UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK EKSTRAK SPONS LAUT Aaptos suberitoides TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) SECARA IN VITRO CYTOTOXICITY TEST AND EFFECT OF Aaptos suberitoides EXTRACT ON CERVICAL CANCER CELL LINE HeLa IN VITRO Awik Puji D.N1, Sukardiman2, Hani Tenia Fadjri3 1.
Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember Institute of Technology 2. Pharmaceutical Facult, Airlangga University Surabaya 3. Alumni of Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember Institute of Technology
ABSTRACT The main purpose of this reseach is to determine the effect of A.suberitoides extract on cervical cancer cell line HeLa in vitro, that using cytotoxicity test. The activity of A.suberitoides extract to inhibit the growth of cancer cell was determined by MTT assay. After the LC50 calculated, the cell proliferation kinetic profiles were observed by doubling time test at 24th, 48th, and 72th hours and the IC50 calculated. Apoptosis studies were done by double staining test using acridine orange and ethidium bromide. The study was used Completely Randomized Design with 5 treatment group, there are group I (treatment), II ( control cell ), III ( positive control), IV (medium control) and V ( cosolven control ), with three times duplication. The concentration of extract that use 7.5 ; 15 ; 30 ; 60 ; 120 ; 240 ; 480 ; 960 and 1920 µg/mL. The concentration of cisplatin, medicine cancer that use 2, 4, 8 dan 16 µg/mL. The data was analyzed with ANOVA and be continued by LSD test. The result of this research shows that A.suberitoides extract have not cytotoxic activity on cervical cancer cell line HeLa with LC50 = 133,968 µg/mL at cytotoxicity test with MTT assay based NCI (National Cancer Institut) criterion, that a compound was said to have sitotoksisitas's effect that poten if that compound have point LC50 ≤ 20 πg/mL. At doubling time test, A. suberitoides extract are not able to inhibit proliferation of cervical cancer cell line HeLa with IC50 = 153, 007µg/mL based criterion of Kamuhabwa et al. (2000), that extract has to assess IC 50 = 100 µg / ml can say to have antiproliferasi's potencies. And A.suberitoides can induction apoptotic on cervical cancer cell line HeLa with activity as big as 16,650 %. Key Words: A.suberitoides, HELA cervical cancer cell, Cytotoxicity test PENDAHULUAN Indonesia merupakan salah satu negara megadiversity yang dilimpahi kekayaan hayati tertinggi di dunia terutama perairannya karena sebagian besar wilayah Indonesia berupa perairan. Kondisi tersebut menjadikan Indonesia memiliki keunggulan komparatif dari segi sumber daya alam untuk dikelola bagi kesejahteraan manusia. Kekayaan hayati perairan Indonesia terdiri dari ikan baik pelagik dan demersal, alga, terumbu karang, plankton, spons dan masih banyak lainnya. Sumber daya alam tersebut sampai saat ini belum banyak dimanfaatkan secara optimal, salah satunya adalah organisme bentik sesil yang
mempunyai aktivitas farmakologis sebagai antimikroba, antivirus, antiinflamasi dan antikanker (Suryati dan Ahmad, 1996). Salah satu organisme bentik yang mempunyai kadar bioaktif tinggi adalah spons. Spons memiliki kemampuan menghasilkan metabolit sekunder yang tinggi serta mensintesis bermacam-macam komponen organik seperti polyketida, alkaloid, peptid dan terpene (Sjorgen, 2006). Komponen organik tersebut dapat digunakan sebagai bahan obat-obatan (Amir dan Budiyanto, 1996). Telah dilaporkan pula bahwa sebagian senyawa yang diisolasi dari spons mempunyai aktivitas toksik yang tinggi terhadap antibakteri , antikanker dan antiparasit (Amir dan Budiyanto, 1996). 1
Sebelas spesies spons yang diambil dari daerah perairan Pantai Pasir Putih Situbondo memiliki senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai antikanker (Nurhayati et al., 2008). Senyawa bioaktif antikanker yang akan digunakan sebagai produk farmasi antikanker harus diujikan terlebih dahulu dengan uji sitotoksik. Uji sitotoksik merupakan salah satu pengembangan metode untuk memprediksi keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada sel (Kurnijasanti et al., 2008). Salah satu metode uji sitotosisitas adalah Brine Shrimp Test (BST) yang dapat digunakan untuk praskrining terhadap senyawa- senyawa yang diduga berkhasiat sebagai anti tumor (Sukardiman, et al., 2004 dalam Widyastuti, 2008). Hasil uji sitotoksisitas BST pada 11 spesies spons yang diambil dari perairan Pasir Putih tersebut menunjukkan tingkat toksisitas yang paling tinggi pada spesies Aaptos suberitoides dengan nilai LC50 134.14 ± 36.61 ppm sehingga spesies ini merupakan kandidat yang paling baik untuk antikanker (Nurhayati et al, 2008). Setelah tahap praskrining terhadap senyawa antikanker dengan metode BST, maka perlu dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker secara in vitro. Uji sitotoksisisitas secara in vitro pernah dilakukan oleh Shaari, et al. tahun 2008 dengan menggunakan ekstrak methanol spons jenis A. aaptos pada beberapa sel kanker. Hasil pengujian tersebut signifikan pada beberapa jenis sel kanker yaitu HL-60 (leukemia promyelositik), CEM-SS (leukemia T-lympoblastik), MCF-7 (kanker payu dara), HeLa (kanker serviks), HT-29 (kanker usus besar) dan L929 (murine fibrosarcoma from mouse) dengan nilai CD50 3.2 - 24.1 µg/ml. Diantara kanker tersebut, kanker serviks (leher rahim) merupakan kanker yang menempati posisi pertama diantara sepuluh kanker primer yang melanda wanita di Indonesia dengan prosentase yang besar yaitu 28.66 % (Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002 dalam Heti, 2008). Sel kanker leher rahim (sel HeLa) terjadi akibat infeksi Human Papillomavirus (HPV 18) sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan sel leher rahim normal. Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. Kedua onkogen tersebut merupakan protein yang dapat menghambat ekspresi gen p53 sebagai gen penekan kanker. Pada peristiwa ini onkogen lebih tinggi dibandingkan p53 sehingga proliferasi sel kanker menjadi tidak terkendali (Prayitno, 2005; Goodwin dan DiMaio, 2000).
Berbagai macam senyawa telah dikembangkan melawan kanker yang meliputi senyawa-senyawa pengalkilasi, antimetabolit, obat-obat radiomimetik, hormon dan senyawa antagonis. Akan tetapi tak satupun jenis senyawasenyawa ini menghasilkan efek yang memuaskan dan tanpa efek samping yang merugikan (Cram et al., 1992; Calabresi and Chabner, 1991; Green et al., 1982; Herzig et al., 1987; Hoppe et al., 1992; Lorgan et al., 1996 dalam Astuti, 2005). Obat antikanker yang ideal seharusnya cepat membunuh sel kanker tanpa membahayakan jaringan normal. Sampai sekarang belum ditemukan obat-obatan yang memenuhi kriteria sehingga perlu dikembangkan obat baru yang mempunyai efek terapi yang baik (Katzung, 1995 dalam Heti, 2009). A. suberitoides adalah salah satu spesies spons laut yang memiliki keistimewaan karena dapat menghasilkan senyawa alkaloid aaptamin (benzo 1,6-naphthyridin) (Coutinho, 2002). Senyawa aaptamin berpotensi sebagai senyawa antikanker (Aoki et al., 2006), yang bekerja dengan mekanisme apoptosis (Mayer, 2008) dan antioksidan (Makarchenko, 2004). Apoptosis merupakan mekanisme kematian sel sehingga proliferasi sel yang mengalami kerusakan DNA dapat dicegah (Tadjudin, 2006). Dengan kondisi tersebut diharapkan aktivitas antikenker spons A. suberitoides dapat menghambat proliferasi sel HeLa. Penelitian ini sebagai dasar pengembangan dalam bidang kesehatan dan sebagai produk farmasi untuk antikanker dan imunostimulan. METODE PENELITIAN Spons A.suberitoides diperoleh dari perairan Pecaron, Pantai Pasir Putih Situbondo, Jawa Timur. Sel HeLa yang diujikan merupakan koleksi dari LPPT UGM. Ekstraksi Spons Laut Ekstraksi spons dilakukan dengan metode yang dilakukan oleh Harada dan Kamei (1997) dan Horikawa et al (1999). Spons diambil , dipotong-potong menggunakan pisau selanjutnya ditambahkan alkohol pada potongan spons untuk mencegah tumbuhnya jamur. Potongan spons dikeringanginkan selama 1 minggu hingga kering. Selanjutnya potongan spons yang telah kering dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga terbentuk ekstrak kasar. Ekstrak kasar yang telah didapat kemudian dimaserasi. Ekstrak kasar spons dimasukkan ke dalam maserator dengan kapasitas 2,5 kg. Ekstrak kasar spons 2
direndam dalam etanol sampai seluruh ekstrak spon terendam, campuran disaring dan dihasilkan ekstrak spons. Filtrat spons yang telah didapat dievaporasi. Proses selanjutnya yaitu pengadukan filtrat dengan stiring magnetic mulai dari pelarut polar hingga pelarut non polar. Filtrat diaduk dengan pelarut kloroform dengan perbandingan 1:5. pengadukan dilakukan dengan replikasi 3 kali selama 2 jam untuk tiap kali replikasi. Dari proses tersebut akan didapatkan filtrat dan supernatan. Filtrat yang diperoleh dievaporasi untuk menghilangkan etanol. Hasil yang diperoleh merupakan ekstrak kloroform yang selanjutnya digunakan dalam uji sitotoksisitas. Uji Sitotoksisitas Metode MTT assay Suspensi sel kanker serviks (HeLa) sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104 sel/100 µL media didistribusikan ke dalam sumuran- sumuran pada 96-well plate dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasi, ke dalam sumuran dimasukkan 100 µL larutan uji pada berbagai seri konsentrasi. Sebagai kontrol positif ditambahkan 100 µL medium kultur, kemudian 100 µL cisplatin pada berbagai seri konsentrasi ke dalam sumuran yang telah berisi 100 µL suspensi sel. Sebagai kontrol sel ditambahkan 100 µL medium kultur ke dalam sumuran yang berisi 100 µL suspensi sel dan sebagai kontrol pelarut ditambahkan 100 µL DMSO ke dalam sumuran yang berisi 100 µL medium kultur dan 100 µL suspensi sel dengan delusi yang sesuai dengan delusi konsentrasi larutan uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 dan 95% O2. Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS), dan medium diganti dengan 190 µL medium RPMI 1640 komplit. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper SDS (100 µL). Microplate kemudian dibungkus dengan tissue dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm (Ola at al., 2008; Mae et al., 2000 dalam Dheta, 2009). Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel ( Uji Doubling Time) Suspensi sel kanker serviks (HeLa) sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104 sel/100 µl media didistribusikan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan
diinkubasi selama 24 jam dalam incubator dalam suhu 37°C dan dialiri 5% CO2. Selanjutnya ditambahkan 100 µL larutan uji dengan 3 variasi konsentrasi yaitu pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 pada uji sitotoksisitas tersebut di atas, kemudian inkubasi dilanjutkan dengan variasi waktu 24, 48 dan 72 jam. Pada setiap akhir inkubasi, medium kultur dibuang dan ke dalam masing- masing sumuran ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS) dan medium diganti dengan menambahkan 190 µL medium RPMI 1640 komplit kedalamnya. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam sampai terbentuk formazon. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper SDS (100 µL). Microplate yang berisi suspensi sel diseker ± 5 menit kemudian dibungkus dengan tissue dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Hasil absorbansi yang terbaca dikonversi ke dalam % (persentase) kehidupan (viabilitas) sel (Dhiani et al., 2006 dalam Dheta, 2009). Uji Apopotosis dengan Metode Double Staining Sel yang telah dipanen dipuasakan sebelum perlakuan menyamakan umur sel seperti pada uji aktifitas proliferasi. Sel kanker yang akan dipuasakan dimasukkan ke dalam plate 24 well yang berisi coverslip, masing-masing sebanyak 500 µL dengan kepadatan 3x104 sel/100 µL media, kemudian sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 370C. Selanjutnya sel diberi perlakuan dengan 500 µL ekstrak spons laut A. suberitoides dengan 3 variasi konsentrasi yaitu pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 pada uji sitoktoksisitas tersebut di atas. Sebagai kontrol sel, ditambahkan 500 µL media kultur RPMI, kontrol positif ditambah 500 µL cisplatin pada konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 dan kontrol pelarut ditambah 500 µL DMSO pada konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50, kemudian sel diinkubasi selama 24 jam dalam incubator. Pada akhir inkubasi, medium dibuang dan coverslip dikeluarkan dari sumuran, diletakkan pada gelas benda Poly-L-Lysine secara merata dan dibuat rangkap dua. Sebanyal 5 µL larutan staining ditambahkan pada permukaan coverslip tersebut, kemudian didiamkan ± 2 menit agar larutan berinteraksi dengan sel. Sel segera diamati di bawah mikroskop flouresen dengan perbesaran dengan perbesaran 100 x dan hasil 3
pengamatan difoto dengan kamera digital. Sel yang hidup akan berflurosen hijau dengan acridine orange dan sel yang mati akan berflurosen oranye dengan ethidium bromide (Dhiani et al., 2006; Nururlita & Mahdalena, 2006 dalam Dheta 2009). Jumlah sel yang mengalami apoptosis dihitung untuk tiap lapang pandang dengan jumlah minimal 100 sel (Spector, 1998 dalam Sukardiman, 2005). Analisis Data Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT assay Data yang diperoleh dari hasil pembacaan ELISA reader (λ = 595 nm) berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam % kematian sel dengan rumus:
Keterangan : Abs = Absorbansi Kemudian dianalisis dengan program SPSS Windows 16.0 menggunakan uji One Way ANOVA. Analisis statistik ditentukan hipotesis statistik sebagai berikut : Ho = Tidak ada pengaruh penambahan ekstrak spons A.suberitoides pada sel HELA dibandingkan dengan kontrol negatif pelarut DMSO Ha = Ada pengaruh penambahan ekstrak spons A.suberitoides pada sel HELA dibandingkan dengan kontrol negatif pelarut DMSO Pengambilan kesim-pulan jika harga Fhitung > Ftabel maka Ho ditolak, sedangkan jika harga Fhitung < Ftabel maka Ho diterima dengan derajad kepercayaan 0,95 (α = 0,05). Jika ada perbedaan bermakna, perhitungan dilanjutkan dengan uji LSD. Untuk mengetahui harga LC50 ditentukan dengan menggunakan analisis persen probit pada program SPSS Windows 16.0. Prinsip pengolahan data pada program ini adalah mengkorelasi antara persen kematian sel dengan konsentrasi ekstrak. Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel Data yang diperoleh dari hasil pembacaan ELISA reader berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam % kehidupan sel (viabilitas) dengan rumus:
Berdasarkan data tersebut dibuat profil hubungan antara persentase sel hidup dan waktu inkubasi, kemudian dibuat persamaan regresi linier. Slope dari persamaan ini menggambarkan kinetika pertumbuhan sel. Data absorbansi dan persentase sel hidup selanjutnya dilakukan analisis varian satu arah (ANOVA) (α = 0,05) untuk mengetahui adanya perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan pada setiap waktu inkubasi, dimana hasil uji bermakna jika diperoleh harga p ≤ 0.05. Jika terdapat perbedaan yang nyata, dilanjutkan dengan uji Least Significant Difference (LSD). Kedua uji tersebut dilakukan pada taraf kepercayaan 95% dengan menggunakan program SPSS Windows 16.0. Pengamatan Apoptosis Data apoptosis berupa data kualitatif yang diperoleh dari hasil pengamatan morfologi sel menggunakan mikroskop flouresens. Sel yang hidup akan berflouresen hijau dengan acridine orange dan sel yang mati akan berflouresens orange dengan ethidium-bromide. Perhitungan sel yang mengalami apoptosis dihitung dengan rumus: % Apoptosis = Jumlah sel apoptosis x 100% ∑ Total sel HASIL Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) dengan Metode MTT assay Hasil pengukuran dengan menggunakan ELISA reader menunjukkan bahwa persentase kematian sel HELA terus meningkat sebanding dengan kenaikan konsentrasi ekstrak yang diberikan. Kematian sel terbesar terdapat pada pemberian konsentrasi ekstrak 480 µg/ml yaitu sebesar 97,649 % (Tabel 1).
4
Tabel 1. Persentase kematian sel HELA dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides Seri ekstrak ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Konsentrasi (µg/ml) 7,5 15 30 60 120 240 480 960 1440 1920
Persen Kematian Sel (%) 17,940 18,056 18,866 21,219 26,852 34,298 58,102 96,836 97,338 90,664
Gambar 1. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak A.suberitoides terhadap sel HELA dengan metode MTT assay Sitotoksisitas Ekstrak Terhadap Sel HeLa
probit
8 7
y = 1.229x + 2.388
6
R = 0.782
2
5 4 3 2 1 0 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
log konsentrasi
Tabel 2. Persentase kematian sel HELA dengan perlakuan cisplatin Konsentrasi Cisplatin (µg/mL) 2 4 8 16
Persen Kematian Sel Hela (%) 13,321 19,476 26,263 63,131
Tabel 3 Persentase kematian sel HeLa dengan perlakuan DMSO Seri Ekstrak Ke-
Konsentrasi DMSO (%)
Persen Kematian Sel HeLa (Metode MTT)
10 9 8
0.960 0.72 0.480
23.187 15.548 5.324
Adapun persentase kematian dari sediaan kontrol negatif DMSO adalah 5,324 % (Tabel 3) dan pada kontrol positif obat kanker cisplatin dimulai pada konsentrasi 2 µg/mL dengan persentase kematian sebesar 13,321 %. Persentase kematian sel HELA terus meningkat sampai dengan konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL
sebesar 63,121 %, sejalan dengan kenaikan konsentrasi cisplatin (Tabel 2). Nilai LC50 pada uji sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides terhadap sel HELA adalah 133,968 µg/mL (Gambar 1), sedangkan pada obat kanker cisplatin sebesar 16.818 µg/mL (Gambar 2). 5
Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Proliferasi Sel Kanker Serviks (HeLa)
Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Apoptosis Sel Kanker Serviks (HELA) Hasil pengamatan dibawah mikroskop flourosen memperlihatkan bahwa sel HELA yang hidup akan berflouresen hijau dengan Acridine orange dan sel yang mati berflouresen orange dengan Ethidium bromide (Gambar 3). Hasil uji apoptosis sel HELA, cisplatin menunjukkan persentase apoptosis yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak, DMSO serta kontrol (Gambar 4). Ekstrak spons laut A.suberitoides mampu menginduksi apoptosis pada sel kanker HELA dengan aktifitas sebesar 19.23 %.
Tabel 4. Persentase kehidupan sel HeLa dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides pada uji Doubling time Persentase Sel HeLa Hidup (%) Konsentrasi Ekstrak (µg/mL) Waktu Inkubasi (jam) 24 48 72 133,967 µg/ml 52,551 38,306 36,613 66,983 µg/ml 55,486 52,502 51,980 33,491 µg/ml 62,579 55,250 52,541 Tabel 5. Persentase kehidupan sel HeLa dengan perlakuan cisplatin pada uji Doubling time Jumlah Sel Hidup % Konsentrasi sample (µg/mL) Waktu Inkubasi (jam) 24 48 72 13,062 52,551 59,201 36,613 6,531 55,486 61,354 51,980 3,265 62,579 61,493 52,541
c
b
e
d
a
Gambar 3. Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak spons A.suberitoides pada konsentrasi LC50 setelah diwarnai dengan acridine orange-ethidium bromide (florescent microscope perbesaran 100 x), a) sel mulai mengalami apoptosis dengan kondensasi kromatin, b) sel yang mengalami blebbing, c) merupakan tahap akhir apoptosis d) sel yang mengalami nekrosis dan e) sel HeLa normal 6
% a p o p to s i s
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
38.869
16.650
0.922
0.000 kontrol
LC50 ekstrak (134 µg/mL)
LC50 cisplatin (134.062 µg/mL)
DMSO (0.670 %)
jenis perlakuan
Gambar 4. Perbandingan persentase apoptosis sel HeLa oleh perlakuan Kontrol, LC50 ekstrak, LC50 cisplatin dan DMSO PEMBAHASAN Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop menunjukkan sel HELA yang hidup tampak seperti berserabut berwarna gelap dan saling berdempet dengan sel lain yang berada disekitarnya, ditunjukkan oleh panah berwarna kuning. Warna gelap dan berserabut yang nampak pada pengamatan merupakan kristal formazon. Kristal-kristal formazon tersebut dapat menembus membran sel dan terakumulasi di dalam sel sehat. Jumlah produk formazan secara langsung proposional dengan jumlah sel hidup. Semakin banyak sel hidup maka semakin banyak sel yang aktif melakukan metabolisme sehingga jumlah produk formazan yang terbentuk juga semakin banyak. Semakin banyak produk formazan yang terakumulaasi ini menyebabakan intensitas warna ungu meningkat dalam plate. SPSS Windows 16.0. LC50 digunakan sebagai parameter untuk mengevaluasi potensi sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides terhadap sel HELA. Untuk melakukan uji sitotoksisitas terhadap ekstrak, NCI (National Cancer Institute) menetapkan suatu standar bahwa harga LC50 adalah ≤ 20 µg/mL (Suffness, 1991). Karena harga LC50 dari ekstrak A.suberitoides diperoleh pada konsentrasi 133,968 µg/mL, maka dapat dikatakan bahwa ekstrak spons A.suberitoides tidak mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker serviks (HELA) berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh NCI (National Cancer Institut). Berdasarkan hasil pengukuran nilai LC50 atas dapat dikatakan bahwa ekstrak spons A. suberitoides bersifat toksik terhadap sel kanker HeLa. Senyawa alkaloid aaptamin yang terkandung dalan spons A. suberitoides (Coutinho, 2002; Larghi, et al., 2008) diduga bertanggungjawab terhadap aktivitas sitotoksisitas terhadap sel kanker HeLa. Sebagai kontrol positif digunakan cisplatin (cisplatinum atau cis diamminedichloroplatinum (II)) yang merupakan obat kemoterapi kanker yang berbasis logam platinum. Cisplatin bekerja sebagai anti kanker dengan cara menempelkan diri pada DNA (deoxyribonucleic acid) sel kanker dan mencegah pertumbuhannya. Jika senyawa ini terlarut dalam air, ligan kloro pada cisplatin diganti satu persatu oleh ligan air (aqua) melalui reaksi hidrolisis. Selanjutnya ikatan Pt-OH2 yang terdapat dalam senyawa kompleks monoaquaplatina dan diaquaplatina yang terbentuk akan jauh lebih reaktif, sehingga kompleks tersebut akan lebih mudah bereaksi dengan ligan donor beratom nitrogen pada basa DNA (Putra, 2008) Cisplatin bekerja sangat efektif dalam mengobati kanker serviks (Rose, 2006) sehingga dapat digunakan sebagai pembanding aktivitas ekstrak spons A. suberitoides dalam menghambat pertumbuhan sel kanker serviks (HeLa). Penggunaan kontrol positif berguna untuk mengevaluasi keberhasilan uji sitotoksisitas sebagai bukti terjadinya efek sitotoksik Pada hasil penelitian, cisplatin dapat menyebabkan kematian sel HeLa yang dimulai pada konsentrasi 2 µg/mL dengan persentase kematian sebesar 13,321 %. Persentase kematian sel HeLa terus meningkat sampai dengan konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL sebesar 63,131 %, sejalan dengan kenaikan konsentrasi cisplatin. Hasil uji One Way ANOVA (α = 0.05) adalah signifikan, menunjukkan harga Fhitung 7
(Fhitung =30.626 dan Ftabel adanya beda nyata antara kelompok perlakuan. Hingga inkubasi 72 jam, persentase sel yang hidup menurun. Hal ini menunjukkan bahwa cisplatin mempunyai kemampuan menghambat proliferasi sel HeLa dengan peningkatan konsentrasi obat dan penambahan waktu inkubasi. Nilai IC50 merupakan patokan untuk melakukan uji pengamatan kinetika sel. Nilai IC50 dalam penelitian ini menunjukkan nilai konsentrasi ekstrak spons A. suberitoides yang menghasilkan hambatan pertumbuhan sel HeLa sebesar 50 % dari populasi. Nilai tersebut juga menunjukkan apakah ekstrak spons tersebut bersifat antiproliferatif terhadap sel HeLa.
180.00 160.00 140.00 120.00 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00
153.007
I C 5 0 (µ g /m L ) )
lebih besar daripada harga Ftabel = 3.48) berarti terdapat pengaruh penambahan cisplatin pada sel HeLAadibandingkan dengan kontrol negatif pelarut DMSO. Untuk mengetahui perbedaan bermakna dilanjutkan dengan analisis LSD (Least Significant Difference). Dari hasil perhitungan diperoleh nilai LSD sebesar 9.825 . karena nilai LSD lebih besar daripada nilai LSD hitung, maka terdapat perbedaan bermakna dari masing-masing kelompok dengan metode MTT assay. Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Proliferasi Sel Kanker Serviks (HELA) Uji doubling time dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak spons A.suberitoides terhadap proliferasi sel HeLa. Konsentrasi yang digunakan adalah pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu 134, 67 dan 33,5 µg/ml dari hasil uji sitotoksisitas dengan waktu inkubasi 24, 48, dan 72 jam. Uji ini dilakukan dengan metode MTT, kemudian dihitung prosentase sel yang hidup (viabel). Pada tabel di atas tampak bahwa setelah pemberian ekstrak dan penginkubasian selama 24 jam terjadi penurunan persentase sel yang hidup pada berbagai konsentrasi ekstrak dengan IC50 sebesar 153 µg/ml. Akan tetapi hasil uji LSD (α =0,05) menunjukkan tidak ada beda nyata antara konsentrasi 134 dengan 67 µg/ml. Perbedaan yang nyata terlihat antara konsentrasi 134 dengan 33,5 µg/ml serta 67 dengan 33,5 µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak spons A. suberitoides telah berinteraksi dengan sel HeLa untuk menghambat pertumbuhan sel terebut. Uji doubling time juga dilakukan pada kontrol positif untuk melihat pengaruh antiproliferatif obat kanker cisplatin terhadap pertumbuhan sel kanker HeLa. Konsentrasi yang digunakan juga merupakan konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu 13,062; 6,531; dan 3,2655 µg/ml dari hasil uji sitotoksisitas dengan waktu inkubasi 24, 48, dan 72 jam. Pemberian cisplatin pada sel HeLa pada uji doubling time juga memberikan hasil yang signifikan terhadap persentase kehidupan sel HeLa selama periode inkubasi Proses penghambatan pertumbuhan sel oleh cisplatin terjadi selama periode inkubasi 48 jam hingga 72 jam. hasil uji LSD menunjukkan
33.424
ekstrak spons A.suberitoides
cisplatin Jenis Perlakuan
Gambar 5. Perbandingan nilai IC50 ekstrak dan cisplatin pada sel HeLa Nilai IC50 ekstrak spons A. suberitoides lebih tinggi dibandingkan nilai IC cisplatin. Hal tersebut menunjukkan bahwa cisplatin memiliki aktivitas yang lebih tinggi dalam menghambat proliferasi sel HeLa. Menurut Kamuhabwa et al. (2000), jika ekstrak memiliki nilai IC50 ≤ 100 µg/ml dapat dikatakan memiliki potensi antiproliferasi. Sedangkan menurut Mans et al. (2000) batas ambang yang ditetapkan untuk bahan alam yang dapat dikembangkan sebagai antikanker yaitu ≤ 50 µg/ml ( Mans et al., 2000). Berdasarkan kedua acuan diatas, dapat dikatakan bahwa ekstrak etanol spons A. suberitoides dengan nilai IC50 sebesar 153,007 µg/ml belum signifikan dalam menghambat proliferasi sel HeLa sehingga perlu upaya fraksinasi dan isolasi bahan bioaktifnya. Beberapa penelitian sebelumnya tentang sitotoksisitas ekstrak maupun yang berupa fraksi 8
spons dari genus Aaptos menunjukkan hasil yang berbeda-beda. Menurut penelitian Shaari, et al. (2008), ekstrak methanol spons jenis A. aaptos mampu menghambat pertumbuhan sel HeLa dengan nilai CD50 22,8 µg/ml. Penelitian tersebut dilakukan terhadap ekstrak methanol A. aaptos yang belum di fraksinasi seperti yang dilakukan pada ekstrak etanol A. suberitoides pada penelitian ini sehingga aktivitasnya dapat dibandingkan. Ekstrak etanol A. suberitoides pada penelitian ini dapat dikatakan kurang toksik jika dibandingkan dengan ekstrak methanol A. aaptos karena hanya memiliki nilai IC50 sebesar 153,007 µg/ml. Penelitian terbaru mengenai aktivitas sitotoksisitas A. suberitoides yang dilakukan oleh Tsukamoto (2010) diperoleh bahwa ekstrak etanol A. suberitoides yang difraksinasi menjadi 3 senyawa aaptamin, yaitu aaptamine, isoaaptamine, dan demethylaaptamine memberikan aktivitas sitotoksik yang signifikan terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 berturut-turut sebesar 15; 3,1 dan 1,4 µg/ml. Spesies A. suberitoides yang digunakan oleh Tsukamoto ini dikoleksi dari perairan Sulawesi Utara, Indonesia pada Desember 2006. Dimungkinkan bahwa jika ekstrak spongs A. suberitoides yang dikoleksi dari perairan Pantai Pasir Putih Situbondo yang digunakan dalam penelitian ini di fraksinasi,dapat memberikan hasil sitotoksisitas yang signifikan terhadap sel kanker HeLa sehingga dapat dipakai sebagai bahan alternative pengobatan kanker serviks. Perbedaan respon sel Hela terhadap berbagai jenis spons genus Aaptos dari berbagai daerah mungkin disebabkan karena perbedaan bahan aktif yang terkandung dalam spons genus Aaptos yang tentunya akan mempengaruhi mekanisme kerjanya terhadap sel HeLa. Menurut Channel (1998) bahan kimia yang dihasilkan dari asosiasi antar mikroorganisme maupun antar inang dan mikroorgtanisme laut dapat dipengaruhi oleh kondisi habitat laut seperti faktor geografis dan musim. Karena perbedaan kondisi habitat inilah, bahan hasil alam laut memiliki golongan bahan kimia yang beragam seperti terpenoid, polyketida, peptida, asetogenin, alkaloid dengan berbagai macam struktur dan beberapa komponen kompleks yang merupakan gabungan hasil biosintesis. Belum diketahui senyawa manakah dari A. suberitoides yang berperan sebagai antiproliferasi sel HeLa. Namun, selain senyawa aaptamin yang diduga berperan sebagai antiproliferasi kanker, ternyata telah diketahui
pula bahwa dalam spesies spons A. suberitoides terkandung senyawa indolamine-2,3-dioksigenase (IDO) dimana senyawa ini sangat berperan penting terhadap regulasi T-cell yang memediasi respon pertahanan. Saat ini IDO banyak dipakai sebagai obat kemoterapi tradisional yang efektif untuk melawan sistem kanker (Dewi, 2004) Pada grafik 4.8 di atas juga menunjukkan bahwa IC50 cisplatin jauh lebih kecil dibandingkan IC50 ekstrak. Nilai IC50 yang rendah menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi sel yang baik karena dengan ekstrak yang sangat sedikit sudah dapat menghambat proliferasi sel sebesar 50%. Hal ini disebabkan karena cisplatin bekerja sebagai anti kanker dengan cara menempel diri pada DNA (deoxyribonucleic acid) sel kanker dan mencegah pertumbuhan sel kanker. Oleh karena itu nilai IC50 nya lebih kecil dibandingkan ekstrak karena cisplatin cenderung menyembuhkan kanker melalui penghambatan proliferasi sel kanker. Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Apoptosis Sel Kanker Serviks (HELA) Kematian sel HeLa akibat perlakuan ekstrak spons A.suberitoides dapat diketahui juga melalui uji apoptosis. Konsentrasi yang digunakan untuk uji apoptosis adalah 134, 67, 33,5 µg/mL (ekstrak) serta 13,062, 6,531 dan 3,2655 µg/mL (cisplatin). Ketiga konsentrasi tersebut adalah konsentrasi pada LC50 dan dua konsentrasi di bawah LC50 dari uji sitotoksisitas dengan metode MTT, sehingga pada saat pengamatan memperoleh sel yang mati dan sel yang hidup untuk dibandingkan perbedaanya. Metode yang digunakan adalah doublestaining DNA dengan menggunakan ethidium bromide-acridine orange. Kedua macam zat warna ini digunakan secara bersamaan karena dapat menghasilkan warna kontras, sehingga mempermudah pengamatan dibawah mikroskop fluorosen. Pengamatan terhadap morfologi sel harus dilakukan dengan segera karena jika larutan doublestaining terlalu lama berinteraksi dengan sel, maka sel yang hidup akan mati. Hal ini disebabkan karena etidium bromide bersifat toksik, sehingga dalam penelitian hanya digunakan konsentrasi yang sangat kecil 5 µL. Ethidium bromide dalam konsentrasi kecil akan dilawan oleh antibodi sel hidup. Ethidium bromide-acridine orange mampu menembus membran sel dan berinteraksi 9
dengan DNA sel. Hasil pengamatan di bawah mikroskop fluorosen memperlihatkan bahwa sel HeLa yang hidup akan berfluoresen hijau (Gambar 4.8 a ) dengan acridine orange sedangkan sel yang mati berfluoresen oranye (Gambar 4.8 b ) dengan ethidium bromide. Ethidium bromide hanya dapat menembus membran sel mati karena terjadi penurunan integritas membran sel mati sehingga tidak permeabel terhadap senyawa yang masuk, sedangkan acridine orange mengandung gugus kation sehingga dapat berinteraksi dengan DNA sel hidup yang bersifat anionik membentuk garam terdisosiasi (Nurulita & Mahdalena, 2006 dalam Meye, 2009). Acridine orange dapat memasuki sel dan mewarnai inti sel menjadi hijau. Ethidium bromide hanya dapat memasuki sel yang mengalami kerusakan membran dan mewarnai inti sel menjadi merah. Pewarnaan dengan metode double staining menggunakan acridine orange dan ethidium bromide dapat membedakan sel yang hidup, sel apoptosis, dan sel nekrosis. Sel hidup akan tampak memiliki inti sel dengan bentuk normal hijau. Sel yang mengalami apoptosis akan memiliki inti sel berwarna orange dengan bentuk inti terkondensasi dan terfragmentasi. Sel yang mengalami nekrosis akan tampak memiliki inti sel berwarna oranye namun bentuk inti sel normal (Rible et al., 2005 dalam Nugrahaningsih, 2009). Pada uji apoptosis ini diketahui bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak spons A. suberitoides dapat memacu apoptosis pada sel kanker HeLa. Pada penelitian ini diperoleh persentase apoptosis yang disebabkan oleh ekstrak, cisplatin, dan DMSO berturut-turut 16,65; 38,87; dan 0,92 %. Pada uji ANOVA (α = 0,05) dinyatakan terdapat perbedaan signifikan antar setiap perlakuan. Jumlah apoptosis dengan perlakuan ekstrak terhitung lebih kecil dari cisplatin karena senyawa dalam cisplatin telah terbukti menghambat proliferasi sel dengan cara apoptosis. Sedangkan ekstrak masih mengandung senyawa-senyawa yang dapat bekerja sinergis membentuk apoptosis atau bahkan menghambat apoptosis. Uji apoptosis yang digunakan dalam penelitian ini belum dapat mendeteksi apoptosis pada tahap yang lengkap (kondensasi kromatin, pembentukan apoptotic bodies, dst.) sehingga jumlah sel yang terdeteksi mengalami apoptosis labih sedikit daripada jumlah apoptosis sebenarnya. Selain itu, sel dalam satu sumuran tidak berada dalam stadium apoptosis yang
bersamaan dan salah satu kekurangan dari metode ini adalah ketidakmampuan mengenali apoptosis pada sel yang berada pada fase G2 yang mempuyai kandungan DNA rendah, maka perhitungan sel yang apoptosis dapat menjadi lebih rendah dari sebenarnya (Eisel et al., 2003). KESIMPULAN Kesimpulan dari penelitian ini adalah: 1. bahwaekstraketanolsponsA. suberitoidesbelumsignifikanuntukmenghambatper tumbuhanselHeLa (bersifatantiproliferatif) dengannilai IC50 sebesar 153,007 µg/ml. 2. EkstraketanolsponsA. suberitoidesjugamampumenginduksi apoptosis padaselHeLadenganaktifitassebesar 16,65 %. SARAN 1. Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi pada ekstrak spons laut A.suberitoides 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan uji in vivo untuk menambah informasi ilmiah tentang efek toksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides terhadap hewan uji, sehingga komponen kimiawi yang terkandung di dalamnya dapat dijadikan sebagai salah satu agen antikanker.
UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada Ibu Awik Puji Dyah Nurhayati, S.Si, M.Si beserta Prof. Dr. Drs. Sukardiman, Apt, MS selaku dosen pembimbing yang bersedia meluangkan waktu untuk bimbingan. Ibu Dra. Dian Saptarini, M.Sc, Ibu Dra. Nurlita Abdulgani, M.Si beserta Ibu Ir.Sri Nurhatika, MP sebagai Dosen Penguji dan Ibu Dra. Dian Saptarini, M. Sc. selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA ITS. Bapak M. Muryono, M.Si selaku Koordinator Tugas Akhir Jurusan Biologi FMIPA ITS. Ibunda dan ayahanda tercinta, adikku tersayang serta seluruh sahabat yang selalu memberikan motivasi, do’a dan dukungan baik material maupun spiritual selama ini. KEPUSTAKAAN Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter, P. 2002. Molecular Biology of the Cell.Edisi ke4. Garland Science: New York. Anggrianti, Padmi. 2008. UjiSitotoksikEkastrakEtanol 70% 10
BuahKemukus(Piper cubeba L.)TerhadapSelHeLa.FakultasFarmasi UNMUH Surakarta Anonim, 2003, BahayaKanker Rahim BagiWanita, http://situs.kesrepro.info/aging /mar/2003/ag03.htm, diakses 2006. Anonim,2003 a, it develops, http://www .cancerbacup.org. uk/Cancertype/Cervix/General/How.Diak sesMaret2010 Anonim.2006. Apoptosis Extrinsic and Intrinsic Pathways,http://www.upstate.com/featur es/apop_pathway.asp.Diaksespadatanggal 3 April 2010 Anonim.2009. HewanSpons, Porifera. http://kamuspengetahuan.blogspot.com/2 009/ 03/hewan-sponsporifera.html.www.google.com. Diaksespadatanggal 2 Februari 2010 Aoki, S., Dexin K., Hideaki S., Yoshihiro S., Toshiyuki S., Andi S., and Motomasa K. 2006. “ Aaptamin, a Spongean Alkaloid, Activates p21 Promoter in a p53Independent Manner.”Biochemical and Biophysical Research Communications 342 (2006)101-106 Astuti, Pujidkk.“Ujisitotoksiksenyawa alkaloid darisponsPetrosiasp: potensialpengembangansebagaiAntikanke r”. MajalahFarmasi Indonesia, 16 (1), 58 – 62, 2005 Ben Best. 2006. Cancer Death Causes & Prevention.
Badisa,,R.B. et.al. 2006. “ Selective Anticancer Activity of Pure Licamichauxiioic-B Acid in Cultured Cell Lines”.Pharmaceutical Biology.Vol. 44, No. 2, Pages 141-145 Canavan, T. P. danDoshi, N. R.. 2000. Cervical Cancer. diakses Mei 2010. Clarke, A., 1992. “ Is there a latitudinal diversity cline in the sea?”. Trends Ecol. Evol.,Vol. 7, pp. 286-287. Cotran RS, et al. 1999.Robbins patologic basis th
of disease.6 ed. WB Saunders Company. Tokyo-London-Sydney: 18-25
Coutinho, A., Chanas, B., Souza, T. Frugrulhetti, I., danEpifanio. 2002. “ Anti HSV-1 Alkaloids from a Feeding Deterrent Marine Spongse of The Genus Aaptos “. Heterocycles, Vol. 57. 2002. Pp. 12651272 Dheta, ErmelindaMeye. 2009. SitotoksisitasdanEfekEkstrakEtanolKu litBuahJambuMente (Anacardiumoccidentale L.) TerhadapSelMieloma. FakultasBiologi UGM. Yogyakarta Faried, Ahmad. 2007. BagaimanaSelKankerBerjalan. Graduate School of Medicine, Gunma University: Japan Freshney, R.I. 1986. Animal Cell Culture, A Practical Approach 1st Ed.IRL Press; Washington D.C. Gewies, Andreas. 2003. ApoReview Introduction to Apoptosis Gilbertson, Shai White, David T., and Christina V.2009.“ The Role of Protein Synthesis in Cell Cycling and Cancer”. Molecular Oncology XXX (2009) 1-7 Goodwin, E.C., DiMaio, D. 2000. “Repression of Human Papillomavirus Oncogenes in Hela Cervical Carcinoma Cells Causes the Orderly Reactivation of Dormant Tumor Suppressor Pathways”. Biochemistry, Vol.97, no.23. Goepel, JR. 1996.Responses to Celluler Injury.In : Underwood JCE. General and nd
systematic pathology. 2 ed. Churchill livingstone. NewYork-London-Madrid; 117-119 Hanani, E., Mun’im, A. danSekarini. 2005. “IdentifikasiSenyawaAntioksidandalamS ponsCallyspongiaspdariKepulauanSeribu ”. MajalahIlmuKefarmasian, Vol. II, No.3, Desember 2005, 127 - 133 Heti, Dany.2008. UjiSitotoksikEkstrakEtanol 70% HerbaSisik Naga (Drymoglossum piloselloides Presl.)TerhadapSel T47D. FakultasFarmasiUniversitasMuhamadiya h Surakarta: Surakarta Jasin, Maskuri. 1992. ZoologiInvertebrata. SinarWijaya: Surabaya JuwonodanJuniarto. 2003. Biologi Sel. PenerbitBukuKedokteran EGC: Jakarta Kamuhabwa, A., Nshimo, C. & de Witte, P. 2000.“Cytotoxicity of Some Medicinal Plant Extracts Used in Tanzanian 11
Tradisional Medicine”.J. Ethnopharmacol.70: 143-149 Kresno SB. 2001. IlmuOnkologiDasar. Bagianpatologiklinik FKUI; 13-15 Labwork Study Guideand Lecture Notes. 2000. Henrietta Lacks.www.micro.msb.le.ac.uk/Labwork /Lack 1.htm.Diaksespadatanggal 3 April 2010 Larghi, E., Obrist, B., dan Kaufman, T. 2008.“A Formal Total Synthesis of The Marine Alkaloid aaptamine”. Tetrahedron.Volume 64, Issue 22 Makarchaenko, A. danUtkina, N. 2004.Antiradical Activity of Alkaloids from Marine Sponges.International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances (ICNPAS-2004) September 12-17, 2004, Novosibirsk, Russia Mayer, A., Gustafson, K. 2008. “Marine Pharmacology in 2005–2006: Antitumour and Cytotoxic Compounds”. European Journal Of Cancer 44 ( 2008 ) 2357– 2387 Meiyanto, EdydanEndah P. Septisetyani. 2005. “EfekAntiproliferatifdan Apoptosis FraksiFenolikEkstrakEtanolikDaunGynur aprocumbens(Lour.) Merr.TerhadapSelHeLa”. Artocarpus, (5) 2: 74-80 Murray, Robert K, dkk. 2003. Biokimia Harper. Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta Neal, Michael J. 2006. Medical Pharmacology At A Glance Fifth Edition. Erlangga: Jakarta Nurlaila, Ika dan Hadi, Miftachul. 2009. Kanker: Pertumbuhan, TerapidanNanomedis. Biophysics Group, Physics Research Centre LIPI. Nanotech Indonesia Nurhayati, AwikPujiDyah. 2009. Skrining, Isolasi, danEvaluasiIn Vivo AntikankerdariSponsLaut. LPPM ITS Prayitno, Adi, dkk. 2005. ” Ekspresi Protein p53, Rb, danc-mycpadaKankerServiks Uteri denganPengecatanImmunohistokimia”. Volume 6, Nomor 3 Halaman: 157-159 Sanif R. 2001. SinopsisOnkologiGinekologi. Sub bagianOnkologiGinekologiBagianObstetr idanGinekologi FKUI/RSUPN dr. CiptoMangunkusumo. Jakarta; 45-63
Shaari
,Khozirah, et al. 2008.“ CytotoxicAaptamines from Malaysian Aaptosaaptos”. Mar Drugs.2009 March; 7(1): 1–8. Sjamsuddin, S., 2001.“PencegahandanDeteksiDiniKanker Serviks”, CerminDuniaKedokteran.133: 8-13. Sukardiman, Wiwied E., dan Pharmasinta P. H.2006. “Aktivitas Antikanker dan Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker Mieloma”.Media Kedokteran Hewan Vol. 22, No. 2, Mei 2006 Sukardiman, Abdul Rahman, WiwiedEkasari, danSismindari. 2005. “ Induksi Apoptosis SenyawaAndrografolidadariSambiloto (AndrographispaniculataNees) TerhadapKulturSelKanker”. Media KedokteranHewanVol. 21, No. 3 Suparno. 2005. Kajian Bioaktif Spons Laut (Porifera: Demospongiae) Suatu Peluang Alternatif Pemanfaatan Ekosistem Karang Indonesia Dalam Bidang Farmasi. IPB: Bogor Suryati E, Parenrengi A, danRosmiati. 2000. “ Penapisan Serta AnalisisKandunganBioaktif Sponge Clathriasp. yang efektifsebagaiAntibiofoulingpadateritif (Balanusamphitrit)”.JurnalPenelitianPe rikanan Indonesia Vol.V No. 3 Tahun 1999. Syaifudin, Mukh. 2007. “ GenPenekan Tumor p53KankerdanRadiasiPengion”. BuletinAlara, Volume 8 Nomor 3, April 2007,119 – 128 Tadjudin, M.K. 2006.Apoptosis PadaGliomaOtak.Simposium: Apoptosis Charming to Death FK UI
Tsukamoto Sachiko; Yamanokuchi Rumi; Yoshitomi Makiko; Sato Kohei; Ikeda Tsuyoshi; Rotinsulu Henki; Mangindaan Remy E P; de Voogd Nicole J; van Soest R W M; Yokosawa Hideyoshi. 2010. “Aaptamine, an Alkaloid From The Sponge Aaptos suberitoides , Fungtions as a Proteasome Inhibitor”. Bioorganic Medicinal Chemistry Letters 20 , 11 : 3341-3 Van Soest, R.M.W. 1989. “ The Indonesian Sponge Fauna: Status Report “. 12
Netherland Journal of Sea Research.Volume 23 issue 2: 223-230 Zakaria, Fransiska R. 2001. ” Pangan dan Pencegahan Kanker”. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan.Vol. XII, No. 2 Th. 2001
Widodo, Nanang. 2007. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Alkaloid yang Terkandung dalam Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreotus). Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Semarang. Semarang Widyastuti, Shanti. 2008. Uji Toksisitas Ekstrak Daun Iprih (Ficus glabella Blume) terhadap Artemia salina Leach dan Profil Kromatografi Lapis Tipis. Jurusan Farmasi Universitas Muhamadiyah Surakarta Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta Zakaria, Fransiska R. 2001. ”Pangan dan Pencegahan Kanker”. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan
13
14
15
