UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

Analisa Karbohidrat 

Uji Kualitatif o o o o o o o o



Uji Kuantitatif

o Cara Kimiawi Uji Molisch o Cara Enzimatis Uji Seliwanoff o Cara kromatografi Uji Anthrone o Cara Optic (fisis) Uji Benedict Uji Barfoed Uji Iodin Uji Pembentukan Osason Uji Fehling

II. Uji Karbohidrat secara Kuantitatif Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan , yaitu hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida.

Hidrolisa

Oligo / polisakarida → monosakarida (Pati) Asam atau enzim (glukosa) Penentuan monosakarida:  kimiawi  fisik  enzimatik  kromatografi

Cara kimiawi 1. Metoda oksidasi dengan kupri Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena adanya gula reduksi Reagen : - Reagen Luff (campuran CuSO4, Na2CO3, dan asam sitrat) - Reagen soxhlet (campuran CuSO4 dengan K – Na –tartrat)

K-Na tartrat : pencegah pengendapan CuSO4 dalam reagen

kuprioksida  - sebagai oksidator - direduksi oleh gula reduksi membentuk kuprooksida (endapan merah bata) Penentuan kuprooksida yang terbentuk:

 Menimbang setelah dikeringkan  Melarutkan kembali, kemudian dititrasi Menentukan selisih kuprioksida sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi Penentuan gula reduksi dalam larutan:  Cara luff Schoorl  Cara Munson Walker  Cara Lane-Eynon

Cara Luff Schoorl Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi = (titrasi blanko – titrasi sampel) Reaksi : R – COH + CuO  Cu2O + R – COOH H2SO4 + CuO  CuSO4 + H2O CuSO4 + 2KI  CuI2 + K2SO4 2CuI2  Cu2I2 + I2 I2 + Na2S2O3  Na2S4O6 + NaI I2 + amilum : biru

Metode oksidasi dengan larutan Ferrisianida alkalis Dasar : reduksi ferisianida  ferrosianida oleh gula reduksi. 2K3Fe(CN)6 + 2KI  2K4Fe(CN)6 + I2 2K4Fe(CN)6 + 3 ZnSO4  K2Zn2[Fe(CN)6]2↓ + 3 K2SO4 gula reduksi ditentukan :  berdasar ∑ I2  berdasar ∑ NaS2O3 untuk titrasi Indikator : amilum (warna biru hilang) K4Fe(CN)6 yang terbentuk dihitung dari selisih antara K3Fe(CN)6 sebelum dan sesudah reaksi reduksi. Perlu dilakukan percobaan standarisasi

Metoda Iodometri Kelebihan I2 dititrasi dengan Na2S2O3  Reaksi : Sampel Spesifik untuk aldosa, ketosa hanya sedikit yang teroksidasi  Harus dihilangkan zat yang dapat bereaksi dengan Iodin : etanol, aseton, mannitol, gliserin, Na laktat, Na format dan Urea 

Laktosa secara kimiawi  25 ml susu + reagen  filtrat  5 ml filtrat + reagen  titrasi dengan Na2S2O3 100 A = (Tb – Ts) x N x 0,171 x  5 A = Kadar Laktosa (g/100 ml) Tb = titrasi blanko Ts = titrasi sampel  Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5% dari 100 ml susu  48,4 ml filtrat 48,4 100 Kadar laktosa/100 ml susu = A x  x  100 25

Penentuan Sukrosa

Langsung dengan Polirimeter/refraktometer Kimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi) C6H12O11 + H2O  C6H12O6 + C6H12O6 Sukrosa fruktosa glukosa (342) (180) (180) ∑ Sukrosa = 0,95 x ∑ gula reduksi ↓ BM Sukrosa 342 FK =  =  2 BM gula reduksi 360 Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi dalam sampel sebelum hidrolisa.

Penentuan pati Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim  gula reduksi  ditera jumlahnya [C6H10O25] m + mH2O  m C6H12O6 pati glukosa BM = m.162 BM = 180 m BM pati FK =  m . BM gula reduksi m x 162 =  = 0,9 m x 180

Cara Enzimatis Terutama untuk penentuan gula dalam campuran  karena enzim bersifat spesifik Misal: penentuan glukosa dan fruktosa Dasar : glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi glu–6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P) dengan bantuan enzim heksokinase dan Adenosin– 5-trifosfat (ATP)

Glu + ATP  G-6-P + ADP Fruk + ATP  F-6-P + ADP G-6-P-DH G-6-P + NADP → glukonat 6P + NADPH + H+ NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi  diukur dengan spektrofotometer (λ = 334, 340, 365 nm)

PGI F-6-P → G-6-P G-6P-DH G-6-P + NADP → glukonat-6-P + NADPH + H+ ↓ Ditera

Penentuan Laktosa dan Galaktosa Dasar : β galaktosidase

Laktosa + H2O

Glukosa + β galaktosa

Gal DH β galaktosa + NAD → asam galatonat + NADH + H+

↓ ditera (I) pada λ= 334, 340, 365 nm

C. Cara Khromatografi Khromatografi kertas/TLC : diukur besarnya Rf tiap komponoen karbohidrat Jarak perpindahan molekul zat Rf =  Jarak perpindahan pelarut Harga Rf tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama dipengaruhi : - Macam zat pelarut - Ukuran bejana - Suhu - Macam fase tetap/stasioner - Sifat zat yang dianalisa

Kromatografi kertas untuk karbohidrat  Zat penyangga : kertas yang tersusun oleh selulosa murni (misal: kertas whatman no.1 kecepatan merambat zat sedang), dipotong sesuai kebutuhan.  Teteskan sampel (sekecil mungkin), penetesan 3-4 x (tetesan besar  terjadi tailing/pemisah tidak sempurna)  Masukkan kertas ke dalam wadah berisi pelarut  pelarut merambat pada kertas sampai tanda (Solvent front)

 Identifikasi : Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV pada λ: 254 – 370 nm Kimiawi : semprot dengan larutan kimia misal: -gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3 - Larutan khloroglusional dan HCl dapat digunakan -gula non reduksi: naphtoresorcinol dlm asam fosfat. untuk:  Aldosa pentosa (violet)  Ketosa pentosa (hijau tua)  Ketoheksosa (kuning coklat)  Metil pentosa (hijau )

Uap Iodin Semprotkan pada kertas diruang asam Setelah kering akan timbul noda berwarna Hitung Rf, bandingkan dengan standar  Zat pelarut: zat murni atau campuran  Untuk penentuan gula sederhana: Campuran butanol : asetat : air atau asam asetat : pyridin : air (4:1:5)

Cara fisis (Cara optic)  Penentuan index bias dengan refraktometer  tiap jenis gula punya index bias tertentu.  Keuntungan: • interval skala index bias cukup besar 1,30 – 1,75 • sampel sangat sedikit (beberapa tetes) • ketelitian : ± 0,0002  dinyatakan dengan

n

20 D

= pengukuran pada t = 20oC dengan sinar Natrium sebagai sumber sinar monokromatis.

 Pengaruh konsentrasi terhadap (α) sangat kecil  diabaikan  Suhu berpengaruh  perlu koreksi :

[α ]

D t

= [α ] − [1 − 0,000184( t − 20 ) ] D t

Penentuan karbohidrat dengan polarimeter Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri Keuntungan  Sampel tidak mengalami kerusakan  Dapat dilakukan cepat Agar hasil teliti, maka:  Larutan harus jernih dan tidak berwarna Larutan tidak mengandung bahan asing yang bersifat optis aktif Konsentrasi sampel yang optimum: tidak terlalu pekat amupun encer

Penentuan dengan polarimeter Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan panjang cairan dalam tabung

[α ] [α] t D α C I

D t

100α = lC

: putaran/ritasi spesifik : suhu pengukuran (oC) : sinar Na (589 nm) : sdf putar yang diamati : konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut) : panjang tabung (dm)

Penentuan Serat Kasar  Serat kasar : Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam organ pencernaan manusia maupun binatang.  Dalam analisa : diperhitungkan banyaknya zat yang tidak larut dalam asam/basa encer pada kondisi tertentu.

Langkah penentuan serat kasar 1. Defatting : menghilangkan lemak dalam sampel dengan pelarut lemak 2. Digestion : - pelarutan dengan asam - pelarutan dengan basa  dalam keadaan tertutup pada temperatur terkontrol (mendidih)  segera dilakukan penyaringan untuk mencegah kerusakan lebih lanjut  Protein menyulitkan penyaringan  perlu digesti pendahuluan dengan enzim proteolitik  Residu = serat kasar yang mengandung 97% selulosa dan lignin  sisanya adalah senyawa yang belum dapat diidentifikasi