Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Speciální chemicko-biologické obory Studijní obor: Molekulární biologie a biochemie organismů

Martina Procházková

Úloha cholesterol-7α-hydroxylázy v regulaci cholesterolémie The role of cholesterol 7α-hydroxylase in cholesterolemia regulation

Bakalářská práce

Školitel: RNDr. Jan Kovář, CSc.

Praha, 2013

1

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze, 15.5.2013

Podpis

2

Poděkování Ráda bych poděkovala svému školiteli RNDr. Janu Kovářovi, CSc. za ochotu, trpělivost a cenné rady, které mi pomohly při vypracování této práce.

3

ABSTRAKT Cholesterol-7α-hydroxyláza (CYP7A1) je enzym katalyzující první krok přeměny cholesterolu na žlučové kyseliny. Aktivita enzymu je zpětnovazebně regulována tak, aby byla zajištěna produkce žlučových kyselin potřebných pro vstřebávání tuků. U některých živočišných druhů přispívá k eliminaci cholesterolu při jeho nadměrném přívodu dietou a brání tak rozvoji hypercholesterolémie. Aktivitu CYP7A1 lze terapeuticky ovlivnit podáváním sekvestrantů žlučových kyselin, které aktivitu enzymu zvyšují a přispívají k poklesu cholesterolémie, a také podáváním žlučových kyselin. Deficit enzymu je u člověka spojen s rozvojem hypercholesterolémie. V genu kódujícím CYP7A1

u člověka byla

identifikována řada jednonukleotidových polymorfismů, tvořících tři velké haplotypové bloky. Největší pozornost byla věnována polymorfismu v pozici -203A>C, který ovlivňuje koncentraci cholesterolu, respektive lipoproteinů v séru, odpověď cholesterolémie na změnu diety a také odpověď na terapii hypercholesterolémie.

Klíčová slova: Dieta, genetika, cholesterol, cholesterol-7α-hydroxyláza, léčba hypercholesterolémie, žlučové kyseliny

4

ABSTRACT Cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) is an enzyme catalyzing the first step of conversion of cholesterol to bile acids. The enzyme activity is regulated to supply enough bile salts necessary for absorption of fats in the intestine. In some species it contributes to cholesterol elimination from the body when dietary cholesterol intake is high and, in such a way, protects against the development of hypercholesterolemia. CYP7A1 activity can be therapeutically affected by administration of bile acid sequestrants that increase the enzyme activity and thus lower cholesterolemia, and also by administration of bile salts. The enzyme deficiency in humans results in hypercholesterolemia. Several

single nucleotide

polymorphisms were identified in gene encoding CYP7A1 in humans. They form three large haplotype blocks. The most attention has been paid to the -203A>C polymorphism that has an impact on cholesterol and lipoprotein concentrations, on the response of cholesterolemia to dietary intervention and on the response to hypolipidemic drugs.

Key words: Bile acids, cholesterol, cholesterol 7α-hydroxylase, diet, genetics, treatment of hypercholesterolemia

5

OBSAH 1 Úvod ........................................................................................................................................ 2 2 Cholesterol - jeho struktura, funkce, metabolismus a transport .............................................. 3 3 Cholesterol a ateroskleróza ..................................................................................................... 6 4 Žlučové kyseliny - struktura, funkce, syntéza a regulace ....................................................... 7 5 Cholesterol-7α-hydroxyláza .................................................................................................. 10 5.1 Měření aktivity cholesterol-7α-hydroxylázy .................................................................. 10 5.2 Regulace promotorové aktivity CYP7A1 ....................................................................... 11 5.3 Diurnální rytmicita ......................................................................................................... 12 5.4 Nesynonymní mutace v CYP7A1 ................................................................................... 12 5.5 Deficit cholesterol-7α-hydroxylázy u lidí ...................................................................... 13 5.6 Deficit cholesterol-7α-hydroxylázy u myší .................................................................... 13 5.7 Projevy zvýšené exprese cholesterol-7α-hydroxylázy ................................................... 14 5.8 Vliv dietního cholesterolu na CYP7A1 .......................................................................... 15 5.8.1 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u potkana .................................................... 15 5.8.2 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u křečka ...................................................... 15 5.8.3 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u kočkodana ................................................ 16 5.8.4 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u myši ......................................................... 16 5.8.5 Vliv dietního cholesterolu na CYP7A1 u transgenní myši ..................................... 16 5.8.6 Vliv dietního cholesterolu na CYP7A1 u člověka .................................................. 17 5.9 Vliv léků na aktivitu CYP7A1 ....................................................................................... 17 5.9.1 Sekvestranty žlučových kyselin .............................................................................. 17 5.9.2 Statiny...................................................................................................................... 18 5.9.3 Žlučové kyseliny ..................................................................................................... 18 5.10 Polymorfismus CYP7A1 u člověka ............................................................................. 19 5.10.1 Oblasti ve vazbě a haplotypy genu CYP7A1 ......................................................... 19 5.10.2 Polymorfismy CYP7A1 a jejich vztahy k hladině lipidů a lipoproteinů v plazmě 21 5.10.3 Polymorfismus -203A>C v CYP7A1 u člověka a jeho odpověď na dietu ........... 23 5.10.4 Vliv polymorfismu CYP7A1 na léčbu hypercholesterolémie ............................... 24 6 Závěr...................................................................................................................................... 25 7 Seznam zkratek ..................................................................................................................... 26 8 Přehled použité literatury ...................................................................................................... 28

1

1 Úvod Kardiovaskulární onemocnění patří celosvětově mezi jedny z nejčastějších příčin úmrtí. Jsou klinickým důsledkem aterosklerózy, onemocnění postihujícího tepenné řečiště. Rozvoj aterosklerózy je urychlován řadou rizikových faktorů, přičemž zvýšená hladina celkového a LDL cholesterolu v séru patří k nejdůležitějším z nich. Nadbytečného cholesterolu se tělo přirozeně zbavuje v játrech a to buď přímo vyloučením do žluči nebo po jeho konverzi na žlučové kyseliny a jejich následným vyloučením. V tomto procesu hraje velmi významnou úlohu cholesterol-7α-hydroxyláza (CYP7A1), klíčový enzym katalyzující přeměnu cholesterolu na 7α-hydroxycholesterol. Spojitost mezi hladinou cholesterolu v séru a aktivitou CYP7A1 není doposud jednoznačně charakterizována. Cílem této práce bylo shrnout současné poznatky o vztahu mezi aktivitou cholesterol-7α-hydroxylázy a koncentrací cholesterolu u člověka i modelových organismů.

Pozornost měla být soustředěna především na vztah mezi variabilitou genu

kódujícího CYP7A1 u člověka a regulací hladiny cholesterolémie v odpověd na dietní a lékovou intervenci.

2

2 Cholesterol - jeho struktura, funkce, metabolismus a transport Cholesterol je amfipatická molekula nerozpustná ve vodě obsahující steroidní jádro s navázanou hydroxylovou skupinou na 3. uhlíku, jednu dvojnou vazbu a osmiuhlíkatý postranní řetězec (Obrázek 1).

Obrázek 1: Struktura cholesterolu.

Cholesterol má v organismu několik důležitých funkcí (Grundy 1978, Grundy 1990, Ledvina 2009). Je nezastupitelnou komponentou biologických membrán a sérových lipoproteinů, syntetizují se z něho žlučové kyseliny, adrenální steroidy a pohlavní hormony. Cholesterol je v určitém množství pro tělo nezbytný. Část cholesterolu je přijímána ze stravy, část se vyrábí v těle v různých tkáních, především v játrech. Syntéza cholesterolu vždy začíná kondenzací 3 molekul acetátu, přes 3-hydroxy-3-methylglutaryl koenzym A, který je následně přeměněn na mevalonát pomocí HMG-CoA reduktázy. Tato reakce je limitujícím krokem biosyntézy cholesterolu. Aktivita tohoto enzymu je zpětnovazebně regulována hladinou cholesterolu v buňce. Cholesterol syntetizovaný v játrech může vstoupit do séra, být v nezměněné podobě vyloučen do žluče nebo přeměněn na žlučové kyseliny. Protože je ve vodě nerozpustný, musí být v plazmě přenášen v molekulových komplexech – lipoproteinech. Jádro lipoproteinů je tvořeno nepolárními lipidy (triacylglyceroly a estery cholesterolu), obal je tvořen polárními molekulami (apolipoproteiny, neesterifikovaný cholesterol a fosfolipidy). Podle denzity nebo elektroforetické mobility rozlišujeme několik typů lipoproteinů (Tabulka 1).

3

Frakce

Zdroj

Průměr (nm)

Relativn í hustota

Složení Protein (%)

Celkový lipid (%)

Procenta celkového lipidu Triacylglycerol Fosfolipid

Apolipoprotein

Chylomikrony

Střevo

90 - 1000

<0,95

1-2

98 - 99

88

8

Ester cholesterolu 3

VLDL

30 - 90

90 - 93

56

20

15

8

11

89

29

26

34

9

LDL

VLDL

20 - 25

21

79

13

28

48

10

HDL

Játra, střevo, VLDL, chylomikrony

10 - 20

0,95 1,006 1,006 1,019 1,019 1,063 1,063 1,125

7 - 10

IDL

Játra (střevo) VLDL

33

67

16

43

31

10

25 - 30

Cholesterol (volný) 1

A-I, A-II, A-IV; B-48; C-I, C-II, CIII; E B-100; C-I, C-II, C-III; E B-100; C-I, C-II, C-III; E B-100 A-I, A-II, A-IV; C-I, C-II, C-III; E

Tabulka 1. Přehled hlavních tříd lipoproteinů (upraveno podle Grundy 1990, Murray 2002).

4

Chylomikrony mají nejmenší hustotu a jsou bohaté na triacylglyceroly. Jsou syntetizovány střevem, odkud přenáší triacylglyceroly do tkání (hlavně svalové a tukové) a cholesterol do jater. Lipoproteinová lipáza lokalizovaná na luminálním povrchu kapilárního endotelu odštěpuje z triacyglycerolů chylomikronů mastné kyseliny, které jsou vychytávány příslušnou tkání. Tímto způsobem z chylomikronů vznikají chylomikronové zbytky („remnants“), které jsou degradovány v játrech (Obrázek 2).

Obrázek 2. Metabolismus chylomikronů (upraveno podle Ledvina 2009).

V játrech vznikají lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL), které přenáší především triacylglyceroly, které jsou v játrech syntetizovány. V cirkulaci jsou triacylglyceroly ve VLDL štěpeny lipoproteinovou lipázou podobně jako triacylglyceroly chylomikronů a z VLDL vznikají lipoproteiny o střední (IDL) a nakonec o nízké hustotě (LDL) (Obrázek 3). Poslední jmenované jsou hlavním nosičem a dodavatelem cholesterolu do periferních tkání, obsahují minimální množství triacylglycerolu. LDL částice jsou vychytávány pomocí LDL-receptorů na povrchu buněk, které rozpoznávají apo-E a apo B-100. Syntézou těchto receptorů lze tedy regulovat příjem cholesterolu do tkání. Při zvýšené hladině cholesterolu v buňce dochází k potlačení exprese LDL-receptorů a tím i ke snížení příjmu cholesterolu tkání. Zvýšená hladina LDL částic je spojena s jejich ukládáním v cévní stěně a rozvojem aterosklerózy.

Obrázek 3. Metabolismus VLDL, IDL a LDL (upraveno podle Ledvina 2009).

5

Lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL) jsou syntetizovány jako tzv. nascentní (pre-beta) HDL v játrech a tenkém střevě. Jejich cholesterol je v cirkulaci esterifikován enzymem lecitin-cholesterolacyltransferázou a vznikající estery cholesterolu se ukládají uvnitř HDL částice. Další cholesterol a fosfolipidy pro esterifikaci získávají částice HDL z buněk nebo z chylomikronů a VLDL. Částice HDL se tímto způsobem zvětšují – z nascentních HDL vznikají nejprve HDL3 a potom HDL2 částice, které mohou cholesterol transportovat do jater. Prostřednictvím HDL tak může být transportován cholesterol z periferních tkání do jater, která jsou jediným místem v těle, které může cholesterol z těla odstranit (Obrázek 4). Tento proces označovaný jako reverzní transport cholesterolu hraje významnou úlohu v ochraně mimojaterních tkání a tedy i cévní stěny před nadměrným hromaděním cholesterolu.

Obrázek 4. Metabolismus HDL (upraveno podle Ledvina 2009).

3 Cholesterol a ateroskleróza Zvýšená koncentrace sérového cholesterolu je společně s věkem, hypertenzí a kouřením jedním z významných rizikových faktorů rozvoje aterosklerózy (Grundy 1990, Racek 1999). Jeho hladina by se měla pohybovat pod 5 mmol/l v séru (Vaverková et al 2007). Nejvíce aterogenní je cholesterol v LDL částicích. Částice LDL mohou přes endotelové buňky arterií pronikat do intimy, kde podléhají různým modifikacím a následně jsou vychytávány monocyty / makrofágy. Při zvýšené koncentraci cholesterolu dochází k hromadění cholesterolu a z makrofágů vznikají tzv. pěnové buňky. Ty uvolňují látky stimulující proliferaci hladké svaloviny cévy a ukládání extracelulární vazivové hmoty. Vznikají tak vazivové pláty, které jsou následně přeměněny ve fibrózní plaky a dále v komplikované aterosklerotické léze. Tento proces může vést až k uzávěru arterie. Naopak zvýšení koncentrace HDL cholesterolu snižuje riziko aterosklerózy. 6

4 Žlučové kyseliny - struktura, funkce, syntéza a regulace Žlučové kyseliny jsou amfipatické steroidní látky tvořené 24 uhlíkovými atomy (Obrázek 5) (Davis et al 2002, Chiang 2002, Monte et al 2009). Většina z nich obsahuje hydroxylovou skupinu v pozicích 3α, 7α a 12α. Téměř vždy se vyskytují v konjugované formě s glycinem nebo taurinem, čímž se zvyšuje jejich rozpustnost ve vodě. De novo vyrobené žlučové kyseliny jsou označovány jako primární žlučové kyseliny (cholová, chenodeoxycholová kyselina). Konjugované žlučové kyseliny jsou vyloučeny do žluče a uloženy ve žlučníku, odkud se uvolňují do tenkého střeva po každém jídle. Zhruba 95% žlučových kyselin je ve střevě absorbováno a podléhá enterohepatální cirkulaci (játra žlučové cesty - střeva - portální oběh - játra). Zbytek je ve střevě působením střevní mikroflóry dehydroxylován v pozici 7α, dekonjugován a hydroxylové skupiny na 3., 7. a 12. uhlíku oxidovány nebo epimerizovány (přesun hydroxylové skupiny z α strany na β stranu a obráceně). Dekonjugací a dehydroxylací v pozici 7α vznikají sekundární žlučové kyseliny (kyselina deoxycholová, litocholová).

Obrázek 5. Struktura žlučových kyselin (upraveno podle Monte et al 2009).

Žlučové kyseliny jsou nezbytné jako detergenty usnadňující absorpci tuků, cholesterolu a vitaminů rozpustných v tucích z potravy. Fungují také jako signální molekuly, které regulují metabolismus žlučových kyselin a cholesterolu. Jejich syntéza je jednou z možností, jak se tělo zbavuje přebytku cholesterolu. Také brání bakteriálnímu přemnožení v tenkém střevě. 7

Žlučové kyseliny jsou syntetizovány z cholesterolu prostřednictvím dvou hlavních biosyntetických drah (Obrázek 6). Klasická (neutrální) dráha se uskutečňuje pouze v játrech. Začíná hydroxylací cholesterolu na 7. uhlíku cholesterol-7α-hydroxylázou (CYP7A1). Vzniklý 7α-hydroxycholesterol je přeměněn na 7α-hydroxy-4-cholesten-3-on. Konečnými produkty jsou především cholová kyselina konjugovaná s taurinem nebo glycinem. Může vznikat i chenodeoxycholová kyselina. Alternativní (kyselá) dráha nejprve modifikuje steroidní jádro cholesterolu oxidací postranního řetězce. Tento krok katalyzuje sterol-27hydroxyláza (CYP27A1). Touto dráhou vzniká kyselina chenodeoxycholová. Procentuální množství žlučových kyselin vyrobených touto drahou se liší druh od druhu. U člověka za normálních podmínek představuje 10% produkce žlučových kyselin. Minoritní syntéza žlučových kyselin probíhá i v mimojaterních tkáních (například v mozku).

Obrázek 6. Klasická a alternativní dráha biosyntézy žlučových kyselin (převzato z Chiang 2002).

8

Žlučové

kyseliny

regulují

svoji

syntézu

negativní

zpětnou

vazbou

zprostředkovanou přes jaderný receptor žlučových kyselin FXR („farnesoid X receptor“) (Obrázek 7). Ten indukuje expresi SHP („small heterodimer partner“), který interaguje s transkripčními faktory, které se váží na oblasti v promotoru genu pro CYP7A1, označované jako elementy odpovídající na žlučové kyseliny (BARE, „bile acid response element“), a tak potlačí syntézu žlučových kyselin. FXR rovněž indukuje ve střevech expresi fibroblastového růstového faktoru 19 (FGF-19) a ten může po navázání na svůj receptor FGFR4 snižovat expresi CYP7A1 v játrech. Oxysteroly, metabolity cholesterolu, aktivují LXR („liver X receptor“), který následně u myší a potkanů aktivuje expresi Cyp7a1. U člověka má malý nebo žádný efekt na transkripci CYP7A1 kvůli absenci elementu pro LXR v promotoru tohoto genu. Mezi další látky ovlivňující syntézu žlučových kyselin patří inzulín, thyroidní hormony a některé léky (fenobarbital, rifampicin).

Obrázek 7. Regulace genové exprese CYP7A1 (upraveno podle Rao et al 2010). Žlučové kyseliny jsou transportovány z tenkého střeva do enterocytu pomocí ASBT transportéru. Tam aktivují expresi FXR a následně vstupují přes transportér OST α/β do cirkulace. V játrech jsou vychytávány a přes FXR inhibují expresi CYP7A1. Z jater jsou vylučovány opět do tenkého střeva. V enterocytu aktivují žlučové kyseliny rovněž expresi FGF19. FGF19 aktivuje expresi SHP v hepatocytu a tak inhibuje expresi CYP7A1.

9

5 Cholesterol-7α-hydroxyláza Gen pro tento enzym byl sekvenován u mnoha živočichů (Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Gallus gallus, Pan troglodytes, Oryctolagus cuniculus a další). U

člověka

se

nachází

na

8.

chromozomu

(8q11-q12)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=cyp7a1). Kódující oblast lidského genu vykazuje 82% podobnost s genem potkana, zatímco 3´nepřekládaná oblast vykazuje pouze 46% podobnost (Noshiro & Okuda 1990). Jeho transkripce je orgánově specifická, dochází k ní pouze v játrech (Davis et al 2002). Lidský CYP7A1 tvoří 504 aminokyselin (Noshiro & Okuda 1990), potkaní gen je o jednu aminokyselinu kratší (Noshiro et al 1989). CYP7A1 patří do rodiny cytochromů P450, které jsou důležité v metabolismu endogenních i exogenních substrátů (např. mastné kyseliny, steroidy, eikosanoidy, léky, karcinogeny, pesticidy) (Shinkyo & Guengerich 2011). Je to první enzym v klasické dráze přeměňující cholesterol na žlučové kyseliny (Gilardi et al 2007, Myant & Mitropoulos 1977). Katalyzuje hydroxylaci cholesterolu v pozici 7α. Jeden atom z molekuly O2 je inkorporován do substrátu, zatímco druhý je redukován na vodu pomocí redukovaného koenzymu (většinou NADPH) podle následující rovnice: cholesterol + NADPH + H+ + O2 → 7α-hydroxycholesterol + NADP+ + H2O nebo cholesterol + NADH + H+ + O2 → 7α-hydroxycholesterol + NAD+ + H2O

5.1 Měření aktivity cholesterol-7α-hydroxylázy Vzhledem k tomu, že k přímému měření aktivity CYP7A1 nebo koncentrace mRNA je u člověka nezbytná jaterní biopsie, je přímé stanovení aktivity prováděno spíše výjimečně a to u pacientů, u kterých byla prováděna cholecystektomie (Bjorkhem et al 1987, Reihner et al 1990). Byla proto hledána sloučenina, která by odrážela aktivitu CYP7A1 a zároveň byla relativně snadno měřitelná v séru. Zprvu se používal 7α-hydroxycholesterol, produkt reakce katalyzované tímto enzymem. Jeho koncentrace v séru dobře reflektovala aktivitu tohoto enzymu, ale jen při zvýšené syntéze žlučových kyselin. Navíc dochází k jeho neenzymatické autooxidaci v inkubační směsi (Myant & Mitropoulos 1977). Jako lepší marker se proto jeví 7α-hydroxy-4-cholesten-3-on (C4), intermediární produkt při syntéze žlučových kyselin, který dobře reflektuje aktivitu CYP7A1 i při jeho snížené nebo zvýšené aktivitě (Axelson et al 1991). C4 je v krvi transportován 10

lipoproteinovými částicemi přenášejícími cholesterol, a proto se často jeho koncentrace koriguje na koncentraci cholesterolu - obvykle je používán poměr C4/cholesterol (Galman et al 2005).

5.2 Regulace promotorové aktivity CYP7A1 Studiem interakce DNA-protein pomocí DNáza I footprintingu bylo na 5´ konci CYP7A1 mezi nukleotidy -266 až +121 identifikováno 9 chráněných oblastí, na které se váží transkripční faktory (Cooper et al 1997). Tyto oblasti jsou evolučně konzervované, podobné byly objeveny i u myši a potkana, což svědčí o jejich významné roli v transkripci. Nejdůležitější a zároveň minimální oblast vyžadovaná k transkripci je mezi nukleotidy -156 až +121, kde se našla největší promotorová aktivita. Další velmi důležitá oblast se nachází mezi nukleotidy -238 a -210. Pomocí umělých konstruktů promotoru o různé délce a měřením aktivity transkripce a vazby transkripčních faktorů byl objasněn význam jednotlivých footprintů (Tabulka 2). Oblast

Název

Vazba

Vazba transkripčních faktorů

+40 až +27

footprint 1

+21 až +13

footprint 2

+8 až -6

footprint 3

pozitivní regulační prvek

HNF-3

-16 až -29

footprint 4

pozitivní regulační prvek

-54 až -69

footprint 5

pozitivní i negativní regulační

HNF-4 (pozitivní)

prvek

ARP-1 (negativní)

-6 až -16

(-52 až -73) -99 až -116

footprint 6

negativní regulační prvek

všudypřítomné transkripční faktory (-98 až -122)

-116 až -138

pozitivní regulační prvek

-138 až -152

footprint 7

negativní regulační prvek

- 193 až -210

footprint 8

negativní regulační prvek

-210 až -238 -238 až -266 -266 až -689

pozitivní regulační prvek footprint 9

HNF-3

slabě negativní regulační prvek slabě pozitivní regulační prvek

Tabulka 2. Oblasti a regulační prvky promotoru CYP7A1.

11

5.3 Diurnální rytmus aktivity Cyp7a1 Cholesterol-7α-hydroxyláza vykazuje diurnální rytmus. U potkana je aktivita tohoto enzymu nejvyšší kolem půlnoci (někteří uvádějí cca 22. hodinu (Kai et al 1995, Noshiro et al 1990), jiní po půlnoci (Mitropoulos et al 1972)), poté kolem poledne klesá až na minimum a k večeru zase roste. Podobná aktivita se vyskytuje i u králíka, který je stejně jako potkan noční zvíře. U hladovějících zvířat je diurnální rytmus patrný také, jen minimální a maximální hodnoty aktivity jsou nižší. Pohlaví na cirkadiánní rytmus nemá vliv. U kočkodana obecného (denní zvíře) byla maximální aktivita naměřena v poledne, nejnižší kolem 18. hodiny (Hulcher et al 1978). Aktivta nejrychleji narůstala během dopoledne. Kočkodan obecný červenozelený (hyporesponder k dietnímu cholesterolu) vykazoval větší amplitudy a celkově vyšší enzymatickou aktivitu než kočkodan obecný bělozelený (hyperresponder k dietnímu cholesterolu). U člověka se diurnální rytmus také vyskytuje, má však dva vrcholy maximální aktivity - první okolo 13. hodiny, druhý okolo 21. hodiny (Galman et al 2005). Během noci aktivita klesá (Obrázek 8).

Obrázek 8. Diurnální rytmus aktivity CYP7A1 u člověka (převzato z Galman et al 2005).

5.4 Nesynonymní mutace v CYP7A1 Byly popsány dva nesynonymní jednonukleotidové polymorfismy. První je C/T záměna v exonu 3, která způsobuje výměnu asparaginu za serin (Asn233Ser) (Nakamoto et al 2006). Druhá je záměna prolinu za alanin (Pro398Ala) (Abrahamsson et al 2005). Další nesynonymní mutace je delece dvou nukleotidů v exonu 6 (1302 delTT) způsobující nefunkčnost enzymu (Pullinger et al 2002). Té se více věnuje kapitola Deficit cholesterol7α-hydroxylázy u lidí. První a třetí mutace mají v populaci velmi nízký výskyt.

12

5.5 Deficit cholesterol-7α-hydroxylázy u lidí U člověka byla objevena mutace vedoucí k posunu čtecího rámce a ztrátě aktivního místa CYP7A1 (Pullinger et al 2002). Delece dvou párů bází v exonu 6 (1302-1303delTT) vedoucí k záměně leucinu za arginin v kodonu 413 způsobí vytvoření předčasného stop kodonu a tím vede ke ztrátě vazebné domény pro hem (Obrázek 9). Homozygotní jedinci pro tuto mutaci vykazovali vysokou koncentraci LDL cholesterolu, která nereaguje na léčbu statiny, značně sníženou exkreci žlučových kyselin i změnu v jejich poměru (více chenodeoxycholové kyseliny oproti cholové), dvojnásobný obsah cholesterolu v játrech a mírnou tukovou malabsorpci. U některých se vyskytla i zvýšená hladina triacylglycerolů v plazmě a žlučníkové kameny. Koncentrace LDL cholesterolu u heterozygotů byla také zvýšená, nedosahovala však koncentrací pozorovaných u homozygotů. To naznačuje, že se jedná o kodominantní poruchu.

Obrázek 9. Mutace v CYP7A1 způsobující nefunkčnost enzymu (převzato z Pullinger et al 2002).

5.6 Deficit cholesterol-7α-hydroxylázy u myší Cyp7a1 deficitní myš vznikla cíleným odstraněním třetího až pátého exonu, což mělo za následek vznik neaktivního proteinu (Ishibashi et al 1996). Jedinci nesoucí jednu kopii tohoto genu byli fenotypově normální, zatímco většina zcela deficitních jedinců uhynula do 18 dnů od narození ve dvou vlnách. První vlna proběhla 1. - 4. den (40%) zřejmě v důsledku nedostatku vitaminů rozpustných v tucích v mateřském mléku. U nekojících samic byla avitaminóza nedetekovatelná. Druhá vlna úmrtí mláďat byla mezi 11. - 18. dnem po narození (45%). Dalo se jí předcházet podáváním kyseliny cholové matkám, stejně jako podávání vitaminů matkám zabránilo masovému úhynu v prvních dnech po narození. Ta, která přežila 18. den, již vykazovala normální míru přežití. Deficiní mláďata byla znatelně menší než zdravá nebo heterozygotní mláďata. Mezi další příznaky patřila mastná srst (vylučování monoacylglycerolů), která se u deficitních i heterozygotních kojících matek 13

objevila mezi 4. až 7. dnem kojení. Míra a doba trvání tohoto fenotypu závisela na počtu mláďat, nicméně potíže netrvaly déle jak 14 dní. U mláďat se mastná srst taktéž objevila, ale se zpožděním 3 - 4 dnů a trvala přibližně týden. Po suplementaci cholovou kyselinou, nikoliv vitamíny, se tento příznak nerozvinul. Také se vyskytla suchá šupinatá kůže, oční abnormality a s tím související změny v chování. Vyřazení Cyp7a1 nemělo žádný vliv na morfologii jater. Ve žlučových kanálcích mladých myších byly nalezeny žluté krystalické usazeniny. Nebyly pozorovány rozdíly v koncentraci triacylglycerolů a cholesterolu v séru, profilu lipoproteinových částic a koncentraci žlučových kyselin ve žluči mezi deficitními a kontrolními zvířaty. Koncentrace žlučových kyselin ve stolici byla u deficitních myší snížená (více u samic) a zastoupení jednotlivých druhů žlučových kyselin ve žluči i stolici se lišilo od zdravých jedinců (Erickson et al 2003). Novorozené deficitní myši vykazovaly výrazně zvýšený obsah tuku ve stolici až do cca 22 dnů od narození. Po 28 dnech se obsah tuku ve stolici normalizoval. Schwarz a kolektiv na základě svých výsledků uzavřeli, že u myši není Cyp7a1 potřebný pro udržování normální hladiny sérového cholesterolu a triacylglycerolů a že alternativní cesta syntézy žlučových kyselin se aktivuje až mezi 3. - 4. týdnem (Schwarz et al 1996). Naproti tomu Erickson et al (2003) zjistili zvýšenou koncentraci cholesterolu v plazmě u deficitních myší, vyšší u samic než u samců. U samic vedla deficience ke změně metabolismu mastných kyselin.

5.7 Projevy zvýšené exprese cholesterol-7α-hydroxylázy Transfekce jaterních tkáňových buněk HepG2 i primárních jaterních hepatocytů rekombinantním adenovirem (AdCMV-CYP7A1) vedla ke zvýšené hladině mRNA pro CYP7A1, což mělo za následek dvakrát zvýšenou syntézu žlučových kyselin (Pandak et al 2001). Došlo ke zvýšení koncentrace cholové kyseliny v médiu, snížení volného i celkového mikrozomálního cholesterolu a potlačení syntézy cholesterolu prostřednictvím snížené aktivity HMG-CoA reduktázy. Transgenní myš exprimující navíc potkaní Cyp7a1 vykazovala vyšší aktivitu cholesterol-7α-hydroxylázy a zvýšený obsah žlučových kyselin ve žluči a střevech (Li et al 2010). Cholesterol v plazmě byl nižší než u kontrolní myši. Na vysokotukové dietě měla transgenní myš méně tělesného tuku a více svalové hmoty oproti kontrole. Koncentrace cholesterolu a triacylglycerolů v játrech se nezměnily, zatímco u kontrolních zvířat signifikantně vzrostly. Ačkoliv u transgenních myší vzrostla sekrece VLDL v játrech,

14

hladina triacylglycerolů v plazmě nebyla zvýšená, což může být vysvětleno zvýšenou clearancí triacylglycerolů v periferních tkáních.

5.8 Vliv dietního cholesterolu na CYP7A1 Aktivita CYP7A1 může být ovlivněna složením diety, především obsahem cholesterolu. Dietní cholesterol zvyšuje koncentraci celkového a LDL cholesterolu v plazmě, nicméně velikost změny se liší nejen mezi různými druhy, ale i mezi jedinci stejného druhu. Někteří vykazují pouze malé odezvy na dietní cholesterol (hyporespondeři), zatímco u některých se rozvine vysoký stupeň hypercholesterolémie (hyperrespondeři) (Beynen et al 1987). Existují dva způsoby, jak zvládat zvýšený přísun cholesterolu. Buď se může snížit absorpce cholesterolu, nebo může dojít ke zvýšené přeměně cholesterolu na žlučové kyseliny.

5.8.1 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u potkana Potkan (kmen Sprague-Dawley) je rezistentní ke zvyšování cholesterolu v plazmě po dietě obohacené cholesterolem (Boone et al 2011, Horton et al 1995). Dietní cholesterol utlumil syntézu cholesterolu v játrech z více než 90 %. Koncentrace cholesterolu v játrech, stejně jako LDL cholesterolu v plazmě, se zvýšila jen nepatrně. Aktivita Cyp7a1 po podání cholesterolu výrazně vzrostla a exprese Cyp7a1 se zvýšila skoro třikrát. Vzhledem k vysoké bazální aktivitě Cyp7a1 v játrech musí potkani hladinu cholesterolu udržovat jeho zvýšenou syntézou.

5.8.2 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u křečka Křeček zlatý je mnohem náchylnější k rozvoji hypercholesterolémie než potkan (Horton et al 1995). Aktivita Cyp7a1 je u křečka šestnáctkrát nižší než u potkana. Bazální exprese Cyp7a1 je nízká a téměř se nezvyšuje po suplementaci cholesterolem, zatímco obsah cholesterolu v játrech i LDL cholesterolu v plazmě několikanásobně vrůstá. Zvýšený obsah cholesterolu v játrech nejprve zvyšuje expresi Cyp7a1, ale po dalším zvyšování koncentrace cholesterolu v játrech dochází k jejímu utlumení. Syntéza cholesterolu v játrech je dvacetkrát nižší než u potkana a je tlumena dietním cholesterolem opět z více než 90 %. Jak potkan, tak křeček se zbavují cholesterolu hlavně konverzí na žlučové kyseliny.

15

5.8.3 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u kočkodana U kočkodana obecného (Chlorocebus aethiops) lze rovněž dietním cholesterolem indukovat hypercholesterolémii. Po zvýšení cholesterolu v dietě došlo ke zvýšení celkového a LDL cholesterolu a snížení HDL cholesterolu (Rudel et al 1994). Koncentrace cholesterolu v séru se zvýšila více u kočkodana obecného bělozeleného (Ch. a. aethiops) než u kočkodana obecného červenozeleného (Ch.a.pygerythrus) (Hulcher et al 1978). Obsah volného cholesterolu v játrech se na vysokocholesterolové stravě zdvojnásobil. U zvířat, která byla po vysokocholesterolové dietě převedena na nízkocholesterolovou dietu, zůstávala koncentrace esterifikovaného i volného cholesterolu zvýšená oproti standardní laboratorní dietě. Aktivita Cyp7a1 se podstatně snížila při zvýšeném příjmu cholesterolu a zůstala snížená i po následující období nezávisle na obsahu cholesterolu v dietě (Rudel et al 1994).

5.8.4 Vliv dietního cholesterolu na Cyp7a1 u myši U myši (kmen C57BL/6J) ovlivňuje dietní cholesterol expresi Cyp7a1 v závislosti na typu tuků v dietě (Cheema et al 1997). Po zavedení vysokotukových diet na bázi nasycených, mononenasycených i polynenasycených mastných kyselin došlo k rozvoji hypercholesterolémie. Po přidání cholesterolu k těmto dietám došlo k dalšímu nárůstu cholesterolu v plazmě už jen u mono- a polynenasycených mastných kyselin. Aktivita Cyp7a1, stejně jako koncentrace mRNA pro Cyp7a1 byly signifikantně vyšší v myších krmených mononenasycenými mastnými kyselinami. Na cholesterolové dietě vzrostla koncetrace mRNA u myší krmených polynenasycenými mastnými kyselinami, zatímco u myší, které dostávaly mononenasycené a nasycené mastné kyseliny poklesla. Bazální exprese Cyp7a1 je u myši nižší než u potkana (Boone et al 2011).

5.8.5 Vliv dietního cholesterolu na CYP7A1 u transgenní myši Myši s vyřazeným vlastním Cyp7a1, který byl nahrazen lidským CYP7A1, měly devětkrát vyšší expresi než myši, které exprimovaly oba geny (Chen et al 2002). Hladina mRNA pro Cyp7a1 u kontrolních samic byla zhruba šestinásobná než u těch, které exprimovaly jen lidský CYP7A1. U kontrolních samců byla hladina mRNA o polovinu nižší než u kontrolních samic, u jedinců s vyřazeným Cyp7a1 hladina mRNA lidského CYP7A1 dosahovala stejných hodnot jako u kontrolních samic. U samců i samic s lidským CYP7A1 byla hladina sérového cholesterolu vyšší než u normálních myší. Po dietě s vysokým 16

obsahem tuku a přídavkem cholesterolu došlo u všech myší ke zvýšení sérového cholesterolu, ovšem u zvířat exprimujících lidský CYP7A1 byl nárůst značně vyšší. I hladiny mRNA se změnily. U kontrolních myší došlo k 80% poklesu, u geneticky manipulovaných zvířat byl pokles ještě vyšší. Po určité době na vysokotukové stravě s cholesterolem byla hladina mRNA u transgenních zvířat nedetekovatelná. Aktivita lidského enzymu těchto myší je nižší než aktivita myšího enzymu u kontrolních myší a po suplementaci cholesterolem klesá zhruba na polovinu původní hodnoty (Agellon et al 2002).

5.8.6 Vliv dietního cholesterolu na CYP7A1 u člověka Člověk se zdá být částečně rezistentní k dietnímu cholesterolu. Rozvoji extrémní hypercholesterolémie zřejmě zabraňuje limitovaná schopnost absorbovat cholesterol spíše než zvýšená přeměna cholesterolu na žlučové kyseliny (Wilson & Lindsey 1965). V CYP7A1 byly identifikovány varianty lišící se v odpovědi cholesterolémie na podávání dietních tuků a cholesterolu. Toto bude podrobně diskutováno v kapitole Polymorfismus -203A>C v CYP7A1 u člověka a jeho odpověď na dietu. V odpovědi na dietní cholesterol byla v literatuře popsána výrazná mezidruhová variabilita. Obecně však platí, že u druhů, které na podání cholesterolu neodpovídají vzestupem cholesterolémie (hyporespondeři), aktivita CYP7A1 stoupá (potkan). U druhů, u kterých dochází k výraznému vzestupu cholesterolémie (hyperrespondeři), se exprese enzymu výrazně nemění nebo dokonce klesá (křeček, kočkodan, myš).

5.9 Vliv léků na aktivitu CYP7A1 Aktivita CYP7A1 je ovlivněna některými léky snižujícími hladinu cholesterolu a terapeuticky podávanými žlučovými kyselinami.

5.9.1 Sekvestranty žlučových kyselin Sekvestranty žlučových kyselin (cholestyramin, kolestipol a kolesevelam) váží ve střevě žlučové kyseliny a blokují jejich návrat do jater v enterohepatálním oběhu (Pikuleva 2008). Tímto mechanismem několikanásobně zvyšují aktivitu CYP7A1 (Bertolotti et al 1986, Reihner et al 1990), a tak zvyšují syntézu žlučových kyselin z cholesterolu. Jaterní cholesterol se postupně vyčerpává, což vede ke zvýšenému vychytávání LDL cholesterolu a poklesu jeho koncentrace v séru. 17

5.9.2 Statiny Statiny jsou nejefektivnější a nejpoužívanější hypolipidemika. Inhibují HMG-CoA reduktázu (Pikuleva 2008). Inhibice cholesterolové syntézy vede ke snížení obsahu cholesterolu v játrech a tím ke zvýšené expresi LDL receptorů. I když statiny zřejmě nepůsobí přímo na CYP7A1, bylo demonstrováno, že odpověď cholesterolémie na statiny může být modifikována genotypem CYP7A1, jak bude diskutováno v kapitole Vliv polymorfismu CYP7A1 na léčbu hypercholesterolémie.

5.9.3 Žlučové kyseliny Žlučové kyseliny, zejména hydrofobní, negativně zpětnovazebně regulují transkripci CYP7A1 a tím i syntézu žlučových kyselin (Hillebrant et al 1999). Nezáleží jen na celkovém množství žlučových kyselin, ale také na složení jednotlivých kyselin vracejících se ze střeva do jater. Žlučové kyseliny se používají při léčbě žlučových kamenů, neboť snižují nasycení žluči cholesterolem. Výsledky studií sledujících vliv podávání deoxycholové kyseliny na aktivitu CYP7A1 nejsou konzistentní. Zatímco v jedné studii nebyl pozorován žádný efekt na aktivitu

CYP7A1 (Hillebrant et al 1999), v jiné práci klesla hladina sérového

7α-hydroxy-4-cholesten-3-onu, markeru aktivity cholesterol-7α-hydroxylázy, po třech týdnech o 75 % (Einarsson et al 2001). Konzistentní nebyl ani vliv léčby na hladinu plazmatických lipidů. V první zmíněné studii celkový cholesterol klesl o 10 % a ostatní lipidy nebyly ovlivněny (s výjimkou snížení VLDL triglyceridů). Vysvětlením tohoto jevu může být snížená absorpce dietního cholesterolu nebo snížená sekrece VLDL játry. Ve druhé studii nebyl pozorován žádný významný účinek na koncentraci lipidů v plazmě. Léčba

chenodeoxycholovou

kyselinou

vedla

k

poklesu

koncentrace

7α-hydroxy-4-cholesten-3-onu o 80%, na koncentraci lipidů v plazmě však neměla žádný vliv (Einarsson et al 2001).

18

5.10 Polymorfismus CYP7A1 u člověka 5.10.1 Oblasti ve vazbě a haplotypy genu CYP7A1 Analýzou haplotypové struktury CYP7A1 v různých populacích se na základě dat vycházejících z HapMap projektu detailně zabývali Nakamoto et al (2006). Jejich analýza vycházela ze 14 jednonukleotidových polymorfismů (SNPs) CYP7A1 (Tabulka 3). Název

Umístění v CYP7A1 genu

rs10504255

+14 260

rs10957057

+12 381

rs8192879

+9 145

3´ downstream

Záměna alel T/C G/A

3´ nepřekládaná

G/A

oblast rs11786580

+6 781

intron 4

G/A

rs3747809

+5 737

rs1457043

+2 282

intron 2

A/G

rs2162459

+1679

intron1

T/C

rs3808607

-203

5´ upstream

A/C

rs3824260

-469

C/T

rs7833904

-4 4941

A/T

rs3903445

-5 621

C/A

rs1125226

-6 790

T/G

rs1023649

-7 697

T/C

rs1023652

-7 895

G/C

A/G

Tabulka 3. Jednonukleotidové polymorfismy v CYP7A1. Lidský gen pro cholesterol-7α-hydroxylázu má tři oblasti s vysokou vazebnou nerovnováhou a nízkou diverzitou haplotypů (haplotypové bloky). První vysoce konzervovaný haplotypový blok dlouhý 3 000 bází leží v promotoru, asi 7 000 bází daleko od transkripčního počátku. Nalezneme zde pouze 2 haplotypy ve všech populacích s výjimkou africké (Obrázek 10). Další relativně konzervovaný haplotypový blok je pozorován mezi cca -500 bází a intronem 2. Dva nejčastější haplotypy této oblasti tvoří dohromady 80 - 90 % všech haplotypových variant. U asijské populace jsou tyto dva bloky spojené v jeden. 19

Nejméně konzervovaný haplotypový blok je mezi intronem 4 a 3´ downstream oblastí. U kavkazské populace (CEU) je úplně sloučen s předchozím úsekem, u africké (YRI) jen částečně. U Japonců (JPT) existuje slabá vazba s předchozím úsekem a u Číňanů (CHB) tato oblast neexistuje vůbec. U kavkazské populace existuje pouze 5 haplotypů s výskytem vyšším než 2 %: CEU-B1H1 až CEU-B1H5. Nejčastější jsou CEU-B1H1 (36,7%) a CEU-B1H2 (31,7 %). CEU-B1H1 nese jen jednu pozměněnou alelu. Nejčastější haplotyp u africké populace je YRI-B1H1 (55 %). Je identický s CEU-B1H2. Druhý nejčastější je YRI-B1H2 (22,5 %), který je stejný jako CEU-B1H1. U japonské a čínské populace jsou rozdíly jen v procentuálním zastoupení jednotlivých haplotypů a japonská populace má jeden navíc. Ve švédské populaci existují tyto dva hlavní haplotypy (Abrahamsson et al 2005): -469T, -203C, IVS1-13T, IVS2+150G, IVS6+363G a -469C, -203A, IVS1-13C, IVS2+150A, IVS6+363A.

Obrázek 10. Haplotypové frekvence z HapMap vybraných SNPs v kavkazské (CEU), africké (YRI), japonské (JPT) a čínské (CHB) populaci (převzato z Nakamoto et al 2006). Modrý pruh reprezentuje alelu 1, červený alelu 2. Černý pruh značí, že alela není v populaci přítomná. Čísla napravo od haplotypů jsou jejich frekvence. Červené trojúhelníky jsou přítomny u htSNPs. Úroveň rekombinace je vyjádřena číslem nad překřížením. Značení alel je podle sekvence plus řetězce DNA.

20

5.10.2 Polymorfismy CYP7A1 a jejich vztah k hladině lipidů a lipoproteinů v plazmě Dosud byl podrobně zkoumán vztah polymorfismu CYP7A1 v pozici -203 (respektive polymorfismu v pozici -469, který je součástí stejného haplotypu) a koncentracemi lipidů v plazmě. Zastoupení tohoto polymorfismu se napříč populacemi významně liší (Tabulka 4).

Populace

Frekvence

Frekvence

Frekvence

Frekvence

Frekvence

alely A

alely C

AA

AC

CC

Kavkazská

0,63

0,37

0,40

0,47

0,14

Africká

0,42

0,58

0,18

0,49

0,34

Japonská

0,43

0,57

0,18

0,49

0,32

Čínská

0,59

0,41

0,35

0,48

0,17

Tabulka 4. Zastoupení polymorfismu -203C/A v populacích (podle Nakamoto et al 2006).

Je známo, že hladina LDL cholesterolu v plazmě je z 53 % předurčena genetickými faktory (Lin et al 2005, Wang et al 1998). Odhaduje se, že alelické varianty CYP7A1 ovlivňují tuto hladinu z 15%. V bělošské populaci byl prokázaný vztah mezi polymorfismem CYP7A1 u osob se zvýšenou koncentrací LDL cholesterolu v plazmě, nikoliv však s nízkou koncentrací LDL cholesterolu (Wang et al 1998). U příbuzných i u jednotlivců bez příbuzenského vztahu byla koncentrace LDL cholesterolu vyšší u -203C homozygotů než u -203A homozygotů. I koncentrace HDL cholesterolu v plazmě byla vyšší u homozygotů pro -203 C alelu, ale pouze u mužů. Couture a kolektiv potvrdili vztah mezi C variantou a vyšší koncentrací LDL cholesterolu u mužů, ale už nenašli vztah mezi CYP7A1 polymorfismem a HDL cholesterolem u mužů a LDL cholesterolem u žen v kavkazské populaci (Couture et al 1999). Ukázali, že u mužů je C varianta spojena s vyšší koncentrací celkového cholesterolu a jeho zvýšeným poměrem k HDL cholesterolu. U žen zjistili souvislost mezi CC genotypem a nižší koncentrací triglyceridů, VLDL a LDL v porovnání s heterozygoty. U obou pohlaví měly lipoproteinové částice normální velikost a nebyla nalezena spojitost mezi tímto polymorfismem a ischemickou chorobou srdeční. V další studii byl sledován význam -203A>C polymorfismu u čtyř poruch metabolismu lipoproteinů (hypertriglyceridémie, kombinovaná hyperlipidémie, familiární dysbetalipoproteinémie a familiární hypercholesterolémie - muži i ženy) a v kontrolní 21

skupině zdravých normolipidemických mužů v Nizozemsku (Hofman et al 2004a). U těchto pacientů byla distribuce alel shodná s kontrolní skupinou, což značí, že se tento polymorfismus nepodílí na vzniku výše zmíněných hyperlipoproteinémií. Nicméně, u pacientů s hypertriglyceridémií byla zjištěna zvýšená hladina celkového cholesterolu v plazmě a tendence ke zvýšené hladině triacylglycerolů, VLDL cholesterolu a VLDL triglyceridů u homozygotů pro A alelu oproti heterozygotům (skupina s CC genotypem byla příliš malá pro statistickou analýzu). Vztah polymorfismu -203A>C ke koncentracím HDL a LDL cholesterolu v séru nebyl u těchto pacientů nalezen, stejně jako spojitost -203A>C polymorfismu s koncentrací celkového, LDL a HDL cholesterolu a celkových triglyceridů. U zdravých mužů homozygotních pro izoformu E3 apolipoproteinu E, který také ovlivňuje hladinu lipidů a lipoproteinů, byl pozorován nárůst sérových triacylglycerolů u AA homozygotů oproti CC homozygotům. Vztah polymorfismu a hladin celkového cholesterolu, apoB a apoA-I a rozdíly mezi muži a ženami nebyly zaznamenány. Ve švédské populaci nebyl žádný vztah mezi koncentrací apoB, LDL, VLDL a HDL cholesterolu v plazmě a polymorfismem -203A>C nalezen (Abrahamsson et al 2005). Nebyl pozorován žádný rozdíl ve vazebné afinitě transkripčních faktorů u -203A>C polymorfismu, na rozdíl od -469C>T polymorfismu, kde byla naměřena zřetelně vyšší afinita jaderných proteinů k alele -469C (měřeno na 30 párů bází dlouhém fragmentu). Co se týče transkripční aktivity, nebyl mezi těmito polymorfismy ani jejich kombinacemi (-203A>C a -469C>T jsou ve vazbě) signifikantní rozdíl. Také míra syntézy žlučových kyselin se shodovala. Klos a kol. zjistily významné rozdíly mezi Američany afrického a evropského původu (Klos et al 2006). U černošské populace byly dva polymorfismy (rs1023649 a rs1023651) spojeny s vyšší hladinou celkového a LDL cholesterolu a haplotyp (rs1023649, rs8192871, rs11786580) měl vliv na koncentraci apoA-I. U bělošských Američanů byl vztah ke koncentraci apoA-I prokázán jen pro rs8192871, a to jen u mužů. Na finské populaci byl analyzován vztah mezi koncentrací různých žlučových kyselin v plazmě a genotypem CYP7A1 (Xiang et al 2012). Ukázalo se, že heterozygotní nositelé rs8192879 GA genotypu měli zvýšenou koncentraci deoxycholové kyseliny oproti GG genotypu. Koncentrace hyodeoxycholové kyseliny byla nižší u rs1023652 CC genotypu oproti GC i GG. Nicméně po Bonferroniho korekci nebyly rozdíly statisticky významné. Kromě toho zjistili, že žádný z jednonukleotidových polymorfismů neovlivňuje koncentraci cholesterolu ani C4 v plazmě. Nebyl zpozorován rozdíl v syntéze C4 mezi muži a ženami, což značí, že pohlaví nemá větší efekt na aktivitu CYP7A1. 22

5.10.3 Polymorfismus -203A>C v CYP7A1 u člověka a jeho odpověď na dietu V České republice došlo po politických změnách po roce 1989 ke změně stravovacích návyků (Hubáček et al 2003). Došlo k poklesu konzumace masa, vajec, másla a živočišných tuků, zatímco spotřeba zeleniny, ovoce a rostlinných olejů vzrostla a následně došlo k poklesu cholesterolémie v celé populaci. U kohorty mužů vyšetřené v roce 1988 a následně v roce 1996 zaznamenali Hubáček a kol. signifikantní změnu cholesterolémie srovnatelnou se změnou v populaci. V roce 1988 dosahovala hladina celkového cholesterolu 6,2 mmol/l a hladina LDL cholesterolu 3,8 mmol/l. O 8 let později se hladina celkového cholesterolu snížila na 5,4 mmol/l a hladina LDL cholesterolu na 3,3 mmol/l. Po rozdělení skupiny podle -203A>C polymorfismu se zjistilo, že pokles cholesterolémie byl genotypem zásadně ovlivněn. U homozygotů pro -203A alelu se hladina celkového i LDL cholesterolu snížila minimálně, zatímco u CC homozygotů došlo k výraznému snížení. Úroveň snížení u heterozygotů se pohybovala mezi naměřenými hodnotami u homozygotů. Polymorfismy v CYP7A1 genu předurčují změnu v celkovém a LDL cholesterolu ze 7% a 4% v odpověď na změnu stravy. Podobné pozorování bylo učiněno v dietně intervenční studii. Podávání diety s vysokým obsahem tuku a cholesterolu po dobu tří týdnů bylo spojeno s významným vzestupem koncentrace celkového a LDL cholesterolu u zdravých dobrovolníků - mužů homozygotních pro variantu C. U AA homozygotů neměla tato dieta na hladinu celkového i LDL cholesterolu žádný vliv (Kovář et al 2004). Hofman a kolektiv v retrospektivní analýze testovali vztah mezi polymorfismem -203A>C a zvýšeným příjmem cholesterolu, kafestolu, nasycených a trans mastných kyselin (Hofman et al 2004b). Zvýšený příjem cholesterolu v potravě byl spojen s výrazně vyšším vzestupem celkového a HDL cholesterolu u nositelů alely C v porovnání s AA homozygoty. Na ostatní měřené parametry (triglyceridy a LDL cholesterol) neměla cholesterolová intervence výrazný vliv. Při podávání kafestolu, látky nacházející se v kávových zrnech, která potlačuje syntézu žlučových kyselin snížením transkripce CYP7A1, došlo u AA homozygotů k méně výraznému vzestupu celkového cholesterolu v porovnání s CC homozygoty a nositeli C alely. Odpověď jednotlivých variant tohoto polymorfismu se nelišila při intervenci nasycenými a trans mastnými kyselinami. Rozdílné odpovědi byly nalezeny i po suplementaci estery rostlinných sterolů, které snižují absorpci cholesterolu (De Castro-Oros et al 2011). Celkový cholesterol klesl

23

více u nositelů varianty -203C než u AA homozygotů. Ostatní lipidové frakce nevykazovaly signifikantní rozdíl.

5.10.4 Vliv polymorfismu CYP7A1 na léčbu hypercholesterolémie Několik vědeckých skupin se zabývalo vlivem CYP7A1 polymorfismu na odpověď hladiny cholesterolu na léčbu statiny, konkrétně atorvastatinem. Atorvastatin patří mezi nejčastěji používané statiny. Během léčby byly zaznamenány interindividuální rozdíly v poklesu lipidů v plazmě, které jsou z 20 - 95 % zapříčiněny genetickými faktory (Evans & McLeod 2003). Vzhledem ke zjištěné resistenci na statiny u CYP7A1 deficitních pacientů je na místě se domnívat, že tento gen je částečně zodpovědný za míru snížení koncentrace LDL cholesterolu při jejich podání (Pullinger et al 2002). Statiny nemají přímý účinek na CYP7A1 (Angelin 1991). Kajinami et al (2004, 2005) studovali interakci mezi -203A>C polymorfismem a polymorfismy v genech kódujících ABCG8 transportér a apolipoprotein E. Muži nesoucí alelu C v pozici -203 měli signifikantně slabší odezvu hladiny LDL cholesterolu na léčbu atorvastatinem oproti alele A. Podobný trend se vyskytl i u žen, nicméně nedosáhl statistické významnosti. U homozygotů pro -203A byla zvýšená odezva hladiny LDL cholesterolu výraznější ve spojení s ABCG8 H19 alelou (Kajinami et al 2004). LDL cholesterol byl nejvíce redukován u mužů s ε2 alelou, nejméně u nositelů alely ε4. Účinek ε2 alely byl výrazně snížen u -203C homozygotů. Rozdíly u žen nebyly tak výrazné. Dokonce byla statisticky prokázaná závislost na pohlaví. Pokles LDL cholesterolu u mužů byl určován především hladinou LDL cholesterolu před léčbou, CYP7A1 genotypem a věkem, zatímco u žen hladinou LDL cholesterolu před léčbou a apoE genotypem (Kajinami et al 2005). Wei et al (2011) nepotvrdili vztah mezi -203A>C polymorfismem a mírou snížení LDL cholesterolu po podání atorvastatinu v čínské populaci. Tito autoři pozorovali významnou procentuální redukci triglyceridů u homozygotů pro alelu -203A oproti heterozygotům a homozygotům pro -203C alelu. Vliv na odpověď hladiny lipidů na léčbu statiny má patrně i polymorfismus rs8192870, jenž je lokalizovaný v prvním intronu CYP7A1 (Jiang et al 2012). U čínských hypercholesterolemických pacientů došlo k menšímu snížení hladiny LDL u nositelů alely G než u TT homozygotů u tohoto polymorfismu.

24

6 Závěr Cholesterol-7α-hydroxyláza

(CYP7A1)

hraje

důležitou

roli

v metabolismu

cholesterolu a žlučových kyselin. Její aktivita je zpětnovazebně regulována žlučovými kyselinami a FGF 19 tak, aby byla zajištěna produkce žlučových kyselin potřebných pro vstřebávání tuků. U některých živočichů, nikoli však u člověka, může CYP7A1 přispívat k eliminaci cholesterolu při jeho zvýšeném přísunu dietou. U člověka se analogický mechanismus uplatňuje při léčbě sekvestranty žlučových kyselin – ty inhibují resorpci žlučových kyselin ze střeva v enterohepatálním cyklu. Tímto mechanismem je uvolněna výše zmíněná zpětnovazebná inhibice a se vzrůstající spotřebou cholesterolu pro syntézu žlučových kyselin klesá i hladina cholesterolu v séru. V poslední době byla věnována poměrně velká pozornost variabilitě genu kódujícího CYP7A1 u člověka, zvláště pak promotorovému polymorfismu -203A>C. Bylo demonstrováno, že tento polymorfismus může ovlivňovat hladiny cholesterolu a lipoproteinů v séru, odpověď cholesterolémie na dietu a také účinek hypolipidemik. Mechanismus, kterým promotorový polymorfismus v pozici -203 ovlivňuje hladinu cholesterolu, nebyl dosud objasněn. Vzhledem k tomu, že je tento polymorfismus lokalizován v oblasti promotoru důležité pro regulaci exprese CYP7A1, je třeba identifikovat transkripční faktory, které se liší svou afinitou k oběma variantám promotoru. Je také třeba ověřit, zda tento polymorfismus není pouhým markerem haplotypového bloku – za pozorované rozdíly v účinku variant genu na cholesterolémii může odpovídat jiný polymorfismus, který je s polymorfismem v pozici -203 ve vazebné nerovnováze. Hlubší porozumění mechanismů regulace aktivity CYP7A1 by potom mohlo mít využití v oblasti nutrigenetiky nebo farmakogenetiky – léky by mohly být předepisovány těm pacientům, kteří z nich budou mít větší prospěch.

25

7 Seznam zkratek ATP-binding cassette sub-family G

ATP vazebná kazeta podrodiny G

member 8

člen 8

ARP-1

Actin-related protein 1

Protein příbuzný s aktinem 1

BARE

Bile acid response element

Element odpovídající na žlučové

ABCG8

kyseliny C4

7α-hydroxy-4-cholesten-3-one

7α-hydroxy-4-cholesten-3-on

CYP27A1

Sterol 27-hydroxylase

Sterol-27-hydroxyláza

CYP7A1

Cholesterol 7α-hydroxylase

Cholesterol-7α-hydroxyláza

CYP7A1

Cholesterol 7α-hydroxylase gene

Gen kódující cholesterol-7αhydroxylázu (člověk)

Cyp7a1

Cholesterol 7α-hydroxylase

Cholesterol-7α-hydroxyláza (jiné živočišné druhy)

Cyp7a1

Cholesterol 7α-hydroxylase gene

Gen kódující cholesterol-7αhydroxylázu (jiné živočišné druhy)

FGF-19

Fibroblast growth factor 19

Fibroblastový růstový faktor 19

FGFR4

Fibroblast growth factor receptor 4

Receptor pro FGF 19

FXR

Farnesoid X receptor

Farnesoidní X receptor

HDL

High density lipoprotein

Lipoprotein o vysoké hustotě

HNF-3

Hepatocyte nuclear factor 3

Jaterní nukleární faktor 3

HNF-4

Hepatocyte nuclear factor 4

Jaterní nukleární faktor 4

HTGL

Hepatic Triglyceride Lipase

Jaterní triglyceridová lipáza

htSNP

Haplotype tagging single nucleotide

Jednonukleotidový polymorfismus

polymorphism

určující haplotyp

CH

Cholesterol

Cholesterol

IDL

Intermediate density lipoprotein

Lipoprotein o střední hustotě

LDL

Low density lipoprotein

Lipoprotein o nízké hustotě

LPL

Lipoprotein lipase

Lipoproteinová lipáza 26

LRP

Low Density Lipoprotein Related

Remnantní receptor

Protein LXR

Liver X receptor

Jaterní X receptor

mRNA

Messenger ribonucleic acid

Informační/mediátorová ribonukleová kyselina

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

Nikotinamid adenin dinukleotid

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide

Nikotinamid adenin dinukleotid

phosphate

fosfát Neesterifikované mastné kyseliny

NEMK SHP

Small heterodimer partner

Malý heterodimerní patner

SNP

Single nucleotide polymorphism

Jednonukleotidový polymorfismus

VLDL

Very low density lipoprotein

Lipoprotein o velmi nízké hustotě

27

8 Přehled použité literatury Abrahamsson A, Krapivner S, Gustafsson U, Muhrbeck O, Eggertsen G, et al. 2005. Common polymorphisms in the CYP7A1 gene do not contribute to variation in rates of bile acid synthesis and plasma LDL cholesterol concentration. Atherosclerosis 182: 37-45 Agellon LB, Drover VA, Cheema SK, Gbaguidi GF, Walsh A. 2002. Dietary cholesterol fails to stimulate the human cholesterol 7alpha-hydroxylase gene (CYP7A1) in transgenic mice. The Journal of biological chemistry 277: 20131-4 Angelin B. 1991. Regulation of hepatic cholesterol metabolism in man. Ann Med 23: 177-80 Axelson M, Bjorkhem I, Reihner E, Einarsson K. 1991. The plasma level of 7 alphahydroxy-4-cholesten-3-one reflects the activity of hepatic cholesterol 7 alphahydroxylase in man. FEBS Lett 284: 216-8 Bertolotti M, Carulli N, Menozzi D, Zironi F, Digrisolo A, et al. 1986. In vivo evaluation of cholesterol 7 alpha-hydroxylation in humans: effect of disease and drug treatment. Journal of lipid research 27: 1278-86 Beynen AC, Katan MB, Van Zutphen LF. 1987. Hypo- and hyperresponders: individual differences in the response of serum cholesterol concentration to changes in diet. Adv Lipid Res 22: 115-71 Bjorkhem I, Reihner E, Angelin B, Ewerth S, Akerlund JE, Einarsson K. 1987. On the possible use of the serum level of 7 alpha-hydroxycholesterol as a marker for increased activity of the cholesterol 7 alpha-hydroxylase in humans. Journal of lipid research 28: 889-94 Boone LR, Brooks PA, Niesen MI, Ness GC. 2011. Mechanism of resistance to dietary cholesterol. J Lipids 2011: 101242 Cooper AD, Chen J, Botelho-Yetkinler MJ, Cao Y, Taniguchi T, Levy-Wilson B. 1997. Characterization of hepatic-specific regulatory elements in the promoter region of the human cholesterol 7alpha-hydroxylase gene. J Biol Chem 272: 3444-52 Couture P, Otvos JD, Cupples LA, Wilson PW, Schaefer EJ, Ordovas JM. 1999. Association of the A-204C polymorphism in the cholesterol 7alpha-hydroxylase gene with variations in plasma low density lipoprotein cholesterol levels in the Framingham Offspring Study. J Lipid Res 40: 1883-9 Davis RA, Miyake JH, Hui TY, Spann NJ. 2002. Regulation of cholesterol-7alphahydroxylase: BAREly missing a SHP. J Lipid Res 43: 533-43 De Castro-Oros I, Pampin S, Cofan M, Mozas P, Pinto X, et al. 2011. Promoter variant 204A > C of the cholesterol 7alpha-hydroxylase gene: association with response to plant sterols in humans and increased transcriptional activity in transfected HepG2 cells. Clin Nutr 30: 239-46

28

Einarsson C, Hillebrant CG, Axelson M. 2001. Effects of treatment with deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid on the hepatic synthesis of cholesterol and bile acids in healthy subjects. Hepatology 33: 1189-93 Erickson SK, Lear SR, Deane S, Dubrac S, Huling SL, et al. 2003. Hypercholesterolemia and changes in lipid and bile acid metabolism in male and female cyp7A1-deficient mice. J Lipid Res 44: 1001-9 Evans WE, McLeod HL. 2003. Pharmacogenomics--drug disposition, drug targets, and side effects. The New England journal of medicine 348: 538-49 Galman C, Angelin B, Rudling M. 2005. Bile acid synthesis in humans has a rapid diurnal variation that is asynchronous with cholesterol synthesis. Gastroenterology 129: 1445-53 Gilardi F, Mitro N, Godio C, Scotti E, Caruso D, et al. 2007. The pharmacological exploitation of cholesterol 7alpha-hydroxylase, the key enzyme in bile acid synthesis: from binding resins to chromatin remodelling to reduce plasma cholesterol. Pharmacol Ther 116: 449-72 Grundy SM. 1978. Cholesterol metabolism in man. West J Med 128: 13-25 Grundy SM. 1990. Atlas of lipid disorders. pp. 38. New York: Gower Medical Publishing. Hillebrant C, Nyberg B, Angelin B, Axelson M, Bjorkhem I, et al. 1999. Deoxycholic acid treatment in patients with cholesterol gallstones: failure to detect a suppression of cholesterol 7alpha-hydroxylase activity. J Intern Med 246: 399-407 Hofman MK, Groenendijk M, Verkuijlen PJ, Jonkers IJ, Mohrschladt MF, et al. 2004a. Modulating effect of the A-278C promoter polymorphism in the cholesterol 7alphahydroxylase gene on serum lipid levels in normolipidaemic and hypertriglyceridaemic individuals. European journal of human genetics : EJHG 12: 935-41 Hofman MK, Weggemans RM, Zock PL, Schouten EG, Katan MB, Princen HM. 2004b. CYP7A1 A-278C polymorphism affects the response of plasma lipids after dietary cholesterol or cafestol interventions in humans. J Nutr 134: 2200-4 Horton JD, Cuthbert JA, Spady DK. 1995. Regulation of hepatic 7 alpha-hydroxylase expression and response to dietary cholesterol in the rat and hamster. The Journal of biological chemistry 270: 5381-7 Hubacek JA, Pitha J, Skodova Z, Poledne R, Lanska V, et al. 2003. Polymorphisms in CYP7A1, not APOE, influence the change in plasma lipids in response to population dietary change in an 8 year follow-up; results from the Czech MONICA study. Clin Biochem 36: 263-7 Hulcher FH, Margolis RD, Bowman DJ. 1978. Circadian rhythm of cholesterol-7alphahydroxylase and cortisol in the African green monkey (Cercopithecus aethiops). Biochim Biophys Acta 529: 409-18

29

Cheema SK, Cikaluk D, Agellon LB. 1997. Dietary fats modulate the regulatory potential of dietary cholesterol on cholesterol 7 alpha-hydroxylase gene expression. J Lipid Res 38: 315-23 Chen JY, Levy-Wilson B, Goodart S, Cooper AD. 2002. Mice expressing the human CYP7A1 gene in the mouse CYP7A1 knock-out background lack induction of CYP7A1 expression by cholesterol feeding and have increased hypercholesterolemia when fed a high fat diet. J Biol Chem 277: 42588-95 Chiang JY. 2002. Bile acid regulation of gene expression: roles of nuclear hormone receptors. Endocr Rev 23: 443-63 Ishibashi S, Schwarz M, Frykman PK, Herz J, Russell DW. 1996. Disruption of cholesterol 7alpha-hydroxylase gene in mice. I. Postnatal lethality reversed by bile acid and vitamin supplementation. J Biol Chem 271: 18017-23 Jiang XY, Zhang Q, Chen P, Li SY, Zhang NN, et al. 2012. CYP7A1 polymorphism influences the LDL cholesterol-lowering response to atorvastatin. J Clin Pharm Ther 37: 719-23 Kai M, Eto T, Kondo K, Setoguchi Y, Higashi S, et al. 1995. Synchronous circadian rhythms of mRNA levels and activities of cholesterol 7 alpha-hydroxylase in the rabbit and rat. J Lipid Res 36: 367-74 Kajinami K, Brousseau ME, Ordovas JM, Schaefer EJ. 2004. Interactions between common genetic polymorphisms in ABCG5/G8 and CYP7A1 on LDL cholesterol-lowering response to atorvastatin. Atherosclerosis 175: 287-93 Kajinami K, Brousseau ME, Ordovas JM, Schaefer EJ. 2005. A promoter polymorphism in cholesterol 7alpha-hydroxylase interacts with apolipoprotein E genotype in the LDLlowering response to atorvastatin. Atherosclerosis 180: 407-15 Klos KL, Sing CF, Boerwinkle E, Hamon SC, Rea TJ, et al. 2006. Consistent effects of genes involved in reverse cholesterol transport on plasma lipid and apolipoprotein levels in CARDIA participants. Arterioscler Thromb Vasc Biol 26: 1828-36 Kovar J, Suchanek P, Hubacek JA, Poledne R. 2004. The A-204C polymorphism in the cholesterol 7alpha-hydroxylase (CYP7A1) gene determines the cholesterolemia responsiveness to a high-fat diet. Physiol Res 53: 565-8 Ledvina M. 2009. Biochemie pro studující medicíny - I. a II. díl. Praha: Karolinum. 546 pp. Li T, Owsley E, Matozel M, Hsu P, Novak CM, Chiang JY. 2010. Transgenic expression of cholesterol 7alpha-hydroxylase in the liver prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Hepatology 52: 678-90 Lin JP, Myers RH, Almasy L, Coon HH, Arnett DK, et al. 2005. Linkage of the cholesterol 7alpha-hydroxylase gene and low-density lipoprotein cholesterol conditional on apolipoprotein E association: the National Heart, Lung, and Blood Institute Family Heart Study. Chin Med J (Engl) 118: 362-9

30

Mitropoulos KA, Balasubramaniam S, Gibbons GF, Reeves BE. 1972. Diurnal variation in the activity of cholesterol 7 -hydroxylase in the livers of fed and fasted rats. FEBS letters 27: 203-6 Monte MJ, Marin JJ, Antelo A, Vazquez-Tato J. 2009. Bile acids: chemistry, physiology, and pathophysiology. World J Gastroenterol 15: 804-16 Murray RK. 2002. Harperova biochemie. Praha: H & H. 872 pp. Myant NB, Mitropoulos KA. 1977. Cholesterol 7 alpha-hydroxylase. J Lipid Res 18: 135-53 Nakamoto K, Wang S, Jenison RD, Guo GL, Klaassen CD, et al. 2006. Linkage disequilibrium blocks, haplotype structure, and htSNPs of human CYP7A1 gene. BMC Genet 7: 29 Noshiro M, Nishimoto M, Morohashi K, Okuda K. 1989. Molecular cloning of cDNA for cholesterol 7 alpha-hydroxylase from rat liver microsomes. Nucleotide sequence and expression. FEBS letters 257: 97-100 Noshiro M, Nishimoto M, Okuda K. 1990. Rat liver cholesterol 7 alpha-hydroxylase. Pretranslational regulation for circadian rhythm. J Biol Chem 265: 10036-41 Noshiro M, Okuda K. 1990. Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding human cholesterol 7 alpha-hydroxylase. FEBS letters 268: 137-40 Pandak WM, Schwarz C, Hylemon PB, Mallonee D, Valerie K, et al. 2001. Effects of CYP7A1 overexpression on cholesterol and bile acid homeostasis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281: G878-89 Pikuleva IA. 2008. Cholesterol-metabolizing cytochromes P450: implications for cholesterol lowering. Expert Opin Drug Metab Toxicol 4: 1403-14 Pullinger CR, Eng C, Salen G, Shefer S, Batta AK, et al. 2002. Human cholesterol 7alphahydroxylase (CYP7A1) deficiency has a hypercholesterolemic phenotype. J Clin Invest 110: 109-17 Racek J. 1999. Klinická biochemie. Praha: Galén. 317 pp. Rao AS, Wong BS, Camilleri M, Odunsi-Shiyanbade ST, McKinzie S, et al. 2010. Chenodeoxycholate in females with irritable bowel syndrome-constipation: a pharmacodynamic and pharmacogenetic analysis. Gastroenterology 139: 1549-58, 58 e1 Reihner E, Angelin B, Rudling M, Ewerth S, Bjorkhem I, Einarsson K. 1990. Regulation of hepatic cholesterol metabolism in humans: stimulatory effects of cholestyramine on HMG-CoA reductase activity and low density lipoprotein receptor expression in gallstone patients. J Lipid Res 31: 2219-26 Rudel L, Deckelman C, Wilson M, Scobey M, Anderson R. 1994. Dietary cholesterol and downregulation of cholesterol 7 alpha-hydroxylase and cholesterol absorption in African green monkeys. J Clin Invest 93: 2463-72

31

Shinkyo R, Guengerich FP. 2011. Cytochrome P450 7A1 cholesterol 7alpha-hydroxylation: individual reaction steps in the catalytic cycle and rate-limiting ferric iron reduction. The Journal of biological chemistry 286: 4632-43 Schwarz M, Lund EG, Setchell KD, Kayden HJ, Zerwekh JE, et al. 1996. Disruption of cholesterol 7alpha-hydroxylase gene in mice. II. Bile acid deficiency is overcome by induction of oxysterol 7alpha-hydroxylase. J Biol Chem 271: 18024-31 Vaverkova H, Soska V, Rosolova H, Ceska R, Cifkova R, et al. 2007. [Czech Atherosclerosis Society Guidelines for the diagnosis and treatment of dyslipidemias in adults]. Vnitrni lekarstvi 53: 181-7, 89, 91-3 passim Wang J, Freeman DJ, Grundy SM, Levine DM, Guerra R, Cohen JC. 1998. Linkage between cholesterol 7alpha-hydroxylase and high plasma low-density lipoprotein cholesterol concentrations. J Clin Invest 101: 1283-91 Wei KK, Zhang LR, Zhang Y, Hu XJ. 2011. Interactions between CYP7A1 A-204C and ABCG8 C1199A polymorphisms on lipid lowering with atorvastatin. J Clin Pharm Ther 36: 725-33 Wilson JD, Lindsey CA, Jr. 1965. Studies on the influence of dietary cholesterol on cholesterol metabolism in the isotopic steady state in man. The Journal of clinical investigation 44: 1805-14 Xiang X, Backman JT, Neuvonen PJ, Niemi M. 2012. Gender, but not CYP7A1 or SLCO1B1 polymorphism, affects the fasting plasma concentrations of bile acids in human beings. Basic Clin Pharmacol Toxicol 110: 245-52

Internetové zdroje: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=cyp7a1, 14.5.2013

32