KINETIKA AKTIVITAS REDUKSI NITRAT BAKTERI NITRAT AMONIFIKASI DISIMILATIF DARI MUARA SUNGAI PADA KONSENTRASI OKSIGEN (O 2 ) YANG BERBEDA TETI MARDIATI

KINETIKA AKTIVITAS REDUKSI NITRAT BAKTERI NITRAT AMONIFIKASI DISIMILATIF DARI MUARA SUNGAI PADA KONSENTRASI OKSIGEN (O2) YANG BERBEDA

TETI MARDIATI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi Oksigen (O2) yang Berbeda adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulisan lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini

Bogor, Juni 2009

Teti Mardiati NRP G351070201

ABSTRACT TETI MARDIATI, Nitrate Reduction Activity Kinetics of Dissimilative Nitrate Ammonification Bacteria Isolated from Estuary under Different Concentration of Oxygen. Under direction of IMAN RUSMANA and TRI WIDIYANTO. Dissimilative Nitrate ammonification bacteria have ability to remove nitrate in aquatic environments. These groups are consist of fermentative bacteria which reduce nitrate to ammonium with nitrous oxide (N2O) as by product. Four selected isolates from tropical estuary were tested the growth and nitrate reduction activities under different concentration of oxygen (O2). The results showed that Cell density was increased by increasing of oxygen concentration. In contrast, the activities of nitrate reduction was decreased by increasing of oxygen concentration. HF7 and LF6 isolates had the highest nitrate reducing activity. The maximum specific growth of HF7 isolate with asetate as carbon source, and 49.41 mM nitrate after 96 h incubation under air saturated of 1%, 10%, 100% was 0.034 CFUh-1, 0.040 CFUh-1, and 0.070 CFUh-1 respectively. While LF6 isolate was 0.035 CFU h-1, 0.045 CFU h-1, and 0.057 CFU h-1. Nitrate removal rate of HF7 isolate with asetate as carbon source, and 49.41 mM nitrate after 96 h incubation under air saturated of 1%, 10%, 100% was 6.3 x 10 -10 mMh-1, 5.1 x 10 -10 mMh-1, and 3.3 x 10-10 mMh-1 respectively. While LF6 isolate was 2.0 x 10-10 mMh-1, 2,1 x 10-10 mMh-1 and 1,0 x 10-10 mMh-1 respectively. Keywords: nitrate reduction, dissimilative nitrate ammonification oxygen concentration.

bacteria,

RINGKASAN TETI MARDIATI. Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi Oksigen yang Berbeda. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan TRI WIDIYANTO. Bakteri nitrat amonifikasi disimilatif atau Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium (DNRA) termasuk kedalam kelompok bakteri pereduksi nitrat. Bakteri DNRA bersifat fermentatif, dapat mendegradasi senyawa organik dalam lingkungan oksigen terbatas atau anaerob. Penggunaan nitrat sebagai akseptor elektron oleh kelompok bakteri ini, dapat mengurangi kadar nitrat di perairan. Pada sisi lain bakteri DNRA menghasilkan produk samping N2O (nitrous oksida), gas yang berpotensi meningkatkan pemanasan global. Meskipun bakteri DNRA umumnya mereduksi nitrat menjadi amonium pada kondisi anoksik, tetapi pada beberapa bakteri ditemukan reduksi nitrat berlangsung secara aerob. Sensitivitas sistem reduktase bakteri DNRA daerah tropik terhadap oksigen belum banyak diketahui. Bertolak dari hal tersebut perlu dilakukan penelitian pengaruh oksigen terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat bakteri DNRA yang berasal dari muara sungai di daerah tropik. Empat isolat terseleksi dari muara sungai daerah tropik, telah diuji pertumbuhan dan aktivitas reduksi nitratnya pada konsentrasi oksigen yang berbeda. Keempat isolat tersebut adalah isolat HF7, LF6 (berasal dari muara Sungai Cisadane) dan isolat FR1, FR2 (berasal dari muara Sungai Cimandiri). Tingkat pencemaran muara Sungai Cisadane lebih tinggi dari pada muara Sungai Cimandiri. Metoda penelitian dilakukan melalui 3 tahap, yaitu konfirmasi kemurnian isolat dan peremajaan, seleksi aktivitas konsentrasi oksigen berbeda, dan kinetika aktivitas reduksi nitrat isolat terpilih pada konsentrasi oksigen berbeda. Pengkondisian konsentrasi oksigen dilakukan dengan mengatur volume saturasi udara pada head space botol sampel dengan penggunaan gas nitrogen murni. Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa-senyawa yang dihasilkan diukur dengan analisis nitrat metoda Greenberg, analisis nitrit metode Sulfanilamid dan analisis amonium metoda Phenate. Hasil penelitian tahap seleksi menunjukkan kerapatan sel cenderung meningkat sejalan dengan penambahan konsentrasi oksigen. Aktivitas reduksi nitrat cenderung menurun sejalan dengan penambahan konsentrasi oksigen. Isolat HF7 dan LF6 memiliki kemampuan mereduksi nitrat paling tinggi, dengan perkiraan gas N2O yang dihasilkan lebih sedikit dibandingkan isolat FR1 dan FR2. Kedua isolat dijadikan isolat terpilih untuk diamati laju pertumbuhan dan kinetika aktivitas reduksi nitratnya. Hasil pengamatan laju pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 menunjukkan konsentrasi oksigen mempengaruhi laju pertumbuhan kedua isolat. Laju pertumbuhan spesifik maksimum (µ maks) dari isolat HF7 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100% dengan sumber karbon asetat dan nitrat media 49,41mM secara berurut adalah 0,034 CFU/jam, 0,040 CFU/jam, dan 0,070 CFU/jam. Laju pertumbuhan spesifik dari isolat LF6 pada kondisi yang sama secara berurut adalah 0,035 CFU /jam, 0,045 CFU /jam, dan 0,057 CFU /jam.

Kecepatan rata-rata mengurangi nitrat medium oleh setiap sel isolat HF7 dengan sumber karbon asetat, nitrat medium 49,41 mM, masa inkubasi 96 jam pada konsentrasi udara saturasi 1%, 10%, 100% secara berurut adalah 6,3 x 10-10 mMJ-1, 5,1 x 10-10 mMJ-1, dan 3,3 x 10-10 mMJ-1. Sedangkan rata-rata kecepatan reduksi setiap sel isolat LF6 pada kondisi yang sama secara berurut adalah 2,0 x 10 -10 mMJ-1, 2,1 x 10-10 mMJ-1 dan 1,0 x 10-10 mMJ-1. Dari hasil penelitian keseluruhan menunjukkan bahwa oksigen berpengaruh terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat bakteri DNRA yang berasal dari muara sungai daerah tropik. Besarnya pengaruh oksigen terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat tergantung pada sensitivitas sistem nitrat reduktase yang dimiliki oleh isolat bakteri. Konsentrasi oksigen berbeda lebih besar pengaruhnya pada isolat HF7 dibandingkan terhadap isolat LF6. Perkiraan konsentrasi gas N2O tertinggi yang dihasilkan pada isolat HF7 dengan nitrat medium 49,41 mM dan sumber karbon asetat terdapat pada konsentrasi saturasi udara 100%. Sedangkan pada isolat LF6 diperkirakan menghasilkan gas N2O terbesar pada konsentrasi saturasi udara 10%. Kata kunci : Reduksi nitrat, bakteri nitrat amonifikasi disimilatif, konsentrasi oksigen.

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

KINETIKA AKTIVITAS REDUKSI NITRAT BAKTERI NITRAT AMONIFIKASI DISIMILATIF DARI MUARA SUNGAI PADA KONSENTRASI OKSIGEN (O2) YANG BERBEDA

TETI MARDIATI

Tesis Sebagai salah satu syarat untukmemperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

Judul Tesis

Nama NRP

: Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi Oksigen (O2) yang Berbeda : Teti Mardiati : G351070201

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Iman Rusmana, M. Si. Ketua

Dr. Tri Widiyanto, M. Si Anggota Diketahui

Ketua Mayor Mikrobiologi

Dr. Ir. Gayuh Rahayu

Tanggal Ujian: 18 Juni 2009

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.

Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Munti Yuhana, M.Si.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas limpahan rahmat, karunia dan ridho-Nyalah tesis yang berjudul ”Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif dari Muara Sungai pada Konsentrasi Oksigen (O2) yang Berbeda” dapat diselesaikan. Pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan dan bimbingan berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Bapak Dr. Tri Widiyanto, M.Si selaku komisi pembimbing atas bantuan, bimbingan dan pengarahan yang telah diberikan selama penelitian dan penulisan tesis ini sehingga penulis dapat menyelesaikan dengan baik. 2. Departemen Agama RI yang telah memberikan beasiswa pendidikan. 3. Ketua Program Studi Biologi, Ketua Mayor Mikrobiologi, Ketua dan Staf Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor yang telah membantu dalam menyediakan fasilitas hingga terlaksananya penelitian ini. 4. Suami, Ibunda, dan anak-anak tercinta, seluruh keluarga serta rekan-rekan di MAN Batumandi yang telah banyak memberikan dukungan, hingga penulis mampu menyelesaikan studi ini dengan baik. 5. Rekan-rekan angkatan 2007 Program studi Biologi, rekan-rekan lab mikrobiologi, Mbak Ratna, Irul dan Ria

atas segala bantuan dan

kerjasamanya. Akhirnya semoga tesis ini bermanfaat bagi semuanya. Amin.

Bogor, juni 2009

Teti Mardiati

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 19 Agustus 1967 dari ayah Ahmad Hidayat dan ibu Siti Rokilah. Penulis merupakan anak pertama dari enam bersaudara. Penulis menyelesaikan program sarjana (SI) Jurusan Biologi Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IKIP Bandung pada tahun 1990.

Penulis bertugas sebagai staf Pengajar Biologi pada Madrasah Aliyah

Negeri (MAN) Batumandi Kabupaten Agam Sumatera Barat sejak tahun 1992 sampai sekarang. Pada bulan Juli 2007 penulis melanjutkan kuliah ke Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Program Studi Biologi Mayor Mikrobiologi melalui beasiswa pendidikan Departemen Agama RI.

Bogor, juni 2009

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman. DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... xv PENDAHULUAN ..........................................................................................

1

Latar Belakang ......................................................................................

1

Tujuan...................................................................................................

3

TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................

4

Muara sungai.........................................................................................

4

Muara Sungai Cimandiri dan Cisadane..................................................

6

Bakteri Pereduksi Nitrat ........................................................................

7

Enzim-Enzim yang Berperan Dalam Reduksi Nitrat ..............................

8

Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif (DNRA) ...................................

9

METODE PENELITIAN............................................................................ .... 13 Waktu dan Tempat penelitian ................................................................ 13 Bahan Penelitian .................................................................................. 13 Konfirmasi dan Peremajaan Isolat. ....................................................... 13 Seleksi Aktivitas Reduksi Nitrat pada Konsentrasi Oksigen (O2) yang Berbeda ....................................................................................... 14 Analisis nitrit. .............................................................................. 15 Analisis nitrat .............................................................................. 15 Analisis amonium ........................................................................ 16 Perhitungan Pembentukan Gas. ........................................................... 16 Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Isolat Terpilih ................................. 17 HASIL ............................................................................................................ 19 Karakteristik, Morfologi dan Fisiologi Bakteri Amonifikasi Disimilatif ............................................................................................ 19 Densitas Sel isolat Bakteri DNRA Pada Konsentrasi O2

yang Berbeda ....................................................................................... 21 Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri DNRA pada Konsentrasi Oksigen yang Berbeda......................................................................... 22 Pertumbuhan Isolat Terpilih ................................................................ 25 Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat ........................................................ 26 PEMBAHASAN............................................................................................. 32 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................ 41 Simpulan............................................................................................... 41 Saran..................................................................................................... 41 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 42 LAMPIRAN ................................................................................................... 46

DAFTAR TABEL Halaman 1. Karakterisasi morfologi dan fisiologi isolat LF6, HF7, FR2,dan FR1 ............. 20 2. Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat HF7 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100% setelah inkubasi 96 jam suhu ruang (29-31)oC ........................................................................... 31 3. Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%, setelah inkubasi 96 jam suhu ruang (29-31)oC.......................................................................... 31

DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Daur biogeokimia nitrogen di perairan ........................................................... 5 2. Lintasan reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri (1) Denitrifikasi, (2).Reduksi nitrat amonifikasi disimilatif (3) Oksidasi amonia secara anaerob................................................................................................ .8 3. Bagan pembentukan N2O pada reduksi nitrat oleh bakteri DNRA ................ 10 4. Enzim pereduksi nitrat bakteri nitrat amonifikasi disimilatif ....................... 11 5. Morfologi koloni dari isolat LF6, HF7, FR2 dan FR1 pada medium denitrifikasi ..................................................................................... 19 6. Hasil uji fermentatif pada isolat FR1, FR2, HF7 dan LF6, setelah inkubasi 48 jam ............................................................................................ 21 7. Densitas sel Isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31)0C. ......................................................................... 22 8. Jumlah nitrat tereduksi oleh isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang ( 29-31)0 C .................................................................. 22 9. Jumlah nitrit terakumulasi dari isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31)0 C ................................................... 23 10.Jumlah amonium yang dihasilkan dari isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang ( 29-31)0C.................................................... 24 11.Pola pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara Berbeda......................................................................................................... 25 12.Laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara berbeda .................................................................................. 26 13. Aktivitas reduksi nitrat, pembentukan nitrit dan amonium dari isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%. .............. 27 14. Perbandingan pertumbuhan sel isolat HF7 dan LF6 dengan penurunan konsentrasi nitrat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100% ...... 29

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Pembentukan warna pada uji kadar nitrat (A), nitrit (B) dan amonium (C)................................................................................................ 47 2. Kurva standar konsentrasi amonium (A) dan kurva standar konsentrasi nitrit (B) ............................................................................... .48 3. Jumlah CFU Isolat HF7 dan LF6 pada pengenceran 10-8 ............................ 49 4. Kurva standar pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 pada kondisi nitrat medium 49,41 mM............................................................................. 50 5. Presentase nitrat tereduksi dan senyawa yang dihasilkan isolat LF6,HF7 dan FR2 pada kadar saturasi udara berbeda dengan inkubasi selama 4 hari suhu ruang (29-31)oC................................................. 51 6. Presentase nitrat tereduksi dan senyawa yang dihasilkan isolat FR1 pada kadar saturasi udara berbeda dengan inkubasi selama 4 hari suhu ruang (29-31)oC ........................................................................... 52 7. Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit, nitrat, amonium dan estimasi gas yang dihasilkan isolat LF6 dan HF7 ................................... 53 8. Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit, nitrat, amonium dan estimasi gas yang dihasilkan isolat FR1 dan FR2 ................................... 54

PENDAHULUAN Latar Belakang Bakteri nitrat amonifikasi disimilatif atau Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium (DNRA) termasuk ke dalam kelompok bakteri pereduksi nitrat. Kelompok bakteri pereduksi nitrat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron dalam

respirasi anaerob (Purwoko 2007). Di alam bakteri pereduksi nitrat

berperan dalam degradasi senyawa organik pada lingkungan oksigen terbatas atau anaerob. Bakteri pereduksi nitrat juga merupakan bagian dari mikroorganisma yang terlibat dalam siklus biogeokimia nitrogen global. Kelompok bakteri ini dapat mengurangi

kadar nitrogen tanah pertanian (kelompok denitrifikasi),

bermanfaat dalam pengolahan air limbah, perbaikan kualitas perairan seperti tambak (Madigan et al. 2006; Maier et al. 2000; Widiyanto 2006). Pada sisi lain kelompok bakteri ini dapat menghasilkan produk samping atau produk antara gas nitrous oksida (N2O). Gas N2O merupakan salah satu gas rumah kaca yang dapat meningkatkan pemanasan global seperti gas CO2 dan CH4. Penambahan gas N2O setiap tahunnya 0,2-0,3% (Conrad 1995) dengan kalor jenis N2O lebih besar dan waktu tinggal (residence time) di atmosfer lebih lama, maka jumlah kalor yang diserap oleh N2O tinggi. Gas N2O memiliki potensi penyerapan panas 150 kali lebih besar dari pada gas CO2. Pada stratosfer N2O dapat terfotolisis menjadi NO atau N2 yang menyebabkan terjadinya pengkisan lapisan ozon (Rusmana 2003c). Proses Fotolisis N2O menjadi NO atau N2 dapat mengubah senyawa ozon (O3) menjadi gas oksigen (O2). Hal tersebut memperbesar radiasi cahaya matahari terhadap bumi. N2O diperkirakan sebanyak 90% berasal dari proses biotik (Rusmana 2003c). Penambahan pupuk nitrogen, limbah senyawa nitrogen dari industri, dan pembakaran bahan bakar fosil memperbesar emisi senyawa N2O. Terdapat hubungan linier antara penambahan pupuk nitrogen pada areal pertanian dengan peningkatan emisi N2O (Li 2004). Pencemaran nitrogen dari daratan terakumulasi di muara sungai. Mikroorganisma pereduksi nitrat menjadi dominan pada muara sungai yang tercemar senyawa nitrogen termasuk bakteri DNRA yang bersifat fermentatif (Rusmana dan Nedwell 2004).

Proses pembentukan N2O pada bakteri DNRA bukan

sebagai senyawa

antara seperti yang dihasilkan oleh bakteri denitrifikasi, tetapi merupakan produk samping melalui reaksi kimia dalam menghasilkan amonium (Rusmana 2003a). Kelompok bakteri ini memanfatkan senyawa nitrat sebagai penerima elektron alternatif untuk mendapatkan energi dibawah kondisi oksigen terbatas (Ricardson et al. 2001). Purwoko (2007) menyatakan bahwa fermentasi sebenarnya merupakan proses yang tidak memerlukan oksigen tetapi organisma fermentatif terkadang memerlukan oksigen untuk proses metabolisma lainnya maupun pertumbuhannya. Walaupun nitrat amonifikasi disimilatif dan denitrifikasi termasuk proses anoksik tetapi reduksi nitrat dapat terjadi pada kondisi aerob. Jenis bakteri yang dapat melakukan reduksi nitrat pada kondisi aerob diantaranya Escherichia coli, Thiosphaera pantotropha, dan Pseudomonas aeroginosa (Carter et al. 1995). Kemampuan bakteri tersebut mereduksi nitrat pada kondisi aerob dan anaerob berkaitan dengan enzim yang dimilikinya. Enzim nitrat reduktase pada membran sel (Nar) aktivitasnya dapat dipengaruhi oleh konsentrasi oksigen, dimana oksigen menghambat sistem transpor nitrat ke membran. Enzim Nap yang mereduksi nitrat dalam periplasma tidak sensitif terhadap oksigen. Ekspresi gen nar dipengaruhi oleh ketersediaan oksigen dan nitrit sedangkan gen nap tidak (Moreno - Vivian et al. 1999). Menurut Holt et al. (1994) sebagian besar bakteri fermentatif memiliki dua jalur metabolisma, yaitu respirasi dan fermentatif. Secara umum bakteri fermentatif

pereduksi

nitrat

bersifat

desulfuricans adalah salah satu bakteri

anaerob

fakultatif,

Desulfovibrio

yang dapat memanfaatkan nitrat atau

sulfat sebagai akseptor elektron yang bersifat anaerob obligat. Keberadaan oksigen berpengaruh pada aktivitas reduksi nitrat bakteri fermentatif. Terdapat hubungan antara ketersediaan oksigen dengan pembentukan amonium hasil aktivitas bakteri fermentatif. Hasil penelitian pada sedimen perairan estuari Colne di Inggris menunjukkan konsentrasi amonium bertambah dengan bertambahnya kedalaman (Rusmana 2003a). Hasil penelitian yang dilakukan Bonin et al. (1989) menunjukkan bahwa pembentukan nitrat, nitrit dan N2O oleh Pseudomonas nautica pada konsentrasi

oksigen lebih besar dari 4,05 mg/l; 2,15 mg/l; 0,25 mg/l sepenuhnya dihambat. Demikian juga pada percobaan Kester et al. (1997) menunjukkan bahwa pada kultur Alcaligenes eutropus, Nitrosomonas europia dan Pseudomonas stutzeri dengan aerasi berbeda didapatkan jumlah produk yang berbeda. Pada udara saturasi 80 % produksi NO dan N2O adalah 0,87% dan 0,17%, sedangkan pada udara saturasi 1% berubah menjadi 2,32% dan 0,78%. Kemampuan mereduksi nitrat Pseudomonas stutzeri pada udara saturasi 90% setelah diinkubasi 92 jam, dengan sumber karbon suksinat adalah 99,24%. Sementara itu pada Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 pada kondisi udara saturasi, suhu dan sumber karbon yang sama adalah 27,29% (Su et.al 2000). Berdasarkan beberapa penelitian tersebut yang banyak dilakukan pada kelompok bakteri denitrifikasi dan bakteri yang berasal dari daerah beriklim sedang, maka perlu dilakukan pengujian pengaruh konsentrasi oksigen terhadap kinetika aktivitas bakteri DNRA muara sungai di daerah tropik. Pengaruh oksigen sebagai sesama akseptor elektron terhadap efektivitas reduksi nitrat menjadi amonium perlu diamati, termasuk prediksi senyawa N2O yang dihasilkan. Hasil penelitian ini diharapkan dapat melengkapi pengetahuan fisiologi respirasi bakteri pereduksi nitrat.

Langkah selanjutnya adalah kemungkinan

kelompok bakteri ini dapat dimanfaatkan dalam strategi penanggulangan masalah lingkungan seperti pengolahan limbah dan perairan tercemar, konservasi kesuburan tanah dan menjaga kualitas perairan seperti tambak, danau

tanpa

menimbulkan emisi Nitrous Oksida (N2O).

Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi oksigen terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat oleh bakteri nitrat amonifikasi disimilatif yang berasal dari muara Sungai Cimandiri Sukabumi Jawa Barat dan muara Sungai Cisadane Tanggerang Banten.

TINJAUAN PUSTAKA Muara sungai Muara sungai termasuk ke dalam ekosistem estuari, dimana air tawar dan air laut bercampur. Bahan-bahan organik dan anorganik yang terdapat di muara sungai sebagian diendapkan, terlarut dan terbawa oleh arus ke laut. Salah satu proses yang mempengaruhi konsentrasi bahan-bahan organik dan anorganik pada muara sungai adalah proses biologi (Chester 1990). Menurut Dahuri et al. (1996) kualitas air suatu perairan pesisir seperti muara dicirikan oleh karakteristik kimianya yang mudah dipengaruhi oleh masukan air yang berasal dari daratan (melalui sungai) dan lautan sekitarnya. Proses pembuangan limbah dari daratan melalui aliran sungai atau dari lautan yang berlangsung secara terus menerus akan mengakibatkan turunnya kualitas air muara sungai. Pencemaran muara sungai oleh senyawa nitrogen lebih dominan berasal dari daratan. Pada muara sungai terjadi daur biogeokimia nitrogen, yaitu terjadinya perubahan-perubahan senyawa atau unsur nitrogen dalam medium dan peristiwa yang berbeda. Beberapa

proses transformasi senyawa nitrogen melibatkan

berbagai jenis bakteri yaitu bakteri yang berperan dalam amonifikasi, asimilasi, fiksasi, nitrifikasi dan reduksi nitrat disimilatif. Amonifikasi adalah proses pembentukan amonia dari materi organik dilakukan oleh bakteri dan cendawan safrofit. Asimilasi adalah proses pemanfaatan senyawa nitrogen anorganik untuk pembentukan asam amino dalam protoplasma. Fiksasi nitrogen yaitu peristiwa pengikatan gas nitrogen (N2) umumnya terjadi di daratan, simbiosis alga di perairan dan percampuran nitrogen dari atmosfer. Nitrifikasi merupakan reaksi oksidasi pembentukan nitrat yang berasal dari amonia. Reduksi nitrat disimilatif merupakan reaksi reduksi terhadap nitrat dimana nitrat direduksi melalui tahap-tahap tertentu dengan hasil akhir amonium atau gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan terjadi di atas sedimen muara sungai adalah denitrifikasi (Dong et al. 2002). Denitrifikasi yaitu reaksi reduksi yang mengubah nitrat menjadi nitrit, nitrit oksida, nitrous oksida dan terakhir gas nitrogen. Reduksi nitrat disimilatif yang dominan pada

bagian sedimen muara sungai adalah nitrat amonifikasi disimilatif (Rusmana 2003a). Madigan et al. (2006) menyatakan proses penghilangan senyawa nitrogen di tanah dan perairan melalui proses denitrifikasi dan anaerob ammonia oxidation (anammox). Kedua proses tersebut menghasilkan gas nitrogen dan nitrous oksida (denitrifikasi) sebagai produk akhir. Proses ini jika terjadi di areal pertanian dapat menurunkan produktivitas hasil pertanian. Senyawa-senyawa nitrogen yang terdapat di muara sungai secara umum terlibat dalam daur biogeokimia seperti yang dijelaskan oleh Kennish (1994) seperti terlihat pada Gambar 1.

Gambar 1 Daur biogeokimia nitrogen di perairan

Muara Sungai Cimandiri dan Cisadane Muara Sungai Cimandiri kabupaten Sukabumi Jawa Barat, merupakan muara sungai yang telah tercemar. Berbagai sampah rumah tangga / pemukiman, limbah areal pertanian (sawah, perkebunan) dan bahan-bahan lain sepanjang Daerah Aliran Sungai (DAS) Sungai Cimandiri terakumulasi di muara. Kualitas air pada muara sungai Cimandiri sudah mengalami penurunan (Marnis 2008). Selain limbah yang masuk ke perairan sungai, aktivitas penambangan pasir sepanjang DAS menyebabkan warna perairan di sekitar muara menjadi coklat sampai jarak yang cukup jauh dari pantai (Marnis 2008). Pada kondisi kimia dan fisik perairan seperti itu

akan memicu

pertumbuhan mikroorganisma-

mikroorganisma aerob fakultatif dan anaerob disamping bakteri aerob, termasuk mikroorganisme yang memanfaatkan senyawa nitrogen baik organik (protein, asam amino) atau senyawa anorganik (nitrat, nitrit, dan amonium). Muara

Sungai

Cisadane

merupakan

muara

sungai

yang

tingkat

pencemarannya lebih tinggi dari muara Sungai Cimandiri. Sungai Cisadane selain sebagai sumber air yang dimanfaatkan penduduk untuk keperluan sehari-hari, juga merupakan sumber perairan pertanian. Disamping itu berfungsi sebagai tempat penampungan limbah yang berasal dari limbah rumah tangga, industri, pertanian dan perternakan (Brahmana & Suriati 2001). Beberapa parameter kualitas air yang menunjukkan muara Sungai Cisadane tercemar adalah rendahnya kandungan oksigen terlarut, tingginya konsentrasi nitrit dan amonia serta suhu perairan yang tinggi. Kandungan oksigen terlarut berkisar antara 0,39-2,33 mg/l, dan suhu 32,0-32,60C. Kandungan senyawa nitrit 0,03-0,14 mg/l dan amonia 0,09-1,19 mg/l (Syahputra 2007). Tingkat pencemaran muara Sungai Cisadane pada musim hujan akan lebih rendah karena faktor pengenceran oleh air hujan, termasuk air hujan dari hulu melalui aliran sungai. Muara sungai yang banyak mengandung limbah organik dan anorganik yang mengandung senyawa nitrogen diduga menghasilkan emisi Nitrous Oksida (N2O) yang lebih besar. Emisi N2O dari perairan dan muara kurang lebih 66%, produksi gas ini berkorelasi positif dengan konsentrasi nitrat atau nitrit perairan (Seitzinger & Kroezen 1998; Rusmana 2003c).

Pada kedua muara sungai diatas senyawa nitrogen umumnya berasal dari limbah organik rumah tangga sepanjang daerah aliran sungai yang mengalami dekomposisi, limbah pupuk nitrogen anorganik areal pertanian dan senyawa nitrogen anorganik tanah yang mengalami erosi tepi sungai. Sumber senyawa nitrogen lain berasal dari proses nitrifikasi, proses dekomposisi mikroorganisma dan eksresi organisma di habitat muara sungai serta gas oksida nitrogen dari udara yang terlarut melalui air hujan. Limbah industri merupakan faktor utama pencemaran yang meningkatkan senyawa nitrogen pada muara Sungai Cisadane disamping faktor-faktor di atas.

Bakteri Pereduksi Nitrat Kelompok bakteri pereduksi nitrat merupakan mikroorganisma yang terlibat dalam daur nitrogen di alam. Kelompok bakteri ini berperanan dalam pengubahan senyawa nitrat menjadi produk akhir gas nitrogen atau senyawa amonium. Rusmana (2003b) menyatakan bahwa terdapat tiga proses reduksi nitrat disimilatif pada bakteri yaitu denitrifikasi, reduksi nitrat menjadi amonium disimilatif dan oksidasi amonium disimilatif (anaerob ammonia oxidation, anammox). Denitrifikasi adalah proses reduksi nitrat menjadi N2O atau N2. Pada proses ini bakteri menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir untuk memperoleh energi pada kondisi O2 terbatas atau anaerob (Zumft 1997; Ricardson 2000; Ricardson et al. 2001). Reduksi nitrat menjadi amonium disimilatif adalah proses untuk menghilangkan kelebihan tenaga pereduksi dan menunjang pertumbuhan bakteri pada kondisi anaerob (Cole 1996). Anamoks adalah oksidasi amonia secara anaerobik dimana terjadi pengubahan amonium dan nitrat atau nitrit menjadi gas nitrogen. Pada metabolisma ini membentuk senyawa antara hidroksil amin dan hidrazin (Jetten et al. 2001). Tiga lintasan proses reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri dapat digambarkan sebagai berikut (Rusmana 2003b).

NO

N 2O

N2

NO

N 2O

N2

(1) (1)

N2O

(3)

N2O NO3

-

NO3-

-

NH4

NO2-

NH4

NO2

NH2OH NH2OH

NH3

(2) (2) N2H2

N2

(3)

N2H2

N2

(3)

NH3

Gambar 2 Lintasan reduksi nitrat oleh aktivitas bakteri (1) Denitrifikasi, (2).Reduksi nitrat amonifikasi disimilatif (3) Oksidasi amonia secara anaerob. Enzim-Enzim yang Berperan pada Reduksi Nitrat Kelompok bakteri pereduksi nitrat baik denitrifikasi, bakteri DNRA maupun anamoks

memiliki enzim-enzim tertentu untuk mengkatalisasi reaksi-reaksi

reduksi nitrat. Enzim pada bakteri denitrifikasi adalah nitrat reduktase (Nar dan Nap), Nitrit reduktase (Nir), Nitrit oksid reduktase (Nor), Nitrous oksid reduktase (Nos) (Moreno - Vivian et al. 1999; Zumft 1997; Ricardson et al. 2001). Bakteri DNRA memiliki enzim nitrat reduktase (Nap dan Nar) yang mereduksi nitrat menjadi nitrit dan dua enzim yang mereduksi nitrat menjadi amonium yaitu Nir B (Harbone et al. 1992) dan enzim formate dependent nitrite reduction to amonium atau Nrf (Cole 1996).

Pada spesies tertentu

seperti

Wollinella succinogens dan Campylobacter fetus memiliki enzim nitrous oksida reduktase (Nos). Enzim ini mereduksi gas N2O menjadi gas Nitrogen (Zumft 1997). Enzim yang terdapat pada bakteri anamoks adalah nitrit reducing enzyme (NR) yaitu enzim yang mereduksi nitrit menjadi hidroksil amin (NH2OH). Hidrazin Hidrolase (HH) enzim yang mereduksi hidroksilamin menjadi hidrazin (N2H4) dan Hydrazine – oxidising enzyme (HZO), enzim yang mengoksidasi hidrazin menjadi gas nitrogen (Jetten et al. 2001).

Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif (DNRA) Pada kondisi yang sesuai beberapa genus dapat mereduksi nitrit menjadi amonia melalui proses reduksi nitrat disimilasif. Prosesnya berlangsung pada saat kandungan senyawa nitrit tinggi (Kelso et al. 1997). Kelompok bakteri ini bersifat fermentatif (Rusmana & Nedwell 2004), dapat memanfaatkan senyawa organik untuk pembentukan energi melalui transfer elektron di sitoplasma (Purwoko 2007). Purwoko (2007) mengemukakan bahwa sebagian besar prokariota fermentatif menghasilkan semua ATP melalui fosforilasi tingkat subtrat, kemudian ATP dihidrolisis oleh ATP sintetase, sehingga dapat menghasilkan perbedaan potensial yang digunakan untuk aktivitas membran. Organisma fermentatif memerlukan akseptor elektron untuk menerima elektron dari NADH. Kelompok bakteri pereduksi nitrat dapat memanfaatkan senyawa nitrat sebagai penerima elektron alternatif untuk mendapatkan energi dibawah kondisi oksigen terbatas (Ricardson et al. 2001). Kelompok bakteri DNRA mereduksi senyawa nitrat sejalan dengan penambahan senyawa nitrit, ketika konsentrasi nitrat rendah terjadi penambahan senyawa amonium (Kelso et al. 1997). Pada beberapa pengamatan di lapangan menunjukkan bahwa proses nitrat amonifikasi disimilatif banyak terjadi pada suhu tinggi (Herbert & Nedwell 1990). Bakteri DNRA lebih dominan pada lingkungan yang rasio C/N nya tinggi (Nedwell 1982). Bakteri DNRA lebih kompetitif dari pada bakteri denitrifikasi pada konsentrasi bahan organik tinggi. Bakteri-bakteri nitrat amonifikasi disimilatif diantaranya adalah Bacillus pyocyanes, Clostridium pasteurianum, Desulfovibrio desulfuricans (Moat et al. 2002).

Bacillus licheniformis, Wollinella succinogenes, Citrobacter freundii,

Klebsiella oxytoca, K. Pneumonia, Escherichia coli (Rusmana 2003a). Rusmana (2003a) telah mengisolasi dan mengkarakterisasi Klebsiella pneumonia yang mereduksi nitrat menjadi amonium dan menghasilkan N2O sebagai produk sampingnya. Syahputra (2007) telah mengisolasi dan menyeleksi bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dari muara sungai Cisadane. Isolat terpilih dikarakterisasi mempunyai kemiripan dengan Escherichia sp 21 CR dengan

tingkat kemiripan 97%. Sebagian besar famili Enterobacteriaceae mereduksi nitrat dan bersifat fermentatif (Holt et al. 1994). Proses pembentukan N2O pada

kelompok bakteri nitrat amonifikasi

disimilatif bukan sebagai senyawa antara seperti pada kelompok bakteri denitrifikasi, tetapi merupakan produk samping

melalui reaksi kimia

dalam

menghasilkan amonium (Rusmana 2003a). Bagan proses reaksi kimia reduksi nitrat ke amonium dapat ditunjukkan pada Gambar 3. N 2O

NO3-

NO2-

NO

N2O2H2

NOH

NH4+

NH2OH

Gambar 3 Bagan pembentukan N2O pada reduksi nitrat oleh bakteri DNRA (Darjamurni 2003) Pada kelompok bakteri DNRA terjadi dua tahap reaksi enzimatik yaitu tahap pertama oleh enzim Nap dan Nar seperti pada bakteri dinitrifikasi. Patereu et al. (1994) menyatakan bahwa ada dua tipe enzim yang mereduksi nitrat menjadi nitrit yaitu nitrat reduktase yang terdapat pada membran (Nar) dan nitrat reduktase yang terdapat pada periplasmik (Nap). Enzim Nar aktivitasnya berhubungan langsung dengan proses respirasi pembentukan ATP yang dapat dipengaruhi oleh konsentrasi oksigen dimana oksigen menghambat sistem transpor nitrat. Enzim Nap yang mereduksi nitrat dalam periplasma tidak sensitif terhadap oksigen. Enzim Nar yang terdapat di membran plasma mempunyai transmembran proton motive force (PMF) tempat terjadinya sintesis ATP (Moreno- Vivian et.al 1999). Demikian pula menurut Carter et al. (1995) reduksi nitrat dalam periplasma tidak sensitif terhadap hambatan oksigen. Oleh karena itu, nitrat reduktase periplasmik berhubungan dengan kemampuan untuk respirasi nitrat dalam ketersediaan oksigen pada spesies laboratorium. Oksidasi quinol oleh nitrat reduktase periplasmik tidak terpusat untuk menghasilkan gradien proton elektrokimia,

tetapi

cukup

bertindak

keseimbangan regulasi reaksi redoks respirasi aerobik.

sebagai

katup

untuk

membantu

dan mempertahankan jalannya rantai

Enzim Nap merupakan komplek dari dua sub unit protein. Sub unit Nap A mengikat kofaktor Molibdenum (Mo) sebagai sisi aktif dari enzim. Sub unit Nap B mempunyai dua situs ikatan heme C yang memiliki perbedaan potensial. Nap C merupakan sitokrom tipe tetraheme C, berperan dalam transfer elektron antara Quinol dan Nap AB (Richardson 2000). Reaksi enzimatik tahap kedua yaitu perubahan nitrit menjadi amonium oleh enzim Nir B yang aktivitasnya bergantung pada NADH sitoplasma sebagai donor elektron (Harbone et al. 1992) dan enzim Nrf yang aktivitasnya bergantung pada format sebagai donor elektron (Cole 1996). Dalam Richardson (2000) kinerja enzim pereduksi nitrat menjadi amonium disimilatif digambarkan sebagai berikut (Gambar 4).

NO2-

NH4+ NrfA

NapA NapB

Periplasma NO3-

NO2-

NO3NO2-

NrfB

NrfB

NrfC NrfC

NapC

Membran plasma

NarI

NrfD

NarH NO3-

NO2NarG

NirD

Sitoplasma

NirB NO3-

NO2-

NO -

NH +

2 4 Gambar 4 Enzim pereduksi nitrat bakteri nitrat amonifikasi disimilatif Ketersediaan oksigen di lingkungan pada bakteri nitrat amonifikasi

disimilatif diantaranya berkaitan erat dengan sistem sensor regulator sebagai mikroorganisme

anaerob

fakultatif. Kelompok bakteri DNRA memiliki

kemampuan adaptasi dari aerob ke anaerob atau sebaliknya. Oksigen merepresi sintesis reduktase anaerob, sebaliknya pada kondisi oksigen terbatas akan merepresi sintesis

ketoglutarat dehidrogenase. Hal ini mengakibatkan perubahan

kondisi jalur asam sitrat dari siklus TCA oksidatif menjadi non siklus/ reduktif (White 1995). Pada White (1995) dijelaskan bahwa pergantian reduktif Escherichia coli

respirasi oksidatif dan

sebagai salah satu bakteri DNRA diatur oleh tiga

sistem, yaitu sistem Arc (Aerobic respiration control), sistem Nar (Nitrat anaerobic respiration) dan sistem Fnr. Sistem Arc merupakan sistem dua komponen. Sistem ini merepresi gen-gen aerob berupa enzim-enzim siklus asam sitrat, piruvat dehidrogenase, asam lemak oksidase, dan sitokrom oksidase. Selain itu sistem Arc menginduksi gen-gen mikroaerob (sitokrom d oksidase dan sintesis kobal alamin). Sistem Nar terdiri dari 3 protein yaitu Nar X, Nar L dan Nar Q. Sistem ini juga merupakan sistem dua komponen, Nar X berperan sebagai histidin kinase, sedangkan Nar L sebagai protein regulator respons.

Sistem ini menginduksi

sintesis transkripsi gen nitrat reduktase dan menghambat gen fumarat reduktase serta gen aerobik lainnya. Penelitian selanjutnya diketahui bahwa Nar Q juga berperan sebagai penerima sensor (White 1995 ; Purwoko 2007). Sistem Fnr merupakan sistem tunggal yang berperanan pada kondisi anaerob. Protein Fnr berperan sebagai regulator positif untuk transkripsi gen-gen dalam pertumbuhan anaerob dan regulator negatif untuk transkripsi gen-gen pertumbuhan aerob (White 1995 ; Purwoko 2007).

METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2008 sampai Maret 2009. Tempat penelitian di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bahan Penelitian Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri nitrat amonifikasi disimilatif (DNRA)

koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi,

FMIPA IPB Bogor. Isolat merupakan bakteri terpilih dari penelitian sebelumnya hasil isolasi dari muara Sungai Cimandiri Pelabuhan Ratu Sukabumi Jawa Barat

dan muara Sungai Cisadane Tangerang Banten. Kode isolat dari muara Sungai Cimandiri adalah FR1 dan FR2 (Marnis 2008). Kode isolat dari muara Sungai Cisadane HF7 dan LF6 (Syahputra 2007).

Konfirmasi dan Peremajaan Isolat. Peremajaan isolat murni dimulai dengan konfirmasi kemurnian isolat menggunakan media padat, dilanjutkan dengan peremajaan isolat murni pada media cair.

Komposisi media cair adalah: 10 g Natrium asetat, 4,2 g NaNO3,

3,0 g yeast ekstrak, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,9 g K2HPO4.3 H2O, 0,5 g MgSO4.7H2O, 0,2 g KH2PO4, 0,1 g CaCl2.2H2O dengan salinitas 2% dan pH 7 (Rodina 1972). Media padat dibuat sama dengan media cair ditambah agar bacto 20 g per liter. Media disterilisasi pada suhu 1210 C tekanan udara 1 atmosfer selama 15 menit. Konfirmasi kemurnian isolat dilakukan dengan cara diinokulasikan masingmasing isolat murni bakteri nitrat amonifikasi disimilatif dengan metoda cawan gores pada medium agar, kemudian diinkubasikan selama 7 hari. Karakterisasi dan morfologi sel tiap isolat dilakukan dengan teknik pewarnaan gram (Hadioetomo 1993). Konfirmasi kemurnian isolat secara fisiologi dilakukan dengan uji fermentatif. Keempat isolat ditumbuhkan pada medium glukosa dengan indikator brom cressol purple. Isolat diletakkan pada tabung bertutup untuk membatasi masukan oksigen. Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan fermentasi dari tiap isolat. Perubahan warna ungu menjadi kuning menunjukkan isolat tersebut melakukan fermentasi, jika tidak terjadi perubahan warna bukan

kelompok

bakteri fermentatif. Peremajaan bakteri pada medium cair dilakukan dengan cara diinokulasikan 1 lup tiap isolat pada medium cair masing-masing sebanyak 20 ml kedalam botol yang berukuran 100 ml. Inkubasi dilakukan selama 24 jam Tahap selanjutnya masing-masing isolat diambil 1 ml dimasukkan ke medium 50 ml untuk perbanyakan inokulan dan diinkubasikan selama 24 jam.

Seleksi Aktivitas Reduksi Nitrat pada Konsentrasi Oksigen (O2) yang Berbeda Pengukuran aktivitas reduksi nitrat pada konsentrasi oksigen berbeda dilakukan pada

botol serum steril 75 ml yang ditutup dengan butyl rubber

septum. Pengkondisian konsentrasi oksigen dengan pengaturan volume saturasi udara pada head space botol serum. Botol serum steril volume 75 ml diisi dengan 23 ml medium cair. Botol dibuat kondisi an aerobik dengan cara menghilangkan oksigen yang terdapat di dalam botol. Gas nitrogen bebas oksigen dialirkan ke dalam botol reaksi dengan menggunakan jarum/syringe steril selama 15 menit. Sebelum gas dimasukkan, gas terlebih dahulu disaring dengan filter steril diameter 47 mm dengan ukuran 0,45 mikro meter. Langkah berikutnya, saturasi udara pada masing-masing botol dikondisikan menjadi 0%, 1%, 10%, 30%, 50%, 80%, dan 100%. Saturasi udara dimasukkan pada masing-masing botol serum yang telah diberi perlakuan pembebasan oksigen sebanyak 0,5 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, dan 40 ml. Pada waktu proses pemasukan saturasi udara, gas nitrogen akan terdorong keluar melalui jarum yang dipasang pada tutup botol disamping syringe, sehingga volume saturasi udara pada masingmasing botol menjadi 1%, 10%, 30%, 50%, 80%. Pengkondisian saturasi udara 100% dilakukan dengan tanpa memasukkan gas nitrogen murni pada botol serum. Kondisi saturasi udara 0% dengan pengisian gas nitrogen murni tanpa memasukkan saturasi udara. Seluruh botol serum yang telah dikondisikan saturasi udaranya dikocok untuk melarutkan gas perlakuan. Masing-masing botol serum diinokulasi dengan 1 ml isolat. Isolat diletakan pada inkubator berpenggoyang pada kecepatan 80 rpm suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam (Su et al. 2001). Setelah diinkubasi pada kadar oksigen yang berbeda, dilakukan pengukuran densitas sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Kultur biakan bakteri diambil sebanyak 1ml pada tabung efendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan supernatan. Supernatan dari kultur biakan dianalisis kandungan nitrit, nitrat dan amonium.

Analisis nitrit. Analisis Nitrit menggunakan metode Sulfanilamide (Cleseri et al 1989). Nitrit dengan amina aromatik pada sulfalinamide akan membentuk diazonium. Senyawa tersebut dengan NED (N-I-Naphtyl Ethylene Diamine Dyhidrochloride) membentuk gugus kromofor yang berwarna merah muda (Lampiran 1) dan dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kadar nitrit ditentukan dengan cara memasukkan 5 ml sampel yang telah diencerkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,1 sulfanilamid (C6H8N2O2S) dan 0,1 NED. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi sebesar : 0 ;

0,2; 0,4; 0,6; 0,8 , dan 1,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM

digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel (Lampiran 2). Analisis nitrat Analisis senyawa nitrat dengan menggunakan metode Greenberg et al (1992). Kadar nitrat ditentukan dengan cara memasukkan 20 ml sampel yang telah diencerkan ke dalam kolom reduksi yang berisi cadmium. Pada saat sampel melewati kolom reduksi, cadmium akan mereduksi nitrat menjadi nitrit. Sampel sebanyak 5 ml direaksikan dengan reagen pada analisis nitrit.

Sampel akan

menunjukkan perubahan warna merah muda (Lampiran 1), diukur pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar natrium nitrit (NaNO2) dengan konsentrasi sebesar : 0 ;

0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mg/l, kemudian dikonversi ke mM

digunakan untuk menentukan kadar nitrit pada sampel. Nilai konsentrasi nitrat adalah hasil pengurangan antara konsentrasi nitrit yang dilewatkan pada kolom reduksi dengan konsentrasi nitrit yang tidak dilewatkan. Analisis amonium Pengukuran konsentrasi amonium menggunakan metode phenate (Cleseri et al. 1989). Kadar amonium ditentukan dengan cara 5 ml sampel yang diencerkan , dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,2 ml larutan fenol alkohol (C6H5OH) lalu dihomogenkan, diamkan selama 1 menit lalu tambahkan 0,2 ml Na-Dihidro Nitroprusid (Na2[Fe(CN)NO]2.H2O), kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan oksidan yang terdiri dari Natrium Sitrat (C6H5Na3O7.2H2O) dan Natrium

hipoklorit (NaOCl2) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (28-31)o C. Sampel yang telah diberi larutan indikator menunjukkan perubahan warna hijau sampai biru (Lampiran 1), diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 640 nm. Kurva standar amonium klorida (NH4Cl) sebesar: 0 ; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ; 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 mg/l kemudian dikonversi ke mM digunakan untuk menghitung konsentrasi amonia pada sampel (Lampiran 2). Perhitungan Pembentukan Gas. nitrit (NO2 -), dan amonium (NH4+)

nitrat (NO3-),

Setelah konsentrasi

diketahui dari masing-masing sampel, dihitung jumlah nitrat yang tereduksi dengan rumus : = [NO3-] kontrol – [NO3-]inokulasi

[NO3-] tereduksi %

[NO3-]

=

tereduksi

[NO3-] red

x

100

-

[NO3 ] kontrol Jumlah senyawa nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut: [NO2-] terbentuk %[NO2

[NO2-] perlakuan – [NO2-] kontrol

=

] terbentuk = [NO2-] perlakuan – [NO2-] kontrol

-

x 100

-

[NO3 ]tereduksi Jumlah senyawa amonium yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut: =

[NH4+] perlakuan – [NH4+] kontrol

% [NH4+] terbentuk =

[NH4+] perlakuan – [NH4+] kontrol

[NH4+] terbentuk

x

100

[NO3-]tereduksi Estimasi produk akhir gas yang terbentuk dihitung dengan rumus [Gas ]

=

[NO3-]reduksi – [NO2-] terbentuk – [NH4 +] terbentuk

%[

=

[Gas] X 100%

Gas]

[NO3-] tereduksi

Keterangan : Konsentrasi nitrat kontrol didapatkan dari sediaan medium steril tanpa bakteri .

Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Isolat Terpilih Dua isolat terbaik dalam mereduksi nitrat dan responsif terhadap oksigen dipilih untuk diamati kinetikanya. Botol serum steril volume 125 ml diisi dengan 50 ml medium cair. Sebanyak 1 ml isolat diinokulasikan pada tiap botol yang telah dikondisikan saturasi udaranya secara berurutan masing-masing 1 %, 10%, 100%. Kultur biakan diinkubasikan pada suhu ruang (28-31)oC selama 96 jam (Su et al 2001).

Kultur biakan diamati pola pertumbuhannya dan dianalisis

konsentrasi nitrat, nitrat, dan amonium dengan metoda yang telah diuraikan sebelumnya. Analisis dilakukan setiap selang waktu 12 jam selama 96 jam (4 hari). Hasil pertumbuhan digambarkan pada suatu grafik pertumbuhan pada kondisi oksigen berbeda. Korelasi antara konsentrasi sel dengan kerapatan optis (OD) isolat, dilakukan metoda hitungan cawan (Lampiran 3) pada konsentrasi pengenceran 10 -6, 10-7, 10 -8, dan 10-9. Kultur biakan yang sama diencerkan dan OD dari beberapa pengenceran diukur. Kurva standar pertumbuhan dibuat dari nilai-nilai OD pengenceran dan konsentrasi sel sehingga didapatkan nilai regresi dan persamaan garis (Lampiran 4) untuk menentukan jumlah sel. Laju pertumbuhan spesifik maksimum didapatkan dengan mencari nilai regresi dan persamaan garis dari korelasi waktu inkubasi dengan nilai ln jumlah sel. Laju pertumbuhan maksimum merupakan koefisien variabel x pada persamaan garis Y= ax + c (Maier et al. 2000). Hasil uji kimia digambarkan dalam suatu grafik yang menunjukkan hubungan lama inkubasi dengan nitrat tereduksi, nitrit, dan amonium serta estimasi gas N2O yang terbentuk pada setiap konsentrasi oksigen yang berbeda. Kecepatan reduksi setiap sel masing-masing isolat dihitung pada kondisi saturasi udara 1 %, 10% dan 100%.

HASIL Karakteristik, Morfologi dan Fisiologi Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif Hasil konfirmasi kemurnian dari keempat isolat dengan metoda cawan gores, morfologi koloninya berbentuk bulat, elevasi tombol dan cembung, tepian licin. Faktor pembeda keempat isolat adalah warna koloni (Gambar 5).

Gambar 5 Morfologi koloni dari isolat LF6, HF7, FR2 dan FR1 pada medium denitrifikasi Secara mikroskopis sel isolat LF6, HF7, FR2 dan FR1 berupa bakteri Gram negatif dan berbentuk batang (Tabel 1).

Tabel 1 Karakterisasi morfologi dan fisiologi isolat LF6, HF7,FR2, dan FR1 Kode No IsIIsolat

Bentuk Sel

Gram 1

LF6

Batang

Morfologi Koloni

Pewarnaan

Bentuk

negatif Bulat, elevasi cembung, tepian

Warna Putih susu

licin 2

HF7

Batang

negatif Bulat, elevasi cembung, tepian

Krem kuning

licin 3

FR2

Batang

negatif Bulat, elevasi tombol, tepian

Kuning oranye

licin 4

FR1

Batang

negatif Bulat, elevasi tombol, tepian

Kuning pucat

licin

Hasil uji fermentatif dengan menggunakan glukosa dan indikator brom cressol purple menunjukkan keempat isolat merupakan kelompok bakteri fermentatif (Gambar 6). Hal ini ditunjukkan dengan adanya perubahan warna medium dari ungu menjadi kuning. Kecepatan untuk merubah warna medium dari keempat isolat berbeda. Isolat LF6 dan HF7 (asal muara Sungai Cisadane) merubah warna medium glukosa dan indikator brom cressol purple dari ungu menjadi berwarna kuning dalam waktu 24 jam. Perubahan warna medium oleh isolat FR1 dan FR2 (asal muara Sungai Cimandiri) memerlukan waktu 36 jam dan 48 jam. Selain perubahan warna akibat asam organik hasil fermentasi yang meningkatkan derajat keasaman (menurunkan pH) medium, pembentukan gas karbon dioksida (CO2) sebagai hasil fermentasi juga dapat diamati pada tabung durham.

Gambar 6 Hasil uji fermentatif pada isolat FR1, FR2, HF7 dan LF6, setelah inkubasi 48 jam Densitas Sel Isolat Bakteri DNRA pada Konsentrasi O2 yang Berbeda Empat isolat bakteri DNRA yang ditumbuhkan pada konsentrasi oksigen berbeda, sumber karbon asetat, masa inkubasi 96 jam menunjukkan kerapatan (densitas) sel yang berbeda (Gambar 7). Secara umum densitas sel keempat isolat lebih rendah pada konsentrasi oksigen (saturasi udara) 0%, yaitu antara OD 0,06 sampai 0,28 (620 nm). Densitas sel tertinggi pada konsentrasi saturasi udara 0 % adalah isolat FR1 yaitu dengan OD sebesar 0,28. Pada konsentrasi saturasi udara 1-10% densitas sel cenderung lebih tinggi dari konsentrasi saturasi udara 0%. Pada konsentrasi saturasi udara 30%, 50% dan 80% kecenderungan densitas keempat isolat tidak seluruhnya lebih tinggi dari konsentrasi saturasi udara sebelumnya. Densitas tertinggi dari keempat isolat terdapat pada

konsentrasi saturasi udara 100% yaitu dengan OD antara 0,27

sampai 0,42 (620 nm). Kecenderungan peningkatan densitas sel isolat FR1 sejalan dengan penambahan konsentrasi saturasi udara lebih nyata dari isolat lainnya. Densitas sel isolat FR1 lebih tinggi dari pada tiga isolat lainnya pada saturasi udara 0%, 30%, 50%, 80% dan 100%. Densitas sel terendah pada konsentrasi saturasi udara 100 % adalah isolat LF6 dengan OD 0,27.

0.50

OD (620nm)

0.40 0.30 0.20 0.10 0.00

0%

1%

10%

30%

50%

80%

100%

Konsentrasi Saturasi udara (%)

Gambar 7 Densitas sel isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31)0C. LF6 HF7 FR2 FR1 Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri DNRA pada Konsentrasi Oksigen yang Berbeda Berdasarkan hasil uji nitrat (NO3-) terhadap isolat FR1, FR2, HF7, dan LF6

menunjukkan kemampuan

yang berbeda dalam

mereduksi

nitrat.

Konsentrasi nitrat tereduksi oleh keempat isolat dengan nitrat awal sebanyak 49,41 mM, sumber karbon asetat setelah diinkubasi 4 hari adalah diatas 45 mM

Jumlah nitrat tereduksi (mM)

(Gambar 8).

50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 0%

1%

10%

30%

50%

80%

100%


Gambar 8 Jumlah nitrat tereduksi oleh isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31)0 C LF6 HF7 FR2 FR1

Secara umum kecenderungan konsentrasi nitrat tereduksi lebih besar pada konsentrasi saturasi udara lebih kecil. Reduksi nitrat terbesar terjadi pada konsentrasi saturasi udara 0%. Konsentrasi nitrat tereduksi cenderung menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi saturasi udara. Dari hasil uji nitrit (NO2-), isolat FR1 mengakumulasi nitrit paling tinggi dibandingkan isolat lainnya. Akumulasi nitrit tertinggi terjadi pada konsentrasi saturasi udara 100% (Gambar 9), yaitu 4,95 mM . Isolat LF6, HF7 dan FR2 pada akhir masa inkubasi masih mengakumulasi nitrit. Konsentrasi nitrit tertinggi pada isolat LF6 adalah 0,05 mM. Isolat HF7 dan FR2 mengakumulasi nitrit paling tinggi pada akhir masa inkubasi dengan konsentrasi yang sama yaitu 0,03 mM (Lampiran 5 dan 6).

Akumulasi nitrit (mM)

5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00

0%

1%

10%

30%

50%

80%

100%


Gambar 9 Jumlah nitrit terakumulasi dari isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31)0 C LF6 HF7 FR2 FR1 Pada uji amonium (NH4+), isolat LF6 dan HF7 menghasilkan amonium lebih tinggi dari isolat lainnya (Gambar 10), sehingga diperkirakan gas yang terbentuk pada kedua isolat bakteri tersebut lebih kecil dibandingkan isolat FR1 dan FR2. Konsentrasi amonium tertinggi yang dihasilkan isolat LF6 adalah sebesar 15,02 mM (30,95%) pada konsentrasi saturasi udara 0%. Isolat HF7 menghasilkan amonium sebesar 14,77 mM (30,29%) pada konsentrasi saturasi udara 0% (Lampiran 5).

Amonium yang dihasilkan (mM)

20 16 12 8 4 0 0%

1%

10%

30%

50%

80%

100%


Gambar 10 Jumlah amonium yang dihasilkan dari isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31)0C. LF6 HF7 FR2 FR1 Perkiraan pembentukan gas N2O dari keempat isolat menunjukkan bahwa keempat isolat tersebut dapat menghasilkan gas yang besar, pada medium dengan konsentrasi nitrat yang tinggi. Isolat yang paling sedikit menghasilkan gas N2 O adalah isolat HF7 sebesar 29,62 mM (64,63%) pada konsentrasi saturasi udara 50%, dan isolat LF6 sebesar 31,61 mM (66,15 %) pada konsentrasi saturasi udara 10% (Lampiran 5). Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit terakumulasi, amonium dan estimasi gas N2O yang dihasilkan dari setiap isolat pada kondisi saturasi udara berbeda setelah diinkubasi 96 jam pada suhu ruang (29-31)0C dapat dilihat di Lampiran 7 dan Lampiran 8. Berdasarkan

hasil uji fermentatif, analisis nitrat, nitrit, amonium dan

estimasi gas N2O pada keempat isolat dipilih isolat HF7 dan LF6 untuk diamati kinetika aktivitas reduksi nitratnya. Dasar pemilihan kedua isolat adalah pada uji fermentatif kedua isolat lebih cepat memfermentasi glukosa. Aktivitas reduksi nitrat isolat HF7 dan LF6 lebih tinggi dibandingkan isolat FR1 dan FR2. Kedua isolat menghasilkan amonium lebih banyak dengan akumulasi nitrit yang kecil. Isolat HF7 dan LF6 diduga menghasilkan gas N2O lebih kecil dari isolat FR1dan FR2. Kedua isolat memiliki perbedaan pengaruh pertumbuhan dan aktivitas

reduksi nitrat pada konsentrasi saturasi udara yang relatif kecil (1 % dan 10%) dibandingkan dengan konsentrasi saturasi udara besar (100%). Pertumbuhan Isolat Terpilih Dua isolat terpilih

HF7 dan LF6 yang ditumbuhkan pada konsentrasi

saturasi udara 1%, 10%, dan 100%, sumber karbon asetat, suhu ruang (29-31)oC, dengan konsentrasi nitrat 49,41mM menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Kerapatan sel pada awal pertumbuhan dikondisikan sama yaitu pada OD 0,03 (620 nm) dengan inokulan berumur 24 jam. Perubahan populasi sel atau pertambahan jumlah sel dari jumlah inokulan dengan saturasi udara 100%

sebelumnya

lebih cepat dibandingkan

pada isolat HF7 dengan isolat LF6

(Gambar 11). Kecepatan pertumbuhan kedua isolat pada konsentrasi saturasi udara 100% paling tinggi. Kecepatan pertumbuhan pada konsentrasi saturasi udara 10 % pada kedua isolat lebih tinggi dari konsentrasi saturasi udara 1%. Fase eksponensial dimulai dari 12 jam pertama sampai jam ke 48 pada isolat HF7 saturasi udara 100%. Pada isolat HF7 kondisi saturasi udara 10% dan isolat LF6 pada kondisi saturasi udara 10% dan 100% fase eksponensial mulai jam ke 12 sampai jam ke 60. Sementara itu pada konsentrasi saturasi udara 1 % kedua isolat menunjukkan fase eksponensial sampai jam ke 72 (gambar 11).

Isolat HF7

Isolat LF6

0.6 0.5 O D se l (6 2 0 n m )

O D s e l (6 2 0 n m )

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

0.4 0.3 0.2 0.1 0

0

12

24

36

48

60

72

84

96

0

12

24

36

48 60 Jam Ke

72

84

96

Jam ke

Gambar 11 Pola pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara berbeda. Saturasi Udara 1% Saturasi udara 10% saturasi udara 100%.

Laju pertumbuhan maksimum kedua isolat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100% dengan sumber karbon asetat dan nitrat media 49,41mM

Laju pertumbuhan maksimum (sel/jam)

dapat dilihat pada Gambar 12.

70 0.0

0.08 0.06 0.04

5 0 0.04 4 5 0 3 0. 0.0

34 0.0

57 0.0

0.02 0.00 1%

10%

100%

Konsentrasi saturasi udara

Gambar 12 Laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara berbeda. HF7 LF6 Laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1% hampir sama. Pada konsentrasi saturasi udara 10% laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 lebih kecil dari isolat LF6. Pada saat konsentrasi saturasi udara 100% laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 lebih besar dari isolat LF6. Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Laju aktivitas reduksi nitrat pada isolat HF7 dan LF6 menunjukkan kemampuan reduksi nitrat terkecil pada konsentrasi saturasi udara 100%. Pada kondisi saturasi udara 1% jumlah nitrat tereduksi lebih besar (Gambar 13). Jumlah nitrat tereduksi pada kedua isolat bertambah seiring dengan pertambahan densitas sel. Reduksi nitrat tercepat pada umumnya terjadi dari inkubasi jam ke 12 sampai jam ke 60, dengan isolat yang diinokulasikan pada umur 24 jam. Umumnya pada fase stasioner reduksi nitrat masih berlangsung lambat, meskipun densitas sel tidak mengalami pertambahan yang signifikan.

LF6 Saturasi udara 1 %

HF7 Saturasi udara 1% 50

2

30

1.0 20

0.5

10

30 1 20

0

0.5

10

0.0

0

1.5

0

12 24 36 48 60 72 84 96 Jam ke

N itrit (mM )

1.5

N itrat & am onium (mM)

40

40

N itrit (mM)

N itrat& A monium (mM)

2.0

0 0

12 24 36 48 60 72 84 96 Jam Ke

HF7 Saturasi udara 10%

40

40

4.0

20

2.0

10 0.0 0

30 1

20 0.5

0

12 24 36 48 60 72 84 96

LF6 Saturasi udara 100%


40

10 8 6

20

4

10

2

0

0 12 24 36 48 60 72 84 96

Jam Ke

12

50 N itra t & a m o n iu m (m M )

12

N itrit (m M )

50

30

0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Jam Ke

Jam ke

N itrat A m o n iu m (m M )

1.5

10

0

2

40 8

30 20

4

N itrit (m M )

30

0


N itrat & am om ium (m M )

50

N itrit (m M )

6.0

N itrit (m M )

N itr a t & A m o n iu m (m M )

50

10 0

0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Jam Ke

Gambar 13 Aktivitas reduksi nitrat, pembentukan nitrit dan amonium dari isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%. nitrat tereduksi nitrit terbentuk amonium terbentuk

Kemampuan mereduksi nitrat isolat HF7 konsentrasi saturasi udara 100% berbeda dengan kondisi lainnya. Isolat tersebut setelah jam ke 60 masih mengalami kenaikan reduksi nitrat yang signifikan sampai jam ke 84(Gambar 13). Hubungan antara kecepatan reduksi nitrat dengan tingkat pertumbuhan sel pada konsentrasi saturasi udara berbeda jelas terlihat pada isolat HF7 dan LF6 (Gambar14). Pada konsentrasi saturasi udara kecil (1%), gradien penurunan konsentrasi nitrat medium oleh kedua isolat paling besar, diikuti konsentrasi saturasi udara 10%. Pada konsentrasi saturasi udara 100% penurunan konsentrasi nitrat lebih kecil dari 10%. Penurunan konsentrasi nitrat sejalan dengan kenaikan jumlah sel. Penurunan konsentrasi nitrat

yang signifikan terjadi pada saat

pertumbuhan sel-sel isolat fase eksponensial. Setelah inkubasi 96 jam kemampuan menurunkan nitrat media dari isolat HF7 pada kondisi saturasi udara 1%, 10%, dan 100% adalah masing-masing sebesar 93,2%, 80,74% dan 77,81% (Tabel 2). Umumnya kecepatan mereduksi nitrat tinggi dari awal jam ke 12 sampai jam ke 60. Isolat HF7 lebih menunjukkan kemampuan reduksi nitrat yang berbeda pada kondisi saturasi udara berbeda dari pada isolat LF6. Isolat LF6 setelah diinkubasi dalam waktu yang sama mampu menurunkan nitrat media pada kondisi saturasi udara 1%, 10%, dan 100% adalah 80,30%, 79,65% dan 78,17% (Tabel 3).

0.15 0.10

20

0.05

10 0

0.00

40

0.15

30 0.10

20 0.05

10

0.00

0

0 12 24 36 48 60 72 84 96

0 12 24 36 48 60 72 84 96 Jam Ke

Jam ke


40

0.20

30

0.15

20

0.10

10

0.05

0

K onsentrasi nitrat (mM)

0.25 OD sel (620 nm)

Konsentrasi nitrat (mM)


0.00

50

0.25

40

0.20

30

0.15

20

0.10

10

0.05

0

0 12 24 36 48 60 72 84 96

0.00 0

Jam ke

0.20

10 0.00 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Jam ke


0.40

OD sel (620 nm)


40

0

24 36 48 60

72 84 96

LF6 Saturasi udara 100 %

0.60

20

12

Jam ke


30

OD sel (620 nm )

30

0.20

50

0.50

40

0.40

30

0.30

20

0.20

10

0.10

0

OD sel (620 nm)

40

50

OD sel (620 nm)

0.20

50



OD sel (620 nm)



0.00 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Jam Ke

Gambar 14 Perbandingan pertumbuhan sel isolat HF7 dan LF6 dengan penurunan konsentrasi nitrat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%. Konsentrasi nitrat OD sel

Kecepatan rata-rata mereduksi nitrat media oleh koloni isolat HF7 adalah 0,48 mMJ-1, 0,41 mMJ-1, 0,40 mMJ-1 pada saturasi udara 1%, 10% , 100% setelah diinkubasi 96 jam.

Selisih kecepatan reduksi nitrat

isolat HF7 pada

tiap

konsentrasi saturasi udara lebih besar. Sementara pada isolat LF6 selisih kecepatan reduksi nitrat pada setiap konsentrasi saturasi udara berbeda tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Kecepatan reduksi isolat LF6 pada saturasi udara 1%, 10% , 100% setelah diinkubasi 96 jam yaitu masing-masing sebesar 0,41 mMJ-1, 0,41 mMJ-1, 0,40 mMJ- . Perbandingan kecepatan rata-rata reduksi nitrat untuk setiap sel isolat HF7 dan LF6

hampir seluruhnya berbanding lurus dengan perbandingan rata-rata

kecepatan reduksi koloni isolatnya. Kecepatan rata-rata mereduksi nitrat pada saturasi udara 1%, 10% , 100% setelah diinkubasi 96 jam untuk setiap sel isolat HF7 secara berurut adalah 6,3 x 10-10 mMJ-1, 5,1 x 10 -10 mMJ-1, dan 3,3 x 10-10 mMJ-1. Sementara untuk setiap sel isolat LF6 dengan kondisi yang sama secara mMJ-1.

berurut

adalah 2,0 x 10 -10 mMJ-1, 2,1 x 10 -10 mMJ-1 dan 1,0 x 10-10

Kecepatan rata-rata reduksi nitrat pada setiap sel isolat HF7 dan isolat

LF6 pada konsentrasi 1% lebih tinggi. Perbedaan kecepatan reduksi nitrat pada konsentrasi saturasi udara kecil (1%) dengan konsentrasi saturasi udara lebih besar (100%) jelas terlihat. Selisih kecepatan setiap sel isolat HF7 adalah 3 x 10-10 mMJ-1. Sementara selisih kecepatan reduksi nitrat untuk setiap sel isolat LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1% dengan 100% adalah 1 x 10-10 mMJ-1. Jumlah senyawa-senyawa yang dihasilkan dari aktivitas reduksi nitrat bervariasi pada kedua isolat. Isolat HF 7 mengakumulasi nitrit pada jam ke 12 sampai jam ke 24 dan konsentrasinya menurun seiring peningkatan konsentrasi amonium. Setelah inkubasi 96 jam tidak terdapat akumulasi senyawa nitrit. Konsentrasi senyawa nitrit sudah menurun pada inkubasi jam ke 12 (Gambar 13) Pada isolat LF6 terjadi fluktuasi akumulasi senyawa nitrit pada inkubasi jam ke12 sampai dengan jam ke 60. Setelah inkubasi 96 jam pada isolat LF6 terdapat akumulasi senyawa nitrit dalam jumlah kecil yaitu 0,32% (Tabel 3). Secara umum senyawa amonium terus meningkat berbanding lurus dengan peningkatan jumlah nitrat yang tereduksi. Pada saat senyawa amonium meningkat

senyawa nitrit menurun. Konsentrasi nitrit sudah menurun pada inkubasi jam ke 12 (Gambar 13). Amonium yang dihasilkan oleh isolat HF7 dan LF6 setelah inkubasi selama 96 jam dengan sumber karbon asetat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10%, 100% secara berurutan adalah 56,06%, 36,07%, 35,93% dan 41,66%, 36,75%, 38,19%.

Perkiraan gas N2O yang dihasilkan HF7 dan LF6 secara berurutan

adalah 53,20%, 63,93%, 64,06% dan 58,34%, 63,25%, 61,49% (Tabel 2 dan 3).

Tabel 2 Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat HF7 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100% setelah inkubasi 96 jam, suhu ruang (29-31)oC Perlakuan Nitrat saturasi Awal udara mM

nitrat tereduksi mM %

1%

49,41

46,07 93,22 0,00

10%

49,41

100%

49,41

Nitrit terbentuk mM %

Amonium terbentuk mM %

Estimasi gas terbentuk mM %

0,00

21,56 56,06

24,51 53,20

39,90 80,74 0,00

0,00

14,39 36,07

25,51 63,93

38,45 77,81 0,00

0,00

13,82 35,93

24,63 64,06

Tabel 3 Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%, setelah inkubasi 96 jam, suhu ruang (29-31)oC Perlakuan saturasi udara

Nitrat Awal

nitrat tereduksi

mM

mM

1%

49,41

39,68 80,30 0,00

0,00

16,53 41,66 23,15 58,34

10%

49,41

39,36 79,65 0,00

0,00

14,46 36,75 24,90 63,25

100%

49,41

38,63 78,17 0,12

0,32

14,75 38,19 23,75 61,49

%

Nitrit terbentuk mM

%

Amonia terbentuk mM

%

Estimasi gas terbentuk mM

%

PEMBAHASAN Isolat FR1, FR2, HF7 dan LF6 bersifat fermentatif, tumbuh pada medium denitrifikasi yang mengandung nitrat dan tumbuh pada kondisi saturasi udara dari variasi 0-100%. Hal ini menunjukkan keempat isolat memiliki enzim-enzim respirasi oksidatif dan nitrat reduktase untuk proses respirasinya. Pada tahap uji seleksi menunjukkan kerapatan sel (densitas) isolat HF7 dan LF6 lebih rendah dibandingkan dengan isolat FR1 dan FR2. Pertumbuhan FR1 paling responsif terhadap oksigen, peningkatan densitas sel sesuai dengan peningkatan kadar saturasi udara cenderung lebih tinggi dari isolat lainnya. Isolat FR1 diduga memiliki enzim nitrat reduktase periplasma (Nap) lebih dominan. Aktivitas enzim-enzim respirasi oksidatif lebih dominan dari pada enzim nitrat reduktase, karena enzim Nap berfungsi sebagai penyeimbang regulasi redoks pada transfer elektron aerobik, energi yang dihasilkan dari aktivitas enzim Nap kecil (Ricardson et al. 2001). Proses tersebut menyebabkan pertumbuhan FR1 meningkat seiring peningkatan konsentrasi oksigen. Hal ini sesuai dengan awal isolasi isolat FR1. Pada saat diisolasi isolat FR1 tumbuh baik pada medium rendah nitrat yaitu 0,1 mM (Marnis 2008). Densitas sel keempat isolat pada kondisi oksigen yang berbeda, secara umum menunjukkan makin bertambah konsentrasi oksigen densitas sel makin tinggi. Pada saturasi udara 30-80 % terdapat isolat-isolat yang densitas selnya fluktuatif, kondisi ini diduga karena sensitivitas sistem nitrat reduktase terhadap oksigen berbeda dari setiap isolat. Keempat isolat lebih cenderung memanfaatkan oksigen sebagai akseptor elektron pada saat oksigen tersedia pada medium. Disisi lain keberadaan akseptor elektron nitrat dapat menimbulkan interaksi dan berpengaruh terhadap jalur metabolisme oksidatif.

Nitrat dapat dimanfaatkan

sebagai akseptor elektron alternatif pada saat oksigen di lingkungan terbatas. Selain itu reduksi nitrat oleh enzim Nap dapat berlangsung sebagai pembuangan kelebihan tenaga pereduksi pada transfer elektron aerobik (Carter et al. 1995). Pada kondisi saturasi udara 100% keempat isolat memiliki densitas sel tinggi. Enzim-enzim respirasi oksidatif lebih mendominasi, transfor nitrat ke membran dihambat oksigen. Reduksi nitrat tahap awal diduga hanya terjadi oleh

aktivitas enzim Nap, dimana aktivitas enzim Nap tidak dipengaruhi keberadaan oksigen (Moreno -Vivian et al. 1999). Sementara enzim Nar baru bekerja setelah konsentrasi oksigen terbatas dalam medium perlakuan. Oksigen merupakan akseptor elektron yang lebih potensial negatif. Sebagai perbandingan perbedaan potensial redoks dengan donor elektron asam format, akseptor elektron oksigen hasil akhir H2O adalah -1,28 (Mairer 2000). Sedangkan perbedaan potensial redoks dengan donor elektron sama akseptor elektron NO3 hasil akhir NH4 + memiliki nilai -0,83. Energi yang dihasilkan dari respirasi dengan oksigen sebagai akseptor elektron lebih tinggi dari pada akseptor elektron nitrat. Energi tinggi memacu pertumbuhan sel lebih cepat, sehingga densitas sel akhir masa inkubasi tinggi. Pada respirasi aerob bakteri DNRA, sumber karbon asetat akan diubah menjadi asetil Co A dan masuk ke siklus tricarboxylic acid (TCA) sehingga akan menghasilkan ATP, NADH dan FADH2. NADH dan FADH2 diubah menjadi ATP melalui rangkaian transfer elektron (posforilasi oksidatif) dengan akseptor elektron terakhir oksigen (White 1995). Pada kondisi oksigen terbatas di lingkungan, sumber karbon asetat tetap melalui jalur TCA, tetapi pada saat transfer elektron di membran digunakan nitrat atau nitrit sebagai akseptor elektron terakhir. Akibat dari penggunaan nitrat atau nitrit sebagai akseptor elektron, nitrat tereduksi menjadi nitrit, nitrit tereduksi menjadi amonium. ATP yang dihasilkan dari respirasi anaerob lebih sedikit, menyebabkan pertumbuhan bakteri lebih lambat. Pada sumber karbon yang lebih kompleks seperti glukosa (C6 H12O6) suksinat (C4H6O4), sitrat (C6H8O7) dan gliserol (C3H8O3) melalui

proses fermentatif

organik atau alkohol

diduga tetap kurang efektif.

perolehan energi Keberadaan asam

hasil posforilasi subtrat akan mengganggu kecepatan

pertumbuhan sel. Hal ini dapat diamati di alam secara langsung, pada perairanperairan yang kadar oksigen terlarutnya kecil proses degradasi senyawa organik berlangsung lambat, meskipun tersedia akseptor elektron alternatif selain oksigen. Disamping nitrat, sumber akseptor alternatif lain selain oksigen diantaranya Fe3+, Mn4+, Trimethylamine N oxide (TMAO), Dimethyl Sulfo oxide (DMSO), sulfat, fumarat (Purwoko 2007).

Pengaruh oksigen terhadap pertumbuhan isolat lebih jelas terlihat pada grafik pertumbuhan isolat terpilih HF7 dan LF6 yang diukur setiap selang waktu 12 jam. Dua isolat terpilih HF7 dan LF6 yang ditumbuhkan pada konsentrasi saturasi udara 1%, 10% dan 100%, sumber karbon asetat menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Pertumbuhan sel pada konsentrasi oksigen saturasi udara rendah (1% dan 10%) dari kedua isolat lebih lambat dari pertumbuhan pada konsentrasi saturasi udara 100%. Kerapatan sel pada awal pertumbuhan dikondisikan sama yaitu pada OD 0,03 (620 nm) dengan inokulan berumur 24 jam. Perubahan populasi atau pertambahan jumlah sel dari inokulan sebelumnya berbeda pada setiap perlakuan konsentrasi oksigen. Secara kuantitatif perbedaan laju pertumbuhan ditunjukkan oleh µ

maks

kedua isolat yang berbeda pada kondisi

saturasi udara berbeda. Hal ini menunjukkan oksigen berpengaruh terhadap laju pertumbuhan bakteri DNRA. Isolat HF7 diduga memiliki enzim Nar yang lebih dominan. Pada saat oksigen rendah kandungan nitrat medium tinggi aktivitas enzim Nar tinggi. Sistem respirasi nitrat dominan sehingga pada konsentrasi saturasi udara 1% dan 10% laju pertumbuhannya rendah, karena energi yang dihasilkan dari respirasi nitrat lebih rendah. Sebaliknya pada saat kandungan oksigen tinggi (saturasi udara 100%) laju pertumbuhan sel HF7 lebih tinggi karena pada tahap awal inkubasi digunakan oksigen sebagai akseptor elektron, energi yang dihasilkan lebih tinggi. Pada saat oksigen pada medium terbatas, enzim Nar menggantikan proses pembentukan ATP meskipun tidak sebanyak respirasi aerob. Enzim Nar mempunyai transmembran proton motive force (PMF) tempat terjadinya sintesis ATP (Moreno- Vivian et.al 1999). Proses pergantian sistem respirasi oksidatif ke respirasi anaerob reduktif pada isolat HF7

diduga diatur oleh sistem sensor

regulator seperti pada Escherichia coli (Purwoko 2007). Kekurangan oksigen di lingkungan diterima dan direspons oleh sistem Arc, sistem Nar dan sistem Fnr. Sistem Arc menerima stimulus kekurangan oksigen dan merespons dengan cara merepresi gen-gen yang mengekspresikan enzimenzim respirasi oksidatif. Sistem Nar merespons kekurangan oksigen dengan menginduksi sistem nitrat reduktase. Sistem Fnr berperan sebagai regulator positif untuk transkripsi gen-gen dalam pertumbuhan an aerob.

Isolat HF7 juga diduga memiliki enzim Nap karena pada 12 jam pertama inkubasi pada konsentrasi udara 100% nitrat medium sudah tereduksi. Sementara pada isolat LF6 diduga sistem respirasi lebih didominasi sistem respirasi oksidatif. Reduksi nitrat

isolat LF6 diduga lebih didominasi enzim

Nap. Pada saat konsentrasi oksigen dalam medium habis aktivitas enzim Nap dan enzim Nar yang tidak dominan menghasilkan energi kecil, tidak sebesar isolat HF7. berjalan

Kurangnya ATP yang terbentuk setelah respirasi oksidatif tidak

menyebabkan energi untuk pertumbuhan rendah. Pada konsentrasi

saturasi udara 10% µ

maks

isolat LF6 lebih tinggi dari pada isolat LF7, diduga

respirasi oksidatif pada isolat LF6 dominan dengan memanfaatkan oksigen 10%. Dari hasil uji nitrat (NO3-) tahap seleksi, keempat isolat dapat mereduksi nitrat pada kisaran konsentrasi oksigen 0% sampai 100%. Keempat isolat dapat menggunakan akseptor elektron nitrat. Penggunaan nitrat sebagai akseptor elektron dibatasi keberadaan oksigen. Hal ini dapat terlihat dari kecenderungan reduksi nitrat berbanding terbalik dengan penambahan konsentrasi oksigen. Kultur biakan isolat dengan konsentrasi saturasi udara 100% menghasilkan reduksi nitrat lebih sedikit. Oksigen dapat menghambat reduksi nitrat dengan 3 cara yaitu menekan ekspresi gen yang mensintesis sistem nitrat reduktase, mengganggu enzim nitrat reduktase yang telah terbentuk, dan mengalihkan aliran elektron dari sistem respirasi nitrat ke sistem respirasi oksigen (Hernandez dan Rowe 1988). Sensitivitas sistem nitrat reduktase setiap jenis bakteri terhadap oksigen berbeda. Hasil penelitian Su et al. (2001), bakteri Pseudomonas stutzeri SU2 dapat mereduksi nitrat 99,24% pada konsentrasi oksigen tinggi (92% oksigen). Sementara itu pada Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 pada kondisi oksigen dan suhu yang sama hanya dapat mereduksi nitrat 27-29%. Menurut Otte et al. (1996) implikasi penghambatan oksigen tidak selalu terjadi, oleh karenanya reduksi nitrat dapat berlangsung secara simultan dibawah kondisi aerobik contohnya Alcaligenes faecalis. Reduksi nitrat pada konsentrasi udara 100%

diduga lebih dominan

dikatalisasi enzim nitrat reduktase

diperiplasma, yang merupakan ekspresi gen Nap. Gen penyandi enzim Nap terekspresi pada kondisi aerob dan anaerob (Bedzyck et al. 1999). Enzim Nap

karena terletak di periplasma tidak dipengaruhi transfor nitrat ke membran plasma. Nitrat diduga dapat masuk melalui membran luar (pada bakteri gram negatif) melalui porin dengan perbedaan konsentrasi atau pertukaran muatan ion. Perbedaan hasil uji nitrat (NO3-) pada konsentrasi oksigen rendah dan konsentrasi oksigen tinggi lebih jelas terlihat pada pengamatan kinetika aktivitas reduksi nitrat dua isolat terpilih. Pada saturasi udara kecil 1% dan 10% reduksi nitrat dikatalisasi oleh kedua enzim (Nap dan Nar). Pada kondisi ini transfor nitrat ke membran dapat berlangsung karena konsentrasi oksigen relatif kecil. Aktivitas reduksi nitrat pada kondisi saturasi udara 1 dan 10% menjadi lebih besar, karena terjadi di periplasma dan di sitoplasma. Menurut Korner dan Zumft (1989) pada saturasi udara 17 %,

keberadaan nitrat menyebabkan ekspresi

optimal dari enzim nitrat reduktase. Reduksi nitrat tercepat umumnya mulai jam ke 12 sampai jam ke 60 dengan inokulan yang sudah dalam fase eksponensial (24 jam). Penurunan konsentrasi nitrat yang tereduksi lebih terlihat berbanding lurus dengan peningkatan jumlah sel pada konsentrasi saturasi udara rendah (1% saturasi udara), dari pada konsentrasi oksigen tinggi (100% saturasi udara).

Hal ini dikarenakan pada

konsentrasi oksigen rendah nitrat digunakan sebagai satu-satunya akseptor elektron untuk menghasilkan energi. Pada kondisi oksigen di lingkungan terbatas bakteri

fermentatif

mengubah

jalur

respirasi

oksidatif ke jalur reduktif

(Purwoko 2007). Enzim Nar pada membran plasma berperanan penting pada kondisi anaerob sebagai penghasil ATP. Sedangkan pada saat konsentrasi oksigen tinggi reduksi nitrat banyak terjadi pada periplasma oleh enzim Nap yang berperan sebagai pengatur keseimbangan redoks pada

posforilasi oksidatif membran. Pada

konsentrasi oksigen tinggi (100%) aktivitas enzim Nar terhambat. Hal ini jelas terlihat pada isolat HF7 konsentrasi saturasi udara 100% setelah jam ke 60 masih mengalami kenaikan reduksi nitrat. Peristiwa ini diperkirakan bahwa aktivitas enzim Nar meningkat dengan habisnya oksigen pada medium. Perbandingan kecepatan rata-rata reduksi nitrat setiap sel isolat pada konsentrasi oksigen berbeda hampir seluruhnya berbanding lurus dengan perbandingan kecepatan rata-rata reduksi koloni isolatnya. Kecepatan rata-rata

reduksi nitrat setiap sel pada isolat LF6 terdapat perbedaan dari kecenderungan umum. Pada saturasi udara 10 % kecepatan reduksi rata-rata setiap sel isolat LF6 lebih besar dari konsentrasi saturasi udara 1%. Sementara kecepatan rata-rata reduksi nitrat pada koloninya, mengikuti kecenderungan umum yaitu reduksi nitrat makin kecil seiring dengan peningkatan konsentrasi oksigen. Hal ini dimungkinkan karena pengaruh faktor pembulatan

perhitungan jumlah sel

dengan penggunaan kurva standar yang regresinya tidak tepat 100%. Kecepatan rata-rata reduksi nitrat baik koloni maupun setiap sel pada isolat LF6 tidak terlalu berbeda pada konsentrasi oksigen yang berbeda. Hal demikian diduga enzim Nap isolat LF6 lebih dominan. Enzim Nap tetap mereduksi nitrat pada saat konsentrasi nitrat rendah atau tinggi. Isolat LF6 dapat tumbuh pada konsentrasi nitrat rendah seperti pada isolasi awal. Isolat LF6 diisolasi

dari

sedimen muara sungai Cisadane dengan media pengkayaan nitrat 0,1 mM (Syahputra 2008). Hasil uji nitrit (NO2-) pada tahap seleksi menunjukkan isolat FR1 mengakumulasi nitrit paling tinggi setelah masa inkubasi 96 jam. Isolat FR1 memiliki gen nitrit reduktase terbatas, sehingga pengubahan nitrit menjadi amonium lambat.

Isolat FR1 cenderung memanfaatkan lebih banyak nitrat

sebagai akseptor elektron untuk menimbulkan energi dari pada menggunakan nitrit. Hal ini sesuai dengan perhitungan termodinamika perubahan nitrat menjadi nitrit menghasilkan energi lebih besar dari pada perubahan nitrit menjadi amonium (Rusmana 2003a). Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut: NO3- + H2 à NO2-

+

NO2 + 3H2 +2H

+

à NH4

H2O +

+

(

2 H2O (

G = -163,03 KJ per mol H2) G = -145,95 KJ per mol H2)

Akumulasi nitrit tertinggi pada FR1 terjadi pada konsentrasi udara 100% diduga selain faktor genetik (dominan enzim Nap) aktivitas reduksi nitrit juga dipengaruhi faktor lingkungan. Aktivitas Nir B dan Nrf terbatas karena tidak tersedianya NADH dan format dalam jumlah banyak sehingga nitrit terakumulasi. Sebab aktivitas Nir B dipengaruhi NADH (Harbone et al. 1992), sedangkan Nrf dipengaruhi format sebagai akseptor elektron (Cole 1996). Hasil uji nitrit

setiap selang waktu 12 jam menunjukkan

isolat HF7

mengakumulasi nitrit pada jam ke 12 sampai jam ke 24 dan konsentrasinya

menurun sejalan dengan peningkatan konsentrasi amonium. Pada isolat LF6 terjadi fluktuasi akumulasi senyawa nitrit, tetapi pada akhir inkubasi isolat LF6 tidak mengakumulasi nitrit yang banyak. Akumulasi konsentrasi nitrit tertinggi diduga sebelum jam ke 12. Hal ini menunjukkan affinitas enzim Nir dan Nrf terhadap nitrit pada kedua isolat cukup baik, faktor suhu dan jumlah nitrit yang banyak diduga mempercepat reduksi senyawa nitrit, meskipun masih tersedia nitrat. Peristiwa ini berlawanan dengan efektifitas energi yang dihasilkan dari perubahan nitrat menjadi nitrit yang lebih besar dari pada energi yang dihasilkan dari perubahan

nitrit ke amonium.

Reaksi perubahan nitrit menjadi amonium secara cepat mulai dari 12 jam pertama masa inkubasi diduga berkaitan erat dengan suhu inkubasi yaitu antara 28-30 oC. Pada kisaran suhu tersebut diduga mempercepat reaksi perubahan nitrit menjadi amonium. Hal ini dapat dibandingkan dengan bakteri DNRA Klebsiella oxyota dan Serratia liquefaciens yang mengakumulasi nitrit pada suhu rendah, dibawah 10oC (Lloyd 2000 diacu dalam Rusmana 2003a). Disamping

faktor suhu jumlah subtrat mempengaruhi reaksi enzimatik.

Jumlah relatif subtrat berpengaruh pada posisi akhir reaksi dan produk pada kesetimbangan untuk mencapai kestabilan termodinamika. Laju reaksi enzimatik sangat dipengaruhi jumlah subtrat dan enzim. Umumnya jumlah subtrat tinggi (dalam batasan optimum) dan kemampuan enzim untuk menurunkan energi aktivasi meningkatkan laju reaksi enzimatik (Kuchel & Ralston 2006). Nitrat tereduksi sangat banyak, afinitas nitrit reduktase baik di periplasma maupun di sitoplasma tinggi, maka laju reaksi enzimatik perubahan nitrit (reaktan) menjadi senyawa produk berlangsung cepat. Laju reaksi yang dikatalisasi enzim dapat meningkat 103 sampai 1012 kali (Kuchel & Ralston 2006). Hasil uji amonium (NH4+) pada tahap seleksi memperlihatkan isolat LF6 dan HF7 menghasilkan amonium lebih tinggi dari isolat FR1 dan FR2. Daya afinitas enzim nitrit reduktase isolat LF6 dan HF7 terhadap subtrat nitrit lebih baik, sehingga reaksi enzimatik nitrit menjadi amonium dapat berlangsung lebih cepat. Isolat yang menghasilkan senyawa amonium tinggi dapat diestimasikan menghasilkan gas N2O lebih sedikit. Hasil penelitian menunjukkan konsentrasi nitrat tinggi menghasilkan estimasi gas N2O atau akumulasi senyawa antara yang

belum terdeteksi lebih tinggi, dibandingkan konsentrasi nitrat rendah.

Hasil

penelitian Syahputra (2007) pada konsentrasi saturasi udara 100% dengan sumber karbon asetat, nitrat medium dibawah 2mM, isolat HF7 dan LF6 menghasilkan amonium 58,80% dan 92,56%. Dari hasil penelitian ini dengan konsentrasi oksigen dan sumber karbon yang sama, menggunakan nitrat 49,41 mM, isolat HF7 dan LF6 menghasilkan amonium 35,93% dan 38,19%. Amonium

yang

dihasilkan pada

kinetika

aktivitas

reduksi

nitrat

menunjukkan konsentrasi amonium meningkat sejalan dengan lamanya waktu inkubasi dan penurunan konsentrasi nitrit. Jumlah amonium dari isolat HF7 dan LF6 setelah diinkubasi selama 96 jam dengan sumber karbon asetat pada konsentrasi saturasi udara 1% lebih tinggi. Hal ini diduga sistem nitrat reduktase berjalan lebih sempurna. Enzim Nar terekspresi, sehingga perubahan nitrat menjadi nitrit tidak hanya dilakukan enzim Nap. Nitrit yang dihasilkan lebih banyak, dengan keberadaan enzim-enzim Nir dan Nrf secara cepat nitrit diubah menjadi amonium. Pada konsentrasi saturasi udara 100 % nitrit yang dihasilkan lebih sedikit karena perubahan nitrat menjadi nitrit pada tahap awal inkubasi hanya difasilitasi enzim Nap sehingga amonium yang dihasilkan lebih sedikit. Pada penelitian ini diduga konsentrasi nitrat

medium yang tinggi

(49,41mM) mempengaruhi mekanisma kerja enzim Nir dan Nrf dalam menghasilkan produk akhir amonium. Walaupun enzim Nir dan Nrf tetap mereduksi nitrit tetapi mempengaruhi hasil akhir pembentukan

amonium.

Pembentukan amonium persamaan reaksi sederhananya adalah: NO2- + 3H2 +2H+

à NH4+ +

2 H2O

Proses biokimia pembentukan amonium dalam reaksi enzimatik sel melalui tahapan beberapa senyawa.

Faktor eksternal dan internal bakteri fermentatif

mempengaruhi produk akhir amonium. Dalam penelitian ini diduga jumlah subtrat (nitrat) yang tinggi meningkatkan laju reaksi tetapi tidak seluruhnya menghasilkan produk akhir senyawa amonium. Pada penelitian ini diduga produk samping berupa gas N2O dari perubahan senyawa nitrit ke amonium lebih banyak dihasilkan. Perkiraan gas N2O yang dihasilkan HF7 dan LF6 secara berurutan adalah 53,20%, 63,93%, 64,06% dan 58,34%, 63,25%, 61,49%. Produksi gas yang

dihasilkan isolat HF7 lebih tinggi pada konsentrasi oksigen 100%. Sementara itu pada isolat LF6 konsentrasi gas tertinggi pada konsentrasi saturasi udara 10%. Hal ini berbeda dengan kultur bakteri denitrifikasi Alcaligenes eutropus, Pseudomonas stutzeri dan Nitrosomonas europia (bakteri nitrifikasi) pada udara saturasi 80 % produksi NO dan N2O adalah 0,87% dan 0,17%, sedangkan pada saturasi udara 1% meningkat menjadi 2,32% dan 0,78% (Kester et al. 1997). Bakteri

Alcaligenes faecalis memproduksi N2 O pada kondisi aerobik sama

dengan kondisi anaerobik (Otte et al. 1996). Pengaruh perbedaan konsentrasi oksigen terhadap gas N2O yang dihasilkan pada bakteri DNRA akan tergantung pada senyawa amonium yang dihasilkan dan senyawa nitrit yang diakumulasi. Kedua isolat menghasilkan amonium paling banyak pada konsentrasi 1%, tetapi pada konsentrasi oksigen 10% dan 100 % bervariasi. Dari penelitian ini belum dapat menunjukkan kecenderungan hubungan konsentrasi oksigen dengan gas yang dihasilkan. Proses poduksi gas N2O ditentukan oleh kelengkapan enzim yang dimiliki bakteri DNRA serta kondisi lingkungan. Bakteri DNRA dapat menghasilkan amonium lebih tinggi dan gas lebih rendah jika memiliki enzim Nap, Nar, Nir dan Nrf. Disamping itu beberapa hasil penelitian menunjukkan faktor lingkungan seperti konsentrasi oksigen, pH, suhu, konsentrasi nitrat, senyawa anorganik sebagai aktivator atau inhibitor mempengaruhi ekspresi dan optimalisasi kerja enzim pereduksi nitrat dan nitrit. Faktor –faktor genetik dan lingkungan tersebut juga diduga berpengaruh terhadap produksi gas N2O kedua isolat. Kemungkinan adanya enzim lain selain Nap, Nar, Nir, dan Nrf. dari kedua isolat juga belum diketahui pasti.

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Oksigen mempengaruhi aktivitas reduksi nitrat bakteri nitrat amonifikasi disimilatif. Pada Isolat HF7 dan LF6 yang bersifat anaerob fakultatif kecepatan reduksi nitrat berbanding terbalik dengan kenaikan konsentrasi oksigen. Pengaruh konsentrasi oksigen terhadap aktivitas reduksi nitrat tergantung dari sensitivitas

sistem nitrat reduktase yang dimilikinya. Pengaruh konsentrasi oksigen terhadap kinetika aktivitas reduksi nitrat isolat HF7 lebih besar dibandingkan terhadap isolat LF6.

Estimasi produksi gas N2O terbesar dari aktivitas reduksi nitrat

terdapat pada konsentrasi saturasi udara 100% pada isolat HF7, sedangkan pada isolat LF6 terdapat pada konsentrasi saturasi udara 10%.

Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui jumlah gas N2O dan jenis gas lain yang dihasilkan dari aktivitas bakteri nitrat amonifikasi disimilatif pada pengaruh konsentrasi oksigen berbeda dengan sumber karbon berbeda. Perlu dilakukan penelitian molekuler untuk mengetahui kelengkapan gen-gen yang mengekspresikan enzim-enzim reduksi nitrat.

DAFTAR PUSTAKA Bedzyck L, Wang T, Ye RW. 1999. The periplasmic nitrate reductase in Pseudomonas sp. Strain G-179 catalyzes the first step of denitrification. J Bacteriol 181:2802-2806 Bonin P, Gilewicz M, Bertrand JC. 1989 Effects of oxygen on each step of denitrification on Pseudomonas nautica. Canadian Journal of Microbiology. 35: 1061-1064. Brahmana S, Suriati A. 2001. Pemanfaatan dan Sumber Pencemaran Muara Sungai Cisadane. Puslitbang Pengairan. Bandung. Carter JP, Ya Hsin Hsiao, Spiro Stephen, Richardson J D. 1995. Soil and sediment capable of aerobic nitrate respiration. Applied and Enviromental Microbiology Journal. 61: p. 2852–2858. Chester R. 1990. Marine Geochemistry. London. Unwin Hyman Etd. Cleseri L S, Greenberg AE, Trusscl RR. 1989. Standard Methods for The Examination of Water and Waste Water. Baltimore. Port City Press. Cole J. 1996. Nitrat reduction amonium by enteric bacteria: redudancy or strategy for survival during oxigen starvation. FEMS Microbiol 138:1-18 Conrad R. 1995. Soil Microbial processes involved in production and consumption of atmospheric trace gas Di dalam : Jones JG. Advance In Microbial Ecology, Vol 14. New York : Plenum Pr. P207-250. Dahuri R, Rais J, Ginting SP, Sitepu MJ. 1996. Pengelolaan Sumberdaya Wilayah Pesisir dan Lautan Secara Terpadu. Jakarta. PT. Pradnya Paramita. Darjamurni. 2003. Siklus Nitrogen di Laut. Term Paper introductory Science Philosophy Graduate Program. Dong LF, Nedwell DB, Underwood GJC, Thornton DCO, Rusmana I. 2002. Nitrous oxide formation in the Colne estuary, England: the central role of nitrite . Appl Environ Microbiol 68:1240-1249.

Greenberg AE, Clesceri LS, Eaton AD. 1992. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. 18th Edition. Washington DC: Publication Office American Public Health Assosiation. Hadioetomo RS. 1983. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta. Gramedia Harbone NR, Griffiths L, Busby SJW, Cole JA. 1992. Transcriptional control, translation and fungtion of the product of the five open reading frames of the Escherichia coli nir operon. Mol. Microbiol 6:2805-2813. Herbert RA, Nedwell DB. 1990. Role of environment factor in regulating nitrate respiration in intertidal sediment. Di dalam : Rusmana I. 2007. Effects of temperature on denitrifying growth and nitrate reduction end products of comamonas testosteroni isolated from estuerine sediment. Microbiology Indonesia 1:43-47. Holt G J, Krieg R N, Sneath HAP, Staley TJ, Williams TS. 1994. Bergeys Manual Of Determinative Bacteriology. Baltimore. Williams&Wilkins. Jetten MSM, Wagner M, Fuerst J, Van Loosdrecht M, Kuenen G, Strous M. 2001. Microbiology and application of the anaerobic ammonium oxidation (Anammox) process. Curr Opin Biotech 12:283-288. Kelso BHL, Smith RV, Laughlin R J, and Lenox D. 1997. Dissimilatory nitrate reduction in anaerobic sediments leading river nitrite accumulation. Appl. Environ. Mecrobiol. 63:4679-4685. Kennish MJ.1994. Practical Hand Book of Marine Sceince. Second edition. Boca Raton. CRC Press Inc. Kester R, Boer W, Laanbroek H .1997. Production of NO and N2O by pure cultures of nitrifying and denitrifying bacteria during changes in aeration. Appl. Environ. Microbiol. 63:3872-3877. Korner H, Zumft WG. 1989. Expression of denitrification enzymes in response to the dissolved oxygen level and respiratory substrate in continuous culture of Pseudomonas stutzeri. Applied and Environmental Microbiology 55(7), 1670-1676. Kuchel P, Ralston GB. 2006. Biokimia. Edisi ke II. Laelasari E, penerjemah. Jakarta. Erlangga. Terjemahan dari Biochemistry. Li Y. 2004. Denitrification Capacity and Denitrifying Bacteria in A Restored Bottom Land Hardword Forest, Missisippi River Alluvial Valley Hydrological Impacts[thesis]. Departement of Environmental Studies. Nanjing University. Lloyd DL. 2000. Temperature effects on competition, selection and physiologi of estuarine nitrate respiring bacteria. Di dalam Rusmana I. 2003. Physiology of Nitrous oxide Produktion In Estuarin Dissimilative Nitrate Reducing Bacteria [thesis]. Department of Biologi University of Essex Colchester. Madigan MT, Martinko JM, Parker. 2006. Biology of Microorganism. 11th. New Jersey. Printice-Hall. Maier MR, Pepper IL, Gerba PC. 2000. Environmental Microbiology. London. Academic Press. Marnis H. 2008. Karakterisasi Molekular dan Uji Aktivitas Bakteri Pereduksi Nitrat di Muara Cimandiri Sukabumi Jawa Barat [tesis]. Departemen Biologi IPB. Bogor

Moat GA, Foster JW, Spector MP. 2002. Microbial Physiology. 4th. New York. Willey liss. Inc. Moreno Vivian C, Cabello P, Martinez-Luque M, Blassco R, Castillo F. 1999. Prokaryotic nitrate reduction : molecular properties and fungtional distinction among bacterial nitrate reductases. Journal of Bacteriology, p.6573-6584. Nedwell DB. 1982. Exchange of nitrate, and product of bacterial nitrate reduction, between seawater and sediment from a U.K. saltmash. Estuarine Coast Shelf Sci 14:557-556. Otte S, Grobben NG, Robertson LA, Jetten M , Kue JG. 1996. Nitrous oxide production by Alcaligenes faecalis under trasient and dynamic aerobic and anaerobic. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 62 : p 2421– 2426. Patereu DJ, Davidson J, Barnet N, Molleta R. 1994. Denitrification under various areation codition Comamonas sp strain SGLY2. FEMS Mikrobiol. 14: 71-78. Purwoko T. 2007. Fisiologi Mikroba. Jakarta. Bumi Aksara. Ricardson DJ. 2000 Bacterial respiration: a flexible process for a changing environment. Microbiology 146:551-571. Ricardson DJ, Berk BC, Ressel DA, Spiro S, Taylor CJ. 2001. Fungtional biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases . Cell Mol Lif, Sci 58: 165-178. Rodina GA 1972. Methods in Aquatic Microbiology . Rita RC, Machael S Editor. Baltimore. University Park Press. Rusmana I. 2003a. Physiology of Nitrous oxide Produktion In Estuarin Dissimilative Nitrate Reducing Bacteria [thesis]. Department of Biologi University of Essex Colchester. Rusmana I. 2003b. Reduksi nitrat disimilatif pada bakteri: isu lingkungan dan penerapannya. Hayati. Hlm 158-160. Rusmana I. 2003c. Nitrous oxide formation ini bacteria [Komunikasi singkat]. J Mikrobiologi Indonesia, hlm 65-70. Rusmana I. 2005. Nitrogen vertical profiles, nitrate and nitrite exchange rate, and nitrous oxide formation in Colne estuary sediment. Jurnal Mikrobiologi Indonesia, hlm 65-70, IPB-Bogor. Rusmana I, Nedwell DB. 2004. Use chlorat as a selectif inhibitor to distinguish membran bond nitrat reductase (nar) and periplasmic nitrate reductase(nap) of dissimilatif nitrat reducing bacteria in sediment . FEMS Microbiology Ecology .48; 379-386. Seitzinger S P, Kroezen C. 1998. Global distribution of nitrous oxide production and nitrogen input in freshwater and coastal marine ecosystem. Global. Biogeochem. Cycle. 12: 93-13. Syahputra K.2007. Uji Aktivitas dan Karakterisasi Molekular Bakteri Pereduksi Nitrat dari Muara Cisadane Tanggerang Jawa Barat [tesis]. Departemen Biologi IPB. Bogor. Su.J.-J, Liu BY, Liu CY. 2001. Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere by Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2 newly isolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatment system, Journal of Applied Microbiology page 457-462.

White D. 1995. The Physiology and Biochemistry of Procaryotes. 2nd Edition. USA. Oxford Univ Pr. Widiyanto T. 2006. Seleksi Bakteri Nitrifikasi dan Denitrifikasi Untuk Bioremediasi di Tambak Udang. [disertasi]. IPB. Bogor. Zumft WG. 1997. Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbial Mol Biol Rev. 61:533-616.

Lampiran 1. Pembentukan warna pada uji kadar nitrat (A), nitrit (B), dan amonium (C).

A

B

C

Lampiran 2 Kurva standar konsentrasi amonium (A) dan kurva standar konsentrasi nitrit (B)

Kurva Standar Amonium 2.00 1.80 Absorbansi (640 nm)

1.60

y = 11.201x + 0.0514 R2 = 0.9963

1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

Konsentrasi amonium (mM)

A

Kurva Standar Nitrit 2.00

y = 114.81x + 0.224 R2 = 0.9087

1.80 1.60 Abs or bans i

1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

Konsentrasi nitrit (mM)

B

0.012

0.014

0.016

Lampiran 3 Jumlah CFU Isolat HF7 dan LF6 pada pengenceran 10-8

Lampiran 4

Kurva standar pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 pada kondisi nitrat medium 49,41 mM

OD (620 nm)

Kurva Standar Pertumbuhan Isolat HF7 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

y = 0.0073x + 0.0208 R2 = 0.9623

0

10

20

30

40

50

9

Jumlah Organisma ( 10 CFU/ml)

kurva s tandar pertum buhan Isolat LF6

y = 0.091x + 0.0239 R2 = 0.9427

0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0

5

10

15

20

Jumlah organisma (109 CFU/sel)

25

30

Lampiran 5

Presentase nitrat tereduksi dan senyawa yang dihasilkan isolat LF6,HF7 dan FR2 pada kadar udara saturasi berbeda dengan inkubasi selama 4 hari suhu ruang (29-31)oC Isolat LF6

Perlakuan udara saturasi

Nitrat nitrat Awal tereduksi

0% 1% 10% 30% 50% 80% 100%

49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41

mM 48,52 47,78 47,50 47,17 46,04 45,34 45,40

% 98,19 96,69 96,12 95,46 93,17 91,75 91,88

Nitrit terbentuk

Amonium terbentuk

Estimasi gas terbentuk

mM 0,05 0,00 0,02 0,01 0,04 0,03 0,03

mM 15,02 6,17 8,94 9,26 12,00 10,02 9,18

mM 33,45 31,61 38,54 37,90 34,01 35,29 36,19

% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

% 30,95 33,85 18,83 19,63 26,06 22,09 20,23

% 68,95 66,15 81,14 80,35 73,86 77,84 79,71

Isolat HF7 Perlakuan udara saturasi


0% 1% 10% 30% 50% 80% 100%

49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41

mM 48,78 47,07 46,13 47,17 45,83 45,84 45,67

% 98,72 95,26 93,35 95,46 92,75 92,77 92,42

Nitrit terbentuk

Amonium terbentuk


mM % 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,03 0,02 0,04 0,00 0,00 0,03 0,07

mM % 14,77 30,29 14,19 30,14 13,15 28,50 14,18 30,06 16,19 35,33 14,69 32,05 7,29 15,96

mM 34,01 32,89 32,99 32,98 29,62 31,15 38,35

% 69,72 69,86 71,51 69,91 64,63 67,95 83,96

Isolat FR2 Perlakuan udara saturasi


0% 1% 10% 30% 50% 80% 100%

49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41

mM 48,37 46,63 46,84 48,31 47,89 47,47 44,76

% 97,88 94,36 94,78 97,76 96,91 96,06 90,58

Nitrit terbentuk

Amonium terbentuk


mM 0,00 0,00 0,02 0,00 0,00 0,00 0,03

mM 6,73 9,02 9,20 8,35 8,90 10,19 7,72

mM 41,64 36,91 37,61 39,96 39,77 38,87 41,38

% 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,00 0,06

% 13,91 19,35 19,65 17,28 18,58 21,47 17,25

% 86,09 79,16 80,31 82,72 83,05 81,88 92,44

Lampiran 6 Presentase nitrat tereduksi dan senyawa yang dihasilkan isolat FR1 pada kadar udara saturasi berbeda dengan inkubasi selama 4 hari suhu ruang (29-31)oC Isolat FR1

Perlakuan Nitrat Awal udara saturasi 0% 1% 10% 30% 50% 80% 100%

49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41 49,41

nitrat tereduksi

Nitrit terbentuk

Amonium terbentuk


mM 48,20 47,73 48,01 47,28 47,08 46,35 46,26

mM 1,74 1,88 2,86 2,55 2,54 3,17 4,95

mM 7,09 9,05 6,87 6,08 6,55 6,75 6,50

mM 39,37 36,79 38,28 38,65 37,99 36,43 34,82

% 97,54 96,58 97,15 95,68 95,28 93,79 93,62

% 3,61 3,94 5,96 5,39 5,39 6,84 10,70

% 14,71 18,97 14,30 12,86 13,92 14,56 14,04

% 81,68 89,79 85,87 87,14 86,08 85,44 85,96

Lampiran 7 Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit, nitrat, amonium dan estimasi gas yang dihasilkan isolat LF6 dan HF7

Nitrat,nitrit, amonium, gas (mM)

Isolat LF6 50 40 30 20 10 0 0%

1%

10%

30%

50%

80%

100%

Konsentrasi udara saturasi

Nitrat, Nitrit, Amonium, gas (mM)

Isolat HF7 50 40 30 20 10 0 0%

1%

10%

30%

50%


Keterangan

Nitrat tereduksi Nitrit terakumulasi Amonium yang dihasilkan Estimasi gas yang dihasilkan

\

80%

100%

Lampiran 8 Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit, nitrat, amonium dan estimasi gas yang dihasilkan isolat FR1 dan FR2

Nitrat,nitrit, amonium, gas (mM)

Isolat FR1 50 40 30 20 10 0 0%

1%

10%

30%

50%

80%

100%


Nitrat,nitrit,amonium,gas (mM)

Isolat FR2 50 40 30 20 10 0 0%

1%

10%

30%

50%

80%


Keterangan

Nitrat tereduksi Nitrit terakumulasi Amonium yang dihasilkan Estimasi gas yang dihasikan

100%

KINETIKA AKTIVITAS REDUKSI NITRAT BAKTERI NITRAT AMONIFIKASI DISIMILATIF DARI MUARA SUNGAI PADA KONSENTRASI OKSIGEN (O 2 ) YANG BERBEDA TETI MARDIATI

Recommend Documents