking on prevalence, clinical manifestations, alveolitis, and evolution of the disease." Thorax 43(7): 516-524. Vandenbroucke, R. E., E. Dejonckheere and C. Libert (2011). "A therapeutic role for matrix metalloproteinase inhibitors in lung diseases?" Eur Respir J 38(5): 1200-1214. Vestbo, J., S. S. Hurd, A. G. Agusti et al., (2013). "Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary." Am J Respir Crit Care Med 187(4): 347-365. Wagner, B. J., C. T. DeMaria, Y. Sun et al., (1998). "Structure and genomic organization of the human AUF1 gene: alternative pre-mRNA splicing generates four protein isoforms." Genomics 48(2): 195-202. Wang, J. G., M. Collinge, V. Ramgolam et al., (2006). "LFA-1-dependent HuR nuclear export and cytokine mRNA stabilization in T cell activation." J Immunol 176(4): 2105-2113. Wang, K. K., L. Jiang, Y. X. Yi et al., (2004). "[Effect of heat shock response on the cleavage of nucleolin induced by oxidative stress]." Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 29(5): 504-508.
75
Wang, S. A., H. Y. Li, T. I. Hsu et al., (2011). "Heat shock protein 90 stabilizes nucleolin to increase mRNA stability in mitosis." J Biol Chem 286(51): 43816-43829. Welm, B., J. Mott and Z. Werb (2002). "Developmental biology: vasculogenesis is a wreck without RECK." Curr Biol 12(6): R209-211. Wilson, C. L., A. J. Ouellette, D. P. Satchell et al., (1999). "Regulation of intestinal alphadefensin activation by the metalloproteinase matrilysin in innate host defense." Science 286(5437): 113-117. Wilson, G. M., J. Lu, K. Sutphen et al., (2003). "Regulation of A + U-rich element-directed mRNA turnover involving reversible phosphorylation of AUF1." J Biol Chem 278(35): 33029-33038. Wilson, G. M., K. Sutphen, K. Chuang et al., (2001). "Folding of A+U-rich RNA elements modulates AUF1 binding. Potential roles in regulation of mRNA turnover." J Biol Chem 276(12): 8695-8704. Wu, L., A. Tanimoto, Y. Murata et al., (2003). "Matrix metalloproteinase-12 gene expression in human vascular smooth muscle cells." Genes Cells 8(3): 225-234. Xin, Z., W. Han, Z. Zhao et al., (2011). "PCBP2 enhances the antiviral activity of IFN-alpha against HCV by stabilizing the mRNA of STAT1 and STAT2." PLoS One 6(10): e25419. Yamada, K. M. and M. Araki (2001). "Tumor suppressor PTEN: modulator of cell signaling, growth, migration and apoptosis." J Cell Sci 114(Pt 13): 2375-2382. Yang, C., M. S. Kim, D. Chakravarty et al., (2009). "Nucleolin Binds to the Proliferating Cell Nuclear Antigen and Inhibits Nucleotide Excision Repair." Mol Cell Pharmacol 1(3): 130-137. Yang, C., D. A. Maiguel and F. Carrier (2002). "Identification of nucleolin and nucleophosmin as genotoxic stress-responsive RNA-binding proteins." Nucleic Acids Res 30(10): 2251-2260. Yarovinsky, T. O., N. S. Butler, M. M. Monick et al., (2006). "Early exposure to IL-4 stabilizes IL-4 mRNA in CD4+ T cells via RNA-binding protein HuR." J Immunol 177(7): 4426-4435.
76
Yu, Q., S. J. Cok, C. Zeng et al., (2003). "Translational repression of human matrix metalloproteinases-13 by an alternatively spliced form of T-cell-restricted intracellular antigen-related protein (TIAR)." J Biol Chem 278(3): 1579-1584. Zaidi, S. H. and J. S. Malter (1995). "Nucleolin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins specifically interact with the 3'-untranslated region of amyloid protein precursor mRNA." J Biol Chem 270(29): 17292-17298. Zhang, T., N. Delestienne, G. Huez et al., (2005). "Identification of the sequence determinants mediating the nucleo-cytoplasmic shuttling of TIAR and TIA-1 RNA-binding proteins." J Cell Sci 118(Pt 23): 5453-5463. Zhang, W., B. J. Wagner, K. Ehrenman et al., (1993). "Purification, characterization, and cDNA cloning of an AU-rich element RNA-binding protein, AUF1." Mol Cell Biol 13(12): 7652-7665. Zucconi, B. E., J. D. Ballin, B. Y. Brewer et al., (2010). "Alternatively expressed domains of AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1) regulate RNA-binding affinity, RNA-induced protein oligomerization, and the local conformation of bound RNA ligands." J Biol Chem 285(50): 39127-39139.
Internet: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/AREsite.cgi http://www.roche-applied-science.com http://universalprobelibrary.com www.thoracic.org
77
9
SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ
5‘ TOP
5‘ olygopyrimidine tracts
A
adenin
AB
astma bronchiale
ADP
adenosindifosfát
ANXA
annexin
APP
amyloidní prekurzorový protein
ARE
adenine-uridine rich element(s)
ATS
American Thoracic Society
AUF-1
AU-rich element RNA-binding protein
BAL
bronchoalveolární laváž
BCL-2
B-cell CLL/lymphoma 2
BSA
bovine serum albumin, hovězí sérový albumin
BTNL-2
butyrophilin-like 2
C
cytosin
CCL11
chemokine (C-C motif) ligand 11, eotaxin
CCND1
cyklin D1
CCR2
C-C chemokine receptor type 2, chemokinový receptor 2
CDE
constitutive decay element
Cdk1
cyklin-dependentní kinasa 1
cDNA
komplementární deoxyribonukleová kyselina
COX-2
cyklooxygenasa 2
CRM1
chromosome region maintenance 1
CRP
C-reaktivní protein
DEPC
diethylpyrokarbonát
DNA
deoxyribonukleová kyselina
ECM
extracelulární matrix
ECP
eosinophil cationic protein, eosinofilní kationtový protein
EGF1
epidermal growth factor, epidermální růstový faktor
eIF4E
eukaryotický iniciační faktor 4E 78
ERS
European Respiratory Society
FEV1
forced expiratory volume in 1 second, usilovně vydechnutý objem za 1s
FVC
forced vital capacity, usilovná vitální kapacita
GINA
Global Initiative for Asthma
GM-CSF
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů
GOLD
Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease
HBB
β-globin
HIF-1α
hypoxia-inducible factor 1α
HLA
human leukocyte antigene
hnRNPD
heterogenous nuclear ribonucleoprotein D (=AUF1)
hnRNPE2
heterogenous nuclear ribonucleoprotein E2 (=PCBP2, αCP2)
HNRNPU
heterogenous nuclear ribonucleoprotein , scaffold attachment factor A
HNS
nucleocytoplasmic shuttling sequence
HPIV3
human prainfluenza virus 3, lidský parainfluenza virus typu 3
HRCT
high resolution computed tomography, výpočetní tomografie s vysokým rozlišením
HRP
horseradish peroxidase, křenová peroxidasa
HUR
=ELAV L1- embryonic lethal, abnormal vision Drosophila-like 1
Chk2
checkpoint kinase 2
CHOPN
chronická obstrukční plicní nemoc
IFN
interferon
Ig
imunoglobulin
IL
interleukin
iNOS
synthasa oxidu dusnatého
IR
imunoregulační index
IRES
internal ribosome entry site
KH
K homology (domain)
LOX
15-lipoxygenasa
LT
leukotrien
MHC
major histocompatibility complex, hlavní histokompatibilní komplex
miRNA
mikroRNA 79
mKatG
Mycobacterium catalase-peroxidase, mykobakteriální katalasa peroxidasa
MMP
matrix metaloproteinasa
MPO
myeloperoxidasa
mRNA
mediátorová ribonukleová kyselina
MT-MMP
membrane type matrix metalloproteinase, membránová matrix metaloproteinasa
MYC
v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog
NCL
nucleolin
NO
oxid dusnatý
NPM-ALK
nucelophosmin-anaplastic lymphoma kinase
nt
nukleotid
OS9
osteosarcoma amplified 9
p16
cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, multiple tumor suppressor 1
p21
cyclin-dependent kinase inhibitor 1, CDK-interacting protein 1
p27
cyclin-dependent kinase inhibitor 1B
PBS
peroxohydrát boritanu sodného
PCBP2
poly(rC) binding protein
Pin1
peptidylprolyl cis/trans isomerasa
PIP3
fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfát
ProTα
prothymosin α
PSMB2
proteasome subunit β type 2
PTEN
phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten
qPCR
quantitative polymerase chain reaction, kvantitativní polymerázová řetězová reakce
RBP
RNA-binding protein, RNA-vazebný protein
RECK
reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs
RGG
arginine/glycine-rich, doména bohatá na arginin a glycin
RISC
RNA-induced silencing complex
RRM
RNA recognition motif, RNA rozpoznávající doména
rRNA
ribosomální RNA
RSV
respirační syncitiální virus
RT
reverzní transkripce
rtg
rentgen 80
RV
residual volume, reziduální objem
S
sarkoidóza
SNP
single nucleotide polymorphism, jednonukleotidový polymorfismus
Sp
specifity protein
T Reg
regulatory T-cell, regulační T-lymfocyt
T
thymin
TBS
Tris-buffered saline
TCR
T-cell receptor, T-buněčný receptor
TGF
transforming growth factor, transformující růstový faktor
Th
T helper, pomocný T-lymfocyt
TIA-1
TIA-1 cytotoxic granule-associated RNA binding protein
TIAL1
TIA1 cytotoxic granule-associated RNA binding protein-like 1 (=TIAR)
TIAR
TIA-1 related
TIMP
tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, tkáňový inhibitor matrix metaloproteinas
TNF
tumor nekrotizující faktor
TP53
tumor protein p53
U
uracil
UTR
untranslated region, nepřekládaná oblast
VEGF
vascular endothelilal growth factor, vaskulární endoteliální růstový faktor
WASOG
World Association of Sarcoidosis and Other Granulomatous Disorders
81
PŘÍLOHY Tab. P1: Korelace relativní mRNA exprese studovaných RNA-vazebných proteinů a inhibitorů proteolytických enzymů. AUF1 AUF1
HuR
NCL
TIA-1
TIAR
PCBP2
RECK
PTEN
rs
0,667
0,827
0,664
0,266
0,416
0,65
NS
p
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
NS
rs
0,565
0,529
0,4
0,388
0,509
NS
p
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
NS
rs
0,734
0,323
0,474
0,61
-0,223
p
<0,001
0,001
<0,001
<0,001
0,015
rs
0,413
0,349
0,683
NS
p
<0,001
<0,001
<0,001
NS
rs
NS
0,349
NS
p
NS
<0,001
NS
rs
0,392
NS
p
<0,001
NS
HuR
NCL
TIA-1
TIAR
PCBP2
RECK
*NS: žádná korelace v relativní mRNA expresi daných proteinů
relativní exprese NCL
5
rs=0,61 p<0,001
4 3 2 1 0 0.0
0.2
0.4
0.6
relativní exprese RECK
Obr. P1: Korelace relativní mRNA exprese RECK a NCL.
0.8
rs
NS
p
NS
relativní exprese TIA-1
2.0
rs=0,683 p<0,001
1.5 1.0 0.5 0.0 0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
relativní exprese RECK
Obr. P2: Korelace relativní mRNA exprese RECK a TIA-1.
relativní exprese TIAR
4
r s=0,394 p<0,001
3 2 1 0 0.0
0.2
0.4
0.6
relativní exprese RECK
Obr. P3: Korelace relativní mRNA exprese RECK a TIAR.
0.8
relativní exprese PCBP2
5
r s=0,392 p<0,001
4 3 2 1 0 0.0
0.2
0.4
0.6
relativní exprese RECK
Obr. P4: Korelace relativní mRNA exprese RECK a PCBP2.
0.8
