Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina
EDWIN CAHYADI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
1
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2013 Edwin Cahyadi NIM G84062557
ABSTRAK EDWIN CAHYADI. Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina. Dibimbing oleh Prof Dr.drh Maria Bintang, MS dan Sri Rachmawati, BSc, MSc. Melamin adalah suatu senyawa organik yang berbentuk kristal putih dan agak sulit terlarut dalam air. Metode validasi adalah suatu prosedur yang digunakan untuk membuktikan hasil suatu metode analisis bersifat valid, akurat dan tepat. Parameter validasi metode antara lain meliputi kesesuaian sistem, linearitas, recovery (perolehan kembali), limit deteksi, dan limit kuantifikasi. Metode analisis Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry (LCMS) dengan standar melamin memiliki ketelitian dan ketepatan yang baik dengan nilai simpangan baku relatif 1.18% (uji kesesuaian sistem) dan rerata perolehan kembali yang dihasilkan sebesar 89,13 ± 9,47%. Limit deteksi (LOD) dan limit kuantifikasi (LOQ) didapatkan masing-masing yaitu 5 ppb dan 7 ppb, linearitas dengan persamaan garis y = 71343428 + 1371748x dan koefisien korelasi (r) 0,9367. Pengujian toksisitas larva udang pada melamin di dapatkan LC50 berada pada kisaran antara 0,02 ppm-0,1 ppm (0,02 ppm ≤ LC50 ≤ 0,1 ppm ) dan jika menggunakan program microsoft excel diperoleh LC50 sebesar 0,036 ppm atau 0,036 µg/mL. Nilai LC50 tersebut menunjukkan bahwa melamin termasuk kriteria yang tergolong toksik. Kata kunci: Brine Shrimp Lethality Test, melamin, toksisitas, uji Validasi
ABSTRACT EDWIN CAHYADI. Validation Test of Melamine in Milk Powder by LC-MS method (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) and Artemia salina toxicity test. Supervised by Prof. Dr.drh Maria Bintang, MS and Sri Rachmawati, BSc, MSc. Melamine is an organic compound in the form of white crystals and a bit difficult to dissolve in water. Method validation is a procedure that is used to prove the results of an analytical method is valid, accurate and precise. Parameter validation methods include system suitability, linearity recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ). Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry (LCMS) analysis method with a standard melamine has good accuracy and precision with a relative standard deviation value of 1.18% (system suitability test) and the mean recovery generated by 89.13 ± 9.47%. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) obtained respectively at 5 ppb and 7 ppb, linearity with line equation y = 71,343,428 + 1371748x and correlation coefficient (r) 0.9367. The result of BSLT get LC50 are in range 0.02-0.1 ppm (0.02 ppm ≤ LC50 ≤ 0.1 ppm) and if using microsoft excel program LC50 obtained at 0.036 ppm or 0.036 µg / mL. LC50 values showed that was toxic. Keywords: Brine Shrimp Lethality Test, melamine, toxicity, test validation
2
Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina
EDWIN CAHYADI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
1
Judul Skripsi : Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina Nama : Edwin Cahyadi NRP : G84062557
Disetujui oleh
Prof Dr.drh Maria Bintang, MS Pembimbing I
Sri Rachmawati, BSc, MSc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang maha kuasa atas rahmat dan berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini hingga selesai penulisan skripsi yang berjudul Uji Validasi Melamin dalam Susu Bubuk dengan Metode LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry) dan Uji Toksisitas pada Artemia salina. Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaksanakan mulai bulan Juni sampai Desember 2012 yang bertempat di laboratorium toksikologi Balai Besar Penelitian Veteriner. Penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada ibu Prof Dr.drh Maria Bintang, MS selaku dosen pembimbing saya di biokimia yang telah, memeriksa draft skripsi saya di waktu kesibukan beliau dan juga memberikan semangat kepada saya untuk secepatnya menyelesaikan penelitian ini, serta kepada ibu Sri Rachmawati, BSc, MSc selaku pembimbing dari Laboratorium Toksikologi, Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET), yang telah sabar membimbing saya, menasehati saya dan mengarahkan saya dalam penulisan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada drh. Prima Mei Widiyanti, Bapak Mihardja atas semua bantuannya selama saya penelitian di Laboratorium Toksikologi, Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET). Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kakak saya tercinta yaitu kak Selvi Novianti dan mama Yeyen sebagai mama angkatku tersayang atas bantuan dan perhatiannya dalam proses pengerjaan skripsi. Serta ucapan terima kasih kepada seluruh pengajar dan murid di bimbel MAFIA CLUBS IPB yang selalu memberikan motivasi untuk menyelesaikan penelitian dan skripsi ini. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Bogor, Februari 2013
Edwin Cahyadi
3
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Analisis Data
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Kesesuaian Sistem
4
Linearitas
4
Recovery
5
Limit of Detection (LOD)
6
Limit of Quantitation (LOQ)
6
Toksisitas Melamin terhadap Larva udang
7
Pembahasan
8
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR TABEL 1 Hasil Uji Kesesuaian Sistem 2 Hasil Uji Recovery 3 Hasil Uji Limit of Quantitation (LOQ) 4 Data kesesuaian sistem 5 Data linearitas 6 Data pengamatan toksisitas
4 5 7 17 18 19
DAFTAR GAMBAR 1 Hubungan antara konsentrasi melamin dengan luas area 2 Luas Area Puncak 5 ppb 3 Hubungan antara persen kematian dengan konsentrasi
5 6 7
DAFTAR LAMPIRAN 1 Diagram alir penelitian 2 Proses ekstraksi melamin 3 Diagram alur uji toksisitas 4 Data kesesuaian sistem 5 Hasil perhitungan data recovery 6 Data uji linearitas 7 Hasil pengamatan Toksisitas
14 15 16 17 18 19 20
1
PENDAHULUAN Pada tahun 2008, kadar melamin dalam jumlah besar ditemukan pada berbagai jenis pangan asal Cina, yaitu susu formula bayi, produk susu olahan cair, bubuk (misal permen berbasis susu, produk kopi bubuk instant, biskuit, coklat, dan minuman berbasis susu) serta berbagai produk bukan berbasis susu (amonium bikarbonat, pakan hewan, ingredien pakan, tepung telur, telur mentah serta krimer bukan susu)(Chen 2009). Melamin adalah suatu senyawa organik dengan berat molekul 126.12, berbentuk kristal putih dan agak sulit terlarut dalam air. Penambahan melamin ditujukan untuk meningkatkan kadar nitrogen karena melamin memiliki kandungan nitrogen yang tinggi (66%) sehingga pada saat susu diperiksa seolaholah susu mempunyai kandungan protein yang tinggi, karena secara umum kandungan protein ditetapkan dengan cara menentukan kandungan nitrogennya. FDA (Food and Drugs Administration) dari Amerika Serikat dan WHO menetapkan Tolerable Daily Intake (TDI) yang dapat ditoleransi dalam 1 hari dari melamin sebesar 0.2 mg per kg berat badan manusia. Toksisitas melamin disebabkan oleh kandungan asam sianurat yang umumnya terdapat bersama-sama melamin. Jika melamin di konsumsi secara berlebihan akan menyebabkan komposisi antara formaldehid dengan fenol menjadi tidak seimbang maka dari itu akan terjadi residu, yaitu monomer formaldehid atau fenol yang tidak bersenyawa sempurna. Analisis terhadap melamin dapat ditentukan melalui berbagai metode, salah satunya adalah Liquid Chromatography-Mass Spectrofotometry (LC-MS) (Turnipseed 2008). LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrofotometry) adalah teknik analisis kimia yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik dari Liquid Chromatography (LC) dengan kemampuan analisis massa dari Mass Spectrometry (MS). Pemisahan senyawa terjadi pada sistem Liquid Chromatography (LC) menggunakan fase gerak berupa cairan yang terikat secara kimia pada penyangga halus (fase diam) dan berupa cairan (fase gerak) yang dipaksa mengalir dengan laju terkendali memakai tekanan tinggi. Setelah terjadi pemisahan, senyawa dalam larutan diubah menjadi gas dan dideteksi oleh detektor spektrometri massa. Di Indonesia sendiri belum banyak industri maupun laboratorium uji yang menggunakan metode LC-MS dalam menganalisis melamin. Sehingga diperlukan kajian metode analisis melamin secara laboratorium lebih lanjut. Metode penentuan melamin dalam susu formula menggunakan LC-MS harus divalidasi terlebih dahulu untuk menjamin keabsahan hasil analisis. Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Metode yang tidak resmi yang akan digunakan dalam pengujian harus di validasi sehingga dapat dibuktikan metode tersebut dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah pada kondisi aktual yang digunakan. Validasi bertujuan untuk menjamin bahwa metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal sehingga dapat dipercaya. Parameter validasi metode antara lain meliputi kesesuaian sistem, recovery (perolehan kembali), linearitas, limit deteksi, dan limit kuantifikasi (Istiqlalah 2004).
2
Setelah melakukan uji validasi, penelitian ini juga melakukan uji toksisitas melamin dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan metode pengujian toksisitas suatu bahan dengan organisme uji berupa nauplius (larva) Artemia salina Leach. Penelitian dengan menggunakan metode BSLT memiliki beberapa keuntungan diantaranya cepat, mudah, dan biaya yang relatif murah jika dibandingkan dengan metode lain. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan mendeteksi melamin yang valid dan menguji biotoksisitas melamin dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) pada Artemia salina. Metode uji validasi yang dilakukan valid untuk analisis melamin pada susu dan melamin bersifat toksik terhadap larva udang yang diuji dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
METODE Bahan Bahan yang digunakan adalah susu bubuk yang telah tersedia di BBALITVET, Bogor, asetonitril, asam formiat 2.5 %, amonium asetat, melamin, susu bubuk, Artemia salina leach dan air laut. Alat Alat-alat yang digunakan yaitu LC-MS 2010 EV, Shimadzu Liquid Chromatography Mass Spectrofotometry, pipet volumetrik, tabung vial, tabung ependorf, sentrifus, aerator, vortex, labu takar, erlenmeyer, socorex 0-150 µL, socorex 100-1000 µL, dan neraca kalibrasi. Prosedur Analisis Data Pembuatan Fase Gerak Sebanyak 7.6 g sampel amonium asetat (NH4CH3COO) di timbang dan di masukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL. Kemudian ditambahkan aquades hingga batas dan larutan tersebut di sonikasi terlebih dahulu selama 10 menit. Preparasi Standar Persiapan Standar Baku Melamin Labu ukur 10 mL di siapkan dan di bilas dengan metanol. Melamin di timbang dengan neraca analitik mettler BSIAR untuk 1000 ppm sekitar 10.4120 mg. Lalu dilarutkan dengan metanol sampai 10 ml sedikit demi sedikit dengan sepatu timbang, lalu di vorteks sampai larut. Ekstraksi Melamin Sampel susu sebanyak 2,0 ± 0.1 dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 50 mL. Kemudian di tambahkan 14 mL asam format 2.5 % dalam air. Lalu Tabung ditutup, dam di kocok-kocok selama 15-30 detik, kemudian di kocok lagi dengan menggunakan vortex mixer selama 30 menit. Setelah itu, sampel di sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit di suhu ruang. Supernatan di pindahkan sebanyak 1.4 mL ke dalam 1.5 mL tabung sentrifius. Lalu di sentrifugasi lagi pada 13000
3
rpm selama 30 menit. Kemudian di ambil semua supernatan dan di pindahkan ke dalam tabung ependorf. Setelah itu, di encerkan ekstrak dengan asetonitril (50 µL ekstrak + 950 µL asetonitril) lalu di vortex selama 30 detik dan sentrifugasi lagi pada 5900 rpm selama 30 menit. Supernatan di pindahkan ke autosampler vial 2 mL siap untuk di suntikan ke alat LC-MS. Uji Validasi Uji Kesesuaian Sistem Larutan baku melamin dengan konsentrasi 0,5 ppm disuntikkan sebanyak 10 µL dan diukur puncak area. Pengerjaan diulangi sampai tujuh kali pengulangan, dan luas puncak yang diperoleh, dihitung simpangan baku relatifnya. Uji Linearitas Pada uji linearitas dibuat larutan yang terdiri dari lima konsentrasi yang berbeda. Pembuatan larutannya yaitu sebanyak 10 µL, 20 µL, 40 µL, 100 µL, 200 µL larutan baku melamin 50 ppm diencerkan menjadi 2 ml pelarut asetonitril untuk mendapatkan konsentrasi 0.25, 0.5, 1, 2,5 dan 5 ppm. Larutan siap di injek ke dalam alat LC-MS. Selanjutnya hasil peak area dari masing-masing konsentrasi di plot terhadap konsentrasi ( konsentrasi versus luas area). Uji Perolehan Kembali (Recovery) Sampel di buat dengan konsentrasi akhir yang di injek ke alat 0.5 ppm. Sebanyak 2 gram sampel susu bubuk diekstrak dengan 14 ml asam format kemudian di tambahkan 280 µL standar baku melamin (1000 ppm) lalu dikocok selama 30 menit. Sampel disentrifius pada 4000 rpm selama 10 menit di ruangan temperatur. Pindahkan supernatan sebanyak 1.4 mL ke dalam 1.5 mL tabung sentrifius. Lalu di sentrifius lagi pada 13000 rpm selama 30 menit. Lalu diambil semua supernatan dan di pindahkan ke dalam tabung ependorf. Di pipet 50 µL ekstrak + 950 µL asetonitril lalu di vortex selama 30 detik dan sentrifius lagi pada 5900 rpm selama 30 menit. Lalu sampel siap untuk di analisis, di suntikan ke alat LC-MS. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) Perhitungan batas deteksi diperoleh melalui konsentrasi terendah analit terdeteksi yang dapat terdeteksi dan batas kuantitasi di hitung dari limit deteksi + 10 x standar deviasi dari 9x pengulangan dari injeksi konsentrasi limit deteksi. Uji Toksistas Uji toksisitas melamin dengan BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test) Sebanyak ± 20 mg telur A. salina dimasukkan ke dalam wadah penetasan yang berisi air laut buat dan diberi penyinaran serta aerator. Setelah 24 jam telur
4
yang sudah menetas menjadi larva (nauplii) dipindahkan ke wadah lain, naupili tersebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji. Sebanyak 30 ekor larva A. salina dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10 mL uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) yang berisi air laut dan dibuat konsentrasi ekstrak melamin 0 ppm, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 2 kali pengulangan. Larutan diaduk sampai homogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel melamin. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva udang yang mati dengan bantuan lampu bohlam dan kaca pembesar. Grafik dibuat dengan menghubungkan konsentrasi dan persen kematian larva. Nilai LC50 diperoleh dengan cara menarik garis pada nilai 50% dari sumbu persen kematian sampai memotong sumbu grafik, perpotongan garis di tarik ke garis konsentrasi zat yang menyebabkan kematian larva 50%.
Hasil Kesesuaian Sistem Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum suatu sistem analisis digunakan dengan tujuan untuk memastikan keefektifan sistem operasional akhir. Uji kesesuaian sistem harus dilakukan secara rutin untuk menentukan bahwa sistem analisis beroperasi secara benar. Menurut farmakope Amerika, suatu sistem dikatakan sesuai jika memenuhi persyaratan presisi dari salah satu uji berikut, yakni resolusi, presisi, faktor asimetri puncak, efisiensi kolom, atau faktor kapasitas (Reynilda 2008). Hasil uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 1 . Tabel 1 Hasil Uji Kesesuaian Sistem Luas Puncak Waktu Rata‐rata (Area) Retensi (menit) 1,388 1,388 1,387 1,384 1,385 1,382 1,385
1272325 1280330 1310298 1294215 1306307 1308049 1308663
1297169,57
Simpangan Baku (SB)
Simpangan Baku Relatif (SBR)
15361,5456
1,18
Linearitas Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas biasanya dinyatakan sebagai variasi sekitar kemiringan (slope) dari garis regresi yang diperhitungkan sesuai dengan rumus matematika. Kelinearan suatu metode harus diuji untuk membuktikan adanya hubungan linear antara konsentrasi analit dengan respon instrumen. (Hartutik 2007). Kurva kalibrasi melamin dapat dilihat pada gambar 1.
5
Gambar 1 Hubungan antara Konsentrasi Melamin dengan Luas Area.
Recovery Perolehan kembali (recovery) menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis terhadap kadar zat yang sebenarnya. Akurasi merupakan ukuran ketepatan metode analisis dan biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali. Perolehan kembali ditetapkan dengan cara menambah analit dalam jumlah tertentu ke dalam tempat yang mengandung analit yang sama dan ditentukan harga persen perolehan kembali. Untuk analisis, harga persen perolehan kembali antara 80-120 %. Makin dekat hasil analisis yang diperoleh dengan nilai sebenarnya, maka akurasinya semakin tinggi (Istiqlalah 2004). Hasi uji recovery dapat di lihat pada Tabel 2. Tabel 2 Hasil Uji Recovery Konsentrasi yang di tambahkan 0.5 µg/g 0.5 µg/g 0.5 µg/g
Ulangan 1 2 3
Luas Puncak (Area) 1272325 1308663 1389934
Kosentrasi yang ditemukan 0.41 0.43 0.49 rata-rata
% Recovery 82 86.8 98.6 89.13
6
Limit of Detection (LOD) Limit of Detection (LOD) adalah suatu metode analisis yang menunjukkan nilai parameter uji batas, yaitu konsentrasi analit terendah yang dapat di deteksi, tetapi tidak dikuantitasi pada kondisi percobaan yang dilakukan. Batas ambang deteksi dinyatakan dalam konsentrasi analit dalam sampel. Batas deteksi adalah batas kadar terkecil yang masih dapat dideteksi oleh alat dan menghasilkan respon yang bermakna. cara yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi yaitu berdasarkan evaluasi visual. Dapat digunakan untuk metode analisis non instrumental dan instrumental. Batas deteksi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap zat uji yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan kadar terendah yang dapat dideteksi dengan baik (Reynilda 2008).
Gambar 2 Luas Area pada 5 ppb.
Limit of Quantification (LOQ) Batas ambang kuantitasi (Limit of Quantitation) adalah konsentrasi analit terkecil yang dapat dikuantitasi secara cermat dan seksama. Batas kuantitasi metode perlu ditentukan kalau metode tersebut digunakan untuk menganalisis sampel yang mengandung analit berkadar rendah. Cara yang dapat digunakan untuk menentukan batas kuantitasi, yaitu berdasarkan evaluasi visual. Dapat digunakan untuk metode analisis non instrumental dan instrumental. Batas kuantitasi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap zat uji yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima. dari suatu metode analisis adalah nilai parameter penentuan kuantitatif senyawa yang terdapat dalam konsentrasi rendah dalam matriks. Batas ambang kuntitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi eksperimen yang ditentukan. Batas ambang kuantitasi dinyatakan dalam konsentrasi analit dalam sampel (Hartutik 2007).
7
Tabel 3 Hasil Uji LOQ (Limit of Quantification) Luas Puncak Ulangan Konsentrasi (Area) 1 5 ppb 157399 2 5 ppb 158803 3 5 ppb 169705 4 5 ppb 157505 5 5 ppb 161493 6 5 ppb 148119 7 5 ppb 158641 8 5 ppb 156962 9 5 ppb 148790 rata-rata 157490,7778
RSD ( Relatif Standar Deviasi) 6442,7471
LOQ = LOD + (10 x SDV) x LOD luas area = 5 + 10.6442.7 x 5 157490 = 7 ppb Toksisitas Melamin pada Larva Udang Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan metode pengujian toksisitas suatu bahan dengan Artemia salina Leach. Metode ini cukup praktis, cepat, mudah, murah dan cukup akurat. Pemeriksaan toksisitas diperlukan untk mengetahui konsentrasi yang dapat menyebabkan keracunan sehingga dapat diketahui jumlah penggunaan konsentrasi yang tepat. Tingkat konsentrasi yang dapat menyebabkan keracunan ditentukan dengan letal konsentrasi 50 (LC50). Lc50 adalah konsentrasi dari suatu bahan yang menyebabkan 50 % kematian dalam suatu populasi. Lc50 dapat digunakan untuk menentukan toksisitas dari suatu zat. Hasil kuva toksisita melamin dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar 3 Hubungan antara Persen kematian (%) dengan konsentrasi (ppm)
8
Pembahasan Validasi suatu metode analisis yang dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Selain itu, agar proses pemeriksaan suatu produk mencapai hasil sesuai dengan spesifikasi yang telah ditentukan sebelumnya. Hal tersebut dilakukan untuk mengidentifikasi validasi yang perlu dilakukan sebagai bukti pengendalian terhadap aspek kritis dari kegiatan yang dikerjakan, sehingga metode analisis yang telah divalidasi dapat digunakan secara rutin dan menghasilkan data yang dapat diandalkan kebenarannya. Menurut International Conference on Harmonisation (ICH 1994), parameter validasi yang diuji meliputi uji kesesuaian sistem, linearitas, recovery, limit deteksi dan limit kuantitasi (Ibrahim 2001). Pengujian pertama yang dilakukan yaitu uji kesesuaian sistem yang perlu dilakukan sebelum suatu sistem analisis digunakan dengan tujuan untuk memastikan keefektifan sistem operasional akhir. Uji kesesuaian sistem harus dilakukan secara rutin untuk menentukan bahwa sistem analisis beroperasi secara benar. Menurut farmakope Amerika, suatu sistem dikatakan sesuai jika memenuhi persyaratan presisi dari salah satu uji berikut, yakni resolusi, presisi, faktor asimetri puncak, efisiensi kolom, atau faktor kapasitas (Reynilda 2008). Pengujian ini didasarkan pada suatu konsep bahwa elektronik, peralatan, zat uji, dan kondisi operasional analisis membentuk satu sistem analitik tunggal yang dapat diuji fungsinya secara keseluruhan. Hasil uji kesesuaian sistem yang dapat dilihat pada Tabel 1 menunjukkan bahwa Nilai SBR (Simpangan Baku Relatif) hasil pengukuran adalah 1.18 % dan memenuhi kriteria penerimaan parameter ketelitian menurut ICH (1994) dan ASEAN (1996), yaitu SBR harus lebih kecil atau sama dengan 2.0%. Metode ini berdasarkan nilai SBR yang diperoleh termasuk teliti, artinya setiap hasil analisis yang dilakukan secara berulang memiliki nilai yang tidak jauh berbeda. Pengujian berikutnya yaitu lineritas. Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode adalah ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara konsentrasi standar melamin dan luas puncak yang merekomendasikan minimal lima deret konsentrasi larutan standar harus digunakan untuk mengevaluasi linearitas (ICH 1994). Koefisien korelasi, kemiringan (slope), dan intersep-y harus dilaporkan (Iatiqlalah 2004). Kurva standar yang diperoleh dari Tabel 3 memiliki persamaan garis y = 71343428 + 1371748x dan koefisien korelasi (r) 0,9367 (Gambar 1). Nilai r yang diperoleh mendekati satu sehingga dapat dikatakan bahwa kurva memiliki kelinearan yang tinggi, artinya dengan meningkatnya konsentrasi melamin maka luas puncak juga akan mengalami kenaikan yang linear. Menurut ICH (1994), nilai r yang dihasilkan telah memenuhi persyaratan, yaitu harus lebih dari 0.90. Ketepatan dapat dilihat berdasarkan nilai recovery standar yang ditambahkan ke dalam contoh dengan menggunakan metode penambahan standar. Persen perolehan kembali tidak harus 100%, tetapi perolehan kembali analit menggunakan internal standar harus konsisten dan presisi. Penentuan perolehan kembali diperoleh dari membandingkan hasil analisis dari 3 konsentrasi sampel (rendah, medium, tinggi). Respon analit harus dapat diidentifikasi dengan kriteria
9
akurasi 80–120% (ICH 1994). Data hasil uji ketepatan dapat dilihat pada Tabel 3 dan perhitungannya berada pada lampiran 4. Rerata hasil recovery melamin yang ditambahkan untuk tiga konsentrasi berada di antara kisaran tersebut, yaitu 89,13 ± 9,47%. Hal ini menunjukkan bahwa metode ini tepat untuk menganalisis melamin karena memenuhi persyaratan ICH. Limit of Detection (LOD) didefinisikan sebagai sebagai konsentrasi analit terkecil yang memberi sinyal instrumen yang berbeda secara nyata dari sinyal blanko dan sinyal latar belakang (Ibrahim 2001). Sedangkan menurut Reynilda (2008), LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi sangat penting dalam analisis untuk menentukan jumlah kontaminan yang ada di bawah atau di atas batas yang diperbolehkan. Batas deteksi merupakan kriteria dalam pemilihan metode tersebut (Ibrahim 2001). Limit of Quantitation (LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terkecil yang dapat dikuantisasi secara cermat dan seksama (Ibrahim 2001). Seperti halnya batas deteksi, batas kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linear. Semakin kecil nilai LOD dan LOQ menunjukkan semakin sensitifnya suatu metode pada penelitian ini, nilai LOD diperoleh dari pengamatan secara visual, kurva kosentrasi 5 ppb melamin masih memberikan kromatogram yang baik (Lampiran 5) dan LOQ dianalisis secara statistik melalui luas puncak kurva dengan 9 kali ulangan injeksi konsentrasi limit deteksi 5 ppb di tambah dengan hasil 10 kali Standar Deviasi (SD) dengan . Sensitivitas metode ini terlihat dari perolehan nilai LOD = 5 ppb dan LOQ = 7 ppb. Larva udang A. Salina yang digunakan untuk uji toksisitas diperoleh dari hasil penetasan menggunakan air laut dengan bantuan aerator untuk menjaga kecukupan kadar oksigen yang terlarut. Gelembung udara dari aerator berfungsi sebagai pengaduk telur sehingga telur tidak mengendap di dasar wadah. Penggunaan aerator tersebut dikarenakan telur akan sulit menetas jika oksigen dalam air kurang. Selain itu dilakukan penyinaran selama proses penetasan yang berfungsi untuk menjaga kondisi air. Umur larva udang yang digunakan adalah 24 jam setelah menetas. Kondisi membran sel larva udang A. Salina pada umur tersebut masih lunak sehingga memudahkan senyawa asing dalam air masuk ke dalam tubuh larva udang A. Salina dan akan menyebabkan kematian. Kematian dari larva udang A. Salina yang disebabkan oleh senyawa asing dalam air tersebut yang menjadi dasar untuk pengujian toksisitas (Moon 1992). Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan karena mudah, cepat, murah dan cukup reproducible. Menurut Meyer (1982), senyawa bahan alam dapat dikatakan sangat toksik bila nilai LC50 < 30 µg/mL, dan toksik bila nilai LC50 < 1000 µg/mL. LC50 (Lethal Concentration 50) merupakan konsentrasi zat yang menyebabkan terjadinya kematian pada 50% hewan percobaan yaitu larva Artemia salina Leach. Hasil pengujian toksisitas larva udang pada melamin di dapatkan LC50 berada pada kisaran 0,02 - 0,1 ppm (0,02 ppm ≤ LC50 ≤ 0,1 ppm) yang dapat di lihat pada Gambar 3, sehingga dapat dikatakan standar melamin itu termasuk sangat toksik karena ukuran dari hewan uji coba terlalu kecil. Hasil pengamatan uji toksisitas larva udang terhadap melamin dapat dilihat pada Tabel 6.
10
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Metode analisis LCMS dengan standar melamin memiliki ketelitian dan ketepatan yang baik dengan nilai simpangan baku relatif 1.18% (uji kesesuaian sistem) dan rerata perolehan kembali yang dihasilkan sebesar 89,13 ± 9,47%. Limit deteksi dan limit kuantifikasi metode adalah 5 ppb dan 7 ppb, linearitas dengan persamaan garis y = 71343428 + 1371748 x dan koefisien korelasi (r) 0,9367. Melamin tergolong toksik dengan nilai LC50 sebesar 0,036 ppm atau 0,036 µg/mL. Metode analisis LC-MS yang telah dilakukan memiliki hasil yang valid. Saran Perlu dilakukan uji keterulangan dan uji toksisitas melamin in vivo pada hewan coba seperti mencit. Selain itu juga, diperlukan pengujian analisis sampel susu formula yang sesuai dengan standar baku pemerintah. DAFTAR PUSTAKA Andersen WC, Turnipseed SB, Karbiwnyk CM, Clark, SB, Madson MR, Gieseker CM, Miller RA, Rummel NG, Reimschuessel R. 2008. Determination and Confirmation of Melamine Residues in Catfish, Trout, Tilapia, Salmon and Shrimp by LC-MS-MS. J. Ag. Food Chem 56: 4340. Briggle T V, Allen L M, Duncan R C. 1981. High performance liquid chromatographic determination of cyanuric acid in human urine and pool water. J Assoc Off Anal Chem 64, 1222-1226. Carbas P, Meloni M, Spaneedda L. 1990. High-performane liquid chromatographic separation of cyromazine and its metabolite melamine. J Chromatography 505(2), 413-416. Chen J S. 2009. A worldwide food safety concern in 2008. melaminecontaminated infant formula in China caused urinary tract stone in 290000 children in China. Chinese Medical Journal 122(3), 243-244. Chozin AS, Sutarno, Ruslan K. 1996. Uji Brine shrimp dan analisis kandungan kimia fraksi ekstrak etanol 95 % dan suren Toona Sureni (BL) Merr. Prosiding Simposium Penelitian bahan obat alami, Perhipba Balittro, Bogor : 537-577. Davidson M B, Thakkar S, Hix J. 2004. Pathophysiology, clinical consequences, and treatment of tumor lysis syndrome. Am J Med 116, 546-554. Debesis, E. et al., 1982. Submitting HPLC methodes to the compendia and regulatory agencies. Pharm.Tech., September. p. 120 Ehling S Tefera S, Ho I P 2007. High-performance liquid chromatographic method for the simultaneous detection of the adulteration of cereal flours with melamine and related triazine by-products ammeline, ammelide, and cyanuric acid. Food Addit Contam 24, 1319-1325.
11
Filigenzi M S, Tor E R, Poppenga R H. 2007. The determination of melamine in muscle tissue by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 21, 4027-4032. Hartutik ES. 2007. Validasi metode penerapan kadar vitamin B12 (sianokobalamin) pada produk bubur bayi secara mikrobiologi [laporan PL]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Heller, DN, Nochetto, C. 2003. Simultaneous Determination and Confirmation of Melamine and Cyanuric Acid in Animal Feed by Zwitterionic HILIC Chromatography and Tandem Mass Spectrometry, in press, Rapid Commun. Mass Spectrom. Iatiqlalah A. 2004. Validasi metode analisis penetapan kadar pirazinamida secara KCKT [Laporan PL]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Ibrahim S. 2001. Penggunaan Statistika dalam Validasi Metode Analitik dan Penerapannya. Dalam Prosiding temu ilmiah nasional bidang Farmasi. VI – 15. International Conference on Harmonisation [ICH]. 1994. Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology. WWW ICH. [terhubung berkala]. http://www.ich.org [9 Jan 2006]. Jutzik, Cook A M, Hutter R. 1982. The degradative pathway of the s-triazine melamine. The steps to ring cleavage. Biochemistry Journal 208(3), 679684. Meyer BN et al. 1982. Brine Shrimps: A Comvenient General Booasaay for active Plant Constituent. Planta Med 45:31-34. Moon CK, Park KS. 1992. Drug and chemical toxicology. Drug Chem. Toxicol. 15 (1):81-91. Patel K, Jones K. 2007. Analytical method for the quantitative determination of cyanuric acid as the degradation product of sodium dichloroisocyanurate in urine by liquid chromatography mass spectrometry. J Chromatogr B 853, 360-363. Pujiati I, Ningsih S, Palupi S. 2002. Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia salina leach. Dari fraksi n-heksan, kloroform, etil asetat, dan air ekstrak etanol rimpang temumangga. (Prosiding Seminar Nasional Tumbeuhan Obat Indonesia ). Universitas Surabaya. Surabaya :109-115. Reynilda J. 2008. Validasi metode analisis penetapan kadar clindamycin dalam librodan kapsul secara HPLC [Laporan PL]. Surabaya: Fakultas Farmasi, Universitas Surabaya. Sancho J V, Ibanez M, Grimalt S. 2010. Residue determination of cyromazine and its metabolite melamine in chard samples by ion-pair liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta 530, 237-243. 94 MIAO AND FAN ET AL. Smoker M, Krynitsky A J 2008. LIB_Interim Method for Determination of Melamine and Cyanuric Acid Residues In Foods using LC_MS_MS: Version 1.0. Laboratory Information Bulletin No. 4422, October 2008. accessed at http://www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4421.html.
12
Turnipseed S, Casey C, Nochetto C. 2008. Determination of Melamine and Cyanuric Acid Residues in Infant Formula using LC-MS/MS. Laboratory Information Bulletin No. 4421, Volume 24, October 2008. accessed at http://www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4421.html. Vail T, Jones P R, Sparkman O D. 2007. Rapid and unambiguous identification of melamine in contaminated pet food based on mass spectrometry with four degrees of confirmation. J Anal Toxicol 31, 304-312. World Health Organization (WHO). 2008. Expert meeting to review toxicological aspects of melamine and cyanuric acid, Ottawa, Canada, 1-4 December 8, Overall conclusion and recommands. (Accesed at http://www.who.int/foodsafety/fs_management/conclusions_recommendatio n.pdf). Yokley R A, Mayer L C, Rezaaiyan R. 2000. Analytical method for the determination of cyromazine and melamine residues in soil using LC-UV and GCMSD. J Agric Food Chem 48, 3352-3358.
13
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram Alur Penelitian Pembuatan fase gerak
Persiapan standar baku melamin
Ekstraksi melamin
Uji validasi
Toksisitas melamin dengan Artemia salina
15
Lampiran 2 Proses Ekstraksi Melamin
EKSTRAKSI MELAMIN 2.0 ± 0.1 gram sampel Masukkan ke tube 50 mL 14 mL asam format 2.5 % dalam air Tabung di tutup Vortex mixer 30 menit
Sentrifus pada 5000 rpm selama 10 menit, suhu ruang
Pindahkan 1.4 mL supernatan dalam 1.5 mL tube
Sentrifus 5900 rpm selama 30 menit
Pindahkan semua supernatan ke dalam 1.5 mL tube
Encerkan ekstrak dengan asetonitril (50 µL ekstrak + 950 µL asetonitril) Vortex selama 30 menit Lalu sentrifus 13.000 rpm selama 30 menit, pindah ke autosampler vial 2 mL (hindari pengendapan)
16
Lampiran 3 Diagram alur uji toksisitas Pembuatan Larutan Sampel Sampel melamin
0 ppm, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm Penyiapan Larutan Sampel (500 ppm) 50 µL Sampel melamin
Labu ukur 100 mL lalu ditera dengan air laut
500 ppm (50 µL /100 mL)
Penyemaian benur udang Di beri ± 30 mg telur udang/500 mL
Disemaikan dalam labu kocok t = 24 jam, di bawah sinar lampu + aerator
Uji toksisitas larva udang Di siapkan botol 10 mL sebanyak 14 yang berisi air laut buatan
Di buat 5 konsentrasi 0, 0.02 ppm, 0.1 ppm, 0.5 ppm, 1 ppm, 2 ppm lalu di masukkan ke dalam botol yang telah disediakan
Tiap konsentrasi akan dimasukkan 30 ekor larva udang
Larva udang di inkubasi selama 24 jam di bawah sinar lampu
17
Lampiran 4 Data kesesuaian sistem Tabel 4 Data Perhitungan Kesesuaian Sistem X
x-
(x-
1272325
-24844,5
617249180,3
1280330
-16839,5
283568760,3
1310298
13128,5
172357512,3
1294215
-2954,5
8729070,25
1306307
9137,5
83493906,25
1308049
10879,5
118363520,3
1308663
11493,5
132100542,5
18
Lampiran 5 Hasil Perhitungan Data Recovery 1. Y = 1272325 Y = a + bx 1272325 = 713428,3641 + 1371748.019 x x = 1272325 - 713428,3641 1371748.019 x = 0.41 x = 0.41 x 100 % 0.5 = 82 % 2. Y = 1308663 Y = a + bx 1308663 = 713428,3641 + 1371748.019 x x = 1308663 - 713428,3641 1371748.019 x = 0.43 x = 0.43 x 100 % 0.5 = 86.8 % 3. Y = 1389934 Y = a + bx 1389934 = 713428,3641 + 1371748.019 x X = 1389934 - 713428,3641 1371748.019 X = 0.49 X = 0.49 x 100 % 0.5 = 98.6 % Rata-rata hasil recovery = 82 + 86.8 + 98.6 3 = 89.13
19
Lampiran 6 Data Uji linearitas Tabel 5 Data hasil uji linearitas Konsentrasi (ppm)
Luas Puncak (A)
X
Y
0,25 0,5 1,0
667303 1117542 2118253
2,5
5336263
5,0
7016450
a = 713428,3641 b = 1371748,019 r = 0,9367 Berdasarkan data di atas di peroleh persamaan garis sebagai berikut : Y = a + bx 71343428 + 1371748 x r = 0,9367
20
Lampiran 7 Hasil Pengamatan toksisitas Tabel 6 Hasil Pengamatan Uji Toksisitas Larva Udang terhadap Melamin Konsentrasi (ppm)
Larva Udang Larva Udang Rata‐rata awal akhir Rata‐rata persen (hidup) (hidup) Larva mati kematian (%) 1 2 1 2 78.3 2 ppm 30 30 6 7 23,5 69,95 1 ppm 30 30 8 11 20.5 63,3 0.5 ppm 30 30 11 12 18,5 54,95 0.1 ppm 30 30 13 14 16,5 0.02 ppm 30 30 15 10 12,5 48,3 Contoh Perhitungan Contoh konsentrasi 2 ppm Ulangan 1 = Jumlah larva awal – akhir = 30 – 6 = 24 (Larva yang mati) Ulangan 2 = Jumlah larva awal – akhir = 30 – 7 = 23 (Larva yang mati) Rata-rata larva yang mati 24 + 23 = 23,5 2
21
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tangerang pada taggal 7 April 1988 dari ayah Tjahyadi (alm) dan ibu Lilis (alm). Penulis adalah anak kedua dari dua bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Mardi Yuana Serang dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan tahun 2007 diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM) di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada tahun ajaran 2007/2008, Master of Dicipline di Masa Perkenalan Fakultas (MPF) dan Masa Perkenalan Departemen (MPD) pada tahun ajaran 2007/2008 dan 2008/2009. Penulis pernah mengikuti dan menang menjadi 15 usaha terbaik dalam Program Mahasiswa Wirausaha IPB di tahun 2009 untuk bidang usaha pendidikan di daerah kampus IPB. Bulan Juli-Agustus 2009 penulis melaksanakan Praktik Lapangan Kerja di Balai Perkebunan Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) Bogor dengan judul Isolasi Fragmen Gen penyandi Aminosiklopropana karboksilat sintase yang diberi Stimulan Etefon.
