Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta
Kateřina Řehořová
In vitro selekce pro zvýšení odolnosti řepky k suchu, mrazu a patogenům In vitro selection of rapeseed for drought, cold stress and pathogen tolerance
Bakalářská práce
Školitel: RNDr. Sylva Zelenková, CSc. Praha, 2012
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze, 23.08.2012
Kateřina Řehořová
Děkuji RNDr. Sylvě Zelenkové, CSc. za odbornou pomoc a nesmírnou trpělivost.
2
ABSTRAKT Řepka olejka (Brassica napus L.) patří mezi tři nejvýznamnější olejniny na světě. Hlavní stresové faktory, které ovlivňují její růst a produktivitu, jsou sucho, mráz a patogeny. Tkáňové kultury založené na in vitro selekci se ukázaly jako efektivní nástroj pro získání tolerantních rostlin. Tato práce pojednává o in vitro selekcích řepky pro zvýšení odolnosti k výše zmíněným stresům. V posledních letech byla diskutována hlavně role prolinu v souvislosti s navozením rezistence ke stresům. Pomocí in vitro selekcí se ale neprokázala jeho přítomnost jako určující pro mrazuvzdornost nebo toleranci k suchu. Oproti tomu exogenně přidávaná kyselina abscisová navozuje u řepky rezistenci jak mrazu tak k suchu a dále ovlivňuje koncentraci dalších látek, včetně prolinu. Prostřednictvím in vitro selekcí se přišlo i na důležitou roli brassinosteroidů během sucha, ale jejich mechanismy v průběhu stresu dosud nebyly objasněny. Během vystavení rostlin mrazu dochází ke zvýšené expresi nově identifikovaných dehydrinových genů, které prostřednictvím dehydrinových proteinů zvyšují u rostlin mrazuvzdornost. U patogenu řepky, Sclerotinia sclerotiorum,se při in vitro selekcích využívá hlavně kyseliny šťavelové jako toxinu houby, který primárně poškozuje rostlinu. Při selekci linií rezistentních k Leptosphaeria maculans se používá méně virulentní druh Leptosphaeria biglobosa, který u rostlin zaktivuje obranné mechanismy.
Klíčová slova: Brassica napus L., in vitro selekce, stres, mrazuvzdornost, sucho, Leptosphaeria maculans, Sclerotinia sclerotiorum
3
ABSTRACT Rapeseed (Brassica napus L.) is one of the three main oil-producing crops in the world. Drought, cold and pathogen are the major stresses, which adversely affect rapeseed growth and productivity. Tissue culture based in vitro selection has emerged as a feasible and cost-effective tool for developing stress-tolerant plants. This review desribes the rape in vitro selections to increase resistance to the above stresses. In recent years, the role of proline was discussed in relation to the induction of resistance to stress. Using in vitro selection, however, has not established that presence of proline as indicative of tolerance to frost or drought. In contrast, while we add abscisic acid exogenously, it can induce resistance to frost and drought, and also affect the concentration of other substances, including proline. Through in vitro selection was discovered that brassinosteroids have the important role during drought, but their mechanisms during stress have not been yet clarified. During exposure of plants to frost, overexpression of new discovered genes increase frost resistence by dehydrin proteins. For rape pathogen, Sclerotinia sclerotiorum, was mainly used oxal acid during in vitro selections as a mushroom toxin, which primarily damages the plant. In the selection of lines resistant to Leptosphaeria maculans was used less virulent type Leptosphaeria biglobosa, which activates the plant defense mechanisms.
Keywords: Brassica napus L., in vitro selection, stress, cold tolerance, drought, Leptosphaeria maculans, Sclerotinia sclerotiorum
4
SEZNAM ZKRATEK ABA = kyselina abscisová ASM = acidobenzolar-S-methyl DH = dihaploidní rostliny DHN = dehydriny EBR = 24-epibrassinolid GSLs = glukosinoláty Hyp = trans-4-hydroxy-L-prolin HypR = linie rezistentní k hydroxyprolinu ITC = isothiocyanáty LEA = Late Embryogenesis Abundant LT50 = množství substance, které je po podání určité látky smrtelnou dávkou pro daný organismus v 50 % případů MSB = menadion bisulfid sodný NADPH = Nikotinamid adenin dinukleotid fosfát OXO = oxalát oxylázy P5C = (S)-1-pyrrolin-5-karboxylát P5CDH = (S)-1-pyrrolin-5-karboxylát dehydrogenáza P5CS = (S)-1-pyrrolin-5-karboxylát syntéza PCR = (S)-1-pyrrolin-5-karboxylát reduktáza PCR = polymerázová řetězová reakce ProDH = prolin dehydrogenáza PUFAs = polynenasycené mastné kyseliny ROS = reaktivní kyslíkové radikály TTC = 2,3,5-triphenyltetratolium chlorid
5
OBSAH ÚVOD ............................................................................................................................ 7 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 8 1.
Abiotický stres ...................................................................................................... 8
1.1
Sucho ............................................................................................................................. 8
1.2
Chlad ............................................................................................................................. 9
1.3
In-vitro selekce ............................................................................................................ 10
1.4
Prolin ........................................................................................................................... 11
1.5
Kyselina abscisová ...................................................................................................... 13
1.6
Brassinosteroidy .......................................................................................................... 14
1.7
Dehydriny .................................................................................................................... 15
2.
Biotický stres ....................................................................................................... 17
2.1
Sclerotinia sclerotiorum .............................................................................................. 17
2.2
Leptosphaeria maculans ............................................................................................. 19
ZÁVĚR ........................................................................................................................ 21 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...................................................................... 22
6
ÚVOD Řepka olejka (Brassica napus L.) (n=19) je druh rostliny vyšlechtěný mezidruhovým křížením mezi Brassica oleracea (n=9) a Brassica rapa (n=10). Je pravděpodobné, že ke křížení mohlo dojít současně na více místech a mezi různými formami B. oleracea a B. rapa. Brassica napus je po celém světě pěstována jako olejnina ve dvou podobách – jarní a ozimá řepka, a je hospodářsky nejvíce obdělávaným druhem z rodu Brassica. Dnes je, spolu se sójou a palmovým olejem, řepka pěstována na 25 milionech ha po celém světě. Většina produkce pochází z Číny, Kanady, Indie, Evropské Unie a Austrálie. V této práci se zabývám shrnutím poznatků o in vitro selekcích řepky pro získání odolnosti k abiotickým a biotickým stresům.
7
LITERÁRNÍ PŘEHLED 1. Abiotický stres Do skupiny abiotických stresů řadíme chlad, mráz, vysoké teploty, vysokou salinitu, sucho, zaplavení, vysokou radiaci, chemikálie a jedy, oxidativní stres a vítr. (Mahajan et al. 2005)
1.1
Sucho Řepka je citlivá na vlivy okolí a zejména sucho během období kvetení je jedním
z hlavních faktorů, který snižuje výnosnost. Vývoj nových odrůd tolerantních k suchu je důležitý pro celý řepkový i olejový průmysl. Průlom v této oblasti by zvýšil výnos a umožnil by rozšířit pěstování řepky do sušších oblastí, tím tak pokrýt rostoucí poptávku. (Wan et al. 2009) Sucho zapříčiňuje u rostlin zmenšení velikosti listů a stonku a ovlivňuje i kořenový systém. Nejprve dojde k uzavření průduchů a díky poklesu přísunu CO2 se sníží i rychlost fotosyntézy. Dále klesá aktivita enzymů, které fixují CO2 a adenosintrifosfát. (Zhu 2002, Farooq 2009) Vodní deficit ovlivňuje strukturu membrán. Semipermeabilní membrána se stává vysoce porézní a proteiny kotvené v lipidové dvouvrstvě mění svou polohu, což vede ke ztrátě membránové integrity. Dále dochází k denaturaci nebo ke snížení aktivity některých proteinů v cytosolu a v organelách. Celková zvýšená koncentrace buněčných elektrolytů vlivem dehydratace protoplasmy výrazně negativně ovlivňuje buněčný metabolismus. (Mahajan a Tuteja. 2005) Vzhledem k tomu, že rostlina je sesilní organismus, který nemůže stresoru utéct, vynakládá značné úsilí na aktivaci obranných mechanismů. Rostlina se snaží zamezit ztrátám vody zavřením průduchů, zvyšuje absorpci vody kořenovým systémem a tvoří menší dužnaté listy. Při osmotickém stresu se v buňce akumulují kompatibilní soluty. Jejich primární funkcí je udržet buněčný turgor v buňce a tím tak ovlivňovat absorpci vody. Mezi tyto látky patří aminokyseliny (např. prolin), kvartérní aminy (např. glycin betain) a cukry (např. mannitol). (Wang et al. 2003; Zhu 2002; Bohnert a Shen, 1999)
8
1.2 Chlad Řepka je olejnina, která se pěstuje hlavně v mírném pásu. Charakteristické znaky těchto oblastí se ale stávají limitujícími faktory pro výnosnost řepky. V našich podmínkách ji ovlivňují hlavně brzké přízemní mrazíky, které způsobují deformaci stonků a poškození květů v květenstvích. V západní Kanadě se počet dnů bez mrazu omezuje na pouhých 100-130 dní v roce a to má vliv na kvalitu semene. Mráz snižuje aktivitu enzymů, která brání degradaci chlorofylu během maturace. Chlorofyl obsažený v semenech znehodnocuje kvalitu řepkového oleje (McClinchey a Kott, 2007). V Kanadě se pouze 35% semen může zařadit do nejvyšší jakosti právě díky nevhodným zeleným semenům. Přirozeným faktorem zvyšujícím odolnost řepky vůči mrazu je aklimace, během které dochází k syntéze kryoprotektantů (rozpustné cukry, alkoholy cukrů, nízkomolekulární nitrogenní sloučeniny, dehydriny, chladem regulované proteiny, heat-shock proteiny) Kryoprotektanty pomáhají stabilizovat membránu a další mechanismy v buňce. Bohužel, v případě jarních nebo podzimních mrazíků se rostlina nestačí aklimatizovat a způsobená škoda je tak větší. (Hlincha 2002; Wang et al. 2003, Bajguz a Hayat, 2009) Jakmile teplota klesne pod 0°C, začnou se obvykle v mezibuněčných prostorech rostlin tvořit ledové krystaly. Extracelulární led se tvoří mnohem dříve než led intracelulární, protože uvnitř buněk je osmoticky aktivní prostředí, které snižuje bod tuhnutí. Extracelulární zmrznutí je stav vratný, ale během intracelulárního, vlivem většího objemu ledu, dochází k popraskání buněk a tento jev bývá nevratný. K většímu poškození buněk ale dochází vlivem dehydratace, která během nízkých teplot nastává díky tomu, že led má nižší chemický potenciál než voda a tudíž během extracelulárnímu tuhnutí buňka pumpuje vodu ven. (Thomashow 1998) Důsledkem těchto změn může být vadnutí listů, chlorózy nebo i nekrózy. (Mahajan a Tuteja, 2005)
9
1.3 In-vitro selekce Technika selekce in vitro umožňuje použít látky nebo podmínky, které následně selektují pouze určité fenotypy dle výběru a to v mnohem kratším čase než v prostředí in vivo. Používají se dvě metody in vitro: A) Postupná, dlouhodobá metoda, ve které jsou kultury vystaveny zvyšujícím se koncentracím selekčního agens B) Šoková terapie, kdy jsou kultury nárazově vystaveny vysoké koncentraci agens a pouze ty, které tuto hladinu tolerují, jsou schopné dále přežít. Obě tyto metody jsou založené na indukci genetické variability v kultivaci a regeneraci rostlin, tzv. somaklonální variaci, která může vést k řadě pozitivních změn důležitých při šlechtění rostlin. V případě řepky by nás měla zajímat zvláště druhá možnost, která neumožňuje rostlině čas na aklimaci jako je to v případě jarních nebo podzimních mrazíků. Při in vitro selekcích rezistentních rostlin vůči patogenu se používá buď kultivace buněčných suspenzí a kalusových kultur a regenerace rezistentních rostlin na médiích se selekčními fytotoxiny nebo aplikace čistého toxinu z patogenní kultury do média.In vitro selekce se používají hlavně u hospodářsky významných rostlin, jako jsou obilniny, tabák, ovocné stromy nebo například brambory. (Jain 2001; Rai et al. 2011) .
10
1.4 Prolin Mezi nejrozšířenější kompatibilní soluty patří aminokyselina prolin. Díky své amfipatické povaze je při dehydrataci schopen zadržovat vodu v buňkách, stabilizovat membránu a cytoplazmatické proteiny. Prolin také snižuje kyselost cytoplasmy a dokáže rozkládat ROS. Po odeznění stresu se prolin stává zdrojem uhlíku, dusíku, energie a redukujících ekvivalentů, které snadněji obnovují fyziologické funkce v buňce. Prolin je syntetizovaný z glutamátu (obr. 1) přes (S)-1-pyrrolin-5-karboxylát (P5C). P5C syntáza (P5CS) katalyzuje přeměnu glutamátu na P5C, následuje reakce P5C reduktázy (P5CR), která redukuje P5C na prolin. Při opačném metabolismu prolinu je prolin zpátky rozložen na glutamát přes P5C pomocí prolin dehydrogenázy (ProDH) a P5C dehydrogenázy (P5CDH).(Wang et al. 2003)
Obrázek 1: Biosyntéza prolinu v rostlinách (Stein et al. 2011) McClinchey a Kott (2008) se zabývají produkcí nových linií řepky odolnějších k chladu. Mutagenezí pomocí UV záření vytvořili linie, které následně selektovali in vitro pomocí třech prolinových analogů: hydroxyprolinu, azetidin-2-karboxylátu a 3,4-dehydro-D,L-prolin. Vybrání 4 mutanti s prokazatelnou mrazuvzdorností byli porovnáni se svými rodiči ve mrazovém testu. U třech mutantů byla hodnota prolinu v listech vyšší než u jejich rodičů. Mutant, který nedosahoval pozitivních výsledků, pravděpodobně používal jiné signální dráhy, které nevyžadují zvýšenou hladinu prolinu. Existují dvě možnosti, jak si rostliny udrží vysokou hladinu prolinu během stresu. První možností je odstranění zpětnovazebné inhibice P5C syntézy, enzymu, který limituje rychlost syntézy prolinu. 11
Vybraní azetidin-2-karboxylát mutanti, kteří by měli tuto zpětnovazebnou inhibici odstraňovat, neprokázali větší mrazuvzdornost oproti svým kontrolám. Druhou možností je snížení metabolismu prolinu, které způsobí jeho hromadění v buňkách. K této hypotéze byli vybráni 3,4-dehydro-D,L-prolin mutanti, kteří v testu vykazují signifikantní toleranci k chladu a to i po dvě zimy v běžné praxi na poli. Jánská et al. (2010) využili pro in vitro selekci trans-4-hydroxy-L-prolin (Hyp). Nepoužili jako v předešlé studii mutagenní linie, ale využili přirozené variability F1 potomstva linií dihaploidních rostlin (DH) řepky ozimé rezistentních k hydroxyprolinu (HypR). Dvě HypR DH linie ukázaly signifikantně vyšší obsah prolinu v listech oproti kontrolním rostlinám a vyšší tolerance k mrazu byla prokázána pouze u jedné DH linie. Výsledky experimentu tedy ukazují slabou signifikantní korelaci mezi tolerancí k mrazu a obsahem prolinu v listech. K opačným závěrům došli Klíma et al. (2012), kteří neprokázali korelaci mezi obsahem prolinu v rostlině a mrazuvzdorností. Nicméně se opírají o Fuller et al. (2006), kteří zjistili, že u květáku obsah prolinu sice není esenciální pro navození rezistence, nicméně jeho vyšší hladina v rostlinách mrazuvzdornost zvyšuje. Obsah prolinu závisí i na počtu dní, během kterých je rostlina aklimatizována. Burbulis et al. (2008) prokázali, že po třídenní aklimatizaci obsahují rostliny 3 krát více prolinu než neaklimatizované rostliny. Obecně lze z těchto experimentů vyvodit, že akumulace prolinu se zvyšuje s délkou vystavení mrazu, ale nedá se říci, že by vyšší obsah prolinu zvyšoval životaschopnost rostlin. Některé práce naznačují, že akumulace prolinu by mohla být významná i během sucha, nejen při reakci na chlad (Lahrer 1998) a jeho metabolické dráhy během tohoto stresu by mohly být ovlivněné kyselinou abscisovou (ABA). (Dallmier 1992). Trotel-Aziz et al. (2000) zkoumají, jaké změny v obsahu prolinu a kyseliny abscisové vyvolá osmoticky různé prostředí. Jako rostlinný materiál používají 8 milimetrové listové disky, které inkubují na médiích různé osmolality a za různých světelných podmínek. Do médií byly přidány různé koncentrace inhibitorů fotosyntézy, ABA, Pro a NADPH. Dokázalo se, že ABA má vliv na mobilizaci prolinu během stresu, ale jen za těchto dalších podmínek: Například za světla způsobila ABA sníženou mobilizaci prolinu pravděpodobně díky použití inhibitorů fotosyntézy, protože za tmy ke stejnému výsledku nedošlo. Ke snížení obsahu prolinu došlo také při současném aplikování ABA+NADPH a ABA+Pro. Trotel-Aziz et al. (2003) dále prokázali, že zvýšený obsah Pro způsobuje downregulaci genu pro dehydrogenázu a zároveň upregulaci genu pro pyrrolin-5-karboxylát syntézu a to díky 12
exogenně přidané ABA. Zároveň ale dodává, že dodání ABA není určujícím prostředkem pro úpravu exprese těchto genů. Akumulace prolinu nemusí být závislá jenom na ABA, ale mohou ji ovlivnit i jiné produkty. Huguet-Robert et al. (2002) se proto zabývají polynenasycenými mastnými kyselinami (PUFAs) a methyl jasmonátem jako možnými regulátory osmoindukce prolinu. Jakmile listové disky vystavili osmotickému prostředí -1,5 MPa, akumulace prolinu značně stoupla. Po přidání PUFAs do stresového média hodnota prolinu během 5 -8 hodin významně klesla. Methyl jasmonát měl podobný účinek jako PUFAs a navíc se prokázal jako antagonista ABA. Souhrnně by se tedy dalo říct, že externě dodávané mastné kyseliny a oxylipiny mohou snižovat akumulaci prolinu během osmotického stresu. Otázkou stále ale je, jestli prolin opravdu plní významnou funkci při dehydrataci nebo jestli metoda listových disků, kdy dochází k poškození tkáně, zkresluje naměřené výsledky. Gibon et al. (2000) tak brali v potaz jak obsah prolinu, viabilitu tkáně, tak intenzitu aplikovaného stresu. Jako biochemický marker použili 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorid (TTC), který se využívá při biochemické zkoušce životaschopnosti (TTC test). (De Ronde a Van Der Mescht, 1997) Listové disky byly vystaveny osmotickému stresu v rozmezí -0,1 až 8 MPa. Při postupném zvyšování vodního deficitu v tkáních docházelo k poklesu obsahu chlorofylu a k silné kumulaci prolinu. Maxima prolinu bylo dosaženo při -3,0 MPa. Tkáň prokazovala životaschopnost i v nižších hodnotách, což dokazuje, že prolin není zodpovědný za primární rezistenci. (Gibon et al. 2000)
1.5 Kyselina abscisová Kyselina abscisová je důležitý stresový fytohormon, který hraje roli jednak při zrání a klíčení semen, tak i při adaptaci na různé abiotické stresy prostředí. Přítomnost ABA způsobuje dormanci semen, potažmo zpomalení klíčení, při reakci na stres je důležitá hlavně při osmotických stresech. ABA dokáže měnit koncentraci iontů v buňkách a tím stimulovat uzavírání průduchů.(Leung et al. 1998) ABA je obecně hormon, který inhibuje růst rostliny a připravuje ji spíše na dormanci a nepříznivé podmínky. Tyto účinky mohou být ale různé u rostlin, které byly dříve vystavené osmotickému stresu a u rostliny pěstovaných za běžných podmínek. Prokázalo se, že přidání
13
exogenní ABA zpomaluje růst semenáčků, avšak rostliny, které byly dříve vystaveny suchu, jsou méně citlivé na působení ABA než rostliny s běžnou zálivkou. (Sangtarash et al. 2009) Na začátku devadesátých let se objevují studie, které objasňují vztah mezi kyselinou abscisovou a tolerancí k chladu a mrazu u řepky. Tolerance byla studována zkoumáním vlivu mefluididu, fluridonu a ABA na mrazovzdornost a endogenní hodnoty ABA. Fluridon byl zvolen jako inhibitor syntézy ABA a mefluidid jako její stimulátor. Suspenzní buněčné kultury byly kultivovány po dobu 6 dnů při teplotě 25°C s přidaným mefuididem nebo ABA. Kultura ošetřená mefluididem dosáhla při testu mrazem LT50 -17,5°C, při ošetření ABA pak LT50 -18°C. Pro srovnání, kultury pěstované na médiu se sacharózou vykazovaly LT50 -10°C. Tato data dokazují, že ABA zvyšuje toleranci k mrazu a mefluidid, jako její stimulátor může být také použit pro indukci větší mrazuvzdornosti. Z dalších dat je také patrné, že fluridon může zvrátit účinky meflufididu, snižuje koncentraci ABA a jeho přidáním do média se snižuje mrazuvzdornost. (Johnson-Flanagan et al. 1990) Johnson-Flanagan (1992) dále sledoval vliv ABA nejen na mírný mráz, ale i na dehydrataci semen. Sledoval i expresi LEA76 a isocitrát lyázy a to, zda mírné zmrazování a rozmrazování semen urychluje vývojové fáze. Mírný mráz a následné zvyšování teploty způsobilo ztrátu vlhkosti, zvýšení ABA a snížení exprese LEA76 a transkriptů isocitrát lyázy. Následné přidání ABA k haploidním embryům zvýšilo toleranci k suchu, hladina LEA76 byla nízká a bez transkriptů isocitrát lyázy. Naopak embrya, která nebyla ošetřená ABA, vykazovala slabou toleranci k mrazu navzdory tomu, že mRNA LEA76 byla přítomna ve velkém množství. Tolerance k vysušení zřejmě koreluje s expresí LEA76, ale není na této expresi přímo závislá, zatímco hladina ABA určuje úroveň tolerance.
1.6 Brassinosteroidy Brassinosteroidy jsou přirozeně vyskytující se rostlinné regulátory, které mají podobnou povahu jako živočišné steroidní hormony. Pokud jsou brassinosteroidy exogenně dodány v nízkých dávkách rostlině, způsobují elonganci a lepší proliferaci buněk a ovlivňují mnoho dalších fyziologických procesů buňky. (Clouse 1996) Kromě toho, že brassinosteroidy mají zásadní význam ve vývoji rostlin, postupem času bylo zjištěno, že by mohly rostlinu chránit i během nepříznivých vlivů prostředí. Kagale et al. (2006) pěstovail Brassica napus L. a Arabidopsis thaliana L. v prostředí s
14
24-epibrassinolidem (EBR) a následně je vystavili dehydrataci. Rostliny ošetřené EBR prokazovaly mnohem větší viabilitu než rostliny neošetřené. Po 48 hodinách, kdy byly rostliny vystaveny suchu, přežilo 60% EBR ošetřených rostlin B. napus a pouze 6% kontrolních sazenic. Všechny neošetřené sazenice zahynuly po 52 hodinách, zatímco EBR ošetřené rostliny přežily 60 hodin. Podobných výsledků dosahovala Arabidopsis thaliana L. Tyto výsledky dokazují, že EBR, potažmo brassinosteroidy, zvyšují toleranci k suchu. I když mnohé brassinosteroidy, včetně 24-epibrassinolidu, jsou komerčně dostupné, chybí studie, které by upřesnily režim aplikace a jejich použití v kombinaci s dalšími fytohormony. (Zullo a Adam, 2002)
1.7 Dehydriny Největší skupinou ochranných proteinů indukovaných stresem spojeným s dehydratací pletiv jsou proteiny skupiny LEA (Late Embryogenesis Abundant). Mezi tyto geny patří i dehydriny (Dhn), jejichž exprese u rostlin probíhá primárně v době dozrávání semen a sekundárně jako adaptační mechanismus na nedostatek vody v buňkách.(Close 1996; Kosová et al. 2007) Všechny LEA proteiny se vyznačují vysokým obsahem glycinu, hydrofilními vlastnostmi a malou sekundární strukturou. (Garay-Arroyo et al. 2000) V průběhu dehydratace hrají LEA proteiny významnou roli hlavně při udržování struktury dalších proteinů, váčků a endoplasmatických struktur. Fungují jako molekulární chaperony a ovlivňují vodní režim v buňce. (Close 1996) Yao et al. (2004) identifikoval u Brassica juncea L. a Brassica napus L. dehydrinové geny BjDHN1 a BnDHN1 pomocí klonování cDNA sekvencí. Při vystavení rostlin nízkým teplotám zaznamenal expresi těchto genů u klíčících semen, která tak projevovala vyšší schopnost mrazuvzdornosti při tvoření semenáčů. Geny byly exprimovány také v pozdních stádiích vývoji šešule, u ní by exprese mohla být na rozdíl od semen spojena s vodním deficitem. Exprese v listech, časných stádiích šešule a v suchých semenech nebyla detekována. Dále byl rozpoznán dehydrinový gen Bndhn ERD10, jehož exprese je indukovaná chladem, dehydratací nebo ABA. Exprese se signifikantně zvyšuje po 8 hodinách od vystavení rostlin stresu a to až 48 hodin od počátku expozice. V tomto případě byla zaznamenána největší exprese dehydrinového genu v listech. (Deng et al. 2004)
15
Klíma et al. (2012) určili další dehydrinový gen řepky a také sledovali expresi genu při působení nízkých teplot. Na rozdíl od předchozích autorů, nechali rostliny v chladných podmínkách po dobu jednoho měsíce, aby rostliny měly čas na aklimatizaci. Prokázali korelaci mezi expresí dehydrinového genu v listech a mrazuvzdorností.
16
2. Biotický stres
2.1 Sclerotinia sclerotiorum Jeden z nejvýznamnějších patogenů řepky olejky, slunečnice a sóji je Sclerotinia sclerotiorum. Tato vřeckovýtrusná houba způsobuje hnilobu řepky, která například v Číně vedla k patnácti procentním ztrátám výnosu. Fungicidy proti této chorobě jsou sice známé, ale často neúčinné. Parazit je na ně citlivý pouze v krátkém období během kvetení rostliny, a pokud jsou pro patogeny příznivé podmínky, šíří se tak rychle, že fungicid nestačí ani působit. (Liu et al. 2005) S. sclerotiorum je pro rostlinu toxická v prvotním kontaktu díky produkci kyseliny šťavelové. (Cessna et al. 1993) Kyselinu šťavelovou produkuje z několika důvodů, za prvé kvůli snížení pH ve svém okolí, při kterém lépe pracují enzymy na destrukci hostitelské tkáně. Za druhé, kyselina šťavelová (potažmo oxalát) může být pro rostlinu toxická, protože akumuluje osmoticky aktivní látky rostliny, které vyvolávají otevření průduchů. Zároveň inhibuje ABA, která by za normálních podmínek indukovala zavírání průduchů. (Guimara a Stotz, 2004) Dále se předpokládá, že oxalát odstraňuje vápenaté ionty, které jsou vázány na povrchu pektinů hostitelských buněk, a tím hostitelské buňky narušuje. (Bateman and Beer,1965; cit. dle Guimara a Stotz, 2004) Po napadení tkáně dochází ke změnám propustnosti membrány a díky tomu může dojít k úniku materiálu z buňky ven i naopak, a to samozřejmě usnadňuje proliferaci patogenu v hostitelské tkáni. (Willetts et al. 1980) Listy nakažených rostlin jsou obvykle infikovány askosporami patogenu. Houba se dál rychle šíří přes řapík až do stonku rostliny. Patogen se projevuje formou léze, která se obvykle vyvine v nekrotickou tkáň, ta začne vytvářet bílé mycelium se sklerocii, což bývá nejpatrnějším příznakem onemocnění S. sclerotiorum. (Bolton et al. 2006) Prvním způsobem, jak získat rezistentní linie odolné k Sclerotinia sclerotiorum, je selektovat takové odrůdy, které budou rezistentní k jejímu toxinu – kyselině šťavelové. Mutace vybraných linií byla indukována ethylmethan sulfonátem nebo byla navozena spontánně. Rostliny byly podrobeny rutinnímu screeningu nebo dvěma kolům screeningu testovacího. Koncentrace selektující agens, v tomto případě kyseliny šťavelové, v prvním 17
testu screeningu byla stanovena experimentem jako dávka, která je pro polovinu populace kalusu letální. Průměrná koncentrace se pohybovala okolo 3mmol/l. V druhém screeningovém testu byla zvolena koncentrace ještě vyšší, ale obecně lze říci, že čím větší rozdíly byly mezi koncentracemi kyseliny šťavelové během jednotlivých cyklů screeningu, tím byla úmrtnost kalusu větší. Již při určování koncentrace kyseliny šťavelové v prvním screening testu byla prokázaná negativní korelace kyseliny šťavelové a přežití kalusu. Linie, které prokázaly odolnost vůči kyselině šťavelové, byly podrobeny umělé inokulaci myceliem S. sclerotiorum. U dvou vybraných linií byly léze signifikantně menší než u kontrolních rostlin. Vybrané rezistentní linie by měly splňovat i agronomická kritéria. V porovnání s kontrolními populacemi vyšly rezistentní linie jako velmi kvalitní, dosahující dřívější maturace, mající větší květenství a počet semen, a samotný výnos semen mnohem vyšší než u donorových linií. (Liu et al. 2005) Druhým způsobem, díky kterému může být řepka odolnější vůči svému patogenu, je rozklad jeho toxických látek. Oxalát oxylázy (OXO) mohou oxidovat kyselinu šťavelovou na oxid uhličitý a peroxid vodíku. Zvýšení produkce OXO v liniích řepky by zvýšilo jejich toleranci vůči S. sclerotiorum. Dong et al. (2008) zvolil dva kultivary B. napus, jeden s běžnou odolností k S. sclerotiorum a druhý s prokazatelnou rezistencí, který použil jako kontrolu. Následně provedl transformaci vektorem pBOXO pomocí Agrobacterium tumefaciens, southernblot analýzy a PCR za vzniku 5 homozygotních transgenních linií. Tři z těchto linií prokázaly signifikantní rezistenci vůči Sclerotinia sclerotiorum a to kvůli rozkladu ke šťavelové kyselině. Díky tomu, že odolné transgenní linie mohou rozkládat kyselinu šťavelovou, chrání tak své tkáně před degradací a acidifikací. Důkaz, že použité rostliny skutečně rozkládají kys. šťavelovou byl proveden měřením pH při exogenním přidávání kys. šťavelové. Zvýšení efektivnosti metabolismu kyseliny šťavelové je jasným postupem k získání rezistentních linií k Sclerotinia sclerotiorum. (Dong et al. 2008) Kyselina šťavelová může mít různý dopad jak na hostitelskou tkáň tak na proteom nebo na signální a oxidační dráhy. Liang et al. (2009) podrobili rostliny řepky exogennímu působení kyseliny šťavelové a následně pomocí 2D gelové elektroforézy a hmotnostní spektrometrie zkoumali výsledné proteiny. Celkem bylo identifikováno 37 proteinů, které se nějakým způsobem podílí na odpovědi při působení kyseliny šťavelové. Třináct z těchto proteinů bylo up-regulováno a 24 down-regulováno. Identifikované proteiny patřily do systému signálních drah, fotosyntézy, redox homeostázy atd. Dále bylo prokázáno, že kyselina jasmonová, etylén a kyselina abscisová mají v pozdějších časových intervalech
18
kladný vliv na metabolismus kyseliny šťavelové, zatímco dráhy kyseliny salicylové nepřispívají k odolnosti vůči patogenům. Řepka a její příbuzné druhy z čeledi Brassicaceae produkují sekundární produkty, glukosinoláty (GSLs). GSLs jsou hydrolyzovány enzymem myrozinázou, který se uvolňuje po narušení buněčné integrity například patogenem. (Osbourn 1996) Produkty této reakce, zejména isothiocyanáty (ITC), mají celou řadu vlastností. Působí fungicidně, jako insekticid a antibiotikum, mají fytotoxické účinky. Jsou známy také toxické účinky ITC na S. sclerotiorum in vitro. (Morra a Kirkegaard, 2002) Schopnost S. sclerotiorum infikovat Brassica napus a její příbuzné druhy navzdory přítomnosti glukosinolát-myrozinázové dráze experimentálně ověřovali Rahmanpour et al. (2009). Vystavili mycelia S. sclerotiorum již předem inokulovaným listovým diskům B. napus, B. nigra a Sinapsis alba. Exponovaná mycelia byla inhibována až z 87%, ale i přesto houba pokračovala v růstu infikovanou tkání. Mycelia podrobil opakované expozici a to hydratovaným hořčičným práškem s obsahem GSLs a myrozinázy nebo syntetickým ITC. Po expozici bylo inhibováno téměř 80% mycelií, ale po několika dnech se houba zregenerovala. Tento fakt naznačuje, že S. sclerotiorum je schopná překonat toxicitu GSLs-myrozinázového komplexu, potažmo se po několika dnech dokáže přizpůsobit přítomnosti ITC. Dále byly v experimentu identifikovány tři geny označené jako glutation S-transferáza geny (GST geny), které jsou pravděpodobně zodpovědné za detoxikaci ITC. Vzhledem k tomu, že S. sclerotiorum má schopnost adaptace na ITC, není řešením přímá inhibice pomocí ITC. Pozornost by se měla zaměřit na GST geny a možnost jejich downregulace.
2.2 Leptosphaeria maculans Fómová hniloba řepky způsobená houbovým patogenem Leptosphaeria maculans (někdy uváděn pod anamorfou Phoma lingam) je velmi významné onemocnění ovlivňující rostliny již na podzim. Leptosphaeria maculans je rozšířena v různých podnebných pásech, infikuje různé kultivary i oblasti s naprosto odlišnými agronomickými technologiemi ať už v Austrálii, Kanadě nebo Evropě. (West et al. 2001) Hlavními zdroji nákazy Leptosphaeria maculans jsou askospory, které na podzim způsobují léze na listech, s prvními mrazíky počet napadených listů klesne a začíná stoupat až
19
na jaře. Po zimě, zejména v období květu, se infekce rozšíří z listů na celou rostlinu, patrné jsou léze hlavně na stoncích. (Gladders a Musa, 1980) Leptosphaeria maculans je velmi variabilní, nicméně tento druh byl rozdělen do dvou skupin, vysoce virulentní a slabě virulentní. Vzhledem k rozšíření patogenu se pro stejné rozdělení používá více názvů – virulentní a avirulentní, agresivní a neagresivní, Tox1 a Tox0, skupina a a skupina b. Obě skupiny mohou infikovat hostitele a mají velmi podobné spory, liší se ale v působení na rostlinu. (Cunningham, 1927; cit. dle West et al. 2001) Později byl pro méně infekční skupinu vyskytující se zejména v Číně a v Evropě použit nový název Leptosphaeria biglobosa, který se používá dodnes. (Shoamaker et al. 2001) K vytvožení rezistence řepky vůči Leptosphaeria maculans se používá ošetření askosporami druhu Leptoshaeria biglobosa „brassicae― nebo aktivátory chemické obrany – acibenzolar-S-methylem (ASM) a menadion bisulfidem sodným (MSB). Liu et al. (2006) ošetřili linie řepky uvedenými látkami a dále nechal rostliny exponovat patogenem Leptosphaeria maculans. Po 36 hodinách se na kontrolních rostlinách objevily drobné léze, ale na rostlinách, které byly ošetřeny, se žádné příznaky nákazy neobjevily. Nejdelší inkubační doba Leptoshaeria maculans byla zaznamenána u rostlin ošetřených ASM. Při delším pozorování se u předem ošetřených rostlin objevilo mnohem méně lézí než u rostlin kontrolních a jejich velikost byla také signifikantně menší. Chen (2006) také ošetřuje rostliny méně virulentním druhem Leptosphaeria biglobosa a to buď před nebo současně s působením L. maculans, a dochází k podobným výsledkům. Rostliny předem ošetřené Leptosphaeria biglobosa zvyšují enzymovou aktivitu, dokáží oddálit nástup infekce a díky nastartovaným obranným mechanismům je u nich průběh nemoci daleko mírnější. Ošetření rostlin řepky pomocí Leptosphaeria biglobosa, ASM nebo MSB by mohlo vést ke snížení výskytu a závažnosti onemocnění způsobeného Leptoshaeria maculans.
20
ZÁVĚR V práci jsem shrnula poznatky o in vitro selekcích linií řepky rezistentních k abiotickým a biotickým stresům. Koncentrace prolinu v rostlinách většinou stoupá s nízkými teplotami i během sucha, ale nemůžeme říci, že vyvinutá schopnost rezistence by přímo závisela na obsahu prolinu. Potvrdilo se, že syntéza prolinu může být pozitivně ovlivněna kyselinou abscisovou, a negativně ovlivněna oxylipiny a PUFAs. Kyselina abscisová nejen, že prokázala vliv na koncentraci prolinu, ale i velký význam při abiotickém stresu. Kyselina abscisová signifikantně zvyšuje mrazuvzdornost rostlin a toleranci k suchu. Dehydriny jsou obvykle známé jako proteiny syntetizované během adaptace na sucho. Jakmile ale vystavíme rostlinu nízkým teplotám, trpí buňky i dehydratací, během které můžou být dehydriny účinnou obranou. Díky identifikaci dehydrinových genů se prokázala významná funkce dehydrinů jakožto účinných stresových proteinů, které jsou aktivované během nízkých teplot. V případě brassinosteroidů se prokázalo, že zvyšují odolnost k suchu, ale přesný mechanismus doposud není znám. U Sclerotinia sclerotiorum se ukázala jako efektivní cesta získat linie, které jsou rezistentní ke kyselině šťavelové, umí ji rozložit nebo dokáží využít GSLs potažmo ITC ke zničení parazita. Při boji proti Leptosphaeria maculans vyšlo jako účinné ošetřit rostliny nejprve méně virulentním druhem Leptosphaeria biglobosa a tím tak nastartovat rostlině obranné mechanismy. In vitro selekce v posledních letech významně zrychlily průběh získávání odolnějších linií rostlin, ale tato metoda má i své nevýhody, které by se neměly opomínat. Při použití in vitro selekce může docházet ke ztrátě regenerační schopnosti rostlin nebo k epigenetickým změnám. Rostliny jsou komplexním systémem a v některých případech je nezbytné studovat je jako celek, nikoli používat jenom části orgánů k vývoji nových odrůd. Nezřídka se potom může stát, že v laboratorních podmínkách jsou linie rezistentní, ale v běžných polních podmínkách, kde působí mnoho faktorů najednou, už takových výsledků nedosahují.
21
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Bajguz, A., Hayat, S. (2009). Effects of brassinosteroids on the plant responses to environmental stresses. Plant Physiology and Biochemistry, 47(1), 1–8. Bateman and Beer, 1965; cit. dle Stotz, H. U., & Guimara, R. L. (2004). Oxalate production by Sclerotinia sclerotiorum deregulates guard cells during infection. Plant Physiology, 136(11), 3703–3711. Bohnert, H., Shen, B. (1998). Transformation and compatible solutes. Scientia Horticulturae, 78(1-4), 237–260. Bolton, M. (2006). Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary: biology and molecular traits of a cosmopolitan pathogen. Molecular Plant Pathology, 7(1), 1–16. Cessna, S. G., Sears, V. E., Dickman, M. B., & Low, P. S. (2000). Oxalic acid, a pathogenicity factor for Sclerotinia sclerotiorum, suppresses the oxidative burst of the host plant. The Plant cell, 12(11), 2191–200. Chen, Y., Fernando, W. (2006). Induced resistance to blackleg (Leptosphaeria maculans) disease of canola (Brassica napus) caused by a weakly virulent isolate of Leptosphaeria biglobosa. Plant disease, 90(8), 1059–1064. Close, T. J. (1996). Dehydrins: Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins. Physiologia Plantarum, 97(4), 795–803. Clouse, S. D. (1996). Molecular genetic studies confirm the role of brassinosteroids in plant growth and development. The Plant journal, 10(1), 1–8. Cunningham, 1927; cit. dle West, J., & Kharbanda, P. (2001). Epidemiology and management of Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) on oilseed rape in Australia, Canada and Europe. Plant Pathology, 50, 10–27. Dallmier, K. a, Stewart, C. R. (1992). Effect of Exogenous Abscisic Acid on Proline Dehydrogenase Activity in Maize (Zea mays L.). Plant Physiology, 99(2), 762–4. Deng, Z., Pang, Y., Kong, W., Chen, Z., Wang, X., Liu, X., Pi, Y., et al. (2005). A novel ABA-dependent dehydrin ERD10 gene from Brassica napus. DNA sequence, 16(1), 28– 35. Dong, X., Ji, R., Guo, X., Foster, S. J., Chen, H., Dong, C., Liu, Y., et al. (2008). Expressing a gene encoding wheat oxalate oxidase enhances resistance to Sclerotinia sclerotiorum in oilseed rape (Brassica napus). Planta, 228(2), 331–40. Farooq, M., Wahid, A., & Kobayashi, N. (2009). Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agronomy fot sustainable development, 29(1), 185–212.
22
Fuller, M. P., Metwali, E. M. R., Eed, M. H., & Jellings, a. J. (2006). Evaluation of Abiotic Stress Resistance in Mutated Populations of Cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 86(2), 239–248. Garay-Arroyo, A., Colmenero-Flores, J. M., Garciarrubio, A., & Covarrubias, A. (2000). Highly hydrophilic proteins in prokaryotes and eukaryotes are common during conditions of water deficit. The Journal of Biological Chemistry, 275(8), 5668–74. Gibon, Y., Sulpice, R., & Larher, F. (2000). Proline accumulation in canola leaf discs subjected to osmotic stress is related to the loss of chlorophylls and to the decrease of mitochondrial activity. Physiologia Plantarum, 110(4), 469–476. Gladders, P., Musa, T. M. (1980). Observations on the epidemiology of Leptosphaeria macutans stem canker in winter oilseed rape. Plant Pathology, 29(1), 28–37. Hincha, D. K. (2002). Cryoprotectin: a plant lipid-transfer protein homologue that stabilizes membranes during freezing. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences, 357(1423), 909–16. Huguet-Robert, V., Sulpice, R., Lefort, C., Maerskalck, V., Emery, N., & Larher, F. R. (2003). The suppression of osmoinduced proline response of Brassica napus L. var oleifera leaf discs by polyunsaturated fatty acids and methyl-jasmonate. Plant Science, 164(1), 119–127. Jain, S. (2001). Tissue culture-derived variation in crop improvement. Euphytica, (1981), 153–166. Jánská, a, Marsík, P., Zelenková, S., & Ovesná, J. (2010). Cold stress and acclimation - what is important for metabolic adjustment? Plant biology, 12(3), 395–405. Jánská, A., Zelenková, S., Klíma, M., Vyvadilová, M., & Prášil, I. T. (2010). Freezing tolerance and proline content of in vitro selected hydroxyproline resistant winter oilseed rape. Czech journal of genetics and plant breeding, 46(1), 35–40. Johnson-Flanagan, a M., Huiwen, Z., Geng, X. M., Brown, D. C., Nykiforuk, C. L., & Singh, J. (1992). Frost, Abscisic Acid, and Desiccation Hasten Embryo Development in Brassica napus. Plant Physiology, 99(2), 700–6. Johnson-Flanagan, A. et al. (1991). Role of abscisic acid in the induction of freezing tolerance in Brassica napus suspension-cultured cells. Plant Physiology, 95(4), 1044–1048. Kagale, S., Divi, U. K., Krochko, J. E., Keller, W. a, & Krishna, P. (2007). Brassinosteroid confers tolerance in Arabidopsis thaliana and Brassica napus to a range of abiotic stresses. Planta, 225(2), 353–364. Klíma, M., Vítámvás, P., Zelenková, S., Vyvadilová, M., & Prášil, I. T. (2012). Dehydrin and proline content in Brassica napus and B . carinata under cold stress at two irradiances. Biologia Plantarum, 56(1), 1–5.
23
Larher, F., Aziz, A., Deleu, C., Lemesle, P., Ghaffar, A., Bouchard, F., & Plasman, M. (1998). Suppression of the osmoinduced proline response of rapeseed leaf discs by polyamines. Physiologia Plantarum, 102(1), 139–147. Leung, J., Giraudat, J. (1998). Abscisic Acid Signal Transduction. Annual review of plant physiology and plant molecular biology, 49, 199–222. Liang, Y., Strelkov, S. E., & Kav, N. N. V. (2009). Oxalic acid-mediated stress responses in Brassica napus L. Proteomics, 9(11), 3156–3173. Liu, S., Wang, H., Zhang, J., Fitt, B. D. L., Xu, Z., Evans, N., Liu, Y., et al. (2005). In vitro mutation and selection of doubled-haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant cell reports, 24(3), 133–44. Liu, S. Y., Liu, Z., Fitt, B. D. L., Evans, N., Foster, S. J., Huang, Y. J., Latunde-Dada, a. O., et al. (2006). Resistance to Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) in Brassica napus (oilseed rape) induced by L. biglobosa and chemical defence activators in field and controlled environments. Plant Pathology, 55(3), 401–412. Mahajan, S., Tuteja, N. (2005). Cold, salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysics, 444(2), 139–58. McClinchey, S. L., & Kott, L. S. (2007). Production of mutants with high cold tolerance in spring canola (Brassica napus). Euphytica, 162(1), 51–67. Morra, M, Kirkegaard, J.(2002). Isothiocyanate release from soil-incorporated Brassica tissues. Soil Biology and Biochemistry, 34(11), 1683–1690. Osbourn, A. (1996). Preformed antimicrobial compounds and plant defense against fungal attack. The Plant cell, 8(10), 1821–1831. Rahmanpour, S., Backhouse, D., & Nonhebel, H. M. (2009). Induced tolerance of Sclerotinia sclerotiorum to isothiocyanates and toxic volatiles from Brassica species. Plant Pathology, 58(3), 479–486. Rai, M. K., Kalia, R. K., Singh, R., Gangola, M. P., & Dhawan, A. K. (2011). Developing stress tolerant plants through in vitro selection—An overview of the recent progress. Environmental and Experimental Botany, 71(1), 89–98. Rai, M. K., Shekhawat, N. S., Gupta, A. K., Phulwaria, M., Ram, K., & Jaiswal, U. (2011). The role of abscisic acid in plant tissue culture: a review of recent progress. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 106(2), 179–190. Ronde, J. D., Mescht, A. V. der. (1997). 2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloride reduction as a measure of drought tolerance and heat tolerance in cotton. South African journal of science, 93(10), 431–433. Sangtarash, M. H., Qaderi, M. M., Chinnappa, C. C., & Reid, D. M. (2009). Differential sensitivity of canola (Brassica napus) seedlings to ultraviolet-B radiation, water stress and abscisic acid. Environmental and Experimental Botany, 66(2), 212–219. 24
Shoemaker, R. a., Brun, H. (2001). The teleomorph of the weakly aggressive segregate of Leptosphaeria maculans. Canadian Journal of Botany, 79(4), 412–419. Stein, H., Honig, A., Miller, G., Erster, O., Eilenberg, H., Csonka, L. N., Szabados, L., et al. (2011). Elevation of free proline and proline-rich protein levels by simultaneous manipulations of proline biosynthesis and degradation in plants. Plant, 181(2), 140–50. Stotz, H. U., Guimara, R. L. (2004). Oxalate production by Sclerotinia sclerotiorum deregulates guard cells during infection. Plant Physiology, 136(11), 3703–3711. Thomashow, M. (1998). Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance. Plant Physiology, 118(1), 1–7. Trotel-Aziz, P., Niogret, M.-F., Deleu, C., Bouchereau, A., Aziz, A., & Larher, F. R. (2003). The control of proline consumption by abscisic acid during osmotic stress recovery of canola leaf discs. Physiologia Plantarum, 117(2), 213–221. Trotel-Aziz, P., Niogret, M.-F., & Larher, F. (2000). Proline level is partly under the control of abscisic acid in canola leaf discs during recovery from hyper-osmotic stress. Physiologia Plantarum, 110(3), 376–383. Wan, J., Griffiths, R., Ying, J., McCourt, P., & Huang, Y. (2009). Development of DroughtTolerant Canola ( L.) through Genetic Modulation of ABA-mediated Stomatal Responses. Crop Science, 49(5), 1539–1554. Wang, W., Vinocur, B., & Altman, A. (2003). Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta, 218(1), 1–14. West, J., Kharbanda, P. (2001). Epidemiology and management of Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) on oilseed rape in Australia, Canada and Europe. Plant Pathology, 50, 10–27. Willetts, H, Wong, J. (1980). The biology of Sclerotinia sclerotiorum, S. trifoliorum, and S. minor with emphasis on specific nomenclature. sc The Botanical Review, 46(2), 101– 165. Yao, K., Lockhart, K. M., & Kalanack, J. J. (2005). Cloning of dehydrin coding sequences from Brassica juncea and Brassica napus and their low temperature-inducible expression in germinating seeds. Plant Physiology and Biochemistry, 43(1), 83–89. Zhu, J.-K. (2002). Salt and drought stress signal transduction in plants. Annual review of plant biology, 53, 247–273. Zullo, M., Adam, G. (2002). Brassinosteroid phytohormones -structure, bioactivity and applications. Brazilian Journal of Plant Physiology, 14(3), 143–181.
25
