UJI KINETIKA DAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI BAKTERI BIOKONTROL D2.2 PADA SALINITAS DAN pH YANG BERBEDA
(Skripsi)
Oleh
DWI RISCA SEPTIANI
JURUSAN PERIKANAN DAN KELAUTAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
ABSTRAK
UJI KINETIKA DAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI BAKTERI BIOKONTROL D2.2 PADA SALINITAS DAN pH YANG BERBEDA
Oleh
Dwi Risca Septiani
D2.2 merupakan jenis bakteri yang memiliki tingkat homologi 97% dengan bakteri Bacillus sp. dan merupakan bakteri biokontrol yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen Gram positif dan bakteri Gram negatif. Tujuan penelitian ini adalah mempelajari kinetika pertumbuhan dan aktivitas senyawa antibakteri dari bakteri D2.2 pada pH dan salinitas yang berbeda. Kinetika pertumbuhan diamati dengan spektrophotometer hingga fase kematian. Senyawa antibakteri diproduksi dari sel (pelet bakteri tanpa supernatan) yang diekstraksi dengan etil asetat dan disaturai dengan amonium sulfat. Aktivitas antibakteri diuji dengan difusi kertas cakram pada bakteri S. aureus, A. hydrophila dan V. alginolyticus. Hasil penelitian menunjukan bahwa laju pertumbuhan paling cepat terdapat pada salinitas 20 ppt dengan 0,179 generasi/jam dan waktu generasi 5,588 jam. Sementara pada semua perlakuan pH, waktu generasi dan laju pertumbuhannya relatif sama. Aktivitas senyawa antibakteri dari perlakuan 10 ppt mampu menghambat bakteri pathogen (V. alginolyticus) terbaik yang ditunjukan dengan diameter zona hambat 14 mm. Kata Kunci: D2.2, laju pertumbuhan, aktivitas bakteri, pH, salinitas.
ABSTRACT
KINETIC TESTING AND ACTIVITIES OF D2.2 BIOCONTROL BACTERIA AT DEFFERENT SALINITY AND pH By Dwi Risca Septiani D2.2 is a type of bacteria that shares 97% degree of homology with Bacillus sp. and biocontrol bacteria that capable to inhibit the growth of pathogenic bacteria both Grampositive and Gram-negative. The purpose of this research was to study the kinetics of growth and activity of bacteria D2.2 as antibacterial compounds at different pH and salinity. Growth kinetics were performed with the spectrophotometer, that were observed until death phase. Antibacterial compounds were produced from cells (bacterial pellet without supernatant) extraction with ethyl acetate and saturated with ammonium sulfate. Antibacterial activity was tested by paper disc diffusion on S. aureus bacteria, A. hydrophila and V. alginolyticus. The results showed that the most rapid growth rate is at 20 ppt of salinity with 0.179 generation/h and generation time 5.588 hours. While at all pH treatments, both growth rate and generation time were similar. Antibacterial compounds from 10 ppt of salinity were capable to inhibit pathogen (V. alginolyticus) with the largest inhibition zone i.e. 14 mm in diameter.
Key Word : D2.2, growth kinetics, bacterial activity, pH, salinity.
UJI KINETIKA DAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI BAKTERI BIOKONTROL D2.2 PADA SALINITAS DAN pH YANG BERBEDA
Oleh
DWI RISCA SEPTIANI
Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA PERIKANAN Pada Jurusan Perikanan Dan Kelautan Fakultas Pertanian Universitas Lampung
JURUSAN PERIKANAN DAN KELAUTAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG 2016
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Desa Wayakrui Kecamatan Kalirejo Kabupaten Lampung Tengah pada tanggal 13 Desember 1991 sebagai anak kedua dari empat bersaudara. Putri dari Bapak Cholidi Hs. dan ibu Masyani A.md
Jenjang pendidikan diawali dari Sekolah Dasar (SD) di SD Negeri Wayakrui diselesaikan pada tahun 2004. Kemudian Sekolah Menengah Pertama (SMP) di SMP Negeri 1 Kalirejo diselesaikan pada tahun 2007 dan Sekolah Menengah Atas (SMA) di SMA Negeri 1 Kalirejo diselesaikan pada tahun 2010. Tahun 2010 penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan Universitas Lampung melalui SBMPTN.
Selama menjadi mahasiswa penulis aktif dalam kegiatan mahasiswa diantaranya pernah menjadi ketua umum GUMPALAN FP UNILA tahun 2012-2013, anggota bidang penelitian dan pengembangan HIDRILA, selain itu penulis pernah menjadi asisten dosen Mikrobiologi, Manajemen Kesehatan Ikan, Teknologi Budidaya Pakan Hidup,
Pada Juli 2013 melaksanakan Praktek Umum di Balai Karantina Pengendalian Mutu dan Kesehatan Ikan kelas I Tanjung Priuk Jakarta Utara. Tahun 2014 Penulis telah melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama 40 hari di Desa Makmur Kecamatan Palas Kabupaten Lampung Selatan.
Tahun 2016, penulis menyelesaikan tugas akhirnya dengan menulis skripsi yang berjudul ”Uji Kinetika dan Aktivitas Antibakteri dari Bakteri Biokontrol D2.2 pada Salinitas dan pH yang Berbeda”.
“Maka apabila kamu telah selesai (dari suatu urusan), kerjakanlah dengan sungguh- sungguh (urusan yang lain). Dan hanya kepada Tuhanmulah hendaknya kamu berharap.” (QS. Asy- syarh : 7-8)
“Berusahalah untuk tidak menjadi manusia yang berhasil tapi berusahalah menjadi manusia yang berguna.” (Albert Einstein)
“Hard Work Will Never Betray you.” (Kang Hae Gun)
“Fight Till The End, Tabah Hingga Akhir.” (GUMPALAN FP UNILA)
“Bismillah For Everything” (Dwi Risca Septiani)
Kupersembahkan karya ini kepada :
My Beloved Ayahanda Cholidi Hs. dan Ibunda Masyani, A.md,
Abangku Mohammad Ridwan S.Pd Adik- Adikku Ferli Armansyah dan Ferdi Firmansyah
dan seseorang terkasih dalam hidupku Julianda S.Pd
Segenap Keluarga besarku yang selalu mendoakan keberhasilanku,
Sahabat dan teman-temanku yang selalu berbagi kebahagiaan,
dan Almamater tercinta
SANWACANA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul ”Uji Kinetika dan Aktivitas Antibakteri dari Bakteri Biokontrol D2.2 pada Salinitas dan pH yang Berbeda” yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan di Universitas Lampung.
Dalam kesempatan ini penyusun menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1.
Ayahanda Cholidi Hs dan Ibunda Masyani A.md yang tak pernah berhenti berjuang dan mendoakan saya serta curahan kasih sayang yang tak terhingga.
2.
Abangku Mohammad Ridwan S.Pd yang selalu menjadi panutan terbaik untukku.
3.
Si ‘Kembar’ adik-adikku Ferli Armansyah dan Ferdi Firmansyah yang menjadi motivasi untukku.
4.
My lovely Julianda S.Pd yang tidak pernah lelah mengingatkan dan mendukung dalam segala hal.
5.
Ibu Esti Harpeni, S.T., M.AppSc., selaku pembimbing utama yang telah membimbing dan memberikan ilmu pengetahuan, gagasan, dukungan, kritik dan saran kepada penulis dalam proses perencanaan dan pelaksanaan penelitian serta dalam penulisan skripsi ini.
6.
Bapak Dr. Supono S.Pi., M.Si selaku pembimbing Kedua yang membimbing dengan semangat dan kesabaran sehingga skripsi ini menjadi semakin baik.
7.
Bapak Wardiyanto S.Pi., M.P selaku pembahas yang telah memberikan kritik, saran dan arahan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan baik.
8. Ibu Ir. Siti Hudaidah, M.Sc., selaku Selaku Dosen Pembimbing Akademik dan Ketua Jurusan Perikanan dan Kelautan Fakultas Pertanian Universitas Lampung
yang telah memberikan dukungan, bimbingan, saran serta nasehat selama kuliah maupun dalam menyelesaikan skripsi. 9.
Bapak Eko Efendi, S.T., M.Si., Selaku Sekretaris Jurusan Perikanan dan Kelautan Fakultas Pertanian Universitas Lampung.
10. Bapak Prof. Dr. Ir. Irwan Sukri Banua, M.Si., (Bang Wawan) selaku Dekan Fakultas Pertanian yang telah memberikan bimbingan dan dukungan selama aktif sebagai mahasiwa Pertanian. 11. Seluruh Dosen dan Staf Karyawan Fakultas Pertanian khususnya jurusan Budidaya Perairan. 12. Bu Ismini, selaku PLP Budidaya Perairan yang telah membantu penelitian. 13. Mas Bambang, Bagian Administrasi jurusan Budidaya Perairan. 14. Mbak Nanda selaku staf Admin jurusan Budidaya Perairan. 15. Keluarga besarku yang selalu memberikan motivasi, dukungan dan doa untuk keberhasilanku. 16. My Supergirl srikandi GUMPALAN Susbol (Susi Susanti), Wibol (Wika Ma’rifatul Fitriah), Tibol (Tika Mutiasari), terima kasih yang tak sanggup terucap untuk segala kesenangan, kesusahan, kesedihan dan semua yang telah diberikan lebih dari sahabat. 17. Keluarga besar GUMPALAN FP UNILA abang- abang dan mbak-mbak yang selalu mengajarkan tentang arti “Fight Till The End” dan “Tabah Hingga Akhir”. 18. Sahabat-sahabat terbaikku, Safrina, Mauli Selvia, Friska Pakpahan, Dian Yuni Marita, Duma Oktorina Purba, Aditya Kurniawan Median Fauzi terima kasih atas persahabatan terhebat yang kalian berikan. Motivasi, perhatian, kasih sayang, kebersamaan suka maupun duka yang selalu mengiringi perjalan kita selama ini hal yang takkan pernah terlupakan, aku sangat bersyukur bisa mengenal kalian, semoga Allah selalu memberikan rahmat-Nya untuk keberhasilan kita. 19. Teman-teman seperjuangan angkatan 2010 oci, tica, sera, siti, ely, septi, asry, bang yuli, dwinda, ayi ayu, dike, rima, winda, mak win, nicki, imam, bayhaki, robert, anggi, njum, yuti, idur, sandi, disebut maap yak).
yang tak bisa di sebut satu persatu. (yang lupa
20. Adiks-adiks kesayanganku Melisa, Mauli, Tiwi, Mbok, Bene, Indah, Elsa, Tami, Cindy, Dan Melinda, Ayu, Anggita, Helda yang selalu membantu terus mendukung hingga selesai penelitian (yang lupa disebut maap yak). 21. Kakak-kakak dan adik-adik Budidaya Perairan angkatan Unila terima kasih atas segala dukungannya. 22. Teman-teman KKN . 23. Temen temen kosan Susanda: Nia, Ariola, lisa, Mbak Enjel, Yesi, dan Happy Monica Sari terima kasih atas motivasi, kebersamaan, dan kekeluargaan terbaik yang kalian berikan. 24. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam penyusunan skripsi ini.
Akhir kata, Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Penulis berharap semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amin.
Bandar Lampung, September 2016 Penulis
Dwi Risca Septiani
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR ISI .................................................................................................. i DAFTAR TABEL ........................................................................................... iii DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... iv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. v
I.
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang .................................................................................... 1 1.2 Tujuan Penelitian ................................................................................. 3 1.3 Manfaat Penelitian ............................................................................... 3 1.4 Kerangka Pikir ..................................................................................... 3
II. METODOLOGI PENELITIAN 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................. 8 2.2 Alat dan Bahan .................................................................................... 8 2.2.1 Alat ............................................................................................. 8 2.2.2 Bahan .......................................................................................... 8 2.3 Desain Penelitian ................................................................................. 9 2.4 TahapPenelitian ................................................................................... 9 2.4.1 Isolat Bakteri D2.2 ..................................................................... 9 2.4.2 Pembuatan Media ...................................................................... 9 2.4.2.1 Komposisi Media SWC ................................................ 9 2.4.2.2 Pembuatan Media SWC ................................................. 9 2.4.3 Fase Pertumbuhan Bakteri ......................................................... 10 2.4.4 Produksi Substansi Antibakteri .................................................. 11
i
2.4.5 Uji Aktivitas Senyawa Antibakteri ............................................ 11 2.5 Variabel Penelitian ............................................................................. 12 2.6 Analisis Data....................................................................................... 12
III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil..................................................................................................... 13 3.1.1 Fase Pertumbuhan pada Perlakuan Salinitas yang Berbeda ...... 13 3.1.2 Grafik Kepadatan Bakteri D2.2 pada Perlakuan Salinitas ......... 14 3.1.3 Fase Pertumbuhan pada Perlakuan pH yang berbeda................ 14 3.1.4 Grafik Kepadata Bakteri D2.2 pada Perlakuan pH .................... 15 3.1.5 Laju Pertumbuhan dan Waktu Generasi Pertumbuhan Bakteri D2.2 .............................................................................. 16 3.1.6 Penentuan Waktu Panen Produksi Substansi Antibakteri .......... 16 3.1.7 Diameter Zona Hambat ............................................................. 17 3.2 Pembahasan ......................................................................................... 19
IV. KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpulan .......................................................................................... 24 4.2 Saran .................................................................................................... 24
DAFTAR PUSTAKA
ii
DAFTAR TABEL
Tabel 1.
Halaman
Laju Pertumbuhan dan Waktu Generasi Pertumbuhan Bakteri D2.2 .............................................................................................. 16
2.
Waktu Panen Produksi Substansi Antibakteri ........................................... 17
3.
Diameter Zona Hambat (mm) Senyawa Antibakteri pada Salinitas yang Berbeda ......................................................................................... 18
4.
Diameter Zona Hambat (mm) Senyawa Antibakteri pada pH yang Berbeda ...................................................................................................... 18
5.
Kategori Daya Hambat Antimikroba Berdasarkan Zona Hambat ............. 19
iii
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1. Bagan Kerangka Pemikiran ........................................................................ 6 2. Desain Susunan Satuan Percobaan ............................................................. 9 3. Peletakkan Kertas Cakram ......................................................................... 12 4. Pertumbuhan Bakteri D2.2 pada Salinitas yang Berbeda ........................... 13 5. Kepadatan Bakteri D2.2 pada Perlakuan Salinitas .................................... 14 6. Pertumbuhan Bakteri D2.2 pada pH yang Berbeda.................................... 15 7. Kepadatan Bakeri D2.2 pada Perlakuan pH ............................................... 15
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampira
Halaman
1. Perhitungan Fase Pertumbuhan Bakteri D2.2 ............................................. 30 2. Bagan Alur Produksi Substansi Antibakteri .............................................. 31 3. Bagan Alur Uji Aktivitas Senyawa Antibakteri ......................................... 32 4. Tahapan Menghitung Fase Pertumbuhan Bakteri D2.2 Hingga Panen .......................................................................................................... 33 5. Aktivitas Senyawa Antibakteri dari Bakteri D2.2 ...................................... 34 6. Hasil Uji Sidik Ragam (Anova) dan Uji Lanjut Duncan Pertumbuhan Bakteri D2.2 pada Salinitas yang Berbeda ................................................ 35 7. Hasil Uji Sidik Ragam (Anova) dan Uji Lanjut Duncan Pertumbuhan Bakteri D2.2 pada pH yang Berbeda ......................................................... 37 8. Laju Pertumbuhan Bakteri D2.2 pada Salinitas yang Berbeda .................. 39 9. Laju Pertumbuhan Bakteri D2.2 pada pH yang Berbeda ........................... 44
v
I.
1.1
PENDAHULUAN
Latar Belakang Lingkungan berperan sebagai indikator keadaan organisme di dalamnya,
jika kondisi lingkungan buruk maka organisme budidaya yang ada di dalamnya menjadi stres sehingga terjadi penurunan ketahanan tubuh, akibatnya penyakit patogen seperti bakteri dapat dengan mudah menyerang organisme budidaya dan meyebabkan penyakit infeksi (Utami, 2013). Kharisma et al. (2012) menyatakan bahwa kelimpahan bakteri Vibrio sp. dalam suatu sistem pemeliharaan udang dapat dijadikan sebagai pertanda timbulnya serangan penyakit Vibriosis. V. harveyi, V. alginolyticus dan V. parahaemolitycus merupakan jenis bakteri yang paling sering menyebabkan penyakit Vibriosis pada udang. Bakteri juga dapat menyebabkan infeksi pada ikan, seperti bakteri Gram positif Staphylocuccus aureus yang merupakan penyebab septicaemia, hemoragi, urcerasi, dan menyebabkan kontaminasi air, sementara dari bakteri Gram negatif seperti Aeromonas hydrophila dapat mengakibatkan penurunan yang signifikan pada produksi perikanan karena mengakibatkan mortalitas yang tinggi (Pachanawan, 2008). Penyakit infeksi sebaiknya ditangani sedini mungkin dengan penanganan yang tepat. Pencegahan maupun pengobatan paling banyak dilakukan dengan memberikan antibiotik serta bahan kimia lainnya, namun penggunaan antibiotik serta bahan kima untuk memberantas bakteri patogen dalam jangka panjang dapat menimbulkan efek negatif terhadap lingkungan sekitar dan resistensi terhadap bakteri patogen (Watson et al., 2008). Beberapa kelemahan dalam penggunaan bahan antibiotik diantaranya, dapat menjadikan bakteri resisten terhadap antibiotik, menimbulkan residu pada tubuh organisme budidaya, merusak lingkungan dan dapat membahayakan kesehatan manusia mengkosumsi organisme budidaya yang telah diberi zat antibiotik. Hal inilah yang menyebabkan negara-negara maju melarang penggunaan antibiotik serta produk perikanan yang mengandung residu antibiotik (Sukenda et al., 2005).
1
Penggunaan bakteri biokontrol merupakan salah satu solusi pemecahan masalah penyakit pada organisme budidaya. Selain itu, penggunaan bakteri biokontrol juga ramah lingkungan dan dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen. Bakteri biokontrol memanfaatkan hubungan antagonis antara organisme untuk mendapatkan ruang gerak serta makanan. Muliani et al. (2012) dalam penelitiannya tentang bakteri biokontrol, menunjukan bahwa isolat bakteri BL542 diidentifikasikan sebagai bakteri Pseudoalteromonas sp. dapat menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi MR5339 secara in vitro maupun in vivo pada larva udang windu karena senyawa antimikroba yang dihasilkannya. Mariska (2013) telah mendapatkan isolat bakteri biokontrol dengan kode D2.2, diisolasi dari tambak tradisional di Desa Mulyosari, Kecamatan Pasir Sakti, Kabupaten Lampung Timur. Sementara pada penelitian yang dilakukan oleh Aji (2014) pada analisis 16s rDNA dari bakteri D2.2 menggunakan aplikasi Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), bakteri D2.2 diidentifikasi memiliki homologi paling tinggi yaitu dengan bakteri Bacillus sp. Tingkat homologi mencapai 97%. Bakteri D2.2 termasuk dalam golongan bakteri Gram positif dan berbentuk batang. Bakteri ini bisa bersifat aerob obligat atau fakultatif anaerob (bisa bertahan pada kondisi aerob dan anaerob), biasanya motil, bersifat katalase dan oksidase positif. Isolat bakteri D2.2 dalam penelitian yang dilakukan oleh Aji (2014), menunjukan kemampuannya menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi, Stapylococcus aureus dan Aeromonas hydrophila secara in vitro. Sementara itu dalam penelitian Hardiani (2014), isolat bakteri D2.2 mampu menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi pada udang vaname yang diujikan secara in vivo. Isolat bakteri D2.2 merupakan isolat potensial antibakteri. Sebelum diaplikasikan ke lapangan, isolat D2.2 perlu diuji aktivitas senyawa antimikrobanya yang dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti pH, salinitas, stabilitas senyawa antibakteri, suhu, takaran inokulum mikroorganisme waktu inkubasi, dan aktivitas metabolisme (Irianto, 2007). Kinetika pertumbuhan bakteri merupakan salah satu cara untuk mengetahui kecepatan produksi biomasa sel dan pengaruh lingkungan terhadap kecepatan
2
pertumbuhan sel (Pramono, 2003). Kinetika perumbuhan bakteri dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti pH dan salinitas serta faktor pertumbuhan lainnya seperti vitamin dan mineral yang terdapat pada lingkungannya (Mangunwidjaja, 1994). Sementara itu Irianto (2007) menyatakan aktivitas senyawa antimikroba dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya pH, lingkungan, stabilitas senyawa antibakteri, suhu, takaran inokulum mikroorganisme, waktu inkubasi dan aktivitas metabolisme mikroorganisme. Faktor yang mempengaruhi zona hambat yaitu sensitivitas organisme, media kultur, kondisi inkubasi, dan kecepatan difusi agar.
1.2
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kinetika pertumbuhan dan
aktivitas senyawa antibakteri dari bakteri D2.2 pada salinitas dan pH yang berbeda.
1.3
Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah adanya informasi mengenai kondisi terbaik
untuk kultur massal dengan bioaktivitas tetap tinggi dari bakteri D2.2 sehingga dapat digunakan sebagai salah satu solusi antibakteri yang ramah lingkungan.
1.4 Kerangka Pemikiran Penyakit dalam dunia perikanan dewasa ini masih menjadi suatu permasalahan yang sulit untuk dipecahkan. Lingkungan yang kurang baik serta padat tebar yang tinggi dalam sistem intensif menyebabkan organisme budidaya stress sehingga patogen seperti bakteri mudah menyerang organisme budidaya. Dan menyebabkan infeksi. Infeksi merupakan keadaan masuknya mikroorganisme seperti bakteri, jamur, parasit dan virus kedalam tubuh kemudian berkembang biak dan menimbulkan penyakit ( Banu dan Yilmaz, 2009). Bakteri menyerang dan menyebabkan infeksi pada tubuh organisme budidaya (Utami, 2013). Penyakit infeksi oleh bakteri Gram negatif seperti Vibrio sp. merupakan penyebab penyakit Vibriosis bersifat akut dan dapat mematikan larva udang atau
3
ikan dalam waktu 1-3 hari (Rukyani et al., 2002). Vibriosis bersifat akut dan ganas, karena dapat memusnahkan populasi udang atau ikan dalam tempo 1-3 hari sejak gejala awal tampak. Organisme budidaya yang terserang vibriosis sangat sulit untuk diselamatkan sehingga seluruh organisme budidaya lainnya yang ada terpaksa dibuang atau dimusnahkan. Penularan penyakit ini dapat langsung melalui air atau kontak langsung antar organisme dan menyebar sangat cepat pada pemeliharaan kepadatan tinggi (Prajitno, 2005). Bakteri dapat bertahan hidup, tumbuh dan berkembang pada batas-batas suhu tertentu. Suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri Vibrio sp berkisar antara 30-350C, sedangkan pada suhu 40C dan 450C bakteri Vibrio sp. tidak dapat tumbuh dan pada suhu 550C bakteri Vibrio sp. akan mati (Prajitno, 2005). Penyakit bakteri yang menyerang organisme budidaya selain bakteri Vibrio sp. misalnya bakteri Aeromonas. Bakteri ini menyerang ikan yang merupakan penyebab penyakit Ulcerative disease atau penyakit borok atau penyakit merah yang mengakibatkan kematian sekitar ±170 ton jenis ikan mas termasuk didalamnya ikan-ikan kecil dan benih (Lukistyowati, 2012). Bakteri Aeromonas hydrophila merupakan bakteri Gram negatif yang mempunyai karakteristik berbentuk batang pendek, bersifat aerob dan fakultatif anaerob, tidak berspora, motil, mempunyai satu flagel, hidup pada kisaran suhu 25-300 C. Bakteri
Gram
positif
seperti
Staphylococcus
aureus
juga
dapat
menyebabkan penyakit pada organisme air dengan merusak organ ginjal, limpa, dan berperan sebagai penyakit infeksi sekunder pada ikan (Atyah et al., 2010). Penyakit infeksi yang dibabkan oleh bakteri Gram postif dan bakteri Gram negatif umumnya dapat diobati dengan antibiotik (Gill et al., 2000). Pengobatan penyakit pada organisme budidaya biasanya dilakukan dengan memberikan bahan kimia, hal ini dalam jangka panjang menyebabkan dampak negatif bagi lingkungan sehingga bahan alternatif yang lebih ramah linggukangan sangat dibutuhkan dalam upaya penanggulangan masalah ini. Salah satunya dengan cara memberikan antibiotik yang ramah lingkungan seperti penggunaan bakteri biokontrol untuk menghambat bakteri patogen. Kinetika pertumbuhan bakteri merupakan salah satu cara untuk mengetahui kecepatan produksi biomasa
4
sel dan pengaruh lingkungan terhadap kecepatan pertumbuhan sel (Pramono, 2003). Kinetika perumbuhan bakteri dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti pH dan salinitas serta faktor pertumbuhan lainnya seperti vitamin dan mineral yang terdapat pada lingkungannya (Mangunwidjaja, 1994). Sementara itu Irianto (2007) menyatakan aktivitas senyawa antimikroba dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya pH, lingkungan, stabilitas senyawa antibakteri, suhu, takaran inokulum mikroorganisme, waktu inkubasi dan aktivitas metabolisme mikroorganisme. Setiap organisme memiliki kisaran pH optimum yang berbeda-beda. Sumarsih (2003) menyatakan bahwa mikroba umumnya menyukai pH netral (pH 7). berdasarkan pH-nya mikroba dapat dikelompokkan menjadi 3 bagian yaitu mikroba asidofil adalah mikroba yang hidup pada pH 2-5, mikroba mesofil (neutrofil) adalah mikroba yang hidup pada pH 5,5-8 dan mikroba alkalifil adalah mikroba yang hidup pada pH 8,4-9,5. Bakteri termasuk makhluk hidup dimana proses biokimiawi yang memerlukan peranan enzim sehingga setiap bakteri memiliki pH optimum untuk pertumbuhannya. Parameter lingkungan yang mendukung dapat mengoptimalkan pertumbuhan bakteri biokontrol sehingga menghasilkan senyawa antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Oleh karena itu penelitian tentang kinetika pertumbuhan dan aktivitas senyawa antibakteri dalam beberapa parameter fisik perlu dilakukan. Parameter tersebut diantaranya pH dan salinitas. Pengunaan bakteri biokontrol D2.2 dalam penelitian Mariska (2013) menunjukan bahwa bakteri biokontrol D2.2 mampu menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi secara in vitro. Sementara dalam penelitian lebih lanjut yang dilakukan oleh Aji (2014) bakteri biokontrol D2.2 mampu menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus, A. hydrophila dan V. alginolyticus.
5
Lingkungan Budidaya yang Buruk
Organisme Patogen Seperti Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif)
Inang yang Stres
Penyakit Infeksi
Kematian Masal, Kerugian Secara Ekonomi
Antibiotik
Penanggulangan
Aplikasi Bahan Kimia
Bakteri Biokontrol
Uji Kinetika
Indigenous Bakteri
Aktivitas Antibakteri
Menekan Pertumbuhan Bakteri Patogen Gambar 1. Bagan Kerangka Pemikiran
6
1.5
Hipotesis 1.
H0. : Salinitas media yang berbeda tidak berpengaruh terhadap laju pertumbuhan dan aktivitas senyawa antibakteri biokontrol D2.2 H1. : Salinitas media yang berbeda berpengaruh terhadap laju pertumbuhan dan aktivitas senyawa antibakteri biokontrol D2.2
2
H0. : pH media yang berbeda tidak berpengaruh terhadap laju pertumbuhan dan aktivitas senyawa antibakteri biokontrol D2.2 H1. : pH media yang berbeda berpengaruh terhadap laju pertumbuhan dan aktivitas senyawa antibakteri biokontrol D2.2
7
II.
2.1
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Budidaya Perikanan Jurusan
Budidaya Perairan Fakultas Pertanian serta Laboratorium Organik Jurusan Biokimia FMIPA Universitas Lampung pada bulan Oktober 2015 – Februari 2016.
2.2
Alat dan Bahan
2.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer (Spectrophotometer Genesys 20), ultrasonicator, micropipet, cawan petri, tabung reaksi, botol falcon steril, autoklaf (S- 90-N Electric Steroclave), bunsen, timbangan digital (Ainswot AA-160, Denver Instrument Company) hot plate stirrer (Noma II Thermolyne), labu erlenmayer, kapas, kain kasa, alumunium foil, sprayer, pipet tetes 10 ml, botol sampel, rak tabung reaksi, tabung falcon, instrumen sentrifius (Model 228 Fisher Scientific), Shaker (SSL2 Stuart), Inkubator (Precistern P’Selecta) dan jarum ose labu ekstraksi.
2.2.2 Bahan Bahan yang
digunakan yaitu, isolat
bakteri D2.2, isolat bakteri
Stapylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Vibrio alginolyticus, alkohol, akuades, air laut steril, kertas cakram, media gliserol, bacto peptone (OXOID LP0034, England), bacto agar (OXOID LP0011, England), Ekstrak yeast (OXOID CM0019, England) media TSA (OXOID CM0131, England), antibiotik amoxyline 50 mg (Indofarma, Bakasi), etil astatat dan amonium sulfat.
8
2.3
Desain Penelitian Desain penelitian ini disusun berdasarkan sistem Rancangan Acak Lengkap
(RAL). Susunan satuan percobaan diletakkan secara acak (Gambar 1.):
P3 U2
P2 U2
P1 U1
P2 U3
P1 U3
P3 U3
P1 U2
P3 U1
P2 U1
Gambar 2. Desain susunan satuan percobaan. P: perlakuan; U: ulangan
2.4
Tahap Penelitian
2.4.1 Isolat Bakteri D2.2 Isolat bakteri D2.2 murni dari koleksi hasi penelitian sebelumnya Mariska et al. (2013), yang diisolasi dari tambak tradisional di Lampung Timur. Isolat ini kemudian disegarkan kembali menggunakan media SWC.
2.4.2 Pembuatan Media 2.4.2.1 Komposisi Media Sea Water Complete (SWC) Media yang digunakan adalah media cair sea water complete (SWC) dalam 1 liter dengan komposisi bacto peptone 5 g, ekstrak yeast 1 g, gliserol 3 ml, air laut 75%, akuades 25%. Media agar SWC padat dibuat dengan menambahkan 15 gram bacto agar dan untuk media SWC semi solid ditambahkan 7,5 gram bacto agar (Ayuzar, 2008)
2.4.2.2 Pembuatan Media SWC Semua bahan komposisi media SWC dicampurkan kedalam labu erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan hot plate Stirrer.
9
Media yang telah homogen kemudian disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C 15 menit. Kemudian media dimasukkan kedalam cawan petri untuk media agar lempeng. Setelah itu inkubasi terbalik selama 24 jam pada suhu ruang. Untuk media agar miring, media agar SWC dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
2.4.3 Fase Pertumbuhan Bakteri Pada penelitian ini diperlukan perhitungan untuk menentukan kurva pertumbuhan bakteri. Sebanyak dua ose isolat bakteri ditumbuhkan dalam 100 ml media SWC cair dan diinkubasi pada inkubator suhu ruang. Pengukuran kerapatan sel (Optical Density) dilakukan setiap 3 jam sekali dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm yang mengacu pada penelitian sebelumnya oleh Aji (2014) hingga fase kematian. Sumarsih (2003) menyebutkan bahawa pertumbuhan dapat diamati dari meningkatnya jumlah sel atau massa sel (berat kering sel). Pada umumnya bakteri dapat memperbanyak diri dengan pembelahan biner, yaitu dari satu sel membelah menjadi 2 sel baru, maka pertumbuhan dapat diukur dari bertambahnya jumlah sel. Waktu yang diperlukan untuk membelah diri dari satu sel menjadi dua sel sempurna disebut waktu
generasi.
Waktu yang diperlukan oleh sejumlah
sel atau massa sel menjadi dua kali jumlah/massa sel semula disebut doubling time atau waktu penggandaan. Perhitungan Laju pertumbuhan bakteri D2.2 menggunakan rumus sebagai berikut: µ=
𝐿𝑜𝑔 10 𝑋𝑡−𝐿𝑜𝑔 10 𝑋0 0,301 𝑡
Keterangan : Xt = Jumlah kepadatan Akhir pada waktu eksponensial X0 = Jumlah kepadatan awal pada waktu eksponensial t = Waktu pertumbuhan eksponensial Sementara Waktu Generasi dapat dicari dengan rumus Waktu Generasi = t/n
Keterangan :
t n
= Waktu pertumbuhan eksponensial = Jumlah Generasi
10
sehingga kita bisa mencari jumlah generasi terlebih dahulu dengan rumus n= Ket. Log N
𝐿𝑜𝑔 𝑁−𝐿𝑜𝑔 𝑁0 0,301
= Jumlah sel Akhir
Log N0 = Jumlah Sel awal (Sumarsih, 2003)
2.4.4 Produksi Substansi Antibakteri Ekstraksi antibakteri yaitu media fermentasi SWC cair dan diinkubasi menggunakan
rotary shaker sampai fase kematian pada suhu ruang dengan
kecepatan 150 rpm. Setelah diinkubasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 25 menit untuk memisahkan supernatan dengan pelet sel bakteri (Isnansetyo et al.,2009) Pada penelitian ini ekstraksi antibakteri mengacu pada hasil penelitian Aji (2013) yakni hanya menggunakan pelet sel bakteri saja. Pelet sel bakteri dicuci menggunakan phospat buffer saline (PBS) dan ditambahkan 15 ml buffer yang sama. Suspensi sel bakteri kemudian dipecah menggunakan ultrasonicator selama 5 menit. Suspensi sel bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 25 menit untuk diambil supernatannya. Supernatan dibagi menjadi 2 bagian, bagian pertama ditambah aquades 50 ml kemudian diekstraksi menggunakan etil asetat sebanyak 2 kali dan di evaporasi menggunakan rotary evaporator dengan suhu 50ºC. Sementara bagian kedua menggunakan amonium sulfat dengan perlakuan sama seperti bagian pertama.
2.4.5 Uji Aktifitas Senyawa Antibakteri Uji aktifitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi (diffusion test) menggunakan kertas cakram. Kertas cakram dengan diameter 6 mm direndam dengan hasil ekstraksi sel etil asetat dan saturasi sel amonium sulfat. Kontrol positif menggunakan antibiotik Amoxyline sebanyak 25 mg sedangkan kontrol negatif direndam menggunakan akuades steril. Sebanyak 2 ose isolat bakteri uji yaitu S. aureus, A. hydrophila, V. alginolyticus, diencerkan masing-masing pada media cair TSB. Sebanyak 0,1 ml bakteri uji dimasukkan kedalam cawan petri yang berisi media TSA dan digerakkan menyerupai angka 11
delapan sehingga bakteri menyebar rata dengan. Masing-masing kertas cakram yang sudah kering diletakkan diatas permukaan media TSA kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, diamati dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk disekitar kertas cakram tersebut. Pola peletakkan kertas cakram sebagai berikut: 4. Kontrol Negatif 3. Kontrol Positif
1.
Eskstraksi sel etil asetat
2. Saturasi amonium sulfat
Bakteri uji
Gambar 3. Peletakkan kertas cakram
2.5
Variabel Penelitian Variabel yang diuji selama penelitian adalah pH dan salinitas. pH yang
digunakan adalah pH dengan kisaran 6, 7 dan 8 hal ini berdasarkan pH optimum pada organisme budidaya seperti udang vaname berkisaran 7-9 (Whetstone et al., 2002), sementara untuk udang windu pH optimumnya 8-8,5 (Amri, 2003). Salinitas yang digunakan adalah skala 0, 10, 20 dan 30 ppt. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Aziz (2010) organisme budidaya mampu hidup pada salinitas 0-30 ppt.
2.6
Analisis Data Fase pertumbuhan bakteri dari masing-masing perlakuan pada salinitas dan
pH yang berbeda disajikan dalam bentuk grafik pertumbuhan kemudian kepadatan diuji dengan uji sidik ragam (Anova) dan uji lanjut duncan pada selang kepercayaan 95%. Laju pertumbuhan disajikan dalam bentuk tabel. Setelah masa inkubasi dari uji aktivitas antibakteri, zona hambat dari masing-masing perlakuan diamati dan diukur diameter zona hambatnya.
12
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
4.1
Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan
diantaranya: 1. Perlakuan salinitas memberikan pengaruh terhadap laju pertumbuhan bakteri D2.2 dimana laju pertumbuhan paling cepat terdapat pada salinitas 20 dan 30 ppt dengan 0,179 dan 0,173 generasi/jam dengan waktu generasi selama 5,59 dan 5,97 jam. Sementara perlakuan pH tidak memberikan pengaruh nyata terhadap laju pertumbuhan bakteri D2.2. 2. Aktivitas antibakteri (uji zona hambat) tertinggi dari bakteri D2.2 terdapat pada uji tantang terhadap bakteri Vibrio alginolyticus dengan zona hambat 14 mm dengan ekstraksi sel menggunakan etil asetat.
4.2
Saran 1. Perlu dilakukan uji kandungan senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri D2.2. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengetahui kondisi fisik lainnya yang mempengaruhi aktivitas pertumbuhan serta aktivitas antibakteri yang dihasilkan bakteri D2.2.
21
DAFTAR PUSTAKA
Abraham, T. J. (2004). Antibacterial Marine Bacterium Luminous Vibriosis in Shrimp Larvae. . NAGA, WordFish Quarterly , 27 (3&4). Aji, M. B. (2014). Aktivitas Senyawa Antimikroba dari Bakteri Biokontrol D2.2 Terhadap Bakteri Pada Udang dan Ikan Secara In Vitro. skripsi: Unila. Al-Janabi, A. (2006). Identification of Bacitracin Produced by Local Bacillus licheniformis. African Journal of Biotechnology , Vol. 5 (18), pp. 16001601. Balcazar, J. L., & Tryson, R. L. (2007). Inhibitory Aktivity of Probiotic Bacillus substilis UTM 126 Against Vibrio Spesies Confers Protection Against Vibriosis in Juvenil Shrimp (Litepenaeus vannamei). Equador: Faculty of Aquaculture, Technical University Of Machala. Cao Y, H., Zhou, Z., Zhang, M., Mao, W., Zhang, H., & Yao, B. (2012). Orally Administered Thermostable N-acyl Homoserine lactonase from Bacillus sp. starin AI96 Attenuates Aeromonas hydrophhila Infection in Zebrafish. Jurnal AEM 10.1128/AEM.06, 139-11. Daliningrum, I. M., Salamah, E., & Tampubolon, K. (2009). Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kerang Darah (Anadara granosa) Sebagai Senyawa Antibakteri. Bogor: Fakultas Perikanan dan Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Devianto, L. A., & Kardena, E. (2010). Pengaruh Glukosa Terhadap Produksi Biosurfaktanoleh Azotobacter vinelandii dan Pengaruh Biosurfaktan Terhadap Biodegredasi Thp oleh Konsorsium Bakteri Petrofilik. Program Study Teknik Lingkungan Fakultas Teknik Sipil dan Lingkungan, Institut Pertanian Bogor. Irianto, K. (2007). Mikrobiologi: Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung: CV Yrama Widya. Isnansetyo, A., & Kemei, Y. (2003). Pseudoalteromonas Phenolica sp. nov., A Novel Marine Bacterium that Produces Phenolic AntimethihillinResistant Staphylococcus aureus (MRSA) substances. . Int J Syst Evol Microciol, 53:583-588.
25
Isnansetyo, A., Istiqomah, I., Sinansari, S., Hermawan, R. K., Triyanto, & Widada, J. (2009). A Potential Bacterial Biocontrol Agent, Strain S2V2 against Pathogenic Marine Vibrio in Aquaculture. Journal Micro Biotechnol, 25: 1103-1113. Kharisma, A., & Manan, A. (2012). Kelimpahan Bakteri Vibrio sp. pada air pembesaran udang vannamei (Litopenaeus vannamei) sebagai deteksi dini serangan penyakit vibriosi. jurnal ilmiah perikanan dan kelautan 4 (2). Universitas airlangga. Mariska, D. C. (2013). Penapisan Kandidat Bakteri Biokontrol dari Perairan Tambak Udang Tradisional terhadap Bakteri Vibrio harveyi. Lampung: Universitas Lampung. Muliani, A., Suwanto, & Hala, Y. (.2003). Isolasi dan karakterisasi bakteri asal Laut Sulawesi untuk biokontrol penyakit vibriosis pada larva udang windu (Penaeus monodon). ISSN 0854-8587., 10 (1): 6-11. Pan, X., Chen, F., Wu, T., Tang, H., & Zhao, Z. (2009). The Acid. Bile Tolerance and Antimicrobial Property of Lactobacillus acidophilus. NIT J. Food Control, 20: 598-602. Pelczar, M. J., & Chan, E. (2005). Dasar-dasar Mikrobiologi 2. Dalam R. Hadieutomo, T. Imas, S. Tjitrosomo , & S. Angka, ELements of Microbiology and Biotecnology. (hal. 167-170). Jakarta: UI Press. Prajitno, A. (2005). The Sensitivity Test Of Flavonoid, of Eucheuma cottoni With Different Concentration as Vibrio harveyi By In. Jurnal Protein ejournal.umm.ac.id. Purwoko, T. (2007). Fisiologi Mikroba. . Jakarta: PT Bumi Aksara. Rukyani, A., & Supriyadi, H. (2000). The Use of Chemicals in Aquaculture in Indonesia. Sukamandi, West Java, Indonesia: Research Institute for Freshwater Fisheries. Suriani, S., Soemarno, & Suharjono. (2013). Pengaruh Suhu dan pH terhadap Laju Pertumbuhan Lima Isolat Bakteri Genus Pseudomonas yang diisolasi dari Ekosistem Singai Tercemar di Sekitar Kampus Universitas Brawijaya. J-PAL Program Magister Pengelolaan Sumber Daya lingkungan Universitas Brawijaya, Malang., Vol. 2: 2.
26
Utami, R. H. (2013). Identifikasi Parasit Pada Ikan Badut (Amphirion percula) Di Balai Besar Pengembangan Budidaya Laut (BBPBL) Lampung. Bandar Lampung: Unila Skripsi. Walpole, & Ronald, E. (1992). Pengantar Statistika Edisi ke-3. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Widanarni, D., Meha, S., Nuryati, Sukenda, & Suwan, A. (2004). Uji Patogenisitas Vibrio harveyi Pada Larva Udang Windu Menggunakan Resisten Rifampisin Sebagai Penanda Molekuler. Jurnal Akuakultur Indonesia, IPB, 3(3): 23-27. Wijayati, A., & Suhartono. (.2000). Penggunaan Antimikroba sebagai Pengganti Obat-Obatan untuk Mengendalikan Penyakit Udang. Jakarta: Laporan tahunan BBAP 1999-2000.
27
