Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká Fakulta

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká Fakulta Katedra botaniky Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie

Fyziologie dřevomorky domácí (Serpula lacrymans) a možnosti sanace napadených budov Serpula lacrymans: physiology and possibility of remediation of affected buildings

Bakalářská práce

Karel Švec Školitel: Doc. RNDr. Jiří Gabriel, DrSc. Praha 2014

Tímto bych chtěl poděkovat svému školiteli Dr. Jiřímu Gabrielovi za cenné zkušenosti, které jsem měl v uplynulých letech pod jeho vedením šanci získat v laboratoři i v životě. Dále můj vděk patří celé mé rodině a přátelům, díky nimž mohla také tato práce vzniknout. Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracoval sám z uvedené literatury a na základě konzultací se svým školitelem.

Praha 2014

Obsah Abstrakt ......................................................................................................................................................... 2 Abstract ......................................................................................................................................................... 2 Seznam zkratek .............................................................................................................................................. 3 Úvod .............................................................................................................................................................. 4 Rozšíření ........................................................................................................................................................ 5 Taxonomie ..................................................................................................................................................... 6 Morfologie ..................................................................................................................................................... 8 Plodnice ..................................................................................................................................................... 8 Mycelium ................................................................................................................................................... 9 Spory .......................................................................................................................................................... 9 Fyziologie ..................................................................................................................................................... 10 Životní podmínky ..................................................................................................................................... 10 Rozmnožování ......................................................................................................................................... 12 Rhizomorfy .............................................................................................................................................. 13 Translokace molekul v myceliu................................................................................................................ 13 Rozklad dřevní hmoty .................................................................................................................................. 14 Struktura dřeva ........................................................................................................................................ 15 Typy hniloby ............................................................................................................................................ 16 Enzymy..................................................................................................................................................... 18 Fentonovské systémy .............................................................................................................................. 19 Okyselování substrátu ............................................................................................................................. 20 Možnosti diagnostiky a sanace .................................................................................................................... 20 Diagnostika .............................................................................................................................................. 20 Kritická místa v budovách a důvody vzniku napadení ............................................................................. 23 Normy ...................................................................................................................................................... 26 Sanace konstrukcí .................................................................................................................................... 26 Preventivní ochrana staveb ..................................................................................................................... 31 Závěr ............................................................................................................................................................ 34 Zdroje........................................................................................................................................................... 35

1

Abstrakt Serpula lacrymans, původce hnědé hniloby dřeva v interiérech, je nejčastěji se nacházející basidiomycet v budovách. Z pohledu ekonomických ztrát a destruktivního potenciálu, je to jedna z nejvýznamnějších hub vůbec. S. lacrymansje schopna rychle kolonizovat, a následně efektivně štěpit substrát díky masivnímu šíření mycelia. Navzdory faktu, že fyziologie této houby je studována více než 100 let, stále proti ní neexistuje dostatečně efektivní metoda obrany. Nicméně, prevence a snaha udržet prostředí budov suché se zdá stále být tou nejlepší možností. Tato práce poskytuje přehled nejnovějších znalostí fyziologie S. lacrymans a technologií, používaných v sanaci napadených budov. klíčová slova: Serpula lacrymans, dřevomorka domácí, fyziologie hub, rhizomorfy, sanace, dřevěné konstrukce, horký vzduch, mikrovlny, fungicidy

Abstract Serpula lacrymans, the causative agent of dry rot indoor wood decay, is the most common Basidiomycete found in buildings. From the viewpoint of economic loss and destructiveness it is the one of the most important fungus worldwide. S. lacrymans is able to fastly colonize substrate by rapid mycelial spread and effectively decompose it. Despite the fact, that the physiology of this fungus has been studied for more then 100 years, efficient approach for efective defense does not exist. However, the prevention and effort to keep the house enviroment dry still seems to be the best option. This thesis is a survey of a recent knowledge of S. lacrymans physiology and up-to-date technologies used in the remediation of affected buildings. key words: Serpula lacrymans, fungal physiology, rhizomorphs, remediation, wood construction, hot air, microwaves, fungicides

2

Seznam zkratek AIB BLAST BR CAZy CC CCA CFB ČSN DDT DMDHEU EcM IGS ITS MALDI TOF MS MW NCBI OBC OSB PAH PCP PCR PCSI RAPD RFLP SDS-PAGE SEM SR SSPP VOCs WR

α-aminoisobutyrová kyselina Basic Local Alignment Search Tool brown rot Carbohydrate-Active enZYmes Database chrome copper salts chrome copper arsenic salts chrome fluorine boron salts česká státní norma dichlordifenyltrichlorethan dimethylol dihydroxyethyleneurea ectomycorrhiza intergenic spacer internal transcribed spacer matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry microwaves National Center for Biotechnology Information organo boron compounds oriented strand board polycyclic aromatic hydrocarbon pentachlorphenol polymerase chain reaction photon-counting scintillation imaging Random Amplified Polymorphic DNA restriction fragment length polymorphism sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis scanning electron microscopy soft rot species-specific priming PCR volatile organic compounds white rot

3

Úvod Dřevomorka domácí (Serpula lacrymans) (Wulfen) P. Karst., je původcem hnědé hniloby (Brown rot, BR), který každoročně působí významné ekonomické ztráty po celém světě. Uvádí se, že pouze ve Velké Británii je to přes 150 milionů liber ročně (Jennings& Bravery, 1991; Rayner & Boddy, 1988). Je to v interiérech, nejčastěji se vyskytující basidiomycet ve střední Evropě (Schmidt, 2006). Důkazy o tom, že se člověk potýká s dřevokaznými houbami od pradávna je možné nalézt již v Bibli, kde se hovoří o „…zhoubném malomocenství na domě“ (Leviticus 13:47-59 a 14:33-54). Tato houba, náležící do třídy Agaricomycetes, se stala démonizovaným symbolem, který se již dávno dostal do povědomí odborné i laické veřejnosti, pro kterou představuje synonymum rozkladu, zkázy a destruktivního potenciálu hub. Za ten vděčí zejména schopnosti rychle kolonizovat substrát díky rozsáhlému myceliu a zároveň také díky silnému enzymatickému aparátu, který ji napomáhá při rozkladu polysacharidů přítomných ve dřevní hmotě. Systém depolymerizace polysacharidů je nejspíše podpořen sekundárními metabolickými drahami, které se vyvinuly u řádu Boletales, kam S. lacrymans také patří (Watkinson & Eastwood, 2012). Výzkumy z poslední doby dokazují, že její mycelium je velice dynamická struktura, která dokáže pohotově reagovat na lokální deficit živin a do místa zvýšené enzymatické činnosti potřebné látky aktivně transportovat (Fricker et al.,2008). Zatím nebylo zjištěno, jaký faktor je konkrétně zodpovědný za to, že je S. lacrymans pro lidské stavbynebezpečnější, než ostatní jí příbuzné druhy nacházející se ve volné přírodě. Vlastnost, která se nabízí, je schopnost přežít i delší dobu bez kontinuálního přísunu živin a vody.Vodu je navíc S. lacrymans schopna, společně s dalšími živinami, transportovat na velké vzdálenosti. Za tuto evoluční adaptaci vděčí místu svého původu, tedy bylinnému patru boreálních lesů (Tlalka et al., 2008a; Eastwood et al., 2011). Díky srovnávacím

genomovým

analýzám,

kombinovaným

s

"high-throughput"

transkriptomickými,

proteomickými a metabolomickými studiemi, nám byl poskytnut vhled do mechanismů přizpůsobení, které umožnily S. lacrymans úspěšně proniknout do prostředí budov (Watkinson & Eastwood, 2012). Vzhledem ke svojí neoddiskutovatelné nebezpečnosti pro dřevěné stavby je předmětem intenzivního zájmu mykologů i stavitelů již více než jedno století. Navzdory dlouhému času, úsilí i prostředkům, do výzkumu vložených, toho o její fyziologii víme překvapivě málo. V současnosti sice disponujeme přípravky a metodami, kterými se můžeme více, či méně efektivně S. lacrymans bránit, ale z ekonomického i praktického hlediska je lepší se v budovách preventivně vyvarovat vzniku podmínek vhodných pro její růst a šíření. Aplikace chemických přípravků s sebou navíc nese mnoho rizik. V případě, kdy již dojde k napadení konstrukcí, nezbývá než přikročit k sanacím, které jsou finančně daleko náročnější, než zmíněná prevence a nesou s sebou mnoho komplikací.

4

Rozšíření Za původní lokalitu, odkud se pak Serpula lacrymans začala globálně šířit (Fig. 1.), jsou považována pohoří Himaláje (Bagchee, 1954; White et al, 2001). Bagchee (1954) ve své studii popisuje nálezy v horských lesích Himalajské oblasti Kullu, v nadmořské výšce až 3 200 m. Na základě analýzy ITS oblasti rDNA, bylo prokázáno, že S.lacrymans se, v původní "wild-type" formě v přírodě vyskytuje pouze ve zmíněných Himalájích (White et al, 2001; Palfreyman et al. 2003). Na základě ITS sekvencí bylo prokázalo, že izoláty kmenů nalezených ve volné přírodě v České republice (Fig. 2.), Indii, Pákistánu a Rusku patří mezi tzv. "domestikovanou formu" Serpula lacrymans var. lacrymans (Kauserud et al., 2004a). Izoláty kmenů volně rostoucích v severní Kalifornii (Cooke, 1955) pak byly identifikovány jako Serpula lacrymans var. shastensis. Do západní Euroasie expandovala přes Beringovu úžinu, toho času spojenou se Severní Amerikou. K této události došlo před cca 14 - 3,5 miliony let (Skrede et al., 2011). Literatura uvádí, že S. lacrymans se v budovách vyskytuje ve střední, východní a severní Evropě, v Turecku, na Sibiři, v chladnějších částech Japonska, Korei, Indii, Pákistánu, Himalájích, Novém Zélandu, Austrálii, Mexiku, Chile, Kanadě a USA (Jennings & Bravery, 1991; Doi, 1991; Schmidt, 2006; Taskin, 2010). Fig. 1. Model distribuce habitatu S. lacrymans v celosvětovém měřítku, vytvořený v programu openModeller, využívající data z portálu http://data.gbif.org. Tmavě červeně vyznačené oblasti představují pro houbu obyvatelné oblasti, modře pak oblasti neobyvatelné. Tento model se dobře shoduje s lokalitami, odkud jsou potvrzeny její nálezy.

zdroj: (Engh, 2010)

5

Fig. 2. Mapa rozšíření S. lacrymans na území ČR ve volné přírodě.

zdroj: http://portal.nature.cz/nd/imgout/sitmap004961.png

Ve studii Schmidt et al., (2012) se uvádí, že mezi 36 druhy dřevokazných basidiomycetů, které byly identifikovány na území Německa v městských parcích a na stromech rostoucích v zástavbě (tedy habitatech vyskytujících se blízko lidských obydlí), nebyla Serpula lacrymans nalezena ani v jednom případě. To naznačuje, že S. lacrymans je spjata hlavně s lidskými obydlími.

Taxonomie Serpula lacrymans byla poprvé popsána již v roce 1781 Franzem Xavierem von Wulfenem jako Boletus lacrymans. V roce 1884 pak byla přeřazena do rodu Serpula Petterem Karstenem. Později byl pak druh Serpula lacrymans rozdělen na 2 variety: v interiérech se vyskytující S. lacrymans var. lacrymans a divokou formu S. lacrymans var. shastensis (Cooke, 1957 dle Engh, 2010). Kauserud et al., (2004a) popisuje, že se sesterským druhem Serpula himantioides tvoří monofyletickou skupinu. Synonyma jsou: Boletus lacrymans Wulfen (1781) Merulius destruens Pers. (1801) Merulius lacrymans (Wulfen) Schumach. (1803) Serpula destruens (Pers.) Gray (1821) Xylomyzon destruens (Pers.) Pers. (1825) Gyrophana lacrymans (Wulfen) Pat. (1900) zdroj: (MycoBank - MB#102458)

6

Čeleď Serpulaceae je podle současných informací monofyletická skupina patřící do řádu Boletales (Fig. 3.), třídy Agaricomycetes (Binder & Hibett, 2006). Řád Boletaes zahrnuje saprotrofní i ektomykorhizní druhy. Kirk et al., (2008) uvádí, že do čeledi Serpulaceae náleží 4 rody, v nichž se nachází 20 druhů hub. Fig. 3. Fylogenetický strom řádu Boletales

zdroj: www.tolweb.org. (Binder & Hibbett, 2006)

Tato čeleď pravděpodobně vznikla v období pozdní Křídy (před 94-74 miliony let) v oblasti Severní Ameriky, přesněji v borálních jehličnatých lesích, o kterých máme z této doby fosilní záznamy (Skrede et al., 2011). Ke studiu fylogeografie druhu S. lacrymans byly použity sbírkové izoláty z celého světa, u kterých bylo analyzováno 6 genů. Bylo doloženo rozdělení na dvě populace. Po vzniku Beringovy úžiny došlo k definitivnímu rozdělení druhu do 2 oddělených populací, Serpula lacrymans var. lacrymansv Asii a Serpula lacrymans var. shastensis v Severní Americe (Kauserud et al., 2007). Podle nejnovějších fylogenomických analýz se odhaduje, že řád Boletales vznikla v druhohorách, přesněji pak v období rané Křídy, přibližně před 113 miliony let. V téže době se předpokládá její asociace s dřevinami patřícími od čeledí Pinacea a Rosaceae (Watkinson &Eastwood, 2012). Změna způsobu výživy v rámci Boletales, lze zjistit pomocí fylogenetických metod. Známe případy přechodu ze saprotrofie na ektomykorhizní symbiózu (Austropaxillus v Serpulaceae), Austropaxillus je na jižní polokouli mykorhizní symbiont pabuku (Notophagus) a eukalyptu (Eucalyptus), i z ektomykorhizy (EcM) na saprotrofii (Hydnomerulius) (Martin et al., 2008). Na to poukázal výzkum EcM houby Laccaria bicolor díky podobnosti genů pro rozklad lignocelulozy u hub hnědé hniloby a EcM hub (Eastwood et al., 2011). Ke vzniku EcM, která vznikla v evoluci opakovaně, nejspíše přispěl výrazně fakt, že v průběhu evoluce, se postupně měnil charakter enzymatického aparátu některých hub díky ztrátě specifických proteinových rodin, což umožnilo těsnější interakce mezi buňkami hub a kořenů rostlin. Nemuselo tomu však tak být ve všech případech a tato problematika nadále zůstáva předmětem studia (Skrede et al., 2011; 7

Eastwood et al., 2011). V kombinované kultuře roste mycelium S. lacrymans směrem ke kořínkům Pinus sylvestris, z čehož lze usuzovat, že houba má počínající, nebo naopak zbytkovou, schopnost obousměrné nutriční interakce s buňkami rostlin (Watkinson & Eastwood, 2012). Je překvapující, že s jehličnany symbiotický rod Austropaxillus se nachází ve stejné čeledi společně s dalšíma dvěma houbami patřícími mezi nejvýznamnější původce hnědé hniloby v budovách; S. lacrymans v Evropě a Asii a S. incrassata. S. incrassata je ,analogicky se S. lacrymans v Evropě, nejběžnější původce hnědé hniloby v budovách v Severní Americe (Watkinson & Eastwood, 2012).

Morfologie Plodnice Plodnice je resupinátní, vyjímečně semiresupinátní, průměr 5-50 cm (někdy i více), plochá nebo polštářkovitá, 0,2-1 cm tlustá, bílá až nažloutlá, s typickým červenohnědým nebo hnědým hymenoforem uprostřed. V hymenoforu jsou labyrinticky nebo síťovitě uspořádané póry (tento typ hymenoforu je někdy nazýván meruloidní (Schmidt, 2006), sterilní okraj (val) je bělavý, nažloutlý nebo našedlý, 0,5-2 cm široký, na povrchu plstnatý (Fig. 4 a 5). Pokud se vytvářejí drobné odstávající kloboučky na okraji plodnice, jsou 0,52 cm tlusté a od podkladu odstávají 0,2-1 cm, na horní straně jsou žlutobílé, plstnaté, hymenofor je na spodní straně, okraj je ostrý, nepravidelný. Na povrchu plodnice je někdy možné pozorovat kapky vody s neutrálním pH, které zde vznikají díky přirozené gutaci. Díky těmto kapkám dostala Serpula své druhové jméno lacrymans, lacryma-lat. slza. Bez zajímavosti nezůstává, že plodnice jsou po tepelné úpravě konzumovatelné. Fig.4. Plodnice vyrůstající z podlahy

Fig. 5. Detail hymenoforu

zdroj: http://www.biolib.cz/

zdroj: http://upload.wikimedia.org/

Pro vyvolání fruktifikace v budovách je nutná přítomnost alespoň malého množství světla. V laboratorních podmínkách se střídání světla a tmy projevilo jako stimulující faktor (Schmidt, 2006).

8

Mycelium Mycelium je větvená síť hyf (Fig. 7.), která je vegetativní částí houby. Ze spor klíčí gracilnější homokaryotické mycelium (1n), které není schopné tvorby plodnic. Podmínkou tvorby plodnic je vznik dikaryotického mycelia (2n). U hub nenalezneme jednotný plán stavby těla složeného z autonomních buněk, jako je tomu například u živočichů, ale členitou síť hyf, kde jsou buňky navzájem propojené a umožňují transport živin a metabolitů na velké vzdálenosti. Tato vlastnost umožňuje houbě velice efektivní interakci s prostředím (Bebber et al., 2007). Životní strategie houby zahrnuje adaptace druhu pro maximální dosažení a využití substrátu a šíření z něj na další lokace. Dosažení substrátu a jeho efektivní štěpení jsou atributy, které jsou zprostředkovány právě díky myceliální síti. Základní živinou jsou sacharidy, sloužící houbě jako zdroj energie a rovněž uhlíku, nezbytného při syntéze uhlíkových koster molekul a aminokyselin, jejichž kombinací vznikají proteiny nezbytné pro růst a další fungování metabolismu. Dusík je silně limitujícím faktorem, dřevo, nebo zdivo, jsou na tento prvek velmi chudé. Obsah N ve dřevě jehličnanůje ≈0.05 % (Merill & Cowling dle Bao et al., 1992), po vysušení materiálu se může jeho koncetrace zvýšit až na ≈0,2 %. Průměrný podíl C:N je 500-600:1 (Rayner & Boddy, 1988). Z tohoto důvodu se u ancestralních druhů vyvinul sofistikovaný mechanismus recyklace N, díky němuž se s tímto omezením mohou vyrovnat (rozvedeno v kapitole "Translokace molekul"). Je společný mnoha basidiomycetům vyskytujícím se v lesním opadu (Watkinson & Eastwood, 2012). V literatuře se uvádí, že mycelium S. lacrymans je schopné přežít ve vysušené formě při 27°C po dobu 6 měsíců, při teplotě 20°C po dobu 1 roku a při 7,5°C po dobu až 8 let, v závislosti na vzdušné vlhkosti (Theden, 1972 podle Schmidt, 2007). Bylo prokázáno, že S. lacrymans je schopna přežít pouze při pomalém vysoušení substrátu (Binder & Hibbett, 2006). Spory Basidiospory S. lacrymans jsou oválného až ledvinovitého tvaru, hladké, nažloutlé až zlatavé, 9-12 × 4,5-6 µm velké (Fig. 6.). Právě díky sporám jsou houby schopny se šířit na velké vzdálenosti, v některých případech, až na vzdálenosti kontinentů (Brown & Hovmøller, 2002). Nicméně, u většiny analyzovaných druhů bylo prokázáno, že vzdálenosti mezi kontinenty jsou dostatečnou bariérou pro vznik geografického rozčlenění druhu a genetické vnitrodruhové variability (Taylor et al., 2006; Kauserud et al., 2007; Skrede et al., 2011). V případě, že nastanou pro houbu nepříznivé podmínky, jsou dikaryontní plodnice schopny uvolnit až 300 000 spor za hod/cm2 (Falck, 1912 dle Schmidt, 2007). Bylo pozorováno, že pro basidiospory S. lacrymans je letální teplota 60°C po dobu 32h, nebo 100°C po dobu 1h. Nicméně teplota 65°C po dobu 4h zredukovala klíčivost spor z 30 % na 8 % (Hegarty et al. 1987).

9

Kromě pohlavně vznikajících basidiospor je schopna vytvořit i nepohlavní spory- arthrospory, které vznikají z monokaryotického mycelia fragmentací hyf.

Fig. 6. Mikrofotografie spor

Fig. 7. Fotografie mycelia na dřevě- SEM

zdroj: autor

zdroj: fotoarchiv O. Benada- MBÚ AV ČR

Fyziologie Houby se skládají přibližně z 90 % vody a 10 % sušiny. Aby tato sušina mohla být syntetizována, musí být houba schopna zajistit asimilaci látek, které slouží jako její prekurzory. S. lacrymans, jakožto saprotrofní houba hnědé hniloby, využívá jako zdroj organického uhlíku, dusíku a energie polysacharidy obsažené v dřevní hmotě. Energii je schopná získávat díky oxidačně-redukčnímu štěpení substrátu (Schlegel, 1992 dle Schmidt, 2006). Buněčná stěna je volně průchozí pro molekuly do velikosti 10nm, může tedy jen stěží limitovat příjem vody a malých molekul. Cytoplasmatická membrána je semi-permeabilní pro vodu, nepolární a malé nenabité polární molekuly, jako je glycerol a CO2. Tyto molekuly jsou schopné samovolně difundovat v závislosti na gradientu. Velké polární molekuly a ionty se dostávají přes membránu buď prostou difuzí, nebo aktivním transportem (Rayner & Boddy, 1988). Metabolická výměna látek probíhá zejména v oblasti špiček hyf (Schmidt, 2006). Během rané fáze růstu jsou živiny v mladém myceliu v přebytku. V průběhu růstu mycelia dochází k radiálnímu šíření, kdy jsou živiny v centru mycelia utilizovány, dochází zde k hromadění metabolitů a následné recyklaci N a jeho transpotu do periferních částí mycelia (více v "Translokace molekul v myceliu"). Životní podmínky Voda je pro fungování metabolismu houby naprosto esenciální. V buňkách tvoří vodné prostředí, v němž jsou rozpuštěny živiny, probíhají reakce, udržuje turgor mycelia a její enzymy jsou rovněž aktivní ve vodném prostředí. Vodu získává houba ze substrátu (nejčastěji dřeva), z půdy nebo zdiva, zde se jedná o vodu volnou. Bylo prokázáno, že široce uznávaná "učebnicová" skutečnost, že S. lacrymans je schopna 10

získávat (tzv. metabolickou) vodu vázanou v substrátu, není pravdivá. Když je zdroj vlhkosti odstraněn, všechny dřevo-rozkladné procesy jsou zastaveny (Bravery et al., 2003). Tento omyl nejspíše vznikl na základě schopností houby transportovat vodu na velké vzdálenosti, nebo schopnosti využít vodu kondenzující na površích. Práce (Eriksson et al., 1990; Kim & Singh, 2000) poukazují na skutečnost, že pokud jsou buňky dřeva plně saturovány vodou, faktor, který se stává limitujícím je nedostatek kyslíku, jehož difuze v substrátu se v takových podmínkách komplikuje. V tomto jevu nejspíše také můžeme hledat důvod, proč jsou dřevokazné houby schopné efektivně rozkládat substrát, jen do určité míry vlhkosti dřeva (Tab. 1.). Tab. 1. Vliv relativní vlhkosti dřeva (v %) na vybrané dřevokazné houby vyskytující se v interiérech, ve smyslu jejich schopnosti kolonizovat a rozkládat substrát.

Teplotní optimum S. lacrymans je 20°C (Tab. 2.), její růst se zpomaluje při 26 - 27°C a úplně se zastavuje při 27 - 28°C, tato data se ale mohou lišit v závislosti na zkoumaném kmenu a na tom, zda se jedná o mono-, či dikaryotické mycelium (Schmidt and Moreth-Kebernik, 1990; Schmidt, 2006).

11

Tab. 2. Vliv teploty (°C) na růst mycelia vybraných dřevokazných hub vyskytujících se v interiérech.

zdroj Tab. 1 a 2.: (Huckfeldt & Schmidt 2006a) Vliv složení plynů na růst a fruktifikaci byl zkoumán méně. V minulosti byly objeveny metabolické dráhy, které souvisí s recepcí hladiny s CO2 ve vzduchu (Bahn & Mühlschlegel, 2006). V této souvislosti se uvažuje, že specifická hladina CO2 může být jedním z faktorů indukujících spuštění tvorby hymenoforu. Rozmnožování Pro houbu jsou zásadní zejména 2 okamžiky: 1) šíření na větší vzdálenosti pomocí spor a jejich následné uchycení na substrátu a 2) klíčení spor spojené s následnou kolonizací substrátu. Většina BR hub, včetně S. lacrymans, má bifaktoriální (tetrapolární) systém rozmnožování (Harmsen et al., 1958). S. lacrymans je schopna dokončit pohlavní cyklus in vitro (Schmidt & Moreth-Kebernik 1991a). Pouze dikaryontní mycelium tvoří přezky a pouze monokaryontní mycelium je schopno vytvořit arthrospory. Bylo prokázáno, že parentální dikaryotické kmeny (a F-1 dikaryonti) rostou rychleji, než od nich odvození monokaryonti (Schmidt, 2006). Harmsen et al., (1958) uvádí, že křížení S. lacrymans a S. himantoides nebylo pozorováno, z toho důvodu je lze považovat za dva odlišné druhy.

12

Rhizomorfy Encyklopedie Britannica definuje rhizomorfy jako houbovým (říše Fungi) provazcům podobné struktury, skládající se z paralelních hyf, které se větví a vyrůstají z nich tubulární filamenta. Rhizomorfy hrají důležitou roli v absorbci a translokaci látek. S. lacrymans tvoří takzvaný "nediferencovaný typ rhizomorf", což je nejjednodušší typ, který se sestává z agregovaných hyf, které mají více-méně homogenní strukturu a uspořádání s měkkou okrajovou částí (Garrett, 1944 dle Townsend, 1953). Serpula je známá pro svou schopnost rychle se šířit v dřevěných konstrukcích budov, právě díky silným rhizomorfám, které jsou schopné růst rychlostí až několik milimetrů za den. Rovněž jsou schopny prorůstat půdou, silným zdivem a dále se šířit pod omítkou (Fig. 8). Tyto struktury jsou z pohledu rychlosti šíření houby velice důležité (Townsend, 1953). Zmíněná práce také dokumentuje, že na vývoj rhizomorf má vliv poměr C:N. Rhizomorfy jsou strukturou charakteristickou pro pokročilé stádium rozkladu substrátu (Schmidt et al., 2012) Fig. 8. Rhizomorfy prorůstající podlahu domu

Fig. 9. Myceliální svazek- fotografie SEM

zdroj: http://www.timberwise.co.uk/

zdroj: fotoarchiv O. Benada - MBÚ AV ČR

Translokace molekul v myceliu Houba transportuje skrze hyfy aminokyseliny, sacharidy, minerální látky i vodu z místa získání látky do místa probíhajícího metabolismu, typicky do okrajových oblastí mycelia (Lindahl & Olsson, 2004). Serpula udržuje homeostazi uhlíku : dusíku v celé myceliální síti, tyto prvky translokuje na velké vzdálenosti, například naakumulovaný dusík do kolonizovaného dřeva, kde se účastní syntézy nových enzymů nezbytných pro degradaci nového substrátu (Fig. 10). Díky uhlíkem

14

C značené α-aminoisobutyrové

kyseliny (AIB) bylo prokázáno, že Serpula také disponuje mechanismy myceliální autolýzy a recyklace dusíku v situacích, kdy začne být dusík limitující. Současně nedostatek dusíku vyvolá rapidní dlouživý růst, radiálně ve směru od původního zdroje živin (Tlalka et al., 2008b) (Fig. 11). V substrátech bohatých na dusík je pak dlouživý růst mycelia inhibován, místo toho dochází k lokálnímu narůstu biomasy, v poměru k Ndeficientním oblastem mycelia, a produkci pigmentů sekundárním metabolismem (Schneider et al., 2008). 13

Ukládání N probíhá v mezibuněčném prostoru ve formě aminokyselin, lokálně se může jeho koncentrace zvýšit až 40–ti násobně (Venables & Watkinson, 1989). Heaton et al., (2010) se domnívá, že tok masy v myceliu je indukován díky distálnímu růstu hyf. Nicméně pozorované mechanismy selektivního transportu molekul z místa jejich získání do místa jejich využití zůstávají nadále málo prozkoumané. Translokací aminokyselin se zabývalo mnoho prací (Venables & Watkinson, 1989; Lindahl & Olsson, 2004; Watkinson et al., 2005; Tlalka et al., 2007, 2008, 2008b; Heaton et al., 2010; Fricker et al., 2008; Schneider et al., 2008). Bylo prokázáno, že rychlost transportu aminokyselin v hyfách je rychlejší než jejich samovolná difuze, což poukazuje na existenci konkrétní dráhy translokace molekul (Tlalka et al., 2007). Doi & Togashi (1989) popisují, že S. lacrymans je schopna získávat dusík z půdy v okolí staveb. 14

Fig.10. Červený bod označuje místo inokulace houby (Phanerochaete velutina) na živné medium obsahující C-AIB. 14 Translokace C-AIB byla pozorována pomocí metody "photon-counting scintillation imaging" (PCSI). Zelený bod představuje místo sekundárně introdukovaného substrátu. Předpokládá se, že u P. velutina a S. lacrymans fungují tyto mechanismy homologně (Watkinson & Eastwood, 2012).

Fig.11. Červený bod označuje místo inokulace houby (P. velutina) na živné medium.

zdroj: Fig. 10 a 11. (Tlalka et al., 2007)

Matematickými modely myceliálních sítí bylo potvrzeno, že současná podoba mycelií dřevokazných hub je uzpůsobena pro maximální konektivitu a robustnost. V průběhu evoluce tedy došlo k modifikacím, díky nimž je houba schopna efektivně kolonizovat heterogenní substráty a současně je schopna vzdorovat predaci půdními živočichy. Serpula, která se vyskytuje v interiérech, nemusí čelit takovému predačnímu tlaku, jako její blízcí příbuzní v lesních habitatech. Díky této skutečnosti může preferenčně investovat více energie do tvorby silnějších hyf, které mají vyšší translokační kapacitu a může se díky nim rychleji šířit (Bebber et al., 2007).

Rozklad dřevní hmoty Nedávné osekvenování genomu S. lacrymans (Serpula lacrymans kmen S7.9 v1.0, 18. 9. 2009, NCBI Project: 32885) a následné porovnání s geny zodpovědnými za syntézu dřevo-rozkládajících enzymů u dalších dřevokazných hub prokázalo, že Serpula disponuje unikátními mechanismy pro rozklad dřevní hmoty (Eastwood et al., 2011).

14

Struktura dřeva Z anatomického hlediska je dřevo (jádrové dřevo, nebo-li duramen) vnitřní vrstva sekundárního xylému ve starších stoncích a kořenech dřevin. Tato část xylému už není schopná ani transportu, ani ukládání rezervních látek a neobsahuje živé buňky. Má obvykle tmavší zbarvení než vnější vrstvy zvané též běl, což je vnější část sekundárního xylému, která obsahuje živé buňky a v níž probíhá transport vody (Votrubová- Základní slovník rostlinné anatomie, http://kfrserver.natur.cuni.cz). Jednotlivé složky buněčné stěny (Fig. 12.) se sestávají z polysacharidů a phenylpropanoidního polymeru ligninu. Polysacharidy mají krystalický charakter a tvoří dlouhé řetězce, které jsou uloženy do amorfního ligninu. Z technického hlediska se tedy jedná o materiál kompozitního charakteru, krystalická celuloza je uložena v amorfní matrici- ligninu (Horáček, 2001) (Fig. 13). Kromě složek buněčné stěny, primárních metabolitů a zásobních látek, obsahuje dřevo široké spektrum extrahovatelných látek, jako jsou sekundární metabolity, vosky, tuky, proteiny, mastné kyseliny, alkoholy, steroidy a pryskyřice. Látky přítomné ve dřevě, které jsou zodpovědné za jeho biorezistenci jsou, ze škrobu vznikající, terpenoidy, flavonoidy, stilbeny a taniny (Magel, 2000; Bao et al., 1992). Například pinosylvin inhibuje houby BR, flavonoidy Gloeophyllum trabeum a Trametes versicolor (Reyes-Chilpa et al. 1998; Celimene et al. 1999). Dřevo jehličnanů je obecně vůči S. lacrymans zranitelnější, než dřevo listnatých stromů. Jak již bylo zmíněno v úvodu, je tomu nejspíše z toho důvodu, ze Serpula pochází z jehličnatých lesů. Fig. 12. Schéma buněčné stěny

zdroj:http://classes.mst.edu/

Fig. 13. Schéma uložení celulozy a ligninu

zdroj: http://energy.mississippi.org/

15

Typy hniloby Obecně se (Rayner a Boddy, 1988; Eriksson et al., 1990; Schmidt, 2006; Eastwood et al., 2011; Watkinson & Eastwood, 2012) rozlišuje tyto 3 základní typy hniloby: •

brown rot (BR) - houby hnědé hniloby

•

soft rot (SR) - houby měkké hniloby

•

white rot (WR) - houby bílé hniloby

Brown rot Do této kategorie spadají převážně houby ze skupiny Basidiomycota, patří sem taktéž S. lacrymans. Další významní zástupci jsou například Fomitopsis pinicola nebo Coniophora puteana. Do BR náleží pouze 6 % dřevokazných druhů hub (Eastwood et al., 2011). Ve dřevě jejich hyfy primárně prorůstají buňkami dřeňových paprsků, odkud pak následně prorůstají skrze extracelulární matrix a kolonizují další substrát.Houby hnědé hniloby rozkládají v dřevní hmotě pouze polysacharidické složky (celulozu, hemicelulozy, pektin atd.), polysacharidové složky jsou schopné asimilovat a nemineralizují je, jako houby WR (Watkinson & Eastwood, 2012). Naopak amorfní lignin rozkládají naprosto zanedbatelně, nebo vůbec. Částečně rozložený substrát se pak velice nápadně rozpadá na drobné kostičky, které tak utváří jeho charakteristickou strukturu (Fig. 14.). Tento proces je pak možné pozorovat i na ultrastruktře dřeva (Fig. 15.). Houby hnědé hniloby mají, ve srovnání s WR, méně oxidoreduktaz, z důvodu genové duplikace u WR (Eastwood et al., 2011). Houby BR se ve většině případů vyskytují na dřevě jehličnanů (Ryvarden & Gilbertson, 1993). Hyfy hub BR se vyskytují ve dřevě velmi řídce, často se omezují na lumen buněk dřevní hmoty. I přes tento domnělý hendikep jsou schopny efektivně dřevo rozkládat, kdy je S2 vrstva buněčné stěny téměř kompletně degradována. Tento typ rozkladu nelze vysvětlit působením celuláz, které jsou příliš velké, aby difundovaly na větší vzdálenosti, nebo dokonce procházely póry v S3 vrstvě. Ve skutečnosti, mají celulázy BR hub na celulozu in vitro jen malý vliv, narozdíl od enzymů SR hub. Místo toho BR houby využívají oxidativní procesy Fentonovských systémů, který zahrnuje produkci H2O2 během degradace hemiceluloz. Tyto malé molekuly již mohou penetrovat buněčné stěny a šířit se na velké vzdálenosti. Tato strategie rozkladu dřevní hmoty je velice úsporná v rámci hospodaření s N, protože nedochází k uvolňování velkého množství extracelulárních enzymů, které N vyžadují (Schmidt, 2006). Původcem BR je také S. lacrymans, kterou někdy anglická literatura označuje za původce "true dry rot". Tento zavádějící anglický název vznikl na základěširoce rozšířené, leč chybné, domněnky, že Serpula je schopna jako zdroj vody využívat vodu metabolickou (Bravery et al., 2003).

16

Fig. 14. Rozpad dřeva na kostičky

Fig. 15. Rozklad dřeva- foto SEM

zdroj: http://images.advancedbasementsystems.net/

zdroj: http://forestpathology.cfans.umn.edu/

Soft rot Houby měkké hniloby jsou zodpovědné za rozklad celulozy, kterou jsou schopny degradovat díky enzymům ze skupiny celuláz. U ligninu odštěpují pouze jeho postranní řetězce. Lze je nalézt na dřevě ve vlhkých prostředích, jako jsou laťky plotů, sloupy, parapety či rámy oken, není to ale pravidlem. Pro houby SR je silně limitujícím prvkem N, vyžadují jeho obsah v dřevní hmotě v cca 1% koncentraci (Deacon, 2009). Pokud se jim ho nedostává z rozkládaného dřeva, jsou schopny ho získat z prostředí, typicky z půdy. Mezi zástupce z řad Ascomycota patří například rody Chaetomium, Doratomyces nebo Acremonium, z Basidiomycota je to pak pouze slizečka porcelánová (Oudemansiella mucida). SR vizuálně silně připomíná BR (Fig. 16.) Rozlišujeme na 2 typy. Typ 1 je charakteristický tvorbou rovnoběžných kavit (Fig. 17.), které vytváří v sekundární buněčné stěně dřeva, když hyfy prorůstají do lumen individuálních buněk (Deacon, 2005). Typ dva je charakterizován kompletní dekompozicí sekundárních buněčných stěn. Střední lamela není degradována, ale v pokročilejším stádiu rozkladu může docházet k její deformaci (Eriksson et al., 1990). Fig. 16. Vzor SR podbný BR

Fig. 17. Kavity ve struktuře dřeva

zdro Fig. 18. a 19.: http://forestpathology.cfans.umn.edu/

17

White rot Houby bílé hniloby jsou schopné mineralizovat všechny komponenty lignocelulozy (lignin, celulozu i hemicelulozy) až na CO2 a vodu (Eriksson et al., 1990; Watkinson & Eastwood, 2012). Jejich schopnost degradace ligninu v takovém množství je unikátní. Z tohoto důvodu jsou jejich enzymatické nástroje předmětem mnoha biotechnologických studií (Afanasyeva, 1984; Terashima, 2010; Steffen et al., 2010). Dekompozicí tmavého ligninu dává WR vyniknout světlé celuloze, jejíž vláknitý charakter je dobře patrný (Fig. 18.). Tetnto jev se nazývá "bleaching" (bělení). Je působen také činností mnoha simultánních rozkladačů, jak jsou například bakterie (Kim & Singh, 2000). Napadené dřevo je porézní a má houbovitý charakter, střední lamela rostlinných pletiv je rozložena a buňky se oddělují (Fig. 19.). WR je typem hniloby, z něhož se SR i BR v průběhu evoluce vyvinuly (Hibbett & Donoghue, 2001; Eastwood et al., 2011; Skrede et al., 2011). Houby WR preferenčně napadají dřevo listnatých stromů (Schmidt, 2006). Skupina hub způsobující WR je velice heterogenní a časová návaznost jednotlivých kroků rozkladu substrátu se může velmi lišit (Eriksson et al., 1990). Do skupiny se řadí druhy parazitické i saprotrofní. Mezi známé zástupce patří bazidiomycety Schizophyllum commune, Fomes fomentarius, Ganoderma applanatum, Trametes versicolor, nebo Armillaria spp.. Fig. 18. Charakteristický rozpad dřeva

zdroj: http://botit.botany.wisc.edu/ Enzymy

Fig. 19. Degradace střední lamely- SEM

zdroj:http://forestpathology.cfans.umn.edu/

Jak již bylo zmíněno, Serpula disponuje velice silným enzymatickým aparátem schopným efektivně štěpit celulozu a hemicelulozy. Enzymy kódované v jejím genomu, které zdědila od svých WR předků, zahrnují i lignin - oxidázy (např. peroxidázy II. třídy a lakázy) a oxidoreduktázy (glukozo-methanol-cholin oxidoreduktázy a glyoxaloxidázy). Polysacharidy ve dřevě jsou ale rozkládány glykosidhydrolázami, glykosyltransferázami, esterázami uhlovodíků a polysacharid lyázami, které konvertují celulozu, hemicelulozu a pektin na jednoduché cukry. Tyto enzymy zahrnují enzymové rodiny endo-

18

a exocellobiohydrolázy, β-glukosidázy, celobióz dehydrogenázy, xylanázy, mannanázy, endo a exoglukanázy a pektinázy (Watkinson & Eastwood, 2012). Fentonovské systémy Rozkladný proces hub hnědé hniloby zahrnuje, kromě enzymů samotných, také méně časté Fentonovské systémy. Jedná se o počáteční, ne-enzymatický, útok na buněčnou stěnu dřeva. Houba při tomto procesu extracelulárně vytváří vysoce reaktivní radikály, jejichž původ můžeme hledat ve Fentonovské reakci, jejíž rovnice je: Fe2+ + H2O2 + H+→ Fe3+ + ∙OH + H2O. Peroxid vodíku, který vstupuje do Fentonovské reakce, metabolicky vzniká díky oxidazam, jakou jsou glyoxal oxidaza, nebo Cu∙oxidázy. Vzniklý hydroxylový radikál má životnost v řádech nanosekund, jedná se ale o nejsilnější oxidativní sloučeninu, jaká vzniká v živých buňkách. Serpula produkuje fenolátové sekundární metabolity odvozené od atromentinové dráhy, která je typická pro řád Boletales.Ta má schopnost redukovat Fe3+ na Fe2+ (Schneider et al., 2008; Goodell, 2003). Mechanismus rozkladu substrátu je následující. Mycelium kolonizuje nový substrát, do kterého začne vylučovat kyselinu variegovou, následuje syntéza enzymů oxidoreduktáz, které následně dávají vzniknout hydroxylovým radikálům. Hydroxylové radikály díky své vysoké reaktivitě a nestabilní povaze,naštěpí makromolekuly celulozy na kratší řetězce. To umožní přístup enzymů do oslabené struktury celulozy a rozštěpí dostupné uhlovodíky. Celý proces je rozebrán na (Fig. 20.) (Eastwood et al., 2011, upraveno Gabriel, 2013). Fig. 20. Schéma rozkladu dřevní hmoty. Nový zdroj potravy indukuje vylučováni kyseliny variegové do substrátu a expresi oxidoreduktáz, které vyvolají tvorbu OH radikálů.

zdroj: (Eastwood et al., 2011, upraveno Gabriel, 2013)

19

Okyselování substrátu K dalším nenzymatickým mechanismům rozkladu dřevní hmoty kromě zmíněných Fentonovských systémů, patří okyselení substrátu. Některé recentní práce naznačují, že právě tento proces je zodpovědný za prvotní fáze depolymerizace polysacharidů. Serpula je schopná, díky intenzivní produkci kyseliny oxalové (Fig. 21.), okyselit rozkládaný substrát až na pH 2,4, který tak efektivně dekarboxyluje (Hastrup et al., 2012). Takto nízké pH rozkládá hemicelulozu i celulozu, tento proces zvyšuje porozitu dřeva pro hyfy (Fig. 22.), enzymy a nízkomolekulární látky tak mohou snadněji pronikat do substrátu (Shimada et al., 1991; Goodell, 2003). Fig. 21. Krystaly oxalátu v místech, kde se původně nacházely aktivně rostoucí hyfy

Fig. 22.Krystaly oxalátu v okolí otvoru vyleptaného do membrány

zdroj: (Hastrup et al., 2012)

Možnosti diagnostiky a sanace Diagnostika Diagnostikou dřevokazných hub v interiérech, se zabývá řada prací. Literatura uvádí, že jich dosud v tomto habitatu bylo popsáno více než 60 druhů (Huckfledt & Schmid, 2006). Serpulu lacrymans lze v budovách identifikovat na základě morfologicky odlišitelných vlastností a díky specifickému způsobu rozkladu substrátu, což je pro praxi a diagnostiku v terénu velice důležité (Huckfeldt & Schmidt, 2006; Schmidt, 2007). Dalším užitečným senzorickým vodítkem může být charakteristická vůně v prostorách, kde se Serpula nachází. Jednou z těkavých organických látek (VOCs), kterou vylučuje do prostředí, je houbový alkohol 1-octen-3.ol (Ewen et al.,2003), který lidem evokuje typicky hřibovitou vůni. Určování v terénu Klasických určovacích klíčů, pro použití přímo v terénu vznikla celá řada (Brawery et al., 2003; Huckfeldt & Schmidt, 2006). Další práce (Stalpres, 1978; v.Arx, 1981; Lombard & Chamuris, 1990) se pak zabývají určováním hub z agarových kultur, které ale rostou v kontrolovaném a predikovatelném prostředí,

20

které se od přirozených podmínek značně odlišuje. Z toho důvodu může být morfologie houbových struktur odlišná a nejsou proto pro využití v praxi příliš vhodné. Klíče se soustřeďují na morfologii myceliálních provazců, která jsou zde definována, jako seskupení více různých, podélně se sbíhajících hyf, které se mohou skládat ze tří hyfálních typů: vegetativních hyf, tenkých (skeletálních) hyf s tlustou buněčnou stěnou, sloužící k vyztužení a "broad vessel" hyfy sloužící k transportu vody a živin (Huckfled & Schmid, 2006). Myceliální provazce se od rhizomorf odlišují v tom, že se vytváří až za myceliálním růstovým čelem (Moore, 1998) Její mycelium rovněž vykazuje charakteristické zbarvení, které přímo odráží její fyziologický stav (Ewen et al.,2003). Mladé mycelium je bílé, v průběhu senescence pak mění barvu do hnědo-oranžové, na mechanické poškození pak reaguje v místě kontaktu rapidní změnou barvy do tmavě hnědé. Metody molekulární biologie Moderní metody molekulární biologie umožňují vhled do problematiky determinace organismu, aniž by do výsledku rozhodování vnášely subjektivní dojem pozorovatele. Jak uvádí Schmidt (2007), z tohoto důvodu se výsledky ostatních metod mohou od těch molekulárně-biologických lišit. Metody analýzy DNA bývají nejčastěji založeny na metodě "polymerase chain reaction" (PCR). Technika "Random Amplified Polymorphic DNA" (RAPD) neposkytuje konkrétní informaci o DNA sekvenci izolátu, výstup z metody jsou vizualizované PCR produkty na elektroforetickém gelu (PCR fingerprint) (Fig. 23.), který je nutno dodatečně porovnat s referenčním kmenem. Některé druhy hub však mohou vykazovat shodný patern (Schmidt, 2007). Fig. 23. RAPD vzor izolátů S. lacrymans (8 vlevo) a S. himantoides (3 vpravo), primer GGACTCCACG

zdroj: (Schmidt, 2007)

Nejvyužívanější techniky pro fylogenetické studie jsou založeny na vysoce konzervovaných úsecích rDNA, jako jsou 18S a 28S (Binder & Hibbett., 2006; Jarosch & Besl, 2001). Pro identifikaci dřevokazných hub se však nejčastěji využívají, evoluci rychle podléhající, úseky " internal transcribed spacer " (ITS) 1 a 2, pořípadě "intergenic spacer" (IGS) 1 a 2 (Schmidt et al., 2012; Coetzee et al., 2001). Úseky IGS je možné analyzovat pomocí metody " restriction fragment length polymorphism " (RFLP) (Schmidt & Moreth, 1999). Mezi nejpřesnější metody identifikace patří sekvenování ITS úseků. Získané sekvence se následně 21

porovnávají, pomocí metody "Basic Local Alignment Search Tool" (BLAST), s databázemi známých sekvencí, například databází "National Center for Biotechnology Information" NCBI. Protože jsou známy i sekvence S. lacrymans z Himálajských izolátů, lze rozlišit, zda se v případě zkoumaného vzorku jedná o "wild-type" nebo již "domestikovaný" typ (White et al., 2001). Pro praxi jednou z nejefektivnějších diagnostikých metod je "species-specific priming PCR" (SSPP), což je technika založená na PCR za použití pro určitý druh specifických primerů (Schmid & Moreth, 2000) (Fig. 24.). Mezi její největší přednosti patří rychlost, přesnost a nízká cena. Nelze ji však použít pro všechny druhy dřevokazných hub. Práce Potyralska et al., (2002) prokázala, že některé evropské druhy rodu Armillaria, mají natolik podobné ITS sekvence, a zároveň intradruhovou variabilitu, že specifické primery nelze využít. Fig. 24. Pozitivní PCR reakce za použití specifických primerů. L- S. lacrymans, H- S.himantoides, C- C. puteana, D- D. expansa, A- A. vaillanti

zdroj: (Schmidt, 2007) Mezi starší a již méně využívané metody, založené na proteinech, patří "sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" (SDS-PAGE) a lysozymová analýza. Mezi využitelné, ale již nepoužívané, patří imunologické metody, založené na protilátkách specifických pro určitý organismus. Lze je také využít pro vizualizaci distribuce enzymů dřevokazných hub v okolí hyf v dřevní hmotě (Kim et al., 1993). Ostatní metody Stejně tak, jak se liší houby v jejich genotypu, má každá svůj specifický metabolický profil, zahrnující i sekundární metabolity, z nichž některé spadají mezi VOCs. To poskytuje prostor pro využití metod hmotnostní spektrometrie. Některé specifické metody "matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry" MALDI TOF MS vyvinuté pro identifikaci bakteriálních kmenů, byly upraveny přímo pro identifikaci Serpuly lacrmynas (Schmidt & Kallow, 2005) (Fig. 25.). Literatura rovněž uvádí, že byli za tímto účelem speciálně cvičeni psi, kteří byli schopni houbu v budově lokalizovat (Watkinson & Eastwood, 2012).

22

Fig. 25. MALDI TOF hmotnostní spektrum mycelií S. lacrymans a S. himantoides. Je patrný velký rozdíl v proteinových profilech

zdroj: (Schmidt & Kallow, 2005)

Kritická místa v budovách a důvody vzniku napadení Jako dobré vodítko při posuzování eventuálního výskytu S. lacrymans v budově je přítomnost kritických faktorů tedy typicky míst, kde je vlhké zdivo v přímém kontaktu se dřevem a celý prostor jejen velmi slabě, nebo úplně nevětraný. Zkušenosti ukazují, že Serpula se ve většině případů vyskytuje v málo udržovaných a obývaných budovách typu chat a chalup, kde je pronikající vlhkost častým problémem a v kombinaci s výše zmíněnými faktory je pro šíření hub zásadní. Kritická místa jsou krovy, podlahy v přízemí a sklepní prostory. V prostorech krovu se pak jedná zejména o pozednice (pozn.: vodorovný trám, který probíhá podélně krovem - nosnou konstrukcí střechy) (Fig. 27.-1), tedy místo styku podezdívky (vlastní zděnéčásti domu) a krokví. Voda často prosakuje poškozenou střešní krytinou a stéká po krokvích (Fig. 27.-2) na pozednice, kde se vlhkost akumuluje v nasákavém zdivu. Často poškozeným místem jsou různé napojení a zlomy ve vedení střešní krytiny, ať už jsou to vikýře, nároží, nebo úbočí (Fig. 28.). U historických staveb, kde jsou zpravidla jako střešní krytina použity slaměné došky, nebo dřevěné šindele, je problém se zatékáním do krovů velice častý, protože tyto historické typy střešních krytin nejsou nikdy schopny zajistit 100% těsnost. Fig. 26. Schéma konstrukce krovu

23

zdroj: http://upload.wikimedia.org/ Fig. 27. Schéma s prvky konstrukce střechy

zdroj: http://commons.wikimedia.org/

Velký problém s sebou (paradoxně) nesou moderní technologické postupy a materiály. Konkrétně se jedná o hydroizolace, parozábrany a moderní plastová okna, která díky své absolutní neprodyšnosti vylučují přirozenou cirkulaci vzduchu v interiérech, jak tomu bývá u starších staveb. Zmíněné elementy sice, při správné realizaci, dostatečně zabraňují pronikání vnější vlhkosti, ale v kombinaci se vznikem tepelných mostů pak dochází ke kondenzaci vody na površích v interiérech. V oblasti podlah (Fig. 28.) se pak jedná zejména o špatně provedenou drenáž v obvodu základů domu, kdy není vlhkost v dostatečném množství odváděna pryč od zdí, ale vzlíná zdivem až do interiérů, do míst kde dochází k prvnímu styku zdiva s dřevem, typicky podlah.

24

Fig. 28. Napadené sklepní prostory

zdroj: http://www.strechy-fasady-izolace.cz/ Za další kritické místo, které patří v budovách mezi nejčastěji napadané, lze považovat sklepní prostory (Fig. 29.). Již z jejich podstaty lze usuzovat, že zde velice často dochází ke kombinaci výše zmíněných faktorů, které z těchto míst činí pro S. lacrymans velice příhodný habitat. Tyto prostory nacházející se pod úrovní okolního terénu, jsou přímo vystavené pronikající spodní vodě, jejíž hladina klesá a stoupá v závislosti na sezoně a úhrnu srážek. Samotná úroveň vlhkosti ve sklepích pak záleží na dalších faktorech. Kromě samotné hladiny spodní vody se jedná způsob odizolování prostor od vnějšího prostředí a naprosto zásadní faktor, frekvenci odvětrávání prostor (za předpokladu, je-li to vůbec možné). Prosakující voda následně vzlíná zdivem do přízemí, kde vzniká stejný problém, jako je popsaný v úseku o špatně provedené drenáži. Sklepní prostory jsou zpravidla využívány k uskladnění materiálu, který slouží S. lacrymans, jako substrát, díky němuž se může dále šířit v budově skrze zdi, a sekundárně napadat prostory, v již suchých částech stavby.

25

Fig. 29.Napadené sklepní prostory- vinotéka

zdroj: http://www.ovine.cz/ Vlhké zdivo a kompletní korpus dřevěných staveb představují pro serpulu ideální niku. Prostředí, které se zde nachází, je velice podobné nejnižším patrům boreálního lesa, tedy habitatu, kde se druh vyvinul (Tlalka et al., 2008a). V experimentech, při kterých byla S. lacrymans kultivována na standardizovaných dřevěných bločcíh s artificiálně přidaným Ca, byla prokázána inhibice růstu (Schilling, 2009), z čehož lze usuzovat, že zvýšená rychlost růstu mycelia v přítomnosti omítky je důsledek právě vyšší vlhkosti, udržované omítkou, než schopností houby metabolicky využít látky v omítce obsažené. Serpula lacrymans je schopná růst přes vápeno-písečnou omítku obsahující více než 1% (w/w) vody. Pokud je obsah vody v omítce nižší, rychlost růstu se sníží a dochází k vysychání mycelia. Studie na pevných a tekutých kulturách ukazují, že pro houbu je limitující vodní potenciál menší než ≈ -60 barů (Clarke et al.,1980). Pro růst je klíčová přítomnost Fe v substrátu, u příbuzného druhu S. himantoides byl prokázán jeho aktivní transport ze sádry (obsahující Fe ionty), která byla přítomná v omítce, do dřeva, kde byla pozorována zvýšená úroveň rozkladu (Schilling & Bissonnette, 2008). Normy V České republice jsou podmínky ochrany dřeva určeny ČSN normami třídy 49. Existují rovněž evropské normy EN, které vydává Evropská komise pro standardizaci a některé normy ČSN z nich vycházejí. V ČR existují jak normy upravující trvanlivost dřeva a materiálů na bázi dřeva a stanovení jejich přirozené trvanlivosti proti dřevokazným houbám, tak norma ČSN 490090 obsahující Kritéria pro horkovzdušné procesy používané k likvidaci dřevokazných škůdců. Sanace konstrukcí Jak již bylo řečeno Serpula je problém zejména starých a neudržovaných budov. Jak ukazuje praxe, tak obzvláště historické stavby a rozlehlejší komplexy budov, jako jsou zámky, kláštery, pivovary, statky nebo jiná zemědělská stavení, bývá mnohdy komplikované mít celé pod neustálou kontrolou a vzniku 26

rizikových faktorů je náročné zabránit. V takových případech pak prosakování vody do krovů, nebo nenápadná hniloba podlah, může nerušeně probíhat mnoho let. V České republice je velice běžným scénářem, kdy byla nemovitost, zpravidla z výčtu výše uvedených, navrácena po desetiletích zanedbávání svým majitelům, kteří se je rozhodli uvést do původního stavu. Výjimkou často nejsou ani budovy vysoké historické hodnoty, jejichž sanace a opravy se řídí příslušným památkovým zákonem a jejichž sanace bývá obzvlášť technicky a finančně náročná, vzhledem k požadavkům na zachování autenticity. V případech, kdy se majitelé rozhodli pro sanaci budov nedestruktivní cestou, nebo, ukládá-li jim tak zákon, je nutno přikročit k technologicky komplikovanějším postupům, než je prostá výměna napadených dřevěných komponent a zdiva, nebereme-li v potaz, že v některých případech to vzhledem ke konstrukci budov vůbec není možné. Při uvažované ochraně dřevěných konstrukcí před dřevokaznými houbami je nejprve nutné vzít v potaz, jaké podmínky houba nezbytně potřebuje pro svůj růst a jak ji v něm co nejefektivněji zabránit. Principy ochrany dřeva, případně již jeho sanace, zahrnují zamezení houbě v přístupu k vodě (vysušení, konstrukční ochrana dřeva), štěpitelnému substrátu (využití antifungálních látek, modifikace dřeva), nebo kyslíku, což není v prostředí budov prakticky proveditelné. Fyzikální metody Sanace suchým teplem Tato metoda byla původně vyvinuta v Německu a Dánsku pro boj s dřevokazným hmyzem v krovech již od 30. let 20. století. Pro likvidaci dřevokazných hub v interiérech ale musí být modifikována, protože teploty používané pro likvidaci dospělců a larev dřevokazného hmyzu, tedy minimálně 40 °C po dobu 35 minut (Makoviny et al., 2012), nejsou pro likvidaci S. lacrymans v hustém dřevě dostatečné (Hegarty & Schmitt, 1988; Huckfeldt & Schmidt 2006a). Jak již bylo zmíněno, teplotní optimum S. lacrymans je ≈20°C. Z tohoto důvodu preferuje chladnější části domů, jako jsou sklepy a jejich přízemní části, její mycelium je však schopno růstu v rozpětí teplot od 0 do 27°C. Letální teplota pro mycelium, rostoucí ve dřevě, je pak 50-70 °C působící po dobu 4 h (Huckfeldt & Schmidt 2006a). Její spory jsou pak likvidovány při 100 °C po dobu 1 h, nebo při 60°C po dobu 32h (Hegarty & Schmitt, 1988).Poměrně nízké letální teploty se tedy jeví jako dobrý faktor, na který je vhodné při sanacích napadených budov cílit. Aplikace horkého vzduchu do napadených prostor s sebou nese, kromě zvýšení teploty přítomných materiálů, také zvýšený odpar v nich obsažené volné vody. Vlhkost prostředí je jedním z nejdůležitějších faktorů, ovlivňující její schopnost se v budovách šířit, snižování vlhkosti substrátu tedy přispívá k inhibici jejího růstu. V ideálních podmínkách je schopna se šířit po dřevě, zdech, nebo izolačních materiálech rychlostí až 0,65 - 9 mm/den. Pro srovnání, rychlost radiálního růstu na agarovém mediu je ≈5 mm/den (Jennings & Bravery, 1991). Vysoká teplota, jakožto sanační opatření , nemusí být ve všech případech na 100 % účinná, protože mycelium některých druhů hub je schopno, ve formě odolných arthrospor, přežít teplotu až 95°C (Schmidt, 27

2007). Z toho důvodu je třeba klást důraz na důkladné proměřování teplotya vlhkosti v sanovaných prostorách. Jak již bylo uvedeno v kapitole "Fyziologie". Serpula tvoří arthrospory z monokaryontního mycelia, na jehož utvoření potřebuje dostatek času, proto je třeba zvyšovat teplotu prostředí co nejrychleji. Samozřejmě je ale zároveň nutné brát zřetel na charakter prostor, a materiály, z nichž je zkontruován.Před začátkem samotné sanace je nejprve nutné odstranit zdroje vlhkosti, protože bez toho kroku by samotná sanace neměla smysl a, v závislosti na stupni napadení, také dřevo v perimetru 1 m od posledních zjevných známek mycelia. Samotný proces sanace probíhá tak, že pomocí mobilního agregátu je za pomoci ventilátoru potrubím vháněn ohřátý vzduch do sanovaných prostor (Fig. 30. a 31.). V agregátu je spalován lehký topný olej, který vzduch ohřívá až na teplotu 120 °C. Důležitým aspektem je, aby horký vzduch na trámy mohl působit alespoň ze 2 stran, v opačném případě nemusí být sanace dostatečně efektivní. Měření teploty probíhá pomocí tepelných čidel, které jsou pomocí navrtaných sond vloženy do míst, kde se očekává, že se bude prvek ohřívat nejpomaleji. V případě krovů je to typicky jádro trámu, nebo nejvzdálenější místo od působícícho horkého vzduchu (viz Fig. 32 A-D). Termosanace není použitelná v místech, kde je značně omezen přístup působícího horkého vzduchu nebo v prostoru, kde jsou kombinované stavební materiály citlivé na působení vysokých teplot. Mezi nutné bezpečnostní opatření je zahrnuta regulace teploty vháněného vzduchu, které nesmí překročit 120 °C a výdechy potrubí musí být umístěny alespoň v okruhu 1 m od lehce zápalných látek (jako je papír, lepenka apod.).

28

Fig. 30. Schéma zavedení potrubí do prostoru krovu

Fig. 31. Probíhající sanace

zdroj Fig. 31. a 32.: http://www.thermosanace.eu/ Fig.32 A.

Fig.32 B.

Fig.32. C.

Fig.32. D.

zdroj: http://www.tzb-info.cz

Jak již bylo zmíněno, před použitím sanace horkým vzduchem je nutné vzít v úvahu několik aspektů. Prvním je charakter budovy, protože horký vzduch může mít negativní dopad na některé prvky, jako jsou historicky cenné malby etc. Dalším aspektem je cena, protože u historicky méně hodnotných staveb v pokročilejším stadiu napadení se tato investice nemusí vždy vyplatit. A v neposlední řadě je ekologické hledisko, při sanaci horkým vzduchem je za potřebí enormní množství energie a dochází taktéž k produkci obrovského kvanta odpadního tepla, které se uvolňuje do prostředí (Schmidt, 2006). Sanace mikrovlnným zářením Další alternativní metoda využívaná k sanaci a vysoušení prostor je ošetření mikrovlnným (MW) zářením. Experimenty prováděné v 90. letech, rovněž v Dánsku, potvrdili, že mycelium S. lacrymans je možné spolehlivě likvidovat ve dřevě i ve zdivu ozařováním po dobu 10 minut (Bech-Andersen & Andersen, 1992). Strätrling et al., (2008) za použití frekvence 2,45 GHz a výkonu 1000 W, dospěl k podobným výsledkům. Principy, kterých tato metoda využívá k likvidaci mycelia, jsou shodné, jako u sanace horkým vzduchem. K likvidaci mycelia se taktéž využívá vysokých teplot spojených s vysušení materiálu. Strätrling et al., (2008) uvádí, že metodu není možná aplikovat na senzitivní dřevěné artefakty (Strätrling et al., 2008). Oproti metodě popsané výše se však sanace MW zářenímv některých aspektech liší. Zásadním rozdílem, který je současně největším nedostatkem této metody, je nutnost vyvarovat se přítomnosti 29

kovových předmětů v ozařovaném poli (Strätrling et al., 2008). Tento druh elektromagnetického neionizujícího záření má schopnost rozkmitat polární molekuly a vodivé ionty (Kidwai, 2001). Díky těmto vlastnostem je záření schopné pronikat do hloubky materiálu, a neohřívat pouze jeho povrch, penetrace MW záření je ale také omezena. Současně ale v přítomnosti kovových předmětů v sanovaném materiálu, jako jsou hřeby, dráty, nebo potrubí, dochází k výraznému lokálnímu zvýšení teploty, které může vést až ke vzniku požárů (Strätrling et al., 2008). To se v minulosti již několikrát stalo i na území ČR, viz článek o požáru v Kladrubském klášteře (přiložen ve zdrojích). Technologický postup je takový, že do sanovaného prostoru se na kovové konzole nainstaluje baterie MW zářičů, sestávajících se ze zdroje, magnetronu a kovového trychtýře, který má za úkol usměrňovat mikrovlny do cílového prostoru (Fig. 33, 34). Mezi klady této technologie rozhodně patří kompaktnost zářičů a tím pádem jejich větší mobilita, menší energetická a finanční náročnost a možnost selektivně ozařovat pouze vybrané úseky dřeva, zdiva atd. Selektivita metody je ovšem vyvážena nemožností ji aplikovat na větší zasažené plochy, jako kompletní krovy, nebo sklepy. Mezi největší zápory pak patří již zmíněné vysoké riziko vzniku požárů v přítomnosti (často skrytých) kovových předmětů. Dalším negativem je jednak nehomogenita MW pole a za druhé nehomogenní ohřev cílové oblasti, který vychází z nehomogenity záření, materiálů samotných a rozdílného obsahu vlhkosti na průřezu materiálem. Vlhkost ozařovaného materiálu má na rychlost ohřevu značný vliv. Rychlost, jakou se materiál ohřívá, roste s vlhkostí (Strätrling et al., 2008). Další komplikaci představuje měření teploty na průřezu materiálu, protože standardní postupy se zde nedají aplikovat. Teplotní čidla jsou vyrobena z kovu. Při aplikaci této metody se z tohoto důvodu používá pouze měření povrchové teploty pomocí termokamery, které vylučuje změření teplotního gradientu. Fig. 33. Ozařování krovu

Fig. 34. Počítačová simulace umístění MW baterie

zdroj Fig. 33. a 34.: http://www.drevoastavby.cz

30

Alternativní metody Chemické metody Z méně známých a používaných metod lze uvést aplikaci kontaktních fungicidů brómethanu a ethylénoxidu, které se využívají v restaurátorství. Neposkytují ale, narozdíl od konzervačních látek, preventivní ochranu do budoucna (Unger, 2001; Schmidt, 2006). V laboratorních podmínkách pak byla testována zmiňovaná sloučenina AIB, analog aminokyseliny alaninu, která prokazatelně redukovala růst mycelia S. lacrymans (Elliott & Watkinson, 1989). Její velkou výhodou je biodegradovatelnost, rozpustnost ve vodě a fakt, že houba ho je schopna transportovat do periferních částí mycelia, kde inhibuje dlouživý růst a šíření mycelia. V současné době ale není komerčně dostupná (Watkinson & Eastwood, 2012) Fyzikální metody Sterilizace materiálů γ-zářením je běžně využívanou metodou v potravinářském průmyslu, zdravotnictví a v restaurátorství (Fernandes et al., 2012). Ač jsou dávky záření používané běžně pro sterilizaci dostatečné (podle normy ČSN 490083se používá dávka 50kGy), použití γ–zářiču in situ není možné. Pro nakládání s těmito zářiči (např. využívaný 60Co) platí zvláštní režim, který je kontrolován Státním úřadem pro jadernou bezpečnost. Ostatní využívané sterilizační metody, jako je ošetření elektronovým paprskem, nebo UV-A/B/C zářením, nelze při sanaci budov efektivně využít. Vzhledem k charakteru mycelia, které se neomezuje pouze na povrch materiálu, ale nachází se i hlouběji v něm. Preventivní ochrana staveb Preventivní ochranu staveb lze rozdělit do 2 kategorií. Jednak je to prevence pasivní (tzv. konstrukční ochrana dřeva), tedy nutnost se vyvarovat vzniku rizikových faktorů. A za druhé je to aktivní ochrana staveb, za použití antifungálních sloučenin.Vzhledem k tomu, ze Serpula lacrymans má požadavky na vlhké dřevo a velmi vysokou relativní vzdušnou vlhkost, její šíření v kvalitně provedených a udržovaných stavbách není možné. U historických, nebo hůře udržovaných staveb samozřejmě riziko vzniku ohnisek šíření dřevokazných hub prudce stoupá.Prostředí budov je možné v obzvlášť zranitelných místech monitorovat elektronickými systémy kontroly vlhkosti. Chemické metody U chemického ošetření dřeva je třeba rozlišovat mezi "preventivní ochranou dřeva" a "řízenou ochranou dřeva" po jeho napadení. Chemické prostředky je nutno použít v případě, kdy konstrukční ochrana dřeva, nebo přirozená odolnost materiálu nejsou sami o sobě schopny zajistit dlouhodobou rezistenci vůči dřevokazným houbám. Předpoklad efektivního užití chemických prostředků je, že je použit v efektivním množství a je zajištěna jeho penetrace do dostatečné hloubky v materiálu. Při aplikaci chemických látek jsou nejčastěji využívány tyto procedury: •

tlaková impregnace- tlakem až 0,8 N/mm2, tento proces zahrnuje různá schémata v závislosti na použitém chemickém prostředku, druhu dřeva atd. 31

•

dlouhodobé procedury - dřevo, nebo jeho část, je trvale ponořeno v roztoku konzervačních látek po dobu několika dní

•

krátkodobé procedury - postupy, které jsou aplikovatelné v domácích podmínkách. Jedná se o namáčení, natírání, případně nástřik. Je ošetřen pouze povrch dřeva

•

speciální procedury - nutno využít při impregnaci extrémně zatíženého dřeva v průmyslovém měřítku, jako jsou telefonní sloupy, pilíře, piloty nebo důlní výdřevy

Z výše uvedených metod se pro použití ve stavbách jako nejvhodnější jeví využití tlakové impregnace. Kovové sloučeniny Soli chrómu jsou v materiálupevně vázány (Bull, 2011). Je-li šestimocný chrom redukován na trojmocný, pak tento proces významně pomáhá stabilizovat ostatní konzervační látky ve dřevě (Bao et al.,2005b dle Schmidt, 2006). K vyluhování sloučenin mědi téměř nedochází, z toho důvodu jsou její sloučeniny vhodné i pro venkovní využití. Chrom-fluorové soli boru (CFB) jsou taktéž vhodné pro venkovní použití v prostředí, ale pouze v místech kde nedochází k neustálému kontaktu s vodou. Sloučeniny chromu a mědi (CC) jsou vhodné pro využití v interiéru i exteriéru. Je možné je využít i v prostředí, kde dochází k permanentnímu styku s půdní vlhkostí, jako jsou ploty, nebo důlní výdřevy (Narayanappa, 2005).Směsné sloučeniny chromu, mědi a arsenu (CCA) je zakázáno využívat v exteriérech, vzhledem k jeho vysoké toxicitě vůči okolnímu prostředí. Vůči sloučeninám Cu vykazuje S. lacrymans značnou rezistenci, protože kyselina oxalová, kterou vylučuje, reaguje s Cu a tvoří s ní komplexy Cu-oxalátu (Hastrup et al., 2012). Nekovové sloučeniny Soli boru na vodní bázi bez přídavku chromátu jsou využitelné pouze uvnitř budov, vzhledem k jejich vyluhovatelnosti (Obanda et al.,2008). Sloučeniny boru, kvartérní amoniové soli a karbamáty mají schopnost zabránit S. lacrymans v prorůstání skrz zdivo (Schmidt, 2006). Dehet (resp. směsi polycyklických aromatických uhlovodíků) se dlouho používal jako impregnační látka pro dřevěné konstrukce exponované vnějším podmínkám. Vesměs šlo o telegrafní sloupy a železniční pražce. Podle platné legislativy koncentrace benzpyrenu ve dřevě musely být menší než 50 ppm. Mezi nejnovější sloučeniny na poli impregnace dřeva patří takzvané WPCs (Wood plastic composites). Tyto materiály obsahují plasty jako matrici ve které jsou rozvolněny dřevěné částice a vlákna. Tento materiál se pak vyrábí lisováním, nebo vstřikováním. Výsledný materiál má lepší technické vlastnosti a je levnější než samotné dřevo. Zejména v USA se tento materiál prosazuje jako levná náhrada palubek "oriented strand board" (OSB) desek, etc. Na moření dřeva proti dřevokazným houbám a hmzu byl od roku 1935 používán pentachlorphenol (PCP), který byl schopen prodloužit životnost pražců a telegrafních sloupů ze 7 (v neupraveném stavu) na až 35 let. Tento přípravek byl zakázán v průběhu 20. století, když vyšly najevo negativní dopady, které měl na lidské zdraví a životní prostředí obecně (Prewitt et al., 2003). Z dalších sloučenin využívaných k impregnaci 32

lze uvést melaminovou pryskyřici, nebo dimethylol dihydroxyethyleneurea (DMDHEU), které po nanesení na dřevo způsobují polymerizační reakce sousedních hydroxylových skupin (eterifikační reakcí s Nmethylhydroxyskupinami)(Rapp and Müller, 2005 dle Schmidt, 2006) Chitosan, lineární kopolymer 2-amino-2-deoxy-D-glukopyranózy a 2-acetylamin-2-deoxy-Dglukopyranózy se vyrábí deacetylací chitinu. Vliv této látky na BR houby byl zkoumán v práci Lee et al., (1993). Při jejich testech (podle evropské normy EN 113) bylo prokázáno, že při dávkách 6 kg/m3 byl inhibován růst Coniophora puteana a Gloeophyllum trabeum ale Oligoporus placenta byla stimulována (Schmidt, 2006). Organo-kovové sloučeniny Kvartérní amoniové soli, například N-dimetylalkylbenzylammoniumchlorid a N,N-didecyl-N-metylpoly-(oxetyl)-ammoniumpropionát, vykazují antifungální aktivitu podobnou kvartérním solím a bisimidazolyl chloridům.Bis-decyl amonium tetrafluoroboráty zabraňují růstu hub a rozkladu dřeva houbami. Podobně byly studovány měďnaté oktanoáty a etanolaminy. Negativní dopady sloučenin na prostředí Již ze své podstaty musejí být antifungální látky toxické. To s sebou nese mnoho komplikací. Nejzásadnější je skutečnost, že člověk se většinou vyskytuje v bezprostřední blízkosti ošetřených dřevěných prvků a chemické sloučeniny v něm obsažené působí i na něj. Další problém nastává ve chvíli, kdy je například budova zbourána a z dřeva se tak stává nebezpečný odpad. V roce 1990, kdy byl v USA zakázán PCP a takto ošetřené prvky byly nahrazeny, vzniklo obrovské množství vysoce toxického odpadu čítající 36 milionu sloupů (Prewitt et al., 2003). V současné době, kdy globálně dochází ke zpřísňování norem v rámci minimalizace dopadu na životní prostředí, současně vzniká problém nový. A to s likvidací nebezpečného odpadu. V tomto ohledu je možné, paradoxně, k remediaci toxického odpadu využít dřevokazné houby. Mezi takové postupy patří například metoda takzvaného "bioleachingu", díky které se z ošetřeného dřeva dají odstranit sloučeniny Cr, Cu a As (např. CCA, nebo CC). Metodický postup je takový, že ošetřený materiál se nechá prorůst houbami rezistentními k těmto sloučeninám, jako Antrodia vaillanti, Trametes versicolor, Gleophyllum trabeum nebo Poria placenta. Tyto houby zároveň do substrátu produkují velké množství kyseliny oxalové, která s těmito kovy vytváří solubilní komplexy, které je již možné ze dřeva vymýt (Sierra-Alvarez, 2007; Milagres et al., 2002). Z dalších potenciálně využitelných metod lze uvést degradaci PAH ošetřeného dřeva WR houbami Pleurotus ostreatus a Dichomitus squalens (Covino et al., 2010). Další studie o bioremediaci některých toxických látek houbami a bakteriemi, zejména kreozotu, DDT, lindanu a PCP popisuje práce Majcherczyk & Hüttermann (1998).

33

Fyzikální metody Tepelná modifikace dřeva Tepelná modifikace dřeva je metoda, kdy se působením vysokých teplot mění chemické a fyzikální vlastnosti dřeva. Při tomto procesu se materiál nechá vysušit na 2-4% vlhkost a po té se zahřívá na 160 260°C po dobu 4 hodin, v atmosféře se sníženým obsahem kyslíku. Vlivem zvýšené teploty dochází k depolymeraci hemiceluloz a snížení počtu sorpčních míst na -OH skupinách (Kamdem, 2002). Takto ošetřené dřevo vykazuje až o 80-90 % menší tendenci absorpci vody, větší prostorovou stabilitu a biologickou rezistenci (Kekkonen et al., 2014). Jako další klady této metody lze uvést, že při ošetření dřeva vysokou teplotou dochází k rozkladu terpenů a silic, které slouží dřevokaznému hmyzu jako látky díky nímž je schopný dřevo lokalizovat. Rovněž ve dřevě vznikají další látky, které jsou pro organismy toxické (Kamdem et al., 2000). Takto upravené dřevo je často kombinováno s impregnací oleji a vosky rostlinného původu.

Závěr Znalost fyziologie S. lacrymans, ač její studium probíhá déle než jedno století, v posledních letech rapidně vzrostla díky pokroku v oblastech genomiky a zobrazovacích metod. Díky výjimečnému ekonomickému dopadu dříve proudily do výzkumu s ní spojeného, velké finanční prostředky. Vzhledem ke svému hospodářskému významu a již mnoha získaným fyziologickým poznatkům se S. lacrymans stala experimentálním modelem v odvětví výzkumu dřevokazných hub. Díky komparativní genomice byly objasněny molekulární procesy, díky kterým jsou hyfy schopny extrahovat polysacharidy z dřevní hmoty. Tyto poznatky mají potenciální aplikovatelnost nejen v oblasti boje s dřevokaznými houbami, ale mohou být také užitečné při získávání polysacharidů pro výrobu biopaliv i pochopení role hub hnědé hniloby v globálním cyklu uhlíku. Díky poznání, které věda v průběhu této doby učinila, bylo možné vyvinout mnoho antifungálních sloučenin, které se ukázaly být dostatečně efektivními. Společným problémem, který však komplikuje jejich užití v prostředí budov je jejich enormní toxicita. V tomto ohledu nezbývá, než dále pokračovat ve studiu její fyziologie a syntéze nových, přesně cílených antifungálních látek. Na poli sanace napadených budov byl od 30. let 20. století rovněž učiněn velký pokrok. Díky nedestruktivním a citlivým metodám horkovzdušné sanace, v kombinaci s nejmodernějšími metodami získávání dat v průběhu aplikace, díky tepelným sondám, měření vlhkosti, tenzometrům etc., lze zajistit efektivní průběh bez negativních dopadů na konstrukce samotné. V tomto ohledu nelze opomenout principy prevence a konstrukční ochrany staveb. Kvalitně provedená stavba, která zahrnuje provedení hydroizolace podle platných norem, která je zároveň dostatečně větraná a je tak udržována vlhkost pod kritickou hranicí, je pro S. lacrymans prakticky nekolonizovatelná. Zvláštní důraz na prevenci je pak nutno klást u historických staveb, kde je vznik rizikových faktorů mnohem pravděpodobnější.

34

Do budoucna lze rovněž uvažovat o dalším využití velkého degradačního potenciálu dřevokazných hub, který se nabízí v průmyslových odvětvích, které produkují odpady v podobě obtížně rozložitelných materiálů na bázi lignocelulózy, jako jsou rezidua zemědělské výroby, dřevozpracujícího průmyslu atd. Degradace polysacharidů, obsažených ve zbytcích dřevní hmoty, na jednodušší cukry a jejich následnou konverzí na ethanol by bylo ideální využití těchto odpadů. Zbytkový lignin by pak mohl sloužit jako surovina pro chemický průmysl.

Zdroje Tato práce byla vypracována s použitím celkem 113 referencí.

Afanasyeva M. M. (1984) Selection and Cultivatio of Lignin-decomposing Fungi. Mikologiya i Fitopatologiya 18, 210-215. Bagchee K. (1954). Merulius lacrymans (Wulf.) Fr. in India. Sydowia 8, 80–5. Bahn Y. S., Mühlschlegel F. A. (2006) CO2 sensing in fungi and beyond. Curr. Opin. Microbiol. 9, 572–578. Bao A., Cooper P. A., Ung T. (2005b) Fixation and leaching characteristics of acid copperchromate (ACC) compared to other chromium-based wood preservatives. Forest Prod J. 55, 72–75. Bao W., O'malley D. M., Sederoff R. R. (1992) Wood contains a cell-wall structural protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6604-6608. Bebber D. P., Hynes J., Darrah P. R., Boddy L., Fricker M. D. (2007) Biological solutions to transport network design. Proc. Biol. Sci. 274, 2307–2315. Bech-Andersen J., Andersen C. (1992) Theoretical and practical experimentswith eradication of the dry rot fungus by means of microwaves. IRG/WP/1577 Binder M., Hibbett D. (2006) Molecular systematics and biological diversification of Boletales. Mycologia 98, 971–981. Bravery A. F., Berry R. W., Carey J. K., Cooper D. E (2003) Recognizing Wood Rot and Insect Damage in Buldings. BRE Bookshop, Watford. Brown J.K.M, Hovmøller M. S. (2002) Aerial Dispersal of Pathogens on the Global and Continental Scales and Its Impact on Plant Disease. Science 297, 537-541. Bull D. C. (2001) The chemistry of chromated copper arsenate. II. Preservative-wood interactions.Wood Sci Technol 34, 459–466. Celimene C. C., Micales J. A., Ferge L., Young R. A. (1999) Efficacy of pinosylvins against white-rot and brown-rot fungi. Holzforsch 53, 491–497. Clarke R. W., Jennings D. H., Coggins C. R. (1980) Growth of Serpula lacrimans in relation to water potential of substrate. Transactions of the British Mycological Society 75, 271–280. Coetzee M. P. A, Wingfield B. D., Harrington T.C., Steimel J., Coutinho T. A., Wingfield M. J. (2001) The root rot fungus Armillaria mellea introduced into South Africa by early Dutch settlers. Molec Ecol 10, 387 –396. 35

Cooke W. B. (1957) The genera Serpula and Meruliporia. Mycologia, 49, 197–225. Cooke WB (1955). Fungi of Mount Shasta (1936–51). Sydowia 9, 94–215. Covino S., Svobodova K., Cvancarova M., D'Annibale A., Petruccioli M., Federici F., Kresinova Z., Galli E., Cajthaml, T. (2010) Inoculum carrier and contaminant bioavailability affect fungal degradation performances of PAH-contaminated solid matrices from a wood preservation plant. Chemosphere 79, 855-864. ČSN P CEN/TS 15083-1. 490083 (průmysl dřevozpracující)Trvanlivost dřeva a materiálů na bázi dřeva Stanovení přirozené trvanlivosti rostlého dřeva proti dřevokazným houbám, metody zkoušení - Část 1: Basidiomycetes. platnost od 1. 5. 2006 Deacon J. W. (2006) Fungal biology 4th edition. University of Edinburgh. Blackwell Pubslishing Doi S (1991) Serpula lacrymans in Japan. Wiley, Chichester, 173–187. Doi S., Togashi I. (1989) Utilization of nitrogenous substance by Serpula lacrymans. IRG/WP/1397 Eastwood D. C., Floudas D., Binder M., Majcherczyk A., Schneider P., Aerts A., Asiegbu F. O., Baker S. E., Barry K., Bendiksby M., Blumentritt M., Coutinho P. M. (2011) The plant cell wall—Decomposing machinery underlies the functional diversity of forest fungi. Science 333, 762–765. Elliott M. L., Watkinson S. (1989) The effect of α-aminoisobutyric acid on wood decay and wood spoilage fungi. Int Biodetn 25, 355–371. Engh I. B. (2010) Evolution of the dry rot fungus Serpula lacrymans and its allies Series of dissertations submitted to the Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Oslo No. 997 ISSN 1501-7710 Eriksson K. E. L., Blanchette R. A. P. (1990) Microbial and Enzymatic Degradation of Wood and Wood Components. 1st ed., ISBN 978-3-642-46687-8 Ewen R.J., Jones P. R. H., Ratcliffe N. M., Spencer-Phillips P. T. N. (2004) Identification by gas chromatography-mass spectrometry of the volatile organic compounds emitted from the woodrotting fungi Serpula lacrymans and Coniophora puteana, and from Pinus sylvestris timber. Mycol. Res. 108, 806–14. Falck R. (1912) Die Meruliusfaule des Bauholzes. Hausschwamm-forschung 6: 1-405 Fricker M. D., Lee J. A., Bebber D. P., Tlalka M., Hynes J., Darrah P. R., Watkinson S. C., Boddy L. (2008) Imaging complex nutrient dynamics in mycelial networks. J. Microsc. 231, 317–331. Gabriel, J. (2008). Dřevokazné houby v interiérech. Živa. LXI. Academia. 54–57. ISSN 0044–4812 Goodell B. (2003) Brown-rot fungal degradation of wood. Our evolving view. Am Chem Soc, Washington, DC, 97–118. Harmsen L., Bakshi B. K., Choundhury T. G. (1958) Relationship between Merulis lacrymans and M. himantoides. Nature 4614–1011. Hastrup A. C. S., Green F., Lebow P. K., Jensen B. (2012) Enzymatic oxalic acid regulation correlated with wood degradation in four brown-rot fungi. International Biodeterioration & Biodegradation75, 109 –114. Heaton L. L. M., Maini E. L. P. K., Fricker M. D., Jones N. S. (2010) Proc. R. Soc. B. 277, 3265–3274. Hegarty B, Seehann G (1987) Influence of natural temperature variation on fruitbody formation by Serpula lacrymans (Wulfen:Fr.) Schroet. Mater. Org. 22, 81–86. 36

Hegarty B., Schmitt U. (1988) Basidiospore structure and germination of Serpula lacrymans and Coniophora puteana. IRG/WP/1340 Hibbett D. S., Donoghue M. J. (2001) Analysis of character correlations among wood decay mechanisms, mating systems, and substrate ranges in homobasidiomycetes. Syst. Biol. 50, 215–242. Hibbett D., Gilbert, L. B., Donoghue, M. (2000) Evolutionary instability of ectomycorrhizal symbioses in basidiomycetes. Nature 407, 506–508. Horáček P. (2001) Fyzikální a mechanické vlastnosti dřeva, Brno, MZLU Huckfeldt T., Schmidt O. (2006) Identification key dor European strand-forming house-rot fungi. Mycologist 20, 42–56. Jarosch M., Besl H. (2001) Leucogyrophana, a polyphyletic genus of the order Boletales (Basidiomycetes). Plant Biol 3, 443–448. Jennings D. H., Bravery A. F. (1991) Serpula lacrymans: Fundamental biology and control strategies. John Wiley & Sons, Chichester- UK, ISBN0-471-93058-X Kamdem D. P., Pizzi A., Triboult M. C. (2000) Heat-treated timber: potentially toxic byproduct presenceand extent of wood cell wall degradation. Holz Roh-Werkstoff 58. 253–257. Kamdem P.(2002) Heat treatment: Can it replace preservatives? CWPA (Canadian Wood Preservation Association) Proceedings: 122-131. Kauserud H., Högberg N., Knudsen H., Elborne S. A., Schumacher, T. (2004a). Molecularphylogenetics suggest a North American link between the anthropogenic dry rot fungus Serpula lacrymans and its wild relative S. himantioides. Mol. Ecol. 13, 3137–3146. Kauserud H., Svegarden I., Saetre G. P., Knudsen H., Stensrud O., Schmidt O., Doi S., Sugiyama T., Hogberg N. (2007) Asian origin and rapid global spread of the adestructive dry rot fungus Serpula lacrymans. Mol. Ecol. 16, 3350–3360. Kekkonen P. M., Ylisassi A., Telkki V. V. (2014) Absorption of Water in Thermally Modified Pine Wood As Studied by Nuclear Magnetic Resonance. Journal of physical chemistry 118, 2146-2153. Kidwai M. (2001) Dry media reactions. Pure Appl. Chem. 73, 147–151. Kim Y. S., Goodell B., Jellison J. (1993) Immunogold labeling of extracellular metabolites from the white-rot fungus Trametes versicolor. International biodeterioration & biodegradation 75, 109-114. Kim Y. S., Singh A. P. (2000) Miccromorphological characteristics of wood biodegradation in wet enviroments. IAWA Journal 21, 135–155. Kirk P. M., Cannon P. F., Stalpers J. A. Dictionary of the Fungi, 10th Edition. CABI.26. 9. 2008. ISBN:0851998267 Lee J. S., Furukawa I., Tomoyasu S. (1993) Preservative effectiveness against Tyromyces palustris in wood after pre-treatmentwith chitosan and impregnationwith chromated copper arsenate. Mokuzai Gakkaishi 39, 103–108. Lindahl B. D., and Olsson, S. (2004) Fungal translocation–Creating and responding to environmental heterogeneity. Mycologist 18, 79–88. Lombard F. E., Chamuris G.P. (1990) Identification Manual for Fungi from Utility Poles in the Eastern United States. Allen Press, 21-104.

37

Magel E. A. (2000) Biochemistry and physiology of heartwood formation. Cell and molecular biology of wood formation. BIOS, Oxford, 363–376. Majcherczyk, A., Huttermann, A. (1998) Bioremediation of wood treated with preservatives using white-rot fungi. Forest products biotechnology.Taylor & Francis, 129–140. Makoviny I., Reinprecht L., Terebesyova M., Smira P., Souakova A., Pavlik L. (2012) Control of house longhorn beetle (Hylotrupes bajulus) larvae by microwave. Heating wood research 57, 179-188. Martin F., Aerts A., Ahren D., Brun A., Danchin, E. G. J., Duchaussoy F., Gibon J., Kohler A., Lindquist, E., Pereda V., Salamov A., Shapiro H. J. (2008).The genome of Laccaria bicolor provides insights into mycorrhizal symbiosis. Nature 452, 88–92. Merrill W., Cowling E. B. (1966) Can. J. Bot. 44, 1555-1580. Milagres A. M. R., Arantes V., Medeiros, C. L., Machuca A. (2002) Production of metal chelating compounds by white and brown-rot fungi and their comparative abilities for pulp bleaching. Enzyme and Microbial Technology 30, 562-565. Moore D. (1998) Fungal Morphogenesis. Development and cell Biology Series. Cambridge University Press Narayanappa P. (2005) A comparison of effectiveness of three waterborne preservatives against decay fungi in underground mines – an appraisal. IRG/WP/30366 Nicholas DB, Schultz TP (eds)Wood deterioration and preservation. ACS Symp Ser 845, Obanda D. N., Shupe T.F., Barnes H. M. (2008) Reducing leaching of boron-based wood preservatives A review of research. Bioresource Technology 99, 7312-7322 Palfreyman J. W., Gartland J. S., Sturrock C. J., Lester D., White N. A., Low G. A., Bech-Andersen J., Cooke D. E. (2003) The relationship between wild and building isolates of the dry rot fungus Serpula lacrymans. FEMS Microbiol Lett. 228, 281-6. Potyralska A,, Schmidt O,, Moreth U,, Lakomy P,, Siwecki R, (2002) rDNA-ITS sequence of Armillaria species and a specific primer for A. mellea. Forest Genetics 9, 119–123. Prewitt M. L., Borazjani H., Diehl S. V. (2003) Soil-enhanced microbial degradation of pentachlorophenoltreated wood. Forest Prod J 53, 44–50. Rapp A. O. (2001) Review on heat treatments of wood. Proc seminar Antibes, France,European Communities, Brussels Rayner A. D. M., Boddy L. (1988) Fungal decomposition of wood. Its biology and ecology. John Wiley & Sons Ltd., New York. Reyes-Chilpa R., Gomez-Garibay F., Moreno-Torres G., Jimenez-Estrada M., Quiroz-Vasquez R. I. (1998) Flavonoids and isoflavonoids with antifungal properties from Platymiscium yucatanum heartwood. Holzforsch 52, 459–462. Ryvarden L., Gilbertson R. L. (1993) European polypores. Part 1. Synopsis Fungorum 6, Fungiflora, Oslo Serpula lacrymans (Wulfen) P. Karst. 1884. MycoBank - MB#102458. International Mycological Association. Retrieved 29. 9. 2011 Shimada M., Akamatsu Y., Ohta A., Takahashi M. (1991) Biochemical relationships between biodegradation of cellulose and formation of oxalic acid in brown-rot wood decay.IRG/WP/1472 Schilling J. S., Bissonnette, K. M. (2008) Iron and calcium translocation from pure gypsum and ironamended gypsum by two brown rot fungi and a white rot fungus. Holzforschung 62, 752–758. 38

Schilling J. S. (2009) Effects of calcium-based materials and iron impurities on wood degradation by the brown rot fungus Serpula lacrymans. Holzforschung 64, 93–99. Schmidt O, Moreth-Kebernik U (1990) Biological and toxicant studies with the dry rot fungus Serpula lacrymans and new strains obtained by breeding. Holzforsch 44, 1–6. Schmidt O. (2006) Wood and Tree Fungi: Biology, Damage, Protection and Use. Springer, Heidelberg. Schmidt O. (2007) Indoor wood-decay basidiomycetes: Damage, causal fungi, physiology, identification and characterization, prevention and control. Mycol. Prog. 6, 261–279. Schmidt O., Gaiser O., Dujesiefken D. (2012) Molecular identification of decay fungi in the wood of urban trees. European Journal of Forest Research 131, 885-891. Schmidt O., Moreth U. (1999) Identification of the dry rot fungus, Serpula lacrymans, and the wild merulius, S. himantioides, by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). Holzforsch 53, 123–128. Schmidt O., Moreth U. (2000) Species-specific PCR primers in the rDNA-ITS region as a diagnostic tool for Serpula lacrymans. Mycol Res 104, 69–72. Schmidt O., Moreth-Kebermik U. (1991a) A simple method for producing basidiomes of Serpula lacrymans in culture. Mycol. Res. 95, 375-376. Schmidt, O., and Kallow, W. (2005) Differentiation of indoor wood decay fungi with MALDI-TOF mass spectrometry. Holzforschung 59, 374–377. Schneider P., Bouhired S., Hoffmeister D. (2008) Characterization of the atromentinbiosynthesis genes and enzymes in the homobasidiomycete Tapinella panuoides. FungalGenet. Biol. 45, 1487–1496. Sierra-Alvarez, R. (2007) Fungal bioleachnig of metals in preservative-trated wood. Process Biochemistry 42, 798-804. Skrede I., Engh I., Binder M., Carlsen T., Kauserud H., Bendiksby M. (2011) Evolutionary history of Serpulaceae (Basidiomycota): Molecular phylogeny, historical biogeography and evidence for a single transition of nutritional mode. BMC Evol. Biol. 11, 230. Steffen K. T., Hofrichter M., Hatakka A. (2000) Mineralisation of C-14-labelled synthetic lignin and ligninolytic enzyme activities of litter-decomposing basidiomycetous fungi. APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOG. 54, 819-825. Strätling, M. M. A., Unger, W., Petersen, K. (2008). Orientated investigation to kill the mycelia of the dry rot fungus Serpula lacrymans with microwaves. In. International conference on wood science for preservation of cultural heritage, Braga – Portugal, http://www.woodculther.com/wpcontent/uploads/2008/unger.pdf. Taskin, H. (2010) A new record for Turkish Mycota: Serpula lacrymans (Wulfen) J.Schröt. Biological Diversity and Conservation 3, 66-69. Taylor J.W., Turner E., Townsend J.P., Dettman J. R., Jacobson D. (2006). Eukaryotic microbes, species recognition and the geographic limitation of species: examples from the kingdom fungi. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 361, 1947-1963. Terashima, Y. (2010) Screening of Fungi Highly Degrading Conifer Wood Based on Degradability of Lignin. Mokuzai Gakkaishi 56, no. 5: 339-346. Tlalka M., Bebber D. P., Darrah P. R., Watkinson S. C., Fricker M. D. (2007) Emergence of self-organised oscillatory domains in fungal mycelia. Fungal Genetics and Biology 44, 1085–1095

39

Tlalka M., Bebber D., Darrah P. R., Watkinson, S. C. (2008a). Mycelial networks: Nutrient uptake, translocation and role in ecosystems. In ‘‘British Mycological Society Symposia Series’’. Academic Press, 43–62. Tlalka, M., Fricker, M., Watkinson, S. (2008b) Imaging of long-distance {alpha}-aminoisobutyric acid translocation dynamics during resource capture by Serpula lacrymans. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2700–2708. Townsend B. B. (1954) Morphology and development of fungal Rhizomorphs Transactions of the British Mycological Society 37, 222-233. Unger A., Schniewind A. P., UngerW. (2001) Conservation of wood artifacts. Springer, Berlin, Heidelberg, New York V klášteře Kladruby shořela část oltáře. 30. 8. 2003.http://zpravy.idnes.cz/v-klastere-kladruby-shorela-castoltare-f02-/domaci.aspx?c=A030830_112516_domaci_ton v. Arx J. A. (1981) The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture. J. Cramer, Vaduz. Venables C. E., Watkinson S. C. (1989). Medium-induced changes in patterns of free and combined amino acids in mycelium of Serpula lacrymans. Mycol. Res. 92, 273–277. Votrubová O. Základní slovník rostlinné anatomie. http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/anatomie/anatomie/index.html Watkinson S. C. (1984). Inhibition of growth and development of Serpula lacrymans by the nonmetabolised amino-acid analog alpha-aminoisobutyric-acid. FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 24, 247-250. Watkinson S. C., Boddy L., Burton K., Darrah P. R., Eastwood D., Fricker M. D., Tlalka M. (2005) New approaches to investigate the function of mycelial networks. Mycologist 19 Watkinson S.C, Eastwood D. C. (2012) Serpula lacrymans, Wood and Buildings. Advances in Applied Microbiology 78, Academic Press, 121-149. ISBN: 978-0-12-394805-2 White N. A., Dehal P. K., Duncan J. M., Williams N. A., Gartland J. S.,Palfreyman J. W., Cooke D. E. L. (2001) Molecular analysis of intraspecific variation between building and “wild” isolates of the dry rot fungus Serpula lacrymans and their relatedness to S. himantioides. Mycol Res 105, 447–452. White T. J., Bruns T., Lee S., Taylor J. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal genes for phylogenetics. PCR protocols. Academic Press, San Diego, 315–322.

40