Újabb típusú hematológiai automaták által kapott paraméterek értelmezése Bekő Gabriella Semmelweis Egyetem Laboratóriumi Medicina Intézet Központi Laboratórium (Pest) 2011. április 20.
• A fehérvérsejtek, vörösvértestek és thrombocyták automatával történő számolása alig 50 éves múltra tekint vissza • A módszer harmonizációja, a mért paraméterek standardizációja, a számolt paraméterek elfogadása az 1990-es évek végén történt • A XXI. század modern komputer és network technikái hozzájárultak a mechanikai és algoritmusokon alapuló kontroll rendszerek kifejlesztéséhez • A hematológiai automaták napjainkban már képesek részletekbe menő, nagyon pontos eredményközlésre, amelyből sokszor juthatunk korrekt diagnózishoz minimális emberi munkával
Lehetőségek és korlátok • A hematológiai automatákból teljesen megbízható értékeket kapunk: - fehérvérsejtszám, vörösvérsejtszám, hemoglobin koncentráció, MCV • Nagyobb odafigyelést kíván: - a qualitatív eloszlás, a reticulocyta és a thrombocyta szám (főként alacsony tartományban) • -
Standardizáció hiánya miatt készülékfüggő: RDW (RBC distribution width) MPV ( mean platetet volume) PDW (platelet distribution width)
Lehetőségek és korlátok • A készülék által használt festésből adódó különbségek: - peroxidáz festésnél LUCs (large unstaind cells) - fluorescens festésnél: IGs( Immature Granulocytes) - HPCs (Hematopoetic progenitor cells) and NRBc (Nucleated RBCs) • Új paraméterek klinikai használata: -
IRF (immature reticulocyta fraction) MCVr (mean reticulocyta volume) CHr ( mean reticulocyte hemoglobin content) FRBC (fragmented RBC) IPF (immature platelet fraction)
Hematológiai automaták mérési elvei • Impedancia elvű mérés ellenállás változás –a sejtek vezetőképessége kisebb sejtnagyságtól függő elektromos impulzus
• Nagy frekvencia elvű mérés - sejtfal vezetőként viselkedik, az áram áthaladva a sejten belső struktúráról is informál ( a sejten belüli granuláris, nukleáris összetételről, vegyi eltérésekről) – a nagy frekvenciájú impedancia impulzus – speciális szoftverrel (Adaptív Cluster Analysis System) érett és éretlen granulocyták elkülöníthetők
Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés
Hidrodinamikailag fókuszált sejtáramlás, megvilágító lézer fény és detektor
Kis szög (2-4o) alatti fényszórás a sejt mérettel, a nagyobb szög alatti (10-15o) fényszórás a sejt tartalommal (pl. hemoglobin koncentráció, vagy sejtmag sûrûség) arányos A kis és a nagy szög alatt szórt fény intenzitásának komplex matematikai összefüggését a Mie teória írja le
Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés 5 lézer detektorral
Beckman Coulter DXH-800
- Volume (térfogat) - Conductivity (vezetőképesség) fényáteresztő képesség (transparency) - Axial light loss (AL2) sejt komplexitás - Low angle light scatter (LALS) - Median angle light scatter (MALS) sejt granularitás, - Lower median angle light scatter (LMALS) sejtmembrán felszíne - Upper median angle light scatter (UMALS)
Fehérvérsejt diferenciálás festés nélkül
Peroxidáz pozitív sejtek
M
E
L
M = Monocyta N = Neutrophil E = Eosinophil L = Lymphocyta B = Basophil
N N M N L
B N
N
L
Wright festés
Peroxidáz festés
Felhődiagram peroxidáz festéssel 1 Zaj 2 Magvas vörösvérsejt 3 Összetapadt thrombocyták 4 Lymfocyták és basophylek 5 Large Unstained Cells (LUC) 6 Monocyták 7 Neutropylek 8 Eosinophylek
Morfológiai flag-ek: ATYP (Atípusos lymphocyták) IG (Éretlen granulocyták) MPO (Myeloperoxidase hiány) NRBC (Magvas vörösvérsejtek) PLT-CLM (Összetapadt thrombocyták)
Felhődiagram a bazofil csatornán
1. Zaj 2. Blasztok sejtmagja 3. Monociták és limfociták sejtmagja 4. Bazofil sejtek 5. Bazofil gyanús sejtek 6. Szaturáció 7. Neutrofil és eosinofil sejtmagok
Morfológiai flag-ek: BLASTS (Blasztok) LS (Nem szegmentált granulocyták)
LUC (Large Unstained Cells) Nagy nem festődő sejtek: • Aktivált lymphocyták • Plazmasejtek LUC • Hajas sejtek • Gyermekkori nagy lymphocyták • Myeloperoxidáz negatív blasztok • Myeloperoxidáz negatív neutrophil granulocyták Morfológiai flag-ek: • ATYP (Atípusos lymphocyták) • BLASTS (Blasztok) • MPO (Mieloperoxidáz hiány)
20 éves ffi, fül-orr-gége ambulancián; láz, nyelési nehézség
Fluoreszcens festés
• A sejtek emelkedett nukleinsav (DNS vagy RNS) tartalmával arányos a fluoreszcens jel nagysága
Felhődiagram fluorscens festéssel Sysmex XE-2000 automatán
IG (Immature Granulocytes)
Promyelocyta
IG Myelocyta
Metamyelocyta
IG (Immature Granulocytes) Emelkedhet: • Bakteriális infekció • Akut gyulladás • Tumor (csontvelő metastasis) • Szövet nekrózis • Akut transzplantátum rejekció • Sebészeti, ortopédiai trauma • Myeloproliferatív betegség • Steroid • Terhesség (harmadik trimeszter)
Nagyobb jelentőségű az emelkedés (IGs>2%): • idősek, újszülöttek, koraszülöttek akut infekció • myeloszupresszált betegek akut infekció • neutropeniával járó szepsis
IG (Immature Granulocytes) •
In this comparison of the IG count on the XE-2100 to the manual count, the correlation coefficient was 0.83. The XE-2100 IG results showed significant correlation with the results from the manual immature granulocyte count. We concluded that the XE-2100 IG demonstrated comparable performance to the manual IG count. Diane Field, Elizabeth Taube, Sherry Heumann Performance Evaluation of the Immature Granulocyte Parameter on the Sysmex XE-2100 Automated Hematology Analyzer St. Anthony's Medical Center, St. Louis, Missouri, USA Laboratory Hematology 2006
növekvő sejt átlagtérfogat és SD éretlen neutrophil granulocytákra utal
NORMAL CASE
CASE WITH MODERATE LEFT SHIFT
Éretlen granulocyták növekvő számban
In these four cases cases, we can see a normal (left) and progresively to the right cases with an increase in number of Imm NE. As we can see the SD Vol NE is also progresively higher.
Magvas vörösvérsejtek a perifériás vérben
Magvas vörösvérsejtek a Sysmex XE-2100 automata NRBC csatornáján
UniCel DxH 800 Coulter NRBC mérés: 1.Vérminta hígítás 2.Nem magvas vvt lizálás 3.Elkülönítve marad: - fehérvérsejt - thrombocyta - sejttörmelék 4.Minta a flowcell-be kerül 5.Lézer analízis - sejtméret - sejt karakterisztika - sejtmag differenciálás AL2 fénynyalábbal
interferencia kiszűrése
Magvas vörösvérsejtek az Advia 2120 automata esetén
Leletkiadás magvas vörösvérsejt esetén
A magvas vörösvérsejtek megjelenése a periférián •
Újszülött korban: - újszülöttkori hemolitikus betegség - koraszülöttek és újszülöttek hypoxiás károsodása • Felnőttkorban: - thalassemia - myeloproliferatív betegség ( myelofibrosis) - szolíd tumor csontvelői metasztázissal - extramedulláris hematopoiesis - hematopoietikus stressz ( szeptikémia, masszív hemorrhagia, súlyos hipoxia)
Ajánlott klinikai alkalmazás -
hematológiai betegségek diagnózisa
-
súlyos kardio-thorakális műtéten átesett, egyéb sebészet intenzív ellátást igénylő nem hematológiai betegségben prognosztikai faktor - csontvelő transzplantáció után ( >0,2x 109/L fölött magas mortalitási ráta) - thalasszémia szindromában transzfúziós terápia hatékonyságának monitorozása
Evaluation of a New Real-Time Flow-Cytometry Based NRBC Enumeration Method for the Routine Hematology Laboratory Alexander Kratz, M.D., Ph.D., M.P.H.,1 Gail Kling, MT(ASCP),2 William Canfield, M.A.,2 Karim Maloum, M.D., Ph.D.,3 Conor O’Malley, FIBMS,4 5 Gina Zini, M.D., Vincenzo Rocco, M.D.,6 David Zelmanovic, Ph.D.,2 and Jolanta Kunicka, Ph.D. 2 1) Department of Pathology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts; 2) Bayer HealthCare LLC, Diagnostics Division, Tarrytown, New York; 3) G.H. Pitié-Salpétrière, Paris, France; 4) St. James University Hospital, Leeds, United Kingdom; 5) Policlinico Universitario Gemelli, Rome, Italy; 6) Azienda Ospedaliera "G. Rummo", Benevento, Italy
2007
Korreláció az XE- 2100 és a flow cytometer NRBC eredményei között
Sysmex Journal Internal 2005
NRBC counts for all samples collected (n = 201) on the DxH 800 vs. flow cytometry (FCM). R2 Value for DxH 800 vs. FCM was 0.910.
R= 0.95
B D HEDLEY, M KEENEY, I CHIN-YEE, and W BROWN Initial performance evaluation of the UniCel® DxH 800 Coulter® cellular analysis system Int J Lab Hematol. 2011 February; 33(1): 45–56.
Coulter DxH 800 automatán nagyon kis számban fordul elő fals negatív vagy fals pozitív magvas vörösvérsejt tartalmú minta
A. JEAN, C. BOUTET, B. LENORMAND, et all.
The new haematology analyzer DxH 800: an evaluation of the analytical performances and leucocyte flags, comparison with the LH 755 International Journal of Laboratory Hematology Volume 33, Issue 2, pages 138–145, April 2011
Hematopoietic Progrenitor Cells az XE-2100 Sysmex automatán az IMI (Immature Myeloid Information) csatornán
HPC CD34+ (Hematopoietic Progrenitor Cells) Sysmex XE 2100 automatán
Padmanabhan A, Reich-Slotky R, Jhang JS, Dael S, Crowder T, Colovai AI, Schwartz J. Use of the haematopoietic progenitor cell parameter in optimizing timing of peripheral blood stem cell harvest. Department of Pathology, College of Physicians and Surgeons of Columbia University, Columbia University Medical Center, 180 Fort Washington Avenue, New York, NY 10032, USA. Vox Sang. 2009
Alacsonyabb sejtszámnál gyengébb összefüggés •
The area under the curve for HPCs was significantly smaller than the preharvest CD34+ cell count on the ROC curve for predicting adequate harvest yield (>10 × 106 CD34+ cells/L) of processed blood volume, 0.678 vs. 0.850, p = 0.001).
•
Yang SH, Wang TF, Tsai HH, Lin TY, Wen SH, Chen SH. Preharvest hematopoietic progenitor cell counts predict CD34+ cell yields in granulocyt colony stimulating factor-mobilized peripheral blood stem cell harvest in healthy donors Department of Pediatrics, Hualien Buddhist Tzu-Chi General Hospital, Hualien, Taiwan. Transfusion. 2010
Vörösvérsejtekről kapott információk 1. Vvs átlagos hemoglobintartalma (mean corpuscular hemoglobin) *MCH = Hb / vvs szám x10 *sejtenkénti átlagos Hb mennyisége 2. Vvs átlagos térfogata (mean corpuscular volume) *MCV = Ht / (vvs szám x 1000) *MCV = közvetlenül a RBC volume histogramból 3. Vvs átlagos hemoglobinkoncentrációja (mean corpuscular hem. conc.) *MCHC = Hb/(vvs szám x MCV) x 1000 *CHCM = közvetlenül a Hgb concentracion histogramból 4. Vvs populáció szélessége (red diagram distribution width) *RDW 5. Microcyta %, Macrocyta %, Hypochrom %, Hyperchrom % 6. MAF (Microcitic Anemia Factor), %LHD (Low Hemoglobin Density %)
MCV és RDW használata • MCV ↓ RDW ↑ – Vashiány – Pozitív prediktív érték = 97.8% – Legjobb teszt a CHr (reticulocyta hemoglobin koncentráció)
• MCV ↓ RDW→ – Thalassemia trait
• MCV →RDW → - Akut anémia/krónikus intercurrens betegség – Transiens erythrocytopenia (TEC)
• MCV →RDW ↑ – Vérvesztés – Hemolitikus anémia
MCV és RDW használata • MCV ↑ RDW ↑ – – – – –
Újszülöttek Reticulocytosis B12/fólsav hiány Hypothyreosis Májbetegség
• MCV ↑ RDW → – – – – – –
Preleukemia Leukemia Aplasztikus anémia Diamond-Blackfan szindróma Down szindróma Dohányzás
RDW (RBC Distribution Width) standardizáció hiánya
van den Bossche J, Devreese K, Malfait R, et al. Reference intervals for a complete blood count determined on different automated haematology analysers: ABX Pentra 120 retic, Coulter Gen-S, Sysmex SE 9500, Abbott Cell Dyn 4000 and Bayer ADVIA 120. Clin Chem Lab Med. 2002;40:69-73.
Interferenciát okozó tényezők Hb Cold agglutinins
Hct
RBC
MCV
MCH
MCHC
↔
↔
↓
↑
↑
↔
↑
↑
↑
↑
↔
↔
Hyperglycemia
↔
↑
↔
↑
↔
↓
Hypernatremia
↔
↑
↔
↑
↔
↓
Triglyceridemia
↑
↔
↔
↔
↑
↑
Leukocytosis
Reticulocyta mérés Beckman Coulter UniCel DxH 800 automatán Metilénkék festést használva
High Angle (5-15 degrees)
Reticulocyta cytogram - reticulocyta érés
Oxazine 750 Absorbance
Reticulocyta cytogram Sysmex XE-2000 automatán
Származtatott reticulocyta paraméterek • MCVr a reticulocyta populáció átlagos sejtmérete • CHr a reticulocyta populációban egy sejt átlagos hemoglobin tartalma →RetHe reticulocyte hemoglobin equivalent →Rsf Red blood cell size factor • CHCMr a reticulocyta populáció átlagos hemoglobin tartalma • M-RTC% a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban • M-RTC# a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben • H-RTC% a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban • H-RTC# a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben • IRF-M+H a közepes és nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban, IRF éretlen retuculocyta frakció
IRF(Immature reticulocyte fraction) használata • Anémiák differenciálása • Táplálkozással kapcsolatos anémiák terápiájának monitorozása • Csontvelő regeneráció korai monitorozás (csontvelő transzplantáció vagy kemoterápia után) • Aplasztikus anémia verifikálása • Csontvelő sejtek gyűjtésének időzítése
CHr (mean reticulocyte hemoglobin content)- Advia Ret-He (reticulocyte hemoglobin equivalent )- Sysmex Rsf (Red blood cell size factor – Coulter használata • Abszolút vagy funkcionális vashiányos eritropoesis diagnózisa (vashiány korai kimutatása gyermekekben) • Orális és intravénás vasterápia monitorozása • Dialízis alatt az erythropoetin terápia monitorozása
Sysmex XE 5000 és LH 750 automaták RetHe és RSf paramétereinek összevetése elégtelen erithropoesis esetén • Red blood cell size factor (RSf) is a new parameter provided by Beckman Coulter, which joins together the volume of the erythrocytes and the volume of reticulocytes. • Good correlation between RSf and Ret He was observed, r = 0.8184
International Journal of Laboratory Hematology 2010
MCVr (Mean reticulocyte volume) használata • Vashiányos erythropoesis diagnózisa • Táplálkozással kapcsolatos anémiák esetén a terápia korai hatásának monitorozása • Csontvelő transzplantáció után az erythropoesis helyreállásának követése • Sportolók erythropoetin használatának kimutatása
RBC fragmentocyták a Sysmex XE 2000 felhődiagramon
Fragmentált vörösvérsejtek Sysmex XE 2000 automatán
Klinikai alkalmazás: Microangiopathiák diagnózisa és monitorozása
Fragmentált vörösvérsejtek (schistocyták) mérésének összehasonlítása Advia 120 automatán és manuális módszerrel
Lesesve JF, Salignac S, Alla F, et al. Comparative evaluation of schistocyte counting by an automated methodand by microscopic determination. Am J Clin Pathol.2004;121:739-745.
Thrombocyták Flow-cytometriás analízise
High angle detector (5o - 15o) 670nm Laser Diode
Low angle detector (2o-3o)
Előny: specificitás↑ és szenzitivitás↑
Thrombocyta cytogram (Advia 120)
Térfogat
1 Thrombocyták 2 Nagy thrombocyák 3 Vörösvérsejtek 4 Vvs fragmentumok 5 Üres vvs-ek
2 5
3 1 4
Refraktív index (Thr törésmutató)
Thrombocyta mérés reticulocyta csatornán (Sysmex XE-2100)
IPF% (Immature Platelet Fraction) retikulált thrombocyták
IPF
Thrombocytákról kapott információk • PLT Thrombocyta szám • (PLT Count x RBC Cal Factor x PLT Cal Factor) • MPV Átlagos thrombocyta térfogat • PDW Thrombocyta eloszlási görbe szélesség • Large LPLT nagy thrombocyta térfogat (nagyobb mint 20 fl) • IPF% (Immature platelet Fraction) reticulált thrombocyták
IPF% (Immature Platelet Fraction) retikulált thrombocyták használata • Thrombocytopenia differenciál diagnosisa • Kemoterápia és csontvelő átültetés után a thombocyta rendszer helyreállásának jelzője • Thrombocytózisban a thrombózis rizikó-indexe • Profilaktikus thrombocyta transzfúzió szükségének megítélése • Trombocyta turnover becslése
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!
