Proceeding Seminar Nasional Biodiversitas II
ISBN : 978-979-98109-2-2
Uji Ketahanan Berbagai Hibrida Tanaman Kubis (Brassica oleracea CV. Capitata L.) terhadap Infeksi Jamur Patogen
Y. Sri Wulan Manuhara1), Ni Nyoman Tri Puspaningsih2),Sri Puji Astuti W.1), dan Widhi Dyah Savitri.1) 1)
Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga
2)
ABSTRAK: Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan ketahanan berbagai hibrida tanaman kubis asal impor dan lokal terhadap infeksi jamur patogen dilihat dari besarnya nekrosis daun dan profil proteinnya. Sebagai bahan penelitian digunakan 6 jenis hibrida tanaman kubis yaitu hibrida K-K Cross, Ishito, Sinjiku, Gloria osena, Rotan osena, dan investor, sedangkan jamur patogen yang digunakan adalah Penicillum sp., Mucor sp., Aspergillus sp. Dan Alternaria sp. Uji ketahanan dilakukan dengan cara menginokulasikan miselium-disk (diameter 5 mm) yang telah ditumbuhi jamur patogen dipermukaan atas daun tanaman kubis. Tanaman kemudian dipelihara dalam keadaan lembab dan gelap. Tiga hari sebuah inokulasi diukur diameter nekrosis yang terjadi pada daun. Untuk mengetahui profil proteinnya dilakukan SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukan tingkat ketahanan 6 hibrida tanaman kubis terhadap infeksi berbagai macam jamur berbeda-beda, tetapi berdasarkan besarnnya nekrosis akhibat infeksi jamur diperoleh bahwa tanaman kubis lokal (Gloria osena, Rotan osena dan Investor) lebih tahan dibanding tanaman kubis impor (K-K Cross, Ishito, Sinjiku). Profil protein dari enam hibrida tanaman kubis yang digunakan dalam penelitian ini sama, yaitu terdiri dari 6 pita dengan berat molekul 200kDa, 150 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa. Di antara pita protein tersebutterdapat pita dengan berat molekul 33 kDa yang menunjukan berat molekul dari protein enzim β-1,3-endoglukanase.
KATA KUNCI: Brassica oleracea CV. Capitata L. Ketahanan tanaman, infeksi, jamur patogen
PENGANTAR Indonesia sebagai negara tropis telah dikenal sebagai negara yang kaya akan biodiversitas, baik dari aspek tanaman, hewan maupun mikroba. Kekayaan biodiversitas tersebut selain mempunyai banyak manfaat, di lain pihak juga merugikan, terutama berlimpahnya mikroba. Di bidang pertanian banyak dijumpai mikroba patogen (bakteri dan jamur)yang merusak tanaman budidaya. Sebagai contoh, berbagai jenis mikroba yang menyerang tanaman kubis antara lain dari golongan bakteri adalah Xanthomonas campestris yang menyebabkan penyakit busuk hitam, Erwinia carotovora yang menyebabkan penyakit busuk lunak, sedangkan dari golongan jamur adalah Alternaria brassicae (Berk).Sacc. yang menyebabkan penyakit bercak hitam, Fusarium oxysporium yang menyebabkan penyakit daun kuning, Plasmodiophora brassica Wor. Yang menyebabkan akar bengkak (Permadi, 1993; Djatmika, 1993). Berbagai mikroba juga banyak merusak tanaman-tanaman budidaya lainnya seperti jamur Fusarium sp. Yang menyerang pohon pisang, virus CVPD (citrus Vein Phloem Degeneration) yang menyerang pohon jeruk dan masih banyak lainnya. Berbagai macam hibrida kubis yang ditanam petani berasal dari hasil silangan kubis lokal dan kubis impor atau diperoleh langsung dari impor biji. Tetapi hibrida hasil silangan tersebut pada umumnya masih rentan terhadap penyakit akhibat jamur maupun bakteri, oleh karena itu masih diperlikan fungisida dan bakterisida untuk
Y. Sri Wulan Manuhara
menjaga agar tanaman kubis tidak rusak. Ada beberapa hibrida kubis lokal yang resisten terhadap infeksi jamur maupun bakteri. Resistensi kubis lokal tersebut terhadap penyakit akhibat jamur diduga kuat akhibat adanya ekspresi enzim β-1,3enduglokanase berfungsi mengkatalis proses hidrolisis enzim β-1,3-enduglokanase terhadap dinding sel jamur akan menghasilkan elisitorberupa karbohidrat yang selanjutnya menginduksi terbentuknya fitoaleksin antijamur (Selitennikoff, C.P.,2001; Tekeuchi et al, 1990, Yoshikawa dan Wang, 1993). Uji resistensi terhadap berbagai hibrida tanaman kubis diperlukan untuk mengetahui manakan diantara diantara kubis lokal dan impor yang mempunyai ketahanan terhadap penyakit akhibat jamur patogen. Selanjutnya hasil uji resistensi ini dapat digunakan sebagai dasar untuk mencari sumber gen ketahanan terhadap infeksi jamur. BAHAN DAN CARA KERJA Bahan Hibrida tanaman kubis (Brassica oleracea var. Capitata L.) Biji berbagai hibrida tanaman kubis diperoleh dari petani di kabupaten Batu, Malang dan kabupaten Probolinggo. Jenis hibrida tanaman kubis tersebut adalah K-K Cross, Ishito, Sinjiku, Gloria osena, Rotan osena, dan Investor. Tiga hibrida yang disebut pertama adalah tanaman kubis impor, sedangkan tiga lainnya merupakan tanaman
Page 109
Proceeding Seminar Nasional Biodiversitas II kubis lokal. Biji berbagai hibrida tanaman kubis di tanam dalam pot dan di pelihara selama 2 bulan. Daun tanaman kubis yang berumur dua bulan digunakan sebagai bahan untuk isolasi protein. Mikroorganisme Dalam penelitian ini juga dilakukan infeksi beberapa jamur terhadap daun tanaman kubis untuk mengetahui aktivitas enzim β-1,3enduglokanase. Beberapa daun di isolasi dari daun tanaman kubis yang menunjujkan gejala sakit, seperti nekrosis, daun berwarna coklat. Dari hasil isolasi diperoleh jamur Penicillium., mucor sp., Aspergillus sp dan Alternaria sp. Cara Kerja Isolasi jamur patogen Jamur patogen tanaman kubis diperoleh dengan mengisolasi beberapa jamur dari daun tanaman kubis yang menunjukan gejala penyakit kuning(nekrosis) dan bercak hitam di kabupaten Batu, Malang. Isolasi dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Universitas Airlangga, Surabaya. Inokulasi jamur patogen ke dalam berbagai hibrida tanaman kubis Empat macam jamur patogen kubis (Penicillium sp. Mucor sp., Aspergillus sp., dan Alternaria sp.) yang diperoleh dari hasil isolasi diatas ditumbuhkan dalam media PDA selama 3 hari. Miselium-disk (diameter 5 mm) yang telah ditumbuhi jamur patogen kemudian diinokulasikan di sisi atas daun tanaman kubis. Tanaman kemudian dipelihara dalam keadaan lembab dan gelap. Tiga hari setelah inokulasi diukur diameter nekrosis yang terjadi pada daun. Hekrosis adalah terjadinya kerusakan jaringan daun yang ditunjukan oleh kematian sel dan jaringan sehingga daun berwarna kuning dan kemudian berubah menjadi coklat.
ISBN : 978-979-98109-2-2 Isolasi protein total (modifikasi Vanini et al., 1999) Tiga sampai enam gram daun tanaman 0 kubis dibekukan (-20 C) selama satu malam, kemudian dihancurkan menggunakan mortal sampai menjadi serbuk. Serbuk yang dihasilkan diekstrak menggunakan 5 ml 50 mM Tris HCI pH 8,2 dan dimasukkan ke dalam tabung konikel/eppendorf, kemudian di vortex lalu 0 dimasukan kedalam freezer (-20 C) selama 1 jam. Ekstrak disentrifuge selama 30 menit dengan 0 kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 C. Supernatan diendapkan menggunakan ammanium sulfat dengan kejenuhan 40 % dengan cara menggoyangkan larutan selama 30 menit pada 0 suhu 4 C. Supernatan dibuang dan pelet yang mengendap dilarutkan menggunakan akuades steril. Pengukuran kadar protein total Pengukuran kadar protein total dilaksanakan mengikuti prosedur BioRad Protein Assay. Sebanyak 2µl sampel protein dimasukan kedalam 798 akuades steril kemudian ditambahkan reagen BioRad Protein Assay sebanyak 200µl dan campuran divortex agar homogen. Pengukuran kadar protein didasarkan pada OD595 nm sampel menggunakan spektrofotometer dengan kyrva standart protein BSA. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini dilakukan inokulasi 4 macam jamur patogen yaitu Penicillium sp., mucor sp., Aspergillus sp., dan Alternaria sp. Terhadap daun tanaman kubis dari 6 jenis hibrida, untuk mengetahui ketahanan tanaman kubis terhadap infeksi berbagai jamur patogen. Pengamatan dilakukan dengan mengukur luas nikrosis yang terjadi akhibat infeksi jamur. Data dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Rerata luas area nekrosis (cm 2) yang terjadi pada daun berbagai hibrida tanaman kubis akhibat infeksi 4 jenis jamur patogen Jenis jamur patogen Jenis hibrida tanaman kubis Penicillium sp. Mucor sp. Aspergillus sp. Alternaria sp. K-K Cross 1,493+1,334 4,743+5,973 7,683+1,093 9,283+8,071 Gloria Osena* 0,210+0,364 0 0 3,817+5,807 Ishito 0 0,070+0,0624 5,227+4,778 0,743+1,270 Sinjiku 0,450+0,501 1,423+1,696 3,797+3,184 0,437+0,499 Rotan Osena* 0,233+0,204 0 3,527+3,146 0,237+0,409 Investor* 0 0 1,480+2,653 0,437+0,374 Keterangan: *:kubis lokal
Dari data tersebut menunjukan bahwa tingkat ketahanan 6 hibrida tanaman kubis terhadap infeksi berbagai macam jamur berbeda-beda. Ke enam hibrida tanaman kubis rentan terhadap jamur Alternaria sp. Yang ditunjukkan oleh terjadinya nekrosis pada ke enam hibrida tanaman kubis tersebut, sedangkan nikrosis terbesar terjadi pada hibrida K-K Cross. Selain itu tanaman kubis hibrida K-K Cross dan hibrida Shinjiku paling rentan terhadap 4 jenis jamur yang diinfeksikan. Kedua hibrida tanaman kubis tersebut berasal dari luar Indonesia, sedangkan yang tahan terhadap infeksi
Y. Sri Wulan Manuhara
jamur adalah hibrida Gloria osena dan Investor, keduanya merupakan hibrida tanaman kubis lokal. Hal ini berarti bahwa tanaman kubis hibrida lokal lebih tahan terhadap penyakit akhibat jamur dibandingkan tanaman kubi hibrida impor. Berikut ini diberikan contoh tanaman kubis yang terinfeksi jamur Penicillium sp., mucor sp., Aspergillus sp.,dan alternaria sp.serta kontrol( daun tanaman kubis tidak diinfeksi jamur patogen) (Gambar1). Dari gambar 1 tersebut terlihat bahwa daun tanaman kubis yang diinfeksi oleh jamur Aspergillus sp. Menunjukkan tingkat nikrosis yang
Page 110
Proceeding Seminar Nasional Biodiversitas II paling besar, sedangkan tingkat nekrosis yang kecil ditunjukkan oleh infeksi jamur Penicillium sp. Hal ini di dukung dengan analisis statistik menggunakan uji Kruskal-Wallis untuk mengetahui pengaruh jenis jamur terhadap tingkat nekrosis daun tanaman kubis pada tabel 2. Hasil test tersebut menunjukan
ISBN : 978-979-98109-2-2 probabilitas kurang dari 0,05 artinya ada pengaruh jenis jamur terhadap luas area nikrosis daun tanaman kubis. Kemudian dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan. Hasilnya disajikan pada Tabel 3.
Gambar 1. Contoh daun tanaman kubis yang mengalami nikrosisnakhibat infeksi jamur Penicillium sp.(A),Mucor sp. (B), Aspergillus sp.(C),Alternaria sp.(D), dan kontrol (E) Tabel 2. Hasil uji Kruskal-Wallis data luas area nekrosis setelah perlakuan infeksi beberapa jenis jamur patogen Test Statistics a,b NEKROSIS Chi-Square Df
8.147 3
Asymp. Sig.
.043
a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable : JAMUR
Tabel 3. Hasil Uji Mann-Whitney data luas area nekrosis setelah perlakuan infeksi beberapa jenis jamur patogen Penicillium sp. Mucor sp. Asspergillus sp. Alternaria sp. Penicillium sp. 0,854(ns) 0,022(s) 0,108(ns) Mucor sp. 0,028(s) 0,073(ns) Aspergillus sp. 0,582(ns) Alternaria sp. Keterangan : ns=non significant, s=significant
Y. Sri Wulan Manuhara
Page 111
Proceeding Seminar Nasional Biodiversitas II
ISBN : 978-979-98109-2-2
Tabel 4. Hasil uji Kruskal-Wallis data luas area nekrosis pada berbagai jenis hibrida tanaman kubis Test Statistics a,b NEKROSIS Chi-Square
15.083
Df
5
Asymp. Sig.
.010
a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable : HIBRIDA
Untuk mengetahui jenis hibrida tanaman kubis terhadap luas area nikrosis dilakukan uji Kruskal-Wallis, yang hasilnya disajikan pada tabel 4. Dari hasil uji tersebut diperoleh probabilitas kurang dari 0,05, artinya ada pengaruh yang
signifikan antara jenis hibrida tanaman kubis dengan luas area nekrosis. Selanjutnya dilakukan uji Mann-Whitney untuk mengetahui perbedaan pengaruh antar kelompok perlakuan. Hasilnya disajikan pada tabel 5.
Tabel 5. Hasil uji Mann-Whitney dan luas nekrosis pada berbagai jenis hibrida tanaman kubis K-K Glo Ish Sin K-K 0,007(s) 0,038(s) 0,067(s) Glo 0,319(ns) 0,033(s) Ish 0,213(ns) Sin Rot Inv Keterangan: ns=non-significant, s=significant
Untuk mengetahui infeksi jamur patogen terhadap aktivitas enzim β-1,3-endoglukanase isolasi protein total untuk mengetahui profil proteinnya. Profil protein dari enam hibrida tanaman kubis yang digunakan dalam penelitian ini sama, yaitu terdiri dari enam pita dengan berat molekul 200 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa (Gambar 2). Di antara pita protein tersebut terdapat pita dengan berat molekul 33 kDa yang menunjukan berat molekul dari protein enzim β-1,3endoglukanase. Tujuan eksperimen ini adalah untuk mengetahui pengaruh infeksi jamur patogen terhadap enzim β-1,3- endoglukanase. Seperti telah diketahui bahwa enzim β-1,3- endoglukanase akan diproduksi oleh tanaman pada saat tanaman diinfeksi oleh jamur. Aktivitas antifungal β-1,3glukanase pada tumbuhan terjadi oleh adanya kemampuan enzim β-1,3- glukanase menghidrolisa struktur β-1,3- glukan yang ada pada dinding sel jamur, terutama pada bagian ujung hifa dimana glukan paling banyak dijumpai sehingga dinding sel menjadi lemah kemudian sel lisis dan mati (Selitennikoff, 2001). Selain itu aktivitas antifungal β-1,3- glukanase pada dinding sel jamur akan menyebabkan dilepaskannya elisitor yang berupa
Y. Sri Wulan Manuhara
Rot 0,015(s) 0,513(ns) 0,801(ns) 0,159(ns)
Inv 0,006(s) 0,829(ns) 0,478(ns) 0,025(s) 0,572(ns)
oligosakarida yang akan menginduksi terbentuknya fitoaleksin antijamur (Yoshikawa et al.,1983). Dari hasil penelitian ini diperoleh bahwa tingkat ketahanan enam hibrida tanaman kubis terhadap infeksi berbagi macam jamur berbedabeda, tetapi berdasarkan besarnya nekrosis akhibat infeksi jamur diketahui bahwa tanaman kubis lokal (Gloria osena, Rotan osena dan Investor) lebih tahan dibanding tanaman kubis impor (K-K Cross, Ishito, Sinjiku). Profil protein dari enam hibrida tanaman kubis yang digunakan dalam penelitian ini sama, yaitu terdiri dari enam pita dengan berat molekul 200 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 40 Da, 30 kDa. Dari hasil isolasi protein total tersebut diketahui bahwa semua hibrida tanaman kubis mempunyai pita protein dengan berat molekul 30 kDa. Pita tersebut diduga adalah pita dari enzim β1,3- endoglukanase. Untuk mengetahui pengaruh infeksi jamur patogen terhadap aktivitas enzim β1,3- endoglukanaseperlu dilakukan uji aktivitas enzim β-1,3- endoglukanase. DAFTAR PUSTAKA 1) Djatnika, I., 1993. Penyakit-penyakit tanaman kubis dan cara pengendalian. Dalam A.H. Permadi & S. Sastrasiswojo (Penyunting). Kubis. Edisi pertama:51-61. Kerjasama
Page 112
Proceeding Seminar Nasional Biodiversitas II
2)
Balitort Lembang dengan program Nasional PHT, Bappenas. Permadi. A.H. 1994. Pemuliaan Tanaman Kubis. Dalam: Permadi, A.H. dan Sastrosiswojo, S. (Penyunting). Kubis. Kerjasama Balitort Lembang dengan program Nasional PHT, Bappenas.
3) Selitennikoff, C.P. 2001. protein. Appl. Environ. 67:2883-2894. 4)
5)
6)
ISBN : 978-979-98109-2-2
Antifungal Microbiol.
Takeuchi, Y., Yoshikawa, M., Takeba, G., Tanaka, K., Shibata, D., Horino, O. 1990. Molecular cloning and ethylene induction of mRNA encoding a phytoalexin elicitorreleasing factor, β-1,3- endoglukanase, in soybean. Plant Physiol. 93:673-682. Yoshikawa, M., Keen, N.T. and Wang, M.C 1983. A receptor on soybean membranes for a fungal elicitor of phytoalexin accumulation. Plant Physiol. 73:49-52. Yoshikawa, M., Tsuda, M. and Takeuchi, Y. 1993. Resitance to fungal disease in transgenic tobacco plants expressing the Phytoalexin elicitor-releasing factor, β-1,3endoglukanase, from soybean. Naturwissenschaften 80:417-420.
200 150 120 100 85
kDa 108,9 101,1 81,07
70 60
60,36 54,04
50 50,19 40 30 25 20 15 10
37,37 32,24 28,84 23,1 20,71
Gambar 2. Pita-pita protein yang terbentuk dalam gel hasil elektroforesis SDS-PAGE pada kontrol. (M) marker, (1) KK Cross, (2) Gloria Osena, (3) Ishito 3, (4) Shinjuku, (5) Rotan Osena, (6) Investor 369.
Y. Sri Wulan Manuhara
Page 113
