JKGIJI 20m 7 FnBi Krut6) 28 32 Diterhi|Ldn di Jakartd
Ju.!.| K.dokr.rrd Gigi Univ.reit.! lrdon..ir ISSN0,351-36lX
UJI SITOTOKSISITAS DENGAN ESEI MTT
Fazwishni Siregarr, B S Hadijono' rBagianBiotogi Oral danr BagianProstodonsia F'akultas Kedokteran Gigi UniversitasIndonesia
Frzwishni Siregrr, B.S Hadijono: Uji Sirotoksisi(as denganEseiMTT. JumalKedokteran cigi tjniversitas Indonesia. 200017 (EdisiKhusus):28-32
Abstract Ihe purposeofctytoxicirytestis to asscss the roxic efect of a subslance direcrlyro rhe tissueculhrre. MTT assayis an assayon microplatervhichneedno cellsrransfers_'lhe methodmay be usedfor evaluating prolileralionand clotoxicity of a substance on cells in a quick. sensirive,and semiautomative manner withoutradioactive isotop.l he assayis basedon theabiliryofliving cellslo reducetheyellowsolublej14,j, dimethylthiazol-2-yl) 2,5di-phenylielrazolium bronide(MTT) sahsro purple,blu€ insolubteformazanwhich involvesthe enym€sof endoplasmic reticulumand n;tochondria.The numberof viablec€lls is rherefore measurable aslhc concenrration of thesolubiliz€dformazanmeasured by a spectrophoromeler.
Abstrak Uji sitoroksisiras dilakukarr unrukmengerahui efeksualubahansecaratangsmgterhadap iaringandatam kultur sel. Esei MII adalahsuatues€ipada mikroplaryang iidak 'nemerlukantransfersel. tjji ioi dapat digunakanuntuk mengukurproliferasi dan sitotoksisirasterhadapsel. Ujinya cukup sensitif. cepat, semiotomalis, dan tidak menggunakan radioisolop.Uji ini berdasarkemampuan sel hid p urnrk mereduksi gararnl-(4,5'dimethylihiazol-2-yl),2.5-di-phenyl-relrrzolium bromide (MTT) yane berwamakuning dan Iarul 'nenjadi endapanformazanyang b€rwamabiru ungu dan iidak larur. Reduksi garamterazolium terjadi intraseldanmelibaikanenzimdariretikulumendoplasma danmitokondria. Dengandemikianjurntah selyang hidupdapatdiukursebagai konsentrasi hasilprodukMTT yangdiukw denganspektrofotometer_
TemullrniahKPPIKGXII
trt \tntuksat^
DenEanEret MrT
Pendahuluan Uii sitotoksisitas adalah bagian dan eraluasi biologik bahan kedokterangigi dan dip€rlukan untuk prosedur skrining yang :randard. I ujuan uji ini adalah urtuk nengetahui ef'ek toksik suatu bahan secara .angsung terhadap kultur jaringan. Ada herbagaimetoda untuk menilai sitotoksisitas luaru bahan antara lain esei MTT, agar ,)\erla]. filter molekul, pembebasan isotop irlrmium. dan m€toda pewamaan eksklust Jengantr}pan blue. Esei MI I' menggunakanmikroplat 96iumur. sehinggadapat diukur banyak sampel i3da saat]ang sarna.Dcngandemikian dapal :nenglemat waktu, tenaga, dan dana. Keuntungan lain adalah merode ini tidak :nenggunakan isotop radioaktif, dan tidak nemerlukan transfer sel. Esei MTT dapat JrgLrnakan untuk mengukur jumlah sel
DasarEseiMTT Esei MTT didasarkanpadakemampuan \el hidupuntukmereduksigaramMTT yang :enrama kuningdan larut menjadiformazan rmg benvama biru-ungu dan tidak larul. Redulisigaramt€trazoliumterjadiinhaselulcr :nen)angkut enzim succinic dehidrogenase lari mitokondria.'' Namun Berridgemem:ultikan bahwareduksiterutamamelibatkair enzim retikulum endoplasmayang bergantung pada NADH, sedangkancnzim mitoLiondria hanya berperandalam porsi yang iecil.!l Selanjutnyaproduk formaTandilarutkan lalam pelarut. dan intensitas wama diukur l.ogan spektrofotometer. Ijntuk mengukur :nrensitaswama digunakan pembaca mikroilar 96-sumur yang biasa digunakan untuk FI lSA. Jumlah formazan yang dihasilkan lan kemudian diukur setelah dilarutkan.
berbanding secara proporsional dengan jumlah sel,rjr walaupur absorbansiabsolut herhedaantara berhagaigalur sel. Malin pelar qamanla. makin tinggi nilai absorbansin-va,dan ini berartj makin banyak jumlahselnya. Alat, Bahan, dan Metoda f,sei MTT Alat yang diperlukanadalahinkubator unluklultur.el. pembaramilroplat(n/c/o pldte readet), mikropipetmultichannel,tip kuning(f?/Iolr t,pr). Bahanyang diperlukan adalahMTT (Sigma).salin, pelarutdimetilsulfoksid(DMSO),atausodiumdodesilsulfal (SDS). MTT dilarutkan dalam salin dengan konsentrasi5 mg/ml dalam salin, kemudian disteril denganfilter^0,22 lrm. Selanjutnya disimpandalam -20"C sampaiwaktu akan SDS, dibual digunakan.Bila menggunakan dalamakuades. larutanSDS200/o Sel dikultur ke dalam setiap sumur mikoplat 96-sumur sampai konfluen dan diberi perlakuan yang akan diuji. Setetah waktu yang dit€ntukan. ke dalam setiap sumur dimasukkan 20 pl MTT 5 rng/ml. Masa inkubasi MTT yang terbaik adalah selama4 jam pada suhu 370C.'Selanjuhya lbrmazan yang terbentuk dilarutkan dalam pelarul dan absorbansinyadiukur dengan pembaca mikroplat. Esei MT'l' dapat dilakukan dengan menggunakan mikoplat 96-sumur,sehingga dapat diukur banyak sarnpelpada saat yang bersamaan. dan metoda menjadi semiolomatis. Hasilnyadiukur pada mikroplat tersebuttanpaperlu memindahkancairan dan mikroplal. diukurdenganpembaca Selain menggunakanmikoplat 96-sumur yang hanya dapat menampungvolume cairansedikit(300p1),dapatpula digunakan wadahkultur lain yang lebih besar,seperti plat 24 sumursehinggadidapatjumlah cairan yanglebihbanyak.Sumumyalebihbesardan mikoplat 96-sumurdan dapa! diisi cairan I ml. aaraini Inediumalaupelarulsebanyak
29
t. a^ RhntsteEur' 8,r ll.tlq.M.
digunakanoleh Kan dkl.' M€todenya sama dengan pada mikroplat 96-sumur, namun cairan pelarut diambil dan dimasukkan ke dalam kuv€t, kemudian diukur d€ngan spektrofbtometer LiV-Vis biasa. (lara ini m€m€rlukan waktu yang lebih lama daripada cara yang sebelumnya. Dapat pula sejumlahkecil (150-200 frl) larutan formazan dipindahkan ke dalam sumur mikoplat 96-sumur dan diukur denganp€mbacamikoplat.'"
BahanPelarutEndapanFormazan Bahan pelarut tbrmazan yang Pertama kali digunakanadalahasamisopropil alkopenelitianmen)atakan hol.r Namunbeberapa bahwanilai absorbansibahanpelarutasam isopropilalkohol sepertipadametodaMos_ mann kurangmaksinal-Van de Loosdrecht pelarut propanoldedkk.a rnembandingkan melarutkan endapanfor_ ngan DMSO unnrk mazan.Padagruppertamaendapanformazan dilarutkandengan100 pl isopropilalkohol dengan0,04N HCI dalamke yangdiasamkan dalamsetiapsumursepertimetodaMosmann. HCI digunakan untuk mengubah wama phenol red pada medirun menjadi kuning sehinggatidak mengganggupadapengukuran di 540nrn.Kelarutandicapaisetelah3-5 kali pipeting danditaruhdi alassr.rl"r \elamal5 menit. Pada grup kedua, supernatanatau medium diaspirasidari sumur. Selanjutnya kistal formazandilarutkan dalam 150 lrl DMSO ditambah 25 pl glisin. Kelamtan dicapai denganshaker sela':.a5-15 menit Hasil menunjukkanbahwa pelarut DMSo hampir2 kali nilai memberinilai absorbansi yangdihasilkanolehpropanol. asamisopropilalkohol un_ Penggunaan tuk pelarul endapanfonnazan yang tidak juga dinyatakan oleh Carmichael memuaskan dkk.r Bahan pelarut DMSO dan minyak mineralmemberikarakteristikabsorpsiyang lebihbaikdibandingasamisopropilalkohol.r
Selainitu juga ditemukanpanianggelombang )ang paling lepat unlul pengulwan absor pelarutyangdiguukan dan bansibergantung faktor kelekatansel terhadapsubshat.Bila semuamediumdiaspirasidari kulnf sel yang melekatpada substratdan digunakanDMSO sebagaipelarut.l. maksimlrmadalah570 nm. bila tidak semuamediumdibuang Sedangkan padasel yangtidak melekatpadasubstrat,l, maksimumadalah540 ffn. Bila digunakan p€larutminyak mineral untuk s€l yang melekat. maka plat didiamkansemalampada 400Csebelumdiukur pada padang gelombang570nm. Berridge menggunakan tysing bufer SlrS untuk melarutkanformazan.' Setelah diberi SDS. sel didiamkan scmalamatau segeradicampur dengan pipet multicharmel udauntukmelarutkanfomazan.Gelembung ra yangterbentr*dibuangdenganpengering pada rambutsebelumpengukutanabsorbansi 570nm. Esei MTT Untuk Uji Sitotoksisitas Untuk membuktikan hal yang telah dipublikasikandi atas, penulis melzrkukan beberapapercobaandengan hasil sebagai berikut.Pertamadilakukanuji untukmelihat denganjumlahsel. hubungannilai absorbansi Sel primer fibroblastgingivadikultur dalam mikoplat 96-sumur Jumlah sel dihitung dengantrypanblue seb€lumditanamdalam sumur-sumur mikroplat dalam jumlah sel yang berbeda. Setelah diinkubasi selama semalam.dan dianggapsel telah m€l€kat padadasarsumur.dilakukanesei MTl dan diukur absorbansinya.Sebagai p€larut formazandigunakanSDS 20% sebanyak50 pl yang dimasukkanke setiap sumur dan didian*an semalam.Hasilnyamenunjukkan nilai absorbansi yang proporsional dengan jumlahsel.
rrr rtatokstntd\t).nladr,:rctMTT
F
1 i
E".1 : 061
"j'r-l
ill Juhbn r.t(llooot
GambarL Grafikmemperlihalkan hubungan nilai absorbansi densanjunlahsel.Sel yang digunakanadalahsel primer fibroblast gingiva.PelarutformazanadalahSDS 20ol.yang didiamkansemalam.Absobans; diukur dcngan pembaca mikoplai pada panjanggelombaDg 570 run dikurangi690 nm. Hubungan linjertampakpadajumlahsellebihdari 8.700 kc atas. Sementarahubungan nenjadi tidak linier pada jmlah sel yang lebihr€ndah.Daradiambildari 3 peng'ulangan. Selanjutnyaesei MTT digunakandalam Jji silotoksisitassuatu bahan.Berikut adalah uii sitotoksisitasbahan alami obat tradisional getah jarak (Jatropha curcas). Setelah sel Frimer fibroblast gingiva tumbuh konfluen lada dasar sumur, medium diganti dan li|ambah-kan berbagai konsentrasi getah rarah. Hasil menunjukkan penurunan nilai lbsorbansibila konsenFasigetahmeningkat.
Ir,
0075 o,r5 031 06? 1.X
2.5
(ia'nbar 2. crafik menunj*kan abso$ansiese, MTT dari sel prnner fibroblasr gingjva pada uji sitoioksisitasgetah Jarak. Pelarui formazanyang digullakanadalahsDS 20oodanabsorbansi diukur padapanjangselombangs40 nJn. Tarnpal penmnan abso'bahi bila konsentrasi setahja.ak meningkar. Pada konsentrasigetah 0,62 mg/ml medium. nilai absorbansi menjadi0 dan dapaldikatakanridak ada lagi sel yang hidup Masingmasing nilai berasal dari 3 pengulangan. Dari hasil percobaan diaras terluhar bahwa esei MTT dapat digunakan untul mengukur jumlah sel dan memperlihatkan korelasi yang baik antara absorbansi spektrofotometri dengan jumlah sel. Karena itu esei M | | ddpal digunal.rn untul uji sitotoksisitas.Dasamva adalah garam tetmzolium (M]l) yang larul dan berwama kuning direduksi oleh enzim sel yang hidup menjadi kistal tbrmazan yang ridak larut dan herwama biru. ProduL reduksi ini (emudian diukur denganspektrofotometri.Makin pekat warrnnya, makin tinggi nilai absorbansinya. dan ini beranimaLinbanlakjumlahcelnya. Dari bcrbagai pelarut yang dapar dipilih untuli melarutkanendapanformazan.tampaknya DMSO memberi nilai absorbansitertinggi. Namun dengan DMSO semua medium harus diangkat untuk mendapat nilai yang maksimum. Pada beberapakeadaanmisalnya bahan uji yang mengendap seperti getah jarak. pengambilan semua medium dapat mengangkat sel yang lekat pada substrat sehingga hasil pengukuran tidak akurat. Dengan demikian dalam hal ini lebih baik dipilil metoda yang tidak memerlukanpengamb;lan medium lang dapar mengaspirasi sel. seperti penggunaanSl)S- Namun pelarut harus didian*an semalam scbelum diukur absorbansin)a. Nilai absorbansinya tidak setinggi dengan DMSO, tetapi telap proporsional denganjumlah sel sep€rtivang lampak padaGambar I dan 2.
3l
I nt
tsln lnqt'
1l \ Hdllront
Kesimpulan Beberapapeneliti telah membandingkan metode esei MTT untuk pengukuran jurnlah sel dengan metoda lain, dan menyatakanbahwa metoda MTT mempunyai keunggulan disamping beberapa kelemahan. Kelebihannya adalah dapat dibuat semiotomatis,valid, tidak memetlukan transfer sel, dan tidak menggrmakan radioisotop.la Kelemahannyaantara lain nilai absorbansiabsolut tidak sama pada berbagaigalur sel' sehinggasebaiknya dilakukan uii pendahuluandan perbandingandengarruji silololsisilaslain' nya Dengan demikian dapat disimPukan bahwadenganbeberapakelemahanMTT, esei kolorinretti M'l'l' memberi metode yang sirnpel. valid, dan cepat untuk menilaijumlahsel.
t.
5_
6.
'7.
kepada Penghargaan. Kami Lrertetimakasih Lab- Cell Biokrgy. AMC. Amsterdamdan Makmal FKUI tempatdilaklkannyacontoh uji yangdiperliha&anpadamakalahini-
9.
D{ftar Pustaka
l0
L
2.
'I. €sei tor Mosmann Rapidcolodrnetric to application cellulargroMhard survival: proliieration and c)'totoxic eseis.I Inltrvhnl M e l , 1 9 8 1 i6 5 : 5 5 - 6 3 . Chang MC. JenCJH, l-in CP et al. Thromb'n activatesthe groMh. cell cycle kin€ti€s.and clustering of human dental pulp cells / En ti odon| 1999. 25 : | | a-22.
ll.
CarmichaelJ. Decraff wG. GasdarAf, ei al. Evaluation of a tet.aznlium-based semiauto'nated colorimetriceseirassessment of chemosensitivitvtesting. Cd,c€' Res l9a7i 411936-42. van de t,oosdrechl AA. Nennie E. Ossenkoppele CJ. el al. Cell mediared cytotoxicityagainstU937 cells by human in a modified monocytes andmacrophrges colorimetricMTT esei. .l lnmunol Meth l99li l4l: l5-22. Kan KC. Messer LB, Messer HH. variability in cytotoxicity and fluoride rel€ase of resinmodified glass-ionomer Derl R?r 1997176: 15027. cernenrs.../ HashiehIA. CampsJ. DejouJ. et al. Eusenol diffusion lhrcugh denlin relaled lo dentin Dent Mater 19981 hydraulicconductance. l4:229-16. Osorio RM. Heffi A. Vertucci FJ. el al. Cytoloxicily ol endodootic materiais. ,l Endono 1998t24:91-6 RakichDR. WatahaJC. I-efebreCA er al. Efiects ol deniin bonding agents on macrophagc milochondrial acliviry. J F.adodont l99at 24, 528-33 Siregar F, Akbar SMS. Cytotoxicity of Jatropha cucas latex by MTT esei. pada International Assosialion Dipresentasi of Dental R€se.rch, Soulh-East Asia Meeting.Singapore. I999. SchmalzG. SchuslerU, NuetzelK. et al. An in-virropulpchambcrwiih thre€dimensional .ell crltwes..JEndodont1999;25:24-9. Beridge MV, Tan AS. Mccoy KD. el al. The biochemicaland cellularbasisof cell prolilerationeseisrhat se tetrazoliumsalls. Rio.hemMr1996t4: l5-2O.
